Microbiología

Manual de Prácticas

Nombre del alumno: ___________________________________

Nombre del laboratorista:_______________________________

Nombre del profesor:___________________________________

Grado & Grupo: ________________

UNIVERSIDAD DE COLIMA

DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN MEDIA SUPERIOR

MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA

Elaborado por: Q.F.B. Mónica Alcaraz Munguía

Aprobado por la Academia Estatal de Microbiología: M.V.Z. Eduardo Aguilar Torres

M.V.Z. Gustavo Valpuesta Vega QFB. María Mercedes Suárez Bravo

QFB. Patricia Edwigis Valladares Celis

Supervisado por: Licda. Laura Araceli Jiménez Cobián

AGOSTO DEL 2009

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JUSTIFICACIÓN

El presente trabajo se elaboró con la finalidad de proporcionar un

material ordenado y de fácil acceso al trabajo académico el cual se

complementa con la actividad científica en el laboratorio.

Actualmente no se encuentra un manual de prácticas de microbiología

en el nivel medio superior dentro de la página de la Universidad de Colima

ni en bachilleratos que tengan el área Químico Biólogo o un área en común en

donde se contemple la asignatura de microbiología general en el nivel medio

superior.

La intención de este manual es satisfacer las necesidades del docente en los

aspectos teóricos llevados en el aula con la actividad científica desarrollada

en el laboratorio de tal forma que se nos facilite el trabajo ordenado y

uniforme en todos los bachilleratos.

El manual consta de quince prácticas y fue elaborado tomando en cuenta

las referencias bibliográficas que marca el programa de educación media

superior de la Universidad de colima para la asignatura de Microbiología.

La elaboración del manual se realizó en varias etapas mediante la

recopilación de prácticas. Cada práctica inicia con el título en la parte central

el cual se seleccionó de acuerdo a la dosificación del programa por semana. El

objetivo hace referencia al aspecto significativo que se pretende que los

alumnos logren al final del experimento. La introducción es la parte teórica de

cada una de las prácticas, fue tomada de diversas referencias bibliográficas. En

la parte experimental el procedimiento se tomó de diversos manuales de

otras Universidades y de la misma Universidad de Colima.

El cuestionario en el que el alumno demuestra su aprovechamiento logrado al

final de la secuencia de aprendizaje se elaboró basado en el aspecto

introductorio y resultados experimentales que se esperan de cada práctica.

Así mismo se complementa con observaciones que el alumno realizará

mediante dibujos o esquemas y finalizará con conclusiones personales del

mismo.

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INDICE DE PRÁCTICAS

Página

Práctica No 1 Empacado del material y esterilización

por calor seco.............................................................................. 7

Práctica no 2 Esterilización por calor húmedo

Práctica No 3 Preparación de medios de cultivo

Sólidos........................................................................................ 21

Práctica No 4 Preparación de medios de cultivo

Líquidos....................................................................................... 21

Práctica No 5 Sembrado en placa de microorganismos

del medio ambiente..................................................................... 28

Práctica No 6 Aislamiento de Hongos mediante el

método extensión en placa.......................................................... 32

Práctica No 7 Aislamiento de bacterias mediante el

método sembrado en placa por estrías........................................ 35

Práctica No 8 Manejo y uso del microscopio

óptico Compuesto……………………………………………………

Práctica No 9 Tinción de la cápsula bacteriana.................................................. 40

Práctica No 10 Tinciones selectivas..................................................................... 42

Práctica No 11 Tinción de Gram........................................................................ 46

Práctica No 12 Tinción ácido-Alcohol resistente................................................. 49

Práctica No 13 Efecto de la presión osmótica sobre la viabilidad

y el crecimiento de los microorganismos.................................. 51

Práctica No 14 Determinación del tiempo y punto térmico

mortal en microorganismos....................................................... 54

Práctica No 15 Inhibidores bacterianos.............................................................. 58

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RECOMENDACIONES GENERALES

1.-La hora de entrada tendrá 10 minutos de tolerancia, después de este tiempo,

no se permitirá al acceso al laboratorio

2.-Al entrar al laboratorio, el alumno deberá ponerse la bata y abotonarla

completamente, sólo podrá quitársela al salir de éste.

3.- Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas

deberán ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo.

4.- No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningún objeto a la

boca.

5.- Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.

6.- Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de usarla.

7.- No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deberá efectuarse

sentado y en su equipo de trabajo.

8.-Hablar sólo lo necesario con los compañeros.

9.- Días antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente que es lo que se va a

realizar, si no entiende pregunte al profesor.

10.- Si hay necesidad de llevar material biológico para la realización de la

práctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la práctica se suspenderá

para todo el equipo.

11.- El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deberá esterilizarse en

la flama del mechero, antes y después de su uso.

12.-Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.

13.-En caso de derramar material que contenga microorganismos, cúbralo con

fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor.

14.- Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio

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indicado por el profesor.

15.-Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo,

grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno.

16.- Después de la incubación es necesario la esterilización del material para

eliminar microorganismos que pudieran hacernos daño a nuestra salud.

17.- Lávese las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio.

18.- Es obligación de cada equipo entregar todo el material limpio.

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FÓRMULA Y PREPARACIÓN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES

PRÁCTICAS DE ESTE CURSO

1.- SOLUCIÓN DE AGUA OXIGENADA AL 10%

PREPARACIÓN

Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de agua oxigenada en 9 ml de agua destilada

2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5%

PREPARACIÓN

Azul de metileno 5.0 gr

Agua destilada 100 ml

3.- REACTIVOS DE LA TÉCNICA DE GRAM

A) COLORANTE CRISTAL VIOLETA

FÓRMULA:

Cristal violeta 2.0 gr

Etanol al 95% 20 ml

Oxalato de amonio 0.8 gr

Agua destilada 80 ml

PREPARACIÓN:

1.- Disolver el cristal violeta en el etanol

2.- Disolver el oxalato en el agua

3.- Mezclar las dos soluciones

B) SOLUCION DE LUGOL

FORMULA

Yoduro de potasio 10.0 gr

Agua destilada 20.0 ml

Yodo metálico 5.0 gr

Etanol, aforar a 100.0ml

PREPARACIÓN:

1.- Disolver el yoduro de potasio en el agua

2.- Agregar el yodo metálico y disolver

3. Aforar a 100 ml con etanol

C) SOLUCIÓN DE ALCOHOL ACETONA

FORMULA

Acetona 1

volumen

Etanol al 95% 2

volúmenes

D) COLORANTE SAFRANINA

FORMULA

Safranina 0.5 gr

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7

Agua destilada 100.0 ml

PREPARACIÓN

Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, después aforara a 100 ml

con más

agua.

4.- REACTIVOS DE LA TÉCNICA DE ZIEHL- NEELSEN

A) COLORANTE FUCSINA FENICADA

FORMULA:

Fucsina básica 5.0 gr

Fenol 25.0 grs

Etanol al 95% 50 ml

Agua destilada aforar a 500 ml

PREPARACIÓN

1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en baño a ebullición

2.- Añadir la fucsina básica y disolver

3.- Añadir el etanol y mezclar

4.- Aforar la solución a 500 ml con agua destilada

B) SOLUCIÓN DE ALCOHOL ÁCIDO

FORMULA

Ácido clorhídrico 3.0 ml

Etanol al 95 100.0 ml

PREPARACIÓN

Adicionar el ácido clorhídrico al etanol, lentamente y agitando

C) COLORANTE AZUL DE METILENO

FORMULA

Azul de metileno 5.0 gr

Agua destilada 100.0 ml

5.- MEZCLA CRÓMICA

Dicromato de potasio

20.0 gr

Ácido sulfúrico concentrado

20.0 ml.

Agua destilada

250.0 ml.

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EMPACADO DEL MATERIAL Y ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

Práctica No 1

Nombre Del Alumno:__________________________________Semestre______ Grupo______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio__________________________________ Calif:__________

OBJETIVO:

El alumno aprenderá el procedimiento para empacar diversos materiales de uso en

microbiología así como el procedimiento de la esterilización por calor seco de estos.

SUSTANCIAS QUIMICAS MATERIAL

Detergente Extran Matraces

Agua destilada Tubos de ensaye

Horno a 170·C Pipetas

Termómetro Cajas de petri

Papel estraza

Algodón

Escobillones

INTRODUCCION.

EMPACADO DEL MATERIAL

Antes de iniciar un empaque del material que se desea esterilizar, es necesario que

todas las prácticas que se realicen estén en condiciones de esterilidad y se debe, en primer

lugar, limpiar el área de trabajo con alguna sustancia desinfectante y encender el mechero.

Se emplearán distintos agentes germicidas y desinfectantes (soluciones de hipoclorito de

sodio, cloroxilenol, formaldehído, etc.) para desinfectar superficies.

El material a esterilizar se deberá de empacar correctamente con papel estraza Una

de las razones de la importancia del papel en nuestra vida cotidiana es la enorme cantidad

de usos que se le pueden dar a este producto. De la misma manera, el papel puede

adaptarse a las diferentes utilidades que se vayan a realizar llegando a contabilizarse hasta

457 variedades diferentes de papel. Las variedades dependen de una serie de características

físicas que hacen que el papel se pueda adaptar a diferentes usos como: Impedir el ingreso

de microorganismos al interior, Sellar en forma completa para evitar contaminación,

Soportar la tracción y manipulación habitual sin sufrir deterioro y hacer permeable al

método de esterilización seleccionado. Todo esto se logra Empacando en primer lugar en

campo de algodón, y posteriormente en empaque mixto o en polipropileno de acuerdo

con el tamaño del material.

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ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

La muerte microbiana se produce por una esterilización, ya sea como consecuencia

de mecanismos de transferencia de energía, además de la oxidación. En la esterilización por

Calor seco existe una destrucción de los microorganismos oxidando sus constituyentes

químicos, desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de las células así como

fragmentando las membranas celulares. Para materiales que deben permanecer secos como

ciertos instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de petri, pipetas, así como

aceites, polvos ( por ser impermeables al vapor), los materiales que no se pueden esterilizar

por calor seco son: Material textil (algodón, sedas, lino, etc.), Gomas y Materiales sintéticos

Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se dispone de hornos eléctricos por

los que circula aire caliente, en vista ¡de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se

acostumbra a aplicar una temperatura de 160·C a 170·C durante una hora o más. Para

materiales de vidrio de laboratorio es suficiente una exposición de dos horas de duración a

160·C ( 320 ·F) para que quede esterilizado. Otras formas útiles de calor seco incluyen

incineración para objetos que deben ser destruidos y flameados por pasaje de agujas o

pequeños instrumentos a través de la llama de un mechero bunsen

PROCEDIMIENTO

I) EMPACADO DEL MATERIAL

l.- Lava el material de laboratorio, principalmente la cristalería con detergente Extran o

Alkox (Fácilmente se contamina con esporas difíciles de eliminar) enjuaga con abundante

agua de la llave y en seguida con agua destilada.

2.- Secar el material utilizando papel absorbente para acelerar el secado

3.-Empaca el material correctamente

A) CAJAS DE PETRI

Corta el papel estraza, en forma de rectángulos adecuados para la cantidad de 2 a 3

cajas. Colócalas en la parte central y Envuélvelas según te indique tu profesor.:Se toman

los extremos de Papel y se unen , Se hace un nuevo doblez recargando ligeramente

en la caja para marcarlo, Los extremos se doblan en forma triangular .Ya en forma

triangular se doblan hacia atrás quedando listas para esterilizar.

B) PIPETAS

Introduce una pequeña porción de algodón en el cuello de la pipeta, procurando que

quede lo suficientemente apretada. Con tiras de papel de 3 cm de ancho envuélvelas,

comenzando por la punta y en forma de espiral gira hacia arriba hasta el final de la pipeta.

C) TUBOS DE ENSAYE.

Se toma el tubo con la mano izquierda y con la derecha el tapón de algodón. Coloca

algodón en la boca del tubo a 1/5 parte de la longitud del mismo procurando que quede

bien apretado, deposítalos en recipientes adecuados, tápalos con papel estraza y átalos.

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D) MATRACES.

Tapa el cuello del matraz con algodón, lo suficientemente apretado para evitar que se

destape ( se tapa en la misma forma que el tubo). Como protección coloca un gorrito de

papel estraza y átalo con cinta.

E) MATERIAL METÁLICO

El asa de platino, tijeras, bisturí, material quirúrgico no es necesario empacarlo para

su esterilización.

II) ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO

1.-Las normas de Procedimiento de la Institución establecerán las condiciones de trabajo

según la carga, volumen, peso, resistencia térmica del material. Es imprescindible respetar

los parámetros obtenidos en la validación del procedimiento. La temperatura de

esterilización por Calor Seco deberá estar entre 160·C a 170 °C. y el tiempo de aplicación

será de una hora o más.

