Maestría en Nutrición HumanaUniversidad Autónoma de Querétaro

Tópicos selectos en nutrición y alimentación

Introducción

La investigación en materia de nutrición y

alimentación ha tenido grandes avances

en los últimos años, ya sea desde la

perspectiva de la investigación básica

como la aplicada.

A lo largo de 10 años de trabajo de la

Maestría en Nutrición Humana, esta es

una pequeña muestra de todo lo que se

venido realizando en la materia. La

generación de conocimiento nuevo así

como la solución a los problemas locales,

regionales y nacionales en materia de

a l imentac ión y nut r ic ión es par te

fundamental de los objetivos que la

Universidad Autónoma de Querétaro debe

cumpl i r mediante sus act iv idades

sustantivas: docencia, investigación y

extensión.

Finalmente, la consolidación de la Maestría

como un posgrado de calidad, es prueba

del trabajo que tesistas, profesores y

administrativos realizan día con día para

mantenerse en los más altos estándares

de calidad en materia educativa y de

i n v e s t i g a c i ó n , p r o m o v i e n d o e l

a p r o v e c h a m i e n t o d e r e c u r s o s

encaminados a la satisfacción de nuestros

tesistas, aspirantes y la comunidad en

general.

Dra.C.S. Juana Elizabeth Elton Puente

i

Directorio

© Maestría en Nutrición Humana, Universidad Autónoma de Querétaro

ii

Dr. Gilberto Herrera Ruiz

Rector

Dr. César García Ramírez

Secretario Académico

Dr. Irineo Torres Pacheco

Director de Investigación y Posgrado

Dra. Teresa García Gasca

Directora de la Facultad de Ciencias Naturales

Dra.C.S. Juana Elizabeth Elton Puente

Secretaria Académica de la Facultad de Ciencias Naturales

Dr. Germinal Jorge Cantó Alarcón

Jefe de Investigación y Posgrado de la Facultad de Ciencias Naturales

Dra. Miriam Aracely Anaya Loyola

Coordinadora de la Maestría en Nutrición Humana

El zinc y su relación con factores de riesgo de enfermedades crónico degenerativas en mujeres de una zona rural de Querétaro

1

T. Aguilar López, OP. García, MC. Caamaño, M. Camacho, D. Ronquillo, JL. Rosado.

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro.

tania121282@yahoo.com

3

Introducción

En México la obesidad es uno de los mayores problemas de

salud pública debido a su asociación con el desarrollo de en-

fermedades crónico degenerativas como la diabetes y las

enfermedades cardiovasculares, las cuales por su parte, re-

presentan las principales causas de muerte en el país. Méxi-

co actualmente enfrenta una etapa de transición nutricional

(FAO, 2008) en la que coexisten deficiencias de micronutri-

mentos con enfermedades crónico degenerativas (Cediel et

al, 2009). En cuanto a la obesidad y el sobrepeso, la preva-

lencia nacional ha alcanzado cifras nunca antes vistas, au-

mentando un 20% en menos de 10 años (Rivera-Domarco et

al, 2001; Olaiz et al, 2006).

El desequilibro en la ingestión de alimentos, el exceso de ca-

lorías en la dieta y la falta de actividad física hacen que se

establezca la obesidad y con ella, una serie de alteraciones

metabólicas que comprometen la función normal del adipoci-

to (Cabezas-Cerrato y Araujo Vilar, 2004). El tejido adiposo a

diferencia de lo que se había creído por muchos años, no es

solo un reservorio de energía sino que también funge como

órgano endócrino capaz de regular la función de muchas cé-

lulas (Zulet et al, 2007).

En la obesidad, la hipertrofia del tejido adiposo provoca una

alteración en la función del mismo, lo que induce la produc-

ción de citocinas. Muchas de éstas, tales como el factor de

necrosis tumoral alfa o la interleucina-6, tienen funciones im-

portantes en la activación de la respuesta inflamatoria, por lo

que a la obesidad se le ha considerado como una enferme-

dad inflamatoria de bajo grado (Zulet et al, 2007). Al mismo

tiempo la obesidad cruza por un estado de estrés oxidativo

continuo, consecuencia de los mismos procesos inflamato-

rios y la desregulación de éstos por deficiencias nutrimenta-

les (Prasad, 1991).

La deficiencia de nutrimentos es otro problema común en Mé-

xico a pesar de la gran prevalencia de obesidad

(Rivera-Dommarco et al, 2001). Se ha observado que es la

misma obesidad la que convella un estado de deficiencia de

nutrimentos, así como la deficiencia de nutrimentos podría

estar relacionada con la obesidad (Vincent et al, 2007).

En cuanto al zinc, la deficiencia se ha relacionado con una

disminución en la respuesta inmune, disminución en el creci-

miento y problemas cognitivos (Rosado et al, 1998), pero

también ha sido ampliamente observada en individuos obe-

sos y diabéticos, así como en personas con enfermedad vas-

cular (Shingh et al, 1997; Marreiro et al, 2004; Gracía et al,

2009).

El papel que juegan el estrés oxidativo y la inflamación en la

etiología de las enfermedades crónico degenerativas ha sido

ampliamente estudiado, así como su relación con la obesi-

dad (Soinio et al, 2007). La manera en la que el zinc podría

estar involucrado en estas patologías es compleja debido a

sus amplias propiedades biológicas.

El zinc posee actividad anitoxidante, al formar parte de una

serie de enzimas cuya función es combatir a los radicales

libres (Prasad, 1991); tiene funciones a nivel genético al for-

mar parte de muchos factores de transcripción y a su vez, al

formar parte de las moléculas denominadas dedos de zinc,

las cuales son esenciales en la unión del factor de transcrip-

ción al ADN; tiene funciones estructurales y de señalización

al formar parte de las membranas celulares; tiene efectos

antiinflamatorios al propiciar la inhibición en la transcripción

de citocinas pro-inflamatorias (Koropatnick y Zalups, 1997;

Zoli et al, 1998; Costarelli, 2009); tiene funciones en la estabi-

lización de moléculas como la insulina y en la producción de

adipocitocinas como la leptina (Mantzoros, 1998; Chausmer,

1998). Esto significa que el zinc parece estar involucrado en

casi todos los procesos de regulación del organismo, por lo

que es de gran interés conocer de que forma la deficiencia

de este nutrimento podría estar contribuyendo al desarrollo

de la obesidad y de sus co-morbilidades. El objetivo de este

estudio fue determinar la asociación entre las concentracio-

nes de zinc en plasma con factores de riesgo de enfermeda-

des crónico degenerativas.

Materiales y métodos

Se llevó a cabo un estudio transversal en una población de

580 mujeres adultas con una edad promedio de 37±7.5 años

pertenecientes a 7 comunidades rurales del Estado de Queré-

taro (El Blanco, San Ildefonso, San Vicente, Purísima de Cu-

bos, La Esperanza, La Peñuela y México Lindo). El estudio

fue aprobado por el Comité Interno de Investigación en Hu-

manos de la Facultad de Ciencias Naturales, en la Universi-

dad Autónoma de Querétaro.

Todas las participantes fueron citadas en las escuelas o cen-

tros de salud para transportarlas a la Unidad Metabólica de

4

la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autóno-

ma de Querétaro donde se realizaron las evaluaciones de

antropometría y composición corporal.

Evaluación Antropométrica: todas las mujeres fueron pesa-

das en ropa ligera y sin zapatos, utilizando una báscula (SE-

CA ONDA, Mod 843). La talla se determinó midiendo a la par-

ticipantes descalzas utilizando un estadiómetro portátil (SE-

CA Mod 206) con una precisión de 0.1 cm. El índice de masa

corporal (IMC) se determinó dividiendo el peso corporal (en

kilogramos) entre el cuadrado de la talla (en metros). Se con-

sideró obesidad cuando el IMC era mayor o igual a 30, sobre-

peso con IMC entre 25–29.9 y adecuado menor a 25 (WHO,

2003).

La circunferencia de cintura y cadera se midieron con una

precisión de 0.1 cm utilizando cintas flexibles (SECA Modelo

200). La cintura se midió alrededor del abdomen sobre el

punto medio identificado entre el borde inferior de la última

costilla y el borde superior de la cresta iliaca. Para medir la

circunferencia de cadera, el evaluador realizó la medición en

cuclillas junto a la participante y colocaba la cinta métrica al-

rededor de parte más prominente de los glúteos. Todas las

medidas antropométricas se tomaron por duplicado por nu-

triólogas previamente estandarizadas (Lohman, 1988).

Composición corporal: la determinación de composición cor-

poral se realizó por medio de absorciometría dual de rayos X

(DEXA) (Hologic Mod Explorer). A todas las mujeres se les

practicó una prueba de embarazo antes de realizar esta medi-

ción. Se consideró como normal un porcentaje de grasa me-

nor de 25, riesgo moderado de 25 a 30, y riesgo alto un por-

centaje mayor a 30 (WHO, 2000).

Consumo de zinc: a partir de una submuestra de 80 mujeres

se determinó el consumo de zinc a través de 3 recordatorios

de 24 horas, dos entre semana y uno de fin de semana. Se

estimó el consumo de zinc utilizando las tablas de composi-

ción de alimentos del Instituto Nacional de Ciencias Médicas

y Nutrición Salvador Zubirán y del Departamento de Agricultu-

ra de los Estados Unidos (USDA). Las determinaciones dieté-

ticas fueron realizadas por nutriólogas estandarizadas en la

aplicación de cuestionarios y recordatorios.

Evaluación bioquímica: se tomaron muestras sanguíneas en

ayunas a cada una de las participantes en las clínicas de sa-

lud de cada comunidad. Los análisis bioquímicos incluyeron

perfil de lípidos, concentración de glucosa, proteína C reac-

tiva (CRP), interleucina 1β, interleucina 6, interleucina 10,

interleucina 8, interleucina 12p70, factor de necrosis tumoral

alfa (TNF-α), leptina y zinc en plasma. Todas las muestras se

analizaron por duplicado en el Laboratorio de Nutrición Huma-

na de la Facultad de Ciencias Naturales.

Perfil lípidico: se determinaron triglicéridos, colesterol total y

lipoproteínas de alta densidad utilizando un kit comercial (Se-

ra–Pak Kit Bayer Diagnostics, Francia) en un analizador Ba-

yer RA-50. Las lipoproteínas de baja densidad se calcularon

a partir de las determinaciones anteriores utilizando la fórmu-

la de Friedewald (Eblen-Zajjur, 2001) y utilizando los puntos

de corte de la American Heart Association (2009). Glucosa

en sangre: se midió mediante el método enzimático colorimé-

trico (GOD – PAP Method, Human Diagnostic, Alemania) y

se utilizaron los puntos de corte para determinar glucosa de

riesgo en ayuno de la Norma Oficial Mexicana NOM-015-

SSA2-1994. Leptina: la concentración de leptina en plasma

se determinó por medio de un kit comercial utilizando la técni-

ca de ELISA (Linco Research, St Charles, MO) en un lector

de ELISA Thermo Multiskan Ascent. Proteína C reactiva: se

llevó a cabo mediante un kit comercial utilizando ELISA

(Linco Research, St Charles, MO). Interleucinas y factor de

necrosis tumoral: se llevó a cabo mediante citometría de flujo

utilizando un kit de inflamación humana (BD Biosciences,

San Jose, CA) en un citometro de flujo FACC Scan. Zinc en

plasma: las concentraciones se midieron por duplicado medi-

ante espectrofotometría de absorción atómica utilizando un

espectrofotómetro Perkin-Elmer (Modelo AAnalyst 7000).

Análisis estadístico: se realizaron análisis descriptivos de to-

das las variables continuas y tablas de frecuencias de las va-

riables categóricas de todas las participantes. Se realizó un

análisis de correlación de Pearson para identificar asociacio-

nes entre las siguientes variables: perfil de lípidos, glucosa,

leptina, CRP, interleucinas, porcentaje de grasa y adiposidad

central. También se realizaron análisis de regresión lineal pa-

ra evaluar el efecto de las concentraciones de zinc en plas-

ma en las variables dependientes mencionadas. En los análi-

sis de varianza y de regresión lineal, se procuró la normali-

dad de las variables, transformando mediante logaritmo natu-

ral o raíz cuadrada las variables que no cumplieran con el

supuesto de normalidad para CRP y leptina. Debido a que

las variables de interleucinas no tienen una distribución nor-

mal se transformaron en variables categóricas de la siguiente

manera: las variables categóricas creadas se incluyeron en

5

los modelos de regresión multinomial en donde la variable

dependiente fue cada una de las interleucinas y las indepen-

dientes las concentraciones de zinc y edad como variable de

control. También se realizaron tablas cruzadas de las varia-

bles de interleucinas con la variable categórica de deficientes

y no deficientes de zinc para obtener la prueba de Chi cua-

drara y cálculo de la razón de momios. Todos los análisis se

realizaron utilizando el paquete estadístico SPPS versión

15.0 para Windows.

Resultados

Características de la población

La edad promedio de las 580 mujeres fue de 37 años. La ma-

yoría de la población presentó sobrepeso u obesidad y un

porcentaje de grasa corporal de alto riesgo. La prevalencia

de sobrepeso fue de 36.4% y la de obesidad de 44%, lo que

significa que 8 de cada 10 mujeres de esta zona rural presen-

tan riesgo de enfermedades crónico degenerativas debido al

sobrepeso y obesidad (Figura 1).

En relación al porcentaje de grasa, el promedio fue de

37.85% y solo el 3.6% de la población presentó un porcenta-

je de grasa adecuado por debajo del 30%. Lo anterior signifi-

ca que el 96.4% de las mujeres de esta población tienen un

riesgo elevado de enfermedades crónico degenerativas co-

mo diabetes y enfermedad cardiovascular debido al exceso

de grasa corporal (Figura 2).

Figura 1. Prevalencia de sobrepeso y obesidad según el

IMC en la población de mujeres (n=580).

Figura 2. Porcentaje de grasa de las mujeres del estudio

(n=576)

Figura 3. Perfil de lípidos de mujeres de zona rural (n=549).

Perfil de Lípidos

El perfil de lípidos muestra que esta población padece un pro-

blema de hipertrigliceridemia con una prevalencia del 58% y

una baja concentración de lipoproteínas de alta densidad

(HDL) con una prevalencia del 60%. El 80% de las mujeres

tuvieron niveles de colesterol por debajo de los 200 mg/dL,

un 14% valores entre 200 y 240 mg/dL y solo un 5% por arri-

ba de 240 mg/dL. Mientras que el 20% de las mujeres tuvie-

ron niveles de riesgo de LDL por arriba de los 130 mg/dL (Fi-

gura 3).

6

Zinc en plasma y consumo de zinc

Las concentraciones zinc en plasma fueron adecuadas para

el 82.42 % de la población mientras que un 17.58 % tuvo con-

centraciones bajas de zinc (Figura 4). No se observó diferen-

cia entre las concentraciones de zinc en plasma en las muje-

res con peso normal, sobrepeso u obesidad.

En cuanto al consumo, se evaluó si había diferencia en el

consumo entre las mujeres con peso normal, sobrepeso u

obesidad. En promedio el consumo fue de 5.09 ± 3.34 mg al

día, lo que representa entre el 46.3 y el 30.4% del porcentaje

de adecuación para zinc. No hubo diferencias significativas

entre grupos.

Citocinas y su relación con el zinc en plasma

Entre el 58.7 y el 69.3% de la población estudiada se encon-

tró en un nivel adecuado de marcadores de inflamación. En-

tre el 15.5 y el 20.5% se encontraron con concentraciones de

citocinas relacionadas a inflamación sistémica de bajo grado.

Se realizó una regresión lineal para encontrar la asociación

entre las variables dependientes y las concentraciones de

zinc en plasma. De todas las variables, se encontró una aso-

ciación positiva significativa de la concentración de zinc con

en el índice cintura-cadera, la glucosa en ayunas, el coleste-

rol total, triglicéridos y colesterol LDL. Lo anterior significa

que a mayores concentraciones de zinc en plasma mayor

índice cintura-cadera, glucosa, triglicéridos, colesterol LDL y

colesterol total.

Figura 4. Distribución porcentual de zinc en plasma en muje-

res de zona rural (N=558).

Se realizaron razones de momios para establecer el riesgo

de presentar niveles altos de interleucinas y TNF-α en rela-

ción a las concentraciones de zinc en plasma. Se encontró

que a mayores concentraciones de zinc en plasma existe un

efecto protector significativo con niveles bajos de interleuci-

nas y TNF-α. La única interlecuina donde no se observa este

efecto es en la interleucina-10 la cual es una citocina antiinfla-

matoria (Tabla 1).

Tabla 1. Razón de Momios entre zinc en plasma y citocinas

(n=380) ajustado por edad.

Asociación entre niveles de inflamación y zinc en plasma

Se realizó una prueba de Chi cuadrada para comparar las

proporciones entre la población deficiente de zinc y la no defi-

ciente de acuerdo a sus concentraciones de interleucinas y

TNF-α. En todos los casos las concentraciones de bajo gra-

do de interleucinas y TNF-α fueron menores en las mujeres

que tienen un estado de zinc adecuado; en todos los casos

la asociación fue significativa (En las Figuras 6 y 7 se mues-

tran la Il-6 y TNF-α). Los niveles altos de interleucinas y TNF-

α en ambos grupos, deficientes y no deficientes, se pueden

deber a una serie de factores independientes al estado nutri-

cio de zinc, como puede ser un estado infeccioso o inflamato-

rio de diferente etiología.

7

Figura 6. Comparación entre deficientes de zinc y no defi-

cientes de acuerdo a sus concentraciones de interleuci-

na 6 (Chi cuadrada = 0.006)

Figura 7. Comparación entre deficientes de zinc y no defi-

cientes de acuerdo a sus concentraciones de TNF-α (Chi

cuadrada = 0.000*)

Discusión

Las mujeres de ésta población se caracterizaron por ser obe-

sas en su mayoría. La prevalencia de obesidad y sobrepeso

fue un 10% mayor a la media nacional del 70%, según la EN-

SANUT del 2006 (Olaiz-Fernández, 2006). También es de

llamar la atención el porcentaje de grasa de las mujeres estu-

diadas ya que se sabe que un exceso de grasa, específica-

mente grasa abdominal, se relaciona con una mayor inciden-

cia de enfermedades crónico degenerativas (Cabezas-Cerra-

to y Araujo-Vilar, 2004). En este caso, el hecho de que el

90% de las mujeres tuvieran un porcentaje de grasa corporal

mayor al 30% las predispone a tener alteraciones metabóli-

cas tales como diabetes y enfermedades cardiovasculares.

En cuanto al perfil lipídico es importante recalcar que la pre-

valencia de hipertrigliceridemia es la de mayor proporción, ya

que el 60% de las mujeres del estudio tuvieron niveles por

arriba de lo normal. La prevalencia nacional se mantiene en

35% para la población en general, lo que indica que el proble-

ma de hipertrigliceridemia en esta población es casi el doble

(Martinez-Hernandez y Chávez- Aguirre, 2007). Las bajas

concentraciones de HDL también representan un riesgo im-

portante para la salud de estas mujeres; el 58% tiene niveles

por debajo de lo normal, mientras que los niveles de LDL so-

lo en un 12.3% de las mujeres se encontraron por arriba de

los niveles recomendables. En esta población, a pesar de

que el 80% presentó niveles de colesterol total adecuados,

sus niveles de HDL, TG y LDL elevan su riesgo que tienen

de padecer alguna enfermedad crónico-degenerativa.

En relación al perfil lipídico, algunos estudios han demostra-

do que el zinc puede tener efecto sobre el aumento de algu-

nos valores (Hooper et al, 1980; Black et al, 1988), mientras

que otros no han observado ningún cambio en el perfil lipídi-

co incluso suplementando con el mineral (Viegas- Crespo et

al, 2000). En el presente estudio, se observó una correlación

entre las mayores concentraciones de TG, LDL y colesterol y

los niveles adecuados de zinc. Sin embargo la correlación

positiva entre estas variables, a pesar de ser estadísticamen-

te significativa, desde el aspecto fisiológico no existe una sig-

nificancia clínica real. Esto es porque por cada 100 µg/dL de

zinc en plasma que se eleve en sangre, los valores de coles-

terol aumentan en 12.520 mg/dL en promedio, mientras que

los niveles de triglicéridos aumentan 13.501 mg/dL y los de

LDL 8.847 mg/dL en promedio. Teniendo en cuenta que el

promedio de zinc en plasma es de 124.10 µg/dL ± 69.55 (me-

dia ± DE), la elevación de 100 µg/dL de zinc en plasma es

muy grande y quiere decir que entre tener un nivel deficiente

o marginal a tener un nivel adecuado incluso por arriba del

promedio, eleva en menos de 20 mg/dL estos valores lipídi-

cos. Lo mismo sucede para las correlaciones positivas obser-

vadas entre el índice cintura-cadera y glucosa en sangre don-

de por cada 100 µg/dL de zinc que se aumente, los valores

se elevan 0.017 y 0.038 mg/dL respectivamente para cada

variable.

8

Por otro lado, es importante recordar que el zinc juega un

papel importante como antioxidante e impide la oxidación de

lipoproteínas responsables de la génesis de la enfermedad

ateroesclerótica (Prasad, 1991); la mayoría de las mujeres

estudiadas presentaron concentraciones adecuadas de zinc

por lo que podrían tener un estado antioxidante adecuado

que las proteja de la acción ateroesclerótica ocasionada por

los niveles de lípidos en sangre y la distribución de la grasa

corporal.

En relación a la concentración sanguínea de glucosa, tenien-

do en cuenta como punto de corte 126 mg/dL en ayunas, nin-

guna de las mujeres tuvo valores por arriba de lo normal. Es

importante señalar éste dato ya que estas mujeres al tener

en su mayoría porcentajes de grasa por arriba de lo normal

no están desarrollando, por ahora, hiperglucemia. Sin embar-

go, cabría la posibilidad de que las mujeres tuvieran resisten-

cia a la insulina y por lo tanto tener un mayor riesgo de diabe-

tes. En el presente estudio no se midió resistencia a la insuli-

na por lo que sería importante estudiar si ésta población, con

una alta prevalencia de obesidad, alto porcentaje de grasa

corporal y glucosa en ayunas adecuada, presenta resistencia

a la insulina. En relación al zinc, se sabe que este nutrimento

es capaz de regular la producción de insulina al ser un metal

indispensable en la formación de la estructura de la hormona

(Chausmer, 1998), así como regular la interacción entre el

receptor de insulina y su sustrato (Marreiro et al, 2004). Co-

mo se ha visto en diferentes estudios, concentraciones ade-

cuadas de zinc se relaciona con una menor prevalencia de

alteraciones en el metabolismo de carbohidratos y la resisten-

cia a la insulina, lo cual podría estar sucediendo en esta po-

blación (Chen et al, 1998).

Aproximadamente un 20% de las mujeres estudiadas presen-

taron una deficiencia de zinc. Esta prevalencia se encuentra

por debajo de lo reportado para la media nacional que es de

29.7% en mujeres en edad reproductiva (Rosado, 2005). La

deficiencia de zinc se puede deber al bajo consumo encontra-

do en los recordatorios de 24 horas, donde se pudo observar

que en promedio el consumo de zinc representa aproximada-

mente el 50% del porcentaje de adecuación. Esto es debido

en general al bajo consumo de fuentes de zinc como son la

carne roja, el pescado, las oleaginosas y las leguminosas.

Adicionalmente, la biodisponibilidad de zinc de dietas con

alto contenido de fitatos, como es la dieta de las mujeres de

esta población, disminuye drásticamente. Se ha observado

que dietas con alto contenido de fitatos disminuyen la absor-

ción de zinc al formar compuestos que inhiben su absorción

(Rosado, 1998), por lo que la absorción de este mineral po-

dría ser menor al consumo.

Los factores que podrían jugar un papel importante en la pre-

sencia de obesidad en esta población podrían ser, en su ma-

yoría, factores nutricionales: exceso en la ingestión calórica y

deficiencia en la ingestión de micronutrimentos (Cabezas-Ce-

rrato y Araujo-Vilar, 2004). La literatura nos dice que las con-

centraciones en general de micronutrimentos en obesos sue-

len ser bajas (García et al, 2009), incluyendo al zinc. En el

presente estudio, no se encontró ninguna diferencia significa-

tiva en el consumo de zinc entre las mujeres con sobrepeso

y obesidad y las mujeres con peso adecuado. Hasta el mo-

mento, poco se conoce del efecto que tiene el zinc en la pre-

sencia de obesidad y existen solo un par de estudios que lo

señalan (Di Martino et al, 1993; Chen et al, 1997).

En cuanto a los indicadores de inflamación, se observó que

un estado nutricio de zinc adecuado favorece los niveles ba-

jos de interleucinas y TNF-α. Esto se puede deber a la capa-

cidad del zinc de inhibir la fosforilación de el inhibidor de NF-

κB, lo que impide la translocación de éste y la subsecuente

transcripción de interleucinas proinflamatorias (Prasad et al,

2001; Vasto et al, 2006). Al comparar las mujeres deficientes

y las no deficientes en cuanto a sus concentraciones de inter-

leucinas proinflamatorias, se observó que el estado nutricio

de zinc se relacionaba con una proporción mayor de niveles

de bajo riesgo de interleucinas y TNF-α. En relación al riesgo

de enfermedad cardiovascular, no se observó ninguna rela-

ción con uno de los marcadores de riesgo de esta enferme-

dad más utilizados, la proteína C reactiva. Sin embargo, el

hecho de observar niveles bajos de todas las demás interleu-

cinas y ver como el zinc se asocia con la presencia de valo-

res de citocinas inflamatorias bajas podría resultar en una

subsecuente regulación en las concentraciones de CRP, ya

que es justamente la IL-6 la responsable de la producción de

la proteína de fase agua en el hígado (Calabro y Yeh, 2007).

En el estudio de Costarelli y col. (2009) encontró que había

una relación muy estrecha entre el estado nutricio de zinc y

la obesidad. En este caso los sujetos con una menor inges-

tión de zinc tuvieron un estado inflamatorio más exacerbado,

un perfil lipídico alterado y un aumento en la producción de

insulina en relación a sujetos obesos pero con una ingestión

adecuada.

9

Otro estudio donde se evaluó el estado nutricio en relación al

zinc a través de la cantidad del mineral en uñas se encontró

que las concentraciones de este nutrimento estaban inversa-

mente relacionadas con las concentraciones circulantes de

IL-6, IL-18 y TNF-α, en sangre en sujetos jóvenes sanos (Pu-

chau et al, 2010), lo que reafirma que en el presente estudio

un adecuado estado nutricio en zinc se relaciona con meno-

res concentraciones de interleucinas y menor inflamación sis-

témica de bajo grado y un menor riesgo de desarrollar enfer-

medades crónico degenerativas.

Conclusión

Los resultados de este estudio muestran que la población de

estas zonas rurales del estado de Querétaro presenta en su

mayoría sobrepeso u obesidad, incluso por arriba de la me-

dia nacional. Esto junto con los elevados porcentajes de gra-

sa, indicarían un riesgo elevado de enfermedades crónicas

relacionadas con un estado proinflamatorio y un estado oxida-

tivo continuo. Sin embargo, dentro de las alteraciones meta-

bólicas que comúnmente se asocian a la obesidad, como

son la hipercolesterolemia, la hipertrigliceridemia, las altera-

ciones en el metabolismo de carbohidratos, aumento en los

marcadores de inflamación (CRP, interleucinas y TNF-α), en

esta población solo se observó una alteración en los niveles

de triglicéridos y de colestrol HDL. El hecho de que las con-

centraciones de zinc se relacionaran con niveles más bajos

de interleucinas y factor de necrosis tumoral alfa, indica que

este nutrimento está inhibiendo la producción de estas citoci-

nas, posiblemente mediante la inhibición de NF-κB. Al prote-

ger contra inflamación sistémica de bajo grado, el zinc posi-

blemente esté contribuyendo a disminuir la aparición de co-

morbilidades asociadas a la obesidad. El zinc en esta pobla-

ción parece ofrecer un efecto protector contra algunos de los

factores de riesgo asociados a las enfermedades crónico-de-

generativas a través de la regulación del estado proinflamato-

rio.

Referencias

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plements and serum lipids in young adult white males. Am J

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Estudio del perfil proteínico de fórmulas infantiles de inicio comercializadas en México

2

B. Alvarez Nieves, M. Duarte Vázquez, JL. Rosado, C. Regalado González, B. García Almendárez

Maestría en Humana, Facultad de Ciencias Naturales

Universidad Autónoma de Querétaro

blanca.erika.alvarez@gmail.com

13

Introducción

La Organización Mundial de la Salud (2014), recomienda a la LM como el alimento ideal para el crecimiento y el desarrollo de los infantes, ya que aporta la energía y los nutrientes necesarios durante los primeros meses de vida. Sin embargo, el consumo de FI se ha incrementado, debido a que las madres han optado por alternativas de alimentación que se ajus-ten a su estilo de vida. En México, cerca del 70% de los bebés menores a seis meses son alimentados parcial o exclusivamente con algún tipo de FI (ENSANUT, 2012).

La LV y/o algún componente de esta, son la base de la mayoría de las FI. No obstante, la LV difiere de la LM en cuanto al contenido y composi-ción de proteínas. La concentración de proteína de la LV es casi el triple que la de la LM, siendo de 2.9 g/100ml en la primera (O’Mahony y Fox, 2013 ) y de 0.8 a 0.9 g/100 ml en la segunda (Lönnerdal, 1976). Además, existen diferencias en cuanto a la relación de proteínas séricas: caseína, ya que la LM madura contiene 60% de proteínas séricas y 40% de caseí-na (Lönnerdal, 2003), a diferencia de la LV, en la que predomina la caseí-na (80%) y el resto se compone de proteínas séricas. Para asemejarse a la LM, las FI son elaboradas a partir de la adición de concentrado de pro-teínas séricas a leche descremada para hacer la razón proteínas séricas: caseína similar a la de la leche materna (Lönnerdal y Lien, 2003). Sin embargo, aun así existe diferencia entre las FI y la LM ya que la concen-tración de ALA, proteína predominante en el suero de la leche humana, es relativamente menor en las FI, mientras que la BLG, proteína no en-contrada en la leche humana, es la predominante en el suero bovino y por tanto se encuentra en concentraciones elevadas en las FI. Debido a estas diferencias en el perfil proteínico de la LM y las FI, los perfiles de aminoácidos también son diferentes, ya que algunos aminoácidos como el triptófano y la cisteína son limitantes en leche de vaca, que es la fuente principal de proteína de las FI, encontrándose aproximadamente a la mi-tad del contenido de estos aminoácidos en la leche materna.

Por lo que la concentración de proteína en las FI debe ser incrementada para compensar las diferencias (Lien, 2003).

Actualmente, no existen estudios en México, que evalúen el perfil proteíni-co de FI de inicio. Dado que el consumo de éstas va en aumento, es im-portante estudiar a las proteínas presentes en ellas ya que son de impor-tancia nutricia y fisiológica. El objetivo de este estudio fue evaluar el perfil proteínico de FI de inicio comercializadas en México y compararlo con el de LM y LV.

Materiales y métodos

Reactivos y muestras

Se utilizó acrilamida (99% pureza), N’N’-bis-metileno-acrilamida (99% pureza), persulfato de amonio, tris Base (> 99.8% pureza) tetrametiletilen-diamina, glicina, glicerol, 2-mercaptoetanol (> 98% pureza), dodecil sulfa-to de sodio, urea, α-lactoalbúmina bovina (85%), β-lactoglobulina bovina (90%), lactoferrina bovina (85%), seroalbúmina bovina, ácido L-cisteico, L-norleucina, la termolisina y el metil metanosulfonato de Sigma (St. Louis MO, EUA). El azul de Coomassie G-250 se obtuvo de Serva (Hei-delberg, Alemania). Metanol, ácido acético glacial, ácido fosfórico (85%), etanol (96%), acetonitrilo (grado HPLC), ácido trifluoroacético (grado

HPLC), ácido clorhídrico (37%), ácido fórmico, peróxido de hidrógeno (30%), grado reactivo analítico suministrados por J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, EUA). Se utilizó un marcador de peso molecular de bajo rango Bio Rad® (Hercules, CA, EUA).

Se obtuvo LM madura de cinco mujeres en etapa de lactancia del primer semestre postparto. Se obtuvo una muestra de LV Holstein. Se adquirie-ron en el mercado mexicano cinco muestras de lotes diferentes de cuatro FI de inicio (n=4, FI de 1 a 4). Las FI analizadas se caracterizaron por ser: elaboradas a base de leche de vaca y/o alguno de sus componentes; FI de inicio, destinadas para la alimentación de bebés durante los prime-ros seis meses de vida y se encontraban dentro de las FI más vendidas en el mercado mexicano en el año 2013 de acuerdo a IMS en valores. Se analizó también una muestra de una FI recientemente lanzada al merca-do. Las leches y FI se descremaron por medio de centrifugación a 3756 g, 4°C durante 15 min y fueron almacenadas a -20°C hasta el momento de su uso.

Determinación de proteína de total

Se determinó la concentración de proteína total de las FI de inicio analiza-das mediante el ensayo de Bradford (1976), así como todas las medicio-nes de proteína en este estudio. Además, se determinó la concentración de caseína en las FI para calcular la relación proteínas séricas:caseína. Se precipitó la caseína de las FI descremadas por medio de la adición de ácido acético 1 N, y la caseína obtenida se centrifugó a 3756 g durante 15 min para separarla del suero. Se realizaron dos lavados con ácido acético 1 N. El pellet de caseína se disolvió con agua a pH 11.

Determinación del perfil de aminoácidos

Se determinó el perfil de aminoácidos de la LM y las FI por medio de cro-matografía de intercambio iónico. Las muestras se sometieron a oxida-ción en baño de hielo a 0°C durante 16 h y posteriormente se hidroliza-ron. Al hidrolizado se le adicionó el estándar interno, se filtró y se sometió a cromatografía de intercambio iónico, usando un cromatógrafo de líqui-dos de alta resolución.

Determinación de proteínas séricas: ALA, BLG y LF

Se llevó a cabo la electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y reductora (SDS-PAGE), para identificar las proteínas ALA, BLG y LF en FI (n=4, FI 1 a FI 4) y en LM y LV. Las muestras fueron mezcladas con el amortiguador de muestra (2x) y calentadas a ebullición durante 4 min. Se inyectaron 30µg de proteína en cada pozo. Los estándares de las proteí-nas séricas se prepararon a una concentración de 1.9 µg/ml. Se mezcla-ron con el amortiguador de muestra y se inyectaron 4.5µg de proteína. Los geles consistieron en 4%T el concentrador y 15%T el separador, don-de, T representa el porcentaje en peso del monómero total empleado (acrilamida + bis-acrilamida en gramos/100 mL). Se efectuó la separa-ción electroforética usando una cámara vertical SE 280 Hoefer (Scientific Instruments) a 10 mV en el gel concentrador, aumentando a 15 mV en el gel separador. Los geles se tiñeron con Coomassie azul brillante G250. La densidad de las bandas de proteína se determinaron mediante el foto-documentador AlphaImager® HP System (Protein Simple, Santa Clara, CA, EUA). La determinación cuantitativa de las bandas se realizó con el Software “Alphaview” mediante la integración del área bajo la curva de los picos de cada banda.

14

Resultados y discusión

Concentración de proteína total de LM Y FI

En todas las FI evaluadas, la concentración de proteína total (de 1.11 a 1.34 g/100 ml), fue mayor

a la de la LM (0.95±0.04 g/100 ml) (Cuadro 1). Esto se debe a que, para compensar las diferencias de aminoácidos esenciales entre la LM y las FI, éstas tienen una concentración de proteína mayor a la LM. Algunos aminoácidos como el triptófano y la cisteína son limitantes en la LV, que es la fuente principal de proteína de las FI, encontrándose aproximada-mente a la mitad del contenido de éstos aminoácidos en la leche materna (Lien, 2003).

Cuadro 1. Concentración de proteína total por ensayo estándar de Bradford en FI de inicioMedia± desviación estándar

Perfil de aminoácidos de LM Y FI

A pesar de estas modificaciones en la concentración de proteína, el perfil de aminoácidos de las FI evaluadas fue diferente al de la leche materna (ver Cuadro 2). El triptófano se encontró en mayor concentración en la leche materna que en las FI. Los aminoácidos esenciales como cisteína, histidina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina se encontraron en con-centraciones similares o mayores que en la leche materna. Con ello se estaría asegurando que se cubren los requerimientos de estos aminoáci-dos que son importantes para el adecuado crecimiento y para funciones fisiológicas específicas. El triptófano se encontró en mayor concentración en la FI 1 y la FI 2 que en la FI 3 y la FI 4, lo cual se explica ya que son fórmulas enriquecidas con ALA, proteína rica en este aminoácido. La le-che materna presentó concentraciones de aminoácidos ramificados (leuci-na, isoleucina y valina), mayores a las de algunas FI. Sin embargo, el consumo de estos aminoácidos por los bebés alimentados con FI es ma-yor, debido a que las FI tienen una mayor concentración de proteína. Es necesario realizar más estudios para confirmar estos hallazgos.

Cuadro 2. Perfil de aminoácidos de leche materna y FI de inicioMedia± desviación estándar

Una vez que se confirmen los estudios con un mayor número de mues-tras, esto podría relacionarse con las concentraciones mayores de insuli-na sérica observadas en bebés alimentados con FI (Ginsburg et al., 1984; Zetterström et al., 1985; Socha et al., 2011), debido a que estos aminoácidos son gluconeogénicos y estimuladores fisiológicos de la se-creción de insulina. Las consecuencias a largo plazo de esta hiperinsuli-nemia temprana aún no se han estudiado con detalle, pero podría ser posible que se relacionara con un mayor riesgo de desarrollar diabetes y obesidad en bebés alimentados con fórmulas infantiles (Lönnerdal, 2014).

El mayor consumo de proteína en los bebés alimentados con FI podría tener implicaciones a la salud. Esto, se ha manifestado en concentracio-nes significativamente más altas de aminoácidos séricos y nitrógeno urei-co en los bebés alimentados con FI, que los amamantados con leche materna (Tikanoja y Simell, 1983; Räiha et al., 2008; Trabulsi et al., 2011). Lo cual, ha sido considerado como una fuente potencial de “estrés metabólico” en tejidos como el hígado y los riñones que aún se están desarrollando en el bebé (Räihä y Axelsson, 1995); ya que al haber una mayor concentración de proteína, aumenta la carga renal de solutos que deben ser excretados por el riñón, entre ellos los productos finales del metabolismo, predominantemente el exceso de nitrógeno.

Se ha sugerido también, que un alto consumo de proteína podría ser un factor de riesgo para desarrollar obesidad futura, ya que los bebés alimen-tados con FI ganan más peso de los 3 a 6 meses que los amamantados al seno materno (Baird et al., 2005; Owen et al., 2005). Socha et al. (2011) realizaron un estudio en el que examinaron la influencia del consu-mo de proteínas en la infancia en la concentración de aminoácidos séri-cos, insulina y el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1, por sus siglas en inglés) y la posible relación de éstos con el crecimiento durante los primeros dos años de vida. Concluyeron, que un alto consumo de proteína estimula la liberación del factor de crecimiento insulínico tipo 1 y

15

Fórmula infantil Concentración declarada de proteína (g/100 ml)

Concentración determinada de proteína

(g/100 ml)

FI 1 1.47 1.26 + 0.22

FI 2 1.32 1.34 + 0.29

FI 3 1.67 1.13 + 0.18

FI 4 1.36 1.11 + 0.21

AAConcentración (g aminoácido/100g proteína)Concentración (g aminoácido/100g proteína)Concentración (g aminoácido/100g proteína)Concentración (g aminoácido/100g proteína)Concentración (g aminoácido/100g proteína)

AALM FI 1 FI 2 FI 3 FI 4

Asp 8.78 10.8 10.25 9.18 10.02Glu 17.07 17.4 17.45 19.29 17.86Ala 3.90 3.49 3.42 4.13 3.40Arg 3.41 2.55 2.95 2.78 3.21Cys 1.95 2.55 2.22 1.68 1.98

Gly 2.44 2.27 2.31 1.94 2.17His 2.44 2.27 2.40 2.19 2.36Ile 5.37 5.57 5.08 5.64 5.10Leu 10.73 10.8 9.70 10.03 10.02Lys 6.83 8.50 8.03 7.58 8.13Met 1.46 1.89 1.75 2.19 1.98Phe 3.41 3.78 4.25 3.79 4.16Pro 10.24 6.33 7.20 7.58 6.81Ser 4.39 5.00 5.45 5.14 5.58Thr 4.39 5.67 5.54 5.81 5.48Tyr 4.88 4.06 4.62 3.96 4.73Val 6.34 5.19 5.45 5.64 5.29Try 1.95 2.08 1.94 1.43 1.70

de insulina en la infancia. Las concentraciones del factor de crecimiento insulínico tipo 1 se asociaron con el aumento de peso, reflejado en un incremento del peso para la estatura y del índice de masa corporal, duran-te los primeros 6 meses de vida.

Relación de proteínas séricas:caseína en FI

Por lo que respecta a la relación de proteínas del suero:caseína, todas las FI evaluadas presentaron un relación similar a la de la leche materna (60:40), por lo que se puede decir que son fórmulas suero dominantes (Cuadro 3). Como se esperaba, la FI 1 y la FI 2 tuvieron mayor porcenta-je de proteínas séricas, debido a que la FI 1 está elaborada con suero disminuido en BLG y en el caso de la FI 2 está enriquecida con ALA por lo que el porcentaje de estas proteínas se ve incrementado. Sin embar-go, una relación suero:caseína similar a la de la leche materna, no es suficiente para demostrar semejanza con ésta. Es preciso evaluar las proteínas que componen al suero, por los posibles riesgos a la salud que se podrían presentar dada su composición. Por esta razón, se identifica-ron proteínas séricas específicas.

Cuadro 3. Relación de proteínas séricas: caseína en fórmulas infantiles de inicio

Media± desviación estándar

Identificación de ALA, BLG y LF en FI de inicio, LM y LV

Se analizaron cinco lotes de producción de tres FI (FI 2, FI 3, FI 4), y una muestra de la FI 1, debido a que es una fórmula nueva en el mercado mexicano.

A continuación se presentan electroforegramas representativos de los lotes de cada FI, la LM y LV. Se realizó análisis densitométrico de las ban-das y se obtuvo de acuerdo a su intensidad, el porcentaje de cada una de las proteínas de interés. Se calculó el promedio y la desviación están-dar entre lotes. Por lo tanto, los porcentajes de las proteínas séricas eva-luadas, que se muestran a continuación, corresponden al promedio de los cinco lotes.

En la LM, la ALA se encontró en un 33.4 ± 1.51% de la proteína total. El porcentaje obtenido en la LM concuerda con lo reportado por Lönnerdal (2003), quien encontró un rango de 2 a 3 g/L de ALA, que representa el 22-33% de la proteína total. La leche de vaca presentó un porcentaje de ALA del 13.6 ± 0.3% de la proteína total. En este caso, para leche de va-

ca se ha reportado que esta proteína se encuentra entre un 2 a un 5% de la proteína total (Lönnerdal, 2003); sin embargo, su concentración puede sufrir variaciones por factores diversos como el número de crías, el mes del año, la etapa de lactancia, el recuento de células somáticas, el conte-nido de grasa, el rendimiento de la leche y el fenotipo de la vaca para las proteínas de la leche (Ng-Kwai-Hang et al., 1987). Las concentraciones de ALA en las muestras de LM, LV y FI fueron significativamente diferen-tes (p<0.05) (Cuadro 4).

La FI 1 fue la que presentó el mayor porcentaje de ALA con 32.44% de la proteína total. La concentración de esta proteína en la FI1 es muy similar a la de la leche materna. Esto se debe a que la FI 1 ha sido elaborada con un suero disminuido en BLG y por ende, las otras proteínas tienden a aumentar su proporción relativa. La FI 2 tuvo un 27.4 ± 1.5% de ALA con respecto a la proteína total, sin embargo existe una diferencia significati-va con la leche materna (Cuadro 4). Esta FI está elaborada con un suero enriquecido con ALA. La FI que presentó el menor porcentaje de ALA fue la FI 3 con un 16.1 ± 0.47% de la proteína total, seguida de la FI 4 con un 21.45 ± 1.4%, habiendo una diferencia significativa entre la LM y ambas FI (Cuadro 4).

La ALA tuvo un peso molecular de 14.65 ± 0.15 kDa, y en el electrofore-grama, su banda correspondiente es la que tuvo mayor movilidad relativa (Figura 1). A simple vista se puede observar, que la banda de ALA en la leche materna es mucho más abundante que en la leche de vaca y que en la fórmulas infantiles. Así mismo, se puede apreciar que la FI 1 y la FI 2 presentan bandas de ALA intensas.

Figura 1. Perfiles de ALA de FI de inicio obtenidos por SDS-PAGE: (1) marcador de peso molecular (97.4-14.4 kDa, BioRad); (2) estándar de ALA bovina; (3) LM; (4) LV; (5) FI 1; (6) FI 2; (7) FI 3; (8) FI 4

El hecho de que haya FI que tienen aproximadamente 50% menos de ALA (FI 3) que la LM, podría limitar algunas de las funciones fisiológicas que tiene esta proteína en el desarrollo del bebé. Por ejemplo, en la ab-sorción de calcio y zinc, en la formación de péptidos en el estómago y duodeno con propiedades antibacteriales e inmunoestimulatorias. Ade-más, debido a la deficiencia de la ALA, la concentración de proteína total debe ser aumentada para proveer los aminoácidos esenciales limitantes, de los cuales es rica la ALA: triptófano y cisteína. Con el aumento de la concentración de proteína total se podrían presentar los problemas meta-bólicos antes mencionados.

16

Fórmula infantil Caseína (%) Proteínas séricas (%)

FI 1 36.8 ± 0.23 63.2 ± 0.23

FI 2 38.0 ± 0.08 62.0 ± 0.08

FI 3 40.0 ± 0.44 60.0 ± 0.44

FI 4 42.0 ± 0.32 58.0 ± 0.32

A diferencia de la LM, todas las FI evaluadas, tuvieron BLG, debido a que son elaboradas con suero bovino. Esto es consistente con lo que se men-ciona en la literatura, ya que la LM no contiene esta proteína debido a que la glándula mamaria no la produce (Jackson et al., 2004), mientras que en el suero bovino es la proteína predominante. En la LV, la BLG se encontró en un 20.46 ± 1.6% de la proteína total. De acuerdo a lo reporta-do en la literatura, del 10 al 17% de la proteína total de la LV corresponde a la BLG (Puyol et al., 1991). Sin embargo, tal como ocurre con la ALA, la concentración de ésta en la leche depende de diversos factores.

Las FI que presentaron el mayor porcentaje de BLG fueron la FI 3 y FI 4, siendo de 41.22 ± 2.3% y de 39.87± 2.2% de la proteína total respectiva-mente. No se encontró diferencia significativa entre las concentraciones de BLG de ambas fórmulas (Cuadro 4). La FI que presentó el menor por-centaje de esta proteína fue la FI 1 con un 15.41% de la proteína total, esto se debe a que, como se mencionó anteriormente, el suero utilizado para su elaboración está disminuido en esta proteína. La FI 2 con 17.9 ± 1.2% respecto a la proteína total, también presentó un porcentaje bajo con respecto a la FI 3 y FI 4 pero mayor a la FI 1. Sin embargo, no existió diferencia significativa entre las concentraciones de esta proteína de la FI 1, FI 2 y leche de vaca (Cuadro 4). Con ello se demuestra, que es reco-mendable utilizar un suero disminuido en BLG, para que las FI resulten más similares a la leche materna, en cuanto a esta proteína.

La BLG tuvo un peso molecular de 18.58 ± 0.43 kDa, por lo cual puede observarse que las FI 3 y FI 4 tienen las bandas de BLG más intensas (Figura 2, carriles 7 y 8).

Figura 2. Perfiles de BLG de FI de inicio obtenidos por SDS-PAGE: (1) marcador de peso molecular (97.4-14.4 kDa, BioRad); (2) estándar de BLG bovina; (3) LM; (4) LV; (5) FI 1; (6) FI 2; (7) FI 3; (8) FI 4

Al no encontrarse en la LM, el organismo del bebé pudiera reconocer a la BLG como un antígeno, la cual junto con la caseína α-s1 son de las princi-pales proteínas alergénicas en la leche de vaca (Tooley et al., 2009; Rui-ter et al., 2006). Esto podría relacionarse con el hecho de que el mayor consumo de FI ha incrementado la prevalencia de alergias a la proteína de leche de vaca. En México no se cuenta con suficientes datos acerca de dicha prevalencia, pero algunos autores plantean que podría estar entre el 5 y el 7%, en niños menores a un año(Bustamante et al., 2007). Además, la BLG podría ser un agente desencadenante del proceso au-toinmune que caracteriza a la diabetes mellitus insulino-dependiente, ya

que una investigación acerca de la respuesta inmune humoral a la leche de vaca en pacientes menores a 3 años recién diagnosticados con esta patología, mostró aumentó el nivel de anticuerpos a la LV y a la BLG (Sa-vilathi et al., 1993). En México, no hay cifras precisas sobre el número de casos de diabetes mellitus tipo 1 debido al gran desconocimiento del pa-decimiento. Sin embargo, el 90% de los casos reportados en la ENSA-NUT del 2012 corresponden a pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (Gu-tiérrez et al., 2012), por lo que el 10% restante podría ser de casos de diabetes mellitus tipo 1 o insulino-dependiente, representando así 640 000 pacientes aproximadamente. La incidencia de esta patología podría verse relacionada con el incremento del consumo de FI en México.

La LF de la LM se encontró en un 11.1 ± 0.2% de la proteína total (Figura 8). Lien et. al (2004), estudiaron la concentración de LF en leche de muje-res de nueve naciones. En México, la concentración fue de 1.37 g/L, re-presentando el 15.22% de la proteína total aproximadamente. Aunque esta concentración es mayor a la obtenida en este trabajo, se encuentra dentro del rango normal que es de 1 a 1.4 g/L (Ballard y Morrow, 2013), que representa del 11.11% al 15.5% de la proteína total. En la LV, se en-contró en un porcentaje del 1.50 ± 0.9% de la proteína total. Se ha repor-tado, que la LV contiene de 0.1 a 0.4 g/L de LF (Wakabayashi et al., 2006), lo que equivale al 0.33 al 1.33% de la proteína total, por lo que el resultado obtenido en esta investigación es congruente con lo estableci-do en la literatura. Hubo diferencia significativa entre ambas leches.

La mayoría de las FI evaluadas presentaron alrededor de un 3.15% de LF respecto a la proteína total (3.14 ± 0.2 % en la FI 2, 3.76 ± 0.1% en la FI 3 y 2.55 ± 0.1% en la FI 4), excepto la FI 1 que mostró el 7.4% de la proteína total. Esto podría deberse al mismo motivo por el que la ALA se encuentra incrementada Entre las concentraciones de LF de la FI 2, 3 y 4 no se observaron diferencias significativas, pero la concentración de esta proteína en la FI 1 si fue diferente significativamente.

La LF tuvo un peso molecular de 84.16 ± 1.3 kDa. Las FI 1 y FI 2 son las fórmulas que tienen las bandas de LF más intensas (Figura 3, carriles 5 y 6).

Figura 3. Perfiles de LF de FI de inicio obtenidos por SDS-PAGE: (1) mar-cador de peso molecular (97.4-14.4 kDa, BioRad); (2) estándar de LF bovina; (3) LM; (4) LV; (5) FI 1; (6) FI 2; (7) FI 3; (8) FI 4

17

Al igual que las proteínas antes mencionadas, la LF tiene ciertas funcio-nes biológicas que la hacen muy importante, por lo que la deficiencia de ésta en las FI podría tener repercusiones en los infantes alimentados con ellas. La LF, facilita la absorción de hierro por las células intestinales hu-manas, presenta actividad bacteriostática y bactericida. Durante su diges-tión se forman péptidos que promueven el crecimiento de bifidobacterias lactoferricina (Lönnerdal, 2003).

Cuadro 4. Contenido de proteínas séricas en LM, LV y FI

Media± desviación estándar. p<0.05. Las medias con diferente superíndi-ce son diferentes significativamente (p<0.05).

Dada la concentración de proteína total en las FI, sería recomendable disminuirla, sin comprometer el aporte de aminoácidos esenciales. Una forma de lograr esto sería aumentar la proporción de ALA en la FI, ya que ésta tiene una alta proporción relativa de triptófano y se encuentra dispo-nible en forma comercial en el suero enriquecido con esta proteína. De tal forma que los bebés alimentados con FI no sólo se beneficien con una mejor calidad de aminoácidos y menor riesgo a la insulino-dependencia, sino que también tengan otros beneficios que tienen los bebés amaman-tados como la defensa frente a infecciones, función inmunológica y desa-rrollo equilibrado.

Conclusiones

Este estudio demuestra que el perfil proteínico de las FI analizadas dista mucho de la LM.

En primer lugar, todas las FI evaluadas tuvieron una mayor concentración de proteína que la LM. Aunque esto se hace para compensar las diferen-cias entre los aminoácidos, existen diferencias entre el perfil de aminoáci-dos de la LM y las FI.

A pesar de que todas las FI analizadas son suero-dominantes y cumplen con la relación suero: caseína de la LM madura presentan diferencias importantes en proteínas séricas específicas. La concentración de ALA y LF en todas las fórmulas analizadas fue menor a la de la LM. Sin embar-go, el uso de suero disminuido en BLG incrementa la proporción relativa de ALA y LF, con respecto a la proteína total.

El enriquecimiento de las FI analizadas con suero de LV con la finalidad de alcanzar una relación suero:caseína similar al de la LM ha provocado que todas ellas presenten BLG, proteína altamente alergénica y rica en aminoácidos de cadena ramificada.

Lo obtenido en este estudio provee una nueva perspectiva sobre el perfil proteínico de FI de inicio comercializadas en México y aporta información que puede ser útil en el desarrollo y formulación de las mismas, a fin de que se asemejen cada vez más a la LM.

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18

Mtra. ALA BLG LF

LM 33.41 ± 1.5a - 11.1 ± 0.2a

LV 13.60 ± 0.3b 20.46 ± 1.6a 1.50 ± 0.9b

FI 1 32.4a 15.4a 7.4c

FI 2 27.33 ± 1.5c 17.98 ± 1.2a 3.14 ± 0.2d

FI 3 16.11 ±0.5b 41.22 ± 0.5b 3.76 ± 0.1d

FI 4 21.45 ± 1.4d 39.87 ± 2.2b 2.55 ± 0.1d

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19

Análisis composicional de la hoja de frijol común Phaseolus vulgaris y evaluación de su consumo como fuente de hierro en ratas

3

M. Martínez-Zavala1*, A. Mora-Avilés2, H. Guzmán-Maldonado2, M. Anaya-Loyola1, V. Andrade-Portillo1, A. Blanco-Labra3, T. García-Gasca T1.

1. Maestría en Nutrición Humana. Facultad de Ciencias Natu-

rales. Universidad Autónoma de Querétaro. 2 Unidad de Bio-

tecnología, Campo Experimental Bajío, Instituto Nacional de

Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias. 3. Departa-

mento de Bioquímica y Biotecnología de Plantas. CINVES-

TAV-Irapuato*

mau_ibq@hotmail.com

20

Resumen

La semilla de frijol es uno de los alimentos más importantes

en todo el mundo sin embargo, en África y regiones de Asia

también se consumen las hojas. Trabajo reciente de nuestro

grupo de investigación encontró que el contenido total de hie-

rro en las hojas de frijol es mayor al de la semilla. El objetivo

del presente trabajo fue determinar la calidad nutricional de

hojas de frijol con énfasis en la recuperación de hierro a tra-

vés de la determinación de la hemoglobina, ferritina y biome-

tría hemática utilizando ratas con deficiencia de hierro. La

dieta suplementada con hojas de frijol presentó mayores nive-

les de marcadores biológicos de hierro que los observados

con sulfato ferroso y dieta suplementada con un efecto esti-

mulante sobre las células blancas y rojas. Nuestros resulta-

dos sugieren que las hojas de frijol podrían ser una buena

fuente de hierro biodisponible.

