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MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO EN BIOGENÉTICA
Claudia Elena Espinal-Correa (Compiladora)
Universidad Cooperativa de Colombia Sede Medellín
Documentos de docencia | Course Work
coursework.ucc.edu.co No. 14, diciembre, 2015
http://dx.doi.org/10.16925/greylit.1084
NOTA LEGAL
El presente documento de trabajo ha sido incluido dentro de nuestro repositorio de literatura gris por solicitud del autor,
con fines informativos, educativos o académicos. Asimismo, los argumentos, datos y análisis incluidos en el texto son
responsabilidad absoluta del autor y no representan la opinión del Fondo Editorial o de la Universidad.
DISCLAIMER
This coursework paper has been uploaded to our grey literature repository due to the request of the author. This
document should be used for informational, educational or academic purposes only. Arguments, data and analysis
included in this document represent authors’ opinion not the Press or the University.
Acerca del compilador
Claudia Elena Espinal-Correa es profesora de tiempo completo de la Facultad de
Medicina de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia.
Correo electrónico:
Cómo citar este documento Espinal-Correa, C. E., Gómez-Gallego, D. M., Ossa-Giraldo, A. C. y Solarte, V.
(2015). Manual de prácticas de laboratorio en biogenética. (Documento de
docencia No. 14). Bogotá: Ediciones Universidad Cooperativa de Colombia. doi:
http://dx.doi.org/10.16925/greylit.1084
Este documento puede ser consultado, descargado o reproducido desde nuestro repositorio
de documentos de trabajo (http://coursework.ucc.edu.co) para uso de sus contenidos, bajo
la licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0
Internacional. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
RESUMEN
La presente obra es el resultado de un esfuerzo académico que busca compendiar, a
la luz de las habilidades y destrezas de los futuros profesionales de Ciencias de la
Salud de la Universidad Cooperativa de Colombia, los conceptos de las ciencias
básicas anclados a los conceptos específicos de la práctica clínica profesional,
aminorando el divorcio histórico con las mal llamadas ciencias duras (biología,
química, física). Las ciencias básicas constituyen un soporte conceptual sobre el cual
se edifica la compresión holística del individuo como unidad orgánica –fisiológica–
psicológica y social; de su interacción resulta la fascinante complejidad de lo
viviente, complejidad cuyos parámetros de normalidad y patología son el soporte
sobre el cual trabaja el personal profesional de la salud. Formular entonces las
competencias a desarrollar en el futuro personal de salud en áreas como la
biogenética, articulado a ambientes prácticos de aprendizaje inteligentemente
diseñados para ello, aminora el divorcio académico entre básicas y clínicas y
robustece la formación académica que como institución nos ha sido dado llevar a
cabo .
Palabras clave: cultivos celulares, dermatoglifos, genealogía sanguínea, cariotipo,
electroforesis, anticancerígeno
TABLA DE CONTENIDO
Introducción • 5
Capítulo 1: Evaluación de un medicamento anticancerígeno mediante un cultivo celular in vitro • 7
8|| Metodología
8|| Temario que lo apoya
8|| Objetivos
8|| Fundamento teórico
11|| Descripción de la actividad a realizar
16|| Ejercicio de aplicación
17|| Bibliografía.
Capítulo 2: Genealogía sanguínea • 19 20|| Temario que lo apoya
20|| Objetivos
20|| Fundamento teórico
23|| Descripción de la actividad a realizar
25|| Bibliografía
Capítulo 3: Dermatoglifos • 27 28|| Temario que lo apoya
28|| Objetivos
29|| Fundamento teórico
41|| Descripción de la actividad a realizar
43|| Bibliografía
Capítulo 4: Extendidos cromosómicos • 45 46|| Temario que lo apoya
46|| Objetivos
46|| Fundamento teórico
48|| Descripción de la actividad a realizar
50|| Bibliografía
Capítulo 5: Cariotipo • 51 52|| Objetivos
52|| Fundamento teórico
57|| Descripción de la actividad a realizar
60|| Bibliografía
Capítulo 6: Biología molecular aplicada a la clínica: extracción de ADN, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y electroforesis de ADN • 63
64|| Metodología
64|| Temario que lo apoya
64|| Objetivos
64|| Fundamento teórico
73|| Descripción de la actividad a realizar
77|| Ejercicio de aplicación
79|| Bibliografía
Anexos • 81
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
5
INTRODUCCIÓN
itar la formación médica por competencias implica no solo un marco conceptual
sobre el cual estas se sustentan, sino formular un componente que haga referencia a
las habilidades prácticas en el marco del desempeño profesional del médico.
Además, implica que la dotación de habilidades prácticas también están enmarcadas en el
cumplimiento de normas legales vigentes que regulan el área del diagnóstico clínico y las
pruebas clínicas que ello requiere.
Introducir al estudiante en la adquisición de habilidades que le permitan un adecuado
manejo del componente clínico durante su práctica profesional, en el área de la genética
clínica y molecular, implica regirse por los acuerdos normativos del Ministerio de Salud
Nacional, que reglamenta y da potestad a los profesionales de la salud para hacer uso de los
diagnósticos genéticos específicos para la determinación de patologías de origen
cromosómico, todas aquellas ligadas al cromosoma X y al cromosoma Y, y las ligadas a
leucemias.
En este orden de ideas se inscribe el presente manual, con el propósito de articular las
conceptualizaciones teóricas en un contexto práctico que garantice el desarrollo de
habilidades diagnósticas de interpretación de pruebas genéticas y técnicas moleculares,
estas últimas como herramienta diagnóstica.
Así pues, la competencia específica y la conclusión de este componente práctico
quedan adscritas al desarrollo de las habilidades necesarias para reconocer patologías
genéticas, de tal suerte que en su práctica profesional diaria el médico general pueda contar
con los elementos conceptuales y prácticos para tomar una decisión adecuada en la
anamnesis, el diagnóstico, el pronóstico, la elección y la interpretación acertada de los
resultados de las pruebas diagnósticas remitidas.
La competencia específica adquirida hace parte de aquella formulada en el plan de
curso de esta, así como la evidencia, número de créditos y temas.
Con el presente manual de prácticas de laboratorio se pretende que el estudiante de
pregrado de Medicina de la Universidad Cooperativa de Colombia tome el curso y sus
prácticas obedeciendo a las siguientes competencias previas y desarrollando las que debe
adquirir, como son:
1. Identificar las estructuras de los seres vivos que les permiten desarrollarse en un
entorno y que puedo utilizar con criterios de clasificación.
2. Identificar condiciones de cambio y de equilibrio en los seres vivos y en los
ecosistemas.
C
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
6
3. Explicar la variabilidad en las poblaciones y la diversidad biológica como
consecuencia de estrategias de reproducción, cambios genéticos y selección
natural.
4. Identificar aplicaciones de algunos conocimientos sobre la herencia y la
reproducción al mejoramiento de la calidad de vida de las poblaciones.
5. Comprensión lecto-escritora.
6. Comunicación grupal asertiva.
7. Uso de las tecnologías de la información y la comunicación (TIC).
La competencia específica a desarrollar es la siguiente: “explicar los determinantes
biológicos y genéticos inherentes a la condición de normalidad para establecer los estados
de salud enfermedad a partir de los conocimientos avalados por la comunidad científica”.
Ser competentes en este sentido implica:
Clasificar los componentes celulares, sus funciones y patologías asociadas.
Diferenciar los componentes de la genética mendeliana y no mendeliana.
Identificar los principios básicos de técnicas de diagnóstico molecular.
Justificar el empleo de técnicas moleculares en las ciencias de la salud.
Utilizar técnicas de diagnóstico molecular.
Las prácticas son el apoyo y la extensión del curso de Biogenética, el cual está
diseñado para proveer a los programas de Ciencias de la Salud de las conceptualizaciones
científicas pertenecientes a las ciencias básicas, fundamentando el quehacer disciplinar de
los programas adscritos con el método científico desarrollado en disciplinas como la
biología, la genética y la biología molecular, lo que permite un alcance académico de
mayor impacto.
Las prácticas proporcionan a los estudiantes de las ciencias de la salud las
herramientas analíticas necesarias para comprender la relación entre los procesos biológicos
a nivel celular, y su incidencia en el desarrollo de patologías o en el mantenimiento de la
homeostasis corporal. Las prácticas están organizadas en sesiones consecutivas, las cuales
se realizarán en los laboratorios de biología molecular o laboratorios multifuncionales o
similares de la Universidad Cooperativa de Colombia. Cada sesión está estructurada con
una breve introducción teórica de los conceptos más importantes y básicos, necesarios para
la mejor comprensión y desarrollo de la parte experimental que se hará a continuación.
Dicha parte experimental consta de actividades individuales o en grupo. Así mismo, al final
de cada sesión, el profesor puede suministrar un cuestionario que ayudará a consolidar los
aspectos prácticos más relevantes de la sesión.
Para el buen aprovechamiento de las prácticas se debe leer previamente el tema a
desarrollar, el cual puede ser objeto de evaluación. Además, el docente debe de evaluar y
realizar un control de asistencia de los estudiantes.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
7
Capítulo 1
Evaluación de un medicamento anticancerígeno mediante un cultivo celular in vitro
Diana Maryory Gómez-Gallego*
Resumen
Los cultivos celulares son una serie de técnicas que permiten aislar, mantener y
multiplicar células in vitro (“en vidrio”= en recipientes en el laboratorio). Los
cultivos celulares son una herramienta esencial en diversas investigaciones y
aplicaciones biomédicas, se usan por ejemplo en la evaluación de la actividad o
toxicidad de sustancias y fármacos. El objetivo de esta práctica es explicar los
principios básicos sobre las técnicas de cultivos celulares y aclarar por qué el efecto
de un fármaco en el ciclo celular puede ser evaluado mediante estos. Para lograrlo,
se realizarán dos sesiones de laboratorio, en la primera cada equipo de estudiantes
hará su propio cultivo celular manejando técnica aséptica; estos cultivos serán
sometidos al fármaco anticancerígeno, se cosecharán y las células se gotearán en una
placa. En la segunda sesión se realizará un cálculo de índice mitótico (mediante
conteo de la placa), con el cual el estudiante establecerá el efecto del fármaco.
Palabras clave: cultivo celular, cultivo primario, línea celular, ciclo celular,
fármaco anticancerígeno, colcemid.
* Ingeniera biológica y estudiante de maestría en Microbiología y Bioanálisis. Profesora instructora de la
Facultad de Medicina de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected].
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
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Metodología Se llevará a cabo en dos momentos o sesiones diferentes.
Temario que lo apoya Ciclo celular y anticancerígenos.
Objetivos
General Establecer los principios básicos por los cuales una sustancia bioactiva con posibles
efectos anticancerígenos puede ser evaluada mediante cultivos celulares in vitro.
Específicos Evaluar el efecto sobre el ciclo celular de linfocitos de una droga
anticancerígena.
Determinar el efecto de la droga anticancerígena.
Establecer el principio por el cual una droga anticancerígena, que tenga efecto
de acumulación en el ciclo celular, determina su actividad anticancerígena.
Fundamento teórico
Cultivos celulares
“Los cultivos celulares han constituido una fuente de
conocimiento extraordinaria en un amplio abanico de
especialidades de las ciencias básicas y aplicadas a la salud.
Se trata de un conjunto de técnicas que están contribuyendo
de forma decisiva al avance de las ciencias biomédicas por
su aplicaciones diagnósticas e incluso terapéuticas y que
permiten encarar nuevas líneas de investigación orientadas
hacia la industria farmacéutica, la agricultura, la
toxicología, etc.” [1]
Actualmente se entiende por cultivo celular el conjunto de técnicas que permiten el
sostenimiento de células in vitro en condiciones especiales propicias para su
supervivencia y multiplicación, manteniendo al máximo sus propiedades
metabólicas, fisiológicas, bioquímicas y genéticas [2].
El cultivo de células de mamífero nació como una valiosa herramienta de
investigación en 1950 cuando la primera línea celular, HeLa, fue exitosamente
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
9
cultivada a partir de células humanas de cáncer de cérvix. Sin embargo, fue solo
hasta mediados de 1980 que cultivos reproducibles y confiables de células de
mamífero fueron logrados [3].
El desarrollo del cultivo de células ha dado lugar a nuevas aproximaciones
experimentales sobre la fisiología celular, en las cuales las células aisladas y
funcionalmente diferenciadas pueden ser mantenidas en cultivo en condiciones que
permiten la manipulación directa de su medio ambiente y la medición de los
cambios resultantes en la función de un solo tipo de células [3].
Tipos de cultivos celulares
Los cultivos de células animales pueden clasificarse según su capacidad de
adherencia, y según si han sido recientemente aisladas de un órgano determinado o
proceden de células que hayan experimentado algún tipo de transformación.
Según su capacidad para crecer adheridas o no a una superficie determinada, lo
que está muy relacionado con el tipo de célula de la cual derivan, pueden clasificarse
en:
Cultivo en monocapa: generalmente provienen de órganos. Forman una
monocapa que cubre la superficie del recipiente en que están en crecimiento y
su multiplicación es inhibida cuando establecen contacto entre sí.
Cultivo en suspensión: corresponde a células que crecen en medio líquido sin
unirse a una superficie.
Cultivo primario: cuando proviene de células que han sido recientemente
disgregadas de su tejido u órgano original.
Líneas celulares: están constituidas por células que se diferencian genética y
morfológicamente de las células originarias. Pueden provenir de un cultivo
primario sometido a procesos de transformación o de células derivadas de
tumores. Tienen una capacidad ilimitada de división [2, 4].
Aplicaciones de los cultivos celulares
Actividad intracelular: replicación y transcripción del DNA, síntesis de
proteínas, metabolismo energético, metabolismo de fármacos, ciclo celular,
diferenciación, apoptosis.
Flujo intracelular: procesamiento del RNA, receptores de hormonas y su
resultante señal de traducción, tráfico de membrana, flujo de metabolitos,
movilización de calcio, transducción de señal.
Farmacología: acción de una droga, interacciones ligando receptor, resistencia
a un fármaco.
Inmunología: epítopos de la superficie celular, hibridomas, citoquinas y
señalización, inflamación.
Genómica: análisis genéticos, transfección, infección, transformación,
inmortalización, senescencia.
Ingeniería de tejidos: constructos de tejidos, matrices y “scaffolds”, células
madres, propagación, diferenciación.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
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Toxicología: infección, citotoxicidad, mutagénesis, carcinogénesis, irritación,
inflamación.
Interacciones célula-célula: morfogénesis, control paracrino, cinética de la
proliferación celular, cooperación metabólica, adhesión celular y
motricidad, modelos organotípicos para prótesis médicas e invasión.
Productos y secreciones celulares: proteómica, biotecnología, diseño de
biorreactores, etc. [4].
El desarrollo de los cultivos celulares se debió en gran parte a las necesidades
de las dos principales ramas de la investigación médica: la producción de vacunas
antivirales y el estudio de las neoplasias [4].
Requerimientos para un óptimo crecimiento celular
Requerimientos nutricionales
Medios de cultivo: compuesto que brinda a las células los nutrientes esenciales balanceados
cuantitativamente. Contiene aminoácidos, hidratos de carbono, iones inorgánicos,
vitaminas, entre otros.
Suero: compuesto no definido que tiene una gran variedad de componentes con actividad
promotora del crecimiento celular.
Requerimientos fisiológicos
Temperatura: generalmente 37°C
pH: entre 7,2 y 7,4
Tensión de gas (CO2): generalmente 5%
Presión osmótica: Isoosmótica
Humedad relativa: cercana a la saturación (95%)
Requerimientos ambientales
Esterilidad
Técnica aséptica
Esterilización
Antibióticos y fungicidas
Frascos de cultivo [5, 6]
Ciclo celular y cáncer
El ciclo celular representa un proceso fisiológico controlado por medio del cual una célula
se divide para formar dos células hijas. Gracias a este proceso los tejidos crecen en los
organismos pluricelulares. En un organismo en homeóstasis, el equilibrio entre
proliferación y muerte celular programada (apoptosis) se mantiene regulado para garantizar
la integridad de los órganos y de los tejidos del cuerpo.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
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El término cáncer denota un muy amplio y complejo grupo de enfermedades que se
caracterizan por alteraciones del ciclo celular que conducen finalmente a la destrucción de
estos procesos fisiológicos coordinados, lo que tiene como consecuencia un descontrol
celular que ocasiona una proliferación autónoma, desordenada, irreversible y progresiva
[7].
Fármacos anticancerígenos
Diferentes agentes químicos han sido utilizados para el tratamiento del cáncer durante cinco
décadas y todavía siguen teniendo un papel importante. Durante este tiempo, muchas
drogas con diversos mecanismos de acción han sido sintetizadas y adaptadas para uso
clínico.