2.- El material a esterilizar se deberá cargar con el esterilizador frío, teniendo en cuenta las

siguientes recomendaciones: Cada unidad deberá quedar separada de las vecinas

Los materiales no deberán estar en contacto con las paredes, piso y techo del esterilizador

La carga del esterilizador será homogénea y no deberá superar el 80% de la capacidad total

de la cámara

3.-Colocar el material dentro del Esterilizador. Encender el Esterilizador, Verificar que los

instrumentos de control de ciclo, tiempo ( l hora) y temperatura( 170·C) se encuentren en

la posición correcta. Esperar hasta que los instrumentos de medición alcancen la

temperatura seleccionada para el ciclo

4.- Cuando se alcance la temperatura seleccionada, se comenzará a descontar el tiempo de

esterilización. Cumplido el tiempo de exposición se apagará el Esterilizador

La descarga del Esterilizador se efectuará una vez que el material se haya enfriado.

5.-Durante el ciclo de Esterilización no deberá abrirse la puerta del Esterilizador porque ello

implicaría abortar el ciclo, debiendo en este caso recomenzarlo, además de que el cambio

de temperatura rompería la cristalería

6.- una vez alcanzada la temperatura de 160ºC en el horno con aire caliente coloca todo el

material

que se empacó y toma el tiempo de 2 horas para su esterilización

CUESTIONARIO:

1.- Porqué antes de una esterilización es necesario lavar y desinfectar el

material?________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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2.- ¿Es necesario un secado del material en el horno antes del empacado con papel estraza?

¿Porque?________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3.- Qué finalidad tiene el empacado antes de la

esterilización?____________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.- Puede ser utilizado otro tipo de papel que el de estraza? ¿Por

qué?____________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

5.- Qué finalidad tienen los tapones de algodón que se colocan en los extremos de las

pipetas y de los Matraces Erlen

Meyer__________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

6.- Qué desventaja tiene el utilizar la esterilización por calor seco en este

laboratorio?_____________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.- Cómo actúa la esterilización por calor seco en los

microorganismos?________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

8.- A qué temperatura y cuánto tiempo tendrás que emplear para esterilizar por calor seco

el material de laboratorio para asegurar la destrucción de microorganismos patógenos y

esporas?_________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES

Realiza los dibujos correspondientes del procedimiento de empacado que realizaste para

cada tipo de material de laboratorio. Así mismo dibuja el horno en donde realizaste la

esterilización por calor seco.

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CONCLUSIONES

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

Práctica No 2

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_______________________________ Calif:_____________

OBJETIVO:

El alumno conocerá y aplicará el procedimiento de esterilización por calor húmedo, así

como las ventajas del procedimiento.

MATERIAL SUSTANCIAS

Reloj Agua de la llave

Autoclave u olla de presión Extran

3 Soporte universal Alkox

2 mechero fischer

Material de cristalería limpio, seco y empacado

Asa de platino

INTRODUCCIÓN

AGENTES FÍSICOS ANTIMICROBIANOS.

A) CALOR HÚMEDO.- La temperatura elevada, combinada con una humedad elevada, es

uno de los métodos más efectivos para matar microorganismos. El calor húmedo mata a los

microorganismos coagulando sus proteínas. Es mucho más rápido y efectivo que el calor

seco. El vapor a presión proporciona temperaturas por encima de las que se pueden

obtener al hervir. Tiene la ventaja de un calentamiento rápido, así como penetración rápida

y abundante humedad..

El aparato a esterilizar que utiliza vapor de agua a presión regulada se denomina

autoclave. Consta de una cámara de doble pared que se llena de vapor saturado libre de

aire y se mantiene a la temperatura indicada y a la presión establecida durante un periodo

de tiempo determinado. Generalmente el autoclave funciona a una presión de 15 libras/

pulgada cuadrada a 121·C ( 249·F). El tiempo de funcionamiento para lograr la esterilidad

depende de la naturaleza del material que se va a esterilizar, del tipo de envase y del

volumen del material. Una temperatura de l00·C es la suficiente para matar a todas las

formas bacterianas en 2 o 3 minutos, excepto a las esporas, para matar a estas se requiere

una temperatura de 121·C durante 15 minutos y a una presión de 15 libras.

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Este método es adecuado para esterilizar aparatos que tienen hule, jeringas que

contienen metal, para medios de cultivo que contienen un azúcar especial dextrosa. El

autoclave se puede sustituir por la olla de presión.

B) CALOR SECO.- En este tipo de esterilización existe una destrucción de los

microorganismos oxidando sus constituyentes químicos, desnaturalizando las proteínas y los

ácidos nucleicos de las células así como fragmentando las membranas celulares. Para

materiales que deben permanecer secos como ciertos instrumentos de vidrio de laboratorio

tales como: cajas de petri, pipetas, así como aceites, polvos ( por ser impermeables al

vapor), los materiales que no se pueden esterilizar por calor seco son: Material textil

(algodón, sedas, lino, etc.), Gomas y Materiales sintéticos

Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se dispone de hornos eléctricos por

los que circula aire caliente, en vista ¡de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se

acostumbra a aplicar una temperatura de 160·C a 170·C durante una hora o más. Para

materiales de vidrio de laboratorio es suficiente una exposición de dos horas de duración a

160·C ( 320 ·F) para que quede esterilizado. Otras formas útiles de calor seco incluyen

incineración para objetos que deben ser destruidos y flameados por pasaje de agujas o

pequeños instrumentos a través de la llama de un mechero bunsen

PROCEDIMIENTO

C) ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO (vapor a presión)

1.- Lava el material que te proporcione tu profesor con mezclas adecuadas como Extran,

mezcla Crómica con concentraciones adecuadas tomando en cuenta lo sucio del material,

seca en estufa o en forma manual con papel absorbente y empácalo. Tenlo listo para su

esterilización.

2.- Coloca el agua necesaria en la autoclave u olla de presión hasta la marca e introduce

unas gradillas metálicas que servirán de base al material a esterilizar. Coloca el material a

esterilizar dentro de la autoclave u olla de presión, evitando que el material toque las

paredes.

3.- Cierra la autoclave u olla de presión, cuidando de dejar abierta la válvula de salida de

vapor que ayudará a expulsar el aire contenido dentro y que éste es desplazado por el

vapor que se produce. .- si el aire no fue eliminado totalmente de la autoclave, el

manómetro aumentará a 15 libras. Pero la temperatura no habrá alcanzado los 12l·C. Por

esto se debe medir el tiempo cuando la temperatura llegue a l12·C

4.- Cierra la válvula cuando el vapor sea continuo. La temperatura de l05·C indica que está

libre de aire. Vigila el termómetro. Cuando vaya en 120·C, mantenla durante 15 minutos

para que se efectúe la esterilización (15 libras de presión). Transcurrido este tiempo se corta

la fuente de calor.

5.-Deja enfriar hasta que el manómetro marque cero. Abre la válvula de salida de vapor,

para expulsar el vapor restante. Abre el autoclave y retira el material

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6.- Si el material no está en estado líquido la válvula se puede abrir rápido a la salida de

vapor, pero si está en estado líquido la rápida pérdida de presión las hace hervir o bien

saltar los tapones. Por lo tanto se espera unos minutos a que se enfríe perfectamente

CUESTIONARIO.

1.- Cuál material se puede esterilizar por calor seco y cuál no. ¿Porqué?

_______________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

2.- Qué tipo de material se puede esterilizar por calor

húmedo?________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3.- A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen todas las formas vegetativas?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.- A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen las esporas?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

5.- Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor

seco?___________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

6.- Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor

húmedo?________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.-Cómo actúa la esterilización por calor seco en los microorganismos?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

8.- Cómo actúa la esterilización por calor húmedo en los microorganismos?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

9.- Qué tipo de esterilización es más recomendable y por qué?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES:

Realiza esquemas y dibujos correspondientes a la esterilización por calor húmedo que

realizaste en la práctica

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CONCLUSIONES:

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS

Práctica No 3

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Prof. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO:

Adiestrar al alumno en la preparación de diferentes medios de cultivo

MATERIAL SUSTANCIAS

4 Matraz Erlen Meyer de 250 ml Agar nutritivo

1 Baño maría Miuller Hinton

3 Tripies Agar base sangre

2 Mecheros Fisher Agar Macconkey

3 Telas de asbesto Agar- Manitol- Sal- Agar

Agitador

4 Vaso de precipitado de 250 ml

1 Espátula

1 Vidrio de reloj

Cajas de petri

Tapones de algodón

Autoclave u olla de presión

Papel estraza

Tubos de ensayo 16X150

INTRODUCCIÓN

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El

material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el

crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.. Para que las bacterias crezcan

adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como

son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado

correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y

factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo

contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos

similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de

muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se

añadirán otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la

preparación de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran

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numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre

completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales:

para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de

los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden

para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Por su aspecto

físico.

Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su aspecto en: :

Líquidos, Semisólidos, Sólidos. Y por su uso en: I.- Medios de cultivos básicos II:_ Medios de

cultivos especiales como: mejorados, selectivos, diferenciales, de transporte.

PROCEDIMIENTO:

1- Primeramente se desinfecta el área de trabajo con fenol al 5% o alcohol y se enciende el

mechero

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS

1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad

necesaria según el volumen requerido.

2.- Colocar el medio en un vaso de precipitado que contenga el agua destilada en el

volumen requerido, agitar y calentar a ebullición para disolver el Agar. En el último paso se

debe tener cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso y el producto tiende a hervir y

proyectarse, lo cual puede producir serias quemaduras. El Agar disuelto hace transparente al

medio que originalmente estaba turbio. Puede utilizarse un baño maría para aumentar la

solubilidad.

3.- Si se va a envasar en cajas de petri, es necesario conservar el medio en un matraz y

esterilizarlo a 121·C durante 15 minutos. Al terminar, es conveniente mantener el mechero

encendido para formar un área de esterilidad al momento del vaciado en las cajas de petri

aproximadamente de 15 ml. A 20 ml De Agar por caja procurando que no se forman

burbujas. Tapar la caja inmediatamente

4.- Si se desea que el Agar quede en tubos, entonces se esterilizará el Agar directamente en

ellos a 121·C durante 15 minutos tapados con algodón, gasa y papel estraza. Si desea que

solidifiquen inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinándolos en un ángulo de 20 a

30 · sobre una varilla de vidrio.

5.- . Para preparar el Agar base Sangre es necesario Adicionar en condiciones de asepsia

sangre desfibrinada estéril en concentración final de 15%. Después de la e sterilización del

Agar base Mezclar cuidadosamente y poner en cajas petri estériles.

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A) VACIADO EN CAJAS DE PETRI

3.- No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan a ser utilizadas. Es

conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a realizar el vaciado y evitar

hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo.

4.- Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del área estéril al

momento del vaciado en las cajas de petri. Levantar la tapadera de la caja petri con la

mano izquierda , sin soltarla y sin retirarla demasiado de la base de la misma caja

mientras que con la mano derecha tomar el matraz que contiene el medio de cultivo y

realizar el vaciado de aproximadamente 15 ml. A 20 ml de Agar por caja procurando que

no se forman burbujas, se procede a tapar la caja inmediatamente

5.- Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la superficie

de la caja de petri y de manera rápida. Se procede a tapar la caja.

6.- Esperar a que el medio solidifique, Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha

y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el mismo día se

sujetan con cinta y se colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar que el

vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar

7.- Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, será necesario secar las

placas invertidas en estufa a 37 °C. Antes de realizar el sembrado de microorganismos.

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué es un medio de cultivo?

________________________________________________________________________________

2.- Qué es un cultivo de microorganismo?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3.- Qué finalidad tiene utilizar medios de cultivo sólidos?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.- Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que pueden ser empleados en el laboratorio

de microbiología.

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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5.- De dónde es obtenido el extracto Agar- Agar para la preparación de medios de

cultivos?________________________________________________________________________

6.- Por qué es necesario esterilizar la mesa entes de realizar el vaciado del medio de cultivo

en las cajas de petri?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.-Por qué la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y

Peptona?________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

8.- Escribe la composición química para cada medio de cultivo que utilizaste.

Agar nutritivo Miuller

Hinton

Agar base sangre Agar Macconkey

Agar- Manitol- Sal- Agar

OBSERVACIONES.

Dibuja todos los pasos realizados en la preparación de los medios de cultivo.

