manual_bsangre2014-Rev05-2014 (3)

8/16/2019 manual_bsangre2014-Rev05-2014 (3)

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MANUAL DE LABORATORIO

BANCO DE SANGRE&

INMUNOHEMATOLOGIA

AutorProf. TM MgCs Guillermo Jerez

Revisado porProf. TM Dr. José CaamañoProf. TM MgCs Franco del ValleProf. TM Monserrat Bustamante

v2014

FACULTAD DE SALUD

ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA UNIVERSIDAD SANTO TOMÁS

SEDE SANTIAGO



Todos los derechos de copia e impresión total o parcial de este documento debe ser con la

autorización expresa del autors. ©2009. Guillermo A. Jerez J.

1

I N D I C E

I N D I C E.......................................................................................................................................... 1

NORM AS DE BI OSEGURI DAD ...................................................................................................... 5

PRECAUCI ONES EN LOS LABORATORI OS ............................................................................. 12

REACTIVOS USO FRECUENTE EN BANCO DE SANGRE E INMUNOHEMATOLOGIA .. 14

CAL IBRACIÓN DE CENTRÍFUGA INMUNOHEMATOLÓGICA ............................................ 15

PREPARACIÓN DE GLÓBULOS ROJOS SENSIBI L I ZADOS .................................................. 17

PREPARACIÓN CONTROL ANTI -D ............................................................................................ 19

CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUEROS CLASIF ICADORES ABO................................... 20

I nspección visual .............................................................................................................................. 20

Recomendaciones de la OMS. .......................................................................................................... 22

CONTROL DE CAL IDAD DE LOS SUEROS Rh, anti D ............................................................. 23

I nspección visual .............................................................................................................................. 23

Especif icidad ..................................................................................................................................... 23

Potencia ............................................................................................................................................ 23

Avi dez ................................................................................................................................................ 23

Recomendaciones de la OMS. .......................................................................................................... 24

Especif icidad ..................................................................................................................................... 25

Potencia ............................................................................................................................................ 25

CONTROL DE CAL IDAD REACTIVOS M ISCELANEOS .......................................................... 26

CONTROL DE CAL IDAD DEL SUERO DE COOMBS ............................................................... 27

TÍTULO DE LA FRACCIÓN I gM y DE LA FRACCIÓN I gG DEL REACTI VO ANTI -D......... 30

DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO ABO Y RH EN LAM INA Y TUBO ................. 31

CLASIF ICACIÓN Rh ..................................................................................................................... 35

CLASIF ICACIÓN ABO Y RH EN M ICROPLACAS .................................................................... 36

DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO POR TÉCNICA EN GELES BI O-TYPE® ..... 39

ANÁLISIS DE CAUSAS DE DI SCREPANCIAS EN LA CLASIF ICACIÓN ABO/Rh ............... 41

ANÁLISIS DE SUBGRUPOS SANGUÍNEOS ............................................................................... 41

CONCLUSIONES: ........................................................................................................................... 44

ANTIGENO B ADQUIRIDO POR INDI VIDUOS A1 ................................................................... 45





2

Debil i tami ento de antígenos A, B y H ............................................................................................. 45

Secretores y no secretores ................................................................................................................ 45

Agl uti nación de campo mixto .......................................................................................................... 45

Di screpancias entre pruebas con eri trocitos y suero ....................................................................... 46

Resolución de discrepancias ABO ................................................................................................... 46

Resolución de discrepancias debidas a la ausenci a de antígenos esperados ................................. 47

Resolución de discrepancias debidas a reacciones inesperadas con anti -A y anti -B ................... 47

Er itrocitos revestidos por anti cuerpo ............................................................................................... 48

Resolución de discrepancias debidas a reacciones séricas inesperadas ......................................... 48

DETECCIÓN DE ANTÍGENOS SOLUBLES EN SECRECIONES ............................................ 50

PRUEBA DE COOMBS DI RECTA E INDIRECTA EN TUBO ................................................... 52

TÉCNICA EN GEL PARA PRUEBA DE COOMBS DIRECTA E INDI RECTA ........................ 54 Coombs directo en gel ................................................................................................................ 56