La mayoría de fármacos quimioterapéuticos anticáncer que se usan en clínica
incluyen agentes que atacan específicamente el ciclo celular con el fin de inhibir el estado
de hiperproliferación de las células tumorales y luego inducir la apoptosis, que es el
resultado deseado de la quimioterapia [8]. Basados en su modo de acción, estos fármacos
quimioterapéuticos pueden subdividirse en grupos distintos: 1) fármacos que interfieren con
la síntesis de ADN; 2) fármacos que introducen daño en el ADN; y 3) fármacos que inhiben
la función del huso mitótico [8-10].
La separación precisa de los cromosomas replicados para ser repartidos a las células
hijas durante la mitosis depende de la formación de un huso bipolar compuesto
principalmente de los microtúbulos (MT). Dado que los MT son estructuras altamente
dinámicas cuya organización espacial es fundamental para la función correcta del huso, los
agentes físicos y químicos que interfieren con el comportamiento de los MT interrumpen
infaliblemente la mitosis [11, 12].
Quizás el más notable de estos agentes químicos es la colchicina, derivada de las
plantas del género Colchicum. La colchicina y su análogo colcemid (menos tóxico) han
sido conocidos por ser potentes inhibidores de la división celular a través de sus efectos
sobre el ensamblaje del huso: este compuesto se une a los monómeros de alfa y beta
tubulina inhibiendo la polimerización de los MT. Dado que la despolimerización no se ve
afectada, el huso mitótico se disocia rápidamente o no se forma y las células se acumulan
en un estado de metafase, en muchos casos por un período prolongado, parando el ciclo
celular [11-13].
Descripción de la actividad a realizar
Primera sesión: cultivo celular primario
Materiales y reactivos
Reactivos
Medio de cultivo RPMI 1640 + glutamax
Suero fetal Bovino _ México
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
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Antibiótico: 10.000 und/ml penicilina; 10.000 µg/ml de streptomicina
L-glutamina 200 mM
Phitohemaglutinina (PHA) (10 µg/ml)
Alcohol etílico 70%
Materiales
Frasco de cultivo T25 falcón
Toallas desechables
Pipeta estéril de 10 mL
Pipeteador
Gradilla para tubos vacutainer
Muestra
1 mL de sangre periférica
Equipos
Cámara de flujo laminar vertical
Incubadora de CO2
Microscopio invertido
Micropipeta y puntas de 100-1000 µL
Micropipeta y puntas de 20-200 µL
Equipo de seguridad personal requerido
Pijama institucional
Bata de laboratorio para fluidos limpia
Tapabocas
Guantes de látex/vinilo
En el caso de personas con cabello largo, sujetador de cabello
Tiempo estimado
20 minutos.
Procedimiento
1. Verificación de condiciones de asepsia, esterilidad y requerimientos para efectuar el
procedimiento de cultivo celular (hecho por el analista del laboratorio).
2. Inicio de la práctica para los estudiantes: desplazamiento del analista con los estudiantes
al cuarto de cultivo.
3. Dentro de la cámara de flujo laminar se realiza lo siguiente:
Adicionar 8,2 ml de medio de cultivo previamente atemperado a 37°C al frasco de
cultivo.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
13
Adicionar 1 ml de sangre periférica.
Adicionar 0,5 ml de suero fetal bovino.
Adicionar 0,1 ml de antibióticos.
Adicionar 0,1 ml de l-glutamina.
Adicionar 0,1 ml de PHA al frasco de cultivo.
Agitar suavemente y llevar a la incubadora de CO2 por 72 horas, con las siguientes
condiciones: 37,5°C, 5% CO2.
Segunda sesión: reconocimiento de mitosis e índice mitótico
Materiales y reactivos
Muestra
Placa con extendidos cromosómicos de la práctica anterior. Recuerde que aquí encontrará
placas con mitosis normales y placas cuyo índice mitótico ha variado por efecto de la droga
anticancerígena; lo anterior se mide con el cálculo del índice mitótico.
Equipos
Microscopio
Equipo de seguridad personal requerido
Bata de laboratorio limpia
Tiempo estimado
2 horas.
Procedimiento
Previo a esta sesión, y tras 71 horas de cultivo, el analista del laboratorio agregará a la
mitad de los cultivos 0,1 mL de la droga anticancerígena y dejará la otra mitad sin el
fármaco. Trascurrida una hora procederá a cosechar la muestra: lavado, centrifugado (para
concentrarlas), hipotonización, fijación, goteo en láminas portaobjetos, tinción y
conservación de las placas.
A los estudiantes en grupos de a cinco se les entregará las placas con extendidos
cromosómicos para observar lo que se describe a continuación, y, con ello, harán el cálculo
en dichas placas del índice mitótico, que finalmente es lo que indica el efecto de la droga
anticancerígena.
Haciendo un uso correcto del microscopio, colocar la placa para empezar a
observarla. Comience un barrido de la placa ordenadamente, como se indica en la figura 1.
13
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
14
Figura 1. Correcto barrido de la placa con extendidos cromosómicos. Laboratorio de
Biología Molecular, Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín
a) Identificación de núcleos activos (color rosado-violeta) e inactivos (color morado). La
principal diferencia es el tamaño; las células que se encontraban en el momento de la
obtención de cromosomas en actividad, presentan núcleos más grandes que las que no
estaban activas en el ciclo celular. Por otra parte, la coloración de los núcleos
inactivos es más intensa.
b) Identificar metafases y, en ellas, distinguir la morfología de los cromosomas.
c) Una vez identificadas las diferentes estructuras a encontrar en la placa, proceda a
calcular el índice mitótico, contando 500 núcleos (entre metafases, núcleos activos y
núcleos inactivos).
IM = Metafases
x 100 (1) Núcleos totales
Núcleos totales= Núcleos activos + Núcleos inactivos + Mitosis= 500
Recordar: la observación en el microscopio debe empezarse en el objetivo de menor valor
(4x), para empezar a enfocar e identificar campos adecuados. Debe pasarse luego al
objetivo de 10x (imagen 1) y por último al de 40x (imagen 2), en el cual se hará el conteo e
identificación de estructuras.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
15
Figura 1. Extendidos cromosómicos de linfocitos T humanos. Aumento 10x. Tomada en el
Laboratorio de Biología Molecular, Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín
Figura 2. Extendidos cromosómicos de linfocitos T humanos. Aumento 40x. Tomada en el
Laboratorio de Biología Molecular, Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
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Ejercicio de aplicación
En la búsqueda de nuevas posibilidades terapéuticas para el tratamiento del cáncer, que
minimicen los efectos colaterales, se han reportado numerosos hallazgos que demuestran
la actividad antitumoral de extractos derivados diferentes especies de macroalgas marinas.
En un trabajo experimental realizado por un grupo multidisciplinar de científicos se
evaluó el efecto antitumoral del extracto de dos especies de macroalgas; específicamente se
realizó una evaluación sobre el efecto en el ciclo celular en células cancerígenas aisladas y
cultivadas de una biopsia de un paciente con diagnóstico de cáncer de encía.
Metodología
Las células en fase exponencial de cultivo fueron tratadas con 20 µg/mL de los diferentes
extractos por un tiempo de 4 horas, al término del cual se detuvo la acción de los extractos
mediante un lavado con medio de cultivo y posterior cosecha de las células (sedimentación,
hipotonización, fijación, goteo en láminas portaobjetos y tinción de las placas). Posterior a
esto, se hace un análisis de índice mitótico mediante recuento en placa (ecuación 1), usando
un microscopio con el objetivo de 40x. Se contaron 1000 células en total por cada
tratamiento utilizado (cada uno de los 2 extractos de algas marinas). Además de los
extractos, se usó como control positivo células tratadas con colcemid, un agente inhibidor
del ciclo celular, y como control negativo, células sin ningún tratamiento.
Resultados
La figura 3 resume los hallazgos encontrados.
Figura 3. Índice mitótico (IM) de los diferentes tratamientos. Elaboración propia.
0%
5%
10%
15%
20%
25%
Controlnegativo
Colcemid Extracto 1 Extracto 2
Índi
ce m
itótic
o (I
M)
Tratamiento
Índice Mitótico (IM) de los diferentes tratamientos
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
17
Análisis
Según los resultados anteriores, responda:
1. ¿Los extractos 1 y 2 tienen efecto en el ciclo celular? ¿Por qué?
2. ¿Cuál fue el agente (colcemid, extracto 1 o extracto 2) que presentó mayor efecto de
inhibición o bloqueo del ciclo celular? ¿Por qué?
3. ¿Sobre qué fase del ciclo celular están actuando los extractos 1 y 2? ¿Por qué?
Bibliografía
[1] Gil-Loyzaga, PE. Cultivo de Células Animales y Humanas. Aplicaciones en
Medicina Regenerativa. Madrid: Visión Libros; 2011.
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ultvos.htm.
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N, Simons K, Small J, Hunter T, Shoton D, editores. Cell Biology. Filadelfia:
Elsevier Science; 2007. p. 13-20.
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83762006000100008&lng=es
[8] Schmidt M, Bastians H. Mitotic drug targets and the development of novel anti-
mitotic anticancer drugs. Drug Resist Updates. 2007; 10(4-5): 162-81.
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Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
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Capítulo 2
Genealogía sanguínea
Víctor Alfonso Solarte-David*
Resumen
Los patrones heredables sanguíneos en las familias constituyen una herramienta
elemental en el análisis de la herencia. Dichos patrones genealógicos sanguíneos son
predecibles y obedecen a los postulados de la genética mendeliana para un carácter o
para alelos múltiples, los cuales determinan el tipo de sangre ABO, ilustrando los
conceptos de dominancia, codominancia y recesividad. La genealogía sanguínea
permite establecer características heredables, útiles en trasplantes, compatibilidad
gestacional y enfermedades, entre muchas otras aplicaciones en áreas como la
epidemiologia. Los patrones sanguíneos en una familia pueden ser fácilmente
analizados mediante la construcción de un árbol sanguíneo genealógico, para lo cual
solo se requieren los datos documentados de los grupos sanguíneos y, en algunos
casos, la hemoclasificación.
Palabras clave: alelo, dominancia, codominancia, recesividad.
* Ingeniero biomédico, especialista y magíster en Biotecnología y doctor en Ciencias Biomédicas de la
Universidad Nacional de Colombia. Actualmente es profesor de tiempo completo de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected].
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
20
Temario al que apoya
Herencia mendeliana y no mendeliana.
Objetivos
Objetivo general
Reconocer las características heredables de tipo sanguíneo según las leyes de Mendel.
Objetivos específicos
1. Realizar la práctica de hemoclasificación.
2. Construcción de un árbol genealógico.
3. Evaluar estadísticamente la probabilidad de la heredabilidad del tipo sanguíneo.
Fundamento teórico
Los llamados grupos sanguíneos humanos obedecen a una clasificación sanguínea en
concordancia con las características de los grupos proteicos ABO o Rh presentes o no en la
membrana de los glóbulos y en el suero. Dicho sistema de clasificación se ha mantenido a
lo largo de las ciencias biomédicas por hechos y registros que datan desde la antigüedad,
según Echeverry [1]. El descubrimiento del sistema ABO se le atribuye a Karl Landsteiner
en 1901, quien recibió el Premio Nobel de Fisiología en 1930 por sus trabajos en la
caracterización de los tipos sanguíneos o sistema ABO. Su denominación de grupos o
sistema proviene de los tres tipos de grupos proteicos identificables en las superficie de los
glóbulos rojos: antígeno “A”, antígeno “B”, o ninguno de los anteriores “O”. Su
conocimiento, papel y efecto en los sistemas humanos radica principalmente en que de ellos
depende el éxito de transfusiones sanguíneas, como lo afirman Lefrere y Berche [2].
En la mayoría de los casos, cada individuo con un grupo sanguíneo porta anticuerpos
contra los antígenos leucocitarios que no posee, de ahí la reacción inmunitaria al ser
transfundido con grupos sanguíneos denominados incompatibles (de diferente tipo
sanguíneo), dando lugar a situaciones de riesgo, tales como hemólisis, anemia, fallo renal,
shock o muerte. El mecanismo mediante el cual se generan anticuerpos contra un antígeno
al que nunca se ha sido expuesto aún no está completamente dilucidado, sin embargo, hay
supuestos teóricos que sostienen que algunos antígenos bacterianos son lo bastante
similares a los antígenos A y B y son estos anticuerpos los que reaccionan contra los
glóbulos rojos incompatibles tras una transfusión, según Kirkwood y Lewis [3].
La heredabilidad de los grupos sanguíneos sigue la dinámica de la llamada herencia
mendeliana para un carácter; los grupos sanguíneos son heredados de los progenitores y
controlados por un solo gen llamado ABO, localizado en el cromosoma 9 (9q34.1-q34.2).
Esta heredabilidad se rige por un sistema de alelos múltiples (L) que determina la presencia
de los aglutinógenos en los glóbulos rojos, y que son los siguientes:
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21
LA, que determina el aglutinógeno A.
LB, que determina el aglutinógeno B.
LO, que no determinan aglutinógeno alguno.
Los alelos múltiples que determinan el tipo de sangre ABO permiten ilustrar los
conceptos de dominancia, codominancia y recesividad, lo que explica que las personas
posean tipos sanguíneos AA, AB, BB, AO, BO, OO, con base en la recombinación alélica de sus
padres.
Los individuos tipificados con el grupo sanguíneo A poseen glóbulos rojos que
expresan proteínas antigénicas de tipo A en su superficie, y anticuerpos contra los antígenos
B en el suero de su sangre. Caso contrario, los individuos tipificados con el grupo
sanguíneo B poseen glóbulos rojos que expresan proteínas antigénicas de tipo B en su
superficie y anticuerpos contra los antígenos A en el suero de su sangre. Los individuos con
sangre del tipo O no expresan ninguno de los dos antígenos (A o B) en la superficie de sus
glóbulos rojos, pero pueden producir anticuerpos contra ambos tipos; en cambio, los
individuos tipificados AB expresan ambos antígenos en su superficie y no producen ninguno
de los dos anticuerpos. Con base en lo anterior, el tipo O puede ser transfundido sin ningún
problema a cualquier persona donante de sangre con cualquier tipo sanguíneo del grupo
ABO y el tipo AB puede recibir sangre de cualquier donante, todo esto teniendo en cuenta el
grupo Rh, como lo anotan Dodd, Lincoln y Soto [4].
Dipta y Hossain afirman que existen otros tipos de grupos sanguíneos, tales como
Bombay, el cual es poco frecuente y en este se heredan dos genes recesivos del tipo hh en
correspondencia con el fenotipo denominado Oh, y, por tanto, no producen la proteína H
que es la precursora de los antígenos A y B. De esta forma, no supone ningún problema la
presencia de anticuerpos A o B en el suero pues los antígenos respectivos no son
producidos al no existir su precursor. Las personas con este grupo sanguíneo, sin embargo,
sí producen anticuerpos para H, el cual está presente en los glóbulos rojos excepto en
aquellos con fenotipo hh, por tanto solo son compatibles con donantes del mismo tipo hh.
Es decir, las personas con el grupo sanguíneo con el fenotipo Bombay pueden ser
únicamente transfundidas con personas del mismo grupo sanguíneo [5].
Factor Rh
El factor Rh (encontrado en el mono Rhesus, de ahí su nombre factor Rh) fue descubierto
por Karl Landsteiner y Wiener en 1940. El factor Rh, al igual que los antígenos
eritrocitarios, se define como una proteína estructural de membrana anclada a las células
sanguíneas dándoles una entidad particular y que, como ABO, tiene la condición de ser
aglutinógena de los glóbulos rojos; dicha proteína es codificada por la acción de 3 genes
alelos. Se define como individuos con fenotipo Rh positivo aquellos que expresan el
antígeno D en sus eritrocitos y Rh negativo quienes no presentan este antígeno (el 85% de
la población lo posee aproximadamente). Existen variaciones o polimorfismos en la
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22
secuencia de aminoácidos de esta proteína, identificándose más de 45 variantes antigénicas
del factor Rh, lo que da lugar a diferentes tipos poblacionales, según Kirkwood y Lewis [3].
Su importancia radica en los procesos de transfusión clínica, de ahí que el
conocimiento previo de estas características proteicas eritrocitarias en los pacientes sea
fundamental para no poner en riesgo la vida. La transfusión de sangre de un individuo Rh+
a un Rh- conduce a la formación, lo que conlleva a la aglutinación de la sangre y, por tanto,
a la formación de coágulos en el torrente sanguíneo. De igual modo, se puede producir una
reacción inmunitaria en el caso de las mujeres gestantes al momento del parto por
diferencias entre el factor Rh de la madre en relación con el del hijo; si la madre es Rh- y el
feto es Rh+ y posee los anticuerpos contra Rh+, puede destruir las células Rh+ del feto. En
este caso se recomienda que si la madre decide tener un segundo hijo deberá someterse a
tratamientos que limiten los anti-Rh [6].
Genograma
El patrón de segregación o heredabilidad de los antígenos del sistema ABO y del Rh a nivel
familiar es importante y útil en el campo de la genética médica ya que, desde el punto de
vista de las probabilidades, muestra mediante los llamados genogramas (o mapas
genealógicos) una correlación hereditaria de estos genotipos y fenotipos. La construcción
de un genograma consiste en un formato que permite dibujar un árbol genealógico que
registra información sobre los miembros de una familia y la relación entre sus generaciones
cercanas, mostrando características hereditarias específicas que se quieran rastrear. Para su
creación se hace uso de símbolos cuyo reconocimiento, interpretación y uso es conocido y
avalado por la comunidad científica [7, 8].