CONCLUSIONES:

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________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS

Práctica No 4

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Prof. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO:

El alumno aprenderá la técnica del vaciado en placa del medio de cultivo preparado en la

sesión anterior en cajas de petri ya esterilizadas además preparará medios de cultivo

líquido estéril.

MATERIAL SUSTANCIAS

3 Telas de asbesto

3 Tripies o soportes Universales

2 Mecheros Fisher

2 Agitadores Medio de cultivo para caldo nutritivo

2 Vasos de precipitado de 250 ml Medio de cultivo para caldo triptona

2 Espátulas Fenol al 5%

2 Vidrio de reloj

Tubos de ensaye 20 X 200 mm

Tapones de algodón

Autoclave u olla de presión

Papel estraza

Equipo para Baño María

INTRODUCCIÓN

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Para el aislamiento, estudio y clasificación de los microorganismos, es necesario utilizar un

medio de cultivo en el que dispongan de las sustancias orgánicas e inorgánicas necesarias

indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios, los

microorganismos además de poder multiplicarse, pueden manifestar características de

crecimiento y propiedades bioquímicas; aspectos de gran importancia para su clasificación.

Estos preparados estériles que poseen los elementos necesarios para el desarrollo de un

microorganismo, se denominan medios de cultivos y pueden dividirse por su:

A) ASPECTO:

Medios líquidos. Se emplean fundamentalmente para:- Cultivar los microorganismos y

obtener grandes cantidades de los mismos o bien la producción de metabolitos específicos

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La multiplicación bacteriana en los medios de cultivos líquidos se manifiesta generalmente

por el enturbiamiento de éste;.- Estimular y promover la selección de algún o algunos

microorganismos e impedir que otros se multipliquen.- Identificar al microorganismo

estudiado mediante pruebas bioquímicas.

Medios semisólidos.- Se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el germen

estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen una consistencia blanda. Medios sólidos.-

Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios sólidos

constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiología. , En

los medios de cultivos sólidos la multiplicación bacteriana se manifiesta por una formación

macroscópica denominada colonia bacteriana, que es el resultado de la multiplicación de

una sola célula bacteriana.

B) USO

I.- Medios de cultivos básicos. Se caracterizan por ser pobres en material nutritivo, de

manera que su uso es muy restringido, constituyen la base para la preparación de otros

medios. Como ejemplo pueden citarse el caldo peptonado y el Agar-Agar corriente.

II:_ Medios de cultivos especiales. Entre estos se encuentran:

a) Medios mejorados. En general son los mismos medios básicos a los que se les agrega

una sustancia enriquecedora como sangre, suero, etc. El uso de estos medios es universal y

está orientado especialmente a obtener buen desarrollo de cualquier tipo de bacteria, se

utilizan en primera instancia en el aislamiento bacteriano, ya sea a partir de otros cultivos o

de productos patológicos.Los medios de este tipo de uso más frecuente son: Agar tripticasa-

sangre, caldo tripticasa, Agar chocolate, medio de Mueller-Hinton.

b) Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden o limitan el

crecimiento de algunas especies microbianas y permiten el desarrollo de otras. consiste en

aislar un microorganismo de un sustrato que contiene numerosas otras especies.Se incluyen

en este grupo el agar cristal violeta para el aislamiento de bacterias Gram(-) y el agar

telurito de potasio para el aislamiento de bacterias Gram(+).

c) Medios de cultivos diferenciales. Se emplean para demostrar alguna propiedad

bioquímica de la bacteria como degradación de hidratos de carbono, proteínas, hidrólisis

de la urea, etc., contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan

cambios en el medio o en las características típicas de las colonias el estudio en estos medios

debe realizarse empleando cepas bacterianas puras. Existen numerosos medios de este tipo,

de uso preferencial en la bioidentificación de bacilos Gram(-) ya que ellos no tienen

características muy distintivas en las colonias o cultivos en general. Entre los de uso más

corriente se encuentran: Agar fierro-triple-azúcar (TSI agar Medio de SIM, Caldo glucosado

fosfatado, Voges-Proskauer o del rojo de metilo, Medio agar-citrato de sodio (Medio de

Simmons- Medio caldo urea,

d) Medios de transporte. Sirven para transportar los especimenes que contienen a los

microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a

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efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora

microbiana en los especimenes.

PROCEDIMIENTO:

B) PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS

* Preparar caldo nutritivo y caldo triptona

1.- Leer las instrucciones del fabricante y pesar la cantidad necesaria según el volumen de

medio de cultivo requerido.

2.- Disolver el medio en agua destilada agitando el recipiente

3.- Envasar el volumen necesario en matraces, tubos u otros recipientes. Procurar que el

volumen del medio no rebase la mitad de la capacidad del recipiente, pues de otra manera

el medio se puede regar

4.- Tapar el recipiente con algodón, gasa y papel estraza.

5.- Esterilizar en autoclave a 121·C durante 15 minutos, a menos que se indique otra cosa.

6.- antes de usar el medio de cultivo, se debe someter a una prueba de esterilidad, para lo

cual se debe meter a una estufa a 37·C durante 24 horas. El medio debe permanecer libre

de crecimiento.

CUESTIONARIO

1.- Qué es un medio de cultivo?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

2.- Qué tipo de nutrientes requieren los microorganismos para poder crecer en un medio

de cultivo?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3.- ¿ Cómo nos podemos dar cuenta que existió crecimiento de microorganismos en un

medio líquido? 4.-¿Cómo se manifiesta el crecimiento de los microorganismos en un medio

de cultivo sólido?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

5.-¿Cuál es el elemento principal del medio de cultivo que favorece su solidificación?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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6.- De acuerdo a su uso ¿ Qué tipo de medios de cultivos podemos encontrar en el

mercado?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.- Escribe dos ejemplos de medios selectivos encontrados en el laboratorio en donde

puedan desarrollarse los microorganismos

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

8,. Qué finalidad tiene guardar invertidos los medios de cultivo ya preparados en las cajas

de petri en el refrigerador o en la estufa de incubación?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

9.- Escribe dos medios de cultivos que nos permiten determinar alguna prueba

bioquímica______________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES:

Dibuja todos los pasos del proceso de vaciado del Agar en cajas de petri esterilizadas

CONCLUSIONES:________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

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SEMBRADO EN PLACA DE MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE

Práctica No 5

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVOS

- Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente,

determinando las diferentes morfologías de colonias que se obtienen.

- Los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias

en un medio de cultivo en cajas de Petri.

MATERIAL

3 cajas de Petri estériles preparadas con Agar nutritivo

Caja de hisopos estériles sin abrir toallas de papel

3 cajas de petri estériles preparadas con Agar sangre.

Cinta pegante

Marcador permanente o lápiz de cera

Un desinfectante con 70% de solución de alcohol, 10% de una solución

blanqueadora , jabón líquido Extran o alkox.

INTRODUCCIÓN

La población microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos de

especies microbianas habitan normalmente en distintas partes de nuestro cuerpo, incluidas

la boca, el tracto intestinal y la piel. Al nacer, los microbios inmediatamente empiezan a

colonizar nuestros cuerpos, así como a casi todos los objetos del mundo. Ellos flotan

alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo.

Se encuentran más frecuentemente en la oscuridad, en objetos húmedos que a menudo

entran en contacto con la comida, la suciedad o la vegetación. Las superficies del baño, los

cepillos para el cabello, los refrigeradores, los lavaplatos y las tablas de cocina tienen a

menudo muchos microbios. Las manijas y las paredes tienen menos porque son pobres en

nutrientes y secos.

Un estudio adecuado de microorganismos que hay en estos hábitat requiere técnicas que

permitan conocer y ordenar la compleja población mixta o cultivo mixto, separándole en

sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro consta de una población de

células derivadas todas ellas de una célula parental. Los microorganismos se cultivan en el

laboratorio sobre materiales nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran

cantidad de medios y la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores, uno de

los cuales es la clase de microorganismos que se va a cultivar. El material que se inocula

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sobre el medio se denomina inóculo mediante alguna técnica (siembra por estría en placa o

siembra en masa en placa). Durante la incubación a 37:C , las células microbianas

individuales se reproducen tan rápidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen

masas visibles de células denominadas colonias. Una colonia es visible a simple vista. Cada

colonia diferente es presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de microorganismo.

Si dos células microbianas procedentes del inóculo original quedan muy cerca una de otra

sobre el medio de Agar, la masa de células observables no será un cultivo puro. La mayoría

de los microbios en nuestro cuerpo y otras superficies son inofensivas, pero algunos son

patógenos o causan enfermedad. Por esta razón, queremos controlar el número de

microbios que nos rodea. La posibilidad de infectarnos aumenta con el número de

microbios en los objetos circundantes. Pero ¿qué podemos hacer para reducir el número de

microbios en las superficies que nos rodean?

PROCEDIMIENTO

En esta actividad escogerás un fomite (cualquier objeto inanimado que pueda causar

enfermedad en los organismos por contener microorganismos como: la manija, el marco, el

control remoto de la televisión, una moneda). Este fomite ayudará a confirmar la presencia

de microbios y los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de

bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri.

1. Si tienes el cabello largo, recógetelo para mantenerlo lejos de las cajas de Petri cuando

estés trabajando. Lava tus manos. Limpia tú área de trabajo frotando suavemente, con la

solución desinfectante en una toalla de papel. Saca tus cajas de Petri pero no abras las cajas

hasta que se te indique.

2. Escoge un objeto del salón de laboratorio (la manija, el

marco, el control remoto de la televisión, una moneda,

etc.). Toma una caja de Petri sin abrir y con tú lápiz de

cera o marcador, divide la base de la caja en cuatro

secciones iguales. Escribe el nombre del objeto al otro lado

y designa las secciones de 1 hasta 4. Abre la caja de hisopos de algodón y escoge uno con

cuidado para no tocar la punta. Limpia tú objeto escogido con todos los lados de la punta

del hisopo volteándolo y retorciendo el hisopo a medida que lo mueves por la superficie

del objeto.

3. Ahora abre la tapa de la caja y suavemente haz cuatro

siembras sobre la superficie de la caja como se muestra en

la ilustración, empezando en la sección designada "1" y

continuando en el orden de las secciones, de manera que

la última siembra esté en la sección 4. Presiona firme pero

suavemente y no retiñas las siembras anteriores. Tus siembras sólo deben dejar una

impresión muy ligera en el Agar. Cierra la caja y séllala con dos pedazos de cinta. No cubras

la caja con cinta o no podrás verla bien.

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4. Divide una segunda caja de Petri en 4 secciones numeradas de 1 hasta 4 y desígnala

“Control.” Limpia la mitad del objeto que escogiste anteriormente con una toalla de papel

humedecida con agua-solo frótala un par de veces; no la restriegues. Con un nuevo hisopo

estéril, toma muestra del área limpiada. Abre la tapa de la segunda caja y haz

SUAVEMENTE 4 siembras en la superficie de la caja, siguiendo el orden de las secciones

numeradas como lo hiciste previamente. Cierra la caja y séllala.

5. Divide la tercera caja de Petri en 4 secciones numeradas y desígnalas con el nombre del

desinfectante que escogiste (por ejemplo "blanqueador"). Usa el desinfectante escogido para

limpiar la otra mitad del objeto que trabajaste antes. Con un nuevo hisopo estéril, toma

muestra del área. Repite el proceso de sembrar la caja. Ciérrala y séllala.

6. Esteriliza los hisopos usados con desinfectante y descártalos. Pon las cajas en un lugar

apartado y déjalas incubar a la temperatura de 37·C durante 24 a 48 horas. Limpia tu área

de trabajo con la solución desinfectante y lava tus manos.

7.- Repite todo el experimento utilizando Cajas de cultivo con Agar sangre sólo que ahora

selecciona otro Fomite que no hayas empleado

7. Después de que hayan pasado dos días, mira las cajas de Petri iniciales. No la abras. A la

vez examina las otras cajas de Petri sin abrirlas. Crea una tabla que compare las cajas

sembradas antes y después de limpiar el objeto (mira la tabla de ejemplo). Asegúrate de

indicar si los microbios crecieron en cada siembra.

8. Nota: un adulto supervisor debe hacer este paso preferiblemente. Cuidadosamente abre

las cajas de Petri en un lavaplatos e inúndalas con blanqueador o alcohol sin diluir. Déjalas

por una hora y enjuágalas completamente; colócalas en una bolsa plástica, amárrala y

descártala. Asegúrate de no tocar la superficie de las cajas cuando las abras y lava tus manos

cuidadosamente después de manipularlas. Limpia tú área de trabajo con la solución

desinfectante.