Palabras clave: Biometría hemática, hoja de frijol, hemoglo-

bina, hierro, Phaseolus vulgaris.

Introducción

Las necesidades nutricionales del hierro en los seres vivos

derivan del papel fundamental que ejerce en la función ener-

gética celular (1, 2). Es muy importante para los seres vivos

pues logra una adecuada oxigenación tisular, para la síntesis

celular de ácido desoxirribonucleico (ADN) (3) ayuda al meta-

bolismo de la mayor parte de las células por su potencial re-

dox que permite la unión del oxígeno a proteínas, la transfe-

rencia de electrones o mediar reacciones catalíticas (4). La

falta de hierro en el organismo ocasiona, en último extremo,

anemia, una de las deficiencias nutricionales más comunes

en todos los países del mundo (5, 6). Actualmente se consi-

dera que aproximadamente un 15% de la población mundial

presenta anemia y que un 30% más tiene deficiencia de hie-

rro (6). Los grupos más afectados son los jóvenes y las muje-

res embarazadas con una prevalencia de 43% y 51% respec-

tivamente, seguidos por los niños en edad escolar con 37%,

las mujeres, incluyendo las embarazadas, con 35% y los

hombres adultos con 18%. (7, 8).

En adultos sanos el hierro corporal total es de 4 g en hom-

bres y 2.5 g en mujeres aproximadamente. En el cuerpo hu-

mano el hierro se encuentra distribuido de dos maneras: hie-

rro funcional y hierro de depósito (9). Aproximadamente 2.1 g

de hierro está distribuido en la hemoglobina de los glóbulos

rojos de la sangre, desarrollando células eritroides y ayudan-

do en el transporte de oxígeno a todas las células del cuer-

po. Aproximadamente en los macrófagos hay 600 mg y en la

mioglobina 300 mg. El exceso de hierro, aproximadamente 1

g es almacenado en el hígado (10, 11). El hierro en exceso

también es potencialmente tóxico ya que bajo condiciones

aerobias cataliza la propagación de especies reactivas de

oxígeno y de radicales altamente reactivos como el radical

hidroxilo por medio de la Reacción de Fenton (12, 13) lo que

ocasiona estrés oxidativo que se asocia con daños a biomolé-

culas, células, tejidos y consecuentemente a enfermedad.

El hierro se encuentra en los alimentos en dos formas diferen-

tes conocidas como hierro hem y hierro no hem (14). Los fac-

tores dietéticos aumentan o disminuyen la proporción del hie-

rro absorbido y utilizado en el metabolismo (9). El hierro férri-

co es reducido por reductasas férricas y transportado en for-

ma ferrosa a través de la membrana apical del enterocito por

la proteína transportadora de metales divalentes (DMT1). El

grupo hemo de la dieta puede ser también transportado a

través de la membrana apical por un mecanismo aún desco-

nocido y subsecuentemente metabolizado en el enterocito

para liberar hierro ferroso. El hierro ferroso es exportado a

través de la membrana basolateral al torrente sanguíneo por

acarreadores de soluto y ferroportina El hierro transportado a

torrente sanguíneo y convertido a la forma férrica es recolec-

tado por la transferrina y mantenido en forma férrica, en un

estado redox inerte para ser liberado al interior de los tejidos

(15). La reserva de hierro en la transferrina es mantenida ma-

yoritariamente por el hierro reciclado de glóbulos rojos senes-

centes y minoritariamente por el hierro absorbido de la dieta

(16).

Un individuo sano absorbe de un 5-10% del hierro ingerido

en la dieta, mientras que un individuo con anemia ferropéni-

ca absorbe entre el 20 y el 30% (17). La absorción del hierro

no hemo se puede ver afectada por minerales presentes en

la dieta que tienen propiedades fisicoquímicas similares al

hierro no hemo como por ejemplo el zinc, magnesio, cobre y

calcio (18). La presencia de carne en la dieta estimula la ab-

sorción de hierro hemo a través de “un factor carne” cuya na-

turaleza no es completamente clara (19). Se ha descubierto

que la presencia de sustancias químicas presentes en los

alimentos como el ácido fítico, los polifenoles y algunas pro-

teínas como las de soya disminuyen notablemente la absor-

ción del hierro no hemo (20).

21

Del hierro presente en los vegetales tan solo el 5% aproxima-

damente es biodisponible (21). El frijol se ha considerado

uno de los alimentos más nutritivos en la dieta por su aporte

de proteína de alta calidad (22), buena fuente de carbohidra-

tos (23), fibra (24) y su contenido de hierro promedia los 50

mg/kg de frijol (25). Adicionalmente contiene compuestos fe-

nólicos que le confiere propiedades antioxidantes (26) que

son capaces de reducir el riesgo de cáncer, enfermedades

del corazón, diabetes, otras enfermedades crónicas degene-

rativas (27, 28). Entre los factores antinutrícios presentes en

frijol se encuentra el ácido fítico, que se liga a minerales de

la dieta como zinc, hierro y calcio, volviéndolos indisponibles

o parcialmente disponibles para su absorción (29). Las lecti-

nas, que interferieren con la absorción de nutrientes y se rela-

cionan con alergias leves (30) e inhibidores de proteasas

(IP), polipéptidos con habilidad de inhibir la actividad proteolí-

tica de ciertas enzimas e interfieren con la digestión de proteí-

nas, la absorción y utilización de aminoácidos y otros nutri-

mentos (24).

Por tradición, en nuestro continente sólo se consume la semi-

lla de frijol sin embargo, en zonas del continente Africano y

Asiático la gente consume tanto la semilla como sus hojas en

varias preparaciones (31). En recientes investigaciones se

encontró que el contenido de hierro en las hojas de la planta

de frijol fue de nueve a doce veces superior con un valor má-

ximo de 643mg/kg de HFL (25). Lo anterior sugiere que, debi-

do a su importante contenido de hierro, el consumo de la ho-

ja de frijol de forma típica podría ser importante para la pobla-

ción. No existen estudios que muestren la calidad nutricia de

las hojas de frijol, por lo que la presente investigación se en-

focó en determinar la calidad nutricia de la hoja de frijol lle-

vando a cabo el análisis bromatológico y el contenido de fac-

tores antinutrícios; así como si el consumo de hoja de frijol

es capaz de recuperar los niveles de marcadores plasmáti-

cos relacionados con hierro después de provocar deficiencia

de hierro a ratas Wistar.

Materiales y métodos

Hoja de frijol. Se utilizó hoja de frijol común de la variedad

Pinto Villa (PV, Reg. Núm. FRI-052-140890) (32). El frijol se

cultivó en condiciones de invernadero en el INIFAP Campus

Experimental Celaya, las semillas fueron germinadas en ma-

cetas con sustrato Sunshine-3® (5 semillas/ maceta) y cada

maceta fue fertilizada con 00-46-00 (10 g/maceta) (Super Tri-

ple®) sin adición de hierro. Las condiciones de germinación

y crecimiento fueron de 22-25°C y una intensidad de luz de

170-285 mol m²/seg. Las hojas fueron recolectadas cuando

la planta estaba fisiológicamente madura (25) en primavera

del 2011. Posteriormente a su recolección las hojas fueron

liofilizadas para ayudar a su manipulación, conservación y

evitar la pérdida de nutrimentos. La hoja liofilizada fue molida

con una malla de 0.2 mm en el laboratorio de Nutrición Ani-

mal de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad

Autónoma de Querétaro y finalmente fue conservada en refri-

geración a -20°C hasta su utilización.

Análisis Químico Proximal (AQP). El análisis químico de la

composición de la hoja de frijol, se llevó a cabo de acuerdo a

métodos oficiales de la AOAC (33). Determinación de hume-

dad y materia seca (AOAC 930.15), cenizas (AOAC 942.05),

fibra cruda (AOAC 962.09), extracto etéreo (contenido de gra-

sa). (AOAC 920.39), proteína (N x6.25) (AOAC 2001.11). El

análisis de hierro se realizó por digestión con ácido nítrico

(34) o digestión con ácido clorhídrico (35). Ambos ensayos

se realizaron en un espectrómetro marca Perkin Elmer mode-

lo Analyst 200.

Determinación de fenoles totales y fenoles solubles en

agua. Para la determinación de los compuestos fenólicos so-

lubles en las hojas de frijol se realizó la extracción bajo dos

condiciones: en extracto metanólico para compuestos fenóli-

cos totales y en extracto acuoso para compuestos fenólicos

solubles, la determinación cuantitativa se realizó por la prue-

ba de Ácido Gálico- Folín (36) y la concentración final se ex-

presó como mg equivalentes de ácido gálico/ 100g de mues-

tra (mg EAG/ 100g).

Determinación de taninos. Se cuantificaron los taninos con-

densados expresados como equivalentes de (+) catequina

(Cat) en mg/ 100g de hoja de frijol liofilizada (mg EC/100g),

de acuerdo al ensayo de la vainillina (37).

Determinación de fitatos. Se cuantificaron los fitatos totales

contenidos en la hoja de frijol liofilizada por el método pro-

puesto por Gao y col. en 2007 (38).

Cuantificación de inhibidores de proteasas. La proteína

se cuantificó por el micro método de Bradford (39) y la pre-

sencia de los inhibidores de proteasas fue analizada por la

actividad inhibitoria de tripsina, usando el sustrato BAEE (Sig-

ma S.A. de C.V.) (40, 41).

22

Determinación de la presencia de lectinas. Para determi-

nar la presencia de lectinas se analizó la actividad aglutinan-

te del extracto acuoso de hoja de frijol liofilizada utilizando el

método de las diluciones dobles seriadas (42).

Animales. Se utilizaron 40 ratas Wistar, hembras, de ocho

semanas de edad, adquiridas en el Instituto de Neurobiología

de la Universidad Nacional Autónoma de México. Las ratas

fueron aleatorizadas en distintos grupos experimentales para

conformar los grupos de estudio. Se mantuvieron en el Biote-

rio de la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad

Autónoma de Querétaro, las ratas fueron tratadas de acuer-

do con la NOM (43) para la producción, cuidado y uso de los

animales de laboratorio y se atendieron las consideraciones

éticas correspondientes. Los animales se colocaron en jaulas

plásticas individuales, la cama de aserrín fue cambiada cada

semana, se les proporcionó agua y alimento ad libitum y se

mantuvieron a temperaturas entre 22-25°C y a ciclos circadia-

nos de 12 h de luz y 12 h de oscuridad.

Dietas. Dieta basal (DB, Rodent Laboratory Chow 5001) y la

dieta deficiente en hierro (DDH, TD.80396. Harlan Laborato-

ries Inc., EU) en polvo. El contenido de hierro en las dietas

fue corroborado por absorción atómica obteniendo valores

de hierro en la dieta basal de 165 ppm de Fe y en la dieta

deficiente en hierro de 34 ppm de Fe. Las dietas experimenta-

les DDH con hoja de frijol liofilizada al 10% m/m y DDH con

sulfato ferroso 20.6 mg de Fe/kg se elaboraron en el Labora-

torio de Biología Celular y Molecular de la Facultad de Cien-

cias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro y

peletizadas. El sulfato ferroso se obtuvo de grageas (Homo-

ger, STREGER S.A.) que fueron molidas cuidadosamente en

un mortero de porcelana, adicionadas a la dieta y mezcladas

cuidadosamente para lograr su homogeneización.

Ensayo Biológico. El estudio consistió en dos fases: fase

de disminución de hierro con duración de 11 días y fase de

recuperación de hierro con duración de 14 días. En el perio-

do de disminución de hierro se tuvieron dos grupos: control

positivo (n= 12) alimentado con la DB y deficiente (n=28) ali-

mentado con DDH durante 11 días para inducir anemia en

las ratas (44). A los 11 días de iniciado el experimento se sa-

crificaron 4 ratas del grupo control y cuatro del grupo deficien-

te. Las ratas restantes de cada grupo siguieron en la fase de

recuperación, el grupo control continuó siendo alimentado

con DB mientras que las ratas deficientes fueron divididas en

tres subgrupos: grupo suplementado con hoja de frijol liofiliza-

da (DHF) que fue alimentado con una mezcla dieta formula-

da con 90% en peso de DDH y 10% de hoja de frijol liofiliza-

da, grupo realimentado con DB este grupo fue alimentado

con la DB y grupo suplementado con sulfato ferroso (DSF)

que fue alimentado con una dieta formulada con DDH y sulfa-

to ferroso que aportaba los 20.6 mg de Fe/kg equivalentes al

hierro aportado por la hoja de frijol liofilizada. Al término del

experimento los animales fueron sacrificados por decapita-

ción, se recuperó la sangre en tubos con y sin anticoagulante

y se realizó la necropsia para obtener el hígado, bazo y cora-

zón.

Determinación de parámetros hematológicos. Los pará-

metros hematológicos se midieron empleando el analizador

hematológico automatizado CELL-DYN 1400 que determina

los niveles de hemoglobinag/dL, Leucocitos (Leu) K/µL, Linfo-

citos (Lin) K/µL, Porcentaje de linfocitos (Lin%), Granulocitos

(Gran) K/µL, Porcentaje de granulocitos (Gran%), Eritrocitos

(Erit) M/µL, Volumen corpuscular medio (VCM) en fL, Hemo-

globina corpuscular media (HCM) en pg, Concentración de

hemoglobina corpuscular media (CHCM) en g/dL. Para deter-

minar la concentración de ferritina sérica se utilizó el Rat Fe-

rritin Elisa RUO (Alpco, TM Immunoassays).

Análisis Estadístico. Se unificaron los valores de todos los

biomarcadores por cada grupo y se analizaron con ayuda del

programa SSPS Statistics 17.0. Se obtuvieron valores de me-

dia, desviación estándar y error estándar para cada biomarca-

dor por grupo. Para la comparación de medias se realizaron

pruebas de t de student o ANOVA con posthoc de Dunnett.

La significancia estadística se consideró con una p<0.05.

Resultados

Análisis químico proximal y contenido de hierro en hoja

de frijol liofilizada

El AQP de la hoja de frijol liofilizada se muestra en el Cuadro

1. El contenido de proteína cruda se encontró dentro del pro-

medio para hojas verdes. La cantidad de fibra fue similar al

promedio reportado para otros alimentos de hoja verde como

la acelga con un valor promedio de hasta 40% en base seca

(45). El contenido de hierro fue de 275 mg/kg, valor superior

al contenido en semilla de frijol, con un 75% de hierro biodis-

ponible como lo muestra la digestión con ácido clorhídrico.

Sin embargo, los valores obtenidos fueron menores a los re-

23

portados por Ayala-Vela y col. (25) quienes encontraron 643

mg/kg.

La caracterización de compuestos fenólicos y factores antinu-

trícios se muestra en el Cuadro 2. Los valores obtenidos de

compuestos fenólicos fueron mayores que los reportados

para la harina de semilla de frijol (0.958 mg eq EAG/g de hari-

na para los compuestos fenólicos solubles y de 0.733 mg eq

AG/g de harina para compuestos fenólicos totales) (46) y de

0.459 mg eq AG/g de frijol (47). Estos datos son importantes

pues se sabe que estos compuestos exhiben propiedades

antioxidantes de importancia para la salud humana. Asimis-

mo, se encontraron valores elevados de taninos comparados

con la semilla de frijol como 0.303 mg eq (+) Cat/g de harina

de frijol cocido Pinto Durango (46) y 0.946 mg eq de (+) Cat/

g de harina de frijol común Pinto Villa (24). Sin embargo, es-

tos valores son esperados pues se sabe que los taninos son

compuestos químicos del metabolismo de las plantas que

están presentes en hojas y principalmente en estructura leño-

sa como tallos y troncos.

Cuadro 1 Análisis químico proximal de la hoja de frijol

común Phaseolus vulgaris

Contenido de compuestos fenólicos y factores antinutrí-

cios.

Los resultados obtenidos para fitatos fueron altos compara-

dos con los valores reportados para granos y semilla de frijol

común. Se sabe que la cantidad de fitatos presentes en las

hojas es muy superior al presente en los granos y semillas

(48). Iniestra y col. (24) reportaron para distintas variedades

de frijol común cantidades entre 0.98 ± 0.13 y 2.16 ± 0.03

mg/g, particularmente para Pinto Villa el valor fue de 1.18 ±

0.08 mg/g. Bernal-Lugo y col. (49) y Deshpande y col. (29)

reportaron valores de entre 0.6 y 2.27% para frijol común.

En este caso, como se esperaba, no se detectó presencia de

lectinas en la HFL pues se sabe que son proteínas presentes

principalmente en semillas. Para inhibidores de proteasas se

obtuvo un resultado de 2.14± 0.32 UI/mg de proteína en la

HFL. En el estudio de Iniestra y col. (24) se reportó para coti-

ledón entre 4.78 y 12.22 UI/mg siendo la variedad Flor de

Mayo M38 la que presentó el valor promedio más alto 12.22

± 0.02 seguida por el Negro Sahuatoba 11.27 ± 0.57.

Cuadro 2. Determinación de compuestos fenólicos y fac-

tores antinutricios en la hoja de frijol común Phaseolus

vulgaris

ND: No detectado, UA: Unidades de aglutinación, UI: uni-

dades de inhibición.

Resulta importante caracterizar los efectos adversos del con-

sumo de estos compuestos al incluir hoja de frijol a la dieta

así como efectos benéficos que permitan prevenir enfermeda-

des no transmisibles como cáncer y enfermedad cardiovascu-

lar.

Estudio Biológico

En la Figura 1 se observa el comportamiento de ganancia de

peso y consumo de alimento para los periodos de deficiencia

y recuperación de hierro. El peso se registró de forma sema-

nal desde el primer día que se inició el experimento. No se

24

CONTENIDO CANTIDAD

Materia seca (%) 94 ± 0.003

Proteína cruda (%) 24.5 ± 0.2

Extracto etéreo (%) 2.9 ± 0.05

Fibra (%) 38.3± 0.8

Carbohidratos (%) 19.2± 0.43

Cenizas (%) 15.1 ± 0.02

Hierro mg/g 0.2747 (total, HNO3)0.2061 (biodisponible, HCl)

Compuestos fenólicos Contenido

Fenoles totales (mg AG/g HFL) 5.796±0.31

Fenoles solubles (mg AG/g HFL) 4.742+0.26

Taninos (mg eq (+) Cat/g HFL) 3.000± 0.48

Fitatos (mg Ac. Fítico/g HFL) 39.280± 2.98

Lectinas (UA/mg de proteína) ND

Inhibidores de proteasas (UI/mg de proteína) 2.14± 0.32

observaron diferencias en la ganancia de peso corporal entre

tratamientos, incluyendo el periodo de deficiencia de hierro.

La cantidad de alimento consumido disminuyó en los anima-

les alimentados con DDH (p<0.05) lo que sugiere que la dis-

minución se debe a la deficiencia de hierro en la dieta.

Uno de los efectos más comunes de las deficiencias de hie-

rro es la anorexia, se ha reportado que cuando existe anemia

o deficiencia de hierro, la ingesta de alimentos se ve disminui-

da (50). Durante el periodo de recuperación la cantidad de

alimento consumido aumentó en los animales realimentados

con DB pero no así en los grupos realimentados con DHF o

DSF. Lo anterior puede deberse a que las dietas suplementa-

das alcanzaron cantidades de hierro de 61.4 mg de Fe/Kg en

dichas dietas mientras que la DB contenía valores de hierro

de 165 mg de hierro/Kg sin embargo, no era posible igualar

el contenido de hierro a la DB sin afectar el balance energéti-

co de la dieta. Entre las posibles razones por las que el con-

sumo de las dietas suplementadas no aumentó, están la tex-

tura y palatabilidad de la dieta ya que la consistencia, textura

y aroma de la DB son adecuadas para roedores y que las

dietas suplementadas tenían una consistencia muy dura.

Figura 1. Comparación de la ganancia de peso (A) y con-

sumo de alimento (B) entre los grupos. Los animales fueron

alimentados con dieta basal (DB) o dieta deficiente en hierro (DDH) por 11 días. Posteriormente se alimentaron con dieta suplementada con hoja de frijol (DHF), DB o dieta suplementada con sulfato ferroso (DSF). Dife-rencia estadística por t de student (p<0.05) (&) o Dunnett (p<0.05) (*).

Los pesos de los órganos fueron ajustados al peso corporal

de cada animal y posteriormente ajustados al control con la

intención de apreciar más claramente los cambios (Figura 2).

A pesar de no presentar diferencia estadística significativa,

se observa que el bazo disminuyó en más del 22% en el gru-

po deficiente con respecto al grupo control y el hígado mos-

tró una pérdida de peso de cerca del 9%. En el caso de la

fase de recuperación los animales alimentados con mostra-

ron aumento importante del bazo ya que no sólo recuperó el

peso perdido sino que aumentó un 16% respecto al grupo

control. Lo anterior puede deberse a un mecanismo de com-

pensación para aumentar la cantidad de glóbulos rojos circu-

lantes con la intención de mejorar la captación de hierro ya

que una de las funciones del bazo es regular la cantidad de

glóbulos rojos (51). En el caso del hígado y corazón se obser-

varon valores similares al control. Las dietas de recuperación

con sulfato ferroso o DB mostraron valores similares al con-

trol para los 3 órganos estudiados.

Figura 2. Comparación del peso de los órganos en el pe-

riodo de deficiencia (A) y recuperación (B). Después del sacri-

ficio los órganos fueron pesados. Los resultados se muestran en valores ajustados por pesos corporales y ajustados al control. No se observó dife-rencia significativa (p>0.05).

Respecto a las células sanguíneas y a los marcadores hema-

tológicos durante el periodo de deficiencia (Figura 3), se ob-

25

serva que todos los parámetros se vieron reducidos en com-

paración de los valores para el grupo control con excepción

de la HCM y la CHCM. Las ratas deficientes en hierro mostra-

ron disminución en glóbulos blancos (64%), linfocitos (62%),

granulocitos (72%), porciento de granulocitos (23%), glóbu-

los rojos (30%), hematocrito (34%). Los valores de VCM y

CHCM no se vieron afectados ya que para modificar estos

parámetros es necesario un periodo de tiempo mayor (51). Al

disminuir la disponibilidad de hierro se altera inicialmente el

número de células rojas y por ende el hematocrito y si la defi-

ciencia continúa se alteran los otros valores.

Figura 3. Comparación de células sanguíneas (A) y pará-

metros hematológicos (B) durante el periodo de deficien-

cia. Los parámetros hematológicos fueron ajustados al control. Diferen-

cia significativa t de student (p<0.05) (*).

Para el caso de los biomarcadores hematológicos ajustados

después de la fase de recuperación (Figura 4), el consumo

de DHF mostró que en cada uno de los parámetros analiza-

dos se revirtió la reducción provocada por la deficiencia en

hierro y, en algunos casos, los valores superaron a los de las

ratas control. Con la DHF se observó un incremento del 40%

para glóbulos blancos, linfocitos en más de un 33%, los gra-

nulocitos en más de un 88% (p<0.05), los glóbulos rojos en

más de un 24% y el hematocrito en un 17%. Las dietas de

recuperación con DB o DSF mostraron niveles similares al

control. En el caso de VCM, HCM y CHCM se observaron

valores similares al control con algunas diferencias significati-

vas (p<0.05).

Figura 4. Comparación de células sanguíneas (A) y pará-

metros hematológicos (B) durante el periodo de recupe-

ración. Los parámetros hematológicos fueron ajustados al control. Dife-

rencia significativa Dunnett (p<0.05) (*).

La DHF mostró valores en los parámetros hematológicos que

no se observaron en los animales recuperados con DB o sul-

fato ferroso. Sorprende que el número de células blancas au-

mentara en todos los casos ya que se logró no solo la recupe-

ración, sino un incremento importante por encima del control.

El valor más importante se observó en granulocitos ya que

mostraron un 88% por encima del control. Lo anterior sugiere

que la hoja de frijol presenta un efecto estimulador del siste-

ma inmune. El incremento de células del sistema inmune pue-

de estar vinculado con una posible actividad mitogénica de

componentes presentes en la hoja de frijol y al aumentar el

tamaño y número de eritrocitos aumenta también la necesi-

26

dad de hemoglobina. De forma similar, el hematocrito que se

había disminuido en un 34% en el periodo de deficiencia, du-

rante el periodo de recuperación con la DHF incrementó en

un 17% por encima del grupo control, lo anterior sugiere nue-

vamente un efecto compensatorio para aumentar la capta-

ción de hierro, en este caso aumentando el tamaño del eritro-

cito (hematocrito). Los demás biomarcadores se mantuvieron

en los niveles mostrados por el grupo control durante el perio-

do de recuperación.

Los valores ajustados para hemoglobina y ferritina después

del periodo de deficiencia y de recuperación mostraron que,

después de la fase de deficiencia, la hemoglobina disminuyó

en más de un 35% y la ferritina en más de un 34%. Después

de la fase de recuperación, todos los grupos experimentales

lograron recuperar los niveles de hemoglobina pero el mayor

nivel se alcanzó con la DHF ya que logró incrementar los ni-

veles de hemoglobina a un 18.12% por encima del control.

En cuanto a los niveles de ferritina, en todos los casos se ob-

servó un aumento que no alcanzó los niveles del control. Lo

anterior sugiere que el tiempo para abastecer el nivel de hie-

rro en ferritina no fue suficiente ya que el organismo da priori-

dad a la recuperación de hemoglobina. La DHF fue la que

mostró el menor aumento en la recuperación de ferritina sin

embargo, este valor fue comparable con las demás dietas.

La proporción de granulocitos/linfocitos se alteró con la DDH

y se recuperó con las 3 dietas de recuperación (Figura 5). Lo

anterior sugiere un efecto estimulatorio del sistema inmune.

Figura 5. Comparación de la proporción de granulocitos/

linfocitos al final del periodo de deficiencia (A) y de recu-

peración (B). Diferencia significativa t de student (p<0.05) (*).

Conclusiones

El AQP para hoja de frijol mostró un elevado contenido de

proteína cruda y de fibra. El contenido de hierro fue mayor

que el reportado para semilla y el hierro biodisponible fue ma-

yor al esperado con un 75% del hierro total. El contenido de

factores antinutrícios se encontró dentro de los valores espe-

rados para alimentos similares. Particularmente el contenido

de compuestos fenólicos solubles en la hoja de frijol liofiliza-

da podría presentar un buen efecto antioxidante en el consu-

midor. El efecto del consumo de la hoja de frijol liofilizada in-

crementó la cuenta de células del sistema inmune, probable-

mente debido a efectos estimuladores de la mitosis como su-

giere también el crecimiento del bazo. El hierro presente en

la hoja de frijol liofilizada fue capaz de revertir los estados de

deficiencia de hierro en sangre de ratas Wistar, demostrado

con la recuperación de los biomarcadores hematológicos co-

mo los valores de hemoglobina, número de glóbulos rojos y

hematocrito. Sin embargo, no se alcanzó a recuperar el nivel

de ferritina bajo las condiciones experimentales del estudio.

Los resultados sugieren que la hoja de frijol liofilizada puede

ser una alternativa de alimento empleada para ayudar a man-

tener los biomarcadores de hierro y revertir los estados de

deficiencia de hierro.

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30

Uso de vectores de impedancia bioeléctrica para ajuste de peso seco en pacientes sometidos a hemodiálisis

4

I.Nieves Anaya, X. Atilano Carsi, E. Sabath Silva, M.E. Rojo Trejo

Maestría en Humana, Facultad de Ciencias Naturales

Universidad Autónoma de Querétaro

iris.nanaya@hotmail.com

31

Introducción

La incidencia de la enfermedad renal está aumentando mun-

dialmente a una tasa de crecimiento del 8%.

En México existen 10 millones de personas (10.3%) con al-

gún grado de insuficiencia renal, de las cuales cerca de 129

mil se encuentran en etapas avanzadas y con requerimientos

de diálisis o hemodiálisis (Castro-Serralde 2014). La enferme-

dad renal crónica (ERC) es actualmente la quinta causa de

muerte general en México y la tercera a nivel hospitalaria

(INSP, 2011).

La sobrehidratación y desnutrición presente en los pacientes

nefrópatas son factores de riesgo de morbi-mortalidad princi-

palmente de origen cardiovascular, por lo que es importante

su diagnóstico y tratamiento. La evaluación de estas dos enti-

dades no es sencilla y las herramientas disponibles no siem-

pre son fiables (Chamney, 2002). Para algunos autores

(Cox-Rejiven et al., 2001; Konings et al., 2002), la combina-

ción de algunos datos clínicos, radiografías de tórax y algu-

nos datos analíticos (hematocrito, proteínas totales y albúmi-

na sérica) pueden ser suficientes para aproximar el peso se-

co del paciente. Sin embargo, para otros autores (Daugirdas

1993; Owen 1998; Lunts et al., 2002; Borroto Díaz et al.,

2006), este ejercicio es difícil, inseguro, poco exacto, intuitivo

y no reproducible, por lo que abogan por otros métodos de

estimación del peso seco, invasivos o no invasivos, pero indu-

dablemente más exactos. De entre estos métodos, uno de

los mejores valorados es de la bioimpedancia eléctrica (BIE).

Recientemente, se desarrolló un sistema vectorial estable-

ciendo un nomograma de esferas concéntricas, basado en el

vector de impedancia llamado método gráfico RXc, el cual

supera las limitaciones convencionales del análisis de BIE.

Debido a esto el objetivo de este estudio fue comparar la

efectividad del análisis de vectores de impedancia bioeléctri-

ca (VIBE) contra los parámetros clínicos convencionales utili-

zados en las unidades de hemodiálisis para ajustar el ultrafil-

trado y alcanzar el peso seco en pacientes sometidos a he-

modiálisis.

Materiales y Métodos

Diseño de estudio

Estudio prospectivo longitudinal en dos grupos de pacientes

en hemodiálisis con intervención para el ajuste de peso seco

durante cuatro meses guiado por vectores de impedancia

bioeléctrica y parámetros clínicos convencionales.

Población a estudiar

Se estudiaron todos aquellos pacientes con enfermedad re-

nal crónica avanzada (ERCA) que se encontraban recibiendo

hemodiálisis en el turno matutino y vespertino, de la unidad

de hemodiálisis del Hospital General del Estado de Queréta-

ro, entre Agosto del 2013 y Noviembre del 2013.

Cuestiones éticas

El protocolo fue registrado ante el comité de bioética de la

Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma

de Querétaro con el No.1FCN2013. A todos los pacientes par-

ticipantes se les explicó el procedimiento y los objetivos del

estudio y firmaron el consentimiento informado.

Criterios de inclusión

Se incluyeron a todos aquellos pacientes ambulatorios con

ERCA en tratamiento sustitutivo con hemodiálisis mayor a 3

meses, de ambos sexos, mayores de 18 años de edad, que

aceptaron su inclusión en el estudio.

Criterios de exclusión

Se excluyeron a todos aquellos pacientes con amputaciones

de algún miembro superior o inferior, así como a pacientes

con algún implante metálico.

Criterios de eliminación

Fueron eliminados del estudio los pacientes con errores en la

medición, que no concluyeran con el tiempo de seguimiento

debido a trasplante de riñón, hospitalización, amputación,

cambio de terapia sustitutiva o muerte.

Tipo de muestra

Se utilizó una tabla de números aleatorios para la asignación

de los pacientes a los grupos de estudio, utilizando los núme-

ros pares de la fila 13 para el grupo de ajuste de peso seco

por VIBE y los no pares de la misma fila para el grupo de

ajuste de peso seco por parámetros clínicos convencionales.

32

Estimación del tamaño de muestra

El tamaño de muestra se estimó con la fórmula para la com-

paración de dos proporciones y el tamaño muestra se ajustó

a las pérdidas, por lo que el grupo guiado por VIBE quedo

integrado por 27 pacientes y el grupo guiado por parámetros

clínicos convencionales por 29.

Mediciones

Todos los pacientes fueron examinados en la segunda se-

sión de hemodiálisis de cada semana, hasta alcanzar los 4

meses de seguimiento. El día de inicio del estudio se obtuvo

la edad, tiempo en diálisis, características de la sesión de

hemodiálisis (frecuencia y horas en diálisis), presencia de

diabetes y otras comorbilidades.

La presión arterial (sistólica y diastólica) pre- y postdiálisis

fue tomada semanalmente, con las cuales se obtuvo la pre-

sión arterial media (PAM), mediante la siguiente fórmula:

PAM = ((PAS – PAD)/3 + PAD)

Donde PAS es la presión arterial sistólica y PAD la presión

arterial diastólica.

Se calculó la ganancia de peso interdiálisis considerándola

como la diferencia entre el peso postdiálisis y el peso prediáli-

sis de la siguiente sesión y el ultrafiltrado como la diferencia

entre el peso pre- y postdiálisis de la misma sesión. Tanto la

ganancia de peso como el ultrafiltrado se calcularon con los

valores promedios de cada semana de duración del estudio.

La medición de las variables antropométricas se realizó exclu-

sivamente al inicio y al final del estudio, con excepción del

peso el cual se tomó inmediatamente antes del inicio de ca-

da sesión de hemodiálisis y al finalizar la misma.

Se tomó la anchura de codo, para determinar la complexión

de los individuos, así como la circunferencia de brazo (CB) y

el pliegue cutáneo tricipital (PCT), con lo que se calculó la

circunferencia muscular de brazo (CMB) mediante la siguien-

te fórmula:

CMB(mm) = CB – (3.1416 x PCT)

Las medidas antropométricas fueron tomadas en el periodo

postdiálisis. Se utilizó la metodología y tablas de referencia

de Frisancho (1981). De igual manera se realizó la evalua-

ción global subjetiva de Detsky (1987).

El diagnóstico nutricional se llevó a cabo mediante el índice

de Bilbrey (1989), el cual incluye parámetros antropométri-

cos, bioquímicos y clínicos, a saber: proporción peso/talla,

pliegue cutáneo tricipital, circunferencia de brazo y circunfe-

rencia muscular de brazo, así como albúmina sérica, transfe-

rrina sérica, cuenta total de linfocitos y la clasificación de la

evaluación global subjetiva. A cada parámetro se le asignó

un puntaje de acuerdo al grado de déficit del valor ideal, pu-

diendo tener cuatro categorías finales: estado de nutrición

normal, desnutrición leve, desnutrición moderada y desnutri-

ción grave. El índice fue modificado con el fin de excluir la

transferrina, ya que su determinación es infrecuente en los

exámenes bioquímicos de rutina.

Se obtuvieron concentraciones mensuales de biometría he-

mática, perfil de lípidos (CT, HDL, LDL, TG), electrolitos séri-

cos completos (Na, K, Cl, P), química sanguínea de 3 ele-

mentos (Glu, BUN, Cr) siguiendo el protocolo de extracción y

determinaciones bioquímicas de la unidad de hemodiálisis

del Hospital General del Estado de Querétaro, con el pacien-

te en ayunas.

Impedancia bioeléctrica

Semanalmente se midió la composición corporal y el estado

de hidratación de todos los pacientes en la segunda sesión

de hemodiálisis por medio de impedancia bioeléctrica, inme-

diatamente antes del inicio de la sesión y 10 minutos posterio-

res al término de la sesión de hemodiálisis durante los cuatro

meses de seguimiento. Al término de la primera medición de

impedancia bioeléctrica se le otorgó a cada paciente una co-

lación que consistía en una barra de amaranto.

Para este procedimiento se utilizó un impedanciometro mono-

frecuencia (50kHz) modelo RJL System Quantum II. La medi-

ción se realizó según los criterios establecidos por el Natio-

nal Institutes of Health Technology Assessment Conference

Statement (1987). Los sujetos permanecieron en posición

supina sobre una superficie no conductora con los brazos y

piernas separados del cuerpo y las palmas de las manos ha-

cia abajo. Se colocaron dos pares de electrodos en las extre-

midades libres del acceso vascular (los cuales permanecie-

33

ron adheridos a paciente durante toda la sesión) los emiso-

res de corriente se situaron en el dorso de la mano y el pie

próximos a las articulaciones falange-metacarpales y falan-

ge-metatarsiales y los sensores en la apófisis estiloide de la

muñeca y entre el maléolo medial y lateral del tobillo.

Para que la medición pudiera llevarse a cabo, los sujetos de-

bieron cumplir con los siguientes puntos:

1. Ayuno nocturno o de 4 horas previas a la medición.

2. No tener objetos metálicos en el cuerpo.

3. No haber realizado ejercicio extenuante 24 horas entes de

la medición.

4. No estar menstruando en el caso de las mujeres.

Análisis de vectores de impedancia

Las resistencias y reactancias estandarizadas por la estatura

(R/E, Xc/E) de cada paciente se graficaron sobre las elipses

de referencia de la población mexicana mediante el BIVA

Software 2002 (BIVA Tolerance file) con el fin de conocer de

manera individual el estado de hidratación y composición cor-

poral de todos los sujetos de estudio.

Para la interpretación de los VIBE se consideró deshidrata-

ción cuando el vector se situaba en la parte superior y so-

brehidratación cuando el vector se situaba en la parte infe-

rior, ambos por fuera de la elipses del 75%. En los cuadran-

tes derechos por fuera de la elipse del 75% se consideró co-

mo depleción de tejidos o desnutrición y en los cuadrantes

izquierdos, exceso de tejidos corporales (obesidad o incre-

mento de la masa muscular y grasa) (Figura 1). Los vectores

situados dentro de las elipses del 50 y 75% se consideraron

normales.

Figura 1. Interpretación cualitativa (patrones) de la composi-

ción corporal obtenida a partir de los vectores de impedancia

bioeléctrica.

Intervención.

A todos los participantes del estudio se les realizaron las me-

diciones descritas anteriormente. Los participantes fueron

asignados de manera aleatoria al grupo VIBE (donde el peso

seco se estimó por medio del análisis de vectores de impe-

dancia) y al grupo convencional (donde el peso seco se esti-

mó por las medidas habituales que utiliza el médico de la uni-

dad de hemodiálisis).

En el grupo VIBE, la intervención se basó en los resultados

del análisis de los vectores de impedancia bioeléctrica perte-

necientes a la medición de impedancia post diálisis de cada

semana, siguiendo los parámetros siguientes (figura 2):

• Aquellos sujetos en los que el vector postdiálisis se sitúo

dentro de las elipses del 50 y 75% fueron considerados en

peso seco, por lo que no requirieron algún tipo de interven-

ción hídrica para ajustar el peso seco.

• Aquellos sujetos en los que sus vectores postdiálisis se si-

tuaron fuera de la elipse del 75% se consideraron como pa-

cientes sobrehidratados o deshidratados y requirieron de un

reajuste en el peso seco; la intervención se hizo de la siguien-

te manera:

-Si el vector se ubicaba fuera de la elipse del 75% pero den-

tro de la del 95%, por arriba o por debajo del eje mayor, se

34

ajustó en 0.5 Kg del peso seco preestablecido del paciente,

si por el contrario el vector se encontraba fuera de la elipse

del 95%, el peso seco se ajustara en 1.0 Kg y este peso ajus-

tado será tomado como referencia para la siguiente sesión

de hemodiálisis.

-En el momento en el que, mediante las modificaciones hídri-

cas, los pacientes se situarán dentro de las elipses del 50 o

75% se consideró que el paciente había alcanzado su peso

seco por lo que no se requería continuar con las modificacio-

nes del peso seco preestablecido.

-En aquellos pacientes que inicialmente se encontraron en

peso seco y que por alguna razón a lo largo de los cuatro me-

ses de estudio se situaban en las elipses del 75%, se reajus-

taba el peso, con el fin de regresarlos a la normohidratación.

Figura 2. Intervención basada en vectores de impedancia

bioeléctrica

En el grupo convencional, la intervención se basó en los pará-

metros clínicos convencionales utilizados por el médico res-

ponsable en la unidad de hemodiálisis, por lo que para el

ajuste del peso seco el médico no tuvo conocimiento alguno

de la ubicación de los vectores y determinó el ultrafiltrado

mediante los siguientes parámetros clínicos.

*Datos de la última sesión: Pérdida de conocimiento durante

la sesión de hemodiálisis, hipotensiones, calambres, cefa-

leas, PAM, ultrafiltración horaria y si fue necesario finalizar la

sesión antes de lo pautado.

*Datos clínicos: índice de masa corporal, circunferencia abdo-

minal, tensión arterial pre y postdiálisis, exploración física

(edemas, auscultación), dificultad respiratoria y ganancia in-

terdiálisis.

*Datos gastrointestinales: Nausea, vómito, diarrea, estreñi-

miento

*Datos analíticos: albúmina, hemoglobina y creatinina.

Análisis Estadístico

Los datos fueron procesados con el programa SPSS versión

16 (SPSS Inc. Chicago, Illinois, USA).

Se realizó un análisis inicial de datos para determinar si se

observaba una distribución normal y considerar realizar prue-

bas paramétricas. Se llevaron a cabo pruebas de estadística

descriptiva para obtener medidas de tendencia central como

media y desviación estándar de las variables consideradas

en el estudio. Se aplicó la prueba de t de Student para la

comparación de medias entre sexos y una t de Student pa-

reada para comparar las variables de composición corporal

pre y post hemodiálisis. Los análisis de correlación entre los

valores de resistencia y reactancia estandarizadas, así como

entre las variables de composición corporal se realizaron por

el coeficiente de Pearson. Se realizó el análisis de varianza

(ANOVA), para comparar los cambios en la composición cor-

poral de acuerdo al diagnóstico nutricional. Para comparar

los vectores de impedancia se utilizó la prueba T2 de Hote-

lling con el programa BIVAMEAN (1998). Para comparar la

concordancia entre los métodos se utilizó la prueba Bland

Altman. En todos los casos se consideró significativa una p <

0.05.

Resultados

56 pacientes adultos fueron aleatorizados en dos grupos (Fi-

gura 3).

35

78.8%

Figura 3. Flujo del estudio.

*Cambio de entidad federativa

Al iniciar el estudio, no se encontraron diferencias significati-

vas entre los grupos.

Los VIBE basales pre y post- hemodiálisis de ambos grupos

indicaban sobrehidratación sin encontrar diferencias significa-

tivas entre los grupos (Figura 4A). Después de cuatro meses

de intervención, lo vectores del grupo VIBE en el periodo

post-diálisis, mostraban el logro de peso seco, a diferencia

del vector post-diálisis del grupo convencional, el cual se

mantuvo en la parte inferior de las elipses indicando sobrehi-

dratación. (p < 0,009 VIBE vs convencional) (Figura 4B). Se

encontró una diferencia significativa en los vectores basales

y finales del grupo VIBE (p <0.001) (Figura 4C).

Figura 4.A. Comparación de los vectores basales pre y post

diálisis de los grupos. Figura 4B. Comparación de los vecto-

res finales pre y post diálisis de los grupos. Figura 4C. Migra-

ción mensual del vector grupo VIBE.

Se encontró una disminución de hipotensión (grupo VIBE

-4.39% vs grupo convencional +20.9%) y edema clínico (Gru-

po VIBE: 95.7% basal vs 0% final, grupo convencional:

83.3% basal vs 54.2% final, p <0.001). (Tabla 1).

Inicialmente, el 82.6% y 95.8% de los pacientes estaban so-

brehidratados en el grupo VIBE y convencional respectiva-

mente. Al finalizar el estudio, el peso seco se alcanzó en

95.7% de los pacientes del grupo VIBE y en 4.2% en el gru-

po convencional. (Figura 5).

36

n= 56

VIBE

n=27

Traslados*

n=4 n=23

Convencional

n=29

Defunciones

n=5 n=24

A

B

C

Figura 5. Condición basal y final del estado de hidratación

En la Figura 6 podemos observar como inicialmente la desnu-

trición grave representaba el 30.4% para el grupo VIBE y el

33.3% para el grupo convencional. Al finalizar el tiempo de

intervención, la desnutrición grave se incrementó para el gru-

po VIBE un 13%, llegando hasta un 43.4%, sin embargo, pa-

ra el grupo convencional el incremento llega a ser el doble

del que muestra el grupo VIBE con un 58.3%. Los datos fina-

les de la intervención para el grupo VIBE reflejan el estado

real de nutrición ya que la sobrehidratación enmascara el

diagnóstico.

Figura 6. Diagnóstico nutricional basal y final de los grupos

de estudio. VIBE: grupo guiado por vectores de impedancia

bioeléctrica; CONVE: grupo guiado por el método convencio-

nal. D: desnutrición.

Se encontró una disminución en la PAM estadísticamente

significativa, siendo favorable para el grupo VIBE (p=0.005),

el número de antihipertensivos también mostro una disminu-

ción estadísticamente significativa, favoreciendo al grupo VI-

BE (p=0.0027) (Tabla 2).

Discusión

Este trabajo, es el primer estudio en la literatura científica

que compara los VIBE con los parámetros clínicos convencio-

nales utilizados en las unidades de hemodiálisis para ajustar

el ultrafiltrado y alcanzar el peso seco en los pacientes en

hemodiálisis.

La utilidad de los VIBE en pacientes nefrópatas para determi-

nar el peso seco fue establecida previamente utilizando un

equipo de bioimpedancia monofrecuencia (Atilano-Carsi et

al., 2012). En el presente estudio se usó un equipo de mono-

frecuencia a 50kHz, lo cual implica la imposibilidad de que la

corriente eléctrica atraviese la célula y por lo tanto no se pue-

de estimar directamente el AIC. A 50kHz se pueden estimar

el ACT y el AEC y por diferencia el AIC en pacientes en he-

modiálisis de forma confiable como lo demostraron Cigarran

et al., (2009) y Wabel et al., (2009). Los valores de resisten-

cia y reactancia obtenidos a través de equipos de monofre-

cuencia a 50kHz son suficientes para graficar el vector de

impedancia y ajustar el ultrafiltrado para alcanzar el peso en

los pacientes sometidos a hemodiálisis.

Como era de esperarse, en este estudio, la hipotensión y el

edema clínico son los principales signos clínicos que se redu-

jeron significativamente con respecto al grupo Convencional.

Lo anterior sugiere que la obtención del peso seco en forma

paulatina y controlada por los VIBE, resulta ser segura pu-

diendo conducir a largo plazo a un aumento en el aporte de

oxígeno tisular, disminución del daño en los tejidos cerebra-

les y cardíacos, disminución de la pérdida acelerada de la

función renal residual con reducción en la morbilidad y morta-

lidad (Sotomayor, 2005).

El manejo del balance de los líquidos es una de las funcio-

nes primarias de la diálisis. Cuando se compara a los pacien-

tes en HD antes del procedimiento dialítico y después de él,

se observa que están sobrecargados de volumen antes de

iniciar el tratamiento; la situación mejora después del procedi-

miento. Los pacientes en tratamiento dialítico han tenido ele-

vadas tasas de morbilidad y mortalidad, las que se han inten-

37

Convencional VIBE

tado reducir de varias formas. Se han probado diversas estra-

tegias para disminuir la mortalidad cardiovascular entre las

que están el aumento de la dosis de diálisis, el uso de estati-

nas, etc.. sin tener resultados positivo (Plum et al., 2001; Se-

rra Cabañas at al., 2010). Al respecto se estima que, el ajus-

te de la ultrafiltración podría reducir la mortalidad de los pa-

cientes en HD (Daugirdas 1993; Owen 1998; Lunts et al.,

2002; Borroto Díaz et al., 2006). En nuestro estudio, la deter-

minación del ultrafiltrado utilizando el método establecido

por Atilano-Carsi et al. (2012) para el grupo VIBE, podría re-

ducir la mortalidad, debido a que el incremento de la ultrafil-

tración tiende a ser mayor para el grupo VIBE (VIBE: 2.34 ±

1.3L vs Convencional: 0.9 ± 1.1L). Estos resultados, apoyan

la reducción de la medicación antihipertensiva (VIBE: -0.6 ±

0.49 vs Convencional: -0.45 ± 0.58), PAM (VIBE: -10.96 ±

10.2 mmHg vs Convencional: 9.3 ± 8.4 mmHg) y edema clíni-

co (VIBE: -95.7 vs convencional 29.1), factores que induda-

blemente se relacionan con la mejora en el estado de hidrata-

ción, debido a la disminución del agua corporal total (ACT),

agua intracelular (AIC) y mayormente agua extracelular

(AEC). Esta disminución del estado de volemia refleja un in-

cremento en la resistencia, con la consiguiente migración del

vector sobre el eje mayor en dirección a los cuadrantes supe-

riores, posicionando de esta forma, al grupo VIBE como el

mejor método para la determinación del peso seco compara-

do con el método establecido para el grupo convencional.

El mantenimiento de cifras de presión arterial elevadas duran-

te el período interdialítico, es sin duda uno de los factores

patogénicos más importantes en la evolución de los enfer-

mos bajo sustitución renal por hemodiálisis. En esta pobla-

ción, cerca del 90% de los casos de hipertensión arterial, se

debe a una sobrecarga de volumen y por lo tanto, está aso-

ciada a una ganancia de peso excesiva entre las sesiones de

diálisis (Kornerup, 2010). Como lo mencionamos con anterio-

ridad, en este estudio, la ultrafiltración guiada por VIBE se

correlaciona fuertemente con la disminución del estado de

volemia del paciente y la presión arterial; por lo tanto, a ma-

yor ultrafiltración, el estado de hidratación es más próximo a

lo deseado y se tiene mejor control de la presión arterial. Au-

nado a esto, la tolerancia a la diálisis, con frecuencia está

condicionada por la presencia de hipotensión arterial, náu-

seas, vómitos, calambres musculares y cefalea. Las manio-

bras encaminadas a lograr una solución de diálisis que satis-

faga los requerimientos terapéuticos y a su vez disminuya la

aparición de síntomas intradialíticos constituyen una de las

armas fundamentales en la práctica nefrológica para procu-

rar una aceptable tolerancia al tratamiento hemodialítico.

La náusea, el vómito y la cefalea, no se modifican significati-

vamente entre grupos debido a que su origen no se relaciona

directamente con la volemia sino con las concentraciones

elevadas de urea, anorexia y la presencia de gastritis medica-

mentosa y/o urémica (Cheng et al., 2005). Cuando la terapia

sustitutiva se realiza con el esquema de 2 sesiones o menos

por semana, las concentraciones de urea tienden a permane-

cer elevadas (Radecki y Nissenson, 2010) ocasionando los

signos y síntomas mencionados con anterioridad.

Para el grupo VIBE el incremento en los calambres muscula-

res, fue notorio comparado con el grupo convencional, esto

debido quizá a los trastornos hidroelectrolíticos (hiponatre-

mia, hipocalcemia, hipomagnesemia), la brusca extracción

de volumen por ultrafiltración y/o niveles elevados de uremia,

pero sobre todo al grado de desnutrición en este grupo, pues-

to que la tolerancia a la extracción de líquidos resulta ser me-

nor mientras el paciente empeora su estado de nutrición.

El análisis de vectores de impedancia es un método gráfico

cualitativo que permite evaluar al paciente en dos aspectos

simultáneamente. Por un lado evalúa el estado de hidrata-

ción y por otro lado el estado nutricio, por lo que este método

es de gran utilidad en pacientes sometidos a hemodiálisis

cuyas fluctuaciones hídricas son constantes y la desnutrición

está presente. Una de las consecuencias de la desnutrición

es la disminución de la masa celular, la cual es reemplazada

por fluidos extracelulares, causando expansión de volumen

(Devolder et at., 2010). Asociado a esto, se ha encontrado

que los pacientes con sobrehidratación tienen un inadecuado

consumo proteínico (Maggiore et alt., 1996). Los VIBE al ini-

cio del estudio, se situaron en el cuadrante inferior derecho,

indicando la presencia de sobrehidratación y desnutrición,

estos datos concuerdan con lo citado en la literatura para la

población con las mismas características (Buckalew et al.,

1996; Picoli, 1998; Atilano-Carsi et al., 2012). En nuestro es-

tudio el estado de nutrición fue diagnosticado utilizando el

índice de Bilbrey (1989), el cual fue modificado con el fin de

excluir la transferrina sérica, ya que su determinación es infre-

cuente en los exámenes bioquímicos de rutina. Al ser un índi-

ce que incluye parámetros antropométricos, bioquímicos y

clínicos, se confirmó que el estado de nutrición se enmasca-

ra por la sobrehidratación que usualmente tienen los pacien-

tes en hemodiálisis. Lo anterior se debe a que los paráme-

38

tros antropométricos utilizados para este índice compuesto,

principalmente la circunferencia brazo y el pliegue cutáneo

tricipital, arrojan valores alterados, esto debido a que la esti-

mación de la circunferencia muscular del brazo utiliza los va-

lores de las dos mediciones anteriormente mencionadas, lo

que finalmente se traduce en una alteración del puntaje para

tres de siete parámetros, este resultado se ve reflejado en el

diagnóstico del estado de nutrición basal para ambos grupos

de estudio. Sin embargo al finalizar el estudio, podemos ob-

servar como el grupo guiado por VIBE realmente refleja su

verdadero estado de nutrición, puesto que la disminución de

los fluidos corporales en este grupo de pacientes, nos permi-

ten obtener datos antropométricos con un mayor grado de

confiabilidad. Los pacientes guiados por el método convencio-

nal mostraron un peor estado nutricional en comparación con

los guiados por VIBE, reflejado por valores menores de Xc,

ángulo de fase, masa celular y albúmina sérica, lo que seña-

la nuevamente la relación estrecha entre el estado de hidrata-

ción y nutrición, que ha sido encontrada también por otros

investigadores (Picoli et al., 1999; Guida et al., 2000; Atilano-

Carsi et al., 2012).

Hay muchos factores que determinan el estado nutricional en

hemodiálisis, como el estado urémico que ocasiona anorexia

y vómito, procesos intercurrentes como infecciones o inflama-

ciones que ocasionan aumento del catabolismo, trastornos

metabólicos como acidosis y resistencia a la insulina que

afectan el anabolismo, aspectos relacionados con la técnica

de diálisis como la pérdida de nutrimentos a través del proce-

dimiento, la bioincompatibilidad del material extracorpóreo

que activa la generación de citoquinas como IL-1 y caquecti-

na como se menciona con anterioridad y finalmente los facto-

res psicosociales de una enfermedad que por su alto costo

afecta considerablemente la economía familiar y por lo tanto

la capacidad de consumir dietas hiperproteínicas.

El objetivo de la intervención de este estudio mediante al aná-

lisis de vectores de impedancia es llevar a los pacientes a un

punto dentro de las elipses de tolerancia del 50 y 75%. Atila-

no-Carsi et al., (2012) concluyen que la desnutrición grave

impide el logro del peso seco en pacientes en hemodiálisis

guiados por VIBE. En nuestra población, pese a la desnutri-

ción grave y el incremento en los calambres musculares, el

peso seco se alcanzó en el 95.7% de los pacientes guiados

por VIBE, el resto (0.03%) no alcanzo la normo hidratación

debido al tiempo de intervención, ya que este porcentaje de

pacientes al finalizar la intervención únicamente logró posicio-

narse en los límites del vector del 75%. Por lo que se debe

considerar implementar estrategias para corregir el volumen

de líquidos corporales y el estado de nutrición, mejorando la

calidad de vida de los pacientes y disminuyendo la morbi-

mortalidad.