I NVESTIGACIÓN DE MUESTRAS Rh NEGATI VAS, Rh POSITI VAS DÉBI LES o Rh

POSITI VA PARCI AL ...................................................................................................................... 57

DETERM INACIÓN DEL FENOTIPO Rh-Hr Y CÁLCULO DEL GENOTIPO MÁS

PROBABLE ...................................................................................................................................... 58

Tabla 1. Genotipos probables. .......................................................................................................... 60

Tabla 2. Frecuencia Genética en Población de Santiago. Cuadro Comparat ivo. ......................... 60

Tabla 3. Frecuencia Genética de Antígenos Rh.............................................................................. 60 CLASIF ICACIÓN ABO Y RH EN EL RECIÉN NACIDO ........................................................... 61

CLASIF ICACIÓN ABO Y RH EN EL RECIÉN NACIDO EN GEL (Bi o-type) .......................... 62

I DENTIF ICACIÓN DE ANTI CUERPOS I RREGULARES ......................................................... 65

CALCULO DE PROBABI L IDAD MÉTODO EXACTO DE FISHER ......................................... 67

TI TULACIÓN DE ANTI CUERPOS IRREGULARES .................................................................. 68

ESTUDIO DE MUESTRAS CON TEST DE ANTI GLOBULI NA HUMANA DI RECTA

POSITI VA ........................................................................................................................................ 70

TÉCNI CA DE AUTOADSORCIÓN DE ANTI CUERPOS CAL IENTES ..................................... 73

TÉCNI CA DE ELUCIÓN ÁCIDA .................................................................................................. 76

ESTUDI O DE CRIOAGLUT INI NAS ............................................................................................. 77

Título de crioaglutininas ............................................................................................................. 79

ESTANDARI ZACIÓN DEL LISS ................................................................................................... 81





3

I NTRODUCCIÓN: ........................................................................................................................... 81

MATERI AL ES ................................................................................................................................. 81

ACTIVI DAD PRÁCTI CA ................................................................................................................ 82

RESULTADOS ................................................................................................................................. 83

TÉCNI CA DEL POLIBRENE ........................................................................................................ 84

TECNI CA ENZI MATICA PAPAÍNA EN DOS ETAPAS ............................................................. 85

BANCO DE SANGRE Y MEDICINA TRANSFUSIONAL ................................................... 87

PUNCIÓN SANGRE VENOSA EN BANCO DE SANGRE .......................................................... 87

EXAM EN FÍSICO AL DONANTE DE SANGRE ......................................................................... 89

TÉCNI CA DE DETERM INACIÓN DE H EMOGLOBI NA (Hb) ................................................. 91

I NSTRUCTIVO PARA LA SELECCION DE UN DONANTE DE SANGRE .............................. 94

1.- INTRODUCCIÓN: ...................................................................................................................... 94 DONACION EN BANCO DE SANGRE GLOSARIO DE TERM INOS ................................... 95

2.- NORMAS PARA EL LLENADO DE LA ENCUESTA: ..................................................................... 97

7.- PREGUNTAS DE LA ENCUESTA: ............................................................................................... 99

MEDICAMENTOS DISPONIBLES EN CH I LE QUE PUEDEN AFECTAR LA AGREGACIÓN

PLAQUETARI A ............................................................................................................................. 112

MEDI CAMENTOS CONTRAINDI CADOS PARA DONAR SANGRE...................................... 115

RECONOCIM IENTO Y MANEJO I NICIAL DE LAS REACCIONES ADVERSAS A LA

DONACI ON ................................................................................................................................... 117

MANEJO DE LAS REACCIONES ADVERSAS A L A DONACION DE SANGRE .................. 119

Medidas generales.................................................................................................................. 119

Desmayos ................................................................................................................................ 119

Náuseas y vómitos .................................................................................................................. 119

Espasmos musculares y calambres ........................................................................................ 119

Hematoma .............................................................................................................................. 120

Punción arterial. ..................................................................................................................... 120