CUESTIONARIO

1.- Qué es un cultivo puro de microorganismos?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

2.- Qué es in inóculo?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3.- Físicamente en un medio de cultivo de microorganismos cuando se dice que no forma

un cultivopuro?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.- Qué tipo de técnica empleaste para la siembra de microorganismos?

________________________________________________________________________________

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5.- ¿En cuál caja crecieron más y más grandes las colonias? ¿Por qué piensas eso?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

6.-¿Cómo es el patrón que observas en el tamaño y cantidad de colonias en cada caja?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.- ¿Cómo podemos controlar la contaminación microbiana?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

8.- Completa en la siguiente tabla anotando X en los espacios correspondientes a las

divisiones realizadas en donde hayan crecido los microorganismos

A) MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR NUTRITIVO

Caja 1 Caja 2 Caja 3

Siembra 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Crecimiento

B)MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR SANGRE

Caja 1 Caja 2 Caja 3

Siembra 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Crecimiento

OBSERVACIONES: Dibuja todos los pasos empleados en el sembrado de las cajas de

petri con Agar nutritivo. Y los resultados de las colonias bacterianas que crecieron.

CONCLUSIONES______________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

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AISLAMIENTO DE HONGOS MEDIANTE EL METODO EXTENSIÓN EN

PLACA

Práctica No 6

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO:

El alumno aislará actinomiceto del suelo mediante el método extensión en placa

utilizando una varilla angular de vidrio

MATERIAL MATERIAL BIOLÓGICO

1 varilla de vidrio doblada Muestra de suelo

2 pipetas de 1 ml 2 caja con medio de cultivo estéril Czapeck

5 tubos de ensayo 2 caja con medio estéril de Gelosa glicerol extracto de levadura (GGL)

Asa bacteriológico 2 caja con medio estéril Gelosa peptona Dextrosa extracto de levadura

(GPDL) Alcohol al 70%

INTRODUCCION

Uno de los problemas más frecuentes en Microbiología es el aislamiento de un

cultivo puro de una especie bacteriana dada. A pesar de que es muy difícil aislar una sola

célula, existen técnicas capaces de aproximar este ideal

En Microbiología, todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de modo que

se impida cualquier tipo de contaminación en el área de trabajo. Los procedimientos

utilizados par conseguirlo se conocen con el nombre de técnica aséptica, y se citan a

continuación:

-Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el material de

vidrio (en zonas estériles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no

destruirlos por calor.

-Después de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar.

-Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas, y

después de la inoculación.

-Durante la inoculación, los tapones se mantienen en la mano sujetándolos por la parte que

no entra en contacto con tubos y matraces.

-Los tubos abiertos deben mantenerse en posición inclinada para que el riesgo de

contaminación sea mínimo.

-Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de trabajo.

Técnicas de siembra

La siembra de microorganismos puede realizarse en medios líquidos o en medios sólidos.

En el primer caso, para la inoculación se utilizará asa estéril si el medio de partida es sólido,

o pipeta estéril (Pasteur o graduada) si es líquido.

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En el segundo caso, cuando se parte de otro medio sólido, se utiliza el asa de platino

normal para siembra en placa o tubo inclinado y el asa recta para siembra en picadura en

tubos rectos o, en general, cuando se quiere introducir el microorganismo en el seno del

medio de cultivo sólido; cuando el medio de partida es líquido, se puede pasar al medio

sólido con un asa de platino calibrada, con la que se extiende la muestra directamente, o

con pipeta (Pasteur o graduada), depositando la muestra que luego se extenderá sobre la

placa con un asa de Digralsky. O con una varilla doblada.

En general, en Microbiología se trabaja con cultivos puros de microorganismos. Un cultivo

puro es aquél en que todas las células provienen de una sola célula inicial. Una colonia de

cualquier microorganismo es un cultivo puro, ya que todas sus células proceden de una

inicial; por lo tanto, cuando se desea aislar un microorganismo de una muestra cualquiera,

es preciso ver colonias del mismo, lo que implica que el aislamiento ha de realizarse en

medio sólido en placa.

Los pasos de un proceso de aislamiento de una especie microbiana se pueden resumir en los

siguientes:

-Siembra en placa de la muestra de partida.

-Tomar una colonia de la placa una vez incubada, resuspenderla en agua estéril y sembrar

una segunda placa, en la que todas las colonias que crezcan deben ser idénticas.

-A partir de la segunda placa se puede resuspender una de las colonias en medio líquido,

consiguiéndose ya un cultivo puro.

-Para la conservación de los cultivos puros de un microorganismo existen diversos métodos,

el más simple es la resiembra en tubos inclinados que se mantienen, normalmente

refrigerados, durante 3-6 meses.

PROCEDIMIENTO

1.- Hacer diluciones decimales a partir de la muestra de suelo hasta 10-5

2.- Sólo vas a necesitar las últimas dos diluciones es decir: 10-4

, 10 –5

las demás se

desecharán.

3.- Rotula dos cajas de petri con el nombre del medio de cultivo Czapeck en una anota

la dilución 10-4, y en la otra anota la dilución 10

-5

4.- Rotula dos cajas de petri con el nombre del medio de cultivo (GGL) en una anota la

dilución 10-4, y en la otra anota la dilución 10

-5

5.- Rotula dos cajas de petri con el nombre del medio de cultivo (GPDL) en una anota la

dilución 10-4, y en la otra anota la dilución 10

-5

6.- Esteriliza el asa bacteriológica en el mechero, espera que se enfríe cerca del área estéril e

introdúcela en la dilución 10-4

7.- Coloca una gota de esta dilución 10-4 en el centro de la superficie del Agar en el

primer medio de cultivo Czapeck., tapa la caja de petri

8.- Vuelve a introducir en la misma dilución 10-4 y coloca una gota en el siguiente medio

(GGL), repite lo mismo y coloca una gota en el tercer medio de cultivo (GPDL) . No

olvides tapar las cajas para evitar que se contamine.

9.-Esteriliza el asa bacteriológica y ahora introdúcela en la dilución 10-5 repite los pasos

anteriores, pero ahora para todas las cajas que están rotuladas con la dilución 10-5

No

olvides tapar los medios de cultivo.

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10.- Vierte una o dos gotas de alcohol al 70% sobre el brazo más corto de la varilla de

vidrio y con el mechero enciende el alcohol que se encuentra en la varilla . Permite que

arda hasta que se queme todo el alcohol. Deja que la varilla de vidrio se enfríe por un

minuto

11.- Utiliza el brazo corto de la varilla para dispersar uniformemente la gota de cada

dilución sobre toda la superficie de cada placa de Agar inicia con las diluciones 10-5

12.- Invierte la caja de petri, incúbala a temperatura de 37ºC por 24 horas.

CUESTIONARIO

1.- A qué grupo de microorganismos pertenecen los actinomicetos?

_______________________________________________________________________________

2.- ¿Para qué son utilizados en el área médica los actinomicetos?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3.-Qué tipo de técnica utilizaste para sembrar a estos microorganismos?

________________________________________________________________________________

4.- Menciona otra técnica para aislar cultivos puros de microorganismos?

________________________________________________________________________________

5.- ¿Cuál fue la finalidad de quemar el alcohol sobre la varilla de vidrio?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

6.- ¿Por qué iniciaste a distribuir con la varilla en forma uniforme las diluciones l0-5 que

contenían a los microorganismos y no con las diluciones de l04?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.-¿Qué apariencia presentaron las colonias después del tiempo de incubación?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

8.- Esquematiza el proceso de dilución para la muestra de tierra que realizaste

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OBSERVACIONES

Dibuja todo el proceso llevado a cabo para el aislamiento del cultivo puro de

microorganismo por extensión en placa, así como los resultados obtenidos al cabo de 24

horas.

CONCLUSIONES

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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AISLAMIENTO DE BACTERIAS MEDIANTE EL METODO SIEMBRA EN

PLACA POR ESTRÍAS

Práctica No 7

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO:

Demostración de los medios de defensa del huésped en la piel y garganta mediante el

método de siembra en placa por estría.

MATERIAL MATERIAL BIOLÓGICO

Cajas de petri con Agar- Sangre (GS) Exudado faringeo

Cajas de petri con Manitol sal Agar (MSA) Solución salina estéril

Cajas de petri con Agar vogel y Jonson (AVJ) Raspado de piel

Cajas de petri con Agar Estafilococo S110

Mechero Fisher

Asa de platino

Hisopos estériles

INTRODUCCIÓN

La piel (en condiciones normales) es una barrera que impide la penetración de los

gérmenes, por ello actúa como mecanismo de defensa. Los mamíferos son frecuentemente

infectados por algunas de las bacterias preexistentes en su medio ambiente, aunque en

general viven en equilibrio con estos microorganismos, manteniéndoles limitados a zonas

relativamente superficiales de su organismo. Sin embargo las bacterias infecciosas producen

enfermedades al invadir tejidos más profundos. Por lo tanto para mantener la salud, el

huésped debe defenderse constantemente frente a la invasión por parte de las bacterias.

Los factores mecánicos, químicos y microbianos desempeñan un papel importante al

restringir la colonización de las bacterias a las superficies corporales.

Factores mecánicos: Las superficies epiteliales de la piel y de las mucosas constituyen

barreras que resultan más o menos impermeables a las bacterias. La impermeabilidad de la

piel es mayor que en la mayoría de las mucosas. Cuando se altera la integridad de la

superficie epitelial, pueden desarrollarse infecciones subcutáneas. Las bacterias que causan

más frecuentemente estas infecciones son las que existen habitualmente en la superficie

cutánea, folículos pilosos y glándulas sudoríparas en la piel, es decir los estafilococos.

Factores químicos: La acidez de las secreciones gástricas mantienen sin duda la esterilidad

habitual del estómago. El Ph bajo de la piel (3-5), debido en gran parte a los productos

ácidos del metabolismo bacteriano, frena sin duda el crecimiento de muchos

microorganismos que toman contacto con sus superficie

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Factores microbianos: El antagonismo microbiano inhibe el crecimiento de muchas bacterias

y hongos potencial mente patógenos en lugares superficiales donde de no ser así, podrían

producirse enfermedades.

La flora de la región faríngea presenta problemas peculiares para el aislamiento e

identificación de microorganismos, por lo tanto se refiere a los componentes de la flora

normal como a microorganismos con acción patógena. Es importante recordar que algunos

microorganismos tienen capacidad patógena definida y su presencia es un indicio claro de

enfermedades, en tanto que otros, llamados oportunistas, guardan una posición ambigua y

pueden encontrarse tanto como componentes de la flora normal, como asociados a

procesos patológicos, causados por otros microorganismos que son verdaderos responsables

(por ejemplo los virus) Los estafilococos están entre las primeras bacterias que se

reconocieron como patógenas, y se descubrieron por primera vez a principios de la década

de1880.

Se encuentran ampliamente distribuidos por la naturaleza, y a menudo forman parte

de la flora bacteriana de la piel y el tracto respiratorio superior; muchas de las especies que

se encuentran en el hombre son comensales. La especie predominante patógena para el

hombre es el staphylococcus aureus, constituye la causa más común de las infecciones

supurativas para el hombre. El aislamiento de S. aureus a partir del exudado faríngeo y

exudado de piel, no tiene importancia diagnóstica, ya que se considera parte de la flora

normal de la faringe y nasofaringe, por lo que no tiene significado clínico.

PROCEDIMIENTO:

1.- Limpiar y esterilizar el área a trabajar con fenol al 5%

2.- Prender el mechero fischer cerca de donde se va a trabajar, si es posible colocar otro

3.- Humedecer el hisopo en solución salina estéril, pasarlo sobre la superficie de la piel (con

o sin pelo)

4.- Descargar el hisopo en dos cajas de petri con el medio ya preparado. (Es recomendable

que para cada dos cajas se utilice un solo hisopo con muestra). No retires completamente

las tapas de los medios de cultivo para evitar que se contaminen

5.- quemar el hisopo y tirarlo.

6.- Esteriliza el Asa de platino hasta el rojo vivo, enfríalo introduciéndolo en un extremo

del Agar

7.- Realiza el sembrado de los microorganismos por el método de estría utilizando el asa y

como se muestra en la figura. Evita destapar completamente la tapa de los medios de

cultivo.

8- Repetir el mismo proceso con otro hisopo estéril y con solución salina para otras dos

cajas . siembra por estría utilizando el Asa de platino y así hasta que se terminen se sembrar

todos los medios preparados.

9.- Incubar a 37ºC por 24-48 horas y observar resultados.