Los vectores correspondientes a sobrehidratación, se han

relacionado con un riesgo relativo mayor de muerte (Pillon et

al., 2004) por lo que posiblemente los pacientes en los que el

peso seco no fue alcanzado y por ende permanecieron so-

brehidratados tendrán mayor riesgo de mortalidad, tal es el

caso de los pacientes del grupo Convencional, en quienes

solo se logró la obtención del peso seco en el 4.2% de la po-

blación.

Los vectores postdiálisis de los pacientes con disminución

del peso seco guiado por VIBE, migran sobre el eje mayor

posicionándose a la altura del cuadrante superior derecho,

indicando pérdida de líquidos corporales. Por el contario, los

vectores postdiálisis de los pacientes guiados por el método

convencional se mantuvieron en la parte inferior del eje ma-

yor, reflejando el incremento programado de agua corporal

sin la eliminación correcta de la misma.

Piccoli et al (1996, 1998, 1994) y Atilano-Carsi et al., (2012)

en sus trabajos demostraron que los valores de los vectores

sufren cambios después de la hemodiálisis, se desplazan

hacia arriba y se vuelven más largos. En este trabajo se ob-

servó el mismo fenómeno para el grupo VIBE, sin embargo

podemos constatar que mientras trascurre el tiempo de inter-

vención, los vectores grupales van sufriendo una ligera dismi-

nución en el alargamiento hasta formar una elipse ligeramen-

te circular, lo que representa la homogenización de este gru-

po de pacientes sin importar la ubicación inicial del vector.

Conclusiones

El análisis de VIBE son una herramienta útil para determinar

y ajustar el peso seco en los pacientes con ERCA sometidos

a hemodiálisis que supera los métodos convencionales.

La utilización de VIBE para determinar el peso seco de los

pacientes en HD disminuye el riego de presentar complica-

ciones relacionadas con la sobrehidratación.

La utilización de los VIBE como método para la estimación

de peso seco en pacientes en HD, a largo plazo, permite dis-

39

minuir el número de antihipertensivos, TAM, edema clínico y

sintomatología.

La correcta estimación y mantenimiento del peso seco en los

pacientes en hemodiálisis es un factor importante a conside-

rar entre los parámetros de diálisis adecuada.

El diagnóstico del estado de nutrición en los pacientes en he-

modiálisis se ve enmascarado por el exceso de líquidos cor-

porales y puede interferir en el logro del peso seco.

La utilización de los VIBE en el diagnóstico del estado de nu-

trición es un indicador más certero que los índices compues-

tos establecidos para estos pacientes.

vida de los pacientes y disminuyendo la morbi-mortalidad. Los vectores correspondientes a sobrehidratación, se han relacionado con un riesgo relativo mayor de muerte (Pillon et al., 2004) por lo que posiblemente los pacientes en los que el peso seco no fue alcanzado y por ende permanecieron sobrehidratados tendrán mayor riesgo de mortalidad, tal es el caso de los pacientes del grupo Convencional, en quienes solo se logró la obtención del peso seco en el 4.2% de la población. Los vectores postdiálisis de los pacientes con disminución del peso seco guiado por VIBE, migran sobre el eje mayor posicionándose a la altura del cuadrante superior derecho, indicando pérdida de líquidos corporales. Por el contario, los vectores postdiálisis de los pacientes guiados por el método convencional se mantuvieron en la parte inferior del eje mayor, reflejando el incremento programado de agua corporal sin la eliminación correcta de la misma. Piccoli et al (1996, 1998, 1994) y Atilano-Carsi et al., (2012) en sus trabajos demostraron que los valores de los vectores sufren cambios después de la hemodiálisis, se desplazan hacia arriba y se vuelven más largos. En este trabajo se observó el mismo fenómeno para el grupo VIBE, sin embargo podemos constatar que mientras trascurre el tiempo de intervención, los vectores grupales van sufriendo una ligera disminución en el alargamiento hasta formar una elipse ligeramente circular, lo que representa la

homogenización de este grupo de pacientes sin importar la ubicación inicial del vector.

V. Conclusiones El análisis de VIBE son una herramienta útil para determinar y ajustar el peso seco en los pacientes con ERCA sometidos a hemodiálisis que supera los métodos convencionales. La utilización de VIBE para determinar el peso seco de los pacientes en HD disminuye el riego de presentar complicaciones relacionadas con la sobrehidratación. La utilización de los VIBE como método para la estimación de peso seco en pacientes en HD, a largo plazo, permite disminuir el número de antihipertensivos, TAM, edema clínico y sintomatología. La correcta estimación y mantenimiento del peso seco en los pacientes en hemodiálisis es un factor importante a considerar entre los parámetros de diálisis adecuada. El diagnóstico del estado de nutrición en los pacientes en hemodiálisis se ve enmascarado por el exceso de líquidos corporales y puede interferir en el logro del peso seco. La utilización de los VIBE en el diagnóstico del estado de nutrición es un indicador más certero que los índices compuestos establecidos para estos pacientes.

Tabla1. Frecuencias de sintomatología basales y finales de los dos grupos

Grupo VIBE Grupo convencional

Delta n=23

P Delta n=24

P p*

Pérdida de conocimiento (%) 0 ns 0 ns ns

Calambres (%) 8.7 0.000 8.3 ns ns

Cefalea (%) -4 0.000 -12.5 0.000 ns

Termino de diálisis por sintomatología (%) -4.3 ns 0 ns ns

Hipotensión (%) -4.34 0.000 20.9 0.000 0.046

Nausea (%) 4.26 0.000 0 ns ns

Vomito (%) 0 ns 0 ns ns

Edema clínico (%) -95.7 0.000 29.1 0.000 0.000

Delta: diferencia entre los valores finales e iniciales de los grupos. n: número de individuos. ns: no significativo. * VIBE final vs. Convencional final. P<0.05

Tabla 2. Comparación de las características generales basales y finales de los grupos de estudio

Grupo VIBE Grupo Convencional

Delta n=23

P Delta n=24

P p*

Peso pre hemodiálisis (Kg) -3.52 + 2.46 .000 -1 + 1.6 0.000 ns

Peso post hemodiálisis (Kg) - 4.02 + 2.7 .000 -1.2 + 1.2 0.000 ns

Peso seco real(kg) -2.31 + 2.54 .000 0.62 +1 0.000 ns

Ganancia de peso Inter diálisis (kg)

-0.32 + 1.1 ns -0.09 + 1 ns ns

IMC pre diálisis (kg/m2) 1.24 (-16.5 – 9) .000 0.38 (-1.0 – 2.2) 0.000 ns

IMC post dialysis (kg/m2) 1.82 (-16.08 – 10) .000 0.30 (-2.4 – 1.46) 0.000 ns

Ultrafiltrado (L) 2.34 + 1.3 .000 0.9 + 1.1 ns 0.000

Antihipertensivos (#) -0.6 + 0.49 .000 -0.45 + 0.58 ns 0.0027

TAM pre diálisis (mmHg) -14.2 + 10.3 .000 -13.2 + 10.5 0.000 0.010

TAM post diálisis (mmHg) -10.96 + 10.2 .003 -9.3+ 8.4 0.000 0.005

VI. Bibliografía Atilano-Carsi X, Johanan-Lopez M, Martinez-

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Biodisponibilidad de zinc en trigo biofortificado

5

J. Conde, OP. García, J. Westcott, K. González, KM. Hambidge, LV. Miller, C. Hotz, W. Pfeiffer, I. Ortiz-Monasterio, NF. Krebs, JL. Rosado

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro

jennifer_conde@hotmail.com

43

Resumen

La finalidad de este trabajo consistió en evaluar la biodisponi-

bilidad de zinc (Zn) a partir de trigo biofortificado en huma-

nos. 26 mujeres adultas, residentes de una comunidad semi-

rural de Querétaro, México, fueron aleatoriamente asignadas

a consumir durante 2 días consecutivos un total de 300 g de

harina de trigo -biofortificado o tradicional- con que se elabo-

raron tortillas. Las comidas fueron marcadas extrínsecamen-

te con 1 de 2 isótopos estables de Zn (cada uno administra-

do en diferente día) y un tercer marcador de isótopo estable

se administró vía intravenosa. La absorción fraccional de Zn

(AFZ) fue determinada con una técnica de marcaje con isóto-

po dual basada en enriquecimiento de orina con isótopos es-

tables de zinc. La absorción de Zn de la harina derivada del

trigo seleccionado por su alto contenido de Zn fue compara-

da con la de un trigo similar pero con contenido típico de Zn.

Mas aun, estas comparaciones se hicieron entre harinas que

tuvieron dos diferentes grados de extracción, 95% y 80%.

Los resultados muestran que el promedio total de Zn ingerido

del trigo con alto contenido de Zn fue 55% mayor que del tri-

go con típico contenido del micronutrimento, sin embargo, la

diferencia de Zn absorbido de un trigo y otro fue de 25%,

siendo mayor la absorción a partir del trigo con alto conteni-

do de Zn. La AFZ es inversamente proporcional a la inges-

tión total de Zn (ITZ), mientras que la absorción total es direc-

tamente proporcional a ésta y la diferencia entre ATZ del tri-

go biofortificado y del trigo tradicional es estadísticamente

significativa. Potencialmente es posible lograr incrementos

importantes en la absorción de Zn a partir de la biofortifica-

ción de trigo con Zn.

Palabras clave: biodisponibilidad, biomarcadores, isótopos

estables, grado de extracción, absorción, biofortificación.

Introducción

Se estima que una tercera parte de la población mundial, in-

cluyendo países desarrollados, vive en áreas con riesgo alto

de tener deficiencia de zinc (Zn). Se estima que la ingestión

promedio de Zn a nivel mundial cubre solamente del 50-80%

de los requerimientos diarios (Lotfi et al, 1996, FAO/OMS,

2003). La biofortificación de cereales con Zn, especialmente

tratándose del trigo, que es el cereal de mayor cultivo, comer-

cialización y consumo a nivel mundial (Nelson, 1985), ofrece

la posibilidad de reducir significativamente la prevalencia e

incidencia de la deficiencia de Zn. Sin embargo, el ácido fíti-

co, presente en vegetales y cereales, ha sido reportado co-

mo el factor que mayormente ha sido reportado como el fac-

tor que mayormente impide una adecuada biodisponibilidad

de zinc (Hambidge, 2004). Con la finalidad de asegurar que

las estrategias que se están desarrollando actualmente para

fortificar cultivos pueden ofrecer un mayor aporte de Zn bio-

disponible, el presente estudio tuvo como objetivos comparar

la biodisponibilidad de Zn a partir de dos diferentes tipos de

trigo (tradicional y biofortificado) utilizando isótopos estables,

así como determinar el efecto de dos distintos grados de ex-

tracción del trigo (80% y 95%) en la biodisponibilidad del Zn.

La principal hipótesis probada en este proyecto fue que la

absorción de Zn es mayor a partir del trigo biofortificado con

Zn que del trigo control cuando lo consumen mujeres adultas

como su principal fuente de energía y nutrimentos.

Material y métodos

Diseño del estudio.Se trata de un estudio de tipo aleatoriza-

do, experimental cruzado, doble ciego, de corto plazo, para

conocer la cantidad de Zn absorbido de un trigo biofortificado

con Zn en comparación con trigo control por mujeres adultas

sanas que reportaron tener un consumo habitual de granos

(principalmente maíz, trigo y frijoles) y fitatos provenientes de

los mismos. La población de estudio fue dividida en 9 grupos

aleatoriamente asignados a uno de 2 diferentes tratamientos,

los cuales consistieron en harina de trigo, para ser consumi-

da 2 días consecutivos (días 1 y 2 del estudio). La diferencia

entre los tratamientos consistió en el grado de extracción de

la harina; para uno fue del 95% (n = 15) y para el otro, del

80% (n = 15). Posteriormente por aleatorización también, se

determinó el orden en que consumiría cada uno de los gru-

pos, durante los días 1 y 2, el trigo biofortificado con Zn y el

tradicional. Cada grupo consumió además, durante el día 0,

tortillas elaboradas con harina de trigo comercial refinada o

integral, según les haya correspondido el tratamiento de hari-

na experimental con 80% o 95% de extracción, respectiva-

m e n t e ( F i g . 1 ) .Se entiende como harina de trigo tradicional al producto deri-

vado de la molienda del grano de trigo de primavera (triti-

cum) con contenido normal o típico de Zn, y como harina de

trigo biofortificado al producto derivado de la molienda de un

grano de trigo biofortificado con Zn con un contenido más

a l t o d e d i c h o m i n e r a l .La absorción de zinc en los sujetos se determinó usando la

44

técnica de doble marcaje con 3 isótopos estables; Zn67,Zn68

yZn70.

Participantes y dieta habitual.La población de estudio fue se-

leccionada a conveniencia y quedó conformada por 30 muje-

res adultas residentes de la comunidad semi-rural Fuentezue-

las, del municipio de Tequisquiapan, Querétaro, México. Su

edad promedio fue de 31 años, con un rango comprendido

entre 18 y 45 años. Los criterios de exclusión incluyeron em-

barazo, lactancia, suplementación con Zn, diarrea o algún

otro síndrome de malabsorción referido. El tamaño de la

muestra fue determinado por la limitada cantidad de trigo bio-

fortificado disponible para este estudio. Sin embargo, la

muestra poblacional fue adecuada para el cumplimiento de

los objetivos planteados. El presente estudio fue aprobado

por el Comité Interno de Investigación en Humanos de la

UAQ y por el Consejo de Revisión Múltiple Institucional del

Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Colora-

do (COMIRB UCHSC por sus siglas en inglés, Colorado Multi-

ple Institutional Review Board of the University of Colora-

doHealth Sciences Center). De cada participante se obtuvo

firma de la carta de Consentimiento Informado de acuerdo a

los lineamientos éticos de los comités mencionados.

Figura 1. Diagrama de flujo que representa elesquema de

aleatorización.

Selección del trigo. El trigo experimental, tanto biofortificado

como tradicional, fue seleccionado por el Centro Internacio-

nal de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT) en México

para Harvest Plus. Cada uno de los tipos de trigo fue de una

cosecha de diferentes líneas y variedades que crecieron den-

tro de una misma zona de México, en un vivero en el Valle

de Yaqui, Sonora. Dicha cosecha fue el resultado de una

combinación de diferentes variedades de trigo; 5 con alto con-

tenido de Zn para obtener un grano de trigo con alto conteni-

do de este nutrimento (trigo biofortificado) y 5 con típico con-

tenido de Zn para obtener un grano de trigo con típico conte-

nido del nutrimento (trigo tradicional).Las variedades de trigo

mejoradas que tienen alto contenido de Zn se originaron de

la siguiente manera: la semilla que tiene los niveles más al-

tos de Zn proviene de líneas nativas de trigo y de parientes

silvestres de este cereal, como Triticumdicoccon y Aegilops-

taushii, respectivamente. Las mejores fuentes provienen de

parientes silvestres del trigo que no pueden cruzarse directa-

mente con el trigo moderno; por tal razón, los investigadores

del CIMMYT facilitaron el cruzamiento entre un pariente sil-

vestre de trigo (Aegilopstaushii) y una variedad primitiva de

trigo (Triticumdicoccon), ambos con un alto contenido de Zn,

y desarrollaron así una variedad de trigo hexaploide. Este

trigo, que puede cruzarse directamente con las actuales va-

riedades modernas del cereal, tiene niveles de Zn en el gra-

no que son de 40 a 50% más altos que los encontrados en el

trigo tradicional moderno. En ambos tipos de cereal se anali-

zó el contenido de Zn y de fitatos, por los investigadores del

CIMMYT (en Sonora, Coahuila, México) con la técnica de

digestión con ácido nítrico y análisis multi-elemental de mate-

rial vegetal a través de Espectrometría de Conductividad Aco-

plada(ICPS por sus siglas en inglés, InductivelyCoupled Plas-

ma Spectrometry). En los laboratorios del CYMMIT también

se llevó a cabo el proceso de molienda con molinos de pie-

dra (para evitar contaminación con metales de los fierros y

de piezas galvanizadas de otro tipo de molino) para obtener

la harina de cada tipo de trigo (biofortificado y tradicional)

con 95% y 80% de extracción.

Dieta experimental.La dieta que se proporcionó a las partici-

pantes durante los días 0, 1 y 2 fue preparada día con día

por el equipo de trabajo a partir de 300 g de harina de trigo y

alimentos con muy bajo contenido de Zn (jitomate, cebolla,

chile serrano y jugo de manzana envasado), y 3 colaciones

opcionales a base de una fruta distinta cada día: melón, san-

día o jícama. Las tortillas fueron preparadas con distintos ti-

pos de harina: comercial integral, comercial refinada, integra-

45

les con 95% de extracción a partir de un trigo biofortificado

con Zn y de uno tradicional con contenido típico de Zn y, refi-

nadas con 80% de extracción, igualmente obtenidas de 2 di-

ferentes tipos de trigo. El número de tortillas de todo un día

fue dividido para su consumo entre desayuno, comida y ce-

na, en cantidades iguales. Cada uno de los 3 días las partici-

pantes asistieron en ayunas a la casa del DIF de la Comuni-

dad para consumir las comidas del día bajo la supervisión

del equipo de investigación. Se intentó que las participantes

consumieran las comidas en su totalidad y cuando no se lo-

gró esto se obtuvo el peso del residuo de alimento en el plato

o de jugo en el vaso y se registró.

Preparación de isótopos. Las soluciones de isótopos esta-

bles fueron preparadas en Colorado y entregadas personal-

mente en México. Las soluciones de isótopos se prepararon

a partir de óxido de Zn enriquecido (Trace Sciences Interna-

cional, Toronto, Canadá), disolviendo la sal en 2 mL de

H2SO4 1M y agitando bien hasta que todas las partículas se

integraron a la solución.Las dosis intravenosas fueron poste-

riormente disuelta en NaCl al 0.45% estéril y ajustado con

NaOH para obtener el pH deseado para la infusión intraveno-

sa (pH 6.0). Las dosis orales, fueron diluidas en agua Milli-Q

(MQ), que es triplemente filtrada, libre de trazas de minerales

y ajustada a pH 3.0 usando NaOH. Las soluciones de isóto-

pos fueron vertidas, a través de un filtro de 0.2 micras, direc-

tamente a viales estériles (soluciones IV) o tubos de ensaye

(soluciones orales) bajo un flujo laminar usando técnica esté-

ril. Todas las soluciones fueron probadas contra pirógenos y

esterilidad antes de ser administradas a los sujetos.

Administración de isótopos. De acuerdo a un procedimiento

estándar para marcado extrínseco con isótopos estables de

Zn se administró a las participantes vía oral una solución

acuosa de ~100 µg con ~40.88 µg Zn70/mL de isótopo esta-

ble con cada comida experimental durante el día 1 (~122.63

µg Zn70/día). De igual manera una solución de ~200 µg con

~34.35µg Zn67/mLfue administrada con cada comida experi-

mental durante el día 2 (~103.05 µg Zn67/día). La ingestión

total de cada uno de estos 2 isótopos de Zn representa apro-

ximadamente el 5% y 10%, respectivamente, de la ingestión

dietaria del micronutrimento de esos 2 días. Las participantes

procuraron ingerir la solución en tres tomas, directamente del

tubo de ensaye, comenzando a la mitad de cada tiempo de

comida, es decir al terminar de comer la segunda tortilla y

continuaron al terminar de comer la tercera y cuarta tortillas.

Cada tubo de ensaye fue enjuagado 3 veces con agua MQ y

ésta también fue ingerida por las participantes. Todo el proce-

dimiento se hizo teniendo como base, sobre la mesa de tra-

bajo, un papel filtro con peso conocido para poder cuantificar

cualquier derrame de solución con isótopo.El día 1, después

de transcurrida 1 hora del término de consumo de la cena

experimental, se administró a cada mujer una solución de

~800 µg con 103.02 µg Zn68/mL de isótopo estableZn68 en

una vena periférica del antebrazo. Tanto los viales como la

jeringa fueron enjuagados 2 veces con agua MQ y también

ésta fue administrada. El procedimiento se hizo teniendo co-

mo base, sobre la mesa de trabajo, un papel filtro con peso

conocido para poder cuantificar cualquier derrame de solu-

ción con isótopo.Los tiempos de acción fueron previamente

determinados como óptimos con base en una prueba de si-

mulación que usó un modelo de compartimentos del metabo-

lismo de zinc (Miller et al, 2000).

Recolección de las muestras. El lote de tortillas preparado

cada día incluyó una tortilla muestra para el posterior análisis

de Zn y fitatos, hasta antes del cual permaneció congelada

dentro de una bolsa de plástico con cierre hermético (Zi-

ploc®) debidamente etiquetada.

Durante los 3 días de dieta experimental, después de cada

tiempo de comida, se pesó un duplicado de la cantidad con-

sumida por cada participante de cada uno de los alimentos

ofrecidos adicionales a las tortillas, incluyendo la fruta de las

colaciones. La finalidad de tener una réplica del consumo in-

dividual durante todo un día fue conocer el contenido nutri-

mental preciso de estos alimentos. Por cada sujeto se obtu-

vieron 3 bolsas de duplicado de dietas, una por cada día. To-

das las muestras de alimentos y bebida fueron congeladas

hasta el momento en que se enviaron a la Universidad de

C o l o r a d o ( U C ) p a r a s u a n á l i s i s . Los días 6-8 del estudio, después de haber completado la

administración de isótopos, cada participante recolectó 2

muestras diarias de orina de aproximadamente 80 mL (la pri-

mera y última micciones del día), adicionalmente a una mues-

tra basal matutina recolectada antes de consumir la dieta e

isótopos (día 0). Las muestras fueron guardadas a -20 ºC

hasta el momento en que fueron empacadas de manera con-

vencional hasta ser enviadas a la UC para su análisis.

Análisis de las muestras. Para el análisis de Zn en tortillas,

éstas fueron deshidratadas a una temperatura de 100 ºC, y

posteriormente hechas cenizas en una mufla a 450 ºC en 24

horas, se hidrataron las cenizas con ácido nítrico (HNO3),

46

fueron devueltas a la mufla otras 24 horas y cuantitativamen-

te reconstituidas en ácido clorhídrico (HCl) 6M diluido en HCl

0.1M. El Zn total fue medido en la muestra de cenizas por

Espectrofotometría de Absorción Atómica de Flama (EAAF).

El contenido de Zn en los alimentos de la dieta experimental,

en los granos de trigo y las diferentes harinas se determinó

por EAAF ajustada con deuterio. Para el análisis de fitatos se

empleó una prueba de HPLC con intercambio de aniones pa-

ra hacer una medición directa de fitatos y fosfatos de inositol

relacionados. Las muestras de orina fueron digeridas en hú-

medo para remover toda materia orgánica presente usando

un sistema de digestión con horno de microondas, posterior-

mente el Zn se separó de otros compuestos inorgánicos por

quelación/extracción con éter. Las relaciones entre los isóto-

pos se midieron por Espectrometría de Masas de Conductivi-

dad Acoplada(ICP-MS por sus siglas en inglés, Inductively-

Coupled Plasma MassSpectrometry). Para purificar las mues-

tras éstas fueron diluidas en HNO3 al 2% hasta obtener 8 mL

de una solución con 50 ppb de zinc. El ICP-MS fue operado

con el modo de detección por conteo de iones, optimizado a

una masa de 66 para detectar el índice máximo posible (50

ppb Zn66). Se midieron las siguientes relaciones entre isóto-

pos: Zn67/Zn66, Zn68/Zn66 y Zn70/Zn66,y fueron convertidas a

enriquecimiento (definido como la cantidad de isótopo de Zn

en la muestra dividido entre la cantidad total de Zn en la mis-

ma). La descripción completa del método analítico ha sido

previamente publicada (Hambidgeet al, 2004).

Análisis de datos. El procesamiento de datos incluyó cálculos

del total de Zn en la dieta experimental (TZD), absorción frac-

cional de Zn (AFZ) y absorción total de Zn (ATZ).La AFZ se determinó por una técnica de marcaje con isótopo

dual (DITR por sus siglas en inglés, Dual-Isotope-Tracer Ra-

tio) basada en el enriquecimiento de orina con isótopos esta-

bles de Zn. Para cada sujeto los datos del enriquecimiento

de orina con el isótopo estable de Zn administrado vía intra-

venosa (Zn68) fueron extrapolados a 24 horas para calcular

la AFZ de los isótopos de zinc administrados vía oral (Zn67

yZn70). Así, la AFZ fue determinada a partir de la relación en-

tre el enriquecimiento de la orina con las dosis orales y el en-

riquecimiento de la orina con la dosis intravenosa.La ATZ de

las comidas experimentales junto con los isótopos administra-

dos, se determinó multiplicando la cantidad conocida de Zn

ingerido por la absorción fraccional previamente determina-

d a .

Así, el TZD y la ATZ para cada individuo fueron calculados a

partir de las siguientes ecuaciones:

TZD (mg Zn) = mg Zn en cada g de dieta experimental * g de

dieta experimental consumida

ATZ (mg Zn) = TZD (mg Zn) * AFZ (mg Zn)

A partir de los datos obtenidos en el estudio se calcularon

estadísticos descriptivos de tendencia central y de dispersión

para conocer variables de interés propias del estudio como

concentraciones de Zn y de fitatos en la dieta experimental y

AFZ y ATZ partir de la misma.Se hizo una comparación con

prueba de T para muestras pareadas: entre la ATZ en un día

y la AFZ al consumir alimentos preparados con trigo biofortifi-

cado con Zn, con el total absorbido en otro día a partir de

una dieta a base de trigo tradicional; con los 2 grados de ex-

tracción (80% y 95%). Se hizo una comparación a través de

la prueba de T en el alto y el típico contenido de Zn entre los

2 n i v e l e s d e e x t r a c c i ó n .Los resultados se reportan como medias + DE.El análisis de los datos se hizo con el programa estadístico

SPSS (StatisticalPackagefor Social Sciences) versión 14.0.

Resultados

Solamente 27 mujeres completaron el estudio. Los resulta-

dos de orina de 1 de éstas fueron inutilizables por la concen-

tración inusualmente baja de Zn en su muestra de orina alta-

mente diluída. Por lo tanto, para el análisis de resultados úni-

camente fueron tomados en cuenta los de 26 mujeres.En cuanto al análisis del trigo experimental, se encontró una

mínima diferencia en los contenidos de Zn y fitatos entre el

grano de trigo entero y las harinas con 95% de extracción

(tanto biofortificada como tradicional). Sin embargo, la dife-

rencia de contenidos entre el grano entero y las harinas con

80% de extracción fue importante, ya que en estas últimas

hubo en promedio una reducción de 40% en Zn y 65% en

fitatos. Mientras que la diferencia entre harinas y tortillas fue

la siguiente: las tortillas de harina (biofortificada y tradicional)

con 95% de extracción tuvieron en promedio 32.5% menos

Zn y 43.5% menos fitatos que su harina correspondiente, y

las tortillas con 80% de extracción tuvieron en promedio 57%

menos Zn y 52.5% menos fitatos que su harina correspon-

diente. (Tabla 1) últimas hubo en promedio una reducción de

40% en Zn y 65% en fitatos. Mientras que la diferencia entre

47

harinas y tortillas fue la siguiente: las tortillas de harina (bio-

fortificada y tradicional) con 95% de extracción tuvieron en

promedio 32.5% menos Zn y 43.5% menos fitatos que su ha-

rina correspondiente, y las tortillas con 80% de extracción

tuvieron en promedio 57% menos Zn y 52.5% menos fitatos

que su harina correspondiente. (Tabla 1) Se encontró que la

pérdida de Zn y de fitatos después del proceso de extracción

fue de acuerdo con lo esperado según lo que reportes de in-

vestigadores del CIMMYT. Haciendo especial hincapié en el

contenido de Zn, de forma muy general se ha visto que las

harinas con 80% de extracción contienen aproximadamente

la mitad de la concentración de Zn que el grano de trigo del

cual derivan, así como al ser comparada con una harina simi-

lar con 95% de extracción, ya que entre el grano y las hari-

nas con este último grado de extracción, que es alto, la con-

centración del nutrimento es prácticamente la misma. Por otro lado, la menor concentración de Zn y de fitatos en

las tortillas comparadas con la harina de la cual derivaron, se

debe a la adición de otros ingredientes para su preparación

(manteca vegetal, agua y sal).

Tabla 1. Contenido de Zn (zinc) y fitatos en 2 variedades de

grano de trigo y en sus productos; 4 variedades de harina y

tortillas

Tabla 2. Ingestión total de zinc (ITZ) y de fitatos (ITF), y la

absorción fraccional (AFZ) y total de zinc (ATZ) con el consu-

mo de harina de trigo tradicional y biofortificada con 80% de

extracción

Extracción Harina de Trigo

ITZ1 (mg) ITF (mg) AFZ (mg) ATZ (mg)

80% Tradicional 3.9 + 0.1 646 + 27 0.38 + 0.1 1.5 + 0.5a

80% Biofortificada 6.6 + 0.1 771 + 81 0.31 + 0.1 2.0 + 0.5a

1 Incluye dosis oral de isótopos de zincap= 0.01

El contenido de Zn en cada tipo de harina, aun en las bioforti-

ficadas, estuvo dentro de los límites máximos (40-50 mg/día)

propuestos como seguros para adultos (Food and Nutrition-

Board, Institute of Medicine, 2001; Hambidge, 2000; IZiNCG,

2004). Se registró una diferencia estadísticamente significati-

vaentre la ATZ de harina biofortificada y de harina tradicional

(p = 0.01 en 80% extr., p = 0.06 en 95% extr.). El grado de

extracción de la harina (80% y 95%) no alteró la ATZ, proba-

blemente debido a la relación directa que existe entre el con-

tenido de fitatos y de Zn en las harinas. Al haber mayor con-

centración de fitatos en una harina integral (95% extr.), hay

también un incremento compensado de Zn que favorece te-

ner una mayor absorción de éste. Así, la ATZ es directamen-

te proporcional a la ingestión total de Zn (ITZ), contrario a

esto, la AFZ es inversamente proporcional a la ITZ a partir de

diferentes tipos de harina de trigo. (Tablas 2, 3) Un menor

grado de extracción corresponde a un menor contenido de

fitatos y este último, tanto en el trigo tradicional como en el

biofortificado, tiene una correlación inversa significativa con

la AFZ (r = -0.654, p< 0.01 y r = -0.759, p< 0.01 respectiva-

m e n t e ) . La ATZ individual de harinas con extracción del 95% y 80%

de cada trigo (biofortificado y tradicional) fue muy similar. Es-

to se puede explicar por el hecho de que las reducciones de

fitatos y de Zn durante el proceso de molienda o extracción

se dan de manera proporcional, ya que durante éste se elimi-

nan las capas más externas y gruesas del grano, principal-

mente la capa de aleurona, con el mayor contenido de fitatos

y Zn. Los resultados, tomando en cuenta los dos diferentes

grados de extracción, muestran que el promedio de ITZ con

trigo biofortificado fue 55% mayor que con trigo tradicional,

48

Trigo Grano

entero 95% de extracción95% de extracción 80% de extracción80% de extracción

Harina Tortilla Harina TortillaZinc Tradicional 23.6 23.0 16.0 ± 0.4 14.4 + 0.3 7.1 ± 0.2

(µg Zn/g)

Biofortificado

41.3 40.5 29.4 ± 0.8 23.8 ± 0.4 13.0 ± 0.3

Fitatos Tradicional 8.9 9.0 5.05 ± 0.39 3.4 1.56 ± 0.24 (mg F/

g)Biofortifica

do11.1 9.3 5.59 ± 0.38 3.3 1.73 ± 0.19

sin embargo, la diferencia en la ATZ con un trigo y otro fue

sólo de 25%, siendo mayor a partir del biofortificado.De la

ITZ de harina biofortificada con 80% de extracción, la ATZ

fue de 30.3% (Tabla 2), mientras que de la ITZ de harina bio-

fortificada con 95% de extracción, la ATZ fue de 15.5% (Ta-

bla 3). Esto puede sugerir que el Zn proveniente de algún

componente aislado de la dieta, como un complemento ali-

menticio -y además administrado sin alimentos- logra ser me-

jor absorbido que aquel proveniente de una dieta, dado que

en el primer caso no hay interrelación con otros componen-

tes alimenticios que disminuyen su absorción. En la Figura 2

se muestra un decremento abrupto en la eficiencia de la utili-

zación de las fracciones de Zn a medida que éstas son mayo-

res, mientras que en la Figura 3 se ilustra el efecto contrario

con la utilización del total de Zn, la cual es directamente pro-

porcional a la ingestión del nutrimento en un periodo de tiem-

po. Sin embargo, el incremento en la ATZ es progresivamen-

te menor a medida que es mayor la cantidad de Zn ingerido

con cada tratamiento.

Tabla 3. Ingestión total de zinc (ITZ) y de fitatos (ITF), y la

a b s o r c i ó n f r a c c i o n a l ( A F Z ) y t o t a l d ezinc (ATZ) con el consumo de harina de trigo tradicional y

biofortificada con 95% de extracción

Extracción Harina de Trigo

ITZ1 (mg) ITF (mg) AFZ (mg) ATZ (mg)

95% Tradicional 7.9 + 0.2 2217 + 156 0.20 + 0.05 1.6 + 0.4b

95% Biofortificada 13.6 + 0.4 2378 + 145 0.15 + 0.05 2.1 + 0.7b

1 Incluye dosis oral de isótopos de Zn (zinc)

bp = 0.06

Figura 2. 4 modelos de consumo de Zn: 1) hari-

na de trigo tradicional 80% extr. día 1 (prom. 3.9 + 0.1 mg

Zn) y harina de trigo biofortificado 80% extr. día 2 (prom. 6.6

+ 0.1 mg Zn); 2) harina de trigo biofortificado 80% extr. día 1

(prom. 6.6 + 0.1 mg Zn) y harina de trigo tradicional 80%

extr. día 2 (prom. 3.9 + 0.1 mg Zn); 3) harina de trigo tradicio-

nal 95% extr. día 1 (prom. 7.9 + 0.2 mg Zn) y harina de trigo

biofortificado 95% extr. día 2 (prom. 13.6 + 0.4 mg Zn); y 4)

harina de trigo biofortificado 95% extr. día 1 (prom. 13.6 + 0.4

mg Zn) y harina de trigo tradicional 95% extr. día 2 (prom. 7.9

+ 0.2 mg Zn). (p< 0.01)

Figura 3. 4 modelos de consumo de Zn: 1) harina de trigo

tradicional 80% extr. día 1 (prom. 3.9 + 0.1 mg Zn) y harina

de trigo biofortificado 80% extr. día 2 (prom. 6.6 + 0.1 mg

Zn); 2) harina de trigo biofortificado 80% extr. día 1 (prom.

6.6 + 0.1 mg Zn) y harina de trigo tradicional 80% extr. día 2

49

!

(prom. 3.9 + 0.1 mg Zn); 3) harina de trigo tradicional 95%

extr. día 1 (prom. 7.9 + 0.2 mg Zn) y harina de trigo biofortifi-

cado 95% extr. día 2 (prom. 13.6 + 0.4 mg Zn); y 4) harina de

trigo biofortificado 95% extr. día 1 (prom. 13.6 + 0.4 mg Zn) y

harina de trigo tradicional 95% extr. día 2 (prom. 7.9 + 0.2 mg

Zn). (p< 0.01)

A pesar de que el consumo de alimentos con mayor conteni-

do de Zn puede reducir la AFZ, la biofortificación a los nive-

les estudiados afecta positivamente la ATZ de un día. Entre

la ATZ y la AFZ existe una relación inversa (Figuras 3, 4).

Esto puede explicarse porque el proceso de transporte satu-

rable del Zn ocurre en fracciones de tiempo menores, mien-

tras que a lo largo de un día, en el que ocurre la ATZ, tiene

participación también un transporte pasivo de difusión. Dado

lo anterior, se puede considerar que es la ATZ la que permite

evaluar con mayor objetividad la biodisponibilidad del

mineral.Por otro lado, este estudio mostró que, independien-

temente del grado de extracción de la harina, cuando un gru-

po de sujetos consumió 2 cantidades muy similares de Zn a

las de otro grupo en 2 días consecutivos en estado post-ab-

sortivo, cambiando únicamente el orden de consumo (1er

día: consumo alto (harina biofortificada) y 2ndo día: bajo (hari-

na tradicional), o viceversa), la absorción de Zn (AFZ y ATZ)

fue diferente. Ésta resultó ser mayor el día 1; hubo una dife-

rencia en la AFZ de 43% entre harinas tradicionales y 15%

entre biofortificadas. La diferencia en la ATZ fue 35%

Tabla 4. Promedio de absorción fraccional de zinc (AFZ) y

absorción total de zinc (ATZ) determinado en los 26 mujeres

en estado post-absortivo

Trigo tradicional

consumido el 1er día (día 1)

Trigo tradicional

consumido el 2º día (día 2)

Trigo biofortificado

consumido el 1er día (día 1)

Trigo biofortificado

consumido el 2º día (día 2)

AFZ (mg)

n=14

0.353

n=12

0.201

n=12

0.245

n=14

0.209ATZ (mg)

n=14

1.82

n=12

1.18

n=12

2.29

n=14

1.85

entre las tradicionales y 19% entre las biofortificadas, entre

uno y otro día. (Tabla 4) Independientemente del grado de

extracción de la harina, la ATZ y la AFZ en todos los casos

fueron mayores el primero de los dos días de consumo, con

una diferencia estadísticamente significativa (p = 0.000).

Discusión

Los resultados de este estudio confirman, que como se espe-

raba, el consumo a lo largo de un día de una dieta basada en

trigo con alto contenido de Zn (biofortificado) se asocia con

una baja absorción fraccional, pero con una sustancial y signi-

ficativamente alta absorción total de Zn, comparado con trigo

de contenido típico de Zn (tradicional).Un estudio llevado a

cabo para determinar un modelo de compartimentos del me-

tabolismo de Zn evaluó, usando isótopos estables, la AFZ en

mujeres sanas con edad de 30 + 11 años, después de consu-

mir una dieta con un contenido constante de 7 mg Zn/día

(Loweet al, 2001), reportó datos que coinciden con lo obteni-

do en las mujeres del presente estudio, con características

prácticamente iguales, cuando consumieron tortillas de hari-

na biofortificada con 80% de extracción. Se mencionan éstas

específicamente por lo comparable de la ITZ cuando fueron

consumidas (6.6 mg Zn/día -vs- 7 mg de Zn/día). Loweet al,

2001, determinaron una AFZ de 0.279 + 0.043 mg, lo que en

ATZ representó 28% del ITZ. En el presente estudio la ATZ

fue de 30%. El ácido fítico de la dieta puede no sólo interve-

nir con la absorción del Zn exógeno proveniente de la mis-

ma, sino también con la reabsorción de las cantidades sus-

tanciales de Zn endógeno que son secretadas en la luz intes-

t ina l en es tado pos tprand ia l (Ober leas , 1996) . Los hallazgos de este estudio concuerdan con lo determina-

do previamente por otros investigadores a partir de un mode-

lo trivariado de respuesta por saturación que permite calcular

la cantidad de Zn absorbido en función de la ITZ y de la ITF

(Miller et al, 2006), también con un modelo de dosis-respues-

ta (ecuación de Hill), para relacionar la ATZ con la ITZ (Tra-

net al, 2004), así como a partir de un algoritmo propuesto pa-

ra determinar la ATZ a partir de la AFZ (IZiNCG, 2004).Para Zn, no se ha reportado una comparación entre los resul-

tados obtenidos de un solo tiempo de comida experimental y

los obtenidos de las comidas de todo un día, marcadas con

isótopos estables. Sin embargo, después de lo observado

hasta ahora, se esperarían resultados diferentes en el estado

post-absortivo entre un tipo de estudio y otro. Los resultados

indican que tanto la AFZ como la ATZ son más bajas cuando

50

se ha ingerido el nutrimento un día o varios días previos. Es

poco probable que alguna cantidad importante del Zn consu-

mido un día permanezca en la luz intestinal hasta el momen-

to de hacer algún otro tiempo de comida, ya que esto implica

el transcurso de varias horas. Sin embargo, se especula que

los transportadores o receptores involucrados en la absor-

ción de Zn pueden permanecer saturados por un periodo de

tiempo mayor. Puede explicarse por el mecanismo de trans-

porte activo saturable que constituye la principal vía de absor-

ción del Zn en los enterocitos, en mamíferos (Reyes, 1996).

Esto último tiene relación con lo reportado en otra investiga-

ción, donde cada sujeto, como en este estudio, fue su propio

control, y se encontró que la ingestión de una dosis alta de

Zn (solución acuosa de sulfato de Zn) durante días consecuti-

vos en estado post-absortivo resultó en una progresiva y sig-

nificativa reducción en la AFZ. Sin embargo, la AFZ no cam-

bió cuando se administró la misma dosis oral con un espacio

de tiempo de días. Estos resultados indican que la AFZ y la

ATZ a partir de una dosis alta son diferentes cuando ésta es

administrada con menor o mayor tiempo de variación. La

AFZ con las dosis de Zn muestra un comportamiento inversa-

m e n t e p r o p o r c i o n a l ( T r a n , 2 0 0 4 ) . De acuerdo con lo reportado por otros autores (Adams et al,

2002; Hambidgeet al, 2004) sobre a la AFZ de comidas pre-

paradas a base de otro cereal de importancia para México, el

maíz, se observan tanto cifras coincidentes, como cifras signi-

ficativamente diferentes, según el grado de extracción de la

harina de trigo, 95% u 80% respectivamente. En el presente

estudio la AFZ de la harina de trigo biofortificado con 95% de

extracción fue coincidente con la que encontraron Adams et

al, 2002 (0.15 + 0.05 mg Zn -vs- 0.17 + 0.11 mg Zn respecti-

vamente) en adultos que consumieron 4.6 + 1.4 mg Zn/día,

con 2,262 + 464 mg fitatos/día a partir de maíz tradicional,

con típico contenido de Zn y de fitatos. El consumo de fitatos

de ese estudio fue muy cercano al de éste, que tuvo 2,378 +

1 45 mg fitatos/día, sin embargo, el de Zn fue 3 veces mayor,

representando esto un beneficio, ya que al calcular la ATZ de

un estudio con otro, se observa una importante diferencia. La

ATZ en la presente investigación fue de 2.1 + 0.7 mg Zn/día,

mientras que la de los otros autores fue de 0.782 + 0.15 mg

Z n / d í a . Comparando los resultados del presente estudio con lo en-

contrado por Hambidgeet al, 2004 (0.15 + 0.05 mg Zn -vs-

0.14 + 0.06 mg Zn respectivamente), pero en ellos con 10 +

1.8 mg Zn/día y 3,078 + 344 mg fitatos/día a partir de maíz

tradicional también. Los resultados de AFZ presentan simili-

tud a pesar de que en el presente estudio la ITZ fue mayor

(13.6 + 0.4 mg Zn/día) y el consumo de fitatos diferente

(2,378 + 145 mg fitatos/día). La ATZ también rebasó al pri-

mer estudio de comparación; en el presente fue de 2.1 + 0.7

mg Zn/día y en el de Hambidgeet al, 2004, de 1.4 + 0.1 mg

Zn/día.Por otro lado, la AFZ de la harina biofortificada con

80% de extracción en el presente estudio fue significativa-

mente mayor en un 94% de lo reportado por Adams et al,

2002 (0.31 + 0.01 mg Zn -vs- 0.17 + 0.11 mg Zn respectiva-

mente) en adultos que consumieron el maíz tradicional con

los contenidos de Zn y de fitatos previamente descritos, mien-

tras que la diferencia fue aun mayor, de 121.5%, con lo repor-

tado por Hambidgeet al, 2004 (0.31 + 0.01 mg Zn -vs- 0.14 +

0.06 mg Zn respectivamente) con maíz tradicional también

descrito previamente. La AFZ es significativamente mayor a

pesar de la diferencia de ITZ, en este estudio fue de 6.6 +

0.1 mg Zn/día (cantidad cercana al promedio de los otros 2

estudios), y con un contenido significativamente menor de

fitatos con respecto a los otros 2 estudios, 771 + 81 mg

fitatos/día.A partir de lo anterior, se puede sugerir que el con-

tenido total de Zn en una fuente alimenticia o bien, en un su-

plemento, tiene un efecto determinante, más allá de la tasa

de biodisponibilidad del nutrimento. Esto puede ser explicado

tomando como referencia el hecho de que la AFZ no difiere

entre personas con diferentes condiciones nutricionales gra-

cias al sistema de homeostasis de Zn en el organismo, el cu-

al permite que el Zn endógeno sea efectivamente conserva-

do por el intestino con una disminución en la excreción del

Zn endógeno cuando el aporte exógeno del nutrimento es

menor a lo requerido (Sian et al, 1996).

Conclusiones

La biofortificación es una estrategia que contribuye con un

mayor aporte de Zn a la dieta con biodisponibilidad del nutri-

mento comprobada, de acuerdo a los hallazgos de este estu-

dio. A pesar de que el incremento de Zn evaluado en este

estudio es significativamente sustancial y útil, no es suficien-

te para cubrir su requerimiento fisiológico calculado a partir

de 300 g de trigo. Por lo tanto, esta estrategia por sí sola no

erradicaría el problema de la alta prevalencia de deficiencia

de Zn, pero sí generaría un impacto positivo en su disminu-

ción, así como en la prevención del incremento en su inciden-

cia dentro de la población que la aplicara. Mejorar el estado

nutricio de Zn de poblaciones que dependen de cereales co-

mo productos alimenticios básicos a través de la biofortifica-

ción tiene algunas ventajas adicionales sobre otras estrate-

51

gias, como la suplementación y/o la fortificación de alimentos

industrializados, en cuanto a que la primera aplica técnicas

basadas en un mejoramiento convencional como el que ha

sucedido por años naturalmente y por los agricultores ances-

trales: la cruza y siembra tradicional o clásica de semillas. La

combinación de características de diferentes especies con

las producidas localmente no es cara, una vez completada, y

es sustentable, ya que es de fácil y generalizado

acceso.Dado que el efecto de los fitatos fue sustancial pro-

porciona evidencia de la necesidad de tomarlo en cuenta pa-

ra estimar los requerimientos de Zn a partir de la dieta, espe-

cialmente para aquellas poblaciones en que los granos de

cereal y/o leguminosas constituyen producto(s) de consumo

básico.Aunada a esta estrategia en desarrollo se requieren

fuentes adicionales de Zn dietario o la biodisponibilidad de

éste necesita ser incrementada con una reducción de fitatos

por medio de algunas estrategias recientemente estudiadas

por diversos grupos de investigadores. La reducción en el

contenido de fitatos en los granos de cereal probablemente

necesite ir acompañada de la reducción de fitatos en otros

alimentos de origen vegetal, principalmente leguminosas, pa-

ra lograr el bajo contenido deseado de fitatos totales en la

dieta. Sin embargo, aún se desconoce cuál es el contenido

óptimo de fitatos y actualmente es el contenido de este ele-

mento en la dieta habitual el principal determinante de los

requerimientos dietarios de Zn en la mayoría de países en

desarrollo (Hambidgeet al, 2004). Estas estrategias pueden

permitir mejorar la calidad de la dieta sin tener que modificar

los patrones de consumo; además, estos enfoques pueden

resultar aceptables para los productores de alimentos bási-

cos que no estén dispuestos a cambiar sus sistemas tradicio-

nales de producción, y a los consumidores les permiten man-

tener su dieta acostumbrada logrando los cambios deseables

e n l a i n g e s t i ó n d e n u t r i m e n t o s .La trascendencia de los resultados obtenidos en este estudio

se debe a los siguientes tres puntos, principalmente:

Contribuyen con la evaluación de los beneficios que derivan

de cultivar trigo con alto contenido de Zn.

Evalúan el impacto de la extracción de un grano de trigo en

el grado de absorción de Zn.

Marcan la pauta para establecer futuras investigaciones, ne-

cesarias para nutriólogos, agricultores y genetistas.

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53

Efecto protector del jugo de granada (Punica granatum L.) sobre complicaciones de la diabetes

6

O. Coop, R. Reynoso, C. Mondragón, T. García, J. Rojas, C. Gamboa

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro

coga_ofe@hotmail.com

54

Resumen

Punicagranatum L., conocida como granada, se ha emplea-

do para el tratamiento de la diabetes mellitus debido a que

posee una extensa variedad de compuestos polifenólicos

con capacidad antioxidante, los cuales son de gran valor te-

rapéutico, sin embargo, la composición depende de la varie-

dad del fruto. El objetivo de este estudio fue evaluar el conte-

nido de fenoles, capacidad antioxidante y el efecto antidiabéti-

co de nuevas selecciones mejoradas de jugo de granada. Se

trabajó con cuatro materiales de tonalidades diferentes (Rojo

Claro o Rojo Oscuro) y grado de acidez diferente (Ácido y

Dulce), las cuales se clasificaron como selecciones RCAc,

RCD, ROAc, ROD. Se evaluaron características fisico-quími-

cas, fenoles totales, taninos, antocianinas, flavonoides y ca-

pacidad antioxidante (ABTS+ y DPPH) y por HPLC se identi-

ficaron algunos compuestos fenólicos. Los resultados indican

que el color de los jugos está relacionado con el contenido

de fenoles, antocianinas y, que el jugo de las selecciones ro-

jas oscuras (ROAc y ROD) mostraron mayor concentración

de fenoles y mostraron características físico-químicas seme-

jantes a la variedad California, pero las selecciones rojas cla-

ras (RCAc y RCD) mostraron mayor capacidad antioxidante.

En los estudios se trabajo con ratas Wistar (280-300g) induci-

das con estreptozotocina, las cuales fueron tratadas con ju-

gos de granada oscuros (ROAc y ROD) al 2%. Solamente

ROD disminuyó los niveles de glucosa, colestreol total y LDL,

sugiriendo que este jugo podría ser utilizado como coadyu-

vante en el tratamiento de la diabetes.

Palabras clave: Punicagranatum L; diabetes mellitus; com-

puestos fenólicos; capacidad antioxidante.

Introducción

La diabetes mellitus se define como un grupo de enfermeda-

des metabólicas caracterizada por hiperglucemia resultante

de defectos en la acción de la insulina, la secreción de insuli-

na, o ambos. El desarrollo de la enfermedad, conlleva a un

estado inflamatorio causado por la presencia de radicales

libres y citocinas pro-infamatorias, ocasionando la destruc-

ción de las células β-pancreáticas, provocando se vea limita-

da la producción parcial o total de la insulina. Debido a esta

alteración pancreática, se generan concentraciones elevadas

de glucosa en sangre (1), característica común en la diabe-

tes, y se incrementa con el estrés oxidativo, permitiendo así,

que en condiciones no controladas de hiperglucemia, se de-

sarrolle un estado inflamatorio agudo, que genere la destruc-

ción de las células pancreáticas y la generación de las com-

plicaciones propias de la enfermedad, tales como, el daño

renal o cardiovascular (2).

La granada (Punicagranatum L.) podría ser una buena alter-

nativa como una fuente importante de fitoquímicos con alto

valor medicinal. La granada es un alimento que contiene com-

puestos fenólicos con alta actividad antioxidante que pueden

ser capaces de disminuir el estado de inflamación, y prevenir

o atenuar el desarrollo de complicaciones que puedan llevar

a la muerte del paciente diabético.

Actualmente en México, el Instituto Nacional de Investigacio-

nes Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) realiza mejo-

ras genéticas de granada con la finalidad de incrementar la

calidad del fruto.

El objetivo del estudio fue evaluar la calidad nutracéutica de

nuevas selecciones de jugo de granada sobre la protección

de diabetes.

Materiales y métodos

Todas las muestras de granada fueron proporcionadas por el

Programa de Nopal y Frutales del Campo Experimental Bajío

ubicado en Celaya, Guanajuato, del Instituto Nacional de In-

vestigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP),

recolectadas de la huerta en el mes de Agosto de 2010. Se

trabajó con jugos clasificados por tonalidad y grado de aci-

dez: Rojo claro ácido (RCAc), Rojo claro dulce (RCD), Rojo

oscuro ácido (ROAc) y Rojo oscuro dulce (ROD). Se les

cuantificaron parámetros de acidez titulable (AT), pH, sólidos

solubles totales (SST) y color del jugo, mediante técnicas

analíticas.Se les determinó fenoles totales (FT), taninos (TN),

antocianinas (ANT), flavonoides (FV), y capacidad antioxidan-

te por los métodos de ABTS y DPPH. Se realizó un estudio in

vivo agudo con ratas Wistar macho sanas para evaluar ele-

fecto hipoglucemiante, despúes de un pérido de ayuno de 12

horas se administró vía intragástrica los diferente jugos de

granada a una dosis de 4 mL/kg de peso, se tomaron mues-

tras sanguíneas de la cola del animal a los tiempos 0, 30, 60,

90 y 120 minutos y se determinó la concentración de gluco-

sa. Y para los estudios in vivos subcrónico, se utilizaron ratas

Wistar macho (280–300 g) inducidas con 45 mg STZ/kg pro-

55

venientes de Rismart, S.A. de C.V., que se mantuvieron bajo

un ambiente controlado de luz/oscuridad de 12 h. recibieron

alimento y agua ad libitum. Para los estudios de efecto pro-

tector, a los animales se les proporcionó jugo de granada a

una sola dosis (2% v/v) al día durante cuatro semanas, poste-

riormente fueron sacrificadas. Al final del estudio se cuantifi-

có glucosa sanguínea y se determinó el perfil lipídico.El análi-

sis estadístico se realizó mediante comparación de medias

de los tratamientos contra el grupo control mediante ANOVA

por el método de Tuckey (p<0.05) y la prueba de Dunnet, utili-

zando el programa JMP versión 9.0.

Resultados y discusiones

Debido a que las características de las frutas varían de mane-

ra importante aún entre frutas de una misma especie, se ca-

racterizaron las nuevas selecciones. Los resultados de la ca-

racterización se muestran en el Cuadro 1, para acidez titula-

ble, las selecciones RCAc y ROAc mostraron mayor conteni-

do de ácido cítrico respecto a las consideradas dulces (RCD

y ROD) y respecto al pH estos valores fueron menores. Es-

tos resultados son similares a los reportados de acidez titula-

ble para jugos de granada Hicaznar (0.67-2.50 g L-1) de Tur-

quía(3). El único valor de acidez titulable obtenido similar a la

variedad California (1.85 g L-1) (4) fue RCAc. Respecto al pH

(3.09-4.30), los jugos de Granada Chilenos considerados co-

mo dulces se encuentran en el intervalo de 2.9-3.7 y los áci-

dos o amargos los de pH menor(5). Además, las variedades

Españolas como Mollar de Elche, Valenciana y Wonderful (6)

muestran valores de acidez titulable similares a los reporta-

dos en este estudio.Los valores reportados de sólidos solu-

bles varían entre 11.31-14.12 °Brix, siendo mayor en el jugo

RDAc. Los jugos Chilenos (15.2-17.8 °Brix) (5) y la variedad

Mollar (15 °Brix) (7;8) presenta mayor contenido de SST. Sin

embargo, los SST están compuestos por azúcares y ácido

cítrico en su mayoría, además, los ácidos orgánicos represen-

tan también una parte fundamental, por lo tanto a esta carac-

terística podría atribuirse el mayor contenido en el jugo RDAc

respecto a los otros evaluados.

Cuadro 1. Acidez titulable, pH y sólidos solubles totales de

las nuevas selecciones mejoradas de jugo de granada.

Valores con la misma letra en la misma columna no tienen

diferencia significativa (p<0.05) (Tukey-Kramer). Datos expre-

sados como media ± desviación estándar. RCAc: Rojo claro

ácido, RCD: Rojo claro dulce, ROAc: Rojo oscuro ácido,

ROD: Rojo oscuro dulce.

