6
Macrophage regulation by Tyro 3 family receptors Greg Lemke and Qingxian Lu Recent analyses demonstrate that the three receptor protein- tyrosine kinases of the Tyro 3 family function as central regulators of the activation state of macrophages. These studies, carried out in cells and tissues derived from single, double and triple mouse knockouts, have shown that Tyro 3 family receptors limit the magnitude and extent of macrophage activation subsequent to an initial immune stimulus. In the absence of this signaling system, macrophages are constitutively activated. This, in turn, results in a hyperactivated immune system, lymphoproliferation, the development of autoimmunity and early death. Addresses Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute, 10010 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA e-mail: [email protected] Current Opinion in Immunology 2003, 15:31±36 This review comes from a themed issue on Innate immunity Edited by Ruslan Medzhitov and Christine A Biron 0952-7915/03/$ ± see front matter ß 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. DOI 10.1016/S0952-7915(02)00016-X Abbreviations APC antigen-presenting cell EGF epidermal growth factor GAS growth arrest speci®c gene IL interleukin LPS lipopolysaccharide LTP long-term potentiation NF-jB nuclear factor-kB PTK protein-tyrosine kinase TAM Tyro 3/Axl/Mer triple mutant TNF-a tumor necrosis factor-a Introduction Macrophages, dendritic cells and other professional anti- gen-presenting cells (APCs) are pivotal regulatory nodes of the immune response. When activated, these cells are essential for antigen presentation to T and B cells, and produce a panoply of cytokines that broadly engage all cells of the immune system. However, the in¯ammatory envir- onment generated by APCs is, if unchecked, as damaging to host cells and tissues as it is to invading pathogens. The immune system must therefore maintain a balance between the positive signals that activate APCs, and in turn lymphocytes, and the negative signals that inhibit them. The disruption of homeostatic regulators of this balance results in either an ineffective immune response or alternatively a hyperactive one [1,2]. Engineered mouse mutants have now provided evidence that an unusual family of receptor protein-tyrosine kinases (PTKs) func- tion as homeostatic regulators of APC activation. Tyro 3 family receptors and ligands The three receptors of the Tyro 3 family Ð Tyro 3, Axl and Mer Ð were ®rst identi®ed as a novel and distinct receptor PTK subgroup in 1991 [3], and two ligands for these `orphan' receptors Ð growth arrest speci®c gene (GAS) 6 and Protein S Ð were identi®ed and cloned four years later [4,5]. The three receptors appear to be rela- tively late evolutionary inventions, as there are no clear structural homologs in Drosophila or Caenorhabditis elegans. They are expressed in cells of the mammalian reproduc- tive, immune, vascular and nervous systems. Coexpres- sion of more than one of the receptors within the same cell is a frequent observation, although some cell types appear to express only a single member of the family [3,6±8]. The extracellular domains of Tyro 3, Axl and Mer carry a de®ning arrangement of two immunoglobulin domains and two ®bronectin type III repeats, each in tandem, followedbyasingle-passtransmembranedomain(Figure1). As is true for nearly all receptor PTKs, the binding of ligand to the Tyro 3 family ectodomains very strongly activates the intracellular kinase activity of each receptor. Gas6 binds and activates all three receptors, albeit with markedly different af®nities (Axl > Tyro 3 >> Mer; [4,5,9]). By contrast, Protein S, an extensively studied anti-coagulant in the blood coagulation cascade, has been reported to be a speci®c agonist for Tyro 3 [4], although its status as a ligand for this receptor in humans has been questioned [10]. Gas6 and Protein S share the same distinctive and complex arrangement of structural motifs, and are apparently the only proteins encoded in the mouse and human genomes that carry this particular con®guration of domains. Each protein has a so-called `Gla domain' at its amino terminus, which is rich in glutamic acid residues that are gamma carboxylated in a vitamin K-dependent reaction [11]. The Gla domain is followed by four epidermal growth factor (EGF)-like domains and by a set of tandem G domains, which are related to those of the sex hormone binding globulin (SHBG; Figure 1; [12]). Overall, Gas6 and Protein S share 42% amino acid identity. Receptor and ligand expression in the immune system Analyses by several groups have demonstrated that Tyro 3, Axl and Mer are prominently expressed by monocytes and their derivatives. Mer, for example, has been detected in peripheral blood and bone marrow mono- nuclear cells, monocytes and macrophages, but not in 31 www.current-opinion.com Current Opinion in Immunology 2003, 15:31±36

Macrophage regulation by Tyro 3 family receptors

Embed Size (px)