10.- Repite el mismo procedimiento pero ahora toma muestra de la faringe con hisopos

estériles en las zonas afectadas como: amígdalas, pared posterior de la faringe, en general

cualquier área que manifiesta signos de inflamación, exudados y úlceras, procurando no

tocar con el hisopo la lengua.

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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

A) REACCIONES POSITIVAS EN DISTINTOS MEDIOS

GELOSA SANGRE

Para el aislamiento, cultivo y detección de actividad hemolítica de Staphylococcus,

Streptococcus y otros microorganismos fastidiosos. Se observan colonias blancas casi grises,

Grandes, convexas de consistencia butirácea, Presentan bordes regulares. Se observa que

Presenta hemólisis. Las colonias en medio sólido son redondeadas, uniformes, Estos crecen

rápidamente a 37 C pero tienden a formar pigmentos mejor a temperatura ambiente (20

C).

MANITOL SAL AGAR (MSA)

Se utiliza como medio selectivo, para cultivar y enumerar especies clínicas de estafilococos

El manitol cuando es utilizado por los microorganismos, vira de su color original rojo a

amarillo. Se observan colonias chicas, blancas, convexas, de consistencia butirácea ,

presentan bordes irregulares. S. aureus Manitol sal Colonia amarilla S. epidermidis Manitol

sal Colonia incolora

AGAR VOGEL Y JONSON (AVJ)

Para la detección de Staphylococcus aureus coagulasa-positivo, se observan colonias negras

Pequeñas. bordes irregulares con halo amarillo. Para S. epidermidis y otros Pequeñas,

negro-grisáceos, sin halo, El medio presenta un vire de rojo pálido a amarillo.

ESTAFILOCOCO S110

S110 Colonias blancas un poco amarillentas, Se observan colonias chicas, convexas, De

consistencia butirácea y bordes Regulares.

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B) DESCRIPCIÓN DEL TIPO DE COLONIAS OBTENIDAS

Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes

características:

.FORMA: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa.

.TAMAÑO: grande (más de 3 Mm.), mediana (2-3 Mm.), pequeña (1-2 Mm.)

.COLOR. Reportar el color final después de la incubación

.BORDE: entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado

.ELEVACIÓN: plano, elevado, convexo, pulvinado, umbonado

.SUPERFICIE: suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta

CUESTIONARIO:

1.- ¿Cuándo los microorganismos pueden causar daño en nuestro organismo?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

2.- Qué tipo de bacterias son encontradas con mayor frecuencia en nuestra piel y que

pretenden aislarse en esta práctica?

_____________________________________________________________________________

3.-¿ Qué finalidad tiene humedecer el hisopo con solución salina estéril?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

4.- ¿Por qué no es recomendable utilizar el mismo hisopo para descargar en las cinco

cajas de petri con los medios ya preparados?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

5.- ¿Por qué se recomienda enfriar el asa de platino en el medio de cultivo ya preparado

antes de realiza el sembrado por estrías de los microorganismos?

37

37

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

6 ¿En qué cosiste el aislamiento por estrías?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

7.- Después de haber incubado a 25·C por 48 horas describe las colonias obtenidas en

cada medio de cultivo utilizado

GELOSA SANGRE MANITOL SAL AGAR (MSA)

.FORMA: FORMA:

.TAMAÑO: TAMAÑO:

.COLOR. COLOR:

.BORDE: BORDE:

.ELEVACIÓN: ELEVACIÓN:

AGAR VOGEL Y JONSON (AVJ) ESTAFILOCOCO S110

.FORMA: FORMA:

.TAMAÑO: TAMAÑO:

.COLOR. COLOR:

.BORDE: BORDE:

.ELEVACIÓN: ELEVACIÓN:

OBSERVACIONES:.

Dibuja y colorea todos los resultados obtenidos después de las 48 horas de haber sido

incubados.

CONCLUSIONES:

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

38

38

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO

Práctica No 8

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio__________________________________ Calif:__________

OBJETIVO

El alumno reconocerá el microscopio compuesto, identificará cada una de sus partes y lo

manejará correctamente observando la Presencia de microorganismos en muestras

biológicas

MATERIAL. MATERIAL BILÓGICO SUSTANCIAS

Microscopio compuesto Sarro dental Sol. Salina. NaCl al 0.85%

Porta y cubre objetos Muestra de orina Sol. de yodo-lugol

Palillo Muestra de Excremento

Hisopo

INTRODUCCION.

El microscopio es el instrumento más frecuentemente utilizado y el más útil en un

laboratorio de microbiología, proporciona la amplificación o agrandamiento que nos

permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista. Los microscopios permiten

una amplia gama de amplificaciones, desde cien veces a cientos miles de veces.

Las dos categorías de microscopios disponibles son los microscopios ópticos y los

microscopios electrónicos. Los microscopios ópticos utilizan un sistema de lentes ópticas y

comprenden los microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia y contraste de

fases. Los microscopios electrónicos emplean haces de electrones en lugar de ondas de luz

para producir una imagen ampliada.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina

completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya

debería estar en esas condiciones.

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de

10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

4. Para realizar el enfoque:

a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el

tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través

39

39

del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación

pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el

objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo

nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5.- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente

con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo

se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y

repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la

preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la

preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión

si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

PROCEDIMIENTO

TECNICAS DE MONTAJE HÚMEDO

La gota pendiente o las preparaciones húmedas permiten examinar organismos vivos

suspendidos en un fluido. Las preparaciones húmedas se hacen colocando una gota del

fluido que contiene el organismo sobre una lámina de vidrio y cubriéndola con una fina

pieza de vidrio (cubreobjetos): para reducir la tasa de evaporación y eliminar corrientes de

aire, generalmente se rodea la gota con vaselina.

Cuando se examinan las preparaciones húmedas por microscopía de campo claro, es

importante ajustar la fuente de luz de forma adecuada. Es posible disminuir la intensidad de

la luz mediante la utilización de filtros especiales.

MONTAJE EN SOLUCION SALINA FISIOLÓGICA (NaCl 0.85%) O AGUA

Utilizada para estudiar la movilidad de las bacterias

A)

1.- En el centro de un portaobjetos coloca una gota de solución salina

2.- Con un hisopo toma muestra de sarro dental de un compañero que no se haya lavado

los dientes y colócala en la solución salina mezclando cuidadosamente

3.- . Examinar con objetivos de 40X y 60 X.

B)

1.- Centrífuga aproximadamente 10 ml de orina a 2,500 rpm durante 5 minutos.

2.- Desecha el líquido sobrenadante y procede a mezclar el sedimento urinario

3.- Coloca una gota del sedimento mezclado en el centro de un portaobjetos limpio y seco

4.- Sobre el sedimento pon un cubreobjetos y observa con el objetivo de 40X y 60X

C)

1.- En un tubo de 13 X 100mm coloca las tres cuartas partes de solución salina fisiológica

2.- Con un aplicador de madera toma muestra de excremento de varias partes de la

muestra y deposítalo dentro del tubo con la solución salina, agita uniformemente.

40

40

3.- En un portaobjetos limpio y seco, coloca una gota de muestra preparada en los pasos

anteriores

4.-Coloca un cubreobjeto sobre la preparación y observa en el microscopio con objetivo

40X y 60X

MONTAJE EN SOLUCIÓN YODO LUGOL

Utilizada para identificar en heces fecales Protozoos intestinales con sus organelos

citoplasmáticos

1.- En un portaobjetos limpio y seco, coloca una gota de solución de yodo lugol

2.- Con un palillo de madera toma una pequeña cantidad de muestra fecal y deposítala en

el portaobjetos mediante movimientos de rotación y extendiendo la muestra por toda la

gota

En el paso No 2 Puedes utilizar la muestra salina preparada en el inciso C en lugar

de la muestra de excremento en forma directa

3.-Coloca un cubreobjeto sobre la preparación y observa en el microscopio

CUESTIONARIO:

1.- ¿Que es poder de resolución?

2.- ¿Qué finalidad te proporciona el utilizar microscopio compuesto:

________________________-_______________________________________________________

________________________________________________________________________________

3.- ¿Cuál es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.- ¿Qué tipo de bacterias pudiste observar en las muestras que se estudiaron

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

5.- ¿Qué importancia tiene el estudiar y observar los microorganismos en muestras

biológicas?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

6.- Escribe el nombre de cada una de las partes del microscopio compuesto

41

41

OBSERVACIONES.

Dibuja lo observado en los diferentes objetivos para cada muestra que preparaste durante

el experimento.

CONCLUSIONES

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

42

42

TINCIÓN DE LA CÁPSULA BACTERIANA

Práctica No 9

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO

El alumno aprenderá diversas técnicas para la tinción de la cápsula bacteriana en

distintos cultivos bacteriológicos.

MATERIAL

Cultivo de 24 horas de Klebsiella Rhinoscleromatis en Macconkey o citrato de simmons

(puede aislarse del excremento seco de palomas)

Cultivo de 24 horas de Staphylococcus aureus en manitol sal Agar (msa)

Cepa de 24 horas en Agar Saboraud Cryptococcus neoformans.

Tinta china ( recientemente filtrada)

Frasco con mordente de Knaysi

Frasco con rojo congo

Frasco con mordente de cápsula

INTRODUCCION

La cápsula bacteriana es una capa de material viscoso o mucoide. El tamaño de estas

cápsulas está influenciado por el medio en el que crece la bacteria. En algunos casos el

grosor de la cápsula es sólo una fracción del diámetro de la célula, en otros casos la cápsula

es mucho mayor que la célula. Las cápsulas bacterianas son importantes tanto para la

bacteria como para otros organismos. A las bacterias les proporcionan una cubierta

protectora y además sirven de reservorio de alimento almacenado. Tienen Propiedad

Antifagocitaria : Dificulta o impide la fagocitosis, lo cual potencia su virulencia ya que

favorece la multiplicación y facilita la invasión. Brinda Protección frente a Fagos.: Dificulta

la fijación de bacteriófagos e impide el pasaje su pasaje que puedan afectar a la bacteria Las

cápsulas de ciertas bacterias productoras de enfermedades aumentan la capacidad infectiva

de las bacterias. Si la bacteria pierde totalmente su cápsula, puede perder su virulencia y por

lo tanto su capacidad de producir enfermedad Algunos ejemplos de bacterias productoras

de cápsulas son: neumococos, Klebsiella., aunque también puede estar presente en bacterias

gram positivas y Gram. negativas

Sin embargo las cápsulas tiene diversas propiedades como: Induce la producción de

anticuerpos protectores (esto es útil en la producción de algunas vacunas) y Permite la

diferenciación de tipos serológicos dentro de la misma especie ya sea por aglutinación con

sueros

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43

PROCEDIMIENTO

TINCION DE CÁPSULA

A) METODO DE DUGUID

1.- Poner con el asa una gota pequeña de tinta china en el centro de un portaobjetos

limpio.

2.-Poner una gota de agua del mismo tamaño junto a la gota de tinta china

3.- Tomar con el Asa bacteriológica un pequeño fragmento del cultivo de bacterias

4.- Hacer una suspensión ( sin extenderla) en la gota de agua

5.- Mezclarla con la tinta china

6.- Colocar un cubreobjetos sobre la suspensión, evitando que queden burbujas

7.- Observar la preparación al microscopio con el objetivo seco fuerte y de inmersión.

La cápsula se observa como una zona brillante alrededor de la bacteria en un campo

oscuro.

B) METODO DEL ROJO CONGO

1.- Poner una gota pequeña de rojo congo en el centro de un portaobjetos limpio

2.-Tomar con el asa bacteriológica un pequeño fragmento de crecimiento de colonia

bacteriana

3.- Suspender la muestra en la gota de rojo congo y hacer un frotis

4.- cubrir el frotis ( SIN FIJARLO A LA FLAMA DEL MECHERO) con una gotas del mordente

de cápsula y dejarlo actuar durante un minuto.

5.-Lavar el frotis con agua destilada y dejarlo secar al aire

6.- Observar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión

La cápsula se observa como una zona brillante alrededor de la bacteria de color rojo en un

campo de azul oscuro.