En la tabla 1 se muestran los simbolismos más importantes para construir un
genograma [8].
Tabla 1. Simbolismos utilizados en la construcción de genogramas
Símbolo Significado
Hombre
Mujer
Sujeto principal
Fallecido
Embarazo
Muerte al nacer
Aborto espontaneo
Aborto inducido
Adoptado
Mellizos (igual en mujeres)
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23
Gemelos (igual en mujeres)
Nota. McGoldrick y Gerson [8]
Descripción de la actividad a realizar
Materiales y reactivos
Información de grupos sanguíneos familiares.
Equipo de seguridad personal requerido
Ninguno.
Tiempo estimado
1 hora y 45 minutos.
Genograma familiar
Recopilar en lo posible la mayor cantidad de información familiar tras las generaciones con
su correspondiente tipo sanguíneo personales y construir el genograma. Indique las
probabilidades de heredabilidad al tipo de sangre en cada persona, edad y si presenta
patologías que puedan asociarse a la herencia, entre otros que usted considere pertinentes.
Ejercicios
Analiza los siguientes casos clínicos.
Caso 1.
En el siguiente árbol genealógico (figura 1) realizado a un mamífero con cariotipo 60, XY
(XX: hembra, XY: macho), se indica la transmisión de una anomalía genética (ilustrada con
los círculos y cuadrados en color gris), la cual lleva a una enfermedad neurodegenerativa en
su adultez. Estudios clínicos muestran que la anomalía se produce por un solo gen ligado al
sexo, y está situado en el cromosoma X.
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24
Figura 1. Árbol genealógico. Elaboración propia.
1. Explica si la anomalía es de tipo dominante o recesivo.
2. Indica los posibles genotipos para los individuos con la anormalidad (letra “A” para
alelo dominante, letra “a” para alelo recesivo).
3. Contando solo son la información dada en este caso, ¿considera usted que el carácter
podría ser autosómico?
4. ¿Qué recomendaciones daría usted a una pareja que desea tener hijos, si se sabe que en
la familia por parte de la mujer se presenta esta anomalía genética?
5. Si el padre tiene el síndrome y la madre no, ¿qué probabilidad tiene el hijo de padecer el
síndrome?
Caso 2
El siguiente árbol genealógico (figura 2) muestra en gris personas albinas. A partir de este
establecer si el albinismo está determinado por un gen dominante o recesivo y si está ligado
o no al sexo.
Figura 2. Árbol genealógico. Elaboración propia
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25
Bibliografía
[1] Echeverry MA. Grupo sanguíneo y factor Rh en los vascos. Buenos Aires: s.n.; 1949.
[2] Lefrere JJ, Berche P. Karl Landsteiner discovers the blood groups. Transfus Clin
Biol. 2010 (Feb); 17(1): 1-8.
[3] Kirkwood EM, Lewis CJ. Inmunología médica básica. 2 ed.; 1990.
[4] Dodd BE, Lincoln PJ, Soto A. Inmunología de los grupos sanguíneos. México: El
manual moderno; 1976.
[5]
Dipta TF, Hossain AZ. The Bombay blood group: are we out of risk? Mymensingh
Med J. 2011 (Jul); 20(3): 536-40.
[6] Scheffer PG, de HM, van der Schoot CE. The controversy about controls for fetal
blood group genotyping by cell-free fetal DNA in maternal plasma. Curr Opin
Hematol. 2011 (Nov); 18(6): 467-73.
[7] Lasanta Sáez MJ. Instrumentos para el conocimiento de la familia: el genograma.
[8] McGoldrick M, Gerson R. Genogramas en la evaluación familiar. Barcelona: Gedisa;
2005.
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27
Capítulo 3
Dermatoglifos
Víctor Alfonso Solarte-David*
Resumen
Este capítulo intenta promover en el estudiante el reconocimiento la genética
asociada a los dermatoglifos a través del reconocimiento de los principales patrones
normales de las líneas dermatopapilares de las manos y los pies, expresando los
resultados en una fórmula dactiloscópica resumida. Con base en el temario, la
fundamentación teórica y las actividades que se proponen, se espera que el
estudiante logre establecer la frecuencia de los patrones palmares; comparar los
patrones individuales con los padres y hermanos para establecer el tipo de herencia
de estos rasgos; discutir las aplicaciones de estos estudios en las poblaciones como
marcadores genéticos y como ayuda diagnóstica para algunos síndromes genéticos;
reconocer la gran variabilidad que puede presentar una característica determinada
por varios pares de genes; realizar la verificación de la distribución continua y
normal de una característica poligénica; manejar los parámetros estadísticos en el
procesamiento de datos de rasgos genéticos multifactoriales; y, establecer relaciones
entre algunas características específicas de estos rasgos en su grupo con otros rasgos
diferentes no patológicos.
Palabras clave: dermatoglifos, genética, líneas dermatopapilares.
* Ingeniero biomédico, especialista y magíster en Biotecnología y doctor en Ciencias Biomédicas de la
Universidad Nacional de Colombia. Actualmente es profesor de tiempo completo de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected].
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28
Temario que lo apoya
Penetrancia.
Expresividad.
Pleiotropía.
Fenotipos influidos por el sexo.
Herencia mitocondria.
Mosaicismo somático.
Mosaicismo germinal.
Huella genómica.
Síndromes de Prader-Willi y de Angelman.
Disomía uniparental.
Inactivación del x.
Mutaciones dinámicas.
Características principales de la población humana.
Ley de Hardy-Weinberg.
Equilibrio Hardy-Weinberg.
Factores que modifican el equilibrio.
Estratificación.
Unión dirigida.
Consanguinidad.
Selección natural.
Deriva génica.
Cuellos de botella.
Efecto fundador.
Migración.
Aplicaciones de la ley de Hardy-Weinberg.
Cálculo de riesgos.
Árbol genealógico e interrogatorio familiar.
Exploración física en genética clínica.
Dermatoglifos.
Objetivos
Objetivo principal
Reconocer la genética asociada a los dermatoglifos.
Objetivos específicos
1. Reconocer los principales patrones normales de las líneas dermatopapilares de las manos
y los pies, expresando los resultados en una fórmula dactiloscópica resumida.
2. Establecer la frecuencia de los patrones palmares entre los estudiantes de la clase.
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29
3. Comparar los patrones individuales con los padres y hermanos para establecer el tipo de
herencia de estos rasgos.
4. Discutir las aplicaciones de estos estudios en las poblaciones como marcadores
genéticos y como ayuda diagnóstica para algunos síndromes genéticos.
5. Reconocer la gran variabilidad que puede presentar una característica determinada por
varios pares de genes.
6. Realizar la verificación de la distribución continua y normal de una característica
poligénica.
7. Introducir al estudiante en el manejo de parámetros estadísticos en el procesamiento de
datos de rasgos genéticos multifactoriales.
8. Establecer relaciones entre algunas características específicas de estos rasgos en su
grupo con otros rasgos diferentes no patológicos.
Fundamento teórico
Las primeras referencias sobre el uso de las impresiones digitopalmares datan de antiguos
documentos chinos encontrados en cavernas, las cuales eran usadas, según se supone, para
identificación de un individuo. Entre 1684 y 1686 se describieron científicamente por
primera vez las figuras palmares y planares formadas por la epidermis de algunos primates.
Esta descripción fue hecha por Grez, Bidloo y Malphighi. En 1823 Purkinge clasificó las
“huellas dactilares” en nueve tipos diferentes y, más tarde, Faulds y Herschel, las
introdujeron como factor de identificación personal. En 1888 Galton publicó un trabajo en
el cual clasificaba las impresiones digitopalmares en tres categorías: arcos, presillas y
verticillos. Galton indicaba, además, en su trabajo la metodología para operar con estas
impresiones. De esta manera nació la aplicación de estas características en el estudio de la
genética humana [1-3].
Con el término dermatoglifos, propuesto por Cummins en 1926, se designan las
crestas dermopapilares y sus configuraciones. Los dermatoglifos son consecuencia de
modificaciones especializadas de la piel que resultan en ondulaciones de su porción
epidérmica [4]. Estas ondulaciones están presentes en la palma y en superficies digitales de
la mano, en la planta y en las superficies digitales de los pies [5]. Las áreas donde se
presentan los dermatoglifos o crestas dermopapilares están desprovistas de glándulas
sebáceas, de pelos y tienen cierto grado de pigmentación, pero abundan en estas áreas
terminaciones nerviosas. El significado funcional y evolutivo de las crestas dermopapilares
probablemente esté relacionado con funciones tactiles-sensitivas y de afinamiento de la
capacidad prensil [3].
Los dermatoglifos se diferencian embriológicamente durante el curso del cuarto mes
de vida fetal y se elevan a la superficie de la piel tiempo después, primero en la pulpa de los
dedos, luego en la palma y finalmente en la planta de los pies. Una vez formados no sufren
alteraciones o modificaciones debidas al ambiente en el curso de toda la vida del individuo.
Sin embargo, durante el periodo de vida intrauterina en que los dermatoglifos están en
formación, pueden verse alterados por factores que interfieren en el normal desarrollo
embrionario [5, 6]. Estos factores pueden ser genéticos, como las alteraciones
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30
cromosómicas numéricas y estructurales, o ambientales, tales como los efectos
teratogenéticos inducidos por enfermedades maternas o el uso de drogas y alcohol durante
el embarazo. Respecto al tipo de herencia de estos caracteres hay consenso en que se trata
de rasgos de herencia poligénica, con mayor heredabilidad que muchos otros caracteres
antropométricos, ejemplos también de herencia poligénica [7].
Dada su transmisión hereditaria, son patrones únicos para cada individuo que
muestran una gran diversidad tanto por sus detalles como por las combinaciones que
presentan en una persona determinada. Además, existen variaciones considerables en las
frecuencias de las diferentes configuraciones dermatoglíficas tanto en los dos sexos como
en los diferentes grupos étnicos, desde el punto de vista embriológico y genético [8].
En la actualidad existe una gran cantidad de trabajos en los cuales relacionan las
diferentes configuraciones con factores tales como raza, grupos sanguíneos, aberraciones
cromosómicas y desórdenes metabólicos hereditarios. Dichos estudios son posibles debido
a que estas huellas no sufren ninguna alteración después de que se han formado
embriológicamente, entre el tercero y séptimo mes de vida intrauterina. Los estudios sobre
dermatoglifos destacan la relación de ciertos patrones anormales con una serie de
síndromes genéticos y cromosómicos, como son la trisomia 21 (síndrome de Down), turner,
patau, entre muchos otros [9].
Las poblaciones muestran diferentes tipos de disposiciones dermatoglíficas:
Los patrones dérmicos normales están presentes en la mayoría de la población.
Los inusuales están presentes en un porcentaje pequeño de la población sana y en
algunos de los síndromes malformativos.
Los anormales están presentes en un alto porcentaje de síndromes malformativos
de origen mono o poligénicos, cromosómicos o ambientales y también en alguna
ocasión en personas sanas.
Los dermatoglifos están relacionados con las crestas epidérmicas (figura 1) que
forman un sistema de líneas paralelas en campos pequeños de la superficie del
estrato corneo. Los poros de las glándulas sudoríparas se localizan a lo largo del
centro de estas crestas. Las depresiones entre las crestas se conocen como surcos.
Internamente, bajo la epidermis, se encuentra el estrato germinativo, los pliegues
glandulares y los pliegues de los surcos [9].
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
31
Figura 1. Representación diagramática de los pliegues de la piel con la nomenclatura de las
estructuras de la epidermis y la dermis. Andrade et al. [9]
La nomenclatura empleada para identificar las diferentes áreas en las manos se
muestra en las figuras 2 y 3.
Figura 2. Nomenclatura y posición de áreas y trirradios en manos. Andrade et al. [9]
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32
Figura 3. Nomenclatura y posición de áreas y trirradios en pies. Andrade et al. [9]
Dimensiones
El ancho entre dos crestas es la distancia existente entre los puntos centrales de dos crestas
consecutivas. Para calcular esta distancia promedio se traza una línea de un centímetro que
corte en ángulo recto una serie de crestas y se cuenta el número de ellas cortado por la
línea. Para cuantificar las impresiones dactiloscópicas se emplea también el conteo total de
crestas o CTC (figura 4).
Figura 4. Conteo de crestas en los arcos. (a) Por definición, carecen de trirradios y el
conteo de crestas es 0-0. (b) Los bucles con el trirradio tienen en este caso 16-0. (c) En el
espiral, el número de crestas a cada uno de los trirradios puede ser diferente: 10-16.
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33
Para esto se cuenta en cada una de las impresiones digitales el número de líneas que
son cortadas por una recta que une el centro geométrico del trirradio con el centro de la
configuración palmar (figura 5).
Figura 5. Los trirradios están conformados por la confluencia de tres sistemas de crestas:
(a) el centro geométrico de confluencia del trirradio se denomina punto del trirradio.
Idealmente es la confluencia de las tres líneas, puede estar representado por un punto (b), p
la terminación de una cresta (c). En otros casos (d, e) están en espacios abiertos
intersticiales.
Principales configuraciones
Algunos elementos pueden ser detallados en el estudio exacto de los dermatoglifos, algunos
de ellos se identificarán según la nomenclatura empleada para su descripción (figura 6).
Figura 6. Nomenclatura empleada en la descripción de las formas finas que presentan las
crestas. Andrade et al. [9]
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34
Isla o punto: es una pequeña cresta de forma redondeada que contiene un solo poro.
Cortada: es un fragmento de una cresta más largo que una isla y puede contener dos o tres
poros.
Línea intersticial: es una pequeña línea angosta, muy rara vez contiene poros; en general,
son más bajas que las crestas y no se consideran cuando se hace el conteo de crestas.
Cerco: es una bifurcación y posterior unión de una cresta que rodea un surco formando una
laguna.
Bifurcación: es la división de una línea formando una Y.
Peine: es la configuración de una línea en la cual tres o más crestas confluyen.
Anastomosis: es la unión de dos líneas por intermedio de una línea subsidiaria.
Campos abiertos
Son áreas llenas de líneas paralelas o casi rectas. Se designan generalmente con la letra
“O”. Entre las configuraciones más frecuentes en estas áreas están los arcos, que se forman
cuando las líneas son un poco curvas, y los abanicos, que se forman en áreas por múltiples
bifurcaciones de las crestas. Si las bifurcaciones se hacen en sentidos opuestos, el resultado
es una configuración que se conoce como escalera.
Trirradios
Los trirradios se forman cuando hay discontinuidad en líneas paralelas. Geométricamente,
el punto del trirradio (figura 5a) es el punto de encuentro de tres líneas radiales que hacen
entre ellas ángulos cercanos a 120°. En la figura 5 se presentan los diferentes tipos de
confluencia de las líneas; en cada caso el punto geométrico del trirradio se encuentra
marcado con un círculo. Idealmente, el trirradio está representado por una bifurcación de la
cual irradian tres líneas; algunas veces el centro está marcado por una isla (figura 5b) o por
el fin de una cortada (figura 5c). En algunos casos el centro geométrico no reposa sobre
ninguna línea (figura 5d y 5e). Si el trirradio ocurre en una región con un peine, el punto
geométrico se toma en el punto donde los tres ángulos sean lo más cercano posible a los
120° (figura 5e). Las configuraciones con arcos verdaderos carecen de trirradios.
Impresiones digitales
En las impresiones digitales se reconocen tres tipos principales de configuraciones:
presillas, verticilos o torbellinos, y los arcos.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
35
Figura 7. Las presillas (L). Pueden ser de diferentes tipos: a) varilla: cuando están
conformadas por líneas caso paralelas con una cresta central, b) en forma de aro o argolla
cuando el centro es libre, c) presilla convergente o invadida, y d) ganchosa o nutable. Los
arcos en tienda e) son los únicos arcos que poseen trirradio. Andrade et al. [9]
Presillas o asas (L): generalmente son configuraciones formadas por líneas que
entran y emergen por el mismo margen del modelo, poseen solamente un trirradio, situado
al lado opuesto de donde se abre el dibujo. Las presillas pueden ser de diferentes tipos
(figura 7): en varilla, cuando están conformadas por líneas casi paralelas con una cresta
central (figura 7a), o en forma de aro o argolla cuando el centro es libre (figura 7b); en la
figura 7c se esquematiza la presilla convergente o invadida, y en la figura 8d la ganchosa o
nutable; los arcos en tienda (figura 7e) son los únicos arcos que poseen trirradio. Algunas
configuraciones presentan un patrón característico de dos trirradios, como las presillas
dobles o los verticilos (figura 7d y 7e). Tres trirradios son también posibles en confi-
guraciones que presentan verticilos y presillas, como la esquematizada en la figura 12.