Respecto al parámetro de color (Cuadro 2), los jugos ROAc y

ROD (∼21) mostraron valores de L* con tendencia oscura

respecto a los jugos RCAc y RCD (∼38). El único valor com-

parable con estos resultados es la variedad Valenciana (∼39)

(6). Los valores de a* y b* fueron mayores en los jugos cla-

ros, indicativo de componentes de colores rojo. Pero el valor

de b* fue negativo en los jugos oscuros esto indica la caracte-

rística de componentes con tendencia azul. En comparación

con otros estudios, ROAc y ROD, clasificados como rojos

oscuros, fue similar a la tendencia de los cultivos de granada

de la variedad California(6).

Cuadro 2. Parámetros de color en muestras de jugo de granada de

diferentes selecciones.L*: Luminosidad, blanco (100) y negro (0) a*: Valo-res positivos (rojo) ó negativos (verde), b*: valores positivos (amarillos) ó negativos (azul), C*: Intensidad, h: Tonalidad cromática. Donde: C*= (a*2+b*2)1/2, h = tan-1(b*/a*). Valores con la misma letra en la misma co-lumna no tienen diferencia significativa (p<0.05) (Tukey-Kramer). Datos expresados como media ± desviación estándar. RCAc: Rojo claro ácido, RCD: Rojo claro dulce, ROAc: Rojo oscuro ácido, ROD: Rojo oscuro dul-ce.

56

Selecciones Acidez titulable(g ácido cítrico L-1) pH

Sólidos solubles totales(°Brix)

RCAc 1.75 ± 0.07b 3.24 ± 0.04c 11.31 ± 0.28c

RCD 0.33 ± 0.01c 3.64 ± 0.02b 12.46 ± 0.41b

ROAc 2.71 ± 0.01ª 3.09 ± 0.05d 14.12 ± 0.21ª

ROD 0.43 ± 0.01c 4.30 ± 0.07ª 12.19 ± 0.17b

SelecciónParámetros de colorParámetros de colorParámetros de colorParámetros de colorParámetros de color

SelecciónL* a* b* C* H

RCAc38.2 ± 0.07a 23.7 ± 0.07b 0.41 ± 0.04b 13.7 ± 0.07b 331.7 ± 0.18d

RCD 38.3 ± 0.03a 25.2 ± 0.07a 0.78 ± 0.02ª 15.2 ± 0.07ª 347.0 ± 0.10c

ROAc21.7 ± 0.04b 15.8 ± 0.13d -2.66 ± 0.01d 6.4 ± 0.11c 335.5 ± 0.54a

ROD 21.7± 0.02b 15.3± 0.11c -2.10 ± 0.04c 6.6 ± 0.11c 343.9 ± 0.29b

La capacidad antioxidante es atribuida al contenido elevado

de polifenoles, los cuales incluyen ácidos orgánicos y fenóli-

cos(9). (Figura 1 y Cuadro 3). En este estudio, el ácido gáli-

co y el ácido protocatecoico fueron mayores en el jugo ROAc

(36.0 y 44.2 mg L-1, respectivamente), además, se observa

que los jugos denominados ácidos presentan mayores con-

centraciones de ácido protocatecoico. El ácido benzóico fue

similar en todos los jugos. El jugo RCD presentó mayor conte-

nido de EGCG (5.20 mg L-1). Diferentes reportes han mostra-

do variaciones significativas en la composición de fenoles.

Tal es el caso de los jugos de Granada de la región de Tur-

quía, en donde los compuestos fenólicos identificados fueron

el ácido gálico y el protocatecoico similares a lo aquí reporta-

do, y además de otros compuestos como el ácido clorogeni-

co, cafeico y ferulico, catequina y quercetina, en otros est-

dios únicamente mencionan que además presenta una varie-

dad de compuestos fenólicos (10-15).

Cuadro 3. Análisis de HPLC de compuestos fenólicos identifi-

cados en muestras de jugo de granada de diferentes selec-

ciones.

Valores con la misma letra en la misma columna no tienen

diferencia significativa (p<0.05) (Tukey-Kramer). Datos expre-

sados como media ± desviación estándar. Ácido gálico (AG),

ácido protocatecoico (AP), ácido benzoico (AB), epigalocate-

quina-3-galato (ECGC).RCAc: Rojo claro ácido, RCD: Rojo

claro dulce, ROAc: Rojo oscuro ácido, ROD: Rojo oscuro

dulce.

Figura 1. Cromatograma decompuestos fenólicos identifica-

dos en muestras de jugo de granada de diferentes seleccio-

nes.

Los resultados de fenóles totales, taninos, antocianinas y fla-

vonoides se presentan en el cuadro 4. Los valores de fenóles

totales fueron menores (564-1344 mg GAE L-1) a los reporta-

dos para la variedad Mollar (2750 mg GAE L-1) (16). Pero,

los jugos Chilenos(1055-1280 mg L-1) (5) son comparables

con las selecciones aquí estudiadas. El método de Folin-Cio-

calteu no cuantifica el contenido total de polifenoles, por lo

que otros compuestos podrían contribuir con el perfil fenólico

(11;17-19). En términos generales, las dos selecciones que

presentaron mayor contenido de taninos, antocianinas y flavo-

noides fueron las denominadas oscuras (RDAc y ROD). Com-

parado con otros autores, la variedad Sweet Alak(3.2 g CE L-

1) (20). Jugos de granada de la variedad California (4.17-5.39

g CE L-1)(21)presentaron valores dentro de los rangos aquí

determinados. Además, el contenido de antocianinas, en

otros estudios revelan que se encuentran entre 162-387 mg

C3G L-1 en jugos comerciales de la variedad Califor-

nia(22;23), valores que se encuentran dentro de los rangos

aquí mencionado en las selecciones oscuras (111.39-320.8

mg C3G L-1). Y para flavonoides los resultados corroboran

que son las selecciones oscuras la que tienen mayor conteni-

do.

Tabla 4. Contenido de fenoles de muestras de jugo de grana-

da de diferentes selecciones.Valores con la misma letra en la

misma columna no tienen diferencia significativa (p<0.05)

(Tukey-Kramer). Datos expresados como media ± desviación

estándar. RCAc: Rojo claro ácido, RCD: Rojo claro dulce,

ROAc: Rojo oscuro ácido, ROD: Rojo oscuro dulce.

57

Selección GA(mg L-1)

PA(mg L-1)

BA(mg L-1)

EGCG(mg L-1)

RCAc 14.0 ± 0.20c 32.7 ± 1.10b 2.00 ± 0.001b 2.10 ± 0.01d

RCD 25.3 ± 0.04b 25.9 ± 0.02c 2.10 ± 0.006ª 5.20 ± 0.01ª

ROAc 36.0 ± 0.29ª 44.2 ± 2.50ª 2.00 ± 0.010b 2.40 ± 0.06c

ROD 10.9 ± 0.01d 29.7 ± 0.04b 1.80 ± 0.002c 3.30 ± 0.01b

En general, se ha correlacionado la capacidad antioxidante

con el contenido de fenoles (24). En este estudio, el jugo

RCD mostró elevada capacidad antioxidante, con un IC50 de

1.90 µmol L-1, en contraste los jugos oscuros presentaron

baja capacidad antioxidante (Figuras 2, 3 y Cuadro 5). Sin

embargo, para corroborar los resultados obtenidos se em-

pleó el método de DPPH. Los valores reportados para IC50

muestran que la selección RCAc presentó mayor capacidad

antioxidante con un valor de 4.11 µmol L-1. Con el método de

ABTS se obtuvieron valores que indican mayor capacidad

antioxidante. Esto podría estar dado por diversos factores

tales como la estereoselectividad de los radicales o la solubili-

dad de los jugos (25). Diversos estudios realizados con jugo

de granada reportan diferencias relacionadas con la contribu-

ción de los compuestos fenólicos y el método empleado de

capacidad antioxidante (14;15;26;27). Además, los resulta-

dos indican que el color de los jugos está relacionado con el

contenido de fenoles, antocianinas y flavonoides (Cuadro 6).

Figura 2. ABTS de muestras de jugo de granada de diferen-

tes selecciones

Figura 3. DPPH de muestras de jugo de granada de diferen-

tes selecciones.

Cuadro 5. Capacidad antioxidante de muestras de jugo de

granada de diferentes selecciones.

Valores con la misma letra en la misma columna no tienen

diferencia significativa (p<0.05) (Tukey-Kramer). Datos expre-

sados como media ± desviación estándar. RCAc: Rojo claro

ácido, RCD: Rojo claro dulce, ROAc: Rojo oscuro ácido,

ROD: Rojo oscuro dulce.

Cuadro 6. Correlaciones entre los componentes de diferen-

tes muestras de jugo de granada y paramétros de color.

* La correlación es significativa al nivel 0.05.

** La correlación es significativa al nivel 0.01.

58

Selecciones Fenoles totales Taninos Antocianinas Flavonoides

mg GAE L-1 g CE L-1 mg C3G L-1 mg CE L-1

RCAc 833.33 ± 16.66c 3.00 ± 0.23c 127.73 ± 3.19c 165.71 ± 11.06b

RCD 564.47 ± 15.44d 4.45 ± 0.07b 111.39 ± 8.95d 135.02 ± 11.06b

ROAc 1344.29 ± 40.87a 7.60 ± 0.19a 320.88 ± 2.68a 351.88 ± 3.54a

ROD 1196.48 ± 53.10b 8.30 ± 0.23a 211.39 ± 1.79b 366.20 ± 13.83a

ABTS DPPH

Selección IC50 IC50

µmol L-1 µmol L-1

RCAc 2.95 ± 0.03a 4.11 ± 0.03d

RCD 1.90 ± 0.03c 4.30 ± 0.02c

ROAc 1.91 ± 0.03c 5.67 ± 0.01b

ROD 2.49 ± 0.02b 7.27 ± 0.02a

(+) Catechin 1.41 ± 0.02d 3.64 ± 0.01e

CompontesParamétros de colorParamétros de colorParamétros de colorParamétros de colorParamétros de color

CompontesL* a* b* C h

Fenoles totales -0.825(**) -0.755(**) -0.916(**) -0.902(**) -0.357Taninos -0.714(*) -0.786(*) -0.548 -0.595 0.381

Antocianinas -0.811(**) -0.713(**) -0.951(**) -0.874(**) -0.357Flavonoides -0.893(**) -0.977(**) -0.785(**) -0.848(**) -0.263

!

Por otra parte, para el estudio in vivo se determinó el efecto

hipoglucemiante, para establecer la mejor respuesta glucemi-

ca en ratas sanas, los resultados muestran que a los 60 minu-

tos la ROD redujo en un 23.20% el nivel de glucosa en san-

gre (Figura 4).También, la ROAc mejora la glucemia en me-

nor proporción. Además estas dos selecciones mostraron ma-

yor contenido de compuestos fenólicos, tales como flavonoi-

des y antocianinas. Por lo tanto estas selecciones (ROAc y

ROD) fueron elegidas para el siguiente estudio.

Figura 4. Efecto hipoglucemiante agudo de las selecciones

de jugos de granada en ratas

Los datos son presentados como la media ± EE.! Indica

diferencia estadística significativa con respecto al control dia-

bético, (Dunnet, p < 0.05).RCAc: Rojo claro ácido, RCD: Ro-

jo claro dulce, ROAc: Rojo oscuro ácido, ROD: Rojo oscuro

dulce.

Se evaluó la administración subcróncia del jugo de granada

en animales diabéticos con las selecciones ROAc y ROD.

Debido a que numerosos estudios reportan el efecto antidia-

bético de los polifenoles de algunas plantas, las cuales mues-

tran efecto hiploglucemico cuando son administrados por pe-

riodos largos lo que conlleva a tener un efecto diferente (28).

Estudios recientes sugieren que la granada podría prevenir o

atenuar las complicaciones de la diabetes vía el receptor

PPAR-gamma y la producción de oxido nítrico, pero el meca-

nismo no es del todo conocido. En la figura 5 se observa que

sólo el jugo ROD (~10.95 %) causó reducción de niveles de

glucosa al término de las 4 semanas. Sin embargo, el jugo

ROAc no mostró ningún cambio significativo respecto al con-

trol. Los estudios in vitro reportados, muestran que los polife-

noles podrían incrementar la absorción de glucosa por los

tejidos periféricos y disminuir la glucemia (29). Los mecanis-

mos incluyen inhibición de gluconeogénesis(30), estimula-

ción adrenérgica de la absorción de glucosa(31), y la estimu-

lación de la insulina por las células β-pancreáticas(32).

Figura 5. Glucosa sérica en ayuno en ratas diabéticas trata-

das con ROD y ROAc. Los datos son presentados como la

media ± EE.! Indica diferencia estadística significativa con

respecto al control diabético, (Dunnet, p < 0.05). CS: Control

sano, CD: Control diabético, ROAc: Rojo oscuro ácido,

ROD: Rojo oscuro dulce

El perfil de lípidos incluye triglicéridos, colesterol total, LDL y

HDL en suero. Estos parámetros se ven afectados en pacien-

tes diabéticos acelerando el riesgo cardiovascular. Después

del consumo de los dos tratamientos (ROD y ROAc). Ambos

tratamientos mostraron un efecto hipolipidémico. El perfil de

lípidos se muestra en el Cuadro 7. El colesterol total disminu-

yó en un ~27.50 % en ambos tratamientos, los cuales ade-

más incrementaron los niveles de HDL hasta un~33 %, pero

sólo ROD disminuyó los niveles de LDL en animales diabéti-

cos. Con respecto a los triacilglicéridos estos fueron simila-

res entre los grupos.

59

!!!

Cuadro 7. Perfil de lípidos en suero de ratas diabéticas trata-

das con jugo de granada.Los datos son presentados como la

media ± EE. !Indica diferencia estadística significativa con

respecto al control diabético, (Dunnet, p < 0.05). CS: Control

sano, CD: Control diabético, ROAc: Rojo oscuro ácido,

ROD: Rojo oscuro dulce.

Conclusiones

Este estudio proporciona suficiente evidencia científica y su-

giere el potencial terapéutico de la granada. El consumo de

selecciones mejoradas de jugo de granada (ROAc y ROD)

podría ser una alternativa que controla los niveles de glucosa

y disminuye el riesgo cardiovascular.

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60

Grupos Colesterol total (mg/dL-1)

Triacilglicérido(mg/dL-1)

HDL(mg/dL-1)

LDL(mg/dL-1)

CS 64.34 ± 1.38 55.60 ± 2.79 45.16 ± 1.06 8.06 ± 0.47

CD 121.42 ± 0.69 116.89 ± 2.96 34.42 ± 0.62 63.02 ± 0.73

ROAc 86.58 ± 3.16* 108.01 ± 4.99 45.33 ± 3.13* 63.15 ± 0.31

ROD 89.45 ± 4.71* 112.03 ± 5.11 47.20 ± 3.23* 23.06 ± 1.51*

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61

Estudio de los factores socioculturales vinculados con la obesidad en mujeres

7

D. Ronquillo, MC. Caamaño, R. Kimoto, MG. Martínez, OP. García, OA Rojas-Ramos, JL. Rosado.

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro

lolitaron@hotmail.com

62

Introducción

El sobrepeso y la obesidad es una enfermedad que afecta a

gran parte de la población en el mundo y es la causa de di-

versas complicaciones de salud (Caterson y Gill 2002; OMS

2003 a, 2011b). La obesidad, conocida como "enfermedad

de la opulencia", no es un problema exclusivo de países de-

sarrollados, o de un grupo de edad en particular (WHO

2003a; 2011a y b). La Organización Mundial de la Salud

(OMS), ha hecho hincapié en la importancia de las enferme-

dades crónicas no transmisibles (CNT) entre las que la obesi-

dad afecta a 35 millones de adultos en todo el mundo (Onis

M. et. al. 2010). Los países en desarrollo tienen una "doble

carga", el aumento de las tasas de obesidad ocurren simultá-

neamente con altos porcentajes de enfermedades infeccio-

sas, que coloca a los sistema de salud en una incompetencia

de atención a la población (Boutayeb y Boutayeb 2005;

Marshall SJ., 2004; WHO, 2011b).

En México la prevalencia de sobrepeso y obesidad es alar-

mante; de acuerdo a la Encuesta Nacional de Salud y Nutri-

ción del 2012 (ENSANUT 2012), se reportó que 73.0% de las

mujeres mexicanas y el 69.4% de los hombres mayores de

20 años de edad tienen sobrepeso u obesidad (Gutierrez,

JP., et. al., 2012; Barquera S. et. al., 2013).

La globalización en la producción de alimentos que se inició

en México con la introducción del Tratado de Libre Comercio

de América del Norte (TLC) en 1994, se ha propuesto como

una explicación para la rápida transición de la nutrición y el

cambio en la calidad de la dieta mexicana (Hawkes 2006).

Investigaciones realizadas con mujeres mexicanas de comu-

nidades rurales en el Estado de Querétaro, reportan una pre-

valencia de obesidad por arriba de la reportada por la ENSA-

NUT 2012 (Barquera S. et. al., 2013). Aunque se han realiza-

do diversos estudios abordando las causas inherentes a la

obesidad, son pocos los estudios que se han enfocado a la

identificación de factores ambientales, sociales, económicos

y culturales que promueven un ambiente de obesidad. Por lo

anterior y reconociendo la existencia de factores culturales,

económicos, psicológicos, además de las interpretaciones y

que la percepción debería diferir dependiendo del contexto

(rural o urbano) en el que se estudia, el propósito del presen-

te estudio es determinar los factores culturales, psicosociales

y de percepción en relación a los hábitos y práctica alimenta-

ria que están generando la obesidad en las mujeres mexica-

nas.

Método

Estudio cualitativo donde se aplicó una entrevista semi-es-

tructurada como guía que incluía temas de salud, emocio-

nes, consumo de alimentos, actividad física e imagen corpo-

ral relacionados con la obesidad. Las entrevistas fueron au-

dio-grabadas, previo consentimiento de las participantes. Se

entrevistaron 60 mujeres, en un rango de edad de 25 a 35

años, el 50% con sobrepeso u obesidad y 50% con peso nor-

mal de acuerdo al Indice de Masa Corporal (IMC) calculado.

Se incluyeron mujeres de dos contextos demográficos (rural

y urbano).

Resultados.

En mujeres, principalmente de zona rural, que dicen haber

sufrido inseguridad alimentaria en su infancia, es común no

desayunar o desayunar poco y tener un almuerzo vasto, lo

cual ha sido relacionado con sobrepeso. Las mujeres no obe-

sas tienen a referirse al almuerzo como su segunda comida

del día y la consideran una comida importante.

Alicia: “Yo, yo no desayuno. No me gusta desayunar. Porque

será que, desde que estaba yo en mi casa, como, sí con mi

mamá, no, nunca nos dio. Nunca, nunca le alcanzó porque

éramos artos, nunca le alcanzó para darnos. Y, yo digo que

desde ahí viene la costumbre.”

La descripción de la dieta en general tenía poca diversidad

de alimentos. Sin embargo se refleja una tendencia a la me-

sura para comer entre las mujeres que no presentan obesi-

dad en contextos rurales, el párrafo que a continuación se

presenta refleja este argumento:

Karla “Cuando me invitan a las fiestas procuro solo comer

tantito, me sirven mucho y pienso que no me lo coma todo,

mejor guardar para el otro día (risas), como dicen aquí me

guardo mi itacate (risas)”.

63

Las bebidas como refrescos se consideran dañinas, pero en

ninguna de las participantes mencionó aspectos negativos

de otras bebidas endulzadas. El efecto negativo de los refres-

cos en la salud, incluyendo su impacto en el aumento de pe-

so, fue reconocido por todas las mujeres. Casi todas ellas

expresaron con gesticulaciones faciales culpabilidad, al mis-

mo tiempo que justificaban que su consumo es menor al de

otros o al de tiempo atrás, lo que implica un conflicto emocio-

nal entre el impacto negativo sobre la salud de los refrescos

y la nula intención de dejar de consumirlos.

Eunice: “Diario tomo refresco, Mmm, bastantes como dos

tres vasos, vasos de refresco (risas). Porque yo sé que no es

bueno tomar tanto refresco pero ps. Pues no sé, porque te

hace mal ¿no? Pues tiene mucha azúcar, el gas, o sea, todo

eso yo digo”

En las mujeres obesas de ambos contextos se observaron

algunos esfuerzos por bajar de peso por medio de dietas o

realizando ejercicio, sin embargo la duración del cambio de

estilo de vida en general no duraba más de algunas sema-

nas. Las mujeres que han tenido la suficiente fuerza de volun-

tad para disminuir el consumo de ciertos alimentos de mane-

ra tajante, no lo logran por mucho tiempo ya que experimen-

tan malestares físicos y al dejar la dieta han experimentado

la ganancia de peso.

Ximena: “Sí, sí le intenté seguir una vez, pero la verdad no

pude, porque me dolía mucho la cabeza, me sentía como

muy cansada y no, no la seguí”

Se confirmó que el comer es considerado muy importante en

sus vidas. El placer de comer ciertos alimentos y la satisfac-

ción de tener acceso a cierta alimentación complaciente se

relaciona con su estado emocional. La única ocasión en que

las mujeres realmente mejoran su alimentación es cuando

tienen problemas de salud, lo que significa que intencional-

mente elegir no comer si algo les impedía comer.

Fabiola: “O sea, yo me imagino, tan solo por la grasa y como

que dicen que engorda la comida, y no sé qué…, pero yo no

hago caso si engordo o si no engordo (risa), yo me lo como y

ya”

Conclusiones

Existe un patrón de comportamiento humano que se compar-

te y se transmite generacionalmente, y depende totalmente

de las prácticas culturales. Estudiar las causas que promue-

ven los ambientes obesogénicos va más allá, se debe consi-

derar que la alimentación es una expresión de conductas ad-

quiridas que determinan al individuo en un grupo social en un

entorno cultural especifico. Por lo tanto, las intervenciones

pueden no tener buenos resultados si no se consideran es-

tos factores psicosociales

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65

Evaluación de la hematotoxicidad de una fracción de lectinas-inhibidor de proteasas de frijol Tépari (Phaseolus acutifolius) en ratas

8

U. Moreno Celis1, RA. Ferríz Martínez1, V. Andrade Portillo1, R. Cervantes-Jiménez1, FJ. López Martínez1, H. Noriega Girón1, MJ. Guerrero Carrillo1, A. Blanco Labra2, AJ. Rodríguez Méndez3, T. García Gasca1

1Maestría en Nutrición Humana. Facultad de Ciencias Natura-

les. Universidad Autónoma de Querétaro. 2Centro de Investi-

gación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Na-

cional, Unidad Irapuato. 3Facultad de Medicina. Universidad

Autónoma de Querétaro.

ulisses.morenoc@gmail.com

66

Resumen

Estudios de nuestro grupo han mostrado que lectinas e inhibi-

dores de la proteasa (IP) de frijol Tepari presentan efectos

contra células de cáncer de colon. Con el fin de conocer los

efectos in vivo de una fracción combinada de estas dos pro-

teínas (LIP-60), se determinaron alteraciones en el sistema

hematopoyético. Se utilizaron ratas Sprague Dawley de 3 se-

manas de edad a las que se les administró por vía intragástri-

ca la fracción LIP-60 (100 mg/kg de peso corporal) durante

28 días, se obtuvieron muestras de sangre de 0, 1, 3, 9, 14,

19 y 24 días, los animales fueron sacrificados al día 30. Se

obtuvo sangre total, suero y plasma así como el bazo, el timo

y el fémur para extraer la médula ósea. En sangre se realizó

frotis sanguíneo con tinción diferencial, en suero se determi-

naron IL-6 y TNF-α como marcadores de activación del siste-

ma inmune mientras que a los órganos se les realizó análisis

histopatológico. El peso corporal y el consumo de alimento

disminuyeron respecto al control, el recuento sanguíneo mos-

tró disminución de linfocitos, mientras que los granulocitos se

incrementaron, lo que sugiere proceso alérgico. El análisis

histopatológico mostró reducción de la pulpa blanca del ba-

zo, relacionada con aumento en la liberación de leucocitos

maduros en sangre y aumento de la celularidad de la médula

osea, mientras que los niveles de Il-6 y TNFα no mostraron

diferencias significativas pero sí tendencia a disminuir en las

ratas tratadas. Los resultados sugieren que la administraión

oral de LIP-60 provoca una respuesta de tipo alérgica.

Palabras clave: lectinas-inhibidor de proteasas, Phaseolus

acutifolius, sistema hematopoyético.

Introducción

El frijol Tépari se utiliza como alimento dentro de la dieta de

algunas regiones del norte de México y sur de EU. Es rico en

proteínas, aunque su resistencia a la cocción, sus efectos

antinutricios así como la importación local de otras varieda-

des de frijol reducen el consumo de éste, poniéndolo en des-

ventaja y subutilizando su contenido proteico (Osman y col.,

2003, SAGARPA, 2005).

Actualmente ésta variedad de frijol se estudia por la importan-

cia de dos de sus componentes bioactivos, las lectinas y los

inhibidores de proteasas (IP) los cuales actualmente se sabe

que tienen efectos sobre diversos procesos celulares relacio-

nados con cáncer. El IP es capaz de provocar aumento de la

adhesión celular y disminución de la invasión de las células

cancerígenas, mientras que las lectinas causan la muerte

celular por inducción de apoptosis de forma diferencial dado

que reconocen carbohidratos específicos unidos a la mem-

brana, los cuales son diferentes de acuerdo con el tipo de

cáncer (García-Gasca y col., 2002; 2012, Castillo-Villanueva

y col., 2005; Ferriz-Martínez, 2010 datos no publicados).

Nuestro grupo de trabajo estudia los efectos tóxicos de un

extracto de lectinas e inhibidores de proteasas en proporcio-

nes naturales, así como sus efectos en cáncer. Por lo ante-

rior, el presente trabajo se centra en la evaluación del efecto

de dicha fracción sobre el sistema hematopoyético ya que

éste se ve afectado en la mayoría de las terapias para com-

batir el cáncer debido a su acelerado recambio celular.

Materiales y Métodos

Se utilizaron 20 ratas Sprague Dawley (10 hembras y 10 ma-

chos) de 3 semanas de edad, obtenidas del bioterio del Insti-

tuto de Neurobiología (INB) de la Universidad Nacional Autó-

noma de México (UNAM) Campus Juriquilla, Querétaro. Se

les dio una semana de adaptación al bioterio de la Facultad

de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Queré-

taro. Posteriormente se formaron 2 grupos aleatorizados y

ajustados por peso corporal, el grupo 1 se le denominó grupo

control (C) y al grupo 2 grupo de tratamiento (Tx). Los anima-

les se mantuvieron en las condiciones del bioterio a 26º C,

con 12 h de luz y 12 h de oscuridad con alimentación y agua

ad libitum. El alimento de ambos grupos fue autoclaveado

para eliminar el efecto de lectinas contenidas en el mismo,

ya que se sabe que la lectina de frijol Tépari, es sensible a

este proceso. En todo momento se observaron los lineamien-

tos de la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-ZOO-1999) pa-

ra el uso de animales de laboratorio bajo las consideraciones

éticas correspondientes.

La dosis de LIP-60 fue definida en base a unidades de agluti-

nación (UA) considerando como base las UA de la FCL pre-

viamente estudiada (López-Sánchez y col., 2010). Al grupo C

se le administró 0.5 mL de solución salina vía intragrástrica

mientras que al grupo Tx 100 mg/kg de peso en 0.5 mL de

solución salina vía intragástrica durante 28 días consecuti-

vos. Durante el periodo de administración se obtuvo sangre

por medio del corte de cola, con ayuda de una guillotina de 4

cuchillas, realizando un corte de 4 mm. Se obtuvieron alrede-

dor de 150 µL de sangre a las 0 h, 8 h, 24 h, 72 h, 9 días, 14

67

días, 19 días, 24 días y 30 días después de iniciado el trata-

miento. Aproximadamente 50 µL se colectaron en capilares

heparinizados y se utilizaron para realizar la biometría hemáti-

ca (BH) y el resto se obtuvo en tubos de microcentrifuga de

200 µL de volumen. La sangre se centrifugó a 5000 g por 10

min para la separación del suero, el cual se almacenó a -80º

C para su posterior análisis. Cada uno de los animales fue

pesado y se les determinó diariamente el consumo de alimen-

to. Los animales se observaron de manera individual hasta

completar un periodo de 30 días.

Llegado los 28 días de administración diaria se les dio un pe-

riodo de descanso de dos días y se procedió al sacrificio por

decapitación con ayuda de una guillotina de 4 cuchillas para

obtener la mayor cantidad de sangre y no causar toxicidad

sanguínea o hepática por anestésicos o sedantes. Se obtuvo

suero, plasma, bazo, timo, placas de Peyer (intestino delga-

do) y médula ósea (MO) de columna vertebral y fémur. Los

órganos fueron medidos, pesados y fijados en formalina al

10% para conservarlos y realizar su posterior análisis.

Biometría Hemática

La biometría hemática (BH) se realizó con ayuda de un hema-

tocitómetro de la marca CellDyn® serie 1600 el cual mide los

siguientes parámetros:

WBC: Glóbulos Blancos

LYNF: Linfocitos

GRAN: Granulocitos

%LINF: % de Linfocitos

%GRAN: % de Granulocitos

RBC: Globulos Rojos

HGB: Hemoglobina

HCT: Hematocrito

VCM: Volumen Corpuscular Medico

MCH: Hemoglobina Corpuscular Media.

MCHC: Concentración Media de Hemoglobina Corpuscular

PLT: Plaquetas

Análisis Histopatológico

Los órganos obtenidos del sacrificio se fijaron en formaldehi-

do al 10%, para su posterior análisis, después se realizaron

los cortes semifinos de timo, bazo y epífisis de fémur. Los

tejidos se deshidrataron y fueron incluidos en parafina con

ayuda del equipo Histoquinete Leica TP1020. Posteriormente

se realizaron los cortes finos a un grosor aproximado de 5

µm con ayuda del equipo micrótomo RM21 de la marca Lei-

ca y fueron montados en un porta objetos adheridos con una

fina capa de gelatina en agua caliente. Después de monta-

dos se procedió a la rehidratación y a la tinción de hematoxili-

na y posteriormente a la tinción de eosina. Los tejidos se des-

hidrataron nuevamente y se sellaron con ayuda de centellan

y un cubreobjetos. Posteriormente se realizó el análisis al

microscopio.

Análisis de IL-6 y TNF α

El estudio de las interleucinas se realizó por medio de kits

comerciales de ELISA para interleucina-6 (Thermo Scientific,

número de catálogo ER3IL-6) y TNF-α (Thermo Scientific,

número de catálogo ER3TNFA) para suero directo de ratas.

Análisis Estadístico

Los resultados se analizaron con ayuda del programa Statisti-

cal Package for the Social Sciences (SPSS) versión 21.0

IBM. Se realizaron pruebas de t de student para muestras

independientes.

Resultados y Discusión

Efecto sobre el peso corporal, consumo de alimento y efec-

tos adversos.

El peso y tamaño de los animales homeotérmicos, como el

caso de las ratas de laboratorio, está determinado por la tasa

metabólica basal (Hill y Anderson, 2006) el cual cambia para

adaptarse a factores ambientales y del comportamiento con-

ductual. Lo anterior puede provocar variaciones en el compor-

tamiento o peso corporal durante el experimento. En cuanto

al efecto sobre el peso corporal, no se encontró una altera-

68

ción significativa entre animales tratados con LIP-60 (100

mg/kg de peso corporal) y el grupo control (Figura 1). Se ob-

servó disminución de peso de aproximadamente un 10% al

final del experimento, de forma similar a lo observado ante-

riormente para la FCL. Sin embargo, el efecto de LIP-60 fue

menos pronunciado que el observado para la FCL ya que

esta última provoca disminución del peso corporal desde el

inicio del tratamiento (López-Sánchez y col., 2010).

En lo que se refiere el consumo de alimento, no se encontró

diferencia estadística significativa (t de student, p>0.05) sin

embargo, se observó una ligera disminución en el consumo

de alimento del grupo tratado posterior al inicio de la adminis-

tración (Figura 2). El patrón de consumo fue el mismo para

los dos grupos, considerando los cambios conductuales y

efectos de la dieta isocalórica de las ratas (Díaz-Reséndiz y

col., 2009) lo cual se puede explicar cómo una sobre-alimen-

tación inicial, seguida de una reducción del consumo para

compensar las calorías ingeridas.

Los efectos adversos encontrados fueron muy similares aun-

que menos severos a los reportados al administrar FCL en el

esquema subcrónico los cuales consistieron en piloerección,

aletargamiento, diarrea, pelo amarillento y áspero y disminu-

ción en el consumo de alimento (López-Sánchez 2010). Lo

anterior sugiere que LIP-60 provoca menor toxicidad que la

FCL bajo un esquema subcrónico.

Figura 1. Efecto de LIP-60 sobre el peso corporal de ra-

tas. No se observó diferencia estadística significativa (t de

student, p>0.05), las barras de error representan la desvia-

ción estándar. Las flechas indican, Roja: Inicio de Tratamien-

to; Negra: Sacrificio.

Figura 2. Efecto de LIP-60 sobre el consumo de alimento.

No se observó diferencia estadística significativa (t de stu-

dent, p>0.05), las barras de error representan la desviación

estándar. Las flechas indican, Roja: Inicio de Tratamiento;

Negra: Sacrificio.

Biometría Hemática

Con respecto a la BH, no se observó diferencia significativa

(t de student, p>0.05) en cuanto al número total de glóbulos

blancos (GB) (Figura 3). Se observó un ligero incremento a

las 24 h de administrar el tratamiento, lo cual podría estar

relacionado a una respuesta mitogénica mostrada también

por otras lectinas como la Concanavalina A, Fitohemaglutini-

na y Fitolaca americana (González y col., 1991). De igual for-

ma, el recuento de glóbulos rojos no mostró diferencia esta-

dística (t de student, p>0.05) entre los grupos control y trata-

miento en los diversos tiempos de evaluación (Figura 4).

Figura 3. Recuento de glóbulos blancos en ratas tratadas

con LIP-60. No se observó diferencia estadística significativa

(t de student, p>0.05), las barras de error representan el

error estándar.

69

Figura 4. Recuento de glóbulos rojos en ratas tratadas

con LIP-60. No se observó diferencia estadística significativa

(t de student, p>0.05), las barras de error representan el

error estándar.

Un análisis más detallado de los glóbulos blancos mostró un

comportamiento diferencial entre linfocitos y granulocitos (Fi-

guras 5 y 6). Para el caso de linfocitos el comportamiento fue

similar al control y, aunque no se observó diferencia significa-

tiva, al día 14 de tratamiento se observó una disminución del

33% aproximadamente. Para el caso de los granulocitos, se

observó un aumento del 100% a partir del primer día de admi-

nistración que fue normalizándose después de 9 días, lo cual

podría tener implicaciones fisiológicas importantes.

Figura 5. Recuento de linfocitos en ratas tratadas con

LIP-60. (*) Indica diferencia estadística significativa (t de stu-

dent, p<0.05), las barras de error representan el error están-

dar.

Figura 6. Recuento de granulocitos en ratas tratadas con

LIP-60. (*) Indica diferencia estadística significativa (t de stu-

dent, p<0.05), las barras de error representan el error están-

dar.

Derivado de lo anterior, se realizó un recuento diferencial de

los glóbulos blancos (Cuadro 1). Los resultados del frotis san-

guíneo mostraron depleción del 22% de los linfocitos con res-

pecto al control y aumento en las diversas poblaciones de

granulocitos, en especial de los eosinofilos (8 veces más),

efecto similar al provocado por la FCL. Lo anterior sugiere

una respuesta alérgica (Rollins, 2009) en las ratas que reci-

bieron el tratamiento con LIP-60 desde las primeras 24 h del

tratamiento. El incremento de neutrófilos se pueden relacio-

nar con un aumento de la cantidad de histamina liberada (Ra-

mos y col., 2004), lo cual puede estar relacionado con un po-

sible aumento del peristaltismo provocado por las lectinas.

La proporción linfocitos/granulocitos mostró una tendencia a

disminuir por parte de los linfocitos y a aumentar por parte de

los granulocitos (Figura 7), lo que sugiere una reacción inmu-

nológica a la presencia de una molécula extraña en el orga-

nismo.

Cuadro 1. Porcentajes de células obtenidos por recuento

en frotis sanguíneo y hemotinción en ratas tratadas con

LIP-60.

70

Figura 7. Proporción de Linfocitos (%L) y Granulocitos

(%G) del total de Glóbulos Blancos en ratas tratadas con

LIP-60. (*) Indica diferencia estadística significativa (t de stu-

dent, p<0.05).

Frotis Sanguíneo

En el frotis sanguíneo se logró observar una diferencia mar-

cada entre las diferentes poblaciones celulares de leucocitos

(Figura 8). Otro de los hallazgos de este estudio fue la obser-

vación de un incremento de la agregación plaquetaria (Figura

9). Lo anterior concuerda con lo descrito por Castillo-Villanue-

va (2005), donde reporta que las lectinas son capaces de

aglutinar diferentes tipos células entre ellas las plaquetas.

Este aspecto puede tener implicaciones en la coagulación

sanguínea ya que la segregación es uno de los mecanismos

por medio del cual las plaquetas forman el trombo para evitar

las hemorragias en heridas.

Figura 8. Diferencias poblacionales leucocitarias entre el

grupo control (A) y el tratado con LIP-60 (B). Aumento

100X.

Figura 9. Agregación plaquetaria entre el grupo control

(A) y el tratado con LIP-60 (B). Aumento 100X

Análisis histopatológico

En el análisis de timo no se encontró diferencia histopatológi-

ca aparente por el método de tinción de H-E (Figura 10) lo

cual sugiere que no existe una respuesta inmunológica des-

de este órgano, tal como se reporta en otros trabajos con la

FCL (Reyes, 2011). Por otro lado, en bazo se encontró una

disminución leve en la pulpa blanca en el 70% de los anima-

les tratados y una disminución del 35% de dichas células (Fi-

gura 11) y un aumento de la celularidad blástica de médula

ósea en un 60% de los casos (Figura 12), lo cual podría rela-

cionarse con un aumento en la liberación de linfocitos madu-

ros a la circulación sanguínea y una mayor producción de

éstos desde el sistema hematopoyético. Esta respuesta tam-

bién fue observada por (Reyes, 2011) en un esquema de ad-

ministración farmacológico (3 veces por semana) de FCL.

Figura 10. Microfotografías de timo de ratas control (A) y

tratadas con LIP-60 (B). Aumento 10x.

71

Figura 11. Microfotografías de bazo de ratas control (A) y

tratadas con LIP-60 (B). Las flechas indican los sitios dismi-

nuidos de la pulpa blanca. Aumento 20x

Figura 12. Microfotografías de médula ósea de ratas con-

trol (A) y tratadas con LIP-60 (B). Aumento 5X y 40X.

Análisis de IL-6 y TNFα

El análisis de la IL-6 no mostró diferencia estadística significa-

tiva (t de student, p>0.05) entre los grupos control y trata-

miento, (Figura 13A). Al realizar un análisis separando ma-

chos y hembras fue posible distinguir una mayor tendencia a

la disminución en el grupo hembras con tratamiento respecto

al control (Figura 13B). La disminución de IL-6 está relaciona-

da con la diferenciación de leucocitos lo que promueve una

mayor utilidad de dicho factor disminuyendo sus niveles séri-

cos (Mayani y col., 2007).

El resultado por ELISA de TNF-α no mostró diferencia esta-

dística significativa comparando controles contra tratamien-

tos aunque se observó disminución del 15% aproximadamen-

te en el grupo tratado (Figura 14A). Al realizar el análisis se-

parando los grupos en machos y hembras se observó que

los grupos tratados tanto de machos como de hembras se

encontraron disminuidos en los niveles de TNF-α (Figura

14B). TNF-α está involucrado con un aumento en la produc-

ción de monocitos y macrófagos, los cuales no se encontra-

ron aumentados en el recuento diferencial y es un inhibidor

de la mielopoyesis (Mayani y col., 2007), lo cual concuerda

con un aumento de linfocitos en sangre.

Figura 13. Efecto de LIP-60 sobre la concentración de IL-

6 séricas (A) y por sexos (B). No se observó diferencia esta-

dística significativa (p>0.05), las barras de error representan

el error estándar.

Figura 14. Efecto de LIP-60 sobre la concentración de

TNF-α séricas (A) y por sexos (B). No se observó diferen-

cia estadística significativa (p>0.05), las barras de error repre-

sentan el error estándar

Conclusiones

De acuerdo con los resultados en el presente trabajo se pue-

de concluir que:

LIP-60 presentó menor toxicidad que la FCL, mostrando me-

nos efectos adversos y una ligera disminución de peso en

periodos iniciales del tratamiento. Aunque se logró una recu-

peración, los grupos con tratamiento no logran recuperar el

100% del peso, dado quizá por una afectación en una etapa

crucial del crecimiento de la rata.

72

LIP-60 afectó a tejido del sistema mielopoyético en bazo, lo

cual se relaciona con las reacciones del sistema inmunológi-

co detectadas en suero sanguíneo.

LIP-60 mostró un efecto marcado en los linfocitos y en los

granulocitos y al realizar el conteo diferencial se puede notar

que los más afectados fueron los eosinófilos, indicando una

reacción alérgica durante las primeras 24 h del tratamiento,

lo cual se normaliza con el paso del tiempo.

Aunque el método automatizado de biometría hemática

(CELL DYN 1600) no lo detectó, el frotis mostró un notable

aumento en el número de glóbulos blancos en los frotis san-

guíneos de ratas tratas con LIP-60.

El análisis histopatológico mostró el efecto de LIP-60 a nivel

sistémico lo cual fortalece la teoría de una acción sanguínea

por la internalización de las lectinas y de forma activa por ab-

sorción gástrica.

LIP-60 resultó tener un efecto aparente sobre la disminución

de las citosinas IL-6 y TNFα, lo cual servirá como referencia

para futuros trabajos.

La fracción combinada de lectinas e inhibidor de proteasas

presentó efectos sobre el sistema hematopoyético de las ra-

tas, los cuales sugieren una respuesta tipo alérgica al trata-

miento. Sin embargo, es necesario profundizar más en este

efecto para comprender mejor su significado fisiológico y, en

su momento, la implicación farmacológica de su administra-

ción.

Agradecimientos

El presente trabajo se realizó egracias al apoyo financiero

del proyecto de CONACyT (FOMIXQRO-2011-C02-175340).

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74

Desnutrición perinatal y conducta apetitiva en ratas jóvenes desnutridas

9

R. Fernández-Vázquez Mellado, M. Salas-Alvarado, C.

Torrero-Solorio.

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro

reginafernandez02@gmail.com

75

Resumen

La restricción perinatal de alimento afecta las partes distales

de las dendritas de estructuras cerebrales relacionadas con

la ingesta de alimento, con pocos efectos sobre los paráme-

tros del soma neuronal. En este estudio se investigó si duran-

te la adolescencia, en ratas que fueron desnutridas en la vida

temprana, hay alteraciones en la conducta apetitiva. Se mi-

dió la capacidad social para transmitir la preferencia por un

alimento entre una rata “demostradora” (DEM) y otra “obser-

vadora” (OBS), utilizando el modelo de la rata Wistar desnutri-

da. La desnutrición se realizó durante el periodo perinatal

(DPN), reduciendo al 50% el aporte de alimento (7.8 g) del

día de gestación (G) 6 al G12; al 70% (10.9 g) del G13 al

G18 y se dio dieta completa hasta el parto. La DPN se conti-

nuó ligando los conductos galactóforos de una de dos ma-

dres lactantes y rotándolas (cada 12 h) entre las camadas.

Se preparó una dieta con sabor a cocoa o a canela para eva-

luar la frecuencia de acercamientos, husmeos, latencia de

inicio de ingesta, tiempo de consumo y gramos consumidos

durante la prueba de preferencia a los sabores. En la OBS

se evaluó la frecuencia de observación hacia la DEM, el au-

toaseo y la frecuencia de posición en dos patas. En el en-

cuentro social se midió la frecuencia de contactos con la ca-

beza, con el cuerpo, el husmeo del hocico de la DEM por la

OBS y la ingesta de fragmentos de alimento. Las ratas con

DPN observaron menos a las DEM, presentaron mayor fre-

cuencia de contactos con la cabeza, con disminución del hus-

meo del hocico vs sus controles. Las ratas DEM prefirieron la

dieta con canela, mientras que las OBS controles consumie-

ron cantidades similares de ambos sabores; las ratas OBS

con DPN prefirieron la dieta de canela al igual que sus DEM.

Los hallazgos sugieren que las ratas con DPN exploran y

husmean menos a su pareja, tienen más contactos con la

cabeza e ingieren el mismo sabor que sus DEM. Se concluye

que la DPN interfiere con la capacidad social para transferir

la información de preferencia al sabor a su congénere.

Introducción

Los efectos cerebrales causados por la desnutrición frecuen-

temente son permanentes, y limitan las capacidades cogniti-

vas esenciales para el desarrollo de las capacidades intelec-

tuales, profesionales, económicas y creativas de la población

humana (Cravioto y Robles, 1965). La DPN reduce los árbo-

les dendríticos, el número de ramas y su densidad en la cor-

teza insular, núcleo del fascículo solitario rostral e intermedio,

núcleo parabraquial, amígdala y desorganiza las papilas gus-

tativas. También hay hipomielinización de vías sensoriales,

disminución del área del bulbo olfatorio, del tamaño de los

glomérulos olfativos, células mitrales, células en penacho,

hipotálamo e hipocampo, que hace deficiente la discrimina-

ción olfativa (Escobar y Salas, 1993; Rubio et al., 2004; Torre-

ro et al., 2008; Carreón et al., 2011; Salas et al., 2012).

La conducta apetitiva como conducta motivada consta de la

respuesta anticipatoria, respuesta consumatoria y el estado

de placidez (Escobar y Aguilar, 2002). Dentro de la respuesta

anticipatoria se puede considerar la interacción social entre

congéneres para la transferencia de información gustativa;

en el encuentro social, una rata puede estimular a otra para

alimentarse, e ingerir una mayor cantidad de alimento, o a

presentar una conducta de imitación de sus compañeros co-

mo una forma de aprendizaje social. La elección de alimento

en la rata está determinada por las necesidades fisiológicas,

los gustos o aversiones a determinados sabores, las caracte-

rísticas propias del alimento y la interacción y aprendizaje

social (Barnett, 1963; Galef, 2007).

Cuando un animal ingiere una sustancia nueva muestra ini-

cialmente su neofobia (aversión a la novedad) e ingiere una

pequeña cantidad del material novedoso; si el alimento es

seguro, su consumo incrementa en las subsecuentes exposi-

ciones (Bures et al., 1998).

En el presente estudio se investigó si durante la etapa juvenil

en ratas Wistar que fueron desnutridas en la vida temprana,

se presentaron alteraciones en la conducta apetitiva. Asimis-

mo, si hubiera deficiencias en la discriminación gustativa, és-

tas podrían contribuir al entendimiento del desarrollo de obe-

sidad y del síndrome metabólico que parece ser el origen de

varias enfermedades neurodegenerativas en el estado adul-

to. Asimismo, si la desnutrición ocurrida en la vida temprana

podría en el largo plazo ser causa de alteraciones en los pro-

cesos cognitivos que requieren de gran plasticidad, como se-

ría el caso de los trastornos de la conducta alimentaria. El

trabajo de investigación reciente con modelos animales esta-

blece que los sujetos desnutridos se ven afectados en el de-

sempeño de procesos cognitivos del tipo del aprendizaje.

Por lo tanto, se busca generar conocimientos de mecanis-

mos básicos acerca de la discriminación a dos sabores en el

76

modelo de la rata que permitan entender procesos cognitivos

en seres humanos.

Hipótesis

La restricción perinatal de alimento en ratas, producirá altera-

ciones en la conducta apetitiva y en la transferencia de infor-

mación, que impactarán en la selección de un alimento en su

etapa juvenil.

Objetivos

Objetivo general

Investigar alteraciones en la capacidad de discriminación so-

cial a dos sabores específicos en la rata con desnutrición pe-

rinatal, en su etapa juvenil.

Objetivos particulares

Evaluar la discriminación entre dos sabores específicos de

un demostrador, ante la presencia de un observador, previa-

mente desnutridos.

Evaluar si un demostrador con desnutrición perinatal muestra

alteraciones en su capacidad para la transferencia de infor-

mación asociada a la discriminación a dos sabores específi-

cos.

Definir la discriminación entre dos sabores específicos de un

observador, posterior al encuentro social con un demostra-

dor, previamente desnutridos.

Materiales y métodos

Para el estudio se integró un grupo control (GC, n=12) y en

un grupo desnutrido (GD, n=12). La desnutrición se realizó

durante el periodo perinatal, reduciendo al 50% el aporte de

alimento (7.8 g) del día G6-G12, del día G13-G18 al 70%

(10.9 g) y con el 100% (15.6 g) de la dieta del G19 hasta el

parto. Al nacimiento, las crías del GD continuaron su desnutri-

ción al ser alimentadas por un par de madres lactantes des-

nutridas durante el periodo prenatal, a una de las cuales se

le ligaron los conductos galactóforos; las crías permanecie-

ron 12 h con una madre sin ligar y 12 h con una madre ligada

(días 1-24). El destete fue realizado en el día 25 continuando

ambos grupos con dieta normal equilibrada (5001 dieta para

roedores) hasta el momento del estudio.

Se midió la capacidad social para transmitir la información de

la preferencia por un alimento entre una rata DEM y una rata

OBS. El procedimiento consta de 3 estadios: en el primero (1

h) a las ratas DEM se les da a comer dos alimentos “marca-

dos” con sabores específicos (canela y cocoa). En el segun-

do estadio, se le permite a la DEM interactuar durante 30 min

con la OBS, durante el cual esta última tiene la oportunidad

de oler el alimento marcado en el aliento de su respectivo

DEM. Durante el estadio tercero (1 h), después de un retardo

de 24 h, a la OBS se le da la opción de escoger entre dos

alimentos marcados con los mismos sabores que los del

DEM (Galef, 2002). Se evaluaron variables de exploración y

conducta: durante la prueba en la OBS se evaluó la frecuen-

cia de observación hacia la DEM; en el encuentro social se

midió la frecuencia de contactos con la cabeza y husmeo del

hocico entre la DEM y OBS; se midieron y compararon los

gramos de dieta consumidos por las ratas DEM el tercer día

de prueba vs las OBS. Los hallazgos experimentales se anali-

zaron con el paquete estadístico Statistica versión 6 con

ANOVA de una o dos vías, con comparaciones post-hoc me-

diante la prueba de Fisher LSD. Nivel de significación p

≤0.05.

Resultados y discusión

Durante la prueba en la que el OBS mira al DEM mientras

éste se alimenta, se encontró que el GD observa menos a su

DEM (Fig. 1).

En la interacción social y transferencia de información entre

DEM y OBS se encontró que el GD presentó mayor frecuen-

cia de contactos con la cabeza (Fig. 2) e ingesta de fragmen-

tos de alimento de cara y cuello (Fig. 3), con disminución del

husmeo del hocico (Fig. 4) y de contacto corporal (Fig. 5) vs

sus controles.

77

Fig. 1 Frecuencia de observación del DEM por el OBS.

Los valores son medias ± error estándar; p <0.05.

n GC= 6; n GD= 6

GC, grupo control; GD, grupo desnutrido; DEM, demostrado-ras; OBS, observadoras.

*, GC vs GD p = 0.038

Fig. 2 Frecuencia de contacto de cabezas entre DEM y OBS en el encuentro social.

Los valores son medias ± error estándar; p <0.05.

n GC= 6; n GD= 6

GC, grupo control; GD, grupo desnutrido; DEM, demostrado-ras; OBS, observadoras.

*, GC vs GD p = 0.048

Fig. 3 Frecuencia de ingesta de fragmentos del cuerpo del

DEM por el OBS en el encuentro social.

Los valores son medias ± error estándar; p <0.05.

n GC= 6; n GD= 6

GC, grupo control; GD, grupo desnutrido; DEM, demostrado-ras; OBS, observadoras.

1, cara y cuello; 2, lomo; 3, laterales; 4, extremidades inferio-res y superiores; 5, cola.

A, GD1 vs GC 2 p = 0.039; B, GD1 vs GC 3 p = 0.041; C, GD1 vs GC 4 p = 0.009; D, GD1 vs GC 5 p = 0.013; a, GD1 vs GD 2 p = 0.001; b, GD1 vs GD 3 p = 0.038; c, GD1 vs GD 4 p = 0.028; d, GD1 vs GD 5 p = 0.001.

78

Fig. 4 Frecuencia de husmeo del hocico del DEM por el OBS en el encuentro social.

Los valores son medias ± error estándar; p <0.05.

n GC= 6; n GD= 6

GC, grupo control; GD, grupo desnutrido; DEM, demostrado-ras; OBS, observadoras.

*, GC vs GD p = 0.001

Dentro de la respuesta consumatoria se encontró que las

DEM de ambos grupos prefirieron la dieta de canela, sin em-

bargo las ratas OBS del GC consumieron una cantidad simi-

lar de las dos dietas, mientras que las ratas OBS del GD pre-

firieron el mismo sabor que sus DEM (Fig. 6). Los resultados

sugieren que la capacidad discriminatoria de los sujetos del

GD muestra en el largo plazo alteraciones en sus mecanis-

mos cerebrales para la discriminación del sabor de las dietas

que aquí se analizaron.

Fig. 5 Frecuencia de contacto corporal entre DEM y OBS en el encuentro social.

Los valores son medias ± error estándar; p <0.05.

n GC= 6; n GD= 6 GC, grupo control; GD, grupo desnutrido; DEM, demostradoras; OBS, observadoras.

No hay diferencias significativas en las comparaciones

79

Fig. 6 Gramos consumidos el día 3 de prueba por ratas de-mostradoras vs gramos consumidos el día 1 por ratas obser-vadoras control y desnutridas.

Los valores son medias ± error estándar; p <0.05.

n GC= 6; n GD= 6

GC, grupo control; GD, grupo desnutrido.

A, DEM GC cocoa vs DEM GC canela p = 0.045; B, DEM GC canela vs OBS GC canela p = 0.044.

Conclusiones

Los hallazgos sugieren que la DPN afectó en la adolescencia

a los distintos componentes de la conducta apetitiva. En la

prueba de observación de las ratas OBS se encontraron dife-

rencias significativas entre el GC y el GD en dos de las tres

variables que se evaluaron. Durante la interacción social el

GD tuvo mayor contacto con cabezas e ingesta de fragmen-

tos de alimento de sus DEM. Por lo tanto, se sugiere que la

DPN interfiere con la capacidad social para transferir y recibir

la información de preferencia al sabor de un congénere.

Los hallazgos de este estudio tienen sustento en estudios

previos del grupo y de otros colegas en donde se observa

que los animales con DPN tienden a ser hiperactivos, su ca-

pacidad para explorar es deficiente y además son hiperemoti-

vos, es decir, tienen respuestas exageradas ante diferentes

tipos de estrés, lo cual pudiera interferir con la ingesta de ali-

mento.

Por lo tanto, la DPN afecta el funcionamiento y desarrollo ce-

rebral, lo cual tiene efectos sobre los procesos cognitivos a

largo plazo como en la etapa de la adolescencia.

Los resultados presentados en este trabajo corresponden a

ratas jóvenes, quienes ya tuvieron una recuperación de la

DPN pero sin llegar al 100%, por lo mismo, se esperaría que

en la vida adulta estos resultados fueran similares ya que los

procesos cognitivos relacionados con la ingesta de alimento

también podrían estar dañados en esa etapa.