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué importancia médica tiene la cápsula bacteriana?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

2.-¿Qué características presenta la cápsula en las bacterias?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3.- ¿Qué importancia tiene la presencia de la cápsula en las bacterias?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.- ¿Qué sucede con las bacterias cuando estas llegan a perder la cápsula?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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44

5.- Investiga de qué está compuesta la capa de material mucosa que forma la cápsula

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES

Dibuja lo que observaste en ambos objetivos indicados en la práctica con el microscopio

compuesto

CONCLUSIONES:

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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45

TINCIONES SELECTIVAS

Práctica No 10

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO

El alumno aplicará la técnica de tinción específica para lograr observar en el microscopio la

pared celular y endoesporas en distintas muestras bacteriológicas

MATERIAL

Cultivo de 12 a 18 horas de Bacillus Suptillus ( lacto bacilos) en Agar nutritivo y Agar sangre

Cultivo de Bacillus cereus ( tierra contaminada y tratada a 80·C por 10 minutos) en Agar

nutritivo y Agar sangre

Cultivo de 24 horas de Staphylococcus aureus en manitol sal Agar (msa)

Solución de ácido fosfomolíbdico ( 1%)

Solución acuosa de verde de metilo ( 1%)

Verde malaquita ( solución acuosa al 5%)

Safranina ( solución acuosa al 5% )

Portaobjetos

Cubreobjetos

Microscopio compuesto

Asa bacteriológica

Mechero Bunsen

INTRODUCCIÓN

PARED CELULAR

Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cápsulas o capas mucosas y

externas a la membrana citoplasmática está la pared celular que es una estructura muy

rígida y que da forma a la célula. El espesor de la pared celular oscila entre 10 y 35 nm, sin

embargo algunas paredes celulares son considerablemente más gruesas.

Las paredes celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la división.

Todas las bacterias poseen paredes celulares rígidas que protegen a la célula de explotar en

medios de baja presión osmótica.

Composición química de las paredes celulares.- Los peptidoglicanos proporcionan a

la pared celular una estructura rígida. Estos grandes polímeros, están compuestos de tres

clases de bloques estructurales: N- Acetil-Glucosamina, Ácido N- Acetil-Murámico y un

péptido que consta de cuatro o cinco aminoácidos que son: L- alanina, D-Alanina, _D-

Ácido Glutámico y Lisina. Además contiene proteínas con polisacáridos, lipoproteínas y

lipopolisacáridos

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46

Propiedades y Funciones: 1= Brinda protección y resistencia a la bacteria frente a los

posibles cambios de presión osmótica del medio en el que se encuentra y a la acción de

ciertos agentes externos.2= Presenta Poros que actúan como filtros, permitiendo el pasaje

de agua y metabolitos esenciales.3= Presenta antígenos de tipo y grupo específicos.4=

Participa en la división (multiplicación) bacteriana (se invagina junto con la membrana

plasmática)5= En las bacterias Gram .negativas tiene poder patógeno debido a que

presenta endotoxinas (Lípido A).6= Es el sustrato donde actúan los - Lactámicos y otros

antimicrobianos.

La tinción para la pared celular se aprovecha del hecho de que los contenidos

citoplasmáticos se pueden hidrolizar diferencialmente con ácido fosfomolíbdico, dejando la

pared sin afectar. Después de teñir se puede observar la pared celular con citoplasma como

ahuecado

ESPORAS

Son elementos de reproducción y/o de resistencia a un medio adverso que presentan

algunas bacterias , especialmente del género bacilar. Su forma, tamaño y ubicación varía

según la especie. Estos cuerpos son producidos en el último estadío del crecimiento celular,

que bajo condiciones apropiadas, germinan y producen la clase original de célula en

crecimiento o vegetativa.

Las esporas son resistentes a muchos agentes químicos y físicos. Hesiten dos tipos de

esporas: Endosporas : espora presente en el interior de la bacteria. Destinada a germinar

originando la forma vegetativa de la que deriva. Es un cuerpo de pared gruesa muy

refringente y sumamente resistente. Son producidas por especies Bacillus, clostridium y

Sporosarcina. Las endoesporas resisten las condiciones ambientales adversas de desecación,

calor y mal suministro de nutrientes ( agentes químicos como desinfectantes) Exosporas :

esporo que permanece libre en el ambiente, constituyendo la forma de resistencia

bacteriana ante condiciones adversas o desfavorables (nutrición, desecación, temperatura,

presencia de agentes químicos, presiones, etc.)

PROCEDIMIENTO

A) TINCIÓN DE LA PARED CELULAR

1.- Prepara un frotis húmedo relativamente concentrado de Bacillus Suptillus sobre un

portaobjetos limpio . NO LO FIJES A LA FLAMA. Prepara otro con B. cereus

2.-Antes de que la suspensión bacteriana se seque sobre el portaobjetos, adiciónale la

solución del ácido fosfomolíbdico cubriéndola por completo.

3.- Déjalo reaccionar 4 minutos.

4.- Inclina completamente el portaobjetos sobre el fregadero para eliminar totalmente el

ácido fosfomolíbdico

5.-Agrega el verde de metilo directamente sobre el frotis húmedo y déjalo reaccionar 5

minutos.

6.- Lava suavemente en la llave. Es inevitable que al lavar en la llave, algo del material se

desprenda del frotis, trata de minimizar el desprendimiento pero al mismo tiempo lava

bien, hasta que el agua ya no arrastre colorante.

7.- Seca al aire y después examina con aceite de inmersión

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47

8.- Si se tiñó correctamente, las paredes celulares aparecerán de verde oscuro o azul,

mientras que el citoplasma se verá de un verde claro o incoloro.

TINCIÓN DE LA PARED CELULAR (TÉCNICA DE KNAYSI)

1.- Hacer un frotis de Bacillus subtilis en la forma usual y fijarlo con calor. Prepara otro con

Bacillus cereus

2.- Cubrir el frotis con mordente de Knaysi y dejarlo actuar durante 10 minutos.

3.- Lavar la preparación con agua

4.- Colocar con el asa bacteriológica una gota de fuscina fenicada sobre la preparación.

5.- Poner un cubreobjetos sobre la preparación y observar al microscopio con el objetivo

de inmersión.

La pared celular se observa de color rojo intenso alrededor de la bacteria, cuyo citoplasma

se ve de un color rosa o rojo tenue.

A) TINCIÓN DE ESPORAS ( TÉCNICA DE SHEAFFER Y FULTON)

1-Prepare un dos extendidos del microorganismo aislado del cultivo de microorganismo

uno de Bacillus Suptillus y otro de Bacillus cereus

2-Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solución de verde de Malaquita.

3-Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no

permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente

y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.)

4-Lavar con agua y cubrir con solución de Safranina. Dejar actuar 30 segundos. Lavar con

agua, secar y observar con objetivo de inmersión.

5-Informar: morfología, color y tipo de espora.

El colorante Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.. La Safranina: colorante

de contraste que tiñe las formas vegetativas. Las endosporas, t ras la primera t inción, no

perderán el colorante en el lavado con agua, y s í lo harán las formas vegetat ivas, que

quedarán teñidas con el segundo colorante

TINCIÓN DE ESPORAS ( TÉCNICA DE COLORACIÓN DE GRAM)

1.- Hacer un frotis de B.suptilis de la forma usual y otra de B. cereus

2.- Teñir con la coloración de Gram

3.-Observar al microscopio con el objetivo de inmersión

las esporas se pueden observar sin teñir o si se encuentra dentro del bacilo, la espora no se

tiñe y el citoplasma se ve de color morado

Localización y morfología de las esporas en Bacillus

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48

CUESTIONARIO

1.- Menciona dos funciones que tiene la pared celular en las bacterias

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

2.-¿Cuáles son los principales compuestos orgánicos de las paredes celulares?

_______________________________________________________________________________

3. ¿Qué característica y que color tiñeron las paredes celulares de las bacterias que

lograste observar?

_______________________________________________________________________________

4.- Investiga las diferencias de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram

negativas

_______________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

5.- Describe dos diferencias para distinguir a una endospora de una exospora

_______________________________________________________________________________

6. ¿Qué característica y que color tiñeron las esporas observadas en las distintas muestras

microbiológicas?______________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.- Menciona algunos microorganismos capaces de producir esporas

________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES

Dibuja las estructuras celulares que lograste observar con el objetivo de inmersión

CONCLUSIONES

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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49

TINCIÓN DE GRAM

Práctica No 11

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO

El alumno aplicará una técnica de coloración diferencial para la identificación de

bacterias Gram positivas y Gram negativas..

MATERIAL

Asa de platino Cultivos de Escherichia coli

Microscopio Cultivo de Staphylococcus aureus

Porta objetos Cultivo de Cándida albicans

Aceite de inmersión Esputo de tuberculoso procesado en autoclave

SUSTACIAS COLORANTES

Colorante violeta cristal de Gram

Solución decolorante alcohol acetona

Safranina de Gram

Yodo de Gram o lugol para gram

INTRODUCCIÓN

TINCION DE GRAM.

Tinción empleada en microbiología para la visualización de bacterias en muestras

clínicas. También se emplea como primer paso en la diferenciación bacteriana. El examen

con microscopio óptico de preparación con tinción de Gram se emplea de rutina para

determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos ( esféricas), bacilos

(alargadas) y formas espiraladas

Las bacterias pueden diferenciarse con esta tinción en dos grupos. Los

microorganismos Gram. positivos se tiñen de azul , mientras que aproximadamente un

tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espira lados se tiñen de

rojo y se dice que son gramnegativos.

Las aplicaciones más comunes de la coloración de Gram son las siguientes:

La presencia de cocos grampositivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas

sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos

La presencia de diplococos gramnegativos son características de especies de Neisseria

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Los bacilos Gram. positivos grandes sugieren especies de Bacillus o clostridium, los

bacilos Gram. positivos pequeños sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes (

difteroides)

Los bacilos Gram. negativos son las bacterias mas comunes halladas en los laboratorios

clínicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y especies de

Haemophilus.

El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena

orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más adecuadas y

también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en especial para instaurar

un tratamiento inicial.

PROCEDIMIENTO

REALIZACIÓN DEL FROTIS

1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es

necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya

que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua,

que resulta suficiente.

2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad

del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la

mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede

bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en

medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con

colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de

siembra, directamente sobre el portaobjetos.

3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta

a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar

demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.

A) TINCIÓN DE GRAM

1. Realiza la preparación del frotis bacteriano como se explicó en el paso anterior

2. Teñir con cristal violeta 1min.

3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

4. Cubrir con Lugol 1min.

5. Lavar con agua el exceso de Lugol.

6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación

deje de perder color (30seg)

7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

8. Teñir con safranina 1min.

9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.

10. Secar la preparación.

11. Examinar al microscopio con aceite de inmersión y fijándose sobre todo en el color

de cada preparación.

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CUESTIONARIO

1.- ¿Qué es un frotis?

-

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

2.- ¿Con qué finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3.-¿Qué importancia tiene teñir las muestras bacterianas?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.- ¿Por qué es necesario emplear aceite de inmersión para la observación de los

microorganismos?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

5.-De los reactivos que utilizaste para la tinción de Gram, ¿cuál es el que funciona como

colorante primario?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

6.-¿Qué función tiene el Yodo en la tinción de Gram?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.-¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram positivas?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

8.- ¿Qué coloración tiñen las bacterias Gram. negativas?

9.- Menciona tres bacterias que tiñen Gram positivas y escribe la enfermedad que causa

cada una de ellas

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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10.- Menciona tres bacterias que tiñen Gram negativas y escribe la enfermedad que causa

cada una de ellas.

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES:

Realiza los dibujos y esquemas correspondientes a las tinciones realizadas

CONCLUSIONES:

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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53

TINCIÓN ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE

Práctica No 12

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO:

El alumno aplicará las técnicas de coloración de microorganismos ácido-resistentes

para diferenciarlos e identificarlos, en base a sus propiedades morfológicas

MATERIAL:

*Un cultivo de 72 horas de mycobacterium. Si es posible se les facilitará un esputo de

tuberculoso procesado en autoclave.

* Un cultivo de 24 horas de streptococcus

REACTIVOS

* Fucsina de Ziehl- Neelsen

* Azul de metileno

* Alcohol acidulado

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por tener una

pared celular completamente diferente a las restantes bacterias. La pared de las

Mycobacterias posee un alto contenido de lípidos que la hace impermeable a los agentes

hidrofílicos, por lo tanto estos microorganismos no se tiñen adecuadamente con los

reactivos utilizados en la coloración de Gram y no pueden ser clasificados como Gram

positivos o negativos. Las Mycobacterias son teñidas adecuadamente por el método de

Ziehl-Neelsen (Tinción Ácido-Rápida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solución

decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Son bacilos ácido-alcohol resistentes

por lo que la tinción de Zieh1Neelsen es útil para la coloración de estos microorganismos

obtenidos de muestras clínicas o de cultivo. Con esta tinción, los bacilos aparecen de color

rojo brillante sobre un fondo azul. Los bacilos tuberculosos son difíciles de teñir con la

tinción de Gram, y se observan como bacilos gram positivos con tinción irregular. Estos

microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-alcohólica y

por eso se denominan Bacilos Ácido Alcohol Resistentes (BAAR) . El género

Mycobacterium incluye más de 100 especies que pueden clasificarse en seis grupos desde el

punto de vista bacteriológico, pero con fines didácticos se dividen en tres apartados:

Complejo tuberculosis. Incluye las especies M. tuberculosis, Mycobacterium bovis (incluida

la cepa BCG) y Mycobacterium africanum, productoras todas ellas de tuberculosis. Se

incluye también Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en rata Complejo lepra.