Las presillas pueden ser:
Cubitales: cuando el modelo se abre hacia la línea media del cuerpo (o hacia el dedo
meñique) estando este en posición anatómica. Posee un solo trirradio, situado al lado
opuesto de donde se abre el dibujo.
Cuando el modelo se abre hacia fuera de la línea media del cuerpo (o hacia el dedo
pulgar) posee un solo trirradio.
En la figura 8 se muestra una presilla; si esta figura corresponde a la mano derecha, es
asa radial, y si pertenece a la mano izquierda corresponde a un asa cubital.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
36
Figura 8. Presilla
Verticilos rizos o remolinos (W): este grupo incluye todas las muestras cuyas líneas
presenta contornos circulares en forma de “S”, elípticas o espiriliformes. Los verti¬cilos
constituyen los patrones más complejos y variables. Una forma simple (w) consta de un
patrón concéntrico circular o elíptico (figura 9a y 9b). Las configuraciones pueden ser muy
variadas (figura 9), y se pueden encontrar figuras con dos o tres trirradios, los cuales se
diferencian por la configuración central y la orientación de las figuras.
Generalmente pueden ser de dos tipos:
Verticilo simétrico: formado por líneas concéntricas. Posee dos centros y dos
trirradios situados a lado y lado del dibujo (figura 9a).
Verticilo espiral: formado por líneas en espiral. Posee un centro y dos trirradios
a lado y lado del dibujo (figura 9b).
Figura 9. Verticilos simples (a y b) y bucles o asas dobles. Andrade et al. [9]
Arcos (A): con configuraciones formadas por líneas que van de uno a otro margen del dedo
y que forman elevaciones en el eje medio de este, lor arcos pueden ser:
35
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
37
Arco plano o simple: cuando las elevaciones son suaves y no poseen trirradio (figura
4a).
Arco tienda: cuando las elevaciones son pronunciadas y poseen un trirradio, situado
hacia el eje medio de la configuración (figura 7e).
Existen otras configuraciones más complejas y menos frecuentes como:
Presilla doble o verticillo-presilla: posee dos centros y dos trirradios situados a lado y lado
del dibujo. Para lo relacionado con el recuento de crestas se lo considera verticilo (figura
10).
Arco atienda prensilla (figura 11).
Verticilos con tres trirradios.
Verticilo-presilla con los dos trirradios a un mismo lado.
Configuraciones sin trirradios.
Figura 10. Presilla doble o verticillo-
presilla
Figura 11. Arco atienda prensilla
La palma de la mano
Existen seis áreas bien definidas que corresponden a las regiones o los plie¬gues
embrionarios. Estas son las áreas hipotenares (figura 2, H), tenares (Th), y las interdigitales
I, II, III y IV. Normalmente existen cuatro trirradios interdigitales en la base de los dedos y
son denotados con a, b, c, d (figura 2). Un trirradio adicional puede presentarse en el área
interdigital y en esos casos se denota como a’, b’, c’, d’, según el área interdigital en la cual
se encuentre localizado.
Trirradios hipotenares: el principal es un trirradio localizado en la palma y próximo
al lugar de pliegue de la mano, normalmente en el eje o cerca del eje del cuarto
metacarpiano, y se conoce como t (tabla 1). Cuando la posición de este trirradio es más
distal, tiene el aspecto de una T invertida, cuyo pie estaría dirigido hacia la eminencia
hipotenar, a la que se le llama t’. La posición t” es mediopalmar, muy distal y tiene forma
de Y mayúscula. Una medida objetiva para la situación de t viene representada por la
mag¬nitud del ángulo que forman los trirradios extremos a y d con el trirradio t,
37
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
38
denominado ángulo de Penrose, o atd (figura 13). El ángulo atd tiene diferentes valores
según sea la localización del trirradio t; en individuos normales tiene un valor promedio de
48º, y cuando se forma un ángulo mayor de 56º el ángulo recibe el nombre de distal. Para
determinar la posición del trirradio t, se mide el ángulo atd; los tres puntos pueden ser
localizados con exactitud, pero si el trirradio t está colocado hacia el lado cubital de la
palma, como ocurre algunas veces con individuos que padecen el síndrome de Down, la
abertura del ángulo no indicará su posición distal. Además, algunos piensan que como la
mano tiende a ser más larga y estrecha con la edad de la persona, el valor del ángulo
dependerá en gran parte de la edad.
Por último, pueden encontrarse diferencias hasta de 10º en la medición del ángulo, lo
cual depende de si los dedos están separados o superpuestos en el momento de tomar la
huella de la palma.
Ocasionalmente, puede encontrarse más de un trirradio axial, en este caso, para la
medición del ángulo atd se tiene en cuenta el más distal.
Tabla 1.
Tipo de posición del ángulo de Penrose según su medida
Nota. Elaboración propia
Figura 12. Varios tipos de patrones en el área hipotecar. W, verticilos: L, bucles; T, arcos
en tienda; A, arcos simples. Los superíndices determinan la dirección: r, radial; u, ulmar; c,
calpar; d, patrón doble; s, espiral. Andrade et al. [9]
Medida del ángulo
Tipo de posición
<45°
Posición t
45°-56°
Posición t’
‘ > 56°
Posición t”
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
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Figura 13. Medida del ángulo atd de la palma de la mano. Observe que entre más distal
esté el trirradio t, més pequeño es el ángulo. Andrade et al. [9]
Pliegues de flexión
Son diferentes a los dermatoglifos, pero se asocian con estos. En la palma suele haber tres
de ellos, aunque en algunos casos los dos pliegues distales se pueden fusionar formando un
solo horizontal. Esta única línea resultante se ha denominado de diferente manera: pliegue
del simio, línea de los cuatro dedos, pliegue transversal único (figura 14).
Figura 14. Pliegues de flexión. Andrade et al. [9]
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Relación entre dermatoglifos y algunos rasgos patológicos y no patológicos
1. En algunos síndromes, los valores promedio del ángulo atd soncomo se muestra en la
tabla 2.
Tabla 2.
Relación entre dermatoglifos y algunos rasgos patológicos y no patológicos
Síndrome Ángulo
Turner (X0) 66º
Down (trisomia 12) 81º
Patau (trisomia 18) 108º
Nota. Elaboración propia
2. Con los grupos sanguíneo. Ciertos autores han encontrado relaciones con los grupos
sanguíneos del sistema ABO y el sistema MN, con el sistema Lewis, con el factor Rh, etc.
Hesh dice que existe una posible relación entre rizos y el grupo B, y entre asas y el
grupo A.
3. Con la estatura. Algunos sugieren que hay un mayor número de rizos en personas altas.
Fórmula dactiloscópica
La fórmula dactiloscópica consiste en la expresión resumida, por medio de símbolos, de los
patrones dermatoglíficas verificados en los dedos de las manos. Se presenta según el
sistema propuesto por Vucetich (1858-1925), famoso dactiloscopista yugoslavo, como una
fracción en la cual el numerador resume los patrones de los dedos de la mano derecha y el
denominador los de la mano izquierda. Según este sistema, todos los arcos están designados
por la letra A en el pulgar y el número 1 en los otros dedos. Los verticilos son designados
por la letra V en el pulgar y con el número 4 en cualquiera de los otros dedos. Las presillas
se consideran internas cuando el trirradio está a la derecha del observador y se designan con
la letra I (en el pulgar) y con el número 2 para los otros dedos. La letra E y el número 3 se
emplean para presillas externas, con el trirradio izquierdo o externo.
Ejemplo: E-3333/I-2222
Significado: mano derecha, presillas externas que se abren para el lado ulnar en todos los
dedos. En la izquierda, todas son presillas internas.
La planta del pie
Las impresiones plantares son homólogas a las verificadas en las palmas de las manos,
como se observa en la figura 3b. Las únicas diferencias con¬sisten en considerar el área
tenar como distal si está cerca del área halucal (del dedo gordo), y proximal, la cercana al
calcáneo. Con respecto a los trirradios correspondientes a los dedos II a V, son designados
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como a, b, c, d, respectivamente. El trirradio de la región halucal se denota como e, y,
dependiendo de su posición, pueden ser empleadas las letras e para el más proximal y e’
para el más distal.
Un trirradio generalmente muy próximo al área halucal es el trirradio p (proximal).
Cuando está desplazado hacia el área hipotenar distal puede llamarse p’ o p” dependiendo
del desplazamiento.
Descripción de la actividad a realizar
Materiales
Papel para dermatoglifos
Tinta
Rodillo
Talcos
Tiza
Fotocopiadora
Estereoscopio
Regla milimetrada
Compás de dos puntas
Transportador
Equipo de seguridad personal requerido
Pijama institucional
Bata de laboratorio
Tiempo estimado
Una hora y 45 minutos.
Procedimiento
Recolectar los datos dactilopalmartes necesarios y plantear la fórmula dactiloscópica de
usted y sus padres, según convención que aparece en la tabla 3
Tabla 3.
Convenciones para recolectar datos dactilopalmartes
Arcos A ---- pulgar 1 ---- otros dedos
Presillas, tirradio a la derecha Interna o tenar I ----- Pulgar 2 ---- otros dedos
Tirradio a la izquierda Externa o Ulnar E ---- pulgar 3 ---- otros dedos
Vertilicios V ---- pulgar 4 ---- otros dedos
X: si no puede definir por cicatriz o daño de la impresión
Nota. Elaboración propia
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Diligenciar las siguientes tablas.
Fórmula observada:
Mano
Pulgar
índice
Medio
Anular
Meñique
Derecha
Izquierda
Ejemplos:
1. Fórmula observada:
Mano
Pulgar
índice
Medio
Anular
Meñique
Derecha
V
4
4
4
4
Izquierda
V
4
4
4
4
2. Fórmula observada:
Mano Pulgar índice Medio Anular Meñique
Derecha
A
3
3
4
1
Izquierda
V
2
2
2
2
Mano derecha: arco en el pulgar, presillas en los dedos índice y medio, verticilo en el
anular y arco en el meñique. Mano izquierda: verticilo en el pulgar, presillas tenares o
internas en los otros dedos.
Conteo total de crestas (CTC).
Otro de los parámetros descriptivos de las impresiones dactilares es el CTC, que se
efectúa trazando con lápiz una línea (línea de Galton) entre el trirradio más próximo y el
centro nuclear de la figura.
Nota: No se cuentan las líneas del trirradio.
Si la figura tiene dos trirradios (verticilos, círculos concéntricos, etc.) se considera el conteo
mayor.
Par los arcos en tienda, arcos planos y abanicos que no tienen trirradio, su conteo es de
cero. CTC = Conteo del número de líneas en las impresiones de los diez dedos.
Conteo total de crestas (CTC):
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43
Mano
Pulgar
índice
Medio
Anular
Meñique
Total
Derecha
Izquierda
Localizar los trirradios digitales a, b, c, d. Si existen otros adicionales se designarán como
a’, b’, c’, d’.
Localizar los trirradios palmares y determinar si hay uno o más y describir su
posición: trirradio axial proximal (t), en forma de Y invertida, axial distal (t”), una Y en
posición normal, o un trirradio en posición intermedia entre t y t’.
Para clasificar el trirradio palmar puede usarse el ángulo de Penrose: atd. Este ángulo
es formado por los segmentos de recta que se trazan uniendo los trirradios digitales a y d
con el trirradio palmar. Entre más distal esté el trirradio palmar menor será el ángulo atd. Se
considera que es t para ángulos menores de 58º.
Bibliografía
[1] Gómez BD. Determinación de patrones dermatoglíficos digitales en un grupo de la
Universidad de Antioquia y la universidad de San Buenaventura. Medellín. [Tesis de
grado]. Universidad de Antioquia, Medellín; 1977.
[2] Thompson and Thompson. Genética médica. Ed. Salvat. S.A.; 1968.
[3] Beiguelman B. Citogenética humana. Río de Janeiro: Guanabara Koogan; 1982
[4] Egozcue J, Antich, J, Ballesta F et al. Genética médica. Barcelona: Es-paxs; 1976.
[5] Penrose LS. Memorandun on Dermatoglyphic Nomenclature. Birth Defects Orig
Series IV. 1968; (3): 1-13.
[6] Schaumann B, Alter M. Dermatoglyphics in medical disorders. New York:
Springer-Verlang; 1976.
[7] Vargas MV. Dermatoglifos en individuos con síndrome de Down. [Tesis para optar
el título de bióloga], Universidad Nacional de Colombia, Bogotá; 1982.
[8] Thompson JS, Thompson MW. Genética Médica. Salvat Editores, S.A; 1979.
[9] Andrade E, Bueno ME, Burbano C, Chaparro A, García LF, Matta N, Nates G,
Usaquén W. Manual de guías de laboratorio. Genética mendeliana, poblaciones,
citogenética y genética molecular. Bogotá: Universidad Nacional de Colombia,
Facultad de Ciencias, Departamento de Biología, Unidad de Genética y Biología
Molecular; 2006.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
45
Capítulo 4
Extendidos cromosómicos
Víctor Alfonso Solarte-David*, Diana Maryory Gómez-Gallego**
Resumen
Los extendidos cromosómicos permiten examinar el material nuclear condensado en
metafase, siendo actualmente la metodología básica implementada en el estudio de
cariotipos. Son útiles en el diagnóstico de enfermedades y síndromes relativos a
ganancias o pérdidas importantes de material genético, y, con tratamientos
adecuados, pueden ser teñidos con patrones de bandas, que permiten determinar
cambios estructurales importantes en el diagnóstico de enfermedades, sirviendo
también en la determinación de polimorfismos poblacionales y aspectos de
reproducción, entre muchas otras aplicaciones a nivel de investigación. La obtención
de extendidos cromosómicos presenta limitantes respecto a la cantidad de células y
la necesidad de que estas sean cultivadas in vitro, sin embargo ofrecen un
acercamiento importante como modelos para el desarrollo de nuevos fármacos.
Palabras clave: cariotipo, cromosomas, fases del ciclo celular, modelo in vivo/vitro.
* Ingeniero biomédico, especialista y magíster en Biotecnología y doctor en Ciencias Biomédicas de la
Universidad Nacional de Colombia. Actualmente es profesor de tiempo completo de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected]. ** Ingeniera biológica y estudiante de maestría en Microbiología y Bioanálisis. Profesora instructora de la
Facultad de Medicina de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected].
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Temario que lo apoya
Cultivo celular y obtención de extendidos cromosómicos.
Objetivos
Objetivo principal
Obtener cultivos primarios a partir de sangre periférica humana, estableciendo los
principios básicos de cultivo celular in vitro.
Objetivos específicos
1. Establecer los principios básicos para la obtención de extendidos cromosómicos a partir
de cultivos primarios de sangre periférica humana.
2. Identificación de estructuras cromosomales.
3. Adquirir pautas básicas para el reconocimiento de los cromosomas humanos en el
microscopio.
Fundamento teórico
Extendidos cromosómicos
El laboratorio de citogenética es fundamental para la genética clínica. La citogenética es el
campo de la genética que se encarga del estudio de la morfología y la función de los
cromosomas y sus patologías relacionadas, causadas por un número o una estructura
anormal de estos. Los cromosomas son estructuras complejas ubicadas en el núcleo de las
células, compuestos por DNA, histonas y otras proteínas, como lo afirman Saez y Cardoso
[1]. Durante la división celular, específicamente durante la mitosis, se condensan tanto que
pueden ser fácilmente observados y analizados en un microscopio óptico. Para recoger
células con sus cromosomas en este estado condensado, es necesario hacer un extendido
cromosómico, con el cual se puede distinguir entre células normales y malignas por el
número y morfología de los cromosomas, según Freshney [2].
Se pueden usar distintos tejidos para obtener preparaciones de cromosomas, por
ejemplo, sangre periférica, piel, medula ósea, fluido amniótico, entre muchos otros.
Los cultivos de sangre periférica son en general los más empleados para hacer
extendidos cromosómicos en las investigaciones de citogenética clínica. Solo
ocasionalmente, cuando hay indicaciones clínicas especiales, se deben efectuar extendidos
cromosómicos a partir de dos tejidos diferentes del mismo individuo. El más usado
comúnmente es la biopsia de piel que solamente presenta un complejo cromosómico
diferente al de los linfocitos cuando se presentan mosaicismos genéticos, como aparece en
el trabajo de Rooney y Czepulkowski [3].
Aunque las técnicas específicas difieren según el tejido usado, el método básico para
obtener preparaciones de cromosomas es el siguiente (figura 1):
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
47
Figura 1. Preparaciones de cromosomas. Fuente: Freshney [2]
Cultivo de las células en un medio apropiado y empleando un mitógeno adecuado.
Acumulación de células en metafase ya sea en cultivo (por utilización de colchicina,
colcemid u otro agente sincronizador) o en preparaciones directas.
Tratamiento hipotónico que conduce a un aumento del volumen celular provocado
por la entrada de líquido a las células, lo que permite la lisis por métodos físicos de la
célula en metafase y dispersión de los cromosomas.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
48
Una fijación adecuada del material con Carnoy (3 metanol:1 ácido acético glacial)
fresco y frío, permitiendo lavado de las células y conservación del material.