Convulsiones ........................................................................................................................... 120

PREPARACIÓN DE HEMODERIVADOS Y CONTROL DE CALIDAD ................................. 122 Cálculo para la extracción de sangre de donantes que pesan menos de 50Kg..................... 122

FRACI ONAMIENTO DE L A SANGRE ....................................................................................... 123

CONTROL DE CAL IDAD DE LOS HEMOCOMPONENTES .................................................. 126

PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES ........................................................................................ 127





4

DESPACHO DE TRANSFUSIONES ........................................................................................... 128

PRUEBAS DE COMPATI BI L IDAD EN GEL ............................................................................. 130

PRUEBA DE COMPATIBI L IDAD RUTINARIA SALI NA-POPIETI LENGLI COL ................ 130

(PEG) 37ºC- anti -I gG ..................................................................................................................... 130

I ND ICACI ON DE LA TRANSFUSION ....................................................................................... 132

REACCIONES ADVERSAS A LA TRANSFUSIÓN SANGUÍNEA ........................................... 142

SOLUCIONES INTRAVENOSAS Y SU RELACIÓN CON LA TRANSFUSIÓN SANGUI NEA

Y HEMOCOMPONENTES ........................................................................................................... 146

BI BL IOGRAFÍA ............................................................................................................................ 147





5

NORMAS DE BIOSEGURIDAD

Introducción

Debido a la importancia que involucra el Servicio de Medicina Transfusional dentro de la actividad de

un Hospital Asistencial, por su apoyo en el tratamiento de los pacientes que lo requieren y porque su

trabajo lo realiza utilizando como elemento principal SANGRE, es que se hace necesario establecer

líneas de trabajo claras a fin de:

1.- Disminuir el riesgo de accidentes al manipular en forma incorrecta objetos contaminados

protegiendo al que ejecuta el procedimiento y a terceros.

2.- Facilitar el trabajo con objetos contaminados con fluidos de alto riesgo, cumpliendo con las

PRECAUCIONES UNIVERSALES establecidas.

PRECAUCIONES UNIVERSALES

Antes de avanzar en las normas propiamente tales, es necesario dejar claro algunos conceptos

importantes para realizar nuestro trabajo, que están vigentes en todo el quehacer del personal de

salud de nuestro país de las cuales daremos un resumen a continuación:

"Las Precauciones Universales de sangre y fluidos corporales, son medidas destinadas a proteger al

personal de salud de la exposición a productos biológicos contaminados provenientes de cualquier

paciente, en relación a la potencial infección laboral producida por gérmenes patógenos cuya

transmisión sea por la sangre".

Sus objetivos son:

Prevenir en el personal de salud de las potenciales exposiciones de patógenos transmitidos

por sangre y fluidos de alto riesgo.

Determinar uso racional de barreras que reduzcan el potencial riesgo de exposición a sangre

y fluidos de alto riesgo.





6

FLUIDOS CORPORALES

Son todas las secreciones o líquidos biológicos fisiológicos o patológicos que se producen en el

organismo.

Dada la posibilidad de transmitir patógenos se han dividido en:

1.- Fluidos corporales de alto riesgo.

2.- Fluidos corporales de bajo riesgo.

3.- Otros fluidos en área especial.

1.- Fluidos de alto riesgo: Son aquellos en los que se ha encontrado mayor concentración de

patógenos y que facilitan su transmisión. En estos siempre se deben aplicar las Precauciones

Universales.

- Sangre y sus derivados.

- Semen, secreciones vaginales.

- Todos los tejidos.

- LCR, líquido sinovial, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido pericárdico, líquido amniótico.

- Fluidos corporales que contengan sangre visible.

2.- Fluidos de bajo riesgo: Si bien se han aislado virus, la frecuencia y la cantidad aislada no

representa riesgo potencial de infectarse. Se requiere solo aplicar medidas de protección de sentido

común.

- Deposiciones, orina.

- Secreciones nasales, óticas.

- Lágrimas, sudor.

- Expectoración, vómito.

- Saliva en la piel.