En el que se incluyen las especies M. leprae, productor de la lepra humana, y

Mycobacterium lepraemurium, que produce lepra en roedoresel. El Mycobacterium leprae

54

54

que es un parásito intracelular obligado que se multiplica lentamente en células fagocitarias

mononucleares como los histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los nervios Otra s

Micobacterias. Micobacterias no comprendidas en los dos grupos anteriores. Sólo algunas

de ellas suelen ser patógenas, otras pueden ser patógenas oportunistas y finalmente otras

suelen ser saprofitas. Producen las denominadas micobacteriosis las infecciones producidas

por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no

tuberculosas

PROCEDIMIENTO

1. Prepara un frotis bacteriano. Haciendo un delgado extendido del material para su

estudio y permitir que se seque al aire.

2. Fijar el frotis con calor, evitar que hierva

3. Cubrir la preparación con carbofucsina. o fuscina fenicada

4. Calentar la preparación en un mechero Bunsen durante 5 min. No debe hervir. Si se

evapora, se añade más carbofucsina para que no se seque en ningún momento.

5. Lavar con agua el resto de colorante.

6. Decolorar con la mezcla ácido-alcohol. Hasta que solo permanezca un tenue color

rosa.

7. Lavar con agua para que no prosiga la decoloración.

8. Teñir con azul de metileno 1 min.

9. Lavar con agua el resto de colorante.

10. Secar la preparación.

11. Examinar al microscopio. Con objetivo de inmersión por 100 X ( aceite)

La tinción es positiva para bacilos rojos contra un fondo azul claro

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué Clasificación de bacterias pueden ser encontradas en este tipo de tinción?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

2.- ¿Qué otro nombre recibe la tinción ácido- alcohol- resistente?

________________________________________________________________________________

3.- ¿Qué coloración se tiñen las bacterias bacilares en la tinción ácido- alcohol- resistente

que da como resultado la reacción positiva?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.-¿Qué función tiene el alcohol en la técnica de tinción?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

5.-¿Qué especies de Mycobacterium son los causantes de la tuberculosis?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

55

55

6.- ¿Qué especie de Mycobacterium es el responsable de la lepra?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES:

Haz un esquema de los pasos que realizaste durante la realización de la práctica, así como el

dibujo de las bacterias bacilares observadas en el microscopio.

CONCLUSIONES:

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

56

56

EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA SOBRE LA VIABILIDAD Y EL

CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS

Práctica No 13

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO:

El alumno manejará las técnicas para observar el efecto de la presión osmótica que

ejerce el Cloruro de sodio y la Sacarosa sobre el crecimiento microbiano

MATERIAL:

3 Tubos de 16X 150 . En cada uno 10 ml de caldo nutritivo adicionado con:

2ml de cloruro de sodio al 1%, 2ml de cloruro de sodio al 10%, 2ml de cloruro de sodio

al 20%

3 Tubos de 16X 150. En cada tubo 10 ml de caldo nutritivo adicionado con:

2ml de Sacarosa al 1%, 2 ml de Sacarosa al 10%, 2 ml de Sacarosa al 20%

Nefelómetro de Mac Farland

Pipetas de 5 ml , y de 1 ml estériles

Agua destilada estéril

CEPAS: AGARES

Escherichia Coli * Agar sangre

Staphylococcus aureus * Agar Nutritivo

Klebsiella pneumoniae * Caldo nutritivo

INTRODUCCIÓN:

A) PRESIÓN:

La osmosis es la difusión a través de una membrana semipermeable que separa a dos

soluciones con distintas concentraciones de sustrato. El proceso tiende a igualar la

concentración de soluto a ambos lados de la memoran. Cuando a ciertas células

bacterianas se les suspende en una solución que contiene una concentración elevada de

cloruro de sodio (20%), el agua pasará desde la región de menor concentración de

sustancia disuelta ( el interior de la célula tiene una baja concentración salina) a través de la

membrana citoplasmática que es semipermeable a la solución que rodea a la célula. Así la

célula se deshidrata produciéndose plasmólisis. Si las bacterias se colocan en una solución

que contiene menos del 1% de cloruro de sodio, el flujo de agua se invertirá, es decir

ocurrirá la difusión, ya que fluirá el agua desde la solución externa al interior de la célula y

originará la plasmotipsis. Dentro de la célula se establece una presión osmótica a causa de la

gran cantidad de agua que se acumula allí, esta presión hará que se hinchen e incluso las

57

57

células pueden reventar. El mecanismo de inhibición microbiana es la plasmólisis: las células

se deshidratan y por lo tanto Son incapaces de metabolizar o crecer, pueden morir o

permanecer vivas pero en condiciones durmientes. Sin embargo también existen

microorganismos que requieren altas concentraciones salinas y son denominadas halófilos, y

los que requieren presiones osmóticas elevadas se les conoce como osmófilos. La mayor

parte de las bacterias pueden tolerar una amplia gama de presiones osmóticas externas y

fuerzas iónicas debido a su capacidad de regular la osmolaridad interna y la concentración

iónica. La osmolaridad está regulada por el transporte activo de iones potasio al interior de

la célula

A) En medios hipotónicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la que ejerce

todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la

membrana citoplásmica tienda a sufrir una presión de turgor excesiva.

B) En medios hipertónicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma). Las

bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la

osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del

ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la

concentración de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamado

genéricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles mecanismos:

bombeando iones al interior;

sintetizando una molécula orgánica osmóticamente activa;

bombeando sustancias osmoprotectoras.

PROCEDIMIENTO:

PREPARACIÓN DE LA CEPA A ESTUDIAR

Suspender la cepa bacteriana en agua destilada logrado obtener una turbiedad del No 10

del nefelómetro de Mac- Farland. En caso de no tener el nefelómetro solo cuidar la

turbiedad a manera de suspensión.

A) EFECTO DEL CLORURO DE SODIO

1.- Colocar en una gradilla en orden creciente de concentración una serie de 3 tubos con 10

ml cada uno con caldo nutritivo y adiciona 2 ml de cloruro de sodio con las distintas

concentraciones ( al 1%, 10% y 20 º% de NaCl)

2.-Rotularlas de acuerdo a la concentración y nombre de la cepa que se va a inocular en

ellos

3.- Inocular en cada tubo 0.l ml de la suspensión bacteriana correspondiente

4.- repetir los pasos del 1 al 4 para cada cepa proporcionada

5.- Incubar los tubos a 37·C durante 24- 48·C-

6.- Homogenizar el cultivo y leer el resultado de cada tubo en base a su turbiedad,

comparándola con las ampolletas del nefelómetro de Mac- Farland

58

58

B) EFECTO DE LA SACAROSA

1.- Colocar en una gradilla en orden creciente de concentración una serie de 3 tubos con 10

ml cada uno con caldo nutritivo y adiciona 2 ml de sacarosa con las distintas

concentraciones ( al 1%, 10% y20% de Sacarosa)

2.-Rotularlas de acuerdo a la concentración y nombre de la cepa que se va a inocular en

ellos

3.- Inocular en cada tubo 0.l ml de la suspensión bacteriana correspondiente.

4.- repetir los pasos del 1 al 4 para cada cepa proporcionada.

5.- Incubar los tubos a 37·C durante 24- 48·C.

6.- Homogenizar el cultivo y leer el resultado de cada tubo en base a su turbiedad,

comparándola con las ampolletas del nefelómetro de Mac- Farland.

CUESTIONARIO:

1.- ¿Cómo se define la ósmosis?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

2.- ¿Qué es plasmólisis y cuando ocurre?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3.- ¿Qué sucedió con las bacterias al incrementar la concentración del NaCl y sacarosa en

los distintos caldos nutritivos?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.- ¿Qué nombre reciben las bacterias que soportan grandes presiones osmóticas?

________________________________________________________________________________

5.- ¿Quién es el responsable en la célula bacteriana controlar la presión en medios

hipotónicos?

________________________________________________________________________________

6.- ¿Cuándo se establece un medio hipotónico?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.- ¿Cuándo se establece un medio hipertónico?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

59

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RESULTADOS:

Anota los resultados del efecto del cloruro de sodio y de la sacarosa sobre el

crecimiento, indicando el número de ampolleta del nefelómetro a que corresponda dicho

crecimiento. En caso de no contar con el Nefelómetro registra a manera de cruces dicho

crecimiento bacteriano

CEPAS EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA

1% NaCl 10% NaCl 20% NaCl

E.COLI

S.AUREUS

K.PNEUMONIAE

CEPAS EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA

1% Sacarosa 10% sacarosa 20% Sacarosa

E.COLI

S.AUREUS

K.PNEUMONIAE

OBSERVACIONES

Dibuja a manera de esquema los pasos realizados en la elaboración de la práctica, así como

los resultados obtenidos después del tiempo de incubación.

CONCLUSIONES:

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

60

60

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO Y PUNTO TÉRMICO MORTAL EN

MICROORGANISMOS

Práctica No 14

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio__________________________________ Calif:__________

OBJETIVO

El alumno aplicará un método que le permitirá conocer la temperatura y el tiempo

mínimos necesarios para esterilizar una suspensión, así como el efecto que tienen diferentes

diluyentes sobre dichas determinaciones.

MATERIAL

Tubos de 13 X 100 estériles

Pipetas de 5 ml estériles

Pipetas de l ml estériles

Cajas de Agar Nutritivo o Agar sangre

Baños maría a 37·C, 70·C, y ebullición

Tubos de ensaye con 1 ml de puré de tomate, jugo de naranja y agua destilada

CEPAS

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Klebsiella Pneumoniae

INTRODUCCIÓN:

Diferentes especies microbianas varían ampliamente en sus fluctuaciones de temperatura

óptima para su desarrollo: Las llamadas psicrófilas crecen mejor a temperaturas bajas (15 a

20·C), las formas mesófilas lo hacen mejor de 30 a 37·C, la mayor parte de la termófilas

entre 50·C y 60·C.

La mayor parte de los microorganismos son mesófilos, 30·C es la temperatura

óptima para muchas de las formas de vida libre y la temperatura del huésped es óptima

para los simbiontes de los animales de sangre caliente.

El límite superior de temperatura tolerada por cualquier especie se correlaciona bien

con la estabilidad térmica general de las proteínas de dicha especie.

Los microorganismos comparten con los vegetales y los animales la respuesta al

choque por calor, una síntesis de proteínas por el calor cuando son expuestos a una

elevación súbdita en la temperatura por arriba de la óptima para el crecimiento. Al parecer

estas proteínas son resistentes al calor y estabilizan a las proteínas de la célula sensible al

calor. Las bacterias también exhiben fenómeno denominado choque por frío, ósea la

61

61

muerte de las células por un enfriamiento rápido, en oposición a uno lento. Por ejemplo, el

enfriamiento rápido de la escherichia coli desde 37·C a 5·C puede matar al 90% de las

células

EFECTO LETAL DEL CALOR.

Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, se dejan

sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa que las bacterias dejan

de ser capaces de crecer y dividirse. La muerte se debe a la destrucción o inactivación

irreversible de una molécula o estructura esencial (como p. ej. el ADN cromosómico o por

creación de un daño irreparable en la membrana). ¿Cómo podemos caracterizar o medir en

la práctica la inactivación por calor de una suspensión bacteriana? He aquí algunos

parámetros utilizados:

tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las

bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura;

tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la densidad de

la suspensión, a una determinada temperatura (también llamado valor D);

punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en un

tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10 min).

PROCEDIMIENTO

A) PREPARACIÓN DE LAS SUSPENSIONES MICROBIANAS

1.- Adicionar agua destilada a cada cepa que se va a estudiar cuidado de que quede turbia a

manera de suspensión.

2.- Colocar 1 ml de jugo de naranja en un tubo de 13 X 100, 1 ml de Agua destilada en otro

tubo de 13X100 y 1 ml de puré de tomate en otro tubo de 13 X 100. Será necesario

rotularlos.

3.- transferir 1 ml de la suspensión bacteriana preparada a cada tubo

B) DETERMINACIÓN DEL PUNTO TERMICO MORTAL (PTM)

1.- Colocar en una gradilla una serie de 4 tubos de 13 X 100 para cada tipo de bacteria a

estudiar

3.- Marcar cada tubo con el nombre de la cepa que se va a estudiar.