Se requieren estudios adicionales sobre conducta apetitiva y

transferencia de información con sabores específicos en ra-

tas desnutridas para obtener más resultados concluyentes.

Esto permitirá identificar posibles mecanismos acerca de las

repercusiones de la DPN en la función cerebral de los seres

humanos.

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81

Asociación de rs9939609 del gen FTO y rs17782313 del gen MC4R con sobrepeso/obesidad y factores de riesgo metabólico en niños escolares de Querétaro

10

K.L. Flores Viveros, OP. García, MC. Caamaño, D. Ronquillo, G. Martínez, JL. Rosado, J.C. Solís Sáinz.

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro.

82

Resumen

La obesidad es una enfermedad crónica que se caracteriza

por la acumulación excesiva de grasa corporal, en la que pue-

den influir factores no genéticos y genéticos. La variabilidad

del Índice de Masa Corporal (IMC) es atribuible de un 40-

70% por factores genéticos. Los polimorfismos de nucleótido

sencillo (SNP) son la forma más simple de variación del DNA

en los humanos. Algunos SNP del gen asociado a la masa

grasa y la obesidad (FTO) y al gen del receptor de melano-

cortina 4 (MC4R) se han relacionado con un aumento del

IMC, elevación en los niveles de insulina, triglicéridos y gluco-

sa en población adulta europea. El objetivo del presente estu-

dio fue determinar la relación de los SNP del gen FTO y

MC4R con la presencia de obesidad y riesgo metabólico en

niños escolares de Querétaro. Participaron 200 niños de en-

tre 6 y 10 años de edad del Municipio del Marqués, Queréta-

ro. A todos se les realizaron las mediciones antropométricas

de peso, talla y circunferencia de cintura y se determinó su

composición corporal mediante DEXA. Se tomó una muestra

de sangre en ayunas para las determinaciones de glucosa,

triglicéridos, colesterol total, colesterol HDL y colesterol LDL.

De igual forma, se determinaron las frecuencias alélicas y

genotípicas de los SNP, rs9939609 del gen FTO y

rs17782313 del gen MC4R por medio de PCR en tiempo real

con sondas Taqman. Se encontró una prevalencia de obesi-

dad y sobrepeso del 12% y 17%, respectivamente. La fre-

cuencia genotípica para FTO resultó de la siguiente forma:

TT, TA y AA 77%, 22% y 1%; la frecuencia de alelos T y A fue

de 87% y 13%, respectivamente. En cuanto a MC4R la fre-

cuencia genotípica para TT, TC y CC fue 86,3%, 13 % y

0,7%; la frecuencia de alelos T y C fue de 93% y 7%, respec-

tivamente. De acuerdo al IMC no hubo diferencia significativa

entre los que presentaban el alelo de riesgo y aquellos que

no lo presentaban sin embargo, los grupos que no presenta-

ron el alelo de riesgo para rs9939609 presentaron una mayor

concentración de triglicéridos comparados con aquellos que

si lo presentaban. Los resultados muestran que la presencia

de estos SNP para FTO y MC4R no está relacionada con so-

brepeso/obesidad o con un mayor riesgo metabólico en ni-

ños escolares de Querétaro.

Introducción

La obesidad en niños es una condición caracterizada por un

exceso de tejido adiposo y constituye la patología nutricional

más frecuente en los países desarrollados. Actualmente Méxi-

co ocupa el primer lugar en obesidad infantil a nivel mundial

(Cortés, 2013).Los factores ambientales como alta ingesta

calórica y poca actividad física, contribuyen a la alta prevalen-

cia de obesidad y sobrepeso sin embargo, los factores de

susceptibilidad genética modulan fuertemente el impacto de

los factores ambientales en los individuos. Los factores gené-

ticos explican hasta el 40%-70% de la variación poblacional

en el índice de masa corporal (IMC) al modificar el gasto

energético y el consumo de alimentos (Cummings, 2003).

Dentro de las variaciones del DNA, los polimorfismos de nu-

cleótido sencillo (SNP) son la forma más simple y común.

Los SNP pueden influenciar la actividad del promotor de un

gen modificando así la expresión génica, la conformación y

estabilidad del RNA mensajero, así como la localización sub-

celular del mensajero y/o proteína y, de esta forma, generar

la enfermedad (Checa, 2007). Dentro de los SNP estudiados

en relación al sobrepeso y obesidad en el humano, dos han

sido asociados en forma significativa (Aller, 2012):

rs99399609: este SNP se encuentra localizado en el gen

FTO (Fat Mass and Obesity) y se expresa en cerebro e hipo-

tálamo. rs17782313: este SNP se encuentra localizado en el

gen MC4R (Melanocortin 4 receptor) y modifica la función del

receptor 4 a melanocortina, el cual se encuentra acoplado a

proteínas G y es expresado principalmente en el cerebro. El

objetivo de este estudio fue investigar la relación de

rs9939609 de FTO y rs1778231 de MC4R con la presencia

de riesgo de sobrepeso/obesidad y riesgo metabólico en ni-

ños escolares de Querétaro.

Materiales y métodos

El presente estudio fue de tipo transversal. Participaron 200

niños de entre 6 y 11 años de edad del municipio El Mar-

qués, Querétaro. Los padres o tutores recibieron información

en forma oral y escrita sobre el estudio. Aquellos padres inte-

resados firmaron de forma voluntaria una carta de consenti-

miento informado. El estudio fue aprobado por el Comité de

Bioética de la Facultad de Medicina de la Universidad Autóno-

ma de Querétaro. Fueron excluidos del estudio aquellos ni-

ños que presentaron alguno de los siguientes criterios: Mues-

tra de sangre incompleta, que hayan decidido no continuar

en el estudio.

A todos los niños se les tomaron medidas antropométricas

de peso, talla, circunferencia de cintura y se determinó su

porcentaje de grasa corporal por DEXA. También se les tomó

una muestra sanguínea con un ayuno previo de 12 horas, de

83

aproximadamente 3 mL, para la determinación de la concen-

tración de glucosa, triglicéridos, colesterol total, HDL y LDL.

En un tubo con EDTA se recolectaron 3 mL adicionales de

sangre para que una vez centrifugada, se recolectaron los

leucocitos de donde se extrajo el ADN para analizar los

SNPs.

Mediciones antropométricas y composición corporal.

A todos los niños se les tomó el peso en una báscula electró-

nica (Seca-Erecta 844, Seca Hanover MD) previamente cali-

brada con pesas patrones de pesos conocidos. Se colocó en

una superficie plana indicándole al niño que se colocara en

el centro de la plataforma de la báscula en posición erguida y

relajada, mirando al frente, con los brazos a los costados del

cuerpo, con las palmas descansando sobre los muslos, talo-

nes ligeramente separados y la punta de los pies formando

una “V”. La talla se tomó con un estadímetro (Seca-Bodyme-

ter 208, Seca Hanover ND) de 2m con separación de 0.1cm.

La determinación de la talla se realizó descalzo, asegurándo-

se que los talones, pantorrillas, glúteos, hombros y parte pos-

terior de la cabeza estuvieran en contacto con la pared. Verifi-

cando el “plano de Frankfurt” se procedió a tomar la lectura.

Con el peso y la talla se calculó el Índice de Masa Corporal

(IMC). Considerando los criterios de la Organización Mundial

de la Salud (World Health Organization, 2006)), sobrepeso

se definió como 1.01≥ Score-Z ≤1.99 (DE), y para obesidad

Score-Z ≥2 (DE). La circunferencia de cintura se midió colo-

cando una cinta métrica (SECA) sobre una línea que se en-

cuentre en el punto medio entre la cresta iliaca superior y el

borde costal inferior, al final de una espiración normal, subien-

do al niño o niña a un banco de 60 cm de altura con la finali-

dad de que coincidiera la altura de la cintura con la altura de

los ojos del lector. Todas las evaluaciones de antropometría

se realizaron por duplicado en forma no consecutiva por nu-

triólogas previamente estandarizadas utilizando los procedi-

mientos recomendados por la Organización Mundial de la

Salud. (World Health Organization, 2006)

Para determinar el porcentaje de grasa, grasa magra y masa

libre de grasa se utilizó un equipo DEXA (HologicMod Explo-

rer), por personal certificado. La masa grasa abdominal y el

porcentaje de grasa abdominal se estimaron siguiendo un

procedimiento descrito previamente por Hill y colaboradores

en 2007 (Hill A.M., 2007).

Análisis bioquímicos

Las muestras fueron centrifugadas a 2,500 rpm durante 10

minutos para obtener el suero y así poder realizar los análisis

bioquímicos de glucosa, triglicéridos, colesterol, HDL y LDL.

Todas las determinaciones se realizaron por un método enzi-

mático colorimétrico en un espectrofotómetro Genesis 20

ThermoSpectronic (Madison, U.S.A.) según las indicaciones

de cada Kit (ELITech Clinical Systems, Sees, France). Consi-

derando glucosa >100mg/dL, triglicéridos >100mg/dL, coles-

terol total >200mg/dL, HDL <45 mg/dL y LDL >130 mg/dL.

Como factores de riesgo metabólico. (Barlow, 2009)

Genotipificación

Las muestras fueron centrifugadas para la obtención de los

leucocitos para la extracción de DNA que se realizó por me-

dio de TRIzol Reagent Ambion con una técnica previamente

estandarizada. Para conocer la integridad de ADN extraído

se realizó una electroforesis en un gel de agarosa al 1% du-

rante 60 minutos a un voltaje de 100 watts. La determinación

de la concentración de ADN se realizó por medio del Nano-

drop.

Posteriormente se almacenaron a -20°C para su óptima pre-

servación y su posterior uso. La genotipificación de

rs9939609 de FTO y rs17782313 de MC4R se realizó utilizan-

do sondas de hibridación TaqMan ® específicas para ensa-

yos de genotipificación.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos se integraron en una base de datos y se

observó el grado de asociación entre las diferentes variables

como peso, talla, IMC, perfil lipídico, glucosa. Con correlacio-

nes. Según el tipo de variable continua o discreta, se usaron

pruebas estadísticas de T-Student y chi-cuadrada con un va-

lor de confianza del 95 %. Todos los análisis se llevaron a

cabo con el programa SPSS versión 18. (SPSS Inc., Chica-

go, IL).

Resultados

De acuerdo a la clasificación del IMC/edad se encontró una

prevalencia combinada de sobrepeso y obesidad del 27% y

71% con peso normal. La Tabla 1 muestra las características

generales de la población estudiada. Como se esperaba, las

variables antropométricas y el perfil de lípidos fueron signifi-

cativamente más altos en el grupo de sobrepeso y obesidad

84

comparado con el grupo normal. Sin embargo no hubo dife-

rencias significativas en la concentración de glucosa entre

grupo.

Triglicéridos elevados y HDL bajo fueron los factores de ries-

go más prevalentes en la población, (37% y 35% respectiva-

mente). Sin embargo se vieron alteraciones metabólicas tan-

to en niños con peso normal como con sobrepeso/obesidad

(figura 1).

Figura 1. Prevalencia de riesgo metabólico de acuerdo a

IMC/edad.

Se determinó la frecuencia alélica del polimorfismo

rs3969609 del gen FTO encontrando 87% para T y 13% para

A, con una frecuencia alélica menor de 12.5% para el alelo

de riesgo (A). Siendo la frecuencia genotípica de: TT 77%,

TA 22% y AA 1%. En cuanto a MC4R la frecuencia alélica

de rs17782313, se encontró 93% para T y 7% para C, con

una frecuencia alélica menor de 6.5%. Siendo la frecuencia

genotípica de: TT 86.3%, TC 13% y CC 0.7%.

En la tabla 2 se muestra la asociación entre antropometría,

perfil de lípidos y glucosa con la presencia del alelo de riesgo

A para FTO, pero no hubo diferencia significativa.

Tabla 2. Asociación entre antropometría, perfil de lípidos y

glucosa con la presencia de de rs9939609.

Tabla 1. Características bioquímicas y antropométricas de

acuerdo al Índice de Masa Corporal de la población.

*t-Student significancia estadística p<0.05

T/E: talla para la edad, P/E: peso para la edad, PAS: presión

arterial sistólica, PAD: presión arterial diastólica, HDL: coles-

terol de alta densidad, LDL: colesterol de baja densidad, Col.

Total: colesterol total.

Al igual que FTO, MC4R no presentó asociación entre antro-

pometría, perfil de lípidos y glucosa con el alelo de riesgo C

(Tabla 3).

Tabla 3. Asociación entre antropometría, perfil de lípidos y

glucosa con la presencia de de rs17782313.

85

2%#

25%#

13%#

28%#

5%#0%#

58%#

26%#

52%#

19%#

Glucosa#>#100#mg/dL#

Triglicéridos#>#100#mg/dL#

Colesterol#total#>170#mg/dL#

HDL<#45#mg/dL# LDL#>#110#mg/dL#

Np# Sp/Ob#

En la Tabla 4 se muestra las características de la población

de acuerdo a los que presentan al menos un alelo de riesgo

en el caso de FTO los cuales tenían menores concentracio-

nes de triglicéridos comparados con los del alelo ancestral.

Tabla 4 . Características bioquímicas y antropométricas

de acuerdo a la presencia de rs9939609.

*T-Student significancia estadística p<0.05

Para MC4R no hubo diferencia significativa en ningún pará-

metro antropométrico y bioquímico comparado con los que

presentaban el alelo de riesgo (Tabla 5).

Tabla 5. Características bioquímicas y antropométricas de

acuerdo a la presencia de rs17782313.

*t-Student significancia estadística p<0.05

Conclusión y discusión

La falta de asociación de la obesidad y sus parámetros meta-

bólicos, con las variantes analizadas podría ser a consecuen-

cia de un tamaño de muestra insuficiente, aún y cuando se

cuenta con un poder estadístico del 80%. Otra posible expli-

cación es la exposición ambiental, estos niños están en una

zona rural donde la alimentación, la actividad física, y el mis-

mo ambiente es totalmente diferente comparado con pobla-

ciones europeas y asiáticas, donde se han descrito claras

asociaciones con estos SNP. Aunque se comprobó la presen-

cia de este SNP, la frecuencia alélica menor fue por debajo

de lo reportado en otras poblaciones por lo que podríamos

concluir que estas variantes podrían no influir en gran medi-

da al desarrollo de la obesidad en escolares de esta región.

Sin embargo los niños que presentaron el alelo de riesgo de

la variante rs99399609 tuvieron concentraciones de triglicéri-

dos menores a los que presentaban el alelo de riesgo ances-

tral. Lo cual pudiera atribuirse a la dieta o actividad física, por

lo que es necesario hacer otros estudios para aclarar esta

variable. Por otro lado se pudo percatar que la presencia de

obesidad es ya un problema en regiones rurales, que duran-

te mucho tiempo se ha creído que su principal problema es

la desnutrición, sin embargo en este estudio pudimos obser-

var que tanto niños con normopeso y niños con sobrepeso/o-

besidad presentan alteraciones metabólicas que los predispo-

ne a enfermedades crónicas de seguir con esta tendencia.

Por eso es importante realizar estudios que nos pueda abrir

un panorama de la situación actual que se vive en zonas rura-

les donde por mucho tiempo se ha tratado de combatir la des-

nutrición siendo que la obesidad es un problema aun mayor

que trae consigo alteraciones metabólicas a tan temprana

edad.

Referencias

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87

Cambios proteogenómicos del receptor purinérgico P2X6 inducidos por modificaciones en la alimentación durante la ontogenia del intestino de rata

11

K. Padilla-Olvera, LC. Berumen Segura, G. García-Alcocer

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro

25.kmpo@gmail.com

88

Resumen

La familia de receptores purinérgicos P2X está formada por

siete subtipos (P2X1-7), los cuales participan en las funciones

del intestino debido a que al unirse a ATP extracelular inter-

vienen en la permeabilidad rápida y selectiva a peque-

ños cationes monovalentes y Ca2+. Un miembro de dicha fa-

milia es el receptor P2X6 el cual está involucrado en la regula-

ción fisiológica de las neuronas entéricas, y su funcionalidad

puede cambiar por su estado de glicosilación. En este traba-

jo se estudiaron los cambios en los niveles de expresión géni-

ca y proteica, así como el estado de glicosilación del receptor

P2X6 durante el desarrollo de intestino de rata en los perío-

dos perinatal (embrionario y recién nacido) y de transición

lactancia-destete. Las metodologías utilizadas fueron qRT-

PCR, inmunofluorescencia y Western blot, para lo cual se

usaron ratas Sprague Dawley macho, las cuales fueron sepa-

radas en seis grupos: E18, P0, P30 y adulto. Se estudiaron

las secciones proximal y distal del intestino delgado de rata.

Los resultados indican que el gen que codifica para el recep-

tor purinérgico P2X6 se encuentra expresado durante toda la

ontogenia del intestino delgado de rata de rata y que tiene

cambios en su expresión génica dependientes de la edad y

sección, obteniéndose mayor actividad en las edades de P30

(una semana después del destete), así como en las seccio-

nes proximales. A pesar de ello, la proteína P2X6 se expresó

en mayor cantidad en la edad de E18 y en menor cantidad

en las edades de P30, además se detectaron bandas corres-

pondientes a diferentes estados de glicosilación, así como

una distribución diferencial del receptor purinérgico P2X6 de-

pendientes de la edad y de la sección estudiada.

Palabras clave: ontogenia, purinoreceptor, P2X6, glicosila-

ción

Introducción

Los receptores P2X son canales iónicos membranales activa-

dos por la unión de adenosina trifosfato (ATP) extracelular

del nucleótido ATP, el cual es mejor conocido por el papel

que desempeña dentro de la célula como fuente de energía

en el metabolismo y de señalización intracelular, sin embargo

no fue hasta 1972 cuando Geoffrey Burnstock propuso el rol

extracelular de dicho compuesto como un neurotransmisor

que se une a sus receptores, los cuales fueron llamados “re-

ceptores purinérgicos”.

Hasta la fecha existen siete subunidades del receptor P2X

(P2X1-7), los cuales se ensamblan en trímeros para formar

complejos homoméricos o heteroméricos. El subtipo P2X6 es

el único incapaz de formar un receptor homomérico funcio-

nal. Sin embargo forma heterómeros con las subunidades

P2X2 y P2X4, (Torres y col., 1999) produciendo receptores

con propiedades diferentes a la de los receptores iniciales

(King y col., 2000). Por lo cual la subunidad receptora de

P2X6 ha sido considerada como un regulador fisiológico de

las otras subunidades.

Entre los efectos fisiológicos reportados para los receptores

purinérgicos se encuentran: su papel en la transmisión sináp-

tica, la sensación del sabor y control del músculo liso (Young,

2010). Además dichos receptores se han encontrado localiza-

dos en el sistema nervioso entérico (SNE), también conocido

como el segundo cerebro, el cual controla la secreción y moti-

lidad gastrointestinal, además de estar involucrado en la sen-

sación visceral. Es por ello que los receptores purinérgicos,

han sido propuestos como blancos potenciales para el trata-

miento de enfermedades intestinales (Burnstock, 2014).

El intestino delgado es la primera entrada de diferentes com-

puestos químicos como los nutrientes, drogas y xenobióticos,

lo cual juega un papel importante durante la etapa de desa-

rrollo, especialmente en la transición lactancia-destete, ya

que ocurre una abrupta inducción de varios genes relaciona-

dos a los nutrientes recibidos y al metabolismo (Henning,

1981; Thomson y Keelan, 1986). Así mismo, se ha encontra-

do que la dieta puede modular el SNE debido a la alta plasti-

cidad del mismo (Pacha, 2000; De Quelen y col., 2011). Por

otra parte, se ha reportado que la dieta también puede modu-

lar la expresión de los receptores P2X (Misawua y col; 2010)

presentando cambios durante el desarrollo embrionario y pos-

natal.

Estudios previos han reportado que el receptor P2X6 es regu-

lado bajo condiciones patológicas como el cáncer y deficien-

cia de zinc, pero también durante la ontogenia (Nawa et al.,

1999; Chu et al., 2003; Xiang et. al., 2006). Adicionalmente,

se ha propuesto el estado de N-glicosilación del receptor

P2X6 como mecanismos para su propia regulación para la

funcionalidad del receptor (Jones et al, 2004; Ormond et. al.,

2006). El objetivo de este trabajo es proporcionar evidencia

89

molecular de los cambios proteogenómicos del receptor puri-

nérgico P2X6 por el cambio de alimentación durante el desa-

rrollo del intestino delgado de la rata.

Métodos

Animales

Se usaron ratas Sprague-Dawley macho con acceso a agua

y alimento ad libitum, alojadas bajo ciclos de luz-oscuridad

de 12 h. Las crías de rata recién nacidas se sacrificaron por

decapitación, posteriormente se disectó el intestino delgado

y se dividió en las secciones proximal y distal. Las ratas adul-

tas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico (40 mg /

kg, ip). Tan pronto como ya no responden a los estímulos no-

ciceptivos, que se sacrificaron por dislocación cervical. El in-

testino delgado se retiró rápidamente y se divide en proximal

(cerca del estómago) y distales (porción más cercana al co-

lón). Los tejidos extraídos fueron lavados en solución salina

tamponada con fosfato fría (PBS); a continuación se congela-

ron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a

-80 °C hasta que se realizaron los experimentos. Los tejidos

colectados fueron de edad embrionaria de 18 días (E18), así

como de ratas posnatales del día 0 al 30 (P0-P30) y adultos.

RT-PCR en tiempo real

Una porción (100 mg) del intestino delgado de cada edad se

utilizó para la extracción de ARN total. El ARN total fue aisla-

do utilizando High Pure RNA Tissue Kit (Roche, Mannheim,

Alemania) según el protocolo del fabricante. Posteriormente

el RNA extraído se incubó DNasa I (Invitrogen, EE.UU) con

el fin de eliminar posibles contaminación de ADN genómico.

El ARN total se cuantificó usando un espectrofotómetro Na-

no-Drop (ND-1000), después 1 µg de ARN total fue sometido

a transcripción reversa empleando Transcriptor First Strand

cDNA Synthesis Kit (Roche, Mannheim, Alemania) según el

protocolo del fabricante.

Los ADNc del gen que codifica para el receptor P2X6 y del

gen constitutivo β-actina fueron amplificados durante 40 ci-

clos por PCR en tiempo real (2µl de ADNc por reacción) me-

diante LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Ro-

che, Mannheim, Alemania). Las secuencias de cebadores

fueron los siguientes; P2X6 de rata: forward 5'-CAG-3 'TGA-

CACCAGCTCAAGTC y reverse 5'-3'- CACCAGCTCCA-

GATCTCACA (Gen Bank Nº de Acceso NM_012721.2); β-ac-

t ina de rata: pr imers foward 5 ' -AGCCATGTACG-

TAGCCATCC-3' y reverse 5' TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG

-3' (Gen Bank Nº NM_031144.2). Por último se hizo una cuan-

tificación relativa con respecto al gen constitutivo.

Western blot

La extracción de proteína de los tejidos se realizó mediante

un buffer de lisis (Tris HCl 5 mM, EDTA 5 mM, pH 7,2) adicio-

nado con inhibidores de proteasas (Complete Roche Applied

Science). La cuantificación la proteína se realizó por el méto-

do de Bradford, usando albúmina sérica bovina (BSA) como

estándar. Aproximadamente 50 mg de proteína fueron sepa-

radas en un gel dodecil sulfato de sodio de poliacrilamida al

10% (Amersham Biosciences, EE.UU.) mediante electrofore-

sis durante 40 minutos a 150 V.

Una vez separadas las proteínas en el gel, fueron transferi-

dos a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se blo-

queó durante 2 h con leche descremada al 3% (Bio-Rad,

EE.UU.) en PBT. Por último se incubó la membrana con anti-

cuerpo primario P2X6 anti-conejo (1: 500, Santa Cruz Biote-

chnology, CA, EE.UU.) durante la noche a 4ºC. La proteína

se detectó utilizando anticuerpo secundario anti-conejo conju-

gado con HRP (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, CA,

EE.UU). Entre cada paso se hicieron 3 lavados de 10 minu-

tos con PBS 1X. Las bandas se visualizaron utilizando la de-

tección de quimioluminiscencia (ECL, Amersham, EE.UU).

Inmunoflourescencia

Con el fin de evaluar los patrones de distribución de los re-

ceptores P2X6 durante desarrollo del intestino de rata, se ob-

tuvieron las secciones proximal y distal del intestino delgado

en las edades de E18, P0, P30 y adulto. Los tejidos fueron

fijados paraformaldehído al 4% a 4 ° C. Posteriormente los

tejidos fueron sumergidos a una solución de sacarosa al

30% de sacarosa y después embebidos en Tissue-Tek y

guardados a -80 ºC. Se hicieron microcortes de 12µM en el

criostato (Leica CM 1850, EE.UU).

Los criocortes fueron depositados en laminillas y almacena-

dos a -20ºC hasta su uso. La laminillas se lavaron con PBS

por 10 minutos, tres veces. A continuación se incubaron du-

rante 30 min a temperatura ambiente con una solución de

bloqueo (3% w / v albúmina de suero bovino y 2 mg / ml poli-

L-lisina en PBS con 0,5% de Triton X -100, PBT) para reducir

90

la unión no específica, seguido de una incubación con anti-

cuerpo primario P2X6 (Santa Cruz Biotechnology, CA,

EE.UU.) diluido 1: 200 en PBT durante la noche a 4ºC.

Posteriormente, las laminillas se incubaron con Alexa 488

burro anti-conejo IgG (Invitrogen, EE.UU.), diluido 1: 1500 en

PBT durante 2 h a temperatura ambiente. Finalmente, la incu-

bación se detuvo mediante 3 lavados durante 10 minutos.

Imágenes de etiquetado inmunofluorescencia fueron toma-

das con microscopía confocal (Carl Zeiss LSM 700, Alema-

nia).

Análisis estadístico

Se realizó un diseño factorial y se llevó a cabo la prueba de

normalidad utilizando el estadístico Kolmogorov-Smirnov al

95% confianza. Posteriormente se hizo un ANOVA Modelo

Lineal General, finalmente se hizo una prueba pos-hoc de

Tukey al 95% de confianza utilizando para ello el paquete

estadístico de Minitab 16.

Resultados

Expresión del gen P2X6

La expresión relativa del gen P2X6 que codifica para el recep-

tor purinérgico P2X6, se cuantificó mediante PCR tiempo re-

al. La figura 1 muestra la expresión relativa de este gen con

respecto al gen endógeno de β-actina a diferentes edades

(E18, P0, P30 y Adulto) y secciones (proximal y distal) del

intestino delgado de rata.

En el intestino delgado de rata se observa que el gen P2X6,

se encuentra expresado durante toda la ontogenia y que es-

ta expresión es por efecto de la edad de la rata como de la

región del intestino evaluada (Cuadro 1). Se encontró que la

expresión del gen que codifica para el receptor P2X6, es ma-

yor en la región proximal que en la región distal del intestino

delgado de rata

Cuadro 1. Modelo Lineal General para la expresión del gen

que codifica para el receptor P2X6

GL: Grados de libertad; SC Sec: Sumatoria de cuadrados

secuenciales; SC Ajust: Sumatoria de cuadrado ajustados;

CM: Cuadrados medios ajustados; F: Estadístico F; P: Esta-

dístico P

* Efecto significativo (P ˃ 0.05).

En cuanto a la ontogenia, se observó la expresión del gen

P2X6, se observó desde la etapa embrionaria (E18); no obs-

tante, dicha expresión disminuyó en las ratas (P0) y luego

tuvo un incremento significativo en la edad de P30. Finalmen-

te en la edad adulta, los niveles de expresión del gen P2X6

regresan a los mismos que los detectados en la edad P0 (Fi-

gura 1).

Figura 1. Cuantificación relativa de la expresión del receptor

P2X6 durante la ontogenia de intestino delgado de rata en

las secciones proximal y distal. Cada columna representa la

media de expresión relativa del gen P2X6 de 5 experimentos,

normalizado con el gen constitutivo de β-actina. (a, b) letras

diferentes indican diferencia significativa, prueba pos-hoc

Tukey al 95% (P ˃ 0.05).

91

Estudio de glicosilación del receptor purinérgico P2X6

La expresión proteica del receptor P2X6 se estudió median-

te Western blot, con el cual se encontró que dicho receptor

presentó dos bandas, una a 70 KDa que corresponda al re-

ceptor totalmente glicosilado y otra de 50 KDa con menor gra-

do de glicosilación. La primera banda se observó con mayor

expresión en las edades E18 y P0 proximal, misma que de-

crece durante el desarrollo posnatal y la segunda banda es

débil en las dos regiones de P0, P30 y se incrementa en

adulto (Figura 2).

Figura 2. Análisis Western blot de las diferencias entre regio-

nes del intestino delgado en la expresión del receptor P2X6

durante la ontogenia. En la figura se observan los cambios

en la expresión de receptor purinérgico P2X6 en las edades:

embrionaria 18 (E18) y posnatales a partir del día de naci-

miento (P0) a la edad adulta (A). Los experimentos se realiza-

ron por triplicado. La letra P indica la sección proximal, mien-

tras que la letra D indica la sección distal.

Es interesante observar los cambios del peso del receptor

P2X6 durante la ontogenia. En la Figura 3 se observa la semi-

cuantificación de las bandas de 70KDa y 50KDa. Los resulta-

dos indicaron diferencia significativa en la banda de 70KDa

de E18 y P0 proximal comparado con las otras edades estu-

diadas. También se observó un aumento significativo de las

bandas de 50 KDa en las secciones de la región adulta com-

parada con el resto de las edades.

Figura 3. Semicuantificación del receptor P2X6 a través del

desarrollo del intestino delgado de rata en las secciones pro-

ximal y distal. En la gráfica se observa las unidades arbitra-

rias de densidad óptica (U.D.O) para las bandas detectadas

de 50 KDa y 70 KDa del receptor purinérgico P2X6.

Letras diferentes indican diferencia significativa por prueba

pos-hoc de Tukey al 95% (P ˃ 0.05). (a,b) prueba para la

banda de 50KDa. (A, B) prueba para la banda de 70KDa.

Distribución del receptor purinérgico P2X6 en la mucosa del

intestino delgado de rata

Por último, para conocer la distribución de la proteína recep-

tora P2X6 se utilizó

inmunofluorescencia confocal. La figura 4 muestra los cam-

bios de distribución del receptor purinérgico P2X6. La sec-

ción proximal del intestino de rata mostró marca inmunoreac-

tiva moderada del receptor purinérgico P2X6 en la edad de

P0, P30 y adulta en los vasos entéricos (VE) del intestino

delgado. En cambio la sección distal del intestino delgado

hubo una marca inmunoreactiva débil del receptor P2X6, en

la edad de P0 en las células epiteliales (CE). Es interesante

observar que la distribución del receptor P2X6 en la región

distal cambia en la edad de P30 y Adulta, en donde se encon-

tró inmunoreactividad en los VE.

Discusión

92

En este trabajo se estudiaron los cambios en la expresión

génica y proteica del receptor purinérgico P2X6 durante el

desarrollo del intestino de rata; así como su distribución en la

región proximal y distal del intestino. Con la técnica de qRT-

PCR, se observó que el gen que codifica para el receptor

P2X6 esta expresado durante la ontogenia del intestino del-

gado de rata, desde etapas embrionarias (E18) hasta la eta-

pa adulta. Por lo tanto el receptor P2X6, podría estar partici-

pando en la diferenciación del intestino, esto es consistente

con trabajos previos donde proponen a los receptores P2X

como reguladores del desarrollo de diversos órganos, tales

como: glándula adrenal en rata (Afework y Burnstock, 2000),

hígado de rata (Xian et al., 2006) y vejiga en humanos (O´re-

lly et al., 2001).

Es importante mencionar que tanto el gen como la proteína

P2X6, se encuentran altamente expresados en la etapa em-

brionaria, esto puede deberse a una posible implicación de

P2X6 en la diferenciación del sistema nervioso entérico. Tra-

bajos previos han reportado mecanismos mediados por los

receptores purinérgicos P2X en la diferenciación neuronal y

por la relación que tienen estos receptores en la movilización

de calcio intracelular (Glaser et al., 2013). Lo anterior es con-

sistente con lo reportado por Silva et al, en el 2007 quien tam-

bién utilizaron la técnica RT-PCR y encontraron una mayor

expresión del receptor P2X6 en etapas embrionarias compa-

radas con las adultas durante la ontogenia del cerebro de

rata.

La expresión del gen que codifica para la subunidad del re-

ceptor P2X6 disminuye en la edad de P0, pero aumenta en la

edad de P30. El aumento de P2X6 a partir de la edad P30,

podría deberse a que el intestino está en interacción directa

con los nutrientes de la dieta. Las ratas son destetadas a la

edad de P21 y los cambios observados en P30 correspon-

den a la transición de lactancia-destete; estos pudieran coin-

cidir con modificaciones morfológicas y funcionales que tie-

nen lugar en el intestino por la alteración en la composi-

ción de los alimentos, de leche materna a alimento sólido.

Lo anterior, es consistente con lo observado por Giaroni et al,

(2006) para el receptor purinérgico P2Y1, en donde observa-

ron cambios en la funcionalidad de éste receptor una sema-

na después del destete de las ratas.

Conociendo el comportamiento de la expresión del gen que

codifica para el receptor P2X6, se analizó si existía un com-

portamiento similar en la expresión de la proteína. El análisis

de Western blot demostró una alta expresión de la proteína

P2X6 en la edad E18, lo cual es consistente con la expresión

del gen para esta edad. Además la banda detectada fue de

un peso de 70 KDa la cual corresponde al peso de la subuni-

dad P2X6 totalmente glicosilada y funcional reportado por

Jones et al; 2004. La alta expresión del gen y de la proteína

P2X6 de 70 KDa en la edad de E18 puede

deberse a la función que podría estar realizando el re-

ceptor en la diferenciación de neuronas entéricas; debido a

que Schwindt et al, en el 2011 reportaron también que la su-

bunidad P2X6 de 70 KDa daba lugar a la formación de hete-

roreceptores P2X2/6, lo cual induce la diferenciación neuronal

en cultivos de neuroesferas.

La expresión de proteína P2X6, detectada por Western blot,

en la edad de P30 fue baja, a pesar de los altos niveles en-

contrados en la expresión del gen que codifica para este re-

ceptor. No obstante se encontró marca inmunoreactiva en los

ensayos de inmunofluorescencia. Cabe resaltar que los expe-

rimentos de Western blot se realizaron con todo la porción

del intestino evaluada, mientras que en los ensayos de inmu-

nofluorescencia se realizaron solo con la mucosa del intesti-

no. Lo anterior sugiere que el receptor P2X6 en la edad de

P30, pudiera estarse expresando más en la mucosa del intes-

93

Figura 4. Imágenes confocales de la distribución del receptor P2X6 durante el desarrollo del intestino delgado de rata. Los resultados indicaron cambios en la expresión y distribución del receptor puri-

tino delgado que en los plexos miéntericos, los cuales perte-

necen al SNE, como lo reportan Yu et al, (2010) en ratas

adultas. Esto implicaría quizá una mayor función del receptor

P2X6 en la mucosa que en el SNE en la edad de P30.

Por último al llegar a una edad adulta ocurre algo relevante,

el gen P2X6 disminuye su expresión 0.5 veces; sin embargo

la expresión de la proteína P2X6 aumenta con respecto a la

edad de P30, pero con una banda de 50 KDa correspondien-

te a la subunidad desglicosilada (Jones et al., 2004). Además

se observó marca inmunoreactiva moderada del receptor

P2X6 en los vasos entéricos de la mucosa del intestino en

ambas regiones. Suzuki-Kerr et al, en el 2008 demostraron

que el receptor P2X6 era almacenado en reservorios citoplas-

máticos, en células corticales, como un almacén intracelular

para la futura exportación de ésta proteína a la membrana

celular.

En conjunto los hallazgos de este trabajo y lo reportado por

Suki-Kerr et al, 2008 sugieren que posiblemente durante las

edades de P30 estuviera expresando el gen P2X6

sin llegar a traducirse por completo a proteína, generando

así un reservorio del gen P2X6 para posteriormente empezar

a traducirse a proteína en la etapa adulta y por ello solo se

observó la banda correspondiente al peso a la subunidad

P2X6 sin glicosilaciones. Las modificaciones encontradas en

la expresión génica y proteica así como la distribución del

receptor purinérgico P2X6 sugieren la participación de este

receptor en el desarrollo del intestino delgado de rata, así

como de posibles diferencias en la función de dicho receptor

dependiendo de la edad y sección. Ya que ha sido reportado

que los receptores heteoméricos con la subnidad P2X6 acti-

van la proteina CaMKII, la cual es esencial para la función

del sistema nervioso entérico (Gao et al, 2013).

Conclusión

El gen que codifica para el receptor purinérgico P2X6 se en-

contró expresado durante toda la ontogenia del intestino del-

gado. Con el Modelo Lineal General, se demostró que tanto

la edad de la rata, como la región del intestino evaluado tie-

nen efecto significativo en la expresión del gen que codifica

para el receptor purinérgico P2X6. Se observó que el gen

P2X6 se expresa más en la región proximal así como en las

edades de E18 y P30.

En cuanto a la expresión de la proteína P2X6, se encontró

durante todo el desarrollo del intestino delgado de rata con

excepción en la edad P0 en la región distal y en bajas canti-

dades en la edad de P30. Se detectaron bandas de 70 y 50

KDa correspondientes a diferentes estados de glicosilación;

sin embargo en este sentido hacen falta estudios posteriores

evaluar las glicosilaciones y funcionalidad de dicho receptor

durante la ontogenia del intestino delgado de rata.

Por último se observó que el receptor P2X6 presentó una dis-

tribución diferencial dependiente de la edad, ya que no se

localizó en todas las edades. No obstante esta distribución

se modificó a la edad de P30, en donde sin importar la región

estudiada, la marca se localizó en los vasos entéricos.

Los hallazgos de este trabajo demuestran que el receptor

purinérgico P2X6 sufre diversos cambios durante la ontoge-

nia del intestino delgado de rata, lo cual sugiere una participa-

ción de dicho receptor en la regulación del proceso del desa-

rrollo del intestino

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95

Purificación y caracterización parcial de una lectina citotóxica de frijol Tépari (Phaseolus acutifolius)

12

Torres Arteaga1,5*, J. L. Castro-Guillén2, E. Mendiola-Olaya2, T. García-Gasca1, C. B. Lebrilla3, C. Aguirre4, A. Blanco-Labra2.

1. Maestría en Nutrición Humana. Facultad de Ciencias Natu-

rales. Universidad Autónoma de Querétaro. 2. Departamento

de Bioquímica y Biotecnología de Plantas. CINVESTAV-Ira-

puato. 3. Departamento de Química. Universidad de Califor-

nia Davis 4. Instituto Tecnológico Nacional. Instituto Tecnoló-

gico de Roque. 5. Universidad Politécnica del Bicentenario.

*iovannatorres@gmail.com

96

Resumen

En nuestro laboratorio se ha observado que una fracción se-

mipura de lectinas de frijol Tépari presenta efecto citotóxico

diferencial sobre células de diferentes tipos de cáncer huma-

no. Sin embargo, la información sobre la identidad molecular

de las proteínas con actividad biológica es controversial. El

objetivo del presente trabajo fue purificar y caracterizar par-

cialmente al menos una lectina bioactiva de frijol Tépari (Pha-

seolus acutifolius). La estrategia consistió en extraer con

Tris-HCl pH 8 a 4º C, precipitación secuencial con sulfato de

amonio al 40 y 60% de saturación y cromatografía en colum-

na de exclusión de peso molecular con Sephadex G-75. Me-

diante este método se lograron separar dos poblaciones de

proteínas con actividad aglutinante, PA (29.8 kDa, pI 4.6 y

actividad de 12339 UA/mg proteína) y PB (26.1 kDa, pI 4.72

y actividad de 8226 UA/mg proteína). Se obtuvo un pico ma-

yoritario de proteína de cada población mediante una colum-

na de Superosa para FPLC acoplada a HPLC que fueron

analizados por espectrometría de masas para proteínas y

carbohidratos. Las dos proteínas presentaron alta homología

a la única secuencia deducida para una lectina de frijol Tépa-

ri, con ligeras diferencias entre ellas mismas. El espectro de

carbohidratos mostró el mismo tipo y cantidad. Futuros estu-

dios se enfocarán en el mayor conocimiento de su identidad

molecular.

Palabras clave: Frijol Tépari, lectinas, Phaseolus acutifolius,

purificación de proteínas.

Introducción

Las lectinas son glicoproteínas de origen no inmune, conoci-

das por aglutinar células y precipitar polisacáridos o incluso

otras glicoproteínas (Goldstein y col., 1980). Estas activida-

des se explican por la presencia de al menos un dominio no

catalítico que se une de forma reversible y específica a car-

bohidratos sin modificación de ellos, sin importar si son mono

u oligosacáridos (Peumans y Van Damme, 1995).

Aunque están presentes en casi todos los organismos vivos,

la de plantas siguen siendo el grupo más ampliamente inves-

tigado (Lis y Sharon, 1998). Las lectinas de plantas están

principalmente en los tejidos de almacenamiento como semi-

llas, que representa hasta el 10% de la proteína total, mien-

tras que en hojas, raíces y tallos su concentración es mucho

más baja (Liener, 1976; Chrispeels y Raikhel, 1991). Estas

proteínas son parte de los mecanismos de defensa en plan-

tas (Chrispeels y Raikhel, 1991).

Los patrones de glicosilación en células cancerígenas se en-

cuentran alterados y se han asociado con metástasis. El po-

tencial de lectinas de plantas como moléculas de reconoci-

miento para diferenciar tumores cancerígenos ha sido proba-

do así como su efecto adverso sobre el crecimiento celular

en células cancerígenas in vitro (Ferriz-Martínez y col.,

2010). Su mecanismo de actividad antitumoral a través de la

muerte celular programada, incluyendo la apoptosis y la auto-

fagia ha sido ampliamente descrito. Además, las lectinas de

plantas han sido utilizadas para el pronóstico y el diagnóstico

de cáncer utilizando microarreglos de lectinas y su combina-

ción con fármacos anti-tumorales pueden conducir a un efec-

to sinérgico, lo que podría ser una estrategia para el trata-

miento de cáncer (Hong y col., 2014). Adicionalmente, las

lectinas de plantas presentan efecto anti-asmático (Rogerio y

col., 2007), antidepresivo (Rieger y col., 2014), antinocicepti-

vo (Vanderlei y col., 2010), anti-viral (Huskens y Schols,

2012; Koharudin y Gronenborn, 2014), analgésico (Araujo y

col, 2011), anti-inflamatorio (Vanderlei y col, 2010; Araújo y

col, 2011), antioxidante (Kim y col, 2010), vasodilatador (Ba-

rroso-Neto et al., 2012) así como su uso potencial en el trata-

miento de las complicaciones relacionadas con la diabetes,

como la hiperglucemia (Da Rocha y col., 2013).

El frijol Tépari (Phaseolus acutifolius) posee al menos dos

lectinas diferentes, una de ellas con una alta afinidad para

los linfocitos, pero pobre afinidad por los eritrocitos y fetuina

y la segunda, con alta afinidad por los eritrocitos y fetuina y

con baja afinidad por linfocitos (Pusztai y col., 1987). Se ha

trabajado con la purificación de lectinas de frijol Tépari y sus

actividades bioquímicas y biológicas (Reynoso-Camacho y

col, 2003; Castillo-Villanueva y col, 2007; Valadez-Vega y

col., 2011). Sin embargo, los métodos de purificación utiliza-

dos varían factores como el pH de la extracción y la afinidad

por Fetuina. En este sentido, nuestro grupo demostró que

una fracción concentrada en lectinas de Phaseolus acutifo-

lius (FCL), obtenida por cromatografía de exclusión de peso

molecular y de intercambio iónico, no presenta afinidad por

cromatografía de afinidad de fetuina-agarosa.

La FCL ha mostrado efecto diferencial sobre la supervivencia

de células de diferentes tipos de cánceres, en particular so-

bre cáncer de colon CaCo2 y de cáncer de mama MCF-7

(García-Gasca y col., 2012). El mecanismo de acción está

97

relacionado con apoptosis (datos no publicados) . Debido a

que no se conoce la identidad de la lectina o las lectinas

bioactivas contenidas en la FCL, el objetivo del trabajo fue

purificar y caracterizar parcialmente una de las lectinas pre-

sentes en la fracción semipura de frijol Tépari (Phaseolus

acutifolius) sin pérdida de su actividad biológica.

Materiales y Métodos

Material biológico. Las semillas de frijol Tépari (Phaseolus

acutifolius) adquiridas en un el mercado local de Hermosillo,

Sonora. Se depositó material en el Herbario Dr. J. Rzedowski

de la Facultad de Ciencias Naturales de la UAQ para su iden-

tificación.

Reactivos. Todos los reactivos fueron grado analítico, prove-

nientes de las casas comerciales Sigma (St. Louis Mo, USA)

y J.T. Baker (Phillipsburg, USA). Los reactivos para electrofo-

resis se adquirieron en Bio-Rad (Hércules, Ca, EUA). Las

matrices para cromatografía de exclusión molecular e inter-

cambio iónico fueron de Pharmacia (Pharmacia Biotech; Upp-

sala, Suiza). Las placas de 96 pozos de Corning (Corning

Costar; Corning, NY, EUA). Los eritocitos de conejo se obtu-

vieron de un mismo animal con eritrocitos de alta afinidad a

la lectina.

Purificación de la lectina y cuantificación de actividad agluti-

nante. La harina se obtuvo mediante la trituración de las se-

millas de frijol Tépari en un molino Tekmar modelo A-10

Analytical mill. La harina obtenida de esta molienda se des-

grasó con una mezcla de cloroformo-metanol 2:1 en una pro-

porción 4:1 p/v con agitación por 15 min y después se filtró

con vacío, este proceso se repitió 2 veces más. Se dejó se-

car a temperatura ambiente en una campana de extracción.

Posteriormente se pesaron 100 g de harina y se mezclaron

con 500 mL de Tris-HCl 50 mM pH 8. La mezcla se dejó en

agitación durante 12 h a 4º C y se centrifugó a 39,200 g, du-

rante 60 min en una centrifuga Bekman JU2 con rotor JA-20.

Se realizó una precipitación secuencial al 40% y posterior-

mente al 60% de saturación con sulfato de amonio. La mues-

tra recuperada se inyectó en una columna de 167 x 1.7 cm

para filtración en gel con Sephadex G-75 (Pharmacia Bio-

tech; Uppsala, Suiza), dicha columna se equilibró con buffer

de bicarbonato de amonio 0.01 M (pH 7.8).

Las fracciones resultantes se recolectaron a una velocidad

de 0,15 mL/min, y se realizó el ensayo para determinar la ac-

tividad aglutinante (Jaffé, 1980) utilizando eritrocitos huma-

nos fijados (Turner y Liener, 1975). Las fracciones con alta

actividad aglutinante se concentraron en un sistema de ultra-

filtración Amicon (Millipore Billerica, MA, EE.UU.) utilizando

una membrana de 10 kDa. Posteriormente, las muestras se

inyectaron en una columna de HPLC Zorbax GF-250 con una

velocidad de flujo de 1 mL/min previamente equilibrada con

solución amortiguadora de fosfato de Sodio 0.01 M (pH 7).

Se determinó la actividad aglutinante y las muestras con alta

actividad se concentraron como se describió anteriormente, y

se almacenó a -20 º C hasta su uso posterior.

Identificación de perfil electroforético monodimencional. La

electroforesis se realizó de acurdo al el método de Schägger

y Von Jagow (1987). Se corrieron geles de poliacrilamida

(SDS-PAGE), al 10% en el gel separador y en el concentra-

dor al 4%, en condiciones desnaturalizante y se utilizó una

cámara de electroforesis Mini-Protean III de Biorad, con mar-

cadores de amplio rango, posteriormente el gel se tiñó con

azul de Coomassie. La proteína se cuantificó mediante el mé-

todo de Bradford (1976).

Perfil electroforético bidimensional y determinación del punto

isoeléctrico (pI). Se utilizaron tiras de acrilamida con un inter-

valo de pH de 3-7 en un sistema lineal. Para la primera di-

mensión se utilizó un equipo IPG-phor Isoelectric Focusing

System de Amersham Biosciences con las siguientes condi-

ciones: 15 h de rehidratación, 1 h a 250 V, 30 min a 500 V,

30 min a 1000 V y 2 h a 8000 V. Para la segunda dimensión,

que consiste en la separación de proteínas por peso molecu-

lar, se equilibró la tira de pH con una solución de equilibrio

durante 15 min con dos cambios. Una vez equilibrada, la tira

se colocó sobre el gel de poliacrilamida al 10% en una cáma-

ra Hoffer y se selló con agarosa. Las condiciones de corrida

fueron 30 min a 80 V y posteriormente se incrementó el volta-

je a 120 V. La determinación del pI se realizó mediante una

escala arbitraria en el gel, en donde el gel se mide transver-

salmente y cada centímetro del gel corresponde a una uni-

dad de pH.

Identificación de glicoproteínas mediante tinción PAS. Se de-

tectaron las glicoproteínas en geles de poliacrilamida siguien-

do la técnica de tinción de Schiff/ácido peryodico (PASS)

(Packer y col., 1999).

Secuenciación de péptidos. Las muestras de HPLC liofiliza-

das se resuspendieron en una solución 50 mM de Bicarbona-

98

to de Amonio y Acetonitrilo (ACN) al 10%, posteriormente se

le adicionaron 10 mM de Tris 2-carbixietilfosfina (TCEP), se

calentó a 35º C por 10 min y se dejó enfriar. Se adicionó Iodo

acetamida (IAA) a una concentración final de 15 mM y se in-

cubó por 1 h a temperatura ambiente en ausencia de luz, pos-

teriormente se incubó con 5 mM de ditiotreitol (DTT) por 10

min, al finalizar la incubación se le adicionaron 30 ng de tripsi-

na y posteriormente se preincubó de 4 a 12 h a 37º C. Se

agregó ácido fórmico al 5% por 10 min y finalmente la mues-

tra se concentró en un Speed Vac para su análisis en el equi-

po LTQ-FT-ICR (método modificado de nano spray utilizando

una fuente acoplada de Waters UPCL). Los resultados se

analizaron con el programa Scaffold 2.

Identificación de los carbohidratos. De la muestra provenien-

te de HPLC se utilizaron 20 µg de proteína previamente cuan-

tificada. Posteriormente se incubó con la enzima PNGase F

a 37º C por 12 h para liberar los N-Glicanos. Los oligosacári-

dos liberados fueron purificados por SPE (solid-phase extrac-

tion) y PGC (porous graphitic carbon). Previamente la colum-

na PGC fue lavada con agua ultra pura y posteriormente con

0.05% (v/v) de ácido trifluoroacetico (TFA) en 80% de acetoni-

trilo (ACN)/H2O (v/v), para posteriormente aplicar los oligosa-

cáridos. La columna fue lavada con agua desionizada con un

flujo de 1mL/min con la finalidad de remover sales y residuos

de buffer. Los oligosacáridos fueron eludíos con 10% de ACN

en H2O, 20% de ACN en H2O, 40% de ACN en 0.05% de

TFA en H2O. Cada fracción fue colectada y concentrada pa-

ra su análisis por MALDI.

Resultados

Una vez precipitada la proteína con actividad aglutinante, la

muestra se dializó y se realizó la cromatografía de filtración

en gel. Se colectaron las fracciones y se les leyó absorban-

cia a 280 nm. Se obtuvieron dos picos principales (Figura 1).

El primer pico (PA) presentó una actividad de 12,339.33 UA/

mg proteína y en el caso del segundo pico (PB) una actividad

de 8,226.22 UA/mg de proteína. Ambos picos se pasaron a

HPLC y se detectó un pico principal de cada grupo de proteí-

nas.

Figura 1. Cromatograma de filtración en gel (A) y HPLC

(B y C). Se obtuvo la FCL por filtración de peso molecular,

de la cual se lograron separar dos poblaciones (PA y PB).

Cada población de separó por HPLC y se obtuvieron dos pro-

teínas mayoritarias.

Se determinó el patrón electroforético (SDS-PAGE) de la pro-

teína con actividad aglutinante en los diferentes estados de

purificación (Figura 2). Se observa que las bandas que se

identifican con la tinción de glicoproteínas se van intensifican-

do en los últimos pasos de purificación, las cuales presentan

un peso molecular aparente de 30.1 y 25.5 kDa. En el PB se

observan con mayor intensidad estas bandas.

Para las lectinas purificadas por exclusión-HPLC PA y PB, su

pI y la masa molecular se verificó mediante 2D (Figura 3). La

lectina presente en PA mostró una masa molecular aparente

de 27,6 kDa y un pI de 3,4 en comparación con PB con masa

molecular aparente de 27,7 kDa y pI de 3,9. Ambas lectinas

se confirmaron con la técnica de tinción PASS. Como se ob-

serva, el peso molecular de ambas proteínas fue similar pero

no así su pI, lo que sugiere que se trata de proteínas distin-

tas, posiblemente isoformas.

99

Figura 2. Perfil electroforético SDS PAGE (A) y tinción

con PASS (B). MPM son los marcadores de peso molecular,

EC extracto crudo, P precipitado y dializado, FCL pool com-

pleto de las fracciones que mostraron actividad aglutinante,

P-A primer pico con actividad aglutinante, P-B segundo pico

con actividad aglutinante, (B) Tinción PASS para glicoproteí-

nas. Las flechas indican la presencia de dos proteínas de

301-1 y 25.5 kDa, respectivamente.

A partir de las manchas de mayor peso molecular se realizó

el estudio de secuenciación de péptidos en un equipo LTQ-

FT-ICR. Los péptidos se utilizaron en solución ya que se ha

observado que al tomar la muestra del gel se podrían afectar

los carbohidratos de la proteína. Después de analizar las se-

cuencias obtenidas a través del programa Scaffold 2 se com-

pararon las secuencias con bases de datos y con la secuen-

cia deducida por Mirkov y colaboradores (1994). Se identifica-

ron varios péptidos con alta similitud a dicha secuencia (Figu-

ra 4).

Figura 3. Perfil electroforético bidimensional de los picos

A (A) y B (B) de las fracciones obtenidas en HPLC. Se lle-

vó a cabo una electroforesis bidimensional con tinción con

Azul de Coomassie y PASS. Se muestran las manchas con

sus pesos moleculares.

Figura 4. Comparación de los péptidos obtenidos de PA

y PB con la secuencia de la lectina de Tépari deducida

por Mirkov y col. (1994). En amarillo se muestra la homolo-

gía con la secuencia deducida por Mirkov y col. (1994) y en

rojo las diferencias. Los óvalos rojos muestran diferencias

entre PA y PB.

En esta comparación también se detectaron algunas diferen-

cias entre PA y PB en las siguientes posiciones: 101 RQ, 122

QK, 171 KR, 181 GV, 182 QN, 185 DN, 229 RS (residuos en

color rojo). Adicionalmente, se encontró una homología del

76% entre los péptidos obtenidos de PA y PB con la fitohema-

100

glutinina de la secuencia deducida de Phaseoulus acutifolius

por Mirkov y col. (1994).

Los resultados del análisis de los espectros de masas de los

péptidos obtenidos a partir de la lectina purificada a partir de

PA fueron: 54 péptidos únicos exclusivos, 83 espectros único

y exclusivo, 498 espectros total 191/276. Los resultados del

análisis de los espectros de masas de los péptidos obtenidos

a partir de PB fueron: 27 péptidos únicos exclusivos, 40 es-

pectros único y exclusivo, 618 espectros total 160/276 ami-

noácidos (cobertura 58%).