La dispersión de los cromosomas sobre la lámina limpia, libre de grasa, con un
método apropiado, como el goteo de las células hipotonizadas sobre la placa.
Identificación y análisis al microscopio de las estructuras cromosomales [2].
Descripción de la actividad a realizar
Reconocimiento de mitosis.
Materiales y reactivos
Muestra Placa con extendidos cromosómicos de linfocitos T y de las líneas celulares Jurkat y HeLa
suministrados por el laboratorio de Biología Molecular.
Equipos Microscopio
Equipo de seguridad personal requerido
Bata de laboratorio limpia.
Tiempo estimado
Una hora.
Procedimiento
A los estudiantes se les entregarán las placas con extendidos cromosómicos de linfocitos T,
además de placas con extendidos cromosómicos con líneas celulares de células
transformadas Jurkat.
Reconocimiento de mitosis
Haciendo un correcto uso del microscopio, colocar la placa para empezar a observarla.
Empiece enfocando en el objetivo de 4x, pase por el de 10x y por último enfoque en 40x.
En este objetivo, comience un barrido de la placa ordenadamente, como se indica en la
figura 2.
Figura 2. Reconocimiento de mitosis
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49
Durante el recorrido deberá:
Identificar núcleos activos (color rosado-violeta) e inactivos (color morado). La
principal diferencia es el tamaño, las células que se encontraban en el momento de la
obtención de cromosomas en actividad presentan núcleos más grandes que las que no están
activas en el ciclo celular; por otra parte, la coloración en los núcleos inactivos es más
intensa.
Cuidadosamente, y usando aceite de inmersión, enfocar la placa en 100x y observar
más detalladamente la morfología de los cromosomas: telómeros y centrómeros. El
estudiante debe además tratar de identificar las diferencias entre las mitosis de células
normales (linfocitos T) y células con anormalidades (Jurkat).
Figura 3. Ejemplo de morfología de los cromosomas. Gómez, Ossa y Espinal [4]
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
50
Bibliografía
[1] Saez F, Cardoso H. Citogenética básica y biología de los cromosomas. Programa
Regional de Desarrollo Científico y Tecnológico, Departamento de Asuntos
Científicos, Secretaría General de la Organización de los Estados Americanos; 1973.
[2] Freshney R. Culture of Animals Cells: A manual of basic technique. 4ª ed. Nueva
York: Wiley- Liss; 2000.
[3] Rooney D, Czepulkowski B. Human cytogenetics: a practical approach. Washington,
D.C.: Oirl Press; 1987.
[4] Gómez D, Ossa A, Espinal C. Extendidos cromosómicos de la línea celular Jurkat.
Medellín: Laboratorio Biología Molecular, Facultad de Medicina, Univeridad
Cooperativa de Colombia; 2013.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
51
Capítulo 5
Cariotipo
Víctor Alfonso Solarte-David*
Resumen
El patrón cromosómico de una especie es único, y puede ser ordenado y
caracterizado mediante patrones específicos en sus cromosomas, lo cual es llamado
cariotipo. El estudio del cariotipo se realiza mediante la citogenética, la cual hace
uso de técnicas que permiten identificar patrones o porciones específicas en los
cromosomas, haciendo posible la construcción de cariogramas o ideograma
(diagrama en el cual se ordena los cromosomas en metafase según sus
características, bajo reglas establecidas en común acuerdo a nivel internacional). El
cariotipo humano consta de 46 cromosomas (23 pares al ser organismo diploide -
2n), los cuales están organizados en 22 pares autosómicos y un par sexual (XX:
mujer, XY: hombre); cada brazo en cada cromosoma ha sido caracterizado y se han
establecido bandas y subbandas que los identifican. Estas características únicas y
comunes en nuestra especie han permitido establecer y correlacionar anormalidades
cromosómicas a enfermedades como la leucemia mieloide crónica (cromosoma
filadelfia) o síndromes como el Down (trisomía del cromosoma 21), entre muchos
otros. Además, ha permitido establecer polimorfismos que identifican a poblaciones.
El cariotipo es una herramienta elemental en el área clínica debido a que se han
identificación de manera confiable gran cantidad de anormalidades cromosómicas
asociadas a enfermedades, que ahora se encuentran en bases de datos y, así, al
alcance del diagnóstico oportuno.
Palabras clave: cromosomas, centrómero, metafase, ideograma.
* Ingeniero biomédico, especialista y magíster en Biotecnología y doctor en Ciencias Biomédicas de la
Universidad Nacional de Colombia. Actualmente es profesor de tiempo completo de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected].
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52
Objetivos
Objetivo principal
Identificar las diversas estructuras cromosomales, su clasificación mediante métodos de
tinción y morfología, y reconocer algunas patologías asociadas con alteraciones
cromosómicas.
Objetivos específicos
1. Introducir a los estudiantes en los conceptos básicos de las técnicas de cultivo celular.
2. Identificación de estructuras cromosomales.
3. Adquirir pautas básicas para el reconocimiento de los cromosomas humanos en el
microscopio.
4. Clasificar cada uno de los cromosomas en una mitosis mediante la realización de un
ideograma.
5. Cálculo del índice mitótico.
6. Definir un arreglo cromosómico sistemático (cariotipo) para la mitosis con bandas R a
analizar, respecto al tamaño relativo de cada cromosoma en relación con la longitud
genómica total haploide femenina.
7. Realizar una representación diagramática de cada uno de los cromosomas (ideograma)
del cariotipo con bandas.
8. Identificar la problemática presentada por el paciente y sus repercusiones.
Fundamento teórico
La historia de la citogenética humana es relativamente corta. Fue solo hasta 1956 que Tjio y
Levan reportaron el número correcto de cromosomas en el hombre, cultivando células del
pulmón fetal. Hasta los últimos años de la década de los cincuenta, las células utilizadas
para el análisis cromosómico provenían de tejidos proliferativos (por ejemplo, médula ósea)
o células que podrían ser cultivadas in vitro usando las técnicas de cultivo de tejidos (por
ejemplo, fibroblastos, tejidos embrionarios) [1].
Nowell, en 1960, realizó un descubrimiento que revolucionó el análisis cromosómico
en el hombre: una sustancia llamada fitohemaglutinina, extraída del fríjol rojo (Phaseolus
vulgaris), que, al adicionarla a la sangre en un medio rico en nutrientes, estimulaba la
división de los linfocitos. De esta manera, fue posible obtener un mayor número de células
a partir de una muestra más accesible. Además, los tratamientos hipotónicos fueron
determinantes para la mejor visualización y conteo de los cromosomas [2].
Inicialmente los 22 pares de autosomas se clasifican, según el tamaño y la posición del
centrómero, en siete grupos identificados con letras de la A a la G:
Grupo A: al cual pertenecen los cromosomas más grandes, metacéntricos o
submetacéntricos (pares 1-3).
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
53
Grupo B: pares 4 y 5, grandes submetacéntricos.
Grupo C: constituido por siete pares cromosómicos (6-12), medianos, con centrómero en
posición medial o submedial. Dentro de este grupo se encuentra también el
cromosoma X, que podría ubicarse entre los cromosomas 7 y 8 por tamaño.
Grupo D: en él se localizan los cromosomas acrocéntricos grandes (pares 13, 14 y 15).
Grupo E: a él pertenecen los cromosomas 16, 17 y 18, pequeños metacéntricos o
submetacéntricos.
Grupo F: dos pares de cromosomas 19 y 20, pequeños y metacéntricos.
Grupo G: corresponde a dos pares de cromosomas acrocéntricos pequeños, (pares 21 y 22).
Por tamaño y morfología, el cromosoma Y corresponde a este grupo.
De esta manera, los cromosomas podrían ser ubicados dentro de un grupo, pero la
posición dentro del grupo se hacía más o menos tentativamente [3]. A principios de los
setenta se desarrollaron las técnicas de bandeo que permi¬tieron no solo la identificación
exacta de la totalidad de los pares cromosómi¬cos, sino también la detección de la mayoría
de las alteraciones estructurales. Caspersson, Zech y Johansson encontraron que al teñir con
quinacrina o compues¬tos relacionados y observar en el microscopio de fluorescencia, en
cada par cromosómico se produce un patrón específico de bandas brillantes y opacas que
llamaron bandas Q (QFQ) por la utilización de la quinacrina [4].
Arrighi Hsu y Summer descubrieron un método específico de bandeamiento que tiñe
el área pericentromérica, las constricciones pri¬marias de los cromosomas 1, 9 y 16, y el
segmento distal del brazo largo del cromosoma Y [5]. Estas áreas contienen
heterocromatina constitutiva (regiones ricas en G C), de ahí el nombre de bandas C (BCG).
Seabright publica una técnica basada en la desnaturalización y renaturalización del DNA,
que produce un patrón de bandas claras y oscuras que corresponde a los patrones opacos y
brillantes de las bandas Q. Esta técnica fue llamada bandas G por la utilización de Giemsa
como colorante (GTG) [6].
Las bandas R, descritas por Dutrillaux y Leujeune, tienen carac¬terísticas de tinción
opuestas a las bandas Q o G y por esto reciben el nombre de bandas R (de reversa). Tanto
las bandas Q como las G y R permiten un análisis claro y preciso de la morfología de los
cromosomas [7].
No obstante, las bandas G y R presentan una ventaja sobre las bandas Q al ser
preparaciones permanentes y no requerir equipos ópticos y de ilumi¬nación especiales. Las
bandas Q no necesitan maduración ni procedimientos térmicos o enzimáticos, y son una
herramienta importante en el estudio de segmentos heterocromáticos, particularmente en
estudios de paternidad, usando como marcador la región heterocromática del cromosoma
Y.
Otra técnica selectiva son las bandas N, descritas por Matsui y Sasaki [8], y
Goodpasture y Bloom [9]. Estas bandas tiñen los tallos y los satélites de los brazos cortos
de los cromosomas acrocéntricos y son de especial im¬portancia en el estudio de anomalías
que incluyen los brazos cortos de estos cromosomas. 55
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
54
Los patrones de bandeamiento obtenidos con la banda Q se usaron para construir un
ideograma humano con el objeto de establecer una nomenclatura unificada de cada uno de
los pares cromosómicos. Según lo establecido en la Conferencia de París en 1971, un sitio o
seg¬mento de un cromosoma puede ser fácilmente identificado describiendo: el número del
cromosoma, el símbolo de brazo (p = brazo corto, q = brazo largo), el número de la región
(área localizada entre dos límites adyacentes bien definidos) y el número de la banda. El
centrómero se utiliza como pun¬to de referencia para la numeración de las regiones o
bandas, de tal manera que para los brazos la numeración se efectúa desde el centrómero
hacia el telómero [10].
No fue sino hasta 1973 que se empezaron a desarrollar técnicas para obtener
cromosomas en estados tempranos de la división celular, en los cuales se observan ma¬yor
número de bandas y subbandas. Estos cromosomas son más alargados entre más temprano
sea el estadio de división celular, de tal manera que mientras en metafase tardía (técnicas
convencionales de cultivo) se observa un total de 300 bandas por complemento haploide, en
metafases medias se observan entre 320 y 554 bandas, y en profase tardía cerca de 2000
bandas. Esto demuestra que el número de bandas observadas en metafase resulta de la
fusión progresiva de las bandas y subbandas de la profase temprana [7].
La aplicación de estos métodos de bandeo y la estandarización de la nomen¬clatura
han permitido la correcta identificación de las anomalías ocurridas durante la división
celular. Las anomalías cromosómicas pueden ser de dos tipos: de número (aneuploidias o
poliploidias) o de estructura (translocaciones, inversiones, deleciones).
Las anomalías numéricas se pueden originar:
Por la no disyunción, es decir, por la migración de las dos cromátides de un
cromosoma (mitosis o meiosis II) o de dos cromosomas de un bivalente (meiosis I)
a un mismo polo.
Por un retraso anafásico que ocurre cuando un miembro de un par cromosómico
no efectúa la sinapsis y, por lo tanto, no se une correc¬tamente al huso, por lo que
no tiene ningún desplazamiento hacia los polos, quedando por fuera durante la
división.
Las anomalías estructurales se producen principalmente durante la reparación de
las lesiones cromosómicas inducidas por agentes teratogénicos in¬ternos o
externos del organismo. Estas variantes cromosómicas anómalas se pueden
clasificar en:
Variantes inestables (fragmentos acéntricos) que se pierden en el curso de las
divisiones celulares.
Variantes semiestables (cromosomas dicéntricos y anillos) que tienden a fallar en
el curso de las divisiones normales, dado que no existe coordinación entre los
centrómeros.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
55
Variantes estables (deleciones, duplicaciones, inversiones, isocromosomas y
translocaciones) que son capaces de pasar inalteradas a través de la división celular
pero que, en muchos casos, dan lugar a proble¬mas meióticos, aunque pueden
alterar la composición cromosómica de los gametos y, en consecuencia, a la
fertilidad y a la progenie de los portadores.
Los cultivos de sangre periférica son, en general, los más empleados en las
investigaciones citogenéticas para la mayoría de pacientes.
En condiciones normales los linfocitos circulantes no se dividen espontáneamente en
cultivos; la estimulación de los linfocitos se logra agregando un agente mitógeno (cualquier
sustancia extracelular, como proteínas complejas que estimulan la proliferación de los
leucocitos). Los más usados son las lectinas vegetales como concanavalina A o
fitohemaglutinina (PHA). La PHA estimu¬la la fracción de los linfocitos T y es obtenida
del fríjol común (Phaseolus vulgaris), el pokeweed mitogen es obtenido de la Phytolaca
americana, la concanavalina A, de Canavalia ensiformis, y la Favina, del haba Vicia faba,
que muestra excelentes resultados como estimulante de los linfocitos en al¬gunas especies
animales [12].
La muestra sanguínea se toma con un anticoagulante, uno de los más indicados en
humanos es la heparina (liquemine) a una concentración de trabajo de 5000 UI; otros
anticoagulantes como el citrato y el EDTA no permiten una adecuada estimulación de los
linfocitos T para la obtención de extendidos cromosómicos. El cultivo de los linfocitos T
presentes en la muestra de sangre generalmente se lleva a cabo en medio de cultivo RPMI
1640 o Ham´s F-12, suplementado con suero fetal bovino (SFB) entre el 5 y 10% Vol. Los
tiempos de cultivo en una muestra de un paciente que no posea registro de tiempo de ciclo
in vitro se debe estandarizar según el comportamiento propio de células de cultivo para
cada especie. Se pueden ensayar inicialmente con tiempos de duración de cultivos que
pueden estar entre 48, 54, 60, 66 y 72 horas de cultivo, según la especie, tomando de
referencia el tiempo de cultivo de linfocitos humanos (72 horas, en las que las células
alcanzan a realizar tres ciclos), el cual es ampliamente conocido [13].
Durante el cultivo de las células lo que se busca son células en estado metafásicos en
los posibles estadios tempranos de replicación, por esto es necesario contemplar técnicas de
sincronización para asegurar la presencia de un mayor número de células en metafase. Para
ello se puede recurrir a una sincronización del cultivo, es decir, llevar a todas las células
que por naturaleza se encuentran dispersas en las diferentes fases del ciclo celular a una
sola fase. Para la sincronización celular se puede utilizar sustancias que metabólicamente
depriven a la célula de elementos fundamentales en el proceso de duplicación, lo que
propiciaría una condición de paro o estancamiento, hasta que se realice una suplementación
exógena del componente deprivado. Entre estas sustancias antimitóticas está el MTX que no
permite la síntesis de timina y el 5-fluoruracilo (5-FU) que ha demostrado la sincronización
parcial de células en la fase S, más precisamente donde se ha duplicado la eucromátina e
inicia la duplicación de la heterocromatina, tanto la constitutiva como la facultativa. Este
último hecho nos permite distinguir desde el punto de vista duplicativo el cromosoma X
57
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
56
inactivo, lo cual resulta de gran importancia en el momento de identificar los cromosomas
sexuales en especies donde aún no se han caracterizado. El bloqueo producido por el MTX
puede ser liberado con la adición en el medio de BrdUrd que se incorpora vía exógena
(timinas en donde el grupo metilo se sustituye por un bromo) para suplir la deficiencia que
induce el tratamiento con la droga ya que es un análogo de la T. Luego de 15 horas
posliberación en células humanas del bloqueo, las células están pasando por estadios
tempranos replicativos en metafase, lo que permite aumentar la resolución de las bandas
observadas debido al menor grado de compactación de los cromosomas [14].
También se usan antimitóticos que se involucran directamente con la polimerización
o despolimerización, como colcemid o colchicina, los cuales paran el crecimiento de las
células justo en la mitosis (fase M del ciclo), permitiendo un mayor porcentaje de células en
las que se pueden visualizar cromosomas condensados. De un lado, el colcemid produce
una estructura menos compacta y la colchicina produce efectos de compactación más
rápida, por lo tanto, dependiendo de los objetivos del experimento, se puede seleccionar
uno u otro compuesto. En algunos casos se pueden combinar el bromuro de etidio a
concentraciones de 5 µg/ml más el colcemid durante una hora para lograr extendidos
prometafásicos de alta resolución combinado con alto número de mitosis. La técnica de
cultivo de linfocitos empleada en la mayoría de los laboratorios es la de Moorhead et al.,
comúnmente conocida como el método de secado al aire [15-17].