4.- Anotar en cada tubo las temperaturas siguientes testigo, 37·C, 70·C, y ebullición

5.- Colocar en cada tubo 0.5 ml de la suspensión bacteriana que preparaste con agua, jugo

de naranja y puré de tomate a tratar

6.- Calentar la suspensión a la temperatura indicada en un baño maría durante 10 minutos

( el tubo testigo NO SERA CALENTADO)

7.- Vaciar el contenido de cada tubo en la superficie de una placa de Agar nutritivo y

Homogeneizar por rotación sobre la mesa o mediante extensión con varilla de vidrio

doblada a 90 grados

8.- Incubar a 39:C durante 24- 48 horas

9.- Observar si hay crecimiento.

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62

C) DETERMINACIÓN DEL TIEMPO TÉRMICO LETAL(TTL)

1.- Colocar en una gradilla una serie de 4 tubos de 13 X 100 para cada tipo de bacteria a

estudiar

2.- Marcar cada tubo con el nombre de la cepa que se va a estudiar

3.- Anotar en cada tubo los tiempos que se indican a continuación: Testigo, 5 minutos, 15

minutos, 30 minutos

4.- colocar en cada tubo 0.5 ml de la suspensión bacteriana que preparaste con agua, jugo

de naranja y puré de tomate a estudiar

5.- Calentar en baño maría a 70·C para todos los tubos y respetando los tiempos indicados

( el tubo testigo NO SE CALIENTA)

6.- Vaciar el contenido de cada tubo sobre la superficie de una placa de Agar nutritivo y

homogeneizar por rotación sobre la mesa o extensión con varilla de vidrio doblado a 90

grados

7.- Incubar las placas a 37·C durante 24- 48 horas

8.- Observar si presenta o no crecimiento

CUESTIONARIO:

1: ¿Qué características presentan las bacterias llamadas psicrófilas?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

2.- ¿A qué temperatura crecen las bacterias mesófilas?

________________________________________________________________________________

3.- ¿Qué sucede con las proteínas en la célula bacteriana cuando se aplica un cambio brusco

en la temperatura

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.- ¿En qué consiste el tiempo térmico letal?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

5.- ¿En qué consiste el punto térmico mortal?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

6.- ¿A qué temperatura se reporta el punto térmico mortal para las bacterias estudiadas en

los distintos diluyentes?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.- ¿Qué muestras después de la incubación reporta el tiempo óptimo para la destrucción

63

63

de las bacterias en los distintos diluyentes?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

RESULTADOS:

Completa las siguientes tablas después del tiempo adecuado y temperatura de incubación

para los distintos medios.

A) PUNTO TERMICO MORTAL (PTM)

Cepas Diluyente Crecimiento después de

calentar

E. coli Testigo 37

ºC

70ºC Ebullic.

Agua

Jugo de Naranja

Puré de tomate

S. aureus Testigo 37

ºC

70ºC Ebullic.

Agua

Jugo de Naranja

Puré de tomate

K.pneumoniae Testigo 37

ºC

70ºC Ebullic.

Agua

Jugo de Naranja

Puré de tomate

B) TIEMPO TÉRMICO LETAL(TTL)

Cepas Diluyente Crecimiento después de

calentar

E. coli Testigo 5 min 15min 30

min.

Agua

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64

Jugo de Naranja

Puré de tomate

S. aureus Testigo 37

ºC

70ºC Ebullic.

Agua

Jugo de Naranja

Puré de tomate

K.pneumoniae Testigo 37

ºC

70ºC Ebullic.

Agua

Jugo de Naranja

Puré de tomate

OBSERVACIONES:

Dibuja los pasos que seguiste para la realización de la práctica

CONCLUSIONES:

____________________________________________________________________

____________________________________________________________________

____________________________________________________________________

___________________________________________________________________

65

65

INHIBIDORES BACTERIANOS

Práctica No 15

Nombre Del Alumno:_________________________________Semestre______ Grupo_______

Nombre del titular_____________________________________Fecha____________________

Nombre del Profr. de Laboratorio_________________________________ Calif:___________

OBJETIVO:

El alumno manejará algunas técnicas para poner de manifiesto la actividad de los

antibióticos sobre el crecimiento microbiano.

MATERIAL:

Cajas de petri con medios de cultivo Muller-Hinton, o Agar nutritivo

Asa bacteriológica

Mechero Fisher

Sensidiscos ( antibiogramas)

Fenol al 5%

SUSTANCIAS BIOLÓGICAS

Cultivo de en caldo nutritivo de 24 horas de Bacillus subtilis ( lactó bacilos)

Cultivo de 24 horas Staphylococcus aureus en manitol sal Agar (msa)

Cultivo de 24 horas de Escherichia Coli en medio Macconkey

INTRODUCCIÓN:

ANTIBIÓTICOS

Son sustancias capaces de destruir y eliminar los microorganismos causantes de una infección

producida por bacterias (faringitis, bronquitis, otitis, neumonía, amigdalitis, etc). No son

eficaces cuando la infección es producida por virus (gripe).

Cada tipo de antibiótico será efectivo para destruir una clase de microorganismos en

función de su modo de actuación..Se les llama antibióticos de amplio espectro a los que son

efectivos frente a un gran número de agentes microbianos: los microorganismos causantes

de la infección son capaces de desarrollar resistencias al antibiótico de manera que este no

será eficaz para eliminarlos. Cada año se investiga creando nuevos antibióticos eficaces para

las formas microbianas resistentes a sus anteriores tratamientos. Se deben usar siempre bajo

prescripción médica.

Existen pruebas (antibiogramas) que determinan el antibiótico más eficaz para cada

infección, pero normalmente se sigue un protocolo de actuación de los antibióticos de

elección para cada tipo de infección.

Es el médico el profesional que juzga la infección existente y el antibiótico eficaz para su

tratamiento.

Los antibióticos siempre se deben tomar bajo prescripción médica y cumplir el tratamiento

completo. El incumplimiento del tratamiento puede dar lugar a recaídas que precisarán el

tratamiento con otro tipo de antibiótico por haber desarrollado resistencia al primero.

66

66

MODO DE ACCION DE LOS ANTIBIÓTICOS

1.- Inhibición de la síntesis de la pared celular. 2.- Alteración sobre la membrana

citoplásmica. 3.- Inhibición de la síntesis proteica.4.- Bloqueo de la síntesis de los ácidos

nucleicos.

ANTIBIOGRAMAS

Para estudiar la sensibilidad de un microorganismo por técnicas de difusión se dispone

de dos sistemas, el de discos de papel impregnados con el antibiótico y las tabletas,

consistentes en una suspensión del antibiótico liofilizada y comprimida en material inerte.

Los fabricantes recomiendan conservar los discos a –20 °C para largos periodos o entre 2 y

8 °C si se utilizan en el plazo de una semana. Por el contrario, las tabletas se han

considerado más estables, pudiéndose almacenar a temperatura ambiente y manteniendo su

actividad más tiempo que los discos .Por lo que respecta a la temperatura de conservación,

al comparar para cada antibiótico los diámetros de los halos de inhibición de los discos

conservados entre 4 y 6 °C con los conservados a temperatura ambiente no se encontraron

diferencias significativas a lo largo de todo el estudio; tampoco se encontraron diferencias al

comparar los halos de las pastillas conservadas entre 4 y 6 °C con las conservadas a

temperatura ambiente, de modo que tanto los antibióticos que permanecieron estables

durante el tiempo del estudio como los que disminuyeron su actividad lo hicieron de modo

paralelo a ambas temperaturas

PROCEDIMIENTO:

A) PREPARACIÓN DE LAS SUSPENSIONES MICROBIANAS

Suspender la cepa bacteriana en agua destilada logrado obtener una turbiedad del No 10

del nefelómetro de Mac- Farland. En caso de no tener el nefelómetro solo cuidar la

turbiedad a manera de suspensión.

B) ACTIVIDAD DE LOS ANTIBIÓTICOS EN DISCO

1.- Marcar 2 placas Muller-Hinton, o Agar nutritivo con el nombre de la cepa S.aureus y

otra con el nombre de K.pneumoniae.

2.- Tomar con un hisopo diferente las muestras que fueron preparadas en el inciso A de

este procedimiento y sembrar las placas rotuladas

3.- Quemar el hisopo y desecharlo.

4. Colocar un multidisco o discos individuales sobre las placas y presionar ligeramente los

discos contra la gelosa

5.-Incubar las placas a 37ºC durante 24 horas

6.- Medir el diámetro de los halos de inhibición del crecimiento producidos por cada

antibiótico y notar los resultaos

C) DETERMINACIÓN DE INHIBIDORES EN LA LECHE

1.- Preparar el medio de cultivo de la siguiente forma:

-Preparar medio de cultivo Muller-Hinton, o Agar nutritivo, esterilizarlo y enfriarlo a 40ºC

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67

- Añadir 0.5 ml de B. Subtilis obtenido de un cultivo de 24 horas en caldo nutritivo en

una caja de petri esterilizada

- Vaciar 15 ml del medio de cultivo ya enfriado a 40ºC. Distribuir en forma homogénea

- Dejarlo que solidifique.

2.- Tomar una muestra de leche y calentar a baño María a 80ºC durante 3 minutos

exactamente, enfriar bruscamente la leche en un baño con hielo

3.- Impregnar un disco de papel filtro con la leche fría, secarlo ligeramente y con unas

pinzas esterilizadas depositarlos en el centro de una caja de petri preparada anteriormente

4.- Incubar la placa de 18 a 20 horas a 37ºC y observar las zonas de inhibición causadas por

los antibióticos sobre el B. Subtilis.

5.- Si la muestra de leche contiene antibióticos, alrededor del disco se formará un halo, el

cual indica la inhibición de microorganismos y presencia de antibióticos en concentraciones

superiores a las permitidas

CUESTIONARIO

1.- Qué función tiene lo antibióticos?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

2.-Qué son los antibiogramas y cuál es su función?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3.-Menciona dos causas del porque los microorganismos pueden llegar a hacerse resistentes

a los antibióticos?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4.-En caso de no tener Sensidiscos en el laboratorio: ¿cómo puedes fabricarlos?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

5.-Escribe dos Fuentes naturales de donde se puedan obtener los antibióticos

________________________________________________________________________________

6.-Según los resultados de tu práctica . ¿Qué medicamentos puedes utilizar para destruir y

eliminar a los microorganismos como: Staphylococcus y Escherichia Coli?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

7.- Investiga qué tipo de enfermedades pueden ocasionar los microorganismos estudiados

en la práctica

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

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8.-Existió inhibición de microorganismos y presencia de antibióticos superiores a las

permitidas en la leche que estudiaste?________por qué?

-

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

OBSERVACIONES

Realiza los dibujos de los resultados obtenidos a las 24 horas de incubación

CONCLUSIONES

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

69

69

BIBLIOGRAFÍA

1) Dr Martínez Ramos, Manual de Prácticas de Microbiología General, Centro de

Graduados e

investigación, Instituto Tecnológico de Veracruz, l993.

2) M.C Gaitán Hinojosa Mario Alberto, Manual de prácticas de Bacteriología General,

Facultad e

ciencias Químicas , Universidad de Colima.

3) Manual de Laboratorio Manual de prácticas de Microbiología. Cualquiera de estas

prácticas se puede hacer perfectamente en un laboratorio de instituto ...

http://www.joseacortes.com/practicas/ Última modificación: 17-03-2005 © 2001 por

José A.

Cortés

4) El Microscopio óptico compuesto

Práctica de laboratorio: Manejo y uso del microscopio optico compuesto. ...

Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella .. .

www.joseacortes.com/practicas/microscopio.htm - 23k - En caché -

5) http://html.rincondelvago.com/biologia_41.html

6) http://html.rincondelvago.com/tincion-de-gram.html

7) gráficos obtenidos de:

http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

8) Las tinciones - Monografias.com

Tinción Simple: utiliza un solo colorante. Tinción de Gram: ... En la muestra de

la práctica anterior 3 eran gran positivo por su coloración morada. Tinción ...

www.monografias.com/trabajos15/ tinciones/tinciones.shtml - 28k - En caché -

Páginas similares

9) Pelczar, Michael, et.al, Elementos de Microbiología, McGraw-Hill, Mexico

10) Zinsser, Joklik Willett Amos, Microbiología, Editorial médica panamericana, 18º edición,

México.

11) Koheman Elmer w., et.al. Diagnóstico Microbiológico, Panamericana, quinta edición,

México.