Los N-glicanos se obtuvieron usando la enzima PNGasa F

sobre ambas lectinas y el análisis de espectrometría de ma-

sas reveló que la abundancia de mayor porcentaje de N-gli-

canos corresponde a oligo-manosas (Figuras 5, 6, 7). Tanto

para el PA como para el PB se identificaron los siguientes

carbohidratos utilizando 20% de ACN (numerados de acuer-

do al número de unidades encontradas): con 10% de ACN

fue posible observar la presencia de manosa 4, manosa 5,

manosa 6, manosa 7, manosa 8 y manosa 9 (Figura 15); con

20% de ACN se observaron hexosa 6, hexosa 7, hexosa 8,

hexosa 9, hexosa 10 (Figura 16) y con 40 % ACN fucosa y

xilosa.

Los carbohidratos que se lograron identificar para ambas

muestras fueron los mismos sin embargo, estos resultados

son parciales debido a que la enzima utilizada (PNGase F)

fue genérica. Lo anterior implica que la enzima corta en sitios

donde se encuentra fucosa α 1-3, por lo que dicha enzima no

estaría cortando en los sitios en donde se encontrase fucosa

1-6 y por lo tanto todos los carbohidratos presentes en dicha

posición no se analizaron. Futuros estudios se enfocarán en

la utilización de enzimas específicas como la PNGase A para

determinar las posibles diferencias en el tipo y orden de car-

bihidratos presentes en las antenas de las glicoproteínas.

Figura 5. Identificación de los carbohidratos presentes

en PA (A) y PB (B) mediante espectrometría por MALDI al

10% de acetonitrilo.

Discusión

Se logró la separación de dos picos principales con actividad

aglutinante en lugar de la FCL obtenida con el protocolo ante-

rior (García-Gasca y col., 2012). En el análisis de SDS-PAGE

se observan dos glicoproteínas principales detectadas en ca-

da población.

Castillo-Villanueva y col. (2007) reportaron la purificación de

una lectina con 4 isoformas obtenidas por cromatografía de

afinidad con Fetuína. Se entiende por isoformas cuando las

proteínas difieren sólo ligeramente en sus pesos molecula-

res, por lo que separación por cromatografía de exclusión de

peso molecular es difícil. En este caso, nuestros resultados

sugieren que las proteínas aisladas pueden ser isoformas sin

embargo, no fue posible separarlas utilizando Fetuína, por lo

que es probable que se trate de poblaciones distintas de lecti-

nas. Este hecho podría ser significativo debido a algunas de

las lectinas de frijol Tepari reportadas tienen alta afinidad por

fetuína (Reynoso-Camacho y col., 2003; Valadez-Vega y col.,

2011). El tratamiento previo con la precipitación con sulfato

101

de amonio puede ser la diferencia entre las lectinas reporta-

das y las presentadas en este trabajo.

Figura 6. Identificación de los carbohidratos presentes

en PA (A) y PB (B) mediante espectrometría por MALDI al

20% de acetonitrilo.

Figura 7. Identificación de los carbohidratos presentes

en PA (A) y PB (B) mediante espectrometría por MALDI al

40% de acetonitrilo.

Aparentemente, la cromatografía de exclusión molecular co-

mo el primer paso de purificación parece ser una buena op-

ción para separar dos o más glicoproteínas a partir de la

FCL, con diferencias estructurales, ya sea en su secuencia,

como en su glicosilación, incluso cuando comparten masas

moleculares similares. Previamente se había observado que,

al pasar la FCL por intercambio iónico se obtiene una frac-

ción con mayor grado de pureza pero con pérdida de cerca

del 80% de la actividad aglutinante pero con actividad citotóxi-

ca (García-Gasca y col., 2012). Las dos poblaciones estudia-

das, PA y PB, fueron probadas sobre células de cáncer de

colon HT-29. Los valores encontrados fueron CI50 de 181.56

µg de proteína/mL y CL50 de 285.92 µg de proteína/mL para

PA, y CI50 de 58.10 µg de proteína/mL y CL50 de 97.08 µg de

proteína/mL) para PB. De acuerdo con estos datos, se consi-

dera que la fracción PB presenta mayor actividad y potencial

citotóxico que la fracción PA y que la FCL (CI50 de 143.15 y

CL50 de 246.25 µg de proteína/mL, respectivamente) (Ánge-

les Zaragoza, 2010).

102

Por otro lado, las dos lectinas purificadas por HPLC fueron

separadas por 2D y presentaron masas moleculares aparen-

tes similares pero con diferencias en los puntos isoeléctricos.

En este sentido, trabajos anteriores presentan lectinas purifi-

cadas a partir de semillas de Tepari y, aunque la evidencia

de purificación que se muestra corresponde a una sola ban-

da en un perfil de proteína de SDS-PAGE, en este trabajo se

demostró que se trata de poblaciones de lectinas diferentes.

Las dos lectinas de Phaseolus acutifolius aisladas presenta-

ron diferencias en su estructura primaria, aunque ambas con

alta homología a la secuencia deducida disponible.

Conclusiones

Se logró establecer un método reproducible para obtener dos

fracciones de lectinas biológicamente activas (PA y PB) me-

diante cromatografía de exclusión de peso molecular. Los

dos picos principales mostraron tener pequeñas diferencias

en el peso molecular aparente pero distintos en pI, lo que su-

giere la presencia de isoformas.

De los datos obtenidos por proteómica se confirmaron dife-

rencias importantes entre PA y PB. Sin embargo, aún no es

posible asegurar que las diferencias correspondan a las lecti-

nas, debido a que no se cuenta con la secuencia completa

para cada muestra. Además, queda abierta la posibilidad de

que parte de las diferencias encontradas se deban a cam-

bios en los carbohidratos presentes en ellas, por lo que im-

portantes diferencias podrían estar vinculadas a la formación

de las unidades más complejas de los carbohidratos que con-

forman las antenas de las lectinas.

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104

Asociación de micronutrientes en sangre con indicadores de inflamación sistémica y leptina

13

G. Zavala , K. Long , OP. García, MC. Caamaño, T. Aguilar, L. Salgado , JL. Rosado

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro

gzavala@gmail.com

105

Antecedentes

La obesidad y las enfermedades crónico-degenerativas que

se le asocian son la mayor causa de muerte a nivel mundial,

y se acentúa en países en vías de desarrollo, como México

[1]. La obesidad y sus comorbilidades no solo afectan la cali-

dad y la expectativa de vida de la población sino además re-

presentan un problema para la economía del país ya que son

enfermedades que causan incapacidad. [2-5].

La obesidad está caracterizada por un aumento en el tejido

adiposo, que no solo es un tejido de almacenamiento de gra-

sa, sino que tiene la capacidad de segregar una serie de

compuestos llamados adipocitocinas, las cuales tienen un

gran impacto en el metabolismo, inmunidad y respuesta infla-

matoria [6, 7]. Diversos micronutrientes, como el zinc y las

vitamina A E y C, y hormonas como la leptina, pueden interve-

nir a través de diferentes mecanismos, en la promoción o inhi-

bición de reacciones inflamatorias[8]. Recientemente se ha

reportado que los micronutrientes tienen una acción diferen-

cial en las concentraciones de leptina y, por lo tanto, la lepti-

na puede estar contribuyendo a la inflamación asociada a la

obesidad a través de los micronutrientes. Sin embargo, otros

autores han reportado que los micronutrientes pueden tener

un efecto en la inflamación por diferentes mecanismos desde

su interacción directa con linfocitos y otras células del siste-

ma inmune, hasta la regulación de ciertas enzimas que se

encuentran en las rutas de transducción de señales y trascrip-

ción de genes [9-11].

El objetivo de este estudio transversal es evaluar el efecto

que tiene la concentración de las vitaminas A, C, E y zinc en

la respuesta inflamatoria y niveles de leptina en una pobla-

ción abierta de mujeres en zona rural de México.

Metodología

280 mujeres (36 años ± 7) de edad de 7 comunidades rura-

les del estado de Querétaro fueron invitadas a participar en

el estudio. Todas las mujeres recibieron información oral co-

mo escrita sobre el estudio y firmaron una carta de consenti-

miento informado. El estudio fue previamente aprobado por

el Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias Naturales

(FCN), de la Universidad Autónoma de Querétaro (UAQ).

Los criterios de exclusión fueron: Mujeres embarazadas o

lactando, con alguna patología asociada con inflamación o

que comprometa al sistema inmune (artritis, cáncer, sida, lu-

pus, etc), mujeres diagnosticadas con diabetes (niveles séri-

cos de glucosa arriba de 110 mg/ml) y personas que padez-

can de sus facultades mentales.

La muestra de 280 mujeres fue calculada para poder detec-

tar diferencias significativas en la razón de momios de 0.5 a

1.75 entre dos grupos independientes con diferentes niveles

de citocinas con un error alpha de 5% y un error beta del

20%, y una prevalencia de deficiencia de micronutrientes de

20% [12].

A las participantes se les tomó una muestra de sangre en

ayunas (12 horas) para la determinación de leptina, TNF-α, y

las Interleucinas 1, 6, 8, 10 y 12 (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-

12) respectivamente. Posteriormente, se les citó para ser

transportadas a la Unidad Metabólica de la FCN de la UAQ,

donde se llevó a cabo la evaluación antropométrica (talla,

peso y circunferencia de cintura). Ese mismo día, se les reali-

zó la evaluación de la composición corporal por medio de

DXA.

Antropometría y composición corporal

Se realizaron mediciones antropométricas por duplicado por

personal previamente estandarizado y certificado, siguiendo

los lineamientos de la OMS [13].

La talla se midió con un estadímetro modelo Body Meter 206

(SECA Bradford, MA). Las mujeres fueron medidas descal-

zas, con los pies bien apoyados en una superficie plana, con

el peso distribuido en ambos pies, los talones juntos. Se llevó

a cabo la medición verificando que los brazos colgaran libre-

mente a los costados, y la cabeza, glúteos y talones estuvie-

ran en contacto con la tabla vertical del estadímetro. Se les

indicó que hicieran una respiración profunda y que mantuvie-

ra la posición erguida. En ese momento se deslizó la cabeza

móvil del estadímetro hasta el vértice del cráneo con una pre-

sión suficiente para comprimir el cabello [13].

Se pesó a las mujeres con una báscula modelo ROBUSTA

813 (SECA Bradford, MA). Cada participante permaneció de

pie inmóvil en el centro de la plataforma, con el peso del cuer-

po distribuido en ambos pies, sin zapatos [13].

La medición de la circunferencia de cintura se realizó a una

distancia intermedia entre el borde inferior de la última costi-

106

lla y la cresta iliaca, en un plano horizontal, se palpó y marcó

cada uno de estos puntos y se determinó el punto medio por

medio de una cinta métrica (SECA Bradford, MA)[13].

Determinaciones bioquímicas

Las concentraciones séricas de las citocinas inflamatorias

TNF-α,IL-1, IL-6, IL-8, e IL-12 y la interleucina antinflamatoria

IL-10 se determinaron en forma simultáneamente por medio

de citometría de flujo utilizando un kit para evaluación de in-

flamación en humanos (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Las muestras se incubaron 1.5 horas en la obscuridad con la

dilución apropiada de cápsulas de captura; estas cápsulas

posteriormente fueron lavadas por centrifugación e incuba-

das nuevamente 1 hora con 30 minutos. Se lavaron nueva-

mente por centrifugación y fueron cuantificadas por medio de

un citómetro de flujo FACSCAN (Becton Dickinson, San Jo-

sé, CA) equipado con un láser a 488nm. Los datos fueron

analizados utilizando el software BD CellQuest utilizando con-

troles positivos subministrados por el proveedor.

La leptina y la proteína C reactiva (CRP) fueron cuantificadas

por duplicado utilizando un kit comercial de ELISA (Kit ELI-

SA para leptina en humanos,Linco Research, St Charles,

MO; Kit ELISA de alta sensibilidad para proteína-C Reacticva

(CRP), Bioquant, San Diego, CA).

Se determinó la concentración sérica de zinc por medio de

espectrometría de absorción atómica. Se midió la absorban-

cia por triplicado con un espectrofotómetro Analyist 7000

(Perkin Elmer, Boston, MA) utilizando una lámpara de Zn de

cátodo hueco a 15mA. Se consideró como deficiente de zinc

a cualquier individuo con una concentración en sangre me-

nor a <70µg/dL [14].

Se determinó la concentración sérica de vitamina A y E simul-

táneamente por cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC) de fase reversa, con un cromatógrafo modelo 1525

con una columna C18 (WATERS, New Braunfels, TX). La fa-

se móvil consistió de 100% metanol (J.T. Baker) y el flujo de

medició fue de 1 mL/min a una temperatura de 40°C, cuantifi-

cado a una longitud de onda de 300 nm.

La vitamina C fue medida por medio de un equipo HPLC mo-

delo 1525 con una columna C18 (WATERS, New Braunfels,

TX), con una fase móvil de NaH2PO4 0.01 M y EDTA 0.2

mM, a un flujo de 0.85 mL/min, y a una longitud de onda de

254 nm.

Los individuos fueron clasificados como deficientes de vitami-

na A cuando presentaron concentraciones en sangre abajo

de 20µg/dL [15], deficientes de vitamina E cuando presenta-

ron concentraciones en sangre inferiores a 5 µg/dL [15]y defi-

cientes de vitamina C con concentraciones en sangre meno-

res a 2µg/mL [15, 16].

Análisis estadistico

Se realizó un análisis descriptivo de las variables que incluye

medias y desviación estándar y un análisis de varianza con

una prueba de Tukey para evaluar si existe diferencia signifi-

cativa entre las mujeres con peso normal con sobrepeso y

con obesidad de la población. Se crearon nuevas variables a

partir de las ya obtenidas como lo son el IMC y el índice cintu-

ra estatura. Se estratificaron las

variables de IMC (normal, sobrepeso y obesidad) y citocinas

(no detectables, niveles bajos y niveles altos).

Se realizó una correlación de Pearson y una regresión lineal

para evaluar la relación entre leptina e índices antropométri-

cos y de composición corporal. Para evaluar la relación entre

los micronutrientes y citocinas se realizó una regresión logísti-

ca ordenada y se utilizó la razón de momios para reportar los

resultados. Todos los análisis se realizaron usando el paque-

te estadístico de STATA 11.

107

Tabla 1. Características de la población de acuerdo a su Índice de Masa Corporal (N=280) Tabla 1. Características de la población de acuerdo a su Índice de Masa Corporal (N=280) Tabla 1. Características de la población de acuerdo a su Índice de Masa Corporal (N=280) Tabla 1. Características de la población de acuerdo a su Índice de Masa Corporal (N=280) Tabla 1. Características de la población de acuerdo a su Índice de Masa Corporal (N=280) Normal Media ± D.E.

Sobrepeso Media ± D.E.

Obesidad Media ± D.E.

Total

Media ± D.E. Edad (años) 33.9 ± 6.8 a 37.2 ± 7.8 a 38.2 ± 7.5 b 37 ± 7.5 ** Peso (Kg) 53.9 ± 4.9 a 62.9 ± 5.1 b 78.9 ± 10.4 c 68.2 ± 12.7

** IMC (Kg/m2) 22.9 ± 1.5 a 27.5 ± 1.4 b 34.5 ± 4.1 c 29.7 ± 5.5 ** Índice Cintura Estatura 0.4 ± 0.03 a 0.5 ± 0.03 b 0.6 ± 0.1c 0.5 ± 0.1 ** Grasa Abdominal (%) 36.9 ± 5.1 a 42.9 ± 3.7 b 47.1 ± 4.1 c 43.6 ± 5.6 ** Circunferencia de Cintura (cm) 76.5 ± 15.1 a 86.3 ± 4.9 b 99.9 ± 8.9 c 90.3 ± 11.5

** Vitamina A (µg/dL) 46.2 ± 10.9 a 50.1 ±.7 b 48.1 ± 11.9 ab 48.5 ± 11.4 * Zinc (mg/mL) 1.2 ± 0.5 a 1.2 ± 0.6 a 1.2 ± 0.7 a 1.2 ± 0.6 Vitamina E (µg/mL) 7.6 ± 2.2 a 7.6 ± 2.1 a 6.7 ± 1.9 b 7.4 ± 2.1 ** Vitamina C (µg/mL) 5.1 ± 2.2 a 5.4 ± 2.2 a 5.4 ± 2.2 a 5.2 ± 2.2 Leptina (pg/mL) 16.1 ± 9.6 a 25.7 ± 11.1 b 44.6 ± 18.4 c 32.2 ± 18.5

** CRP (mg/L) 2.7 ± 3.3 a 4.3 ± 3.1 b 6.7 ± 3.7 c 5.1 ± 3.5** abc Diferencias entre grupos ANOVA *p<0.05 **p<0.01

a b c Diferencias entre grupos por medio de un prueba de comparación de medias de Tukey con un nivel de confianza de 95%

abc Diferencias entre grupos ANOVA *p<0.05 **p<0.01

a b c Diferencias entre grupos por medio de un prueba de comparación de medias de Tukey con un nivel de confianza de 95%

abc Diferencias entre grupos ANOVA *p<0.05 **p<0.01

a b c Diferencias entre grupos por medio de un prueba de comparación de medias de Tukey con un nivel de confianza de 95%

abc Diferencias entre grupos ANOVA *p<0.05 **p<0.01

a b c Diferencias entre grupos por medio de un prueba de comparación de medias de Tukey con un nivel de confianza de 95%

abc Diferencias entre grupos ANOVA *p<0.05 **p<0.01

a b c Diferencias entre grupos por medio de un prueba de comparación de medias de Tukey con un nivel de confianza de 95%

Resultados

Las medidas antropométricas y metabólicas de la población

se resumen en la Tabla 1, donde se puede observar que la

media para la edad fue de 36 años. En promedio, las muje-

res fueron de baja talla (151.9 cm. ± 4.9), con un elevado

índice de masa corporal y porcentaje de grasa abdominal. El

promedio de la concentración de vitaminas A, E y C fue ade-

cuado; sin embargo el promedio de la concentración en san-

gre de zinc fue bajo (1.3 µg/mL). La concentración promedio

de proteína C reactiva indica inflamación sistémica de bajo

grado (5.3 mg/mL).

Las prevalencia de deficiencias de vitamina C fue de 4%,

15% de vitamina E y 18% de zinc. La prevalencia de deficien-

cia de vitamina A fue prácticamente nula.

Se evaluó a la población de estudio de acuerdo a su IMC (Ta-

bla 1). Como era de esperarse, se presentó una diferencia

significativa entre los grupos de peso normal, sobrepeso y

obesidad en las variables de peso, ICE, % grasa abdominal

circunferencia de cintura, leptina y proteína C reactiva. La

concentración de vitamina E fue significativamente menor en

las mujeres con obesidad comparadas con las mujeres con

peso normal y sobrepeso. Las mujeres con peso normal y

obesidad tuvieron significativamente más vitamina A que las

mujeres con sobrepeso. No hubo diferencias entre grupos de

acuerdo a la concentración de zinc y vitamina C.

Se realizaron una serie de regresiones para detectar posi-

bles variables confusoras. Se evaluó el riesgo que tienen las

mujeres con altos niveles de grasa abdominal, un alto índice

cintura estatura y un alto índice de masa corporal de tener

altas concentraciones de marcadores de inflamación. Las

mujeres con alto porcentaje de grasa abdominal, un alto IMC

y un alto ICE, presentaron un mayor riesgo de tener altas

concentraciones de IL-6. No se encontró ninguna asociación

entre las demás citocinas IL-1, IL-8, IL-10, IL-12 y TNF- α y

las variables de composición corporal.

Se efectuó una regresión logística ordenada para evaluar la

relación que existe entre los marcadores

de inflamación y los niveles séricos de leptina en la población

(tabla 2). En esta población, la concentración de leptina no

incrementó ni disminuyó el riesgo de tener mayores niveles

de marcadores de inflamación.

Para evaluar el riesgo que tiene la población de tener altos

niveles de marcadores de inflamación acuerdo con diferentes

concentraciones de micronutrientes se realizó una regresión

logística ordenada (Tabla 3). El riesgo de tener altas concen-

traciones de los marcadores de inflamación: IL-6, IL,10, IL-12

y TNF-α se vieron significativamente reducidos en individuos

que presentan altas concentraciones de zinc. El riesgo de

presentar altos niveles de IL-1 fue menor en las mujeres que

presentaron altas concentraciones de vitamina A. Por el con-

trario, el riesgo de tener altos niveles de IL-6 fue mayor en

las participantes que presentaron altas concentraciones de

vitamina E. La vitamina C en este estudio no se asoció con

ninguno de los marcadores de inflamación en sangre.

Discusión

Este estudio es el primero en caracterizar la relación entre

citocinas inflamatorias y medidas de adiposidad y obesidad

central entre mujeres de zona rural en México, además de

caracterizar el efecto de las concentraciones sanguíneas de

diversos micronutrientes sobre niveles de marcadores de in-

flamación.

Se observó una relación significativa entre IL-6 y las medidas

de obesidad y adiposidad central que es consistente con lo

que otros autores han reportado [17, 18]. Mohamed et al.

(1997), por ejemplo, reportaron que aproximadamente el

30% de la IL-6 circulante es secretada por el tejido adiposo,

y que este porcentaje se incrementa en personas obesas.

Vozarova et al. (2001) en estudios en una población de in-

dios Pima encontraron que las concentraciones de IL-6 están

relacionadas positivamente con el tejido adiposo y negativa-

mente relacionada a la acción de la insulina. Otras interleuci-

108

Tabla 2. Relación entre leptina y marcadores de inflamaciónTabla 2. Relación entre leptina y marcadores de inflamaciónTabla 2. Relación entre leptina y marcadores de inflamación

Citocinas RM (95% IC)* P

IL-1 (ug/mL) 0.92 (0.80-1.05) 0.255

IL-6 (ug/mL) 1.01 (0.89-1.15) 0.781

IL-8 (ug/mL) 0.95 (0.83-1.08) 0.481

IL-10 (ug/mL) 0.92 (0.79-1.06) 0.272

IL-12 (ug/mL) 0.96 (0.83-1.11) 0.616

TNF-α (ug/mL) 0.91 (0.79-1.06) 0.252

Razón de momios (95% IC), probabilidad de que la concentración de una citocina (categorizadas en 3 niveles no detectable, <mediana, >mediana) sea mayor en mujeres con una elevada concentración de leptina. Ajustado por CRP y edad.

Razón de momios (95% IC), probabilidad de que la concentración de una citocina (categorizadas en 3 niveles no detectable, <mediana, >mediana) sea mayor en mujeres con una elevada concentración de leptina. Ajustado por CRP y edad.

Razón de momios (95% IC), probabilidad de que la concentración de una citocina (categorizadas en 3 niveles no detectable, <mediana, >mediana) sea mayor en mujeres con una elevada concentración de leptina. Ajustado por CRP y edad.

nas, como TNF-α, han sido correlacionadas con obesidad y

tejido adiposo en estudios realizados tanto en roedores co-

mo en humanos [19, 20]. Los resultados del presente estudio

son similares a los de le Kern et al. (2001). Ya que observa-

ron que las concentraciones de IL-6 fueron mucho más eleva-

das en plasma y en tejido adiposo en sujetos obesos compa-

rado con sujetos con peso adecuado. Sin embargo, no hubo

diferencias significativas entre obesos y no obesos en las

concentraciones de TNF- α.

En el presente trabajo, la IL-6 se asoció significativamente

con el tejido adiposo. Estos resultado coinciden con lo repor-

tado en otros

estudios [17, 18]. Así mismo, está comprobado que las per-

sonas obesas y con diabetes tienen concentraciones altas de

IL-6, y existe una correlación directa entre ésta y el porcenta-

je de grasa corporal [21].

La leptina se ha asociado directamente con la producción de

citocinas proinflamatorias [22]. De igual forma, se ha estudia-

do también el efecto que tienen los micronutrientes en la pro-

ducción de leptina, por lo que la leptina pudiera ser el meca-

nismo por el cual los micronutrientes se relacionan con los

procesos de inflamación observados en la obesidad. Los re-

sultados muestran una falta de asociación entre la leptina y

los marcadores de inflamación lo que sugiere que, en esta

población, el mecanismo por el cual los micronutrientes tie-

nen un efecto en la inflamación sistémica no es por medio de

la regulación de leptina. Por consiguiente la leptina no fue

incluida en el modelo que se utilizó para evaluar la relación

entre micronutrientes e inflamación crónica.

Se observaron diferentes asociaciones entre la concentra-

ción de micronutrientes y el riesgo de presentar concentracio-

nes elevadas de marcadores de inflamación en sangre. La

reducción en el riesgo de tener altas concentraciones de los

marcadores de inflación TNF-α, IL-6 IL-10 e IL-12 entre las

mujeres con altas concentraciones de zinc es similar a lo re-

portado por [23], quienes observaron que una suplementa-

ción con zinc en personas de la tercera edad reduce citoci-

nas proinflamatorias en plasma.

Han surgido diferentes hipótesis y mecanismos de cómo es

que se relaciona el zinc con la obesidad y por consiguiente

con la inflamación crónica de bajo grado. Uno de los más

aceptados es por medio de la regulación de la leptina ya que

es la hormona encargada de prender rutas de señalización

en el hipotálamo, que regula la sensación de saciedad. Un

estudio realizado por Gómez et al. (2006) demostró que la

administración de un suplemento de zinc aumenta la concen-

tración de leptina sérica en hombres obesos. Sin embargo,

en este estudio la leptina no se relacionó con la inflamación

crónica y por consiguiente la regulación que pueda tener el

zinc en la secreción de leptina no fue considerada en el mo-

delo.

Otros mecanismos por medio de los cuales el zinc pudiera

afectar la inflamación crónica es por medio de enzimas de-

pendientes de zinc que se involucran en la transcripción de

proteínas inflamatorias. Una de ellas es la glicoproteina-zinc

α2 (ZAG) que es una adipocitocina soluble encontrada en

plasma. Un análisis de la estructura de esta citocina demos-

tró que forma parte del complejo mayor de histoproteínas

(MHC por sus siglas en inglés). A diferencia de las otras pro-

teínas de esta familia, ZAG no es una proteína de membrana

y su función parece ser diferente a las otras proteínas. ZAG

tiene un papel importante en la transcripción de TNF-α y al

parecer reduce la expresión de este marcador de inflama-

ción[24]. Se ha caracterizado a esta citocina como un factor

protector en la obesidad, ya que reduce algunos marcadores

de inflamación y estimula la lipolisis [25]. Se ha comprobado

que la expresión de ZAG es menor en individuos obesos que

en personas con peso normal [26].Sin embargo se requieren

más estudios para poder asegurar que este es uno de los

mecanismos por los que el zinc es un factor de protección en

la inflamación crónica de bajo grado.

Otra de las enzimas en las que el zinc está involucrado es la

α2-macroglobulina, al modificar su conformación y así tener

una mayor influencia sobre la función inmune, principalmente

promoviendo su interacción con citocinas y proteasas [27].

109

Tabla 3 Relación entre micronutrientes y marcadores de inflamaciónTabla 3 Relación entre micronutrientes y marcadores de inflamaciónTabla 3 Relación entre micronutrientes y marcadores de inflamaciónTabla 3 Relación entre micronutrientes y marcadores de inflamaciónTabla 3 Relación entre micronutrientes y marcadores de inflamaciónTabla 3 Relación entre micronutrientes y marcadores de inflamación

Micronutriente

I L-1 (pg/mL) IL-6 (pg/mL) IL-10 (pg/mL) IL-12 (pg/mL) TNF-α (pg/mL)

Zinc (ug/mL)

0.81(0.56-1.18)

0.57 (0.39-0.84)*

0.63 (0.41-0.96)*

0.63 (0.41-0.95)*

0.63 (0.42-0.96)*

Vit. A (ug/dL)

0.97 (0.95-0.99)*

0.98 (0.96-1.00)

0.98 (0.95-1.01)

0.97 (0.94-0.99)*

0.98 (0.95-1.01)

Vit. C (ug/mL)

1.04 (0.92-1.17)

1.01 (0.90-1.13)

1.08 (0.95-1.21)

1.11 ( 0.98-1.25)

1.08 (0.96-1.22)

Vit. E (ug/mL)

1.27 (1.03-1.57)

1.23 (1.00-1.5)

1.07 (0.85-1.41)

1.19 (0.96-1.49)

1.15 (0.92-1.44)

Razón de momios (95% IC), probabilidad de que la concentración de una citocina (categorizadas en 3 niveles no detectable, <mediana, >mediana) sea mayor entre mujeres con una elevada concentración del micronutriente. ajustado CRP y edad, la vitamina E se ajustó por lípidos *p<0.05

Razón de momios (95% IC), probabilidad de que la concentración de una citocina (categorizadas en 3 niveles no detectable, <mediana, >mediana) sea mayor entre mujeres con una elevada concentración del micronutriente. ajustado CRP y edad, la vitamina E se ajustó por lípidos *p<0.05

Razón de momios (95% IC), probabilidad de que la concentración de una citocina (categorizadas en 3 niveles no detectable, <mediana, >mediana) sea mayor entre mujeres con una elevada concentración del micronutriente. ajustado CRP y edad, la vitamina E se ajustó por lípidos *p<0.05

Razón de momios (95% IC), probabilidad de que la concentración de una citocina (categorizadas en 3 niveles no detectable, <mediana, >mediana) sea mayor entre mujeres con una elevada concentración del micronutriente. ajustado CRP y edad, la vitamina E se ajustó por lípidos *p<0.05

Razón de momios (95% IC), probabilidad de que la concentración de una citocina (categorizadas en 3 niveles no detectable, <mediana, >mediana) sea mayor entre mujeres con una elevada concentración del micronutriente. ajustado CRP y edad, la vitamina E se ajustó por lípidos *p<0.05

Razón de momios (95% IC), probabilidad de que la concentración de una citocina (categorizadas en 3 niveles no detectable, <mediana, >mediana) sea mayor entre mujeres con una elevada concentración del micronutriente. ajustado CRP y edad, la vitamina E se ajustó por lípidos *p<0.05

Otro mecanismo independiente de leptina en el que el zinc

puede estar involucrado es por medio de la secreción de

TNF-α IFN-Υ, IL-6 e IL-1 que se promueve por la interacción

directa del zinc con monocitos, y puede ser detectado en lí-

neas de este tipo de células [27].

Hasta el día de hoy no existe una teoría que por sí sola expli-

que la relación entre el zinc y la inflamación sistémica. Que-

da mucho por explorar en esta área y se requieren estudios

de cohorte o de intervención para poder aislar variables con-

fusoras y encontrar el verdadero efecto del zinc así como las

vías en las que actúa en el proceso de inflamación crónica

de bajo grado.

Al Igual que el zinc, en esta población altas concentraciones

de vitamina A están asociadas con un riesgo reducido de te-

ner concentraciones elevadas de marcadores de inflamación.

Esta asociación solo se encontró con las citocinas IL-1 e IL-

12 y no fue tan fuerte como en el caso del zinc, probablemen-

te por el hecho de que no hubo deficiencia de vitamina A en

las mujeres del estudio. Por consiguiente la parte de la regre-

sión ordenada con valores bajos de vitamina A no está consi-

derada en el modelo.

La vitamina A se asocia con la respuesta inflamatoria ya que

se sabe que retinol activa los receptores nucleares RA, que

regula la transcripción de genes que contienen el elemento

responsivo RA, que tiene que ver con genes del sistema in-

mune y secreción de interleucinas [28]. La vitamina A y sus

compuestos retinoicos activos modifican las respuestas inmu-

nes promoviendo la respuesta Th2 y al mismo tiempo inhi-

biendo las respuestas Th1 en roedores y humanos; sin em-

bargo aún no se ha definido un mecanismo específico. Una

de las propuestas es que el ácido retinoico trans se une al

receptor de ácido retinóico alfa (RAR-α), el cual inhibe la pro-

ducción de IFN-Υ por linfocitos T [29].

Se puede concluir que la vitamina A y el zinc pueden estar

actuando por diferentes mecanismos en la inflamación cróni-

ca de bajo grado ya que cada uno actúa en diferentes marca-

dores de inflamación. [24, 27, 29].

En contraste se encontró que concentraciones elevadas de

Vitamina E se asocian con un riesgo elevado de tener mayo-

res concentraciones de citocinas proinflamatorias (IL-6 e IL-

12), y la vitamina C no tuvo ningún efecto. Estos hallazgos

no son consistentes con los que otros autores han encontra-

do de las vitaminas antioxidantes, ya que se ha reportado

que tienen un efecto antiinflamatorio. [30], por ejemplo, re-

portaron que la vitamina C tiene efectos antiinflamatorios en

hombres sin historial de enfermedad cardiovascular o diabe-

tes. Por otro lado, [31] reportaron que la suplementación con

vitamina C está asociada a una reducción del 25% en las

concentraciones de CRP en plasma.

Existieron algunas limitaciones metodológicas en el estudio,

ya que es un estudio trasversal y determinar la causalidad

entre la composición corporal, los niveles de micronutrientes

en sangre y marcadores de inflamación es muy complicado.

Es imposible conocer si los micronutrientes están afectando

los niveles de citocionas o si las citocinas están contribuyen-

do a cambiar los niveles de micronutrientes en sangre.

Este estudio proporciona antecedentes para poder realizar

nuevos estudios en el área, ya sea estudios de cohorte o es-

tudios de intervención, a partir de los cuales se pueda encon-

trar los verdaderos efectos de cada micronutriente en la infla-

mación crónica, y conocer la causalidad sobretodo en micro-

nutrientes como el zinc y las vitaminas A, C y E que están

íntimamente ligadas al metabolismo de personas obesas.

En esta población, no se encontró ninguna relación entre las

vitaminas evaluadas, el zinc y la inflamación con leptina. Un

aumento en el tejido adiposo, ya sea medido como % de gra-

sa abdominal, índice de masa corporal o índice cintura estatu-

ra, aumenta el riesgo de tener una mayor concentración de

IL-6 en sangre. Altas concentraciones de zinc demostraron

ser un factor protector contra la inflamación crónica de bajo

grado disminuyendo la probabilidad de tener altos niveles de

las citocinas inflamatorias IL-6, IL,10, IL-12 y TNF- α. La vita-

mina A demostró ser un factor protector contra la inflamación

crónica disminuyendo la probabilidad de tener altos niveles

de IL-1; sin embargo el efecto pudo verse atenuado por la

falta de deficiencia de vitamina A en la población. Altas con-

centraciones de vitamina E demostraron aumentar el riesgo

de tener altas concentraciones de IL-6 en sangre, sin embar-

go este efecto desaparece al ajustar la vitamina E por la con-

centración de lípidos en sangre.

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112

Estudio piloto sobre el gasto energético en reposo en niños preescolares con sobrepeso y obesidad

14

Trujillo Becerra L, Martínez Peña, MG y Anaya-Loyola MA

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro

lauratrujillo74@yahoo.com.mx

113

Introducción

El niño en edad preescolar tiene características de desarrollo

y crecimiento muy particulares, muestra poco interés a los

alimentos en relación a la etapa previa de desarrollo, física-

mente es muy activo, sus principales intereses están centra-

dos en el juego, y la percepción de la gente que los rodea es

que bajan de peso lo que incluso de acuerdo a diversos auto-

res hasta un cerca del 20% de la consulta pediátrica a esta

edad es por una aparente anorexia, durante años previos las

encuestas en nuestro país mostraban a este grupo de edad

como de riesgo para presentar desnutrición y obesidad, sin

embargo la última encuesta de salud y nutrición del 2006 evi-

denció que ha habido una disminución importante de emacia-

ción y desmedro en este grupo de edad y que por el contra-

rio ha existido incremento en el número de niños a esta

edad con sobrepeso y obesidad. Sin embargo, la obesidad

infantil es un problema de salud mundial y nuestro país no es

la excepción, cifras de la encuesta nacional de salud y nutri-

ción reporta una prevalencia estatal del 5.1% en el 2006 pa-

ra la edad. Los preescolares obesos tienen un alto riesgo de

permanecer obesos toda su vida.

La obesidad es un problema multifactorial que puede estar

ligado principalmente a un desequilibrio energético entre lo

ingerido y lo utilizado y a procesos metabólicos que se rela-

cionan con el uso y almacenamiento de la energía.

Debido a las características de crecimiento somático y desa-

rrollo conductual del preescolar, este grupo de edad tiene ma-

yor riesgo de ser desnutrido que obeso, por lo que la presen-

cia de obesidad en esta edad justifica un mayor estudio de

las causas de ésta.

Es por esto que es de suma importancia evaluar no solo la

dieta del preescolar, sino también su gasto energético, y acti-

vidad física, sus antecedentes heredofamiliares y así poder

entender mejor el complejo fenómeno de la obesidad infantil.

Material y métodos

Tipo de estudio y localización.

Se realizó un estudio descriptivo, transversal, que se llevó a

cabo en las instalaciones de la clínica de nutrición de la facul-

tad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de

Querétaro en el periodo comprendido entre junio de 2011 a

junio de 2012.

Participantes.

En este estudio piloto participaron 30 niños en edad preesco-

lar voluntarios, que cumplieron con los criterios de inclusión,

residentes de la ciudad de Querétaro, por lo que la muestra

fue a conveniencia y la invitación a participar fue abierta y

aleatoria.

Los cuales se dividieron en dos grupos como sigue:

a) niños con índice de masa corporal normal

b) niños con sobrepeso y obesidad

Logística

Se otorgó una primera cita en la clínica de nutrición de la Fa-

cultad de Ciencias Naturales donde se explicó de manera

extensa al responsable del niño el objetivo del estudio y los

procedimientos a realizar en el menor y en caso de estar de

acuerdo se solicitó su firma en la hoja de consentimiento in-

formado. Se entregaron al responsable del menor los forma-

tos para recordatorio de dieta y de actividad física de 24 hrs,

ambos de tres días no consecutivos, y se solicitó se llenaran

en ese momento los del primer día. En dicha cita se solicitó

que el niño acudiera con un ayuno de 12 hrs y se llevaron a

cabo antropometría, calorimetría indirecta en reposo y deter-

minación de la composición corporal mediante absorciome-

tría dual de rayos X (DEXA). En una segunda cita se entrega-

ron resultados de los estudios realizados y se ofreció aseso-

ría de acuerdo a los hallazgos obtenidos. Se solicitaron para

su revisión los formatos llenados en casa que correspondie-

ron al segundo y

tercer día de los recordatorios de dieta y de actividad física

de 24 horas, para así completar el llenado de ambos forma-

tos de tres días no consecutivos.

Recolección de la información.

Datos demográficos: lugar de procedencia, edad, sexo.

114

Datos antropométricos: el peso, la talla las circunferencias de

cintura y cadera se tomaron de acuerdo a los métodos están-

dares en cada uno de los niños participantes previo ayuno de

12 horas. Todas las medidas se realizaron por duplicado y se

determinó el promedio de todas las mediciones. Todas las

mediciones se registraron en el formato correspondiente. Pa-

ra el peso se utilizó la báscula digital marca SECA modelo

onda 834, (SECA corp. Medicall scales and measuring sys-

tems. Hanover, MD., USA), previamente calibrada con peso

conocido certificada por el Centro Nacional de Metrología

(CENAM). La talla se midió con un estadímetro marca SECA

modelo 206 (SECA corp. Medicall scales and measuring

sytems. Hanover, MD., USA). La circunferencia de la cintura

se realizó con una cinta métrica de fibra de vidrio marca con

graduaciones en milímetros SECA (SECA corp. Medicall sca-

les and measuring systems. Hanover, MD., USA). Se determi-

nó el índice de masa corporal para su posterior comparación

con las graficas de crecimiento de la OMS.

Hábitos de alimentación: Se aplicaron tres cuestionarios para

la recolección de los datos dietarios, recordatorio de 24 ho-

ras de tres días no consecutivos. Los datos de alimentación

obtenidos fueron analizados con la base de datos de nutri-

mentos del departamento de agricultura de estados unidos

de norteamérica (USDA) para obtener la ingesta calórica to-

tal y además de macro y micronutrimentos.

Actividad física: Se investigó acerca de la actividad física que

realizaba el participante, mediante un cuestionario de activi-

dad física de 24 hrs de tres días no consecutivos. Y se obtu-

vo un coeficiente de actividad física obtenido por el método

de MET´s (unidad de medida del índice metabólico) el cual

se explica mas adelante en esta sección. Y se clasificó a los

niños de acuerdo al grado de actividad física como ligera

aquellos con un coeficiente < 3, moderada con un coeficiente

de 3 a 6 e intensa a los que tuvieron un coeficiente >6.

Datos clínicos: Se aplicó una historia clínica pediátrica, en la

que se incluyeron antecedentes perinatales y familiares de

importancia.

Composición corporal: Se determinó la composición corporal

de los participantes mediante absorciometría dual de rayos X

(DEXA), con un equipo marca Hologic Explorer, 4500 C/W

QDR, INC 35 Crosby Drive, Bedford, Massachussets, USA).

Gasto energético en reposo: Se determinó el gasto energéti-

co en reposo de los participantes mediante calorimetría indi-

recta, mediante un equipo marca Cardiocoach Plus (Modelo

9001-RMR, Korr, Medical Technologies Inc., Salt Lake City,

UTA, U.S.A). Los participantes se presentaron en ayuno

acompañados de un adulto responsable, sin haber ingerido

cafeína y sin haber realizado ejercicio físico importante un

día antes de la medición. El participante se colocó en posi-

ción sentada y la duración de la medición fue de 10 minutos.

Gato energético total: Se determinó el gasto energético total

mediante el análisis de la actividad física realizada por los

niños en 24 horas en periodos de 15 minutos a partir de los

diarios de actividad física de tres días no consecutivos y el

costo energético para cada actividad fue asignado en una

categoría de una escala del 1 al 9 en Kcal/k/15 min (MET´s)

(Bouchard, et al., 1983). Un MET se define como la cantidad

de energía que consume un individuo por unidad de tiempo

en situación de reposo esto permite medir la intensidad de

las actividades físicas en MET´s, es decir el número de ve-

ces que se incrementa el metabolismo basal.

Valores de referencia:

Para la clasificación del IMC de los participantes, se utiliza-

ron los estándares de referencia emitidos por la OMS en el

2006 de acuerdo a edad y sexo y se clasificarán como sigue:

Peso Normal: IMC entre la +1 y -1 DE

Sobrepeso: IMC entre la +1 y +2 DE

Obesidad: IMC mayor a la + 2 DE

Análisis estadístico

Se realizó análisis descriptivo de las variables que incluyó

media y desviación estándar, para conocer las característi-

cas de la población a estudiar. Para el análisis de la correla-

ción entre variables continuas se usó la prueba de Pearson,

y posteriormente regresión lineal, para el análisis de la corre-

lación de las variables categóricas se utilizó la prueba de chi

cuadrada. Para el análisis de la comparación entre grupos se

utilizó un análisis de varianza ANOVA y para el análisis de

115

variables categóricas con continuas se utilizó un análisis de

covarianza.

Resultados y discusión

Características generales y antropométricas

La edad global de la población fue de 5.2 años, el resto de

las características antropométricas se muestran en la tabla 1.

Diagnóstico de obesidad de acuerdo al IMC

El 37% de nuestra población estudiada tuvo diagnóstico de

sobrepeso y obesidad de acuerdo a su IMC y el 63% con pe-

so normal (gráfica 1), en contraste con la prevalencia reporta-

da por la encuesta nacional de salud del 2012 para la edad

a nivel nacional que es del 9.9% y de acuerdo a la SESEQ

el 17% de los menores de 5 años atendidos en el seguro po-

pular presentan sobrepeso.

Composición corporal

Se observaron diferencias significativas por sexo en las varia-

bles de densidad mineral ósea siendo mayor en niños que en

niñas, así como en la masa libre de grasa que fue mayor en

niños, y hubo un mayor porcentaje de grasa corporal total en

niñas, el resto de las variables analizadas por DEXA no pre-

sentaron diferencias significativas por sexo (tabla 2).

Tabla 1. Características generales y antropométricas de la

población estudiada.

*SDG: Semanas de edad gestacional

Gráfica 1. Prevalencia se sobrepeso y obesidad en la pobla-

ción de estudio

Tabla 2. Resultados del análisis de composición corporal

por DEXA.

Global Niñas Niños Valor P

Media DE Media DE Media DE

CMO* ( gr) 599.57 ±73.20 566.62 ±34.9 613.69 ±81.15 0.10

DMO** gr/cm2

0.58 ±0.05 0.54 ±0.01 0.59 ±0.05 0.02

DMO Z -1.45 ±0.98 -1.87 ±0.66 -1.26 ±1.05 0.11

Grasa total (g)

6227.43 ±2012.95 6390.26 ±1651.53 6157.65 ±2183.41 0.77

MLG*total (g)

12874.04 ±2014.80 11230.2 ±1308.84 13578.55 ±1861.13 0.001

% de Grasa Total

31.23 ±5.94 34.82 ±5.48 29.69 ±5.56 0.02

CMO abdominal (g)

9.38 ±1.78 9.36 ±1.23 9.38 ±1.99 0.970

Grasa abdominal (g)

306.84 ±166.22 318.2 ±114.14 301.97 ±186.46 0.817

MLG abdominal (g)

762.86 ±118.42 706.58 ±71.78 786.98 ±127.43 0.082

% Grasa abdominal

27.17 ±7.90 30.23 ±6.56 25.86 ±8.20 0.163

*CMO = Contenido Mineral Óseo

**DMO = Densidad Mineral Ósea

***MLG = Masa libre de grasa

Diagnóstico de obesidad de acuerdo al % de grasa corporal

La media del porcentaje de grasa corporal total global y por

sexo se encontró por arriba de lo referido en la literatura, in-

dependientemente del IMC clasificándose hasta el momento

todos los sujetos estudiados como sobrepeso u obesidad (

gráfica 2). Por lo que el porcentaje de grasa corporal total

(GCT) de nuestra población fue elevado tanto para los niños

con IMC normal como para los niños con sobrepeso y obesi-

dad y todos, de acuerdo a los puntos de corte establecidos

para sobrepeso y obesidad por % de GCT.

116

GlobalGlobalGlobal NiñasNiñasNiñas NiñosNiñosNiños

Media ± DE Media ±DE Media ±DE Valor de P

Edad, meses 62.79± 8.96 61.43 ±7.92 63.37 ±9.50 0.59Peso, kg 19.96± 3.29 18.47 ±2.18 20.6 ±3.52 0.10Estatura, cm 109.58± 5.48 107.73 ±3.42 110.38 ±6.05 0.23IMC 16.58± 2.27 15.88 ±1.30 16.88 ±2.55 0.27Cintura, cm 55.05± 6.16 54.15 ±4.37 55.43 ±6.85 0.61Cadera, cm 60.42± 5.06 58.30 ±3.62 61.33 ±5.39 0.13ICC 0.91± 0.04 0.92 ±0.03 0.90 ±0.04 0.10Z-P/E 0.35± 1.23 -0.09 ±0.85 0.55 ±1.33 0.19Z-T/E -0.28± 0.80 -0.44 ±0.81 -0.21 ±0.81 0.49Z-IMC 0.82± 1.43 0.36 ±0.80 2.59 ±1.61 0.25Peso nacimiento, kg

3097.32± 351.94

3022.22 ±375.923132.89 ±344.71 0.44

Talla nacimiento, cm

50.72± 1.67 50.62 ±1.84 50.76 ±1.64 0.85

SDG* 38.10± 1.13 37.77 ±0.97 38.26 ±1.19 0.29Lactancia materna, meses

5.37± 2.77 5 ±2.64 5.55 ±2.87 0.62

Fórmula, meses

10.03± 7.23 10.66 ±6.12 9.75 ±7.81 0.75

Ablactación, meses

5.41± 1.70 5.77 ±2.53 5.25 ±1.20 0.44

Lo anterior nos hace cuestionar la verdadera utilidad en la

actividad clínica del IMC para establecer el diagnóstico de

obesidad, sin embargo hay que considerar que estos puntos

de corte se han establecido a nivel internacional con poblacio-

nes distintas a la nuestra, lo que nos lleva a cuestionar si son

o no validos para nuestros niños ya que como se ha visto en

población adulta la composición corporal de los latinos difiere

en relación a población europea o anglosajona, y esto esta

dado por diferencias genéticas, que bien puede ser también

valido para nuestros niños, sin embargo no contamos hasta

el momento con puntos de corte para población infantil latina.

(Taylor, et al., 2002; McCarthy, et al., 2006).

Gráfica 2. Prevalencia de sobrepeso y obesidad de acuerdo

al porcentaje de grasa corporal total determinado por DEXA

Gasto energético en reposo

El gasto energético en reposo (GER) calculado mediante la

fórmula emitida por la OMS/FAO para sexo y edad y el medi-

do mediante la calorimetría indirecta no mostró diferencias

significativas. El GER fue mayor en los niños que en las ni-

ñas y esto seguramente se encuentra en relación con la ma-

yor cantidad de masa libre de grasa que tienen los niños, sus-

tentado por el análisis de composición corporal (tabla 2). Los

cocientes respiratorios medidos indicaron una mayor utiliza-

ción de hidratos de carbono (mayor a 80%) que de grasas

como sustrato energético, lo cual puede estar relacionado

con un buen almacenamiento de glucógeno en estos prees-

colares, sin embargo no hay antecedentes en la literatura

que sustenten esta afirmación y si existen diversos estudios

que indican que esta variación del uso de sustratos entre indi-

viduos no puede únicamente ser explicada por característi-

cas morfológicas como sexo y edad, sino que pueden existir

variaciones fisiológicas y metabólicas dentro de rangos consi-

derados como normales por ejemplo en los niveles circulan-

tes de leptina y tiroxina que modifican la utilización de sustra-

tos y que determinan la menor utilización de lípidos en estos

pacientes, razón por la que existe mayor acumulación de ma-

sa grasa sustentado por el análisis de composición corporal

(Johnston, et al., 2005).

Tabla 3. Resultados de la calorimetría indirecta en reposo.

Global

Niñas Niños

Media DE Media DE Media DE Valor de P

GER estimado(kcal/d)* 942.13 ±92.02 867.93 ±60.03 973.93 ±85.43 0.001

GER medido (Kcal/d) 900.13 ±152.03 815.22 ±152.67 936.52 ±139.84 0.04

Diferencia GER medido calculado

43.01 ±170.77 44.76 ±128.82 42.26 ±188.80 0.97

VO2 ayuno (ml/min)** 126.43 ±29.60 111.99 ±35.26 132.62 ±25.28 0.08

VO2 ayuno (ml/kg/min)*** 6.34 ±1.83 6.79 ±1.64 6.14 ±1.91 0.38

VCO2 (ml/min) 131.35 ±24.34 119.38 ±23.46 136.67 ±23.39 0.10

Cociente respiratorio 0.98 ±0.10 0.98 ±0.06 0.97 ±0.11 0.82

Hidratos de Carbono (%) 83.46 ±18.58 89.04 ±16.42 80.98 ±19.37 0.32

Lípidos (%) 16.54 ±18.58 10.96 ±16.42 19.02 ±19.37 0.32

Hidratos de carbono (g) 219.39 ±93.43 201.50 ±64.33 227.33 ±104.48 0.53

Lípidos (g) 17.80 ±20.12 10.88 ±17.30 20.88 ±20.96 0.25

*GER calculado: Mediante la fórmula emitida por la OMS/FAO para edad y sexo

**VO2 ml/min: Volumen de oxígeno inspirado por mililitro por minuto

***VCO2 ml/min: Volumen de dióxido de carbono espirado

por mililitro por minuto

Actividad física

En cuanto a actividad física el promedio del coeficiente calcu-

lado por medio del sistema de MET’s fue de 2.43 con una

desviación estándar de ± 0.48 lo cual los ubica en el rango

de actividad física ligera. Al analizar los resultados por sexo

no se encontró diferencia en cuanto al nivel de actividad físi-

ca (niños 2.5 ± 0.5 vs niñas 2.4 ±0.4; P = 0.6022). El 90% de

los niños evaluados se clasificaron con una actividad física

ligera y solo el 10% con actividad física moderada, ningún

niño se encontró en actividad física intensa (gráfica 3).

117

Gráfica 3. Distribución de niños de acuerdo a su nivel de acti-

vidad física.

Más del 75% del día (18.4 horas), los preescolares evalua-

dos realizan actividades con gasto energético menor a 3

MET’s (dormir, estar sentado, comer, etc), independientemen-

te si son niños o niñas y solo un 20% (5 horas aproximada-

mente) del día lo ocupan en actividades con gastos de 3 a 6

MET’s (correr, juegos recreativos, brincar, etc), y aproximada-

mente el 5% del tiempo (media hora) lo dedican a activida-

des con gastos energéticos mayores a 6 MET´s (entrena-

miento deportivo, y juegos de competencia). La energía pro-

medio gastada por actividades de menos de 3 MET´s es de

aproximadamente 5 kilocalorías, mientras que en las activida-

des que requieren un gasto entre 3 y 6 MET´s se invierten

alrededor de 400 kilocalorías y en aquellas con gastos mayo-

res a 6 MET´s los preescolares utilizan menos de 100 kiloca-

lorías.

como acudir al parque y juegos de competencia ocuparon

mayor tiempo (Trost, et al., 2003), y concluyen que esto incre-

menta el riesgo de acumular mayor adiposidad, lo que con-

cuerda completamente con nuestros resultados, y al igual

que nuestros resultados no existen diferencias por sexo.

Dieta

No se encontraron diferencias significativas por sexo en la

mayoría de consumos de nutrimentos evaluados a partir de

los recordatorios de 24 horas (tabla 4). Sin embargo, el con-

sumo energético dietario fue aproximadamente 500 Kcal ma-

yor y estadísticamente significativo con relación al requeri-

miento energético recomendado por la FAO/OMS (P <

0.0001). Lo cual representa un excedente mayor al 30% del

requerimiento energético. El consumo tanto de lípidos como

de proteínas se encontró excedido de acuerdo a las recomen-

daciones para la edad (gráfica 4). Así como también se en-

contró que el consumo de azúcares simples representó el

41% de la ingesta total de hidratos de carbono cuando la re-

comendación máxima para la edad se encuentra en un máxi-

mo del 15% del total (gráfica 5). El 22% de las niñas y el

35% de los niños tuvieron consumos de hidratos de carbono

por debajo al 40% de su ingesta calórica total, mientras que

el 55% de las niñas y el 70% de los niños consumieron un

porcentaje mayor al 15% de proteínas y el 55% de las niñas

y 75% de los niños tuvieron consumos de lípidos mayores al

30% de la ingesta calórica total diaria.

Gasto energético total calculado por actividad física

El consumo de energía en la dieta fue prácticamente del do-

ble que el gasto energético total calculado por cuestionario

de actividad física (1968 kcal/d vs 945 kcal/d), no encontrán-

dose diferencia por sexos (P=0.3508). Lo cual puede estar

contribuyendo al exceso de grasa encontrado en la composi-

ción corporal de los niños y la presencia de obesidad como

tal (gráfica 6).

Gráfica 4. Porcentaje de adecuación de consumo de

macronutrimentos.