Una vez realizado el cultivo y la correspondiente fijación de las mitosis, las placas del
extendido obtenido en principio tendrán tres tipos de células: estimuladas, es decir que
están pasando por una fase del ciclo diferente a la metafase y conllevan el ciclo mitótico,
generalmente son de color rosado y de mayor tamaño que los núcleos no estimulados;
núcleos inactivos o células que no lograron acoplarse a las condiciones de cultivo y no
mantienen un menor tamaño que las células estimuladas y se visualizan de un color
morado; y células en mitosis propiamente en metafase. Es importante realizar una medida
del número de mitosis en relación con el número de células totales en el ciclo (estimuladas
mitóticas), ya que pueden ser indicativos directos que evidencian problemáticas
patológicas, entre otras. Una de estas medidas es el índice mitótico, el cual da el porcentaje
de células totales sin tener en cuenta las no estimuladas en correlación con el número de
mitosis obtenidas, y se calcula de la siguiente manera:
IM= ((cantidad de mitosis)) ⁄ ((células totales)) x 100.
El número de células totales a contar por placa generalmente es de 2000 a 3000
células, a un aumento de 40x, procurando realizar el conteo recorriendo la placa con la
fijación de una manera ordenada.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
57
Descripción de la actividad a realizar
Materiales y reactivos
Microscopio.
Placa con extendido cromosómico.
Aceite de inmersión.
Placas para coordinar la posición de las mitosis (placas forradas con cinta de papel).
Equipo de seguridad personal requerido
Pijama institucional.
Bata de laboratorio.
Guantes de látex/vinilo.
En el caso de personas con cabello largo, sujetador de cabello.
Tiempo estimado
Una hora y 45 minutos.
Elaboración de un cariotipo
Metodología
Conteo cromosómico
A cada estudiante se le asignará una fotografía de una mitosis que será el objeto de estudio,
y con la cual el estudiante realizará el cariotipo.
Localización del centrómero
Los cromosomas metafásicos se encuentran en estructuras en forma de diadas (dos
cromátidas) unidas por el centrómero identificado por ser un estrechamiento en el
cromosoma. La identificación del centrómero permite determinar los dos brazos que posee
un cromosoma: p o brazo corto y q o brazo largo.
Cálculo del índice centromérico (IC)
Se obtiene relacionando la longitud del brazo corto (Lp) con la longitud total de cada
cromosoma (LT,i) y se expresa en porcentaje según la siguiente relación:
𝐼𝐶𝑖 =𝐿𝑝,𝑖
𝐿𝑇,𝑖𝑥100 (1)
Cálculo del índice braquial (IB)
Se obtiene mediante la relación de la longitud del brazo corto (Lp) respecto al brazo largo
(Lq), mediante la siguiente relación:
𝐼𝐵𝑖 =𝐿𝑞,𝑖
𝐿𝑝,𝑖 (2)
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
58
Clasificación del cromosoma por ubicación del centrómero
Una vez determinados el IC y el IB se procede a la clasificación de los cromosomas en
metacéntricos, submetacéntricos, acrocéntrico y subtelocéntrico mediante el criterio que se
muestra en la tabla 1.
Tabla 1.
Calcificación cromosómica morfológica
IC IB Clasificación
50-46 1-17 Metacéntrico
45-26 1.7-3 Submetacéntricos
25-25 3-7 Acrocéntrico
<15 >7 Subtelocéntrico
Nota. Elaboración propia
Apareamiento de cromosomas homólogos
Calculados el IC o el IB y asociándose con la longitud de cada cromosoma junto con la
morfología del bandeo, se pueden organizar los cromosomas homólogos. Una correlación
que puede ayudar en el apareamiento de cromosomas homólogos y más aún en el caso de
cromosomas con coloración homogénea es el índice de homología.
𝐼𝐻𝑖 =𝐿𝑝,𝑖
𝐿𝑇,𝑖𝐿𝑞,𝑖 (3)
Este valor depende del error de la medida y la presencia o no de polimorfismos en los
cromosomas, pero junto con el bandeo pueden ayudar en el reconocimiento de los
cromosomas homólogos.
Longitud relativa (Lr)
Para proponer el cariotipo es necesario establecer un orden dentro de los cromosomas, lo
cual se logra calculando la longitud relativa de cada par homólogo, expresado en
porcentaje, lo cual se obtiene al dividir el tamaño del cromosoma entre la longitud total del
grupo haploide femenino (lthf). Para el caso de un organismo con genoma 2n se tiene:
𝐿𝑙𝑡ℎ𝑓 =∑ 𝑐𝑟𝑜𝑚𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎 𝑖𝑛
1
2 (4)
Al tratarse de una hembra con cromosomas sexuales XX la anterior correlación se
aplica, por el contrario para el caso de tratarse de un macho XY, lthf se halla restando la
longitud del cromosoma Y y sumando dos veces el cromosoma X. Para el caso de trisomías
y aneuploidías somáticas o sexuales se rearregla el genoma a condiciones de normalidad, y
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
59
para el caso de la trisomía se elimina el cromosoma causante de la trisomía. Para el caso de
aneuploidías se multiplica por dos el cromosoma unitario en ausencia de su homólogo.
Después, el cálculo de la longitud relativa de cada cromosoma se obtiene de la
siguiente manera:
𝐿𝑟,𝑖 =𝐿𝑇,𝑖
𝐿𝑡ℎ𝑓𝑥100 (5)
Esquema general de clasificación cromosómica
Los cromosomas de una especie cualquiera pueden ser organizados en grupos. En el caso
del genoma humano se han clasificados en los que se muestre en la tabla 2.
Tabla 2.
Esquema general de clasificación cromosómica
Grupo A Grandes cromosomas metacéntricos o submetacéntricos
Grupo B Cromosomas submetacéntricos
Grupo C Cromosomas submetacéntricos de tamaño medio
Grupo D Cromosomas acrocéntricos de tamaño medio con satélites
Grupo E Cromosomas subtelocéntricos Cromosomas submetacéntricos
relativamente cortos
Grupo F Cromosomas metacéntricos relativamente cortos
Grupo G Cromosomas acrocéntricos cortos con satélites
Nota. Elaboración propia
El estudiante podrá contar, además, con ejemplos de cariotipos de trabajos anteriores como
una guía para el desarrollo del cariotipo.
Idiograma
Se construirá un patrón de bandas manteniendo la proporción de longitud de cada
cromosoma en el genoma, bosquejando la problemática cromosómica y posibles
polimorfismos, entre otros. Un ideograma para el caso de cromosomas humanos según
diferentes patrones de bandeos se muestra en la figura 1.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
60
Figura 1. Ideograma para humano normal.
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Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
63
Capítulo 6
Biología molecular aplicada a la clínica: extracción
de ADN, reacción en cadena de la polimerasa y electroforesis
Ana Claudia Ossa-Giraldo*
Resumen
Desde el descubrimiento de la composición y estructura del ADN por Watson y
Crick, se han logrado grandes avances en el entendimiento de las complejas
interacciones y comportamientos al interior de la célula, desde el punto de vista
molecular. El estudio de las interacciones de aquellas moléculas biológicamente
activas, conocido como biología molecular, ha brindado interesantes herramientas
para la detección, caracterización y evidencia de estas. Dichas herramientas, a su
vez, han permitido su aplicación ya no solo en la investigación básica sino también
en diferentes campos biomédicos como el diagnóstico clínico, el pronóstico, el
tratamiento de patologías o el uso en el campo forense, entre muchos otros, que son
transversales a las profesiones u oficios biomédicos como la medicina de humanos,
la medicina veterinaria y la odontología, entre otros. Existen innumerables técnicas
y protocolos que se pueden usar para cualquiera de los objetivos mencionados. En
este capítulo se estudiarán algunas de sus aplicaciones y se llevará a la práctica tres
técnicas moleculares básicas que permiten la obtención, replicación y visualización
del ADN a partir de cualquier muestra biológica que contenga células nucleadas.
Palabras clave: biología molecular, ADN, reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), electroforesis.
* Microbióloga y bioanalista, especialista en Microbiología Clínica y estudiante del doctorado en Ciencias
Básicas Biomédicas de la Universidad de Antioquia. Actualmente, es profesora auxiliar de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Medellín, Colombia. Correo electrónico: [email protected]
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
64
Metodología
Se realizarán dos prácticas demostrativas de técnicas de biología molecular enfocando su
aplicación a la clínica, con la discusión de casos clínicos cuyo diagnóstico es guiado por la
biología molecular.
Temario que lo apoya
Biología molecular en la clínica, extracción de ADN, reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) y electroforesis en gel de agarosa.
Objetivos
Objetivo principal
Entender y aprender las técnicas de biología molecular descritas y su aplicación en las áreas
clínicas.
Objetivos específicos
1. Extraer ADN de calidad a partir de muestras biológicas como sangre periférica de
humano.
2. Verificar la calidad del ADN extraído.
3. Entender y aplicar los principios básicos de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
4. Realizar electroforesis de ADN en gel de agarosa.
5. Integrar los conocimientos adquiridos sobre técnicas de biología molecular y su
aplicación en la práctica clínica.
Fundamento teórico
Biología molecular en la clínica
La posibilidad de estudiar ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas ha abierto un
amplio campo para las ciencias médicas y biológicas, toda vez que su obtención permite
hacer estudios específicos del material genético de diversas especies para evaluar su
estructura y funcionalidad, lo que, en la perspectiva clínica, se ha traducido en un avance en
el descubrimiento, entendimiento, diagnóstico e intervención de un sinfín de patologías
para las cuales, antes del conocimiento de la biología molecular, su abordaje era limitado o
imposible.
Se puede describir un sinnúmero de aplicaciones clínicas de las técnicas de biología
molecular, las cuales se emplean de manera rutinaria en investigación –y cada vez más
habitualmente en el campo asistencial– alrededor de todo el mundo, incluyendo países en
vía de desarrollo como el nuestro. Si bien esta práctica se limita al entendimiento de tres de
las técnicas de biología molecular, a continuación se enumeran algunos ejemplos de la
aplicación de esta disciplina científica, incluyendo otras técnicas:
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
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Trasplante de órganos: Colombia y Medellín se han convertido en referentes en
trasplantes de órganos, gracias al trabajo arduo de diversas especialidades y equipos
interdisciplinarios en biomedicina. Parte del proceso y resultado exitoso del trasplante
de órganos ha sido posible gracias a las técnicas de biología molecular, especialmente
la PCR, a través de la cual se pueden amplificar y estudiar los genes del complejo
mayor de histocompatibilidad (CMH I y II) de los donantes y futuros receptores de
órganos, permitiendo encontrar el receptor más parecido al donante desde el punto de
vista genético, el cual tiene el mejor pronóstico de aceptación biológica del injerto [1,
2].
Diagnóstico de patologías hereditarias: diversas enfermedades padecidas por el humano
tienen un origen genético y, en muchos casos, hereditario, y para muchas de estas ya
se tiene la posibilidad de hacer diagnóstico rápido y preciso a través de técnicas de
biología molecular. Un ejemplo de ello es la detección de alteraciones estructurales
de una secuencia específica del material genético por medio de técnicas como PCR
con hibridación alelo específica, la cual es usada comúnmente para la detección de
polimorfismos en el diagnóstico de enfermedades como la hemofilia A y la anemia de
células falciformes [3].
Diagnóstico precoz y prevención de enfermedades: otra aplicación de la biología
molecular en la clínica se ha direccionado por el diagnóstico temprano de patologías
o sus desencadenantes, para prevenir la aparición o complicación de estas. En este
sentido, se puede mencionar la posible detección prenatal del gen RHD que codifica
para la glicoproteína del RH (factor RH) en fetos que son hijos de madres RH negativo,
para prevenir en estos la aparición de la anemia hemolítica del recién nacido o
eritroblastosis fetal [4].
Tratamiento de patologías: las técnicas de biología molecular e ingeniería genética
también han permitido desarrollar moléculas de uso terapéutico en diferentes
patologías. Un clásico ejemplo de ello es la utilización de insulina recombinante
idéntica a la humana. Antes, la insulina para el tratamiento de pacientes diabéticos
insulinodependientes se hacía con una insulina obtenida del páncreas del ganado
porcino y vacuno; sin embargo, dado que dicha hormona no es idéntica a la humana,
se generaba en algunos pacientes el desarrollo de anticuerpos contra esta, que
finalmente les impedía seguir usándola como tratamiento. Gracias a las técnicas de
ingeniería genética y biología molecular, actualmente se usa insulina recombinante
idéntica a la humana, lo cual ha eliminado el rechazo inmunológico de los pacientes y
optimizado su tratamiento [3, 5].
Diagnóstico y seguimiento de enfermedades infecciosas: este diagnóstico se ha basado
tradicionalmente en la detección del microorganismo en una muestra clínica a través
del cultivo de esta y el consecuente crecimiento del microbio infectante. Dicha
metodología de diagnóstico requiere desde 24 horas hasta meses (como el caso del
cultivo de Mycobacterium tuberculosis), tiempo que, en muchas ocasiones, puede
significar un pronóstico pobre para el paciente. La necesidad de hacer más eficiente el
67
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
66
diagnóstico microbiológico de las infecciones se ha solucionado a través del uso de
pruebas rápidas basadas en la detección de antígenos y anticuerpos y, en los últimos
años, por el empleo de técnicas de biología molecular que permiten detectar ácidos
nucleicos del microorganismo infectante en muestras del paciente en tiempos
reducidos, y con una sensibilidad y especificidad comparable con los cultivos
tradicionales. De esta manera, se puede acelerar el diagnóstico de pacientes,
proporcionando la posibilidad de un tratamiento oportuno; un ejemplo de ello, en el
campo humano, son las pruebas de diagnóstico molecular de Mycobacterium
tuberculosis, las cuales reducen el tiempo de diagnóstico microbiológico de meses
(requerido a veces para el crecimiento en cultivo de esta bacteria) a días u horas. Así
mismo, encontramos en el mercado pruebas moleculares para el diagnóstico de
chlamydia trachomatis, neisseria gonorrhoeae y virus de la inmunodeficiencia
humana 1 (VIH-1) o para el control de la terapia en infecciones como las causadas por
el virus de la hepatitis C (VHC), citomegalovirus y bordetella pertusis, entre otros [5,
6]. En el campo veterinario también se ha visto un importante impacto de la detección
con técnicas de biología molecular de microorganismos causantes de infecciones,
como es el caso de brucella abortus, el cual causa abortos en el ganado, generando
importantes pérdidas económicas, y su detección temprana puede significar una
intervención oportuna para evitar esas pérdidas económicas al ganadero [7].
Medicina forense: las ciencias forenses se han visto igualmente beneficiadas con el
avance de la biología molecular. Actualmente, se usan múltiples técnicas moleculares
para el esclarecimiento de asuntos legales alrededor del mundo. Se puede hablar
entonces de las llamadas “pruebas de paternidad”, que se han convertido en un evento
cotidiano en nuestro medio; estas son realizadas con protocolos moleculares que
permiten identificar con amplia precisión el posible progenitor de un individuo en
casos legales que requieren dicho esclarecimiento. Otro uso común en el campo
forense es la detección y estudio del ADN del agresor en víctimas de diversos delitos
como los sexuales, lo que permite, en un gran número de casos, identificar con
certeza el victimario entre la lista de sospechosos [3].
Medicina veterinaria y zootecnia: las herramientas moleculares han generado grandes
avances en la medicina veterinaria y zootecnia, a través de los cuales se ha podido no
solo mitigar la morbimortalidad en los animales, sino conocer a profundidad las
diversas especies, así como beneficiar y aumentar la productividad económica a partir
de la crianza de animales. Ejemplos de ello son los diagnósticos oportunos de
patologías que afectan a los animales, como las enfermedades infecciosas (como se
mencionó) [7], y la posibilidad de conocer inequívoca y tempranamente el sexo en
aquellas especies a través de técnicas moleculares, el cual es imposible identificar
anatómicamente por la ausencia de dimorfismo sexual de algunos animales, como es
el caso de las aves, principalmente las exóticas [8, 9]. Así mismo, la ingeniería
genética ha abierto un campo de posibilidades de perfeccionamiento de las especies
con miras a una mayor producción, como lo es el cruce genético de ciertas especies
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
67
bovinas, la fertilización in vitro o la modificación genética de animales para que sean
más resistentes a ciertas condiciones ambientales o patológicas o para que produzcan
en mayor cantidad y calidad aquellos productos derivados, como la carne y la leche
[10, 11].