Citation preview

��������� ����� �� �� ���� � ��� �� ����������� ������ � ��� �� ��

����� ������� ��������� ���� ��� ����� �������� �������

������� ������ �� ��� ���� � ������ ������ �� ������ ����������

�� ��� ��������� ����� �� ������������ ����� ������� ������

��� � ����� � ������� ����� ���� ������ ����� � ������

����� ��������� ���� ��� ���� ���� � ������ ��������� �����

��� ������� � � ��� �� ���������� ��������� �����!���

�� � ������ ����� ��������� " ��� ������ �� ���� �������

������� ����������� ��� ������������� ��������� ����� � ����

������� � � ������������� ����� ������� �������������������

��� ��������� �� ����������� � ����� �����

�������#�������� $����������� ����������� ��� %��� "�������� &''&' $����

������ (��� ���� �� )����� *+ ,-'�.� /%+�������0 �����1�������

����� �� � �� � ��������� -''�� ��0�&2�3

���� ����� ����� ���� � ����� ����� �

"��� �������

4��� �� ����� #�5����� � *������� + 6���

',7-�.,&78'�89 2 ��� ���� ������

� -''� 4������� %����� ��� +�� ������ ��������

��� ������ !"�#�$%&#��'�$(���� %)

����* �� ����+� �������������� ����

,-. �������� ��� �� ������

-�" ��� �� ������ �����:� ���

�/ ���������

/+" �����������������

/�+ �������� ����������

0.%�1 ������ ��������6+�2 �������������� �����

��� ���� ������� ������ �����

�0.%� ����� ������� ��������

�������� ������������ � ������ ��� � � ���� ������ �� � ���� ��� �� � ��� ����� �� ������� ��������� �� ���� ���� ��� � �� ��������� �� ��� �� ���� ��� � ��� �� ����� �� � � � � ���� � ������� � �� ���� �� ���� � ���� !������ ��� ��� ����� �� ���� ���� "�#��� �� � $�������� ����� � � � ���� !� ��� �� �� � ��� �� � ������ ��� ��� ��� � � ��� � �� � �� � ���� � ������ � ������ ��� ��� ������ ��� ��� � !��� �!�# �� ������ �� �� ���� ������� ���� � � � ��� ���������� � � �� ����� �� �� ���� � ��!������ �� �������� �� ��������� �������� �� ���!��� � ���� � ���� � � ������ ���� ��� �� ���� ������ � ��������� � %&�'(� ) �� ��������� � ��� �# ������� ��� � ���� � � ����

������ �� ������ ����� ������ � � ���*� �� ����� � ��������� �������� �� ��� ��������� �

���� � ��� �� ������� ��� � ������� ��� ������ �� �� ���� + ������ , ���� +� �-�� � �� , #� .�� �� ��.� � � ��� � � ���� �������� ��* �!����� � &//& %+(� � � �#� ���� � ����� 0����� 1 ������ , ���#�� ���� ���.� � �2�3� 4 � � ����� 3 , #� �� ��.� � � ��� � ������� ���� %5�6(� �� ��� ������ ����� �� ! ��������� ��� ������� ��� � � ��� � � ��� �� � ������������� ������� � ��������� �� ����� ����� ���������� �� -��� � ��� �� �� �������� ������������ ���� � ������� � � ���� ���� ��-����� ����� ��� � �� �� ������ #���� �� �� ���� � ��7� � �!������ � �������� �� ��� ��� ������� -�� � �� � � �� ��!� �� �� ������ %+�489(�

�� -���������� ����� �� ���� +� �-� � � �� ����� ��. � � ���� �� � �� �#� ���� ����!��� ����� � � �#� .!�� ��� ��� ::: ����� ��� � �� ��������#�!��� �������� ��!�� ����� �;����&��� � ��� ��� ���� ��� ������ ��*� �� !� �� � ������ � �� �� ���� + ������ �������� ��� ��� ���������� �� � ���������� � � �������� �� ��� �������2�4 !� � � � ������� ��� ��� ������� ��!�� #������ ��� ����� � ��. ��� ��-� � ���� � �� ��<%5�6�/(�� �� �� ����� ����� 3� � -� ���� ������ ���������� � � �� !���� ���������� ������ �� ! ������ �� ! � ���.� ��� �� ��� ���� + %5(� �������� ������ � � ���� � ��� ��� ������ � ���� �� ! 7���� � %&=(� 2�4 � � ����� 3 ��� �� ������ ���� � � �����- ���� �� � �� ��������� ������� � �� ����� ��� �� � �� ����� ���� � ����� � � ���� � �� ���� ����� ��� ������������ .������� �� ����� � )��� ����� �� � �������02�� ����� 1 �� �� ��� � ���� �� #���� � ���� � �������� ���� ���� ���� �� ����� ���!�-����� � � ������ *��� � � ������ %&&(� �� 2�� ����� ������#� !� ���� ������� ���#�� ������ �)2;���� ����� � � !� � � �� �� �� 2 ����� � #���� ������� �� ��� �� �� - ����� !� �� � ���!��� �3"�2< ;���� &< %&'(�� >������ 2�4 � � ����� 3 ����5'? ��� � ���� �� �����

3����� ��� � ���� 4���� �� � �� ��� ������ ��� !� ���� ����� ��� ��� ����� ���� ����+� �-� � � �� �� ����� ��� -��� !� �� ����� � ���� ��������� ��� ��� -����� �� ! ����� � �������� !���� � � !� �����# �� �� ����� ���� �� ���� � � ���������� !�� �� �

�&

����������������� ����� �� � �� � ��������� -''�� ��0�&2�3

��� ������ �� �������� � �� � ��������� %9�&+(�3��������� �-� � -��� !� �������� �� ���� � ����������� !�� �� !� ��� ������ �� ���������%&5�&6(� �� ���� ��!����@���� ������ ��� � ���� ���� � ����� �� � � ����� ��� ��� ����� ������ ���� �� ��� � � ��� �AB� �� � ����� ����� � ���� �������� !� ��������� � �� �� ����� ��-����� ���� ���������� ����� ���� %&4��(� : �� �� � ��� -����� ��� ��� ������ �AB� ��������@� �� �� �� ���� � � ����� �� @� � #��� ����� �� � -���� � �� ������������ �������� ����� � ������� � �� ���� �� � �� �� �� #��� ���� �#������ ��� �� !�� �� !��� � � � � ���< %&4��(�� ����������� ����� �� ! �� �.�� � ������ � -���� �� ����� ������ ��� � �� ����C��������� ���������� � �� ���!����� ���� ���� �� �!� �� ���������-�� ���� �� ���!� ���� �� ������ �� �� ! ���� ����

+�������� �������� �� ��� 5���5������ ���� ��� � � �� ��!� �� �� ���� + ������-��!�� � �� � �� �� ���� � ������ ��� �� ����������� ���� %&D�&9(� ����� ��� �� �� �� �� ��

� �� ��� �� ��� %&9�&/���'=�(� #���� �� !�� �� � ���� �� �� ������ ��� ���� �� ����� ������������� %&D�&/��(� �� �� � #��� ��� �!������� � �� A���� ����� �� 3���� �A�3� ���� � �������� � ���� ���� �� ��� ��� ���� ���� �� �� ���! ��# �� ����� � 5=/ !� ����� ������ � � ��������� � � ��� ����� ���� ���� � � �� ������ � %'&(� � � ������� � �� ���� ��� � ��� ! ����� � � �!� �� ���� � #��� ��� ��� ���� ���%''(� ��� ��� �� ��� ��� ������ � �� �� ������� �� ����-�� ��� %&9�&/��(� � ����� ������ � �� ��������� ���� ��#����� �� ������� � � ����� �� �� ������ � �� �������� ��� %&/���'=�(����� � � �� ���� � -��!�� ��������� � ���� ����� ��� ��B3� �� ���� ����� ��� ������������� ����� ��� ������ %E��(� � ��� � ����� � �� #� ���� ��� -��!�� ���� �� ����� ������� �� !��@�� � � �� ����! ������� %&D(�

)��� �� �� ����� � �� ���� � �� ���� � �� ������ ��� ��� ��� �� �� � ������ � ���� � �� ������ �� ��� � � ��� � � � � �� ��� �� � ��������� � ���� ��� ��� ��� ������ %&4���&D(� :� �������� � �� ��� ��#��� ���� � ���� +C�-�C������� ���� � ����� ����� ������� �!���� �� � -��!�� � �!���� ������ ��� ���� � � ����� ��� ���� �!��� ��� �� .�� �#� �� ��� # ���� !����� �� ��� ��� �� � ���� �����!� ����#������� � ���� %&4���&D(� ��� ��� �� � ����� ������� ��� �� ���� � �����#� � �� �� ���� ��� ������ ������ � � �7� �� �� ���� + ������� < �� � � �� ������ ��* ������� �� �!���� �� ����� � �� ���� ���� �� �� ���� ���� ������ �� ���� �� #���� �� � ��� ���� � �� ���� � ����� ������� � � ���������� ���� ��� ��� ������ � ������� � � ����� � ��� �� � ���������� ����� ��� � � ���� %&4���&D(�

�� �� ���� �� ���� + ������ ������ ���� � ����������� .�� �!��� ���� � �� � � �� -��� ���������� �� �����-������ ���� # �� ��� ��� ��� � ��� ��� �!������ � �� �� ��� ���� ����� !�� �� � � ���� �� �� ���� �� ����� �� �����������!�# ���� � � ���� # %&D(� ��� ��� ��� ����� �� �� �� �� ����� �� ��� ��� ��� � �� �� ��� �� �� ��� �� %&D(< �� � ������� �� ��� � ������ ��� ���� !��� ��� � ������ �� ��� �� ���� � �@�� !�� � � ���� ����� # �� ��� � � ��� ��� ��� ��� �������� ��� � ����� �� ���� �� ���� !� E�� � �� ����������� ��� �� ���� � � �� ���� �� ����!��� � ������ -��!�� -� �� ��� �� �� � � ���� �� �� �� ������ �����������< � ������� ���� ��� ��� ��� �� ������@� %&D(�

: ��� �� #�� ���� � � ���������� �� ������� ! ����� � ������ ��� �� ! ��� � �� ! ���

. �� �

C

N

C

NIgdomains

FNIIIdomains

PTKdomain

Gladomain

EGFdomains

SHBGdomain

(a) (b)

Current Opinion in Immunology

���� � ������ ��������� � ������ '�( ��� ���� � ������ ���������;���� �� + � � #��< ����� � ��������� ��������� ��������

������� �� � � ������������ "� ����� ����� � �� � �

��������� ���� """ ;=$"""< �������� + ����������� (�> ����� ����

���� ������� � ����� �� ������� ��������� �� ��� ���� � ������ ?-7@ ��

������� �������� �� ���� ����� '�( ��� � � ������� ����� ������ ���� � ������ ��������� ;���3 � (����� %< ����� � ����������

��������� �� ����� ���� �� ������0 � ������������ ��� ����

���� � �������� ��� ������� ���� ���� �� ����� ����� ����� ����� ��� ��� ����� �� �� ���������� ���� 4�=����� ������ � � �����

����� ��������� ���� ������ �� ��� %A6� ;���� ������� �� �� ���

����� ���� ������<� ��� � ��� �� ���� (����� %� �

����������� � ��� ���� ���������� ������� ������� �� � ���� �

���� � ����� ��� ��� !������� ?B�&'@�

�- ����� ��� ��

����� �� � �� � ��������� -''�� ��0�&2�3 �����������������

� ���� ����< �� ��� ��� ���� �� ��� �!������������ �� �� ������� -�� �� � �������� ������� %&4���&D�&/��(� �������� ����������� ���.������� ��� � ��������� �� ��� -����� �� ��� ���� ����� � � �� � �� ���������� ��� �� ���� ��������� #��� #���� �� ����������� ���� �� ��� � ������� �������� ���� ������� -�� �� %'&(�3��������� �� � �� 3����� ��� �� �� �� ���� �������-�� ���� +� �-� � � �� �� #�� � !��� ���� �� ���� ��� ��� ���� �� ��� � �� ����� ���� � %&D(�

+������� � �� ��� �����

��� � �� ��� �������� ��� �� ���� �� ��� � �� ���� ��� %&4��(� �� !����� ��� ��������� �������� �������� ���� �� ����� �@ � �#����� � � �� ���� ��� ���� ������ � �� ������������ � � ������ �� �� � �� �!������ ����� ����� #������� ��� %&4��(� ��� � � �� ���� � ����# � ��#��� �� �� � � ����� �� �� ����� ���# �� ��� ��� ����� ���� � � !� �- �� ���� �� ��� �� ����7��� ������ �� � ���� ������� �� #���� �� ��� ��� � &= ��� ���� ��#������� ���� � � ������� ������ � !��� ���� �� �� � � #������� )��� �� �� ��� ������ � ������� �� ���!�� �� �� ��� ���� �� ���������������� ����� �� #��� ������������ -��!��� ��� ����� ���� %&4��(�

�� ����� �� �� ���� �� �� �!��� � ����������� �� !��� � � � � ���������� : ��� ���� �� ����� ��� �� � ���� � � �� �F5� �� �F9� � ���� � ����������� ������ �� #������� ���� �������� ��� ���������� ��������� ����� �� ! ������ -�� �� %&4��(��� ����� ����������� �� ��������� .�� �� ������������� �������� �������� � !�� � ��������� � �� ������ ��� �� �� �� � �� ���� � �� � ������������� � ������ ��� ��� � � ���� �� ������ � %&4��(�

����� �� * ��� *�� �� ��� ��� ��� ��

E��������� ������ #��� �� �� �� �� ���� ����� �� �� ��������� �������� � ������� � �$���!� �� ����� -���� �� !��� ���� ���� :E�' �������� �F4/� ;�� :;B��� � � ���� �� ���� �F55� ��������� ��� �� �� ������� ��������� �� �� ���� ���������� #��� ��������� ��� ���� � � �� �� ����� ��������� � ����� ���� ��� %&4���&D�&/��( � ��� ���� �� �� ������ � �� !����������� ��������� ��� � ������� � ���� �!� ������� �� �������� ��� ������ �� � ������ �������� � ����� ���� ��!�� � ��������� ��������� ����� �������������� ������� ������� � � 3G�H�� � ����� ���� %&4��(� � � �� �� ��� �� � ���� ��������� ���� ���� ��� ��� ����� �� ! ������� ������ ��� ��� %&4��(� �� ��� ���� �� �������� �� �� ��� ��� �� ������� �� !� ���� ��!��� ���� �� � #�� �� � �� ����� ��� � � ����� �

�FB�� ������ � � ����� ��!�� �����������%&4��(� �������� ��������� � � ��!��� ���� �� ������ ������!� ��� � � �������� �� � ��� � ����� ��� � � � ���� � � ����� ���� ��� � ���������� ������ � ������ ��� #��� ���!� �� ��� � ������������ � ����� ���� ��� � �� �� ��� � � ����� �� ��� ������� � �� ����� ���� �� ��� %&4���'=�(���� � ������������ ����� � ��� ����� ��!��� ���������� � �FB� � � ���������� %&4��(� � � � �� �� �#��� �� ��7� ��� �!��� ��-���� �� �� ������� + ������ ������ � �

�� ���� ��� �� ���� �� �� ���� + ������������ �� ��� ��� ��� �� ��� ���.������� ��� ��� � ���� ����� �������� � � �� ��� ����������������!��� ���� � � � ���� ��� � � !��������������� � �� ����� �� ���� ��������� �� �� -�� �� � �������� ������ � � A����� ����+� �-� � � �� �� ����� � �� ����� ���������� � � ������ ��� #� ���� � � � ���@� ���� ��������� !����� �� � ������ �� ����� �� %&+8&6�&4���&9�&/���'=�(� �� �� � #��� �� -���� ����� ������� ��� �� -���� � ��� ���� ����#������� � � � � ��� ����� � ��� �� ����� ��� !� �� ����������� �� ��!�-�$����� �������� ���� ������ �� ��;3)����!�� ���� #� ��� ���� � �� ���� !�� �� #�������� ��� %&4��(�

���� �� ����� �� ��� �������� ���#� � ����� �� �� ����� �� ���� + ������ ������� ��� � ���� �� �� ���� ��� �� ���� � �� ��� ��� � �� �� � �� -� �� � �����!� � � � �� �� ����

�� .�� � ���� �� ������� #� ��������� ����� ��� ����� � � ��!����� �� �� ���� ��#� �� ��������� ����� ��� �!7� � �� � � ����� ���� ��� � ����+� �-� � � �� �� ���������� � ����� � 0��� � � ��# 1�� ���� ��� �� ��������� � � � ������ ��������#� � � � $�������� ��� � � ���!� �� � � ����� � �� �� ���� �� ���� �� ���� ���� �� ���� ��� �� !��� #� � ������ �� ��-� � �� 7���� �;���� '�� ������� �!������ � ��� � !��� �� ��� � �� ���� � � � �� ����� ���� �� ���� �� � #��� ��� ������ � ;���� ��������� ������� ���� �� #� ����� �� #��� !������� ����������������� �E�3�� -�� � ������ ���� ��� �� ��������� ����� ������ �B;����� � � �� ��� ������ ���� �� E�3�� ���� ����-�� ��� � �������� � � ���� � � ���� �� �� -��� ��������� �� �B;�� %&9�&/���'=�(� �� �� ���� �� �� ������ ��� ��� ��� �� �� � �� ��� ��� %&4��(� 3��� �� ��� � �� ��� ��������� � � ����� � ���������-���� �� �"� ��� :: � � �� �D ���������� ���� ��������� �������� � �� ��� ��� � �������� �� #������� ��� � �� ���������� �� �� �� ��������������� � ��� �� E�3 ����� �� ��� � ���

��������� ����� �� �� ���� � ��� �� ������� ����� � �� ��

����������������� ����� �� � �� � ��������� -''�� ��0�&2�3

��� �F&&!� � � �F&&�� ��� ����� ������ ������������ �������� ��� �� ����� � #�� � ��� ������ �� ��������� ������� �� ����� %&4��(� � �� � ��� $�������� ���� � ������� #��� ��������� ���������� � � ����� � �B;�� � � :E�&'� -��!�� �� ������� -���� � � �� �� ������������� � ��� �� E�3 � �� ����� ���� � %&4��(�

����� � ���������� �

: ������� �� ��� �������� �� � �� �� � ������ ������� !� ��������� ���� �� ���� + ������

���� � ���� ����� ����� �� �� ���!�� �� ���� ������� � �� �������� ��� � ���� ��� ���� �� ����������@ � � ���� ��������� ���� �� �� � � �� � ������� ��� � �� �� �� ��� � #������� ������������� �� �� � �� ! ��� ���������� � ���@� � �� ��� � �� ���� � %&/���'=�(� �� �� ��� �� #���� ���� ��!� �� -���� ����� � ���� ������������������ ��� -����� �� �� �� ��� ����������� ��# �� ���� �� ��� ���� ��� ���� � ���.� ���� ���������� � � ����� � �� ��������� ���� � � � �� �$��� � ���� ��� ������������ �������� �����

. �� $

(e.g. LPS)

Gas6/Protein S+ Apoptotic cell

acac

Immune stimulus

Baseline APC Activated APC(e.g. upregulation

of MHCII,TNF-α, IL-12)

Inhibited APC(Tyro 3 family

receptors engaged)

Activated APC Phagocytic APC(Tyro 3 family

receptors engaged;apoptotic cells cleared)

Immune stimulus Gas6/Protein S

Current Opinion in Immunology

#��������� ��������� �� ���� � ������ ���������� $����� ���� � ������ �������� ��������� �� +(* ;���������� � ������ ����< ������ ��� � �

������ ��������� '�( =����� ��������� �� ������� ������� ���� � ������ ��������� ������ �����!��� �� � ������ ����� ��������� ���� �� � ���������������� ;����� �� � ������ �� �(%<� ���� ��������� ������� � ������� ����������� ����� ;�< �� +(*�� � ��������� ����� � ��������� ����������� �������� � ���� ������� ������� ��������� ��� ����� ����������� ������� ������� ��� ����� �� � ������� ������ ���� ����

���� ��� ����� �� ������ ����� ��������� ��� ������ �� ��� ����� ��!���� �� �������� ���� �� + � � #�� ;���38(����� %< ��� �� ���

+(*� ����������� � ����������� �� ����� ����� ��� ������ �� � ������� �� ��� ������� �� ��� ������ ����� �������� ?&3��@� %���� �� ���������� �� �������� +(*� ��!����� ����� ��������� ���� � ������������ �� ��������� ����� '�(� ��� ���� � ������ ��������� ���� � ����������� ������ �� ��� ������� �� ����� ������ ���3 � (����� % �� �� ���� ��� ��� ������� ������������ � ������ �� ��� ��������� �����

;��< �� � ���� �� ��� ���� � ������ ���������� ���� ����������� ������5�� ��������� ����� �� ��� ����������� ���� ��� ���������5� ���� ?&,���-'�@� "��� ���� � ������ ������� ������� ���� �� ����� ������ ��� ��������� �� ��� ���� �� ���� +(*� ��� �� ������ ���������

�B ����� ��� ��

����� �� � �� � ��������� -''�� ��0�&2�3 �����������������

!� �� ����� � � � ���� �� ��!�� !������� ������ ���- !��� � � ��� %&/���'=�(� : ��� � ����@����������� � ������� �� �� � ��������� �� � �� � ��� �� �� � �� ����� ���� � %&4��(� ������� ����� � �� ��������� ��� � �� ���������� � ����� ��� �� �!����� �� �� ���� + ������ ���� � �� !� ��� ������������� � � ������ ����������� ����������� ��� ������ �� 2�� ����� %'+(� �� ����� �� ������� ���� ������ -��� � �� � � ��$� ���� ����� ��!�� � � � �� ��� -��� #� ��� ���� �� � � ���� 2�� ����� ������� !� �� � �� ������� �� 2�4 � � ����� 3� #������� � ��� !� � �� ������ + ������ ������� ���!� ������ � ���� ����� �� ����� ��!���@���� �� ��������� ��� �� �� ���������� ���� �!7� ��� ���� ��� �;���� '�� � ����� �� �� ��� ��� ���� � ��� ��� ���� �������������� � �� � � ��� �� � � �������� �� ������ + ������ ������ %&/���'=�(�

������� �� �!������ � ���� � ��� ��������������� �� �#� ����� � ���� ��� �� ������� � �� � � �������� �� ������� I ���� ������ � ��������� �� �������� � ����� � !�� ��� ������� ���������� � ��� � � ���� �� ���� -���� ������� ��� �� ��� ��� ���� � ������ ��;���� '�� ��� ����� ����� � � ��� ������� !��� � ��� �� �� ����� �� ���� ������� �� !���������� ��� ���� � �� ���� ��� �� !��� � � ���� �� � �� ���� + ������ �� ���� #����� �� ��� � ��� ���� � ���� ��� � ��������������� ��� � � � � � ������� � �� � � ������ �� ���� %&4���&D(�

" ���� �� ����� ���

�� �� �� ��� ������ ���� �� ������� #���� ����������� ��� �� ��������� ��� ! � ��!��� !���������� �� �� ���� + ������ ������ � �# ���!G�� �� ����� � �������� � � ���� + ������ �������� ��� � ������ � -�� ����� � �� �� ���� ����� ������ �� ��� ��������� � � ���� ��������� �� � $��������� ���� � � ��� �� ��� � ��� #��� �����!�� �� ! ����� ���� �� �� � � �� � ���� ��� �;���� '�� ���� �� ��������� �� �� ������ ����� ! ���# ���� � � �!7� � �� � ����� ��� ��������� ������� ��� -����� !� �� -���� �� �B;�� � ����� � $�������� ���� � � � ��� �� ����� ������ �� ����!� �� ������� ��������� ,�� � ��-���� ���� + ������ ������ � � ���� ���� � , � ���!����� ���� ��� � �� ���� � ���� ���� � ������ ����� ! ������� � � �� ���� �� �� ���������� ��� �� ��� � � �� ������ � ���� �!7� ��� � � ����� ���� ������ %&4��(�

�� !��������� ���� �� �� � ���������� � ��!������� �� ��# ���� �� ������ ��������� ���� �� !�� ��.�� >��� � ������ � � ���� ����������� ;��A::�� �/&�:A�� � � ��5/�&� �� ������ ��

���������� ����� ��������� ��� � 3"��&� #������ �# �� �� �� ���� � ��!����� �� ���������� �� �� � ��������� %'5(� �� ���� ���������� ���� ������� ����� �!�� � ��!����� ������:�:�� �� � � ���� ���������� ����� � #������ � �������� !� �� � ��� � � � ����� � 0:�:���� 1 �� � %'5( � �� ��� � �� � � ����� ���� ���� + ������ ������ %&4��(� ����� ��� �� ��������� ������������ ��� ������ ��������� � � �#���� �� �� �� � � �������� ��� � � ��� ���� �� ! ���

������ ����� �� ���� �� ��� �� ��� �� �� ���� �� ���� � ��� � � !��� � ��� � � � ���!� ���� � � ���!������� ��� ���� � ���� ��� ��� �� ������� � � ���� ���� � � �� ��������� �������� ����� ��������� � ���8��� � ������� � �� ��������� ���, ������ �� � ��������� ����� ������ � � � ������� � �� �������� ����������� � � ����� ��� , �� ������ � �� �� �� ���� �� �� ���� � ������� ��� ���� ���� � �� ����� � � ��� ��������� ������� !�# �� �������� �������� � � �� ���� � ������ ���� � � � ��� ���� %&4���'=�(� �� � �# �� ���������� � ��� �� ������ �� -� � �� #���� ��������� �� ��� � ����������� +� �-� �� �� ��� � ���� �� ���!�� �� �� ������� � �� ���� �������� ��� ��� � ���� � ���������� ���������

3����� ��� �������� ��� ��(����� �� ���������� �������� �������� ���� ��� ���� ����� ������� � ���� ��� ���������� ��0

� �� ������� ����������� �������� �������&� =������ ++� ����� 60 +����� �� � ����� �� ����������6 ��

7 ��� ��� ��* *��� ��� ��� ��� �� -'''� �80C��&&&�

-� A��� �� D�������� +0 3���� �� �� ����5 � � ���� �� ��� �7����� ��� �������� ������ ������ ��� -''-� ��0B&��B-&�

�� ��� *� ����� �0 �� 4���� ��� �� �� ���� �%����� � 5 ������ � ����� ���� 4����� � �� *������ ��*�������� �� ��� &,,&� 03,&�.'B�

B� %���� �$� *� �� ���� #� ��� *� 6��� )� ��5��E� ��� *� #������>� =����� )� ���� F�� )��� (= �� ��0 �� ��� ������� �� ���������� � " ��� �� ���� *9 -�� 9 �� � ����� ��� �� ���� �!�4���� �� �� ������ ����� � 5 ����� �� &,,7� 8�033&�3.'�

7� G���� 6*� D��� *� 4������ �� ������ +� 6������ �F� =����� DH�A�� �H� ����� �� *������ *� ���� �) �� ��0 �4� ������ ����� �5 ��� �� ����� �� �� * ��� � 2%������ ���� � ������� ���:��%�����%��� ;� �� � ��� �� &,,7� �&�03-��3-3�

3� ��� *� ���� #� ����� �0 "�����9 4���� ��9 ��� ��� * �� ������ �9 � ���� ���� ��%����� ������ ����� � 5 ������������ &,,B� #0-73.�-7.C�

.� IJ6��� )(� =��� �+� *��� ��� (*� $������� +� >���� 6� (����� *�4������ � """� �� 6��� ##� 4��� A%� ��� 4�0 �4�9 � ��������� ���� ������ ���� �� ���� ���� ���� � �5� � ����9����� � ��*� ������ ����� � 5 ���� � �� �� &,,&���07'&3�7'�&�

C� ������ F>� F� �� ��� #������ F�� %������ A�� 4��� A%0���� �� ��� �30� 4���� �� ������ � �� � ��*� ���������������9 �%��� �� ������ !�""�� &,,B� �03B.�37.�

��������� ����� �� �� ���� � ��� �� ������� ����� � �� �7

����������������� ����� �� � �� � ��������� -''�� ��0�&2�3

,� $����� >� I����� >� $���� �� +���� A� K�� *� A������ A�#�5�� >0 ���� ;��� �� �� �� ������ �� ���:�� �����%��� ;��� �� � ������ � ���� ��� �4�9 "5�9 ��� �� ����������� � 5 ����� # �� ���� &,,3� $&�0�''--��''-.�

&'� ��� ��� ()� #��� #�� *�� )� %���� #F� ���� A� A�������0 3*���� �� �� �� ���� �� ���� � " ��� -�� �� � �������� �� ������ ����� � 5 ��� 3�!���� �� �� &,,7�8$0�77��7C�

&&� F� (� A�� %H� $������� %� A������� �0 ������� �� ����� �� �� * ��� � 2� ��� ��� � �� &,,7� ��0B&,�BB'�

&-� )����� F�0 "<�� ��� ���� ���� ���� ���� �� ��:��������%� �� �� ���� �!�4 ������%� �� �� ����� � ��� �� �������� ���� � "9 -�� 9 ��� � �9 ��� ��� �� $�����%& &,,.� $07.C�7CC�

&�� ������ F>� 6� �� �H� F� �� ��� %����� H�� 4��� A%�%������ A�0 ���� �� ��� �*�������� 4���� �� ������ ��� �� �� � �%�� ����� � 5 ���� �������� &,,7���0-�B,�-�7,�

&B� $������� +� =������� +� ������ F>� IJ6��� )(� %����� *+�6����� (� %���� %� %������ H� %������ A�� A�� F �� ��0,4���� �� �� �4�9 � ��������� �� ������ ����� � 5 ���9 ������� ��� ��� ����� ������� � �� ��% &,,B�8=0&,�&�&,B&�

&7� $������� +� 6������� +� #�� �� *� ����� A)� %���� %� A�� F�H����� 6� ��� 40 3��� ������� �� �� ��� �� �4�9 � ����������� � 5 ���9 � ��� ����� ����������� �� �� ���� ��5� ��� '� � '��(���� &,,.� $�0,&�,3�

&3���

�� �� ����� �0 >������� � ����� �� �� �� ��� ������� ������ ����� � 5 ���� �� �� ���� � ��� ��� $������ -''&�$#�0�'3��&&�

��� ������� ������ ����������� +(* ���������� ������������������� ���������� � ������������� ����������� ������� � ������������� �� ���� ���� ��� ������ ����� � ������ ������ ��� ��� ���� ���� � �� ����� ���� ������� � ���� ����� ��� ���� � ��������������� ������� ����� �� ������ +(* ��������� �����!��� �� � ����������� �������� ;���� �������<� � ������ ��������� ��� �� �������������� ������� � ��� ���� � ������ ������ � ���� ���������� ��������

&.� �� �� ���� #� K��� �� *������� �� 6���� %� *������� =� ���*� %���� #>� >��� �� #��������� �> �� ��0 ����%� ��� ��

������� �� ���� �� �������� �� ������ ������������ �� ��� �� &,,,� �#80.-��.-C�

&C� *������� �F� >����� 6A� 4��� A%� #��������� �>0 � ��*������� ����� � 5 ���9 ��9 �� � �� �0.%����� ������ ����� � ������������� �% ���� �����4 � ����5� # ��� ��&,,,� � $0�B,C��7'��

&,���

%���� �%� #�#��� 4)� (�� %#� ���� 4+� *�������� �� *��� (��4��� A%� #��������� �>0 +��������� � ��� ������� ��������� � ���� � �� ��� �� �,3� ��� �� -''&� =��0-'.�-&&�

��� ������� ��� � ���� �� � ����������� ���� ��������� � ����������� �� ��������� ���� �� ������� ����������� ������ ����������������� � �������� �� ��������� ������ ���� ��� ���� ���� ������ �����:� �� ��������� ������ � �� �� ��L���� � ������ � ������ �������� �� � �������5� ������������� ����� �:������� � ��� �������� ��� ������ � �������� ������� ��� ��� ��������� �� ������������ � ���������M ��� ������� � ������ �� ��� ����� �������� �����������

-'��

*��� (�� *�������� �� +������ G� *������� �F� )����� )*������� �+� 4��� A%� #��������� �� ���� 4+0����� ������� ���� ������� ��� ���%� 5 ��� ��� �� � � � ���5 �� ���%�� ������ ����� � 5 ���� # )�( �% -''-� �# 0&�7�&B'�

���� ����� �� � ����� ��� ������� �� ��� �� ������� � ���� ������������� �� ��L���� ��� � ����� � ��� ��������� �� �������� �������� ������� �� ������� � ������

-&� FJ*��5 (#� D������� F� H��� )� #������ #�� +�������� A� ��G���##� G������� F0 ���� �� �� �� ������ ����� � 5 ��� �����5 � �� �� ��� �������� � 3�" ���� * � � ����� -'''�#03B7�37&�

--� ��� +� �� D� ������� F+� H��� )� I��� /� )������ %��+���������%���� 4� G������� F0 ���� ��� � �,3�29 �� ������������ �� �� 3�" ��� �� ��� ��������� ��9 ����� � � � � �������� ��� ����� -'''� $ 0-.'�-.&�

-�� $���� �� "������� D� >����� )� /��� #� "��� >� $����� >�I����� >� #�5�� >� +���� A0��� ���� �� �� �������� ����� ��� ��� �� � ������ �� ���:�� �����%��� ;� �� � # ������ &,,.� $&$0-,B&&�-,B&B�

-B� F��N �� #� G����� 40 ����������� ����� �%���� �� � � ����� ��� � �� ��( ����+�� ��� �� &,,,� $==0&�&.3�

-7� *������ >4� *������ (%0 0: �� ���� ��� �� ������� �� ������:��? �� ��� �� �� �4� ��� ��� ,������� &,,.� $#0&�&�&�7�

�3 ����� ��� ��

����� �� � �� � ��������� -''�� ��0�&2�3 �����������������