118

Gráfica 5. Consumo porcentual del tipo de hidratos de carbo-

no de acuerdo a las tablas de composición de alimentos de

USDA

Tabla 4. Consumo global de alimentos y por sexo

Global Niñas Niños

Media DE Media DE Media DE Valor de P

Requerimiento energético (Kcal/d)

1486.08 ±255.17 1503.81 ±155.99 1478.49 ±290.65 0.80

Consumo de Energía, (Kcal/d)

1968.60 ±453.87 1940.75 ±435.46 1981.12 ±472.44 0.83

Diferencia consumo-requerimiento (Kcal/d)

476.69±

376.28 436.94±

448.80 494.48±

350.38 0.71

Diferencia consumo-requerimiento (%)

32.70±

25.2 29.80±

28.25 34.00±

24.37 0.68

Agua (ml) 1455.09 ±502.55 1596.14 ±637.59 1391.61 ±432.84 0.32

Proteínas (g) 82.36 ±25.01 73.06 ±19.29 86.54 ±26.56 0.18

Lípidos (g) 78.84 ±21.46 77.27 ±12.75 79.54 ±24.67 0.80

Cenizas 16.50 ±4.71 15.50 ±4.29 16.95 ±4.93 0.45

CHOS (g) 241.70 ±76.76 250.62 ±89.45 237.69 ±72.52 0.68

Fibra (g) 20.38 ±12.18 26.86 ±15.08 17.47 ±9.69 0.05

Azúcar (g) 98.94 ±38.27 104.32 ±24.84 96.53 ±43.35 0.62

Calcio (mg) 1316.66 ±532.73 1066.19 ±179.64 1429.37 ±601.29 0.09

Hierro (mg) 13.75 ±5.54 13.58 ±6.64 13.83 ±5.17 0.91

Zinc (mg) 12.50 ±3.86 12.42 ±4.23 12.53 ±3.79 0.94

Gráfica 6. Diferencia de energía del consumo dietario y la

actividad física.

GER

Los factores relacionados con el gasto energético en reposo

se muestran en la tabla 5, tanto el peso como la talla y la

masa libre de grasa se relacionan de manera importante con

el GER. Sin embargo el IMC y el coeficiente de actividad físi-

ca no presentaron una asociación con el GER.

GET

Los factores relacionados con el gasto energético total, fue-

ron factores antropométricos y de composición corporal, ade-

más del coeficiente de actividad física, el cual no se encontró

asociado en el GER (tabla 5).

119

Tabla 5. Resultados obtenidos en la prueba de correlación

de Pearson del GER vs diversas variables

*ICC: Indice cintura cadera, **MLG: Masa libre de grasa,

***BMC: Contenido mineral ósea. ****DMO: Densidad mine-

ral ósea

Tabla 6. Resultados de la prueba de correlación de Pearson

del GET

*DMO: Densidad mineral ósea

**MLG: Masa libre de grasa

***CMB: Contenido mineral óseo

IMC vs GER

Continuando con el estudio del GER y su relación con el diag-

nóstico de IMC, aunque se encontró una tendencia en los

niños con obesidad y sobrepeso a ser tener un GER mayor,

la diferencia no fue significativa (P =0.16) (gráfica 7).

Grafica 7. Gasto energético en reposo vs diagnóstico de

IMC.

IMC vs composición corporal

El porcentaje de grasa corporal fue significativamente mayor

en los preescolares que presentaron sobrepeso y obesidad

aproximadamente en un 5% (P =0.0148), al realizar el estu-

dio de acuerdo al sexo las niñas con peso normal y sobrepe-

so no tuvieron porcentajes de grasa diferentes, sin embargo

en los hombres si se observa esta diferencia (P=0.0036) (grá-

fica 8).

Gráfica 8. Porcentaje de grasa corporal total vs categoría de

IMC

120

Correlación Valor - Z Valor – P

Edad (años) 0.22 1.19 0.23Peso (kg) 0.54 3.19 0.001Estatura (cm) 0.53 3.09 0.002 IMC 0.28 1.52 0.12Cintura (cm) 0.38 2.10 0.03Cadera (cm) 0.44 2.45 0.01 ICC* 0.10 0.56 0.57 Grasa total (g) 0.27 1.48 0.13 MLG total **(g) 0.64 4.01 <.0001 MLG/BMC*** 0.64 3.98 <.0001 Masa Total (g) 0.56 3.28 0.001 % Grasa Total -0.07 -0.41 0.68 MLG abdominal 0.54 3.17 0.0015 MLG/DMO**** abdominal(g/cm2)

0.54 3.18 0.0014

MasaTotal abdominal 0.40 2.23 0.02 %Grasa abdominal 0.01 0.06 0.94 GER/Peso 0.53 3.12 0.0018

GER/MLG 0.24 1.29 0.0019 Coef.Act.Fisica 0.61 0.31 0.75

Correlación Valor - P

Peso (kg) 0.570 0.001

Estatura (cm) 0.481 0.007

Cadera (cm) 0.423 0.021

DMO(g/cm2)* 0.414 0.024

MLG total (g)** 0.599 0.0004

MLG + CMB (g)*** 0.603 0.0004

Coef.Act.Fis. 0.715 <0.0001

En cuanto a la masa libre de grasa por categoría de IMC, si

se encontró diferencia significativa entre los preescolares

con IMC normal y aquellos con sobrepeso u obesidad, sien-

do esta diferencia de aproximadamente 1.5 kg (P = 0.02),

gráfica 9.

Gráfica 9. Masa libre de grasa por categoría de IMC

IMC vs actividad física

También se observó un coeficiente de actividad física mayor

en los niños con IMC normal con respecto a aquellos con so-

brepeso u obesidad pero esta diferencia tampoco fue signifi-

cativa como se observa en la gráfica 11. Del 100% de los ni-

ñas con peso normal el 85.7% tuvo actividad ligera y solo un

14.3% actividad moderada mientras que el 100% de las ni-

ñas con sobrepeso y obesidad realizaron actividad ligera.

Por otro lado en los niños con IMC normal el 90.9% realizó

actividad ligera y el 9.1% actividad moderada. El 88.9% de

los niños con sobrepeso u obesidad realizaron actividades

ligeras y solo un 11.1% actividades moderadas (gráfica10).

Sin embargo un estudio realizado en niños en edad preesco-

lar demostró que aquellos niños con una actividad física in-

tensa de por lo menos 60 minutos diarios se relaciona con

una mejor composición corporal en relación con aquellos ni-

ños que no cumplen con esta recomendación con un valor

de p < 0.05, (Gabel, 2011), y en nuestra población de estudio

ningún paciente demostró tener una actividad física intensa,

por lo tanto no existieron diferencias significativas.

Gráfica 10. Coeficiente de actividad física por diagnóstico de

IMC.

Gráfica 11. Relación del diagnóstico de IMC vs consumo

energético

IMC vs dieta

En el análisis por grupos de acuerdo al diagnóstico de IMC y

su relación con el consumo energético, de igual forma aun-

que hubo tendencia a haber mayor consumo de energía en

los niños con sobrepeso y obesidad, no se obtuvo diferencia

significativa (valor de P 0.36) (gráfica 11). Y la diferencia en-

tre los consumos de niños con peso normal y aquellos con

sobrepeso y obesidad fue 161 kcal/d. De igual forma en el

análisis de consumo de lípidos, carbohidratos y azúcar y su

relación con el diagnóstico de IMC, no se encontraron diferen-

121

cias significativas entre categorías, esto sustenta el hallazgo

de un porcentaje de grasa corporal total mayor en todos los

niños estudiados sin importar el IMC y su alto consumo de

energía.

Conclusiones

Con los resultados obtenidos podemos concluir los siguien-

tes puntos:

Que el gasto energético en reposo en niños preescolares

con sobrepeso y obesidad no es menor en relación a niños

con IMC normal, por lo tanto, este no contribuye a la presen-

cia de obesidad.

El IMC no es un buen indicador para diagnosticar obesidad

en niños

La baja actividad física en relación al consumo energético

son los factores causantes de sobrepeso y obesidad en los

preescolares.

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123

Evaluación de la tolerabilidad de la ε-polilisina, como posible fármaco para el tratamiento de la obesidad

15

L. Olvera Ochoa, J. L. Rosado, M. Vallejo Soto.

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro

olochlo@yahoo.com.mx

124

Resumen

La obesidad es una enfermedad que tiene una incidencia

muy elevada en el mundo. Generalmente se trata con dieta y

ejercicio, pero en ocasiones es necesaria una intervención

farmacológica, desafortunadamente los medicamentos dispo-

nibles logran solo del 5 al 10 % de eficacia en menos del 50

% de los pacientes. Por ello es necesaria la búsqueda de

nuevas terapias. La ε-polilisina (e-PL) es una molécula catió-

nica inhibidora de la lipasa pancreática mediante la desestabi-

lización de las sales biliares y la grasa que son su sustrato.

En este estudio se midió la tolerabilidad de la ε-polilisina al

administrarse en humanos. La muestra fue de 20 sujetos sa-

nos no obesos, las dosis de e-PL estudiadas fueron 45, 150,

300, 450 mg/dosis ó placebo administradas tres veces al día

después de los alimentos por un periodo de 12 semanas.

Las dosis fueron determinadas basadas en los estudios pre-

clínicos realizados anteriormente. A los sujetos se les realiza-

ron pruebas de transaminasas hepáticas, creatinina, albúmi-

na, perfil de lípidos, glucosa, biometría hemática y análisis de

orina. Los eventos adversos presentados fueron de naturale-

za gastrointestinal y mediante un análisis de supervivencia

de Kaplan Meier se demostró que no existe relación estadísti-

ca en la aparición de los eventos adversos con respecto al

tiempo entre los tratamientos comparados con el placebo.

Además, los resultados del perfil de bioseguridad tampoco

cambiaron, por ello se concluye que la e-PL es una molécula

inocua y tolerable a dosis farmacológicas en humanos.

Palabras clave: obesidad, ε-polilisina, tolerabilidad

Introducción

La obesidad es una enfermedad metabólica que afecta a la

población mundial, específicamente en México el 70 % de la

población mayor de 20 años tiene sobrepeso u obesidad (En-

cuesta Nacional de Salud y Nutrición, ENSANUT 2006). El

exceso de tejido adiposo abdominal tiene consecuencias ne-

gativas en la salud, tales como diabetes mellitus tipo 2, dislipi-

demias, enfermedades cardiovasculares (I, II), disminución

de la capacidad pulmonar (III, IV), enfermedades gastrointes-

tinales y cáncer de colon.

En el tratamiento de la obesidad la pérdida de peso corporal

entre el 5 y 10 % se asocia con una disminución sustancial

del tejido adiposo abdominal ocasionando una mejora en los

marcadores metabólicos de riesgo (I). La reducción de la in-

gestión de energía y el aumento de la actividad física, son la

forma más efectiva para reducir la grasa corporal y controlar

el peso (V, VI).

Sin embargo en ocasiones estas terapias no son suficientes

y es necesario recurrir a los tratamientos farmacológicos. En

1995, la Asociación Norteamericana para el estudio de la obe-

sidad (NAASO) estableció que la terapia farmacológica pue-

de considerarse parte del tratamiento junto con la dieta hipo-

calórica y el ejercicio físico en individuos obesos con un IMC

≥ 30 kg/m2 o en aquellos con un IMC ≥ 27 kg/m2 que padez-

can factores importantes de morbilidad como diabetes, hiper-

tensión, dislipidemia, etc (VI).

Actualmente solo existen dos fármacos aprobados para la

pérdida de peso por la FDA, la Sibutramina que es un anore-

xigénico y el Orlistat que actúa a nivel de absorción de las

grasas (I, VI). El mecanismo de acción de este último deriva

menos eventos adversos (principalmente son de naturaleza

gastrointestinal) en comparación con la Sibutramina. En la

nutrición, las dietas con un alto contenido de lípidos promue-

ven el almacenamiento de la grasa corporal debido a que

contienen más energía que los carbohidratos; por lo tanto

dietas altas en grasa pueden incrementar el peso corporal y

los adipocitos en humanos y animales. Así, la disminución de

la digestión y absorción de la grasa de la dieta es un factor

potencial para tratar la obesidad. Algunos sujetos obesos tie-

nen una ingestión alta de energía en forma de grasa. Los tri-

glicéridos, la forma más común de la grasa de la dieta se di-

gieren en el ser humano principalmente por tres enzimas: la

lipasa lingual, la carboxilester lipasa y la lipasa pancreática;

ésta última actúa a nivel intestinal donde se lleva a cabo la

absorción de las grasas al organismo. La lipasa pancreática

es una proteína soluble que tiene especificidad sobre sustra-

tos insolubles emulsificados gracias a la presencia de bilis,

esta especificidad se presenta solamente en la interfase acei-

te/agua. Existen diversas biomoléculas que inhiben la activi-

dad de la lipasa pancreática y consecuentemente suprimen

la absorción de grasa en el intestino; al respecto se han estu-

diado proteínas tales como ß-lactoglobulina, ovoalbúmina,

mioglobina, protamina y ε-Polilisina (e-PL), esta última es un

homopolímero catiónico de la L-lisina (aminoácido esencial).

Su mecanismo de acción no es a través de una inhibición

competitiva, como el caso del Orlistat, ya que no inhibe pro-

piamente a la enzima, sino que interrumpe la formación de la

125

emulsión de las sales biliares con la grasa de la dieta rom-

piendo esta emulsión por desestabilización de cargas (VII,

VIII, IX, X). En Estados Unidos de América, la e-PL ha sido

aprobada como aditivo en los alimentos por la FDA (Food

and Drug Administration) y cuenta con el título GRAS # 135

(sustancia generalmente reconocida como segura) por ser

una molécula inocua. La e-PL ha sido sujeta a diversos expe-

rimentos toxicológicos agudos, crónicos y subcrónicos en ra-

tas en los que no produjo algún efecto adverso significativo

(XI, XII) además no causa daños inmunológicos, mutagéni-

cos ni embriogénicos (XIII). La farmacodinamia, farmacociné-

tica y los estudios de metabolismo han mostrado que la e-PL

y sus metabolitos formados en el tracto gastrointestinal se

absorben solo en un 6 % en la circulación sistémica (XII) y

éstos no se almacenan en ningún tejido u órgano (XIV).

En estudios anteriores hemos demostrado al igual que otros

autores (XV), la eficacia de la e-PL como agente antiobesi-

dad en experimentos en ratas Sprague-Dawley, se comprobó

que la e-PL suprime la absorción de grasa de la dieta en el

intestino delgado por inhibición de la actividad de la lipasa

pancreática. Además disminuye los triglicéridos y el coleste-

rol total en plasma en un periodo de 6-9 semanas, disminu-

yendo también el tejido adiposo hepático, retroperitoneal y

epididimal; así como eliminando la grasa de la dieta en las

heces fecales.

Materiales y métodos

Diseño del estudio

Este estudio clínico fue aprobado en México por el comité de

ética de la Facultad de Nutrición de la Universidad Autónoma

de Querétaro, fue ciego simple, aleatorizado, placebo contro-

lado con 20 sujetos sanos (16 mujeres y 4 hombres) con un

rango de edad entre 18-40 años, posterior a la lectura y fir-

ma de la carta de consentimiento informado se evaluaron

con una exploración física y tomas de muestra de orina y san-

gre para realizar los análisis de general de orina, biometría

hemática completa y bioquímica clínica. Estos análisis se rea-

lizaron con el fin de corroborar el criterio de inclusión de ser

sujetos sanos; a las mujeres se les determinó hormona gona-

dotropina coriónica (HGC) en orina puesto que las mujeres

embarazadas fue un criterio de exclusión al igual que la in-

gestión de alcohol, fumar, cualquier tipo de enfermedad y la

toma de medicamentos 6 meses antes, al inicio y durante el

estudio. Los sujetos seleccionados se distribuyeron al azar

en alguno de los siguientes tratamientos: placebo (maltodex-

trina), e-PL de 45, 150, 300 ó 450 mg, estas dosis se toma-

ron 3 veces al día después de cada comida; por un periodo

de 12 semanas. Al final de este periodo, a los participantes

se les realizo nuevamente una toma de muestra sanguínea y

de orina para realizar los análisis anteriormente menciona-

dos y de esta manera tener los resultados básales y finales

del periodo de tratamiento. Los voluntarios consumieron su

dieta habitual. A lo largo de todo el estudio los participantes

fueron monitoreados por un médico gastroenterólogo, un nu-

triólogo y un médico general quienes registraron, evaluaron y

atendieron los eventos adversos que se presentara durante

el estudio.

Muestras sanguíneas

Las muestras sanguíneas fueron colectadas en tubos con

EDTA o gel inerte Vacutainer® y centrifugadas a 3500 g por

15 min a 4 °C (centrifuga refrigerada marca Eppendor) para

obtener el plasma o suero correspondiente.

Análisis bioquímicos

Se utilizaron Kits (Sera Pack Plus, marca Bayer) para deter-

minar en suero la concentración de triglicéridos, colesterol

total, HDL-c, LDL-c, AST, ALT, creatinina y albúmina, fueron

analizadas en un equipo RA-50 marca Bayer. La biometría

hemática se determinó en un Analizador químico Cell-Dyn

1400. El análisis general de orina se llevo a cabo mediante

tiras reactivas Multistix 108G (marca Bayer) y la detección de

la hormona gonadotropina coriónica (HGC) se realizó utilizan-

do tiras BIO-PREG (marca Mexlab).

Análisis Estadístico

Para determinar la proporción de eventos adversos en cada

uno de los tratamientos se consideró como un 100 % el total

de eventos presentados por tratamiento en las 12 semanas y

así poder conocer que evento adverso se presentó en mayor

proporción en cada uno de los tratamientos.

Se determinó la correlación entre el tiempo y la aparición de

eventos adversos (estos últimos clasificados por trastorno)

de los tratamientos comparados con el placebo se realizo

una ANOVA (Prueba de Tuckey HSD con una P< 0.05).

126

En el análisis del método de Kaplan-Meier se utilizó un pa-

quete estadístico SPSS versión 9 y se determinó si existía

relación entre el tiempo del tratamiento de estudio y la ocu-

rrencia de eventos adversos. El método de Kaplan Meier es

un análisis de supervivencia que nos permitió conocer la tole-

rabilidad de los participantes al tomar e-PL a dosis farmacoló-

gicas.

Por último, para determinar si hubo cambios significativos en

las variables del perfil de bioseguridad al inicio y al final del

estudio también se utilizó un análisis de ANOVA (Prueba de

Tuckey HSD con una P< 0.05).

Resultados

En la Tabla 1 se muestra la proporción de eventos adversos

presentados por los sujetos en cada uno de los tratamientos

durante las 12 semanas de evaluación, se diagnosticaron 23

tipos diferentes de eventos entre los que se encontraron dolo-

res de cabeza, boca reseca, etc; los principales eventos pre-

sentados fueron de naturaleza gastrointestinal incluso en el

grupo placebo, siendo inflamación estomacal el evento adver-

so más común; heces blandas se presentó en 22 y 28 % pa-

ra las dosis de e-PL de 150 y 300 mg, respectivamente y nau-

seas 24 % para la dosis más alta (450 mg e-PL); las heces

blandas fue el evento más esperado debido a la naturaleza

de acción de la e-PL, además la ingestión de grasa entre los

sujetos de estudio no tuvo diferencias estadísticamente signi-

ficativas ya que se encontraron en porcentajes promedio de

31.49 ± 8, 31.69 ± 7, 34.5 ± 3, 31.63 ± 4 y 29.13 ± 7 para las

dosis de 0, 45, 150, 300 y 450 mg de e-PL, respectivamente.

Tabla 1. Proporción (%) de eventos adversos presentados

por los sujetos cada uno de los tratamientos durante las 12

semanas de evaluación.

Estre-estreñimiento, Naus-nausea, Dolor E.-dolor estomacal, Dia-diarrea, PdA-perdida del apetito, SdH-sensación de hambre, HB-heces blandas, IED-inflamación estomacal/dolor, DdC-dolor de cabeza, SdA-sensación de atragantamiento, Agru-agruras, SRGC- Sensación de retorcijones o gorgoritos/ Cólicos, Gas-gases, SSP-sensación de pesadez, Temp-tempe-ratura, DdCu-dolor de cuerpo, MCE-mayor cantidad de evacuaciones, Mar-mareos, AG-ardor de garganta, UIB- urgencia de ir al Baño, Erup-e-ructos, BR- boca reseca, Vóm-vómitos

Debido a la cantidad de eventos presentados se realizó una

clasificación de éstos para posteriormente comparar las dife-

rentes dosis de e-PL con el placebo mediante una ANOVA

(Prueba de Tuckey), de acuerdo a los resultados se observa

que no hubo diferencias estadísticamente significativas en la

presencia de trastornos de las diferentes dosis de e-PL al

compararlas con el placebo (Tabla 2).

127

% de eventos adversos con los diferentes tratamientos

% de eventos adversos con los diferentes tratamientos

% de eventos adversos con los diferentes tratamientos

% de eventos adversos con los diferentes tratamientos

% de eventos adversos con los diferentes tratamientos

Placebo 45 mg

e-PL

150 mg

e-PL

300 mg

e-PL

450 mg

e-PLEstre 0 5 22 0 12Naus 0 10 0 10 24Dolor E. 0 10 0 0 0Dia 0 5 0 10 0PdA 0 10 0 7 0SdH 9 0 0 7 0HB 14 0 22 28 12IED 5 20 22 7 12DdC 18 10 0 0 6SdA 9 0 0 0 0Agru 5 10 0 0 0SRGC 9 0 0 0 18Gas 0 0 22 7 12SSP 0 5 11 7 0Temp 0 0 0 3 0DdCu 0 0 0 3 0MCE 14 10 0 3 0Mar 9 0 0 0 0AG 0 0 0 3 0UIB 5 0 0 0 0Erup 5 0 0 0 0BR 0 0 0 3 0Vom 0 5 0 0 6

Tabla 2. Promedio de eventos de acuerdo con el tipo de tras-

torno, presentados por los sujetos en cada tratamiento.

0 Placebo: maltodextrina1 Trastornos gastrointestinales: náuseas, vómitos, dolor ab-dominal, perdida del apetito, sensación del hambre, inflama-ción abdominal, cólicos, gases, sensación de saciedad o pe-sadez estomacal, eructos.2 Trastornos de evacuaciones: heces blandas, diarrea, ur-gencia para evacuar, mayor cantidad de evacuaciones a lo normal, estreñimiento.3 Trastorno de tracto digestivo superior: boca seca, sensa-ción de atragantamiento, agruras, ardor de la garganta.4 Síntomas generales: cefalea, hipertermia, dolor de cuerpo, mareos.

No hubo diferencias estadísticamente significativas (P<0.05)

al comparar las diferentes dosis de e-PL con el placebo.

En cada una de las pruebas estadísticas realizadas de Log

Rank, Breslow y Tarone-Ware, los resultados obtenidos del

análisis de supervivencia de Kaplan Meier demostraron que

no existe diferencia significativa en la aparición de eventos

adversos con respecto al tiempo y a cada tratamiento; en la

Tabla 3 se muestran las significancias derivadas de estos

análisis y ninguna es menor de 0.05. Por lo tanto al no tener

relación alguna la aparición de estos eventos a lo largo del

tiempo con respecto a cada tratamiento se puede intuir que

la e-PL es tolerable a las dosis de 45, 150, 300 y 450 mg.

Tabla 3. Análisis de supervivencia (presencia de eventos

adversos) de Kaplan Meier con respecto al tiempo para cada

uno de los tratamientos.

En la tabla se presentan las significancias estadísticas para las pruebas de Long RanK, Breslow y Tarone-Ware propias del método de Kaplan Meier donde se analiza la presencia de eventos adversos con respecto al tiempo para cada tratamiento, al ser P>0.05 se comprueba que no existe diferencia estadísticamente significativa en la aparición de eventos adver-sos es decir que tuvo la misma tolerabilidad en humanos el placebo (mal-todextrina) que las dosis de e-PL.

Por otra parte, en los niveles plasmáticos que medían la bio-

seguridad del paciente no se observaron modificaciones a lo

largo del estudio, ya que no hubo diferencias estadísticamen-

te significativas en los valores básales e iníciales en los indi-

cadores de función hepática (AST y ALT), renal (Creatinina)

o metabólicos (Glucosa), (Tabla 4) por lo que se también

comprueba que la e-PL al ser utilizada con dosis farmacológi-

cas en humanos es segura. Otras variables estudiadas que

garantizan la bioseguridad del paciente fueron los análisis de

biometría hemática completa y examen general de orina, és-

tas variables tampoco se vieron alteradas en el tiempo de

estudio (datos no mostrados).

128

# eventos# eventos# eventos# eventos

TG1 TE2 TGS3 SG4

Placebo0 2.5±2.1 2.5±2.6 0.5±0.8 1.83±1.2

45 mg e-PL 1.25±1.5 0.75±0.9 0.00±0.0 0.00±0.0

150 mg e-PL 3.00±2.2 1.00±0.8 0.00±0.0 0.25±0.5

300 mg e-PL 3.00±2.5 2.75±2.2 0.50±0.6 0.50±1.0

450 mg e-PL 0.67±0.6 0.67±1.2 0.67±1.2 0.33±0.6

Prueba estadística (significancias)Prueba estadística (significancias)Prueba estadística (significancias)Prueba estadística (significancias)

Log Rank Breslow Tarone-Ware

Placebo 0.7327 0.5517 0.6265

45 mg e-PL 0.1672 0.1745 0.1702

150 mg e-PL 0.1011 0.1182 0.1087

300 mg e-PL 0.1434 0.2446 0.1934

450 mg e-PL 0.8370 0.8430 0.8460

Tabla 4. Evaluación del perfil de bioseguridad

No existen diferencias significativas entre los valores iniciales y finales para cada variable entre los tratamientos (P<0.05, análisis de ANOVA)

Discusión

Las estrategias terapéuticas clásicas del tratamiento de la

obesidad, como son la dieta y la actividad física son útiles

para perder peso corporal. A pesar de esto, el tratamiento

farmacológico produce una perdida más rápida (VI) especial-

mente en los que la dieta y el ejercicio no son efectivos. Hay

dos categorías de fármacos aprobadas por la FDA para el

tratamiento de la obesidad la Sibutramina y el Orlistat; sin

embargo los eventos adversos que éstos presentan son gra-

ves e incómodos para el sujeto que los toma, van desde ta-

quicardias en el caso de la Sibutramina hasta perdidas invo-

luntarias de grasa tal es el caso del Orlistat (I, VI), este último

tiene un efecto inhibidor de la lipasa pancreática al igual que

la e-PL (XVI). No hay en la literatura eventos adversos aso-

ciados con el uso de la e-PL a dosis farmacológicas, en este

estudio se presentaron 23 eventos adversos tras la adminis-

tración por 12 semanas de e-PL los cuales de acuerdo a los

criterios del sistema Nacional de Farmacovigilancia fueron

clasificados como “No graves”; estos resultados pueden de-

berse a que las dosis administradas se encontraban por de-

bajo del NOAEL (nivel sin efecto adverso observado) que en

ratas macho Sprague Dawley es de 1060 mg/kg (XII) si supo-

nemos que para una persona de 70 kg, la máxima dosis de

e-PL que se le podría administrar sin esperar observar even-

tos adversos es de 74.2 kg las dosis utilizadas en este estu-

dio se encuentran en un rango menor; esto debido a los resul-

tados que obtuvimos en la experimentación preclínica. Por

otro lado, es sabido que muchos fármacos presentan even-

tos adversos hasta después de un largo periodo de tratamien-

to, efecto tal solo se detecta en los estudios clínicos de efica-

cia un ejemplo de estos fármacos es el Orlistat (XVI) es por

eso que aún en los estudios clínicos fase II se sigue monito-

reando la tolerabilidad de la molécula. Por otro lado el hecho

de que los resultados del perfil de bioseguridad no cambia-

ran se atribuye a que la e-PL tiene su acción en el intestino y

solo se absorbe el 6% (XII) lo cual es degradado por la ac-

ción de las proteasas para liberar L-lisina y ser metabolizado

como un aminoácido. La e-PL es un fuerte candidato como

fármaco para la perdida de peso por dos causas principal-

mente, primero porque en estudios anteriores nosotros de-

mostramos en ratas Sprague Dawley que disminuye la canti-

dad de tejido adiposo después de 39 días de tratamiento a

dosis de 50, 150 y 350 mg/kg de e-PL las cuales tuvieron

una disminución en la ganancia de peso corporal de 45, 43 y

50 % respectivamente, respecto al control. Además para el

caso de acumulación de grasa abdominal este fue 53 % me-

nor respecto al control en la dosis de 350 mg/kg; y segundo,

al ser la e-PL de origen proteico a parte de favorecer la perdi-

da de peso en sujetos obesos disminuye la perdida de nitró-

geno ureico (XVII). Esto también ha sido demostrado en ami-

noácidos, tal es el caso de la leucina en donde se observo

como reduce el incremento de tejido adiposo y aumenta la

masa magra además de mantener un control glicémico en

sujetos obesos (XVII).

En conclusión, se presentaron eventos adversos en todos los

tratamientos incluso con el placebo, los cuales al comparar-

los en los análisis estadísticos no tuvieron diferencias signifi-

cativas en la aparición de trastornos con respecto al tiempo,

se puede afirmar que la e-PL es tolerable a las dosis analiza-

das en el tiempo de 12 semanas en sujetos sanos no obe-

sos. Aunado a esto se encuentra el hecho de que no hubo

diferencias estadísticamente significativas con respecto al

tiempo en el perfil de bioseguridad (Hemoglobina, Glucosa,

ASL, ALT, Albúmina y Creatinina) y por lo tanto se tiene la

129

Tratamiento Tiempo HB GLU AST ALT ALB CREA

PlaceboBasal 16 ± 2.3 86 ± 3.0 19 ± 2.7 16 ± 6.9 4.80 ±0.3 1.17 ±0.2

PlaceboFinal 15 ± 0.7 81 ± 4.7 19 ± 2.8 17 ± 2.7 4.78 ±0.4 0.95 ±0.2

45 mg e-PL

Basal 15 ± 0.4 82 ± 15.7 18 ± 2.7 13 ± 3.2 5.07 ±0.1 0.93 ±0.145 mg e-PL

Final 16 ± 1.0 79 ± 3.7 14 ± 6.1 14 ± 2.5 4.93 ±0.1 0.98 ±0.1

150 mg e-PL

Basal 15 ± 3.6 94 ± 15.1 17 ± 6.6 20 ± 10.0 5.63 ±0.5 1.11 ±0.2150 mg e-PL

Final 15 ± 2.1 80 ± 7.8 20 ± 5.7 34 ± 23.3 5.05 ±0.1 1.05 ±0.4

300 mg e-PL

Basal 15 ± 1.3 86 ± 8.5 19 ± 3.6 15 ± 1.7 5.17 ±0.3 1.07 ±0.1300 mg e-PL

Final 14 ± 0.4 81 ± 2.5 17 ± 2.5 24 ± 1.2 4.77 ±0.2 1.00 ±0.0

450 mg e-PL

Basal 15 ± 1.0 82 ± 7.2 26 ± 7.0 23 ± 11.0 5.03 ±0.4 0.90 ±0.0450 mg e-PL

Final 15 ± 0.3 86 ± 7.8 19 ± 2.1 22 ± 17.7 5.10 ±0.3 0.95 ±0.2

suficiente información científica para iniciar el estudio de efi-

cacia en sujetos obesos.

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130

Evaluación del estado nutricio de vitamina B12 y folato de adolescentes potosinos del área conurbana

16

C. Tapia Hernández, M. A. Anaya Loyola.

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro

dra.cristina_tapia@yahoo.com.mx

131

Resumen

El objetivo de este estudio transversal descriptivo correlacio-

nal fue determinar el estado nutricio de adolescentes potosi-

nos en relación a la vitamina B12 y folato, anemia y factores

de riesgo de enfermedades crónicas (EC). Se incluyeron 133

adolescentes (59 % mujeres y 41 % hombres), con edades

entre los 15 y 19 años inscritos en el CONALEP número 1 de

la ciudad de San Luis Potosí. Previo consentimiento informa-

do se aplicó una historia clínica, así como la toma de medi-

das antropométricas y toma de muestra sanguínea en ayu-

nas para determinar la biometría hemática completa y las

concentraciones de glucosa, lípidos séricos, vitamina B12 y

folato. Se calculó el índice de masa corporal y las prevalen-

cias de sobrepeso, obesidad, anemia, glucosa alta, dislipide-

mias y deficiencias de vitamina B12 y folato. La edad prome-

dio de los adolescentes fue 16.8±1.2 años, mientras que los

valores promedio para peso, estatura, cintura, cadera, índice

de masa corporal (IMC) y % de grasa fueron: 59.8±11.7 kg,

161.0±8.0 cm, 75.9±9.1 cm, 95.7±8.4 cm, 23.0±3.7 kg/m2 y

25.9 ±8.5%, respectivamente. En base al IMC el 71% de los

adolescentes estuvo en el rango de peso normal, 6% dentro

de obesidad, 10% con riesgo de sobrepeso y 10% con ries-

go de obesidad y solo el 3% con bajo peso. Las concentracio-

nes sanguíneas medias para hemoglobina (15.1±1.4 g/L),

vitamina B12 (448.8±437.1 pg/mL), folato (12.0±4.5 ng/mL),

glucosa (81.4±14.1 mg/dL), colesterol (134.1±35.9 mg/dL),

triglicéridos (TGs, 89.9±65.9 mg/dL), LDL (67.6±35.8 mg/dL)

y HDL (52.0±11.1 mg/dL) encontrándose dentro de lo normal;

sin embargo, el 1.5 % presentó anemia, el 4% deficiencias

de folato, el 15% deficiencia de vitamina B12, el 15% valores

anormales de glucosa, el 6% se detectó con alto colesterol,

el 9.5% con altos TGs y el 4% con concentraciones de LDL

elevadas. En conclusión la mayoría de los adolescentes eva-

luados presentaron un estado nutricio adecuado, sin embar-

go, ya desde esta edad se observa la presencia de proble-

mas asociados con lípidos sanguíneos y deficiencia de vitami-

na B12.

Palabras clave: vitamina B12, folato, estado nutricio, adoles-

centes.

Introducción

Las necesidades de nutrimentos se incrementan en la adoles-

cencia por existir un aumento en la tasa de crecimiento; así

como cambios en la composición corporal que son diferentes

para cada sexo (Rasmussen, 2001). Los adolescentes sufren

cambios en el ámbito social, psicológico y fisiológico (Shils,

2002). La población de adolescentes aumento de manera

importante en la segunda mitad del siglo XX (Celis de la Ro-

sa, 2003) actualmente representan la cuarta parte de la po-

blación mundial (Santos-Preciado, 2003). Es de gran impor-

tancia detectar en etapas tempranas problemas de deficien-

cia de micro y macro-nutrimentos que pongan en

riesgo su salud. Además de los cambios en la composición

corporal hay cambios alimenticios influidos por la cultura y el

medio externo (Sagredo, 1997). Otro de los problemas en

esta etapa es en cuanto a su sexualidad y reproducción. El

promedio de inicio de la vida sexual activa es a los 15.4 años

de edad teniendo como consecuencia el embarazo no desea-

do poniendo en riesgo tanto la salud de la madre como del

producto. Se ha observado relación entre defectos del cierre

del tubo neural con niveles bajos de folatos y vitamina B12

(Rodríguez-Morán, 1998). Así como niveles de folato y homo-

cisteína están relacionados con riesgo de preeclampsia (Pa-

trick, 2004).

En México la mayoría de los estudios de deficiencia de nutri-

mentos se han realizado en niños menores de 5 años y mu-

jeres embarazadas por lo cual es necesario contar con esta-

dísticas sobre la deficiencia de nutrimentos en los adolescen-

tes para así poder observar las consecuencias de las mis-

mas sobre su salud.

Debido a que las y los adolescentes son un grupo de edad

vulnerable por los cambios que suceden durante su desarro-

llo físico y mental; así como por los problemas nutricionales;

los cambios sociales, culturales y religiosos a los cuales se

enfrentan; aunado al consumo de drogas, el embarazo no

deseado y los trastornos alimentarios que se ven en esta

edad como la anorexia nerviosa y la bulimia.

Se requieren de estudios epidemiológicos para identificar la

magnitud de las deficiencias, sus consecuencias en la salud

y la repercusión en la funcionalidad de las y los adolescentes

mexicanos ya que las estadísticas en estos son pobres.

132

Debido a que la mayoría de las deficiencias continúan siendo

subclínicas, esto constituye un desafío en cuanto a la salud

de los mismos (Olaiz-Fernández, 2006). Como se ha obser-

vado en diversos estudios que la deficiencia de vitamina B12

y folatos es más frecuente de lo que se esperaba a pesar de

los programas de fortificación de alimentos (Allen, 2003;

Siekmann, 2003).

El objetivo de este estudio fue evaluar el estado nutricio de

adolescentes viviendo en el área conurbana de la ciudad de

San Luis Potosí, enfocado básicamente en la evaluación de

vitamina B12, folato, marcadores de lípidos y riesgo de enfer-

medades cardiovasculares.

Materiales y Métodos

Diseño del estudio

Estudio transversal, descriptivo y correlacional realizado en

adolescentes inscritos en el Colegio Nacional de Educación

Profesional Técnica No. 1 (CONALEP) de la ciudad de San

Luis Potosí.

Tamaño de la muestra

La muestra de este estudio piloto estuvo determinada por la

cantidad de alumnos del CONALEP No. 1 que decidieron par-

ticipar de manera voluntaria. De un total de 250 alumnos par-

ticiparon 133 adolescentes, de los cuales 79 pertenecieron al

sexo femenino (59%) y 54 adolescentes al sexo masculino

(41%).

Recolección de datos

Antropométricos

Cada participante se presentó con ropa ligera y en ayuno se

procedió a la toma de medidas antropométricas de peso, ta-

lla, cintura, cadera y porcentaje de grasa corporal por perso-

nal previamente estandarizado. Con las medidas de peso y

estura se calculó el índice de masa corporal (IMC). El porcen-

taje de grasa corporal se determinó por duplicado mediante

un equipo de impedancia bioeléctrica bipolar, marca OMRON

modelo HBF-306INT (Omron Healthcare, Inc, Vernon Hills,

Ilinois, USA). Para esta medición se les pidió a los adolescen-

tes que se descalzaran y retiraran todos los objetos metáli-

cos que vestían, tales como aretes, relojes, pulseras, cinturo-

nes entre otros. Y se les entregó un algodón humedecido

con alcohol para eliminar la posible grasa o suciedad en ma-

nos que pudiera interferir con la medición.

Bioquímicos

Tras doce horas de ayuno se tomó una muestra sanguínea

la cual fue analizada para obtener los datos de Biometría he-

mática por equipo CellDyn 1400, determinación de glucosa y

perfil de lípidos mediante el método de colorimetría. La deter-

minación de vitamina B12 y folato se realizó en plasma me-

diante radio-inmunoensayo utilizando Co57 y I 125.

Valores de referencia

Antropométricos

Índice de masa corporal (IMC). Los puntos de corte para va-

lorar el IMC fueron los establecidos por el Centro para el Con-

trol de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés), en los

cuales se hace un ajuste del IMC con la edad de los adoles-

centes y se trabaja en percentiles. Valores porcentuales del

IMC por debajo del percentil 5 fueron considerados como ba-

jo peso para los adolescentes. Del percentil 5 al 85 se definió

como peso adecuado. Arriba del percentil 85 y hasta el 90

fue definido el riesgo de sobrepeso y para riesgo de obesi-

dad mayor al percentil 90 pero < percentil 95 y obesidad

como tal cuando el IMC fue mayor del percentil 95

(WHO,1995).

Porcentaje de Grasa corporal. Los valores cortes para el por-

centaje de grasa fueron para la mujeres de 5 a 20 % como

bajo, de 21 a 33 % normal, de 34 a 38 % moderadamente

elevado y alto > 38%. Mientras que para los hombres los pun-

tos de corte fueron de 5 a 7 % bajo, normal de 8 a 20%, mo-

deradamente elevado de 21 a 25 % y alto >25 % (Gallagher,

2000).

Bioquímicos

Anemia. Una concentración de hemoglobina <12.0 g/dL para

mujeres y <13.0 g/dl hombres fue considerada como anemia

según los valores de corte utilizados por la OMS (WHO,

2001). Se realizaron ajustes a razón de 0.7g/dL para la alti-

tud de San Luis Potosí de 1860 m (Ruiz-Argüelles, 2006).

133

Glucosa. El valor corte de glucosa normal fue 100 mg/dL,

>100 mg/dL indicó glucosa alta y menor a 50 mg/dL fue consi-

derada como hipoglucemia (Mataix, 2002, NOM-015-SSA2-

1994).

Triglicéridos. Concentraciones séricas de triglicéridos <150

mg/dL, fueron consideradas como normales, de 150-200 mg/

dL limítrofes (con riesgo de enfermedad coronaria y algún

factor de riesgo) y > 200 mg/dL como altos; asociados con

riesgo de enfermedad coronaria más dos o más factores de

riesgo. (NOM-037-SSA2-2002).

Colesterol. Valores normales de colesterol fueron definidos

por una concentración sérica de colesterol total <200 mg/dL,

de 200 a 239 mg/dL valores de colesterol limítrofes (con ries-

go de enfermedad coronaria y algún factor de riesgo) y >240

mg/dL como de alto riesgo cardiovascular, se deben de to-

mar medidas para su reducción tales como cambios en la

alimentación, medicamentos y realizar ejercicio (NOM-037-

SSA2-2002).

Colesterol HDL. Concentraciones mayores HDL >35 mg/dL,

se consideraron normales y < 35mg/dL como HDL de alto

riesgo cardiovascular. (NOM-037-SSA2-2002).

Colesterol LDL. El valor de corte de LDL fue <130 mg/dL pa-

ra indicar un estado normal, de 130 a 159 mg/dL como valor

limítrofe (con riesgo de enfermedad coronaria y algún factor

de riesgo) y ≥160 mg/dL como de alto riesgo cardiovascular

(NOM-037-SSA2-2002).

Vitamina B12. Los valores cortes de vitamina B12 fueron pa-

ra deficiencia <200 pg/mL, deficiencia marginal de 200–300

pg/mL y concentración adecuada de vitamina B12 valores >

300 pg/mL (Campbell, 2003).

Folato. El valor corte para niveles adecuados de folato es ≥6

ng/mL y para deficiencia es < 6 ng/mL (OPS, 1996).

Análisis Estadístico

Para el análisis de los datos se utilizó el paquete estadístico

Statview Versión 5.0.1 de SAS Inst) y en este programa se

corrieron los análisis para la determinación de estadísticas

descriptivos de tendencia central como la media, mediana,

desviación y error estándar de las características antropomé-

tricas y bioquímicas de los adolescentes. Además se hicie-

ron los análisis de correlaciones de Pearson’s con las cuales

se determinaron las asociación entre variables antropométri-

cas y bioquímicas. Las diferencias entre proporciones en va-

riables categóricas se evaluaron por medio de tablas de con-

tingencia y la prueba de Chi-cuadrada. Así como también se

determinó la prevalencia de deficiencia de vitamina B12 y

anemia de los participantes.

Resultado y Discusión

Características antropométricas

La edad promedio de los adolescentes fue 16.8±1.2 años

con un rango de edad de 15 a 19 años. Del total de la mues-

tra (n=133), el 59.4% (n=79) fueron mujeres y el 40.6%

(n=54) hombres. Se encontraron diferencias debidas al géne-

ro en el valor promedio de peso (en mujeres 56.8±11.4 vs.

hombres 64.2±10.7, P=0.0003), estatura (en mujeres

155.8±4.8 vs. hombres 168.5±5.5, P<0.0001), % de grasa

corporal (en mujeres 29.1±4.8 vs. hombres 21.2±10.4,

P=0.0001) y en la relación cintura/cadera (en mujeres

0.78±0.05 vs. hombres 0.81±0.05, P=0.0067) (Tabla 1).

El IMC fue mayor en mujeres que en hombres, esto está en

relación estrecha con las diferencias antropométricas entre

los sexos y a la composición corporal. El 71% de los adoles-

centes presentó un valor de IMC normal. Aunque las tasas

de obesidad (6.0%), riesgo de obesidad (9.8%) y de sobrepe-

so (9.8%) fueron bajas, estas en conjunto contabilizaron para

aproximadamente el 26% del IMC fuera del rango normal.

Sólo 3% de los adolescentes presentaron bajo peso.

En relación a la grasa corporal, se encontró que 71% de los

adolescentes tuvo un porcentaje de grasa dentro del rango

normal, 4% tuvieron menor porcentaje de grasa corporal que

el normal, mientras que en 12% y el 13% de los adolescen-

tes el porcentaje de grasa fue moderadamente elevado y al-

to, respectivamente. Analizando por sexo el porcentaje de

grasa corporal, se encontró una diferencia estadísticamente

significativa (X2=13.9, p<0.005).

134

Tabla 1. Características antropométricas de los participantes

(n=133)

*DS= Desviación estándar

Índices hematológicos

Las concentraciones promedio de hemoglobina en ambos

sexos se encontraron por encima del valor corte para diag-

nóstico anemia. Solo un 1.5 % de los adolescentes presentó

anemia, afectando únicamente a mujeres, lo cual repre-

sentó el 2.5 % del total de estas. Estos datos sobre la pre-

valencia de anemia en adolescentes están por debajo de la

media nacional de 11.5% según lo reportado por la ENSA-

NUT 2006 (Olaiz-Fernández, 2006). En otros estudios se

han reportado prevalencias de anemia muy por encima

de los resultados obtenidos en este estudio, por ejemplo, en

un estudio llevado a cabo en adolescentes de áreas rurales

de Costa Rica se encontró que la prevalencia de anemia en

adolescentes fue del 57%; incluyendo tanto a hombres como

a mujeres; y al separarse por sexo las prevalencias de ane-

mia fueron del 45% y 69 % para mujeres y hombres, respecti-

vamente (Monge-Rojas, 2005). Al igual que en la ENSANUT

2006 la prevalencia de anemia es los hombres es mayor que

en las mujeres (12.3% vs.10.9%) (Olaiz-Fernández, 2006).

Indicadores Bioquímicos

Los valores séricos promedio para los indicadores bioquími-

cos medidos se encontraron dentro del rango normal de los

valores corte (Tabla 2). Y al evaluar diferencias en éstos debi-

das al sexo sólo se observaron diferencias significativas en

la concentración media de colesterol total. Estos resultados

concuerdan con lo encontrado por Ramírez-López, en donde

en jóvenes de Guadalajara del sexo femenino, las concentra-

ciones de colesterol sérico fueron mayores que en los varo-

nes (Ramírez-López, 2003).

Tabla 2. Resultados bioquímicos

*DS= Desviación estándar

Vitamina B12 y folato

En lo referente a las concentraciones de vitamina B12 el

56% de los adolescentes presentaron niveles adecuados, el

15% presentó deficiencia y el 29% presentó deficiencia margi-

nal de está. Estos datos concuerdan con los reportados para

una población de adolescentes femeninas en Venezuela en

donde se encontró un 18.8% de deficiencia (Suárez, 2005),

Mientras que en adolescentes viviendo en áreas rurales de

Costa Rica se ha reportado una prevalencia de deficiencia

de vitamina B12 más alta de aproximadamente el 30% (Mon-

ge-Rojas, 2005). En otro estudio llevado a cabo en Venezue-

la se encontró que la deficiencia de B12 afectó al 64% de los

adolescentes (Diez-Ewald, 1997). En la segunda encuesta

nacional de la nutrición se encontró que el 26 % de las muje-

res adolescentes presentaron concentraciones deficientes de

vitamina B12 (Anaya-Loyola, 2007).

Al respecto, adolescentes holandeses consumiendo dietas

macrobióticas presentaron una prevalencia de deficiencia de

B12 del 37% (Van Dusseldorp, 1999) y el 28% de aquellos

en régimen estrictamente vegetariano (Hellebostad, 1985).

La prevalencia de deficiencia de vitamina B12 que ha sido

reportada en adolescentes chinas en edad reproductiva es

del 10% (Ronnenberg, 2000).

135

Indicador TotalMedia ± DS*

MujeresMedia ± DS*

HombresMedia ± DS*

P

Vitamina B12 (pg/mL) 448.8 ± 437.1 464.5 ± 45.7 424.5 ± 67.9 0.6122Folato (ng/mL) 12.0 ± 4.5 12.45 ± 4.8 11.4 ± 4.1 0.2133Glucosa (mg/dL) 81.4 ± 14.1 81.6 ± 13.8 81.2 ± 15.0 0.8898Colesterol (mg/dL) 134.1 ± 35.9 139.1 ± 36.3 126.0 ± 34.1 0.0458Triglicéridos (mg/dL) 89.9 ± 65.9 92.8 ± 65.9 85.3 ± 66.4 0.5372HDL (mg/dL) 52.0 ± 11.1 52.7 ± 11.4 51.1 ± 10.7 0.4535LDL (mg/dL) 67.6 ± 35.8 71.9 ± 35.7 60.7 ± 35.3 0.0885Colesterol / HDL 2.5 ± 0.6 2.6 ± 0.3 2.5 ± 0.7 0.4182

Concentraciones séricas de folato bajas indicando deficien-

cia fueron encontradas en 4% de los adolescentes, no ha-

biendo diferencia significativa debidas a la diferencia de se-

xo. Este resultado fue igual a otro estudio realizado en niños

y mujeres de 12 a 49 años en México (Villalpando, 2003).

Mientras que en otros estudios la deficiencia es más alta de

54% sin diferencia significativa entre ambos sexos (Monge

Rojas, 2005) y de 90% en mujeres adolescentes venezola-

nas (Suárez, 2005). En adolescentes chinas la deficiencia de

folato se ha reportado que afecta a 23% de los adolescentes.

Glucosa

No se observó diferencia estadística significativa en las con-

centraciones promedio de glucosa debida al sexo de los ado-

lescentes, con un valor promedio de 81.4 mg/dL igual a lo

reportado por el Grupo de Estudio de Insulinemia en Adoles-

centes de Guadalajara, México (Ramírez-López, 2003). Un

2% de los participantes presentaron concentraciones altas

de glucosa, la hipoglucemia se presentó en 13% de los ado-

lescentes, sin embargo, este alto porcentaje de concentracio-

nes bajas de glucosa puede deberse quizás a los valores cor-

tes usados que son para adultos ya que en jóvenes no se

han definido.

Lípidos

Las mujeres adolescentes presentaron concentraciones séri-

cas promedio significativamente mayores de colesterol que

los adolescentes hombres (Tabla 2). Lo cual concuerda con

lo reportado por (Ramírez-López et al., 2003). Sin embargo,

los hombres fueron los únicos que presentaron colesterol ele-

vado, pero en un porcentaje muy bajo (1%) y el 5% de las

mujeres presentaron concentraciones de colesterol limítrofes

(200-239 mg/dL).

En cuanto a los triglicéridos promedio, estos se encontraron

más elevados en las en mujeres adolescentes aunque la dife-

rencia debida al sexo no fue estadísticamente significativa.

Estos mismos hallazgos se han reportado en otros estudios

en adolescentes en los que se ha observado diferencia en

concentraciones séricas debido al género (Leis, 1999). Del

total de los adolescentes un 9.5 % presentó concentracio-

nes de triglicéridos elevadas, y un 4.0% en el límite, sien-

do las mujeres las que mayor prevalencia presentaron.

Un estudio conducido anteriormente en la ciudad de San

Luis Potosí reporto que 4% de los adolescentes estudiantes

de medicina presentaron concentraciones de triglicéridos al-

tos y un 20% colesterol elevado (Aradillas, 2003).

En jóvenes de la ciudad de Guadalajara de edades entre 14

a 19 años, se reportó que el colesterol total y LDL fueron

más altos en mujeres que en varones (Grupo de Estudio de

Insulinemia en Adolescentes, 2003).

En el estudio de Monge-Rojas 18% de los adolescentes mos-

traron concentraciones limítrofes de colesterol y un 7% eleva-

das y prevalencia de triglicéridos altos de un 77% (Monge-Ro-

jas, 2005).

Los resultados promedio para colesterol y triglicéridos en es-

te estudio fueron menores a los reportados anteriormente

para adolescentes mexicanos de la región occidente, en don-

de el valor promedio fue de 143.0 mg/dL para hombres y de

155.0 mg/dL para mujeres adolescentes (Posadas et al.,

1992). Mientras que las concentraciones séricas para coleste-

rol y triglicéridos para adolescentes canadienses y norteame-

ricanos causcásicos reportadas fueron también ligeramente

mayores a las encontradas en éste estudio. En adolescentes

hombres se reportó una media de colesterol sérico de 150.4

mg/dL y en mujeres de 156.5 mg/dL; en cuanto a los triglicéri-

dos los adolescentes hombres presentaron una media de

77.0 mg/dL y las mujeres 73.9 mg/dL (Christensen, 1980).

El valor de HDL promedio de los adolescentes no fue signifi-

cativamente diferente entre hombres y mujeres y se encontró

en general dentro de los valores normales. Solamente el 2%

de los adolescentes hombres presento concentraciones ba-

jas de HDL. Nuestros datos difieren de la prevalencia encon-

trada previamente en adolescentes potosinos, en donde con-

centraciones anormales (bajas) de HDL afectaron al 40% de

los adolescentes evaluados (Aradillas, 2003).

Las concentraciones promedio de colesterol-LDL fué similar

tanto en mujeres como hombres adolescentes (Tabla 2). Al

igual que las prevalencias de valores anormales de LDL, que

para los hombres fue de 5% y para las mujeres del 4%. Ara-

dillas reportó una prevalencia de LDL elevado de 38% en jó-

venes potosinos estudiantes de medicina (Aradillas, 2003).

En adolescentes de Costa Rica tampoco se observó diferen-

cia entre los valores promedio de LDL en mujeres y hombres

adolescentes (Monge-Rojas, 2003).

136

La relación colesterol/LDL fue similar en ambos sexos y la

prevalencia de riesgo de enfermedades cardiovasculares

también.

Estos resultados pudieran reflejar el inicio temprano de una

alteración en el perfil de lípidos en varones adolescentes,

más que en mujeres, aun cuando sólo el 5 % presentó coles-

terol elevado y el 9.5% triglicéridos elevados. Considerando

también que la adolescencia es un período de transición tan-

to dietaria como en lo relacionado a la actividad física.

Correlaciones de variables antropométricas, hematológicas y

bioquímicas

El porcentaje de grasa se encontró asociado con la edad los

adolescentes en forma inversa, y como era de esperarse

con el peso y el IMC en forma positiva El % de grasa se en-

contró también inversamente relacionado con la concentra-

ción de hemoglobina. La vitamina B12 se encontró directa-

mente asociada a la concentración sérica de folato. Las con-

centraciones de folato sérico se encontraron inversamente

asociados con los triglicéridos. Mientras que glucosa y trigli-

céridos séricos estuvieron correlacionados en forma inversa,

colesterol se asoció directamente a triglicéridos y colesterol

LDL y HDL, al igual que triglicéridos y LDL (Tabla 3).

Tabla 3. Correlaciones de variables antropométricas, he-

matológicas y bioquímicas.

Conclusiones

En este estudio en adolescentes potosinos se encontró que

la prevalencia de sobrepeso y obesidad aún no son un pro-

blema de salud importante, basados en las prevalencias de-

terminadas, pero que a pesar de ser bajas se observan ya

desde edades tempranas.

Aun cuando no es alarmante el sobrepeso y la obesidad en

este grupo de adolescentes, si resulta interesante el 25% de

los adolescentes tuvieron un % de grasa no adecuado y cer-

ca de un 5% presenta ya alteraciones en las concentraciones

séricas de lípidos. Siendo los triglicéridos el lípido más afecta-

do.

La anemia no fue un problema nutricional observado en esta

población de estudio, al igual que la deficiencia de folato. Sin

embargo, si se encontró un porcentaje alto de deficiencias de

vitamina B12.

El tabaquismo y el alcoholismo son otros problemas que se

observaron en los jóvenes así como un alto índice de emba-

razos.

Es necesario, implementar programas de nutrición, para fo-

mentar buenos hábitos no solo alimentarios sino también pa-

ra la disminución de consumo de sustancias tóxicas.