Odontología: en el campo de la odontología, al igual que en las otras áreas biomédicas,
la biología molecular ha impactado la práctica clínica y el entendimiento de las bases
celulares y moleculares del desarrollo dental y las estructuras maxilofaciales. Por
ejemplo, a través de estas herramientas se pudo concluir que la mutación del SOSI está
relacionada con la fibromatosis gingival hereditaria, o se sabe que una mutación en el
gen que codifica para la sialofosfoproteína de la dentina genera dentinogénesis
imperfecta tipo II [12]. La aplicación de la biología molecular es útil para la
clasificación de los tumores orales, para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer oral
o para el desarrollo de fármacos o mejoramiento de estos [13]. Además, esta
disciplina también ha permitido el estudio de las biopelículas de microorganismos
que se forman sobre las estructuras bucales y su mutua interacción [14].
Aunque los anteriores ejemplos solo cobijan una parte de la amplia aplicación de la
biología molecular, se hace evidente entonces la necesidad y obligatoriedad de que el
médico general, el médico veterinario y zootecnista, el odontólogo y todos aquellos
profesionales de las áreas biomédicas, desde sus enfoques, posean conocimientos de los
principios básicos de las técnicas moleculares y dimensionen su aplicación clínica y
práctica.
Extracción de ADN
La extracción de ADN es el método por el cual se puede recuperar este material genético de
muestras orgánicas. Dicha extracción implica la obtención del ácido nucleico, su
purificación y cuantificación, pues es necesario garantizar que el material obtenido es de
suficiente calidad para desarrollar de manera óptima otras técnicas para su estudio.
Dependiendo del tipo de muestra biológica a partir del cual se vaya a extraer el ADN, los
protocolos pueden tener ligeras variaciones (por ejemplo, es diferente asilar ADN a partir de
una célula animal que de una célula vegetal o de una bacteria gramnegativa que de una
bacteria grampositiva, en función de sus estructuras como la pared celular). Según lo
anterior, el aislamiento de ADN se puede resumir en los siguientes pasos:
Lisis celular: se usan sales y detergentes (comúnmente el SDS) que destruyen
macromoléculas por desnaturalización, llevando a la eliminación de la membrana de
la célula, y luego la nuclear, para permitir la liberación del material genético [15, 16].
Purificación del ADN: una vez lisados los núcleos y liberado el ADN, hay que separar este
material genético de los materiales contaminantes, como sus proteínas asociadas. Este
procedimiento se hace generalmente con fenol, o fenol/cloroformo y centrifugación
de manera repetida; el fenol desnaturaliza las proteínas y las precipita, lo que es 69
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
68
optimizado con la centrifugación. Este procedimiento permite que se separe el ADN,
el cual queda en la fase acuosa de la solución, mientras que las proteínas quedan
como precipitado [15, 16].
Precipitación del ADN: después de la separación del ADN y de las proteínas, el primero es
recuperado de la fase acuosa y se hace un proceso de precipitación con etanol frío
para su almacenaje y conservación [15, 16].
Cuantificación y control de calidad del ADN: para tener una idea de la cantidad y la
calidad del ADN extraído, se puede hacer una verificación de este por medio de
espectrofotometría, hallando la densidad óptica (DO) de la muestra a 260 y 280
nanómetros (nm), lo que permitirá, con la aplicación de algunas fórmulas, saber qué
concentración se obtuvo de ADN y su nivel de pureza [17]. Las fórmulas (relación
260/280) y su interpretación están ubicadas en la práctica de ese tema (ver página 77).
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Una vez obtenida una muestra de ADN, esta se puede analizar para hallar un fragmento
específico deseado, por ejemplo, verificar si esa muestra de ADN contiene un gen mutado
que codifica para alguna proteína causante de una enfermedad. Para lograr esto de una
manera más óptima, se hace uso de la reacción en cadena de la polimerasas (PCR por sus
siglas en inglés), la cual es una técnica de biología molecular que permite amplificar
muchas veces un fragmento deseado de ADN al hacer múltiple copias de este por medio de
la enzima DNA polimerasa a través de la aplicación de diversos ciclos térmicos que generan
la desnaturalización del ADN y su replicación de manera exponencial y semiconservativa
ciclo tras ciclo. En la figura 1 se muestra un diagrama del principio de la PCR [5, 15, 17].
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
69
Figura 1. Imagen de reacción de cadena de la polimerasa [18]. Texto traducido por la
autora
ADN Genómico
Secuencia blanco
Ciclo 1 Produce
2 moléculas
Ciclo 2 Produce
4 moléculas
Ciclo 2 Produce 4
moléculas; 2 moléculas (en los recuadros
blancos) se unen a la secuencia
blanco
Desnaturalización: calentamiento breve para separar las hebras
Alineación: enfrentamiento para permitir que los cebadores formen puentes hidrógenos con la secuencia blanco
Elongación: la ADN polimerasa adiciona nucleótidos al extremo 3’ de cada cebador
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
70
Electroforesis en gel de agarosa
Finalmente, luego de extraer el ADN y someterlo al proceso de PCR, es necesario evidenciar
si la muestra problema contiene el fragmento que buscamos, para lo cual hacemos uso de la
electroforesis en gel de agarosa. Esta técnica permite separar los fragmentos de ADN por
tamaños al aplicar electricidad a este, lo que genera su desplazamiento o migración a través
del gel de agarosa dispuesto en una cámara de electroforesis. Gracias a la carga negativa del
ADN, este migrará del ánodo al cátodo de la cámara a través de los poros del gel; los
fragmentos de ADN más pequeños tendrán más facilidad de atravesar el gel, lo que les
permitirá llegar en menor tiempo al otro lado de la cámara de electroforesis en comparación
con fragmentos más pesados. Esta diferencia entre la velocidad de migración permite que
las porciones de ADN se separen y podamos comprobar si se encuentra en la muestra
problema el fragmento de ADN que buscamos, de un tamaño ya conocido, al compararlo
con una escalera de ADN de diversos pesos (tamaños) llamada marcador de peso molecular.
Para visualizar el ADN sembrado en el gel y saber la distancia de recorrido, es necesario
usar fluorocromos intercalantes del DNA para excitarlos con luz UV y realizar la
visualización correspondiente [5, 15, 17].
En la figura 2 y 3 se muestran diversas fotografías de geles de agarosa luego de la
electroforesis de fragmentos de ADN posPCR (amplicones).
Figura 2. Ensayo efecto tres colorantes. * Corrido electroforético luego de una PCR para
amplificación de genes de Mycobacterium bovis: obsérvense los pozos de siembra de las
muestras y la migración diferenciada de tres colorantes indicadores de corrido de peso
molecular diferenciado. [19]
71
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
71
Figura 3. PCR gen TAQM3 y TAQM4. * Corrido electroforético luego de una PCR para
amplificación de genes de Mycobacterium bovis: 1: marcador de peso molecular de 100pb;
2 y 3: controles positivos, banda de 122pb; 4-19: muestras; 20: control negativo.
Obsérvense las bandas fluorescentes de ADN con bromuro de etidio. [19]
Figura 4. Detección b-Actina, TLR2, TLR3 y TLR4.
Corrido electroforético luego de una PCR para amplificación del mRNA de b-Actina, TLR2,
TLR3 y TLR4. Obsérvense los pozos de siembra de las muestras y la migración
diferenciada de los cuatro amplicones en tres muestras (células dendríticas plasmacitoides
de dos donantes sanos y células mononucleares totales). Los tres primeros pozos
corresponden a b-Actina, luego tres pozos de TLR2, luego el marcador de tamaño
molecular, luego TLR3 que esta negativo y por último tres pozos de TLR4. [20]
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
72
Figura 5. Electoforesis DNA genómico.
Corrido electroforético luego de una PCR para amplificación de genes de Mycobacterium
bovis: 1: marcador de peso molecular de 200pb; 2 y 3: control positivo; 19: control
negativo; 4-18: muestras. Obsérvese en los pozos de las muestras DNA genómico en los
pozos de siembra; este es muy pesado para migrar a través del gel. [19]
Figura 6. PCR con Smear.
Corrido electroforético luego de una PCR para amplificación de genes de Mycobacterium
bovis: 1: marcador de peso molecular de 200pb; 2: control positivo; 20: control negativo; 3-
19: muestras. Obsérvese en las muestras 4, 6, 8, 10 y 12, 14 y 16 el Smear que es un barrido
de ADN generado posiblemente por una alta concentración de ADN o una inadecuada
extracción. [19]
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
73
Figura 6. Detección TLR5, TLR10 y TLR9.
Corrido electroforético luego de una PCR para amplificación del mRNA de TLR5, TLR10 y
TLR9. Obsérvense los pozos de siembra de las muestras y la migración diferenciada de los
dos amplicones en tres muestras (monocitos de tres donantes sanos). Los tres primeros
pozos corresponden a TLR5, seguido de tres pozos de TLR10 que están negativos,
nuevamente el marcador de tamaño molecular y, por último, tres pozos de TLR9. [20]
Descripción de la actividad a realizar
Se llevarán a cabo dos sesiones prácticas.
Primera sesión
Extracción de ADN por Salting Out y cuantificación por espectrofotometría.
Recursos materiales (reactivos, equipos, muestras, animales)
Bloque térmico
Centrifuga
Micropipetas
Vortex
Espectrofotómetro
Agua destilada
Agua inyectable
Alcohol al 70%
Isopropanol puro
Solución A
Solución B
Solución C
Tubos ependorff de 1,7 ml
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
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Tubos ependorff de 0,5 ml
Puntas para micropipeta
Equipo de seguridad personal requerido: bata de laboratorio
Procedimiento
Extracción de ADN
1. Tomar entre 100 a 300 µl de sangre previamente homogenizada en un tubo de reacción
limpio y estéril de 1,5 ml debidamente rotulado, con el código de la muestra.
Completar a 1500 µl con solución A y mezclar por inversión.
2. Se marcará un tubo como control negativo (-) y la fecha, al cual se le hará todo el
procedimiento remplazando los µl de sangre por H2O inyectable y se procede como
una muestra normal.
3. Centrifugar a 13.000 rpm durante 3 minutos. Descartar el sobrenadante.
4. Lavar suavemente el precipitado con solución salina al 0,9% usando pipeta Pasteur
estéril; cuidar de no remover el precipitado. Descartar suavemente el sobrenadante.
5. Agregar 150 µl de solución B (precalentada a 37º C hasta lograr que se disuelvan
completamente las sales) y agitar con vórtex a 3000 rpm hasta una disolución parcial o
total del botón.
6. Agregar 50 µl de solución C y agitar con vórtex a 3000 rpm durante unos segundos.
7. Centrifugar a 13.000 rpm durante 3 minutos.
8. Transferir el sobrenadante a un tubo de reacción limpio y estéril de 1,5 ml debidamente
rotulado.
9. Agregar 200 µl de isopropanol frío. Mezclar por inversión hasta detectar la malla de
ADN.
10. Centrifugar a 13.000 rpm durante 3 minutos.
11. Descartar el sobrenadante y hacer un lavado del precipitado con 100 µl de etanol al
70%.
12. Agregar aproximadamente 200 µl de agua inyectable (estéril) (dependiendo de la
cantidad de ADN detectado cualitativamente).
13. Aplicar vórtex entre 10 y 15 segundos de 2500 a 3000 rpm hasta lograr que el botón se
desprenda y se homogenice el ADN (disuelto totalmente en la solución).
14. Incubar a 93° C durante 3 minutos para lograr la completa homogenización.
15. Almacenar a -20° C en la nevera después de la respectiva cuantificación y dilución.
Nota: cuando la sangre a disposición tiene mucho tiempo de almacenamiento en la nevera o
llega en condiciones poco óptimas (sangre lisada, con coágulos, etc), se procede a:
Lavar dos veces con solución A.
Lavar dos veces con solución salina al 0,9%.
Precipitar con 300 µl de isopropanol.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
75
Cuantificación del ADN por espectroscopia
Este método es recomendable si la muestra es pura (contaminación mínima con proteínas,
fenol, agarosa u otros ácidos nucleicos).
1. Realizar una dilución 1/100 de la muestra de DNA. El volumen final mínimo debe ser
1500 μl.
2. Encender el espectrofotómetro: en el menú principal aparecerá el botón “Medir ADN”.
3. Determinar la longitud de onda: 260 nm para calcular la concentración de ADN en la
muestra; densidad óptica (DO) = 1 corresponde aproximadamente a 50 μg/ml para ADN
de doble cadena, 40μg/ml para ADN de cadena sencilla y RNA, y 20μg/ml para
oligonucleótidos de cadena sencilla. 280 nm para proteínas.
4. Colocar la cubeta de modo que la luz atraviese los lados transparentes de la celda.
5. Con el botón “Autocero” ajustar. Tener en cuenta que la cubeta debe tener el mismo
solvente que se utilizó para preparar la dilución de la muestra de ADN.
6. Descartar el solvente. Lavar la cubeta dos veces con agua destilada y secar con un
pañuelo nuevo desechable. La cubeta debe tomarse siempre por los lados opacos para
evitar que se resbale de las manos.
7. Llenar la cubeta con 1,5-2 ml de la muestra de interés.
8. Medir.
9. Escribir los resultados: relación 260/280, concentración de proteínas y concentración
de DNA.
10. Repetir desde el paso 6 al 8.
Nota: la relación entre las lecturas a 260 nm y 280 nm (DO260/DO280) indica el grado de
pureza del ácido nucleico. Las preparaciones puras de DNA y RNA deben tener valores de
1,8 y 2,0, respectivamente. Si hay contaminación con proteína o fenol, la relación
DO260/DO280 será significativamente menor a 1,8.
Realizar dilución a 10 ng/µL para la PCR en tubos de reacción de 0,5 ml según los cálculos
hechos en el numeral anterior. Almacenar a -20° C.
Segunda sesión
PCR y electroforesis.
Recursos materiales (reactivos, equipos, muestras, animales)
Kit QIAGEN Multiplex PCR
Primers de interés
Muestra de DNA humano
Tubos ependorff de 0,2 ml para PCR
Tubos ependorff de 0, 5 ml
Micropipetas
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
76
Puntas micropipetas
Minicentrífuga
Vórtex
Termociclador
Equipo de seguridad personal requerido: bata de laboratorio, guantes de látex nuevos, tapa-
bocas nuevo.
Procedimiento
1. Tomar las muestras de ADN (previamente cuantificadas).
2. Marcar los tubos de PCR según el ensayo a realizar.
3. Usar los tubos de 0,5 ml para hacer las mezclas de PCR.
4. Tomar 1 µL de agua del kit por cada reacción a ejecutar y adicionarla al tubo de 0,5 ml.
5. Tomar 3 µL de la mix del kit por cada reacción y adicionarla al tubo de 0,5 µL.
6. Tomar 1 µL de los primers de interés por cada reacción y adicionar al tubo de 0,5 ml.
7. Tomar la mezcla del tubo de 0,5 ml y adicionar 5 µL a cada tubo de PCR.
8. Dar vórtex a las muestras de ADN y adicionar 1 µL de muestra a cada tubo de PCR.
9. Programar el termociclador.
10. Poner las muestras y poner a funcionar el programa seleccionado o programado en el
termociclador.
11. La amplificación puede tardar hasta tres horas. Una vez termine el programa en el
termociclador, las muestras pueden ser almacenadas a -20º C.
Electroforesis en gel de agarosa
1. Pesar la agarosa haciendo el cálculo para que el gel quede al 1,5% de concentración de
agarosa (los gramos a pesar dependen del tamaño de la cama de electroforesis a usar).
2. Mezclar la agarosa con agua destilada en un Erlenmeyer y calentar en un microondas
hasta llegar al punto de ebullición. Evitar que la agarosa se derrame al llegar al punto
de ebullición.
3. Dejar enfriar la solución hasta una temperatura aproximada a 30º C y adicionar 13 ul
de bromuro de etidio. Mezclar. Nota: Este procedimiento se debe realizar en una
cámara de extracción de gases.
4. Servir el gel en la cama de electroforesis y adicionar los peines garantizando una buena
formación de los pozos de siembra.
5. Dejar solidificar.
6. Hacer un mapa del gel a servir, indicando la ubicación en cada pozo de las muestras de
productos de PCR, controles negativo y positivo, y el marcador de peso molecular.
7. Tomar 10 uL de marcador de peso molecular y mezclar con 3 uL de buffer de carga.
Servir cuidadosamente en el pozo del gel que corresponda.
8. Repetir el paso anterior para cada uno de los controles y muestras de productos de PCR
(amplicones).
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
77
9. Una vez se termine de servir las muestras en el gel, tapar la cámara de electroforesis y
conectar a la fuente de poder.
10. Programar un corrido de 2 horas a 120 voltios.
11. Revisar constantemente el corrido de ADN.
12. Una vez terminado el corrido electroforético, tomar el gel y visualizarlo en un
transiluminador de luz UV.
13. Analizar las bandas e interpretar los resultados.
Ejercicios de aplicación
Ejercicio 1
Paciente masculino de 24 años de edad, quien consulta a su médico por dificultad para
respirar, tos productiva de 3 meses de evolución, hemoptisis (esputos con sangre), pérdida
de peso, fiebre intermitente y sudoración nocturna. Luego del examen físico, el médico
sospecha que el paciente tiene tuberculosis pulmonar (causada por la bacteria
Mycobacterium tuberculosis). Para confirmar el diagnóstico, se decide realizar una PCR a
partir de muestras de esputo del paciente para detectar ADN de la bacteria y confirmar la
infección sospechada. En la PCR se pretende amplificar un fragmento de ADN de 250 pb
correspondientes a un gen específico de la especie M. tuberculosis. Luego de los
respectivos procedimientos de laboratorio, en la figura 7 se muestran los resultados del
corrido electroforético.