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3.- Otros Fluidos:

a) Saliva: La excreción viral del VIH y VHB por la saliva es escasa y ocasional. La posibilidad de

infectarse por este tipo de fluido es remota y sólo aquel personal en contacto prolongado debe

tomar medidas como por ejemplo: dentistas, anestesistas, etc.

b) Leche Materna: Ha sido implicada en la transmisión perinatal del virus VIH, así como también VHB

en madres infectadas. No se ha implicado en la transmisión del VIH y VHB al personal de salud.

Por lo tanto no se aplican las Precauciones Universales salvo en situaciones especiales (personal que

trabaje en Lactarios).

"EL RIESGO DEL PERSONAL DE SALUD DE ADQUIRIR LA INFECCION DE HEPATITIS B, C y VIH-SIDA

DURANTE LA PRACTICA PROFESIONAL ESTÁ ASOCIADO PRINCIPALMENTE A LA EXPOSICIÓN

PARENTERAL CON SANGRE INFECTADA".

Para disminuir el riesgo de exposición a sangre, fluidos corporales de alto riesgo, fluidos corporales de

bajo riesgo y otros fluidos corporales en los cuales se hace necesario aplicar las Precauciones

Universales se deberían usar las Barreras Protectoras.

BARRERAS PROTECTORAS

Deberán utilizarse rutinariamente en cualquier paciente independiente de su calidad de infectado o

no, ya sea en hospitales, laboratorios, atención ambulatoria, diálisis y anatomía patológica.

Las precauciones universales no son solo la aplicación de barreras protectoras, sino un cumplimiento

a las recomendaciones de rutina para prevenir infección. Haciendo uso de ellas en forma racional porsu elevado costo y modificando técnicas de rutina a fin de disminuir riesgos.

EL RIESGO DE TRANSMISION INTRAHOSPITALARIA DE GÉRMENES POTENCIALMENTE INFECCIOSOS

TRANSMITIDOS POR LA SANGRE U OTROS FLUIDOS CORPORALES PUEDEN MINIMIZARSE, SI EL

PERSONAL DE SALUD APLICA EN LA ATENCIÓN DE CUALQUIER PACIENTE LAS SIGUIENTES MEDIDAS:

I. LAVADO DE MANOS: Es una de las medidas más sencillas y más importantes para cortar la

cadena de transmisión de infecciones. El lavado de manos y otras superficies de la piel se

realizará con agua, jabón y/o antisépticos, inmediata y cuidadosamente si han sido

contaminadas con sangre y fluidos corporales. Deberá realizarse de rutina independiente del

uso de guantes, antes y después de atender a cualquier paciente.

II. PREVENIR LESIONES: Causadas por material corto-punzante, durante la realización de

procesamientos clínicos, de laboratorio, limpieza del material y eliminación de desechos.





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1. Material Desechable Corto-Punzante: Material como agujas bisturíes, hojas de afeitar, máquinas

de rasurar, catéteres, teflones, venoflex, lancetas, simplate, etc.,deberán ser desechados en cuanto

cese su uso.

2. Manipulación del Material Corto-Punzante: Material corto-punzante es todo aquel que habiendo

estado o no en contacto con sangre y fluidos corporales, es capaz de producir lesiones por puncióny/o corte, por lo que significan un riesgo para los manipuladores y para la comunidad.

Para facilitar su manejo se dividen en:

2.1. Material Cortante: Principalmente material de vidrio que no ha estado en contacto con sangre y

fluidos de alto riesgo. Frascos, vidrios, botellas, ampolletas, tubos, etc., sin sangre ni fluidos

corporales, termómetros, láminas, porta objetos, etc.

En lo que respecta a su eliminación destacamos, en este resumen solamente lo siguiente, puesto que

se aplicará en nuestro Banco de Sangre principalmente.

Los receptáculos que los recepcionen deben ser de paredes semi-rígidas (cartón o plástico) y serán

llenados solo a 3/4 partes de su capacidad.

En el servicio de Banco de Sangre dichos receptáculos serán las cajas de "SAFE BOX" que