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137

Coeficiente Valor P

% de grasa y edad, -0.224 0.0095

% de grasa y peso 0.248 0.039

% de grasa y el IMC 0.477 <.0001

% de grasa y hemoglobina -0.405 <.0001

Hemoglobina, colesterol -0.210 0.0192

Hemoglobina, triglicéridos 0.322 0.0267

Vitamina B12, folato 0.186 0.0365

Folato, triglicéridos -0.376 <.0001

Folato, HDL 0.308 0.0097

Glucosa, triglicéridos -0.289 0.0460

Colesterol, triglicéridos 0.188 0.0350

Colesterol, HDL 0.385 <.0001

Colesterol, LDL 0.921 <.0001

Triglicéridos, HDL 0.217 0.0186

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140

Efecto de la depleción de aminoácidos no esenciales y el tratamiento con 5-FU en la distribución de TWIST en células de cáncer de mama

17

J. E. Escobar Cabrera, L.C. Berumen Segura, G. García Alcocer.

Maestría en Humana. Facultad de Ciencias Naturales.

Universidad Autónoma de Querétaro

jeec82@yahoo.com.mx

141

Resumen

La proteína TWIST es un factor de transcripción que partici-

pa en la regulación del movimiento celular durante el desarro-

llo normal del embrión, sin embargo se ha encontrado sobre-

expresada en distintos tipos de cáncer, asociándose al desa-

rrollo de la metástasis. El tratamiento con fármacos antineo-

plásicos y la disminución de aminoácidos específicos alteran

la presencia y distribución de proteínas necesarias para la

proliferación y migración de las células cancerosas. En este

estudio se analizó el efecto del antineoplásico 5-Fluorouraci-

lo (5-FU) y la depleción de aminoácidos no esenciales (AA-

NE) sobre la proliferación celular, la presencia y distribución

de TWIST en células de cáncer de mama. Los resultados in-

dican que el 5-FU disminuye significativamente la viabilidad

celular a concentraciones de 5, 50, 100 y 200 uM a las 48

horas. Además, el tratamiento con 5-FU y la depleción de

aminoácidos no esenciales incrementan el número de célu-

las con TWIST en citoplasma en comparación con el control.

Los resultados indican que el 5-FU y la depleción de AANE

retienen a TWIST en el citoplasma. Por lo anterior, la elimina-

ción de los AANE de la dieta y el tratamiento con 5-FU serían

una alternativa para la disminución del riesgo a desarrollar

metástasis, al evitar el paso de TWIST hacia el núcleo donde

activaría genes asociados con migración celular.

Palabras clave: TWIST, depleción de aminoácidos, 5-Fluo-

rouracilo, metástasis.

Introducción

El cáncer de mama a nivel mundial y nacional es de las pri-

meras causas de muerte en mujeres (OMS, 2014). Esta en-

fermedad se caracteriza por un aumento en la tasa de prolife-

ración, la capacidad de las células para inhibir la apoptosis y

migrar e invadir otros tejidos adyacentes o distantes, proceso

conocido como metástasis (Flórez, 2004). Para iniciar la me-

tástasis es necesario la activación del proceso conocido co-

mo transición Epitelial-Mesenquimal (TEM) (Lo et al., 2007).

Estudios previos han encontrado que diversos factores de

transcripción participan en la activación de la TEM, uno de

ellos es TWIST, el cual participa en la regulación de la migra-

ción celular durante el desarrollo del embrión en etapas tem-

pranas (Yang et al., 2004) En células de cáncer la sobreex-

presión de TWIST activa la TEM favoreciendo la metástasis

(Meza-Junco et al., 2006; Cheng et al., 2008). La síntesis de

proteínas en células cancerosas, puede alterarse por la ac-

ción de los fármacos antineoplásicos utilizados durante el

tratamiento. En el tratamiento del cáncer de mama el 5-FU

es un fármaco utilizado frecuentemente; su mecanismo de

acción radica en su capacidad para inhibir la actividad de la

timidilato sintasa, enzima necesaria para la síntesis de Timi-

na (Brunetti et al., 1990). La falta de la base nitrogenada pro-

voca alteraciones en el DNA induciendo la activación de la

apoptosis. El 5-FU también interactúa con el RNA, lo cual

causa una desestabilización de la estructura y promueve su

degradación, disminuyendo la síntesis de proteína (Matsuo

et al., 2009). Por otro lado, estudios han demostrado que la

deficiencia de aminoácidos específicos como tratamiento pue-

den disminuir el desarrollo del cáncer y de manera contraria

los pacientes con quimioterapia en algún momento del trata-

miento presentan malnutrición lo que ocasiona una menor

respuesta y tolerancia al tratamiento (García-Luna et al.,

2006).

El objetivo de este trabajo fue estudiar en cultivos de células

de cáncer de mama, el efecto de la disminución de los ami-

noácidos no esenciales y el tratamiento con 5-Fluorouracilo,

tanto en la viabilidad celular, como en la distribución subcelu-

lar de TWIST, para conocer el posible efecto de estos trata-

mientos en la disminución del riesgo de metástasis asociado

con la expresión proteica de TWIST. Lo anterior permitiría

considerar su aplicación en un futuro para mejorar los trata-

mientos existentes o crear nuevas combinaciones farmacoló-

gicas modificando el estado nutricional del paciente con cán-

cer, que aumente la esperanza de vida.

Materiales y Métodos

Anticuerpos y Reactivos

El anticuerpo primario anti-TWIST se compró de Santa Cruz

Biotechnology, (USA). El anticuerpo secundario anti-conejo

conjugado con peroxidasa de rábano se obtuvo de Invitro-

gen. El fármaco antineoplásico 5-FU se obtuvo de Laborato-

rios Columbia (México) (50 ug/ul), la Diaminobenciadina

(DAB) de Sigma (Alemania), el medio de cultivo Eagle modifi-

cado de Dulbecco (DMEM), la glutamina, los aminoácidos no

esenciales y la mezcla de antibióticos fueron obtenidos de

Gibco (Suiza).

142

Expansión Celular

La línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 fue com-

prada de la ATCC. Las células fueron sembradas en medio

de cultivo DMEM con 10% de suero fetal bovino (SFB), 1%

de L-glutamina, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de

mezcla de antibióticos (penicilina/estreptomicina). Los culti-

vos se mantuvieron en una incubación a 37° C y en un am-

biente con CO2 al 5%.

Viabilidad Celular

Evaluación de la disminución del SFB y la albúmina

Para poder eliminar el efecto cruzado de los componentes

del SFB con la disminución de los aminoácidos no esencia-

les sobre la viabilidad celular, se evaluó el cultivo con SFB al

2% y la utilización de Albúmina Sérica Bovina (ASB) al 0.5%

a las 48 horas, que es el tiempo que toma en llegar al 90%

de confluencia un cultivo control con 10% de SFB.

Evaluación de los Aminoácidos No Esenciales (AANE) sobre

la viabilidad

Para este análisis se sembraron 30 000 células por pozo en

placas P12 para cada tratamiento por triplicado. Se evaluó la

viabilidad celular con la concentración óptima de AANE (1%,

grupo control), la mitad de la concentración óptima (0.5%) y

la depleción de éstos aminoácidos (0%) durante 48 horas.

Posteriormente las células fueron tripsinizadas y contadas en

una cámara de Neubauer. Se determinó la viabilidad con

azul tripano al 0.4%.

Evaluación de la viabilidad con 5-Fluorouracilo (5-FU)

A partir del subcultivo, una alícuota de 30,000 células se sem-

bró por pozo en placas P12, con 1ml de medio de cultivo D-

MEM y los suplementos mencionados anteriormente. Se eva-

luaron diferentes concentraciones de 5-Fluorouracilo (5, 50,

100 y 200uM) a las 48 horas, para determinar la concentra-

ción a utilizar durante el estudio. Se evaluó la viabilidad me-

diante tinción con azul tripano al 0.4%.

Inmunocitoquímica

Después del tratamiento las células se lavaron 3 veces con

PBS (buffer de fosfato salino, pH: 7.4) y después se fijaron

con Paraformaldehído (PF) al 4% durante 10 minutos. Poste-

riormente, las células se volvieron a lavar con PBS, y se blo-

queó la actividad de la peroxidasa endógena con una solu-

ción de peróxido de hidrógeno al 1% en PBS por 30 minutos.

Después, las células se lavaron nuevamente con PBT (Buffer

de fosfato salino con tritón al 0.5%) y se bloqueó la marca

inespecífica con leche desgrasada (BIO-RAD) al 3% en PBT

durante 2 horas. Posteriormente, se lavaron las células con

PBT y se incubaron con el anticuerpo primario anti-TWIST

(1:200) en PBT toda la noche a 4°C. Al siguiente día, se quitó

el anticuerpo primario excedente lavando 3 veces con PBT,

10 minutos cada vez y después se agregó el anticuerpo se-

cundario acoplado a peroxidasa de rábano (1:300 en PBT)

durante 2 horas más. Finalmente la tinción inmunoreactiva

para TWIST se observó revelando con el cromógeno DAB. El

grupo control negativo se incubó solamente con el anticuerpo

secundario para demostrar que no había marca inespecífica

que nos diera un falso positivo. Se realizaron al menos 3 ex-

perimentos por triplicado y se analizaron 250 células por répli-

ca/por grupo y se clasificaron dependiendo de la zona subce-

lular donde se presentara TWIST.

Análisis Estadístico

Los datos fueron analizados con ANOVA y una prueba post-

hoc de Tukey para determinar diferencias significativas entre

grupos con un valor de confianza de P< 0.05. Los resultados

son expresados en porcentaje con respecto al control y con

media ± error estándar.

Resultados y Discusiones

Viabilidad Celular

Para observar el efecto del SFB en la viabilidad celular, las

células de cáncer de mama MDA-MB-231 se sembraron con

SFB al 10%, SFB al 2% y con albúmina al 0.5% durante 48

horas. Se encontró que la disminución del SFB permite el

82.66 ± 10.74% y la albúmina el 16.5± 5.32% de viabilidad

con respecto al SFB al 10%. El cultivo de las células con al-

búmina al 0.5% disminuye significativamente la viabilidad de

las células a las 48 horas, contrariamente el tratamiento con

SFB al 2% no modifica la viabilidad celular (Figura 1).

Los resultados de los experimentos de viabilidad son consis-

tentes con lo descrito por Ganguly et al. (2008) quienes al

disminuir el SFB del 1% al 0% en cultivos de las líneas celula-

143

aa

b

res 7F2 y UMR-106 de osteoclastos, observaron la misma

viabilidad en todos los grupos; también son consistentes con

lo reportado por Lui et al. (2009) quienes al sembrar células

madre obtenidas de fluido amniótico humano en medio de

cultivo con 10% y 20% de SFB obtuvieron la misma viabili-

dad celular. Por otro lado, Zanghi et al. (1999) observan un

efecto contrario, donde las células de ovario de hámster chi-

no sembradas en un medio de cultivo con 5% de SFB, pre-

sentan mayor viabilidad que las células suplementadas con

SFB al 10%. También Sawada et al. (2010) observan un efec-

to contrario, al reportar mayor viabilidad de células madre

mesenquimales sembradas sin SFB en comparación de las

células que fueron sembradas con SFB al 10%; así mismo,

De Castro et al. (2006) observaron un aumento de la viabili-

dad de las células C2C12 y HBK de riñón de hámster, al ser

sembradas con albúmina sérica humana al 1%, en compara-

ción con las células que fueron cultivadas con SFB. La dife-

rencia observada entre los distintos reportes, posiblemente

se debió a los requerimientos específicos y sensibilidad a los

nutrientes de cada tipo celular estudiados en los distintos pro-

yectos.

En las células cancerosas de tejidos humanos, se ha obser-

vado un buen desarrollo celular aún en condiciones de restric-

ción de nutrientes, posiblemente porque son capaces de cam-

biar su expresión genética para sintetizar proteínas necesa-

rias en su proliferación, como son los factores de crecimiento

IGF-1, FGF, TGF-B, EGF (Sawada et al., 2005). Algunos

otros factores como TGF-B1 incrementan significativamente

su actividad mitogénica cuando hay deficiencia de nutrientes

(Zhang et al., 2006), con lo cual podría sugerirse que las célu-

las poseen eficaces sistemas de adaptación a las condicio-

nes ambientales. Existen otros factores que pudieron influir

en la viabilidad celular y que son distintos en cada trabajo,

como el tiempo de incubación y el medio de cultivo. Al obte-

ner la misma viabilidad en los cultivos con 10 % y 2% de

SFB se decidió suplementar todos los siguientes experimen-

tos con el 2% de SFB.

Figura 1. Efecto del Suero Fetal Bovino y la Albúmina Sérica Bovina en la viabilidad celular. La albúmina al 0.5% disminuye significativamen-te la viabilidad celular con respecto al SFB al 10%. Los resultados están expresados como la media ± ee, p< 0.05. Las letras diferentes indican

diferencia significativa.

Para evaluar el efecto de los aminoácidos no esenciales (AA-

NE) sobre la viabilidad celular, se formaron 3 grupos: a) Con-

trol (1% de AANE, el cual fue tomado como el 100% de viabi-

lidad al representar las condiciones óptimas de cultivo), b)

aminoácidos al 0.5% en el cual se obtuvo la viabilidad del

109.27 ± 19.8% y c) el grupo con depleción de AANE en el

cual se encontró una viabilidad del 90.72 ± 5.3%. Ninguno de

los tratamientos modificó significativamente la viabilidad celu-

lar (Figura 2).

Los resultados encontrados en la viabilidad de las células

con disminución y depleción de AANE, sugieren que la viabili-

dad no es afectada por la ausencia de estos aminoácidos, al

menos durante las primeras 48 horas. Se ha reportado, que

la depleción de aminoácidos modifica la expresión génica y

promueve eventos moleculares que llevan a la activación de

genes transportadores de aminoácidos para ingresar una ma-

yor cantidad de aminoácidos a la célula (Maruvada y Srivasta-

va, 2004), lo cual podría ser la respuesta al efecto observa-

do en este estudio y contribuir a la sobrevivencia de las célu-

las.

Actualmente, no existen reportes del efecto de los AANE so-

bre la viabilidad celular. Sin embargo, se tienen reportes del

efecto de la disminución de aminoácidos esenciales sobre

células tumorales de ratones alimentados con dietas deficien-

tes de triptófano, donde el tratamiento no afecta el desarrollo

del tumor (Kamath et al., 1998). Otros estudios, observan en

144

menos 3 experimentos por triplicado y se analizaron 250 células por réplica/por grupo y se clasificaron dependiendo de la zona subcelular donde se presentara TWIST. 4. Análisis Estadístico Los datos fueron analizados con ANOVA y una prueba post-hoc de Tukey para determinar diferencias significativas entre grupos con un valor de confianza de P< 0.05. Los resultados son expresados en porcentaje con respecto al control y con media ± error estándar. III. Resultados y Discusiones 3.1 Viabilidad Celular Para observar el efecto del SFB en la viabilidad celular, las células de cáncer de mama MDA-MB-231 se sembraron con SFB al 10%, SFB al 2% y con albúmina al 0.5% durante 48 horas. Se encontró que la disminución del SFB permite el 82.66 ± 10.74% y la albúmina el 16.5± 5.32% de viabilidad con respecto al SFB al 10%. El cultivo de las células con albúmina al 0.5% disminuye significativamente la viabilidad de las células a las 48 horas, contrariamente el tratamiento con SFB al 2% no modifica la viabilidad celular (Figura 1). Los resultados de los experimentos de viabilidad son consistentes con lo descrito por Ganguly et al. (2008) quienes al disminuir el SFB del 1% al 0% en cultivos de las líneas celulares 7F2 y UMR-106 de osteoclastos, observaron la misma viabilidad en todos los grupos; también son consistentes con lo reportado por Lui et al. (2009) quienes al sembrar células madre obtenidas de fluido amniótico humano en medio de cultivo con 10% y 20% de SFB obtuvieron la misma viabilidad celular. Por otro lado, Zanghi et al. (1999) observan un efecto contrario, donde las células de ovario de hámster chino sembradas en un medio de cultivo con 5% de SFB, presentan mayor viabilidad que las células suplementadas con SFB al 10%. También Sawada et al. (2010) observan un efecto contrario, al reportar mayor viabilidad de células madre mesenquimales sembradas sin SFB en comparación de las células que fueron sembradas con SFB al 10%; así mismo, De Castro et al. (2006) observaron un aumento de la viabilidad de las células C2C12 y HBK de riñón de hámster, al ser sembradas con albúmina sérica humana al 1%, en comparación con las células que fueron

cultivadas con SFB. La diferencia observada entre los distintos reportes, posiblemente se debió a los requerimientos específicos y sensibilidad a los nutrientes de cada tipo celular estudiados en los distintos proyectos.

En las células cancerosas de tejidos humanos, se ha observado un buen desarrollo celular aún en condiciones de restricción de nutrientes, posiblemente porque son capaces de cambiar su expresión genética para sintetizar proteínas necesarias en su proliferación, como son los factores de crecimiento IGF-1, FGF, TGF-B, EGF (Sawada et al., 2005). Algunos otros factores como TGF-B1 incrementan significativamente su actividad mitogénica cuando hay deficiencia de nutrientes (Zhang et al., 2006), con lo cual podría sugerirse que las células poseen eficaces sistemas de adaptación a las condiciones ambientales. Existen otros factores que pudieron influir en la viabilidad celular y que son distintos en cada trabajo, como el tiempo de incubación y el medio de cultivo. Al obtener la misma viabilidad en los cultivos con 10 % y 2% de SFB se decidió suplementar todos los siguientes experimentos con el 2% de SFB.

SFB10 SFB2 ALB0.50

20

40

60

80

100

% C

ELU

LAR

TRATAMIENTOS

*

EFECTO DEL SUERO FETAL BOVINO Y ALBÚMINA SÉRICA SOBRE LA VIABILIDAD CELULAR

Figura 1. Efecto del Suero Fetal Bovino y la Albúmina Sérica Bovina en la viabilidad celular. La albúmina al 0.5% disminuye significativamente la viabilidad celular con respecto al SFB al 10%. Los resultados están expresados como la media ± ee, p< 0.05. Las letras diferentes indican diferencia significativa. Para evaluar el efecto de los aminoácidos no esenciales (AANE) sobre la viabilidad celular, se formaron 3 grupos: a) Control (1% de AANE, el cual fue tomado como el 100% de viabilidad al representar las condiciones óptimas de cultivo), b)

a a

b

células PC12 y neuronas postmitóticas de cerebro de rata

fetal, que al depletarlas de los aminoácidos esenciales triptó-

fano, isoleucina, metionina y colina, disminuye su viabilidad

(Yen et al., 2002), esta diferencia en la viabilidad se debe a

que en nuestro estudio se depletaron los AANE en lugar de

los aminoácidos esenciales estudiados por Yen et al. Es co-

nocido que los aminoácidos esenciales como la leucina, iso-

leucina y valina son precursores de la síntesis de proteínas,

inhibidores de la proteólisis y promueven la síntesis de gluta-

mina y alanina (Choudry et al., 2006), por lo que la falta de

estos aminoácidos es crítica para las células. La alta viabili-

dad celular obtenida en nuestro estudio, probablemente fue

inducida por los factores de crecimiento contenidos en el sue-

ro animal, que promueven la utilización de péptidos como

fuente de aminoácidos en condiciones de deficiencia de nu-

trientes (Pan et al., 1998) favoreciendo el desarrollo celular,

o bien, porque los aminoácidos no esenciales contenidos en

el medio fueron suficientes para la elaboración de proteínas

necesarias para la sobrevivencia de las células. Al no encon-

trarse cambios significativos en la viabilidad celular al deple-

tar los AANE, se decidió utilizar estas condiciones para los

siguientes experimentos y evaluar su efecto combinado con

5-FU, tanto en la viabilidad celular como en la presencia de

TWIST.

Figura 2. Evaluación de la viabilidad celular por efecto de la disminu-ción de aminoácidos no esenciales. La disminución y la depleción de los aminoácidos no esenciales no modifican la viabilidad celular. Los re-sultados están expresados como la media ± ee, p< 0.05. Las letras dife-rentes indican diferencia significativa.

Para conocer el efecto del 5-FU sobre la viabilidad, se evalua-

ron diferentes concentraciones: 5, 50, 100 y 200 uM. Se en-

contró con 5 uM una viabilidad del 33.1 ± 13.8%, con 50 uM

el 39.01 ± 8.75%, con 100 uM el 34.54 ± 6.08% y con 200

uM el 19.6 ± 9.58%. Todas las concentraciones evaluadas

disminuyeron significativamente la viabilidad celular al compa-

rarse con el control (sin 5-FU), sin embargo entre tratamien-

tos no hubo diferencia significativa (Figura 3).

El efecto citotóxico del 5-FU observado en este trabajo es

consistente con lo reportado por Sawada et al. (2005), al des-

cribir una disminución significativa en el crecimiento de la lí-

nea celular N0005 de cáncer linfoblástico, a concentraciones

de 10 y 100 uM de 5-FU; también es consistente con Misaki

et al. (2002), quienes reportaron una disminución significativa

del crecimiento de células de cáncer de tiroides, tratadas con

3 ug/ml de 5-FU durante 48 horas. Estos datos también coin-

ciden con los obtenidos por Brunneti et al. (1990), quienes

encontraron que el 5-FU en combinación con AZT, disminuyó

en un 70% el crecimiento del tumor en ratones con cáncer de

colon; y que el aumento en la concentración del 5-FU no re-

sultó más efectivo contra el crecimiento del tumor. La razón

por la cual el 5-FU ocasiona el mismo daño en todas las con-

centraciones, posiblemente sea, que el sistema de repara-

ción celular puede trabajar eficazmente hasta cierto nivel de

deterioro, rescatando timidina para subsistir y evitando que el

efecto del fluorouracilo fuera letal. Sin embargo, el sistema

llega a un límite, en el cual ya no puede soportar el daño y

las células comienzan a morir, disminuyendo la viabilidad co-

mo se observa en el grupo de 200 uM, donde disminuye aún

más la sobrevivencia celular en comparación con los otros

grupos, sin ser significativamente diferentes (Brunneti et al.,

1990).

La muerte celular inducida por 5-FU, se lleva a cabo por su

acción en la inhibición de la timidilato sintasa (TS), o bien por

la acumulación del metabolito del 5-FU (FdUMP) el cual pro-

voca citotoxicidad (Brunneti et al 1990; Ciccolini et al., 2000).

Al observar que la viabilidad es la misma en todos los grupos

tratados, se decidió utilizar la concentración 50 uM para los

experimentos subsiguientes.

145

aminoácidos al 0.5% en el cual se obtuvo la viabilidad del 109.27 ± 19.8% y c) el grupo con depleción de AANE en el cual se encontró una viabilidad del 90.72 ± 5.3%. Ninguno de los tratamientos modificó significativamente la viabilidad celular (Figura 2). Los resultados encontrados en la viabilidad de las células con disminución y depleción de AANE, sugieren que la viabilidad no es afectada por la ausencia de estos aminoácidos, al menos durante las primeras 48 horas. Se ha reportado, que la depleción de aminoácidos modifica la expresión génica y promueve eventos moleculares que llevan a la activación de genes transportadores de aminoácidos para ingresar una mayor cantidad de aminoácidos a la célula (Maruvada y Srivastava, 2004), lo cual podría ser la respuesta al efecto observado en este estudio y contribuir a la sobrevivencia de las células. Actualmente, no existen reportes del efecto de los AANE sobre la viabilidad celular. Sin embargo, se tienen reportes del efecto de la disminución de aminoácidos esenciales sobre células tumorales de ratones alimentados con dietas deficientes de triptófano, donde el tratamiento no afecta el desarrollo del tumor (Kamath et al., 1998). Otros estudios, observan en células PC12 y neuronas postmitóticas de cerebro de rata fetal, que al depletarlas de los aminoácidos esenciales triptófano, isoleucina, metionina y colina, disminuye su viabilidad (Yen et al., 2002), esta diferencia en la viabilidad se debe a que en nuestro estudio se depletaron los AANE en lugar de los aminoácidos esenciales estudiados por Yen et al. Es conocido que los aminoácidos esenciales como la leucina, isoleucina y valina son precursores de la síntesis de proteínas, inhibidores de la proteólisis y promueven la síntesis de glutamina y alanina (Choudry et al., 2006), por lo que la falta de estos aminoácidos es crítica para las células. La alta viabilidad celular obtenida en nuestro estudio, probablemente fue inducida por los factores de crecimiento contenidos en el suero animal, que promueven la utilización de péptidos como fuente de aminoácidos en condiciones de deficiencia de nutrientes (Pan et al., 1998) favoreciendo el desarrollo celular, o bien, porque los aminoácidos no esenciales contenidos en el medio fueron suficientes para la elaboración de proteínas necesarias para la sobrevivencia de las células. Al no encontrarse cambios significativos en la viabilidad celular al depletar los AANE, se decidió utilizar estas condiciones para los siguientes experimentos y evaluar su efecto

combinado con 5-FU, tanto en la viabilidad celular como en la presencia de TWIST.

1% 0,50% 0 %0

20

40

60

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100

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% C

ELU

LAR

PORCENTAJE DE AMINOÁCIDOS NO ESENCIALES

EFECTO DE LA DISMINUCIÓN DE AANE SOBRE LA VIABILIDAD CELULAR

Figura 2. Evaluación de la viabilidad celular por efecto de la disminución de aminoácidos no esenciales. La disminución y la depleción de los aminoácidos no esenciales no modifican la viabilidad celular. Los resultados están expresados como la media ± ee, p< 0.05. Las letras diferentes indican diferencia significativa. Para conocer el efecto del 5-FU sobre la viabilidad, se evaluaron diferentes concentraciones: 5, 50, 100 y 200 uM. Se encontró con 5 uM una viabilidad del 33.1 ± 13.8%, con 50 uM el 39.01 ± 8.75%, con 100 uM el 34.54 ± 6.08% y con 200 uM el 19.6 ± 9.58%. Todas las concentraciones evaluadas disminuyeron significativamente la viabilidad celular al compararse con el control (sin 5-FU), sin embargo entre tratamientos no hubo diferencia significativa (Figura 3). El efecto citotóxico del 5-FU observado en este trabajo es consistente con lo reportado por Sawada et al. (2005), al describir una disminución significativa en el crecimiento de la línea celular N0005 de cáncer linfoblástico, a concentraciones de 10 y 100 uM de 5-FU; también es consistente con Misaki et al. (2002), quienes reportaron una disminución significativa del crecimiento de células de cáncer de tiroides, tratadas con 3 ug/ml de 5-FU durante 48 horas. Estos datos también coinciden con los obtenidos por Brunneti et al. (1990), quienes encontraron que el 5-FU en combinación con AZT, disminuyó en un 70% el crecimiento del tumor en ratones con cáncer de colon; y que el aumento en la concentración del 5-FU no resultó más efectivo contra el crecimiento del tumor. La razón por la cual el 5-FU ocasiona el mismo daño en todas las concentraciones, posiblemente sea, que el sistema de reparación

a a

a

Figura 3. Efecto del 5-Fluorouracilo en la viabilidad celular. Los resul-tados mostraron disminución significativa en la viabilidad celular en todos los grupos tratados con 5-FU con respecto al control, pero no hubo dife-rencias entre los tratamientos. Las letras diferentes indican diferencias significativas.

Para determinar el efecto combinado de la disminución de

AANE y del 5-FU a la concentración de 50 uM sobre la viabili-

dad celular, se analizó el cultivo con 1% de AANE y 5-FU, lo

que se consideró como el 100% de viabilidad, otro grupo eva-

luado fue con disminución de AANE al 0.5% y 5-FU el cual

mostró una viabilidad del 118.8 ± 26.7%, sin ser significativa-

mente diferente del control. El último grupo evaluado fue el

depletado de AANE, el cual mostró una viabilidad del 93 ±

33%, sin mostrar diferencia significativa con el control ni con

los tratamientos (Figura 4). Los resultados muestran que la

disminución o depleción de los AANE, no modifican el efecto

del 5-FU como tratamiento individual sobre la viabilidad. Con

éste análisis se tomó la decisión de utilizar la depleción de

los AANE y el 5-Fu (50 uM) para estudiar su efecto sobre

Twist en las células.

La disminución en la viabilidad celular observada durante la

combinación del 5-FU y la disminución de AANE se debieron

exclusivamente al efecto del 5-FU (Figura 3), asociados a los

mecanismos anteriormente discutidos, ya que los aminoáci-

dos no ejercen ninguna modificación en la viabilidad por sí

solos, ni en combinación con el 5-FU.

Figura 4. Efecto de la diminución de los AANE y el 5-FU en la viabili-dad celular. Los resultados indican que la viabilidad celular es la misma en todos los tratamientos al no encontrar diferencias significativas entre los tratamientos. Los resultados están dados como la media ± ee, p< 0.05. Las letras diferentes indican diferencia significativa.

Distribución subcelular de TWIST

Para explorar la distribución de TWIST se realizó la inmunoci-

toquímica con un control blanco, el cual se incubó con los

reactivos y solo el anticuerpo secundario, el cual se observó

sin marca inespecífica de unión del anticuerpo. Una vez anali-

zados los tratamientos, se encontraron células sin marca y

células con marca (positivas) en las cuales se presentaron

puntos marrones que indicaban la presencia de TWIST, la

cual se clasificó en zonas subcelulares: en núcleo, en cito-

plasma y en núcleo-citoplasma (al mismo tiempo) (Figura 5).

Figura 5. Distribución de Twist en la célula. A) Célula con TWIST sola-mente en el núcleo. B) Célula con TWIST solo en citoplasma, C) TWIST se observa tanto en núcleo como en citoplasma. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo 40X.

146

celular puede trabajar eficazmente hasta cierto nivel de deterioro, rescatando timidina para subsistir y evitando que el efecto del fluorouracilo fuera letal. Sin embargo, el sistema llega a un límite, en el cual ya no puede soportar el daño y las células comienzan a morir, disminuyendo la viabilidad como se observa en el grupo de 200 uM, donde disminuye aún más la sobrevivencia celular en comparación con los otros grupos, sin ser significativamente diferentes (Brunneti et al., 1990). La muerte celular inducida por 5-FU, se lleva a cabo por su acción en la inhibición de la timidilato sintasa (TS), o bien por la acumulación del metabolito del 5-FU (FdUMP) el cual provoca citotoxicidad (Brunneti et al 1990; Ciccolini et al., 2000). Al observar que la viabilidad es la misma en todos los grupos tratados, se decidió utilizar la concentración 50 uM para los experimentos subsiguientes.

SFB2 5uM 50 uM 100uM 200uM0

20

40

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% C

ELU

LAR

CONCENTRACIONES DE 5-FU

EFECTO DEL 5-FU SOBRE LA VIABILIDAD CELULAR

* * **

Figura 3. Efecto del 5-Fluorouracilo en la viabilidad celular. Los resultados mostraron disminución significativa en la viabilidad celular en todos los grupos tratados con 5-FU con respecto al control, pero no hubo diferencias entre los tratamientos. Las letras diferentes indican diferencias significativas. Para determinar el efecto combinado de la disminución de AANE y del 5-FU a la concentración de 50 uM sobre la viabilidad celular, se analizó el cultivo con 1% de AANE y 5-FU, lo que se consideró como el 100% de viabilidad, otro grupo evaluado fue con disminución de AANE al 0.5% y 5-FU el cual mostró una viabilidad del 118.8 ± 26.7%, sin ser significativamente diferente del control. El último grupo evaluado fue el depletado de AANE, el cual mostró una viabilidad del 93 ± 33%, sin mostrar diferencia significativa con el control ni con los tratamientos (Figura 4). Los resultados muestran

que la disminución o depleción de los AANE, no modifican el efecto del 5-FU como tratamiento individual sobre la viabilidad. Con éste análisis se tomó la decisión de utilizar la depleción de los AANE y el 5-Fu (50 uM) para estudiar su efecto sobre Twist en las células. La disminución en la viabilidad celular observada durante la combinación del 5-FU y la disminución de AANE se debieron exclusivamente al efecto del 5-FU (Figura 3), asociados a los mecanismos anteriormente discutidos, ya que los aminoácidos no ejercen ninguna modificación en la viabilidad por sí solos, ni en combinación con el 5-FU.

1% AANE+5FU 0,5% AANE+5FU 0%AANE+5FU

0

20

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S

TRATAMIENTO CON AANE Y 5FU (50 UM)

EFECTO DE LA DISMINUCIÓN DE AMINOÁCIDOS NO ESENCIALES CON EXPOSICIÓN AL 5-FLUOROURACILO

Figura 4. Efecto de la diminución de los AANE y el 5-FU en la viabilidad celular. Los resultados indican que la viabilidad celular es la misma en todos los tratamientos al no encontrar diferencias significativas entre los tratamientos. Los resultados están dados como la media ± ee, p< 0.05. Las letras diferentes indican diferencia significativa. 3.2 Distribución subcelular de TWIST

Para explorar la distribución de TWIST se realizó la inmunocitoquímica con un control blanco, el cual se incubó con los reactivos y solo el anticuerpo secundario, el cual se observó sin marca inespecífica de unión del anticuerpo. Una vez analizados los tratamientos, se encontraron células sin marca y células con marca (positivas) en las cuales se presentaron puntos marrones que indicaban la presencia de TWIST, la cual se clasificó en zonas subcelulares: en núcleo, en citoplasma y en núcleo-citoplasma (al mismo tiempo) (Figura 5).

b b b

b

a

a

a a

celular puede trabajar eficazmente hasta cierto nivel de deterioro, rescatando timidina para subsistir y evitando que el efecto del fluorouracilo fuera letal. Sin embargo, el sistema llega a un límite, en el cual ya no puede soportar el daño y las células comienzan a morir, disminuyendo la viabilidad como se observa en el grupo de 200 uM, donde disminuye aún más la sobrevivencia celular en comparación con los otros grupos, sin ser significativamente diferentes (Brunneti et al., 1990). La muerte celular inducida por 5-FU, se lleva a cabo por su acción en la inhibición de la timidilato sintasa (TS), o bien por la acumulación del metabolito del 5-FU (FdUMP) el cual provoca citotoxicidad (Brunneti et al 1990; Ciccolini et al., 2000). Al observar que la viabilidad es la misma en todos los grupos tratados, se decidió utilizar la concentración 50 uM para los experimentos subsiguientes.

SFB2 5uM 50 uM 100uM 200uM0

20

40

60

80

100

120

% C

ELU

LAR

CONCENTRACIONES DE 5-FU

EFECTO DEL 5-FU SOBRE LA VIABILIDAD CELULAR

* * **

Figura 3. Efecto del 5-Fluorouracilo en la viabilidad celular. Los resultados mostraron disminución significativa en la viabilidad celular en todos los grupos tratados con 5-FU con respecto al control, pero no hubo diferencias entre los tratamientos. Las letras diferentes indican diferencias significativas. Para determinar el efecto combinado de la disminución de AANE y del 5-FU a la concentración de 50 uM sobre la viabilidad celular, se analizó el cultivo con 1% de AANE y 5-FU, lo que se consideró como el 100% de viabilidad, otro grupo evaluado fue con disminución de AANE al 0.5% y 5-FU el cual mostró una viabilidad del 118.8 ± 26.7%, sin ser significativamente diferente del control. El último grupo evaluado fue el depletado de AANE, el cual mostró una viabilidad del 93 ± 33%, sin mostrar diferencia significativa con el control ni con los tratamientos (Figura 4). Los resultados muestran

que la disminución o depleción de los AANE, no modifican el efecto del 5-FU como tratamiento individual sobre la viabilidad. Con éste análisis se tomó la decisión de utilizar la depleción de los AANE y el 5-Fu (50 uM) para estudiar su efecto sobre Twist en las células. La disminución en la viabilidad celular observada durante la combinación del 5-FU y la disminución de AANE se debieron exclusivamente al efecto del 5-FU (Figura 3), asociados a los mecanismos anteriormente discutidos, ya que los aminoácidos no ejercen ninguna modificación en la viabilidad por sí solos, ni en combinación con el 5-FU.

1% AANE+5FU 0,5% AANE+5FU 0%AANE+5FU

0

20

40

60

80

100

120

140

160

% C

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LAS

VIA

BLE

S

TRATAMIENTO CON AANE Y 5FU (50 UM)

EFECTO DE LA DISMINUCIÓN DE AMINOÁCIDOS NO ESENCIALES CON EXPOSICIÓN AL 5-FLUOROURACILO

Figura 4. Efecto de la diminución de los AANE y el 5-FU en la viabilidad celular. Los resultados indican que la viabilidad celular es la misma en todos los tratamientos al no encontrar diferencias significativas entre los tratamientos. Los resultados están dados como la media ± ee, p< 0.05. Las letras diferentes indican diferencia significativa. 3.2 Distribución subcelular de TWIST

Para explorar la distribución de TWIST se realizó la inmunocitoquímica con un control blanco, el cual se incubó con los reactivos y solo el anticuerpo secundario, el cual se observó sin marca inespecífica de unión del anticuerpo. Una vez analizados los tratamientos, se encontraron células sin marca y células con marca (positivas) en las cuales se presentaron puntos marrones que indicaban la presencia de TWIST, la cual se clasificó en zonas subcelulares: en núcleo, en citoplasma y en núcleo-citoplasma (al mismo tiempo) (Figura 5).

b b b

b

a

a

a a

Figura 5. Distribución de Twist en la célula. A) Célula con TWIST solamente en el núcleo. B) Célula con TWIST solo en citoplasma, C) TWIST se observa tanto en núcleo como en citoplasma. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo 40X. El análisis en el grupo control (1% de AANE) mostró la presencia de TWIST en el 96.3 ± 1.3% de las células analizadas, en el grupo con depleción de los AANE se observó en el 88.6 ± 5.3%, en el tratamiento con 1% de AANE y 5-FU (50 uM) en el 80.6 ± 13.3% y en las células con depleción de AANE y exposición al 5-FU se observó a TWIST en el 87 ± 3.8% de las células. El análisis ICQ mostró que ni el 5-FU ni la depleción de los AANE eliminan a TWIST de las células, al no encontrarse diferencia significativa con el control ni entre tratamientos (Figura 6).

1%AANE 0% AANE 1% AANE-5FU 0% AANE-5FU0

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% C

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S

TRATAMIENTOS

EFECTO DE LOS AANE Y EL 5-FU SOBRE LAS CÉLULAS CON TWIST

Figura 6. Porcentaje de células con presencia de TWIST por tratamiento. Los resultados indican que los tratamientos no modifican significativamente el número de células con TWIST, sin embargo en todos los tratamientos se observa una tendencia a disminuir. Los resultados están expresados como la media ± ee, p< 0.05. Las letras diferentes indican diferencia significativa.

El análisis realizado para estudiar la distribución de TWIST en las células, mostró que esta proteína se presenta en núcleo, en citoplasma y en ambas zonas a la vez. En las células control (con el 1% de AANE), el número de células con TWIST en citoplasma y núcleo/citoplasma es el mismo, al no observarse diferencias significativas entre las dos zonas. Los datos muestran que la depleción de AANE aumenta significativamente el número de células con TWIST en citoplasma con respecto al número de células con TWIST en núcleo/citoplasma dentro del mismo grupo. Además, la depleción de AANE también aumenta de manera significativa, el número de células con TWIST en citoplasma al compararse con el control y los demás tratamientos. Los tratamientos con 5-FU con y sin AANE aumentan de manera significativa el número de células con TWIST en citoplasma con respecto al número de células con presencia de TWIST en núcleo/citoplasma dentro de sus mismos grupos, pero no muestran diferencia entre tratamientos (Figura 7).

Durante el análisis del efecto de los distintos tratamientos sobre la presencia y distribución de TWIST en células MDA-MB-231, se encontró que la falta de AANE y la exposición al 5-FU, no fue suficiente para eliminar por completo la proteína de la célula, pero sí se observa una disminución del número de células con presencia de TWIST, aunque no es significativa. Los resultados de la distribución de TWIST son muy interesantes porque sugieren la retención de TWIST en el citoplasma, por efecto de la disminución de AANE y el 5-FU. El número de células que presentan TWIST solo en núcleo es muy bajo y no muestra cambio entre los tratamientos.

Una posible explicación para la permanencia de TWIST en el citoplasma en un estado depletado de AANE, es que al crecer las células con esta deficiencia, la proteína pudo haberse sintetizado incompleta, lo que impide una correcta interacción dimérica y traslocación al núcleo, como lo expresa Hao et al. (2011), quienes establecen que es necesaria la existencia de un grupo de aminoácidos específicos en el dominio N-terminal de la proteína para realizar la correcta interacción. La posible mutación en dicha región afecta la dimerización con otras proteínas bHLH, disminuyendo así su función (El Ghouzzi et al., 2000). Otra posibilidad es que la célula en condiciones de desnutrición específicamente de

a a a a

A B C

El análisis en el grupo control (1% de AANE) mostró la pre-

sencia de TWIST en el 96.3 ± 1.3% de las células analiza-

das, en el grupo con depleción de los AANE se observó en el

88.6 ± 5.3%, en el tratamiento con 1% de AANE y 5-FU (50

uM) en el 80.6 ± 13.3% y en las células con depleción de AA-

NE y exposición al 5-FU se observó a TWIST en el 87 ±

3.8% de las células. El análisis ICQ mostró que ni el 5-FU ni

la depleción de los AANE eliminan a TWIST de las células, al

no encontrarse diferencia significativa con el control ni entre

tratamientos (Figura 6).

Figura 6. Porcentaje de células con presencia de TWIST por trata-miento. Los resultados indican que los tratamientos no modifican signifi-cativamente el número de células con TWIST, sin embargo en todos los tratamientos se observa una tendencia a disminuir. Los resultados están expresados como la media ± ee, p< 0.05. Las letras diferentes indican diferencia significativa.

El análisis realizado para estudiar la distribución de TWIST

en las células, mostró que esta proteína se presenta en nú-

cleo, en citoplasma y en ambas zonas a la vez.

En las células control (con el 1% de AANE), el número de

células con TWIST en citoplasma y núcleo/citoplasma es el

mismo, al no observarse diferencias significativas entre las

dos zonas. Los datos muestran que la depleción de AANE

aumenta significativamente el número de células con TWIST

en citoplasma con respecto al número de células con TWIST

en núcleo/citoplasma dentro del mismo grupo. Además, la

depleción de AANE también aumenta de manera significati-

va, el número de células con TWIST en citoplasma al compa-

rarse con el control y los demás tratamientos. Los tratamien-

tos con 5-FU con y sin AANE aumentan de manera significati-

va el número de células con TWIST en citoplasma con res-

pecto al número de células con presencia de TWIST en nú-

cleo/citoplasma dentro de sus mismos grupos, pero no mues-

tran diferencia entre tratamientos (Figura 7).

Durante el análisis del efecto de los distintos tratamientos

sobre la presencia y distribución de TWIST en células MDA-

MB-231, se encontró que la falta de AANE y la exposición al

5-FU, no fue suficiente para eliminar por completo la proteína

de la célula, pero sí se observa una disminución del número

de células con presencia de TWIST, aunque no es significati-

va. Los resultados de la distribución de TWIST son muy inte-

resantes porque sugieren la retención de TWIST en el cito-

plasma, por efecto de la disminución de AANE y el 5-FU. El

número de células que presentan TWIST solo en núcleo es

muy bajo y no muestra cambio entre los tratamientos.

Una posible explicación para la permanencia de TWIST en el

citoplasma en un estado depletado de AANE, es que al cre-

cer las células con esta deficiencia, la proteína pudo haberse

sintetizado incompleta, lo que impide una correcta interac-

ción dimérica y traslocación al núcleo, como lo expresa Hao

et al. (2011), quienes establecen que es necesaria la existen-

cia de un grupo de aminoácidos específicos en el dominio N-

terminal de la proteína para realizar la correcta interacción.

La posible mutación en dicha región afecta la dimerización

con otras proteínas bHLH, disminuyendo así su función (El

Ghouzzi et al., 2000). Otra posibilidad es que la célula en con-

diciones de desnutrición específicamente de AANE, entre en

catabolismo el cual ocasionaría un trastorno en el metabolis-

mo de los aminoácidos (Choudry et al., 2006) e iniciara la

degradación de proteínas para su sobrevivencia, entre las

que podría encontrarse TWIST. Otra posibilidad, es que al

estar la célula deficiente de AANE, se evitara la síntesis de

proteínas que requieren estos aminoácidos en su estructura,

siendo TWIST una de éstas proteínas al conformarse en un

68% de éstos aminoácidos.

En el grupo tratado con 5-FU se observó la permanencia de

TWIST en el citoplasma, lo que puede ser asociado a una

posible mutación que provoque un reemplazo de residuos

aminoacídicos en el dominio de unión a otras proteínas de

147

Figura 5. Distribución de Twist en la célula. A) Célula con TWIST solamente en el núcleo. B) Célula con TWIST solo en citoplasma, C) TWIST se observa tanto en núcleo como en citoplasma. Las imágenes fueron tomadas con un objetivo 40X. El análisis en el grupo control (1% de AANE) mostró la presencia de TWIST en el 96.3 ± 1.3% de las células analizadas, en el grupo con depleción de los AANE se observó en el 88.6 ± 5.3%, en el tratamiento con 1% de AANE y 5-FU (50 uM) en el 80.6 ± 13.3% y en las células con depleción de AANE y exposición al 5-FU se observó a TWIST en el 87 ± 3.8% de las células. El análisis ICQ mostró que ni el 5-FU ni la depleción de los AANE eliminan a TWIST de las células, al no encontrarse diferencia significativa con el control ni entre tratamientos (Figura 6).

1%AANE 0% AANE 1% AANE-5FU 0% AANE-5FU0

20

40

60

80

100

% C

ÉLU

LA

S M

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S

TRATAMIENTOS

EFECTO DE LOS AANE Y EL 5-FU SOBRE LAS CÉLULAS CON TWIST

Figura 6. Porcentaje de células con presencia de TWIST por tratamiento. Los resultados indican que los tratamientos no modifican significativamente el número de células con TWIST, sin embargo en todos los tratamientos se observa una tendencia a disminuir. Los resultados están expresados como la media ± ee, p< 0.05. Las letras diferentes indican diferencia significativa.

El análisis realizado para estudiar la distribución de TWIST en las células, mostró que esta proteína se presenta en núcleo, en citoplasma y en ambas zonas a la vez. En las células control (con el 1% de AANE), el número de células con TWIST en citoplasma y núcleo/citoplasma es el mismo, al no observarse diferencias significativas entre las dos zonas. Los datos muestran que la depleción de AANE aumenta significativamente el número de células con TWIST en citoplasma con respecto al número de células con TWIST en núcleo/citoplasma dentro del mismo grupo. Además, la depleción de AANE también aumenta de manera significativa, el número de células con TWIST en citoplasma al compararse con el control y los demás tratamientos. Los tratamientos con 5-FU con y sin AANE aumentan de manera significativa el número de células con TWIST en citoplasma con respecto al número de células con presencia de TWIST en núcleo/citoplasma dentro de sus mismos grupos, pero no muestran diferencia entre tratamientos (Figura 7).

Durante el análisis del efecto de los distintos tratamientos sobre la presencia y distribución de TWIST en células MDA-MB-231, se encontró que la falta de AANE y la exposición al 5-FU, no fue suficiente para eliminar por completo la proteína de la célula, pero sí se observa una disminución del número de células con presencia de TWIST, aunque no es significativa. Los resultados de la distribución de TWIST son muy interesantes porque sugieren la retención de TWIST en el citoplasma, por efecto de la disminución de AANE y el 5-FU. El número de células que presentan TWIST solo en núcleo es muy bajo y no muestra cambio entre los tratamientos.

Una posible explicación para la permanencia de TWIST en el citoplasma en un estado depletado de AANE, es que al crecer las células con esta deficiencia, la proteína pudo haberse sintetizado incompleta, lo que impide una correcta interacción dimérica y traslocación al núcleo, como lo expresa Hao et al. (2011), quienes establecen que es necesaria la existencia de un grupo de aminoácidos específicos en el dominio N-terminal de la proteína para realizar la correcta interacción. La posible mutación en dicha región afecta la dimerización con otras proteínas bHLH, disminuyendo así su función (El Ghouzzi et al., 2000). Otra posibilidad es que la célula en condiciones de desnutrición específicamente de

a a a a

A B C

TWIST (Hamamori et al., 1997) inhibiendo la dimerización y

su traslocación al núcleo, donde cumple su función como fac-

tor de transcripción (El Ghouzzi et al., 2000).

Figura 7. Efecto del 5-FU y la depleción de aminoácidos sobre la dis-tribución de TWIST. En el grupo control (AANE 1%), TWIST se encuen-tra distribuido por igual tanto en citoplasma (C1) como en núcleo/citoplas-ma (NC1). Todos los tratamientos aumentan significativamente el número de células con TWIST en citoplasma. Los resultados están como media ± ee.

Conclusiones

En base a los resultados obtenidos se puede concluir que la

viabilidad de las células MDA-MB-231 no se modifica por

efecto de la desnutrición provocada por la disminución de

SFB y la depleción de aminoácidos no esenciales. El trata-

miento farmacológico con 5-FU disminuye significativamente

la viabilidad a concentraciones de 5, 50, 100 y 200 uM. La

disminución de AANE y el 5-FU (50 uM) de forma individual y

conjunta, inhibe la movilidad de TWIST del citoplasma hacia

el núcleo. Finalmente, se puede sugerir que el tratamiento

antineoplásico con 5-FU (50 uM) asociado a una deficiencia

de AANE podría disminuir el riesgo a desarrollar metástasis,

asociado con la diminución del factor de transcripción

TWIST.

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148

AANE, entre en catabolismo el cual ocasionaría un trastorno en el metabolismo de los aminoácidos (Choudry et al., 2006) e iniciara la degradación de proteínas para su sobrevivencia, entre las que podría encontrarse TWIST. Otra posibilidad, es que al estar la célula deficiente de AANE, se evitara la síntesis de proteínas que requieren estos aminoácidos en su estructura, siendo TWIST una de éstas proteínas al conformarse en un 68% de éstos aminoácidos.

En el grupo tratado con 5-FU se observó la permanencia de TWIST en el citoplasma, lo que puede ser asociado a una posible mutación que provoque un reemplazo de residuos aminoacídicos en el dominio de unión a otras proteínas de TWIST (Hamamori et al., 1997) inhibiendo la dimerización y su traslocación al núcleo, donde cumple su función como factor de transcripción (El Ghouzzi et al., 2000).

Figura 7. Efecto del 5-FU y la depleción de aminoácidos sobre la distribución de TWIST. En el grupo control (AANE 1%), TWIST se encuentra distribuido por igual tanto en citoplasma (C1) como en núcleo/citoplasma (NC1). Todos los tratamientos aumentan significativamente el número de células con TWIST en citoplasma. Los resultados están como media ± ee. IV. Conclusiones

En base a los resultados obtenidos se puede concluir que la viabilidad de las células MDA-MB-231 no se modifica por efecto de la

desnutrición provocada por la disminución de SFB y la depleción de aminoácidos no esenciales. El tratamiento farmacológico con 5-FU disminuye significativamente la viabilidad a concentraciones de 5, 50, 100 y 200 uM. La disminución de AANE y el 5-FU (50 uM) de forma individual y conjunta, inhibe la movilidad de TWIST del citoplasma hacia el núcleo. Finalmente, se puede sugerir que el tratamiento antineoplásico con 5-FU (50 uM) asociado a una deficiencia de AANE podría disminuir el riesgo a desarrollar metástasis, asociado con la diminución del factor de transcripción TWIST. V. Bibliografía

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149

Índice

El zinc y su relación con factores de riesgo de enfermedades crónico degenerativas en mujeres de una zona rural de

Querétaro...................................................................................................................................................................................... p. 3

Estudio del perfil proteínico de fórmulas infantiles de inicio comercializadas en México............................................................p. 13

Análisis composicional de la hoja de frijol común Phaseolus vulgaris y evaluación de su consumo como fuente de hierro en

ratas.............................................................................................................................................................................................p. 20

Uso de vectores de impedancia bioeléctica para ajuste de peso seco en pacientes sometidos a hemodiálisis.........................p. 31

Biodisponibilidad de zinc en trigo biofortificado...........................................................................................................................p. 43

Efecto protector del jugo de granada (Punica granatum L.) sobre complicaciones de la diabetes.............................................p. 54

Estudio de los factores socioculturales vinculados con la obesidad en mujeres.........................................................................p. 62

Evaluación de la hematotoxicidad de una fracción de lectinas-inhibidor de proteasas de frijol Tépari (Phaseolus acutifolius) en

ratas.............................................................................................................................................................................................p. 66

Desnutrición perinatal y conducta apetitiva en ratas jóvenes desnutridas..................................................................................p. 75

Asociación de rs9939609 del gen FTO y rs17782313 del gen MC4R con sobrepeso/obesidad y factores de riesgo metabólico en

niños escolares de Querétaro.....................................................................................................................................................p. 82

Cambios proteogenómicos del receptor purinérgico P2X6 inducidos por modificaciones en la alimentación durante la ontogenia

del intestino de rata.....................................................................................................................................................................p. 88

Purificación y caracterización parcial de una lectina citotóxica de frijol Tépari (Phaseolus acutifolius)......................................p. 96

Asociación de micronutrientes en sangre con indicadores de inflamación sistémica y leptina.................................................p. 105

Estudio piloto sobre el gasto energético en reposo en niños preescolares con sobrepeso y obesidad....................................p. 113

Evaluación de la tolerabilidad de la ε-polilisina, como posible fármaco para el tratamiento de la obesidad.............................p. 124

Evaluación del estado nutricio de vitamina B12 y folato de adolescentes potosinos del área conurbana................................p. 131

Efecto de la depleción de aminoácidos no esenciales y el tratamiento con 5-FU en la distribución de TWIST en células de cáncer

de mama....................................................................................................................................................................................p. 141

cl

Fuente de las imágenes

Portada - Monumento a la Autonomía, UAQ.

Capítulo 1 - Jardín del Centro Universitario, UAQ.

Capítulo 2 - Laboratorio de Biología Molecular, FCN.

Capítulo 3 - http://www.biopix.es/judia-phaseolus-vulgaris_photo-47840.aspx

Capítulo 4 - http://www.saludyalgomas.com/tablasnutricionales/valoracion-del-estado-nutricional/

Capítulo 5 - http://fondos.wallpaperstock.net/de-trigo-en-verano-wallpapers_w17773.html

Capítulo 6 - http://vasakiiberica.com/frutas/

Capítulo 7 - http://ruymaroc.wordpress.com/2014/03/30/mujer-completa/

Capítulo 8 - http://www.medicinatradicionalista.com/los-beneficios-del-frijol/

Capítulo 9 - http://cutcaster.com/photo/801119862-Malnutrition-background-concept/

Capítulo 10 - http://www.vectorizados.com/vector/11281_marco-con-nios/

Capítulo 11 - http://frasesdedios.blogspot.mx/2013/10/ciencia-y-religion-el-falso-conflicto.html

Capítulo 12 - http://ongzi-secretgarden.blogspot.mx/2012_07_01_archive.html

Capítulo 13 - http://hdwallpaperzs.blogspot.com/2014/10/glass-apple-wallpapers.html

Capítulo 14 - http://annaidmundorock.blogspot.mx/2011_10_01_archive.html

Capítulo 15 - http://www.taringa.net/posts/salud-bienestar/15134921/La-Adiccion-a-los-farmacos.html

Capítulo 16 - http://www.secretosparatusalud.com/product/311345/vitamina-b-12-y-acido-folico-sublingual

Capítulo 17 - http://www.cubadebate.cu/noticias/2014/05/29/elaboran-primer-borrador-del-mapa-de-las-proteinas-humanas/#.VHK-21WG8p8

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