Figura 7. Muestra de resultados del corrido electroforético.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
78
Según los resultados, responda:
1. ¿Funcionó adecuadamente esta prueba molecular?
2. ¿Por qué no hay banda en el control negativo?
3. ¿Cuál es el resultado de la PCR?
4. ¿Cuál es la conclusión diagnóstica?
Ejercicio 2
En consulta, un odontólogo identifica en un paciente lesiones de la mucosa oral indicativas
de procesos malignos. Para confirmar su diagnóstico, el odontólogo recurre al estudio de
biopsias de las lesiones por técnicas histoquímicas y moleculares; dentro de las técnicas
moleculares, se pretende detectar mutaciones del gen p53 que está implicado en actividades
antitumorales, ya que las mutaciones en este gen están asociadas a procesos malignos
(cáncer). Para detectar dichas mutaciones, se realizó una PCR para detectar el gen p53 y
luego se secuenció este para confirmar si estaba normal (secuencia esperada de nucleótidos)
o mutado (alteración en la secuencia de nucleótidos).
1. ¿Cómo esperaría usted encontrar o visualizar el producto de esta PCR en caso de que
hubiese alguna mutación en el gen? ¿Habría alguna alteración en el corrido
electroforético del fragmento amplificado en comparación con el control positivo?
2. ¿Por qué fue necesario secuenciar el gen para confirmar si había mutación?
Ejercicio 3
En una institución de protección de fauna silvestre han recuperado de cautiverio un ave
psitácida. Para el proceso de identificación, recuperación y reproducción del ave, el
personal del centro necesita saber el sexo de este, sin embargo, no es posible hacerlo
fenotípicamente porque esta especie no presenta dimorfismo sexual. Para identificar el sexo
se toma muestra de ADN y se amplifica por PCR el gen CHD. Se sabe que los machos tienen
cromosomas ZZ (homocigóticos) y las hembras cromosomas ZW (heterocigóticos),
características que generan diferencias en los fragmentos amplificados del gen CHD pues se
conoce que el fragmento derivado del cromosoma W siempre es más grande que el Z. Así,
en los machos se obtiene una sola banda de ADN amplificado luego de una PCR y en las
hembras dos bandas de diferente tamaño (correspondientes a los fragmentos derivados de Z
y W, respectivamente). En la figura 2 se ilustra el resultado de la PCR.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
79
Figura 2. Resultado de la PCR
1. ¿Cuál es el sexo del ave?
2. ¿Funcionó adecuadamente esta PCR? ¿Por qué?
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Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
81
Anexo 1. Normas de ingreso para la práctica de laboratorio de biología molecular o similares
Mantener niveles de asepsia y normas de bioseguridad con altos estándares es una prioridad
en las ciencias de la salud para aquellos espacios donde se trabaja con objetivos docentes,
con piezas humanas, placas con tejidos o cultivos celulares, por ello se ha elaborado un
manual particular para hacer uso de este en las presentes prácticas. Lo anterior cobija las
prácticas docentes, por esto se hace necesario su conocimiento y divulgación, previo al
inicio del curso.
Ingreso al laboratorio
1. Los estudiantes deben esperar al profesor fuera del laboratorio.
2. Una vez el profesor ingrese al laboratorio, debe esperar 10 minutos a que ingresen todos
los estudiantes, tiempo a partir del cual se cerrará la puerta y se impedirá el ingreso a los
estudiantes.
3. Al iniciar la práctica el estudiante deberá aportar el material que le sea solicitado
dependiente de cada práctica.
4. Los estudiantes que no lleven el material requerido para el laboratorio no podrán estar en
la práctica.
Medidas de seguridad
1. Los estudiantes deberán usar batas blancas, largas y limpias para entrar al laboratorio
(estándar para la Universidad Cooperativa de Colombia).
2. Los estudiantes deberán usar gafas de protección y guantes de látex en el desempeño
de la práctica cuando esta lo requiera.
3. Los estudiantes no podrán comer, beber, masticar chicle, fumar y, en general, llevar
objetos a la boca dentro del laboratorio, al igual que no deben usar teléfonos celulares.
4. El aseo del laboratorio es de primordial importancia, por lo que los estudiantes deberán
cooperar con el mantenimiento de la limpieza de sus mesones de trabajo y del material
que así lo requiera. Deberán limpiar con solución desinfectante el área de trabajo antes
de empezar y después de terminar la práctica.
5. La basura debe colocarse en los recipientes correspondientes, no deberá ser guardada
en los cajones o vertederos. Así mismo, no deberán tirarse residuos o desperdicios a los
lavabos.
6. Los estudiantes son responsables de que las llaves del agua y del gas de sus mesas de
trabajo queden debidamente cerradas al finalizar la práctica.
7. Los estudiantes deberán abstenerse de colocar sobre las mesas de trabajo cualquier
material que no sea requerido para la realización de la práctica. Todos los objetos
personales deberán ser guardados en las áreas asignadas.
8. En caso de cualquier accidente o contaminación accidental, el estudiante deberá
notificar de inmediato al profesor.
9. Los estudiantes no podrán permanecer dentro del laboratorio después de que el
profesor haya salido.
10. Los estudiantes deben lavarse las manos con agua y jabón al finalizar cada práctica (o
antes de salir del laboratorio).
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
82
Anexo 2. Presentación de informes
Los informes de las prácticas se entregarán a la semana siguiente de haberse realizado y
seguirán el siguiente protocolo:
Portada
1. Nombre de la universidad
2. Facultad
3. Materia
4. Grupo
5. Título de la práctica
6. Nombre del estudiante
7. Fecha
Introducción
1. Fundamentos teóricos
Materiales y métodos experimentales
1. Materiales utilizados
2. Descripción breve de las técnicas o métodos experimentales utilizados
Resultados 1. Descripción de los resultados obtenidos
2. Tablas
3. Figuras
4. Gráficas
5. Análisis de los datos
Cuestionarios
Estos deben ser suministrados por el profesor.
Discusión 1. Análisis de los resultados obtenidos
2. Observaciones
3. Conclusiones
4. Recomendaciones
Bibliografía 1. Libros
2. Artículos
3. Sitios de Internet
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
83
ANEXO 3. Planificación académica
Grupos de trabajo
1. Los estudiantes deberán crear grupos de trabajo el primer día del curso y estos serán
mantenidos por el resto del semestre.
2. En cada práctica se dotará a cada grupo del material de trabajo que utilizará,
responsabilizándose de su integridad para entregarlo al finalizar la práctica. El material o
equipo que sea destruido o perdido será restituido por el grupo responsable.
Obligaciones prepráctica
1. Los estudiantes deberán presentarse al laboratorio adecuadamente preparados, con los
materiales o las revisiones bibliográficas referentes a la práctica.
2. El estudiante debe leer con detenimiento la técnica a seguir y, en caso de existir dudas,
consultar con el profesor antes de iniciar la práctica.
3. Se hará en algunos casos un examen previo sobre la práctica a realizar.
Desarrollo de la práctica
1. Los estudiantes deben mantener el orden dentro de los laboratorios.
2. Al inicio de cada práctica se designará un estudiante como responsable de seguridad
para verificar que se cumplan las normas de este reglamento.
3. Los estudiantes y profesores deben planear su trabajo de manera que la práctica se
complete puntualmente, y puedan salir del laboratorio 10 minutos antes de la próxima
clase o práctica, previendo el tiempo que utilizarán para recoger, ordenar el material y
limpiar su mesa.
4. No se permite el desarrollo de actividades diferentes a la práctica durante la estancia en
el laboratorio, lo cual incluye estudiar otras materias o realizar trabajos.
5. No se permite visitas personales por parte de los estudiantes.
Obligaciones pospráctica
1. Los estudiantes deben enjuagar el equipo utilizado y disponer de los residuos generados
de la manera adecuada.
2. Los estudiantes deberán colocar el material utilizado en la zona designada para la
recolección de equipo.
3. Los estudiantes deberán verificar que las llaves de agua y gas de su mesa de trabajo
estén completamente cerradas.
Informes sobre prácticas de laboratorio
1. El informe de la práctica deberá ser entregado en la siguiente semana de su realización.
2. El informe deberá ser entregado antes del inicio de la siguiente práctica al profesor. El
profesor anotará en el formato correspondiente la constancia de recepción del informe.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
84
Es responsabilidad del estudiante verificar que se diligencie ese formato. Por ningún
motivo se recibirán informes extemporáneos.
3. El informe de prácticas se considera un trabajo original generado por cada estudiante o
grupo de trabajo. El contenido de la práctica deberá ser redactado íntegramente por el
estudiante, y cuando se utilicen citas textuales, debe de indicarse la fuente. La copia de
material sin acreditar al autor se considera plagio, el cual será reportado a las autoridades
académicas de la facultad.
Sanciones
1. El incumplimiento de estas normas será sancionado por el profesor, y dentro de los
marcos que contempla el reglamento académico.
2. Se emitirá un reporte a las directivas académicas de la facultad.
3. Si los incumplimientos persisten se expondrá el caso ante el Consejo de Facultad.
4. En caso de encontrarse copias o reproducciones en el contenido de los informes de las
prácticas, se anularán ambas copias y se le enviará el informe de la falta disciplinaria a
las directivas académicas correspondientes.
Bioseguridad en los laboratorios
Pasos a seguir después del accidente
1. Exposición percutánea: lave inmediatamente el área expuesta con agua y jabón
germicida; si la herida está sangrando, apriétela o estimule el sangrado, siempre que el
área corporal lo tolere. Después, aplique solución desinfectante después de concluido el
lavado.
2. Exposición en mucosas: lave profusamente el área con agua o solución salina.
3. Exposición en piel no intacta: lave el área profusamente con solución salina y aplique
solución antiséptica.
4. Exposición en piel intacta: lave simplemente el área con agua y jabón profusamente.
Evaluación del accidente
1. Reportar accidente: todos los estudiantes y el personal que labore en el laboratorio deben
conocer la importancia de informar inmediatamente una exposición ocupacional y tener
garantías de la confidencialidad y el respeto con el cual será tratado.
2. El reporte se debe hacer dentro de las primeras 24-72 horas de presentado el accidente.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
85
Tabla 1.
Convenciones para alertas de accidentalidad en el laboratorio
Símbolo Leyenda
Las superficies pueden calentarse durante su uso.
Esta es capaz de generar corrientes letales. Utilice las mismas precauciones que con cualquier dispositivo eléctrico. No opere sin la cubierta en su lugar. No
opere en humedad o ambientes húmedos en los cuales esta pueda causar daño en los componentes eléctricos internos, no opere con cables conectores con
alambres sueltos.
Radiación ultravioleta que puede ser perjudicial para la piel y los ojos, no se exponga a esta radiación sin protección ocular o de piel.
Nota.
Etiqueta de un producto químico
El etiquetado reglamentario de las sustancias y los preparados peligrosos es un medio
sencillo para informarle y alertarle sobre los peligros relacionados con su utilización.
Cuando los productos son transvasados, la etiqueta deberá ser sistemáticamente
reproducida.
1. En las etiquetas habrá, entre otras cosas, uno o varios símbolos de peligro, así como un
número restringido de indicaciones sobre los riesgos y sobre las medidas de prevención
a adoptar.
2. La etiqueta le informa inmediatamente sobre el producto y le permite evitar confusiones
y errores a la hora de utilizarlo.
3. La etiqueta es imprescindible en caso de accidente, le dará las indicaciones necesarias
sobre el comportamiento a seguir en caso de accidente.
Figura 1. Etiquetas de indicaciones para prevenir accidentes en el laboratorio.
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
86
Convenciones
1: identificación del producto (nombre químico de la sustancia o nombre comercial del
preparado).
2: composición (para los preparados, relación de sustancias peligrosas presentes según
concentración y toxicidad).
3: responsable de la comercialización (nombre, dirección y teléfono).
4: identificación de peligros.
5: descripción del riesgo (frases R*).
6: medidas preventivas (frases S*).
Pictograma de productos químicos
Tabla 3.
Etiquetas para riesgos de incendio o explosión
Símbolo Significado Descripción de los riegos Medidas preventivas
F – Fácilmente inflamable
Productos de fácil inflamación por la acción de
una fuente de energía (llama, chispa) a temperatura
ambiente.
Prohibido fumar. Almacenar los productos en un
lugar bien ventilado. Guardar los productos
inflamables . (Símbolo F) bien separados de los productos comburentes (O). No utilizar cerca de una fuente
de calor. No llevar ropas sintéticas.
F+ – Extremadamente
inflamable
Productos que pueden inflamarse fácilmente por la
acción de una fuente de energía (llama, chispa)
incluso por debajo de los 0º.
O – Comburente
Productos que pueden favorecer o activar la
combustión.
E – Explosivo
Productos que pueden explotar por la acción del
calor, de un choque o de un rozamiento
Prohibido fumar. Evitar el exceso de calor y proteger contra los rayos
solares. No ponerlos cerca de fuentes
de calor, lámparas, radiadores, etc.
Nota. Elaboración propia
Guías de práctica Manual de prácticas de laboratorio en biogenética
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Tabla 4. Etiquetas para riesgos de alteración de la salud
Símbolo Significado Descripción de los riegos Medidas preventivas
R – Radioactivo
Cancerígenos o problemas de esterilidad.
Productos peligrosos en caso de penetración en el organismo por la nariz, la boca o a través de la piel. Productos que pueden alterar el
conjunto del organismo o lesionar únicamente, ciertos órganos: pulmones, hígado, corazón,
nervios. Pueden causar profundas
alteraciones en el organismo, incluso la muerte. Dependiendo
del grado de toxicidad que presentan, estos productos son
calificados de “Tóxicos” y de “Muy tóxicos” o de “Nocivos”.
Ciertos de estos productos son definidos como cancerígenos, ya
que pueden provocar cáncer. Otros son definidos como
mutágenos, ya que pueden implicar mutaciones genéticas que
pueden provocar tumores.
Prohibido fumar
Utilizar equipos de protección individual (EPI) para evitar
cualquier contacto. Trabajar en locales bien
ventilados. Buena higiene: lavarse las
manos, no comer durante la utilización de los productos.
Conservar los productos en el envase de origen.
Tras el uso, lavarse bien la cara y las manos.
Verter siempre el producto en el agua y no al contrario.
T – Tóxico
T+ – Muy Tóxico
X n – Nocivo
X I – Irritante
C – Corrosivo
Productos que pueden provocar la destrucción de tejidos vivos. Queman la piel y las mucosas,
pueden producir lesiones graves que pueden provocar
cicatrices. Nota. Elaboración propia
Tabla 5.
Etiquetas para riesgos del medio ambiente
Símbolo Significado Descripción de los riegos Medidas preventivas
N – Peligro para el medio ambiente
Se trata de sustancias contaminantes y tóxicas para la fauna, para el aire, la
capa de ozono.
Tratar el producto y sus desechos (separe, recicle,
elimine), según la legislación.
Nota. Elaboración propia
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Almacenamiento de sustancias teratógenas, mutagénicas y cancerígenas
Son aquellas sustancias que, con base en las monografías de la Agencia Internacional del
Cáncer (IARC), están catalogadas como:
1. Carcinógenos para los humanos o razonablemente sospechoso como cancerígenos a los
humanos.
2. Teratógenos o mutagénicas para los humanos.
3. Almacenar las sustancias carcinógenas, mutagénicas y teratógenas separadas de otras
sustancias.
4. Identificar en un croquis o un plano de laboratorio la localización de estas sustancias.
5. Limitar la cantidad almacenada de estas sustancias a lo estrictamente necesario para una
semana de trabajo.
6. Mantenga un inventario de las sustancias carcinógenas en el laboratorio.
7. Mantenga al personal femenino en estado de gestación totalmente aislado de las áreas
donde se utilicen estas sustancias.
Normas de seguridad en la utilización de equipos
1. Los equipos y aparatos nunca deben colocarse en zonas de paso, en particular en los
pasillos del laboratorio.
2. Todos los aparatos con toma eléctrica deberán cumplir las normativas de seguridad
correspondientes. Nunca deben utilizarse en zonas mal aisladas y expuestas a la
humedad.
3. Las fuentes de calor (calentadores, termobloques, etc.), sobre todo si se alcanzan
temperaturas elevadas, deberán estar debidamente señalizadas para evitar quemaduras
accidentales.
4. Todos los procedimientos de utilización de aparatos deberían contar obligatoriamente
con apartados relativos a su utilización segura.
Es necesario aclarar que para cada equipo existen ciertas normas según su empleo o
función en el laboratorio, como es el caso de neveras, congeladores, incubadoras,
termocicladores, baños serológicos, centrífugas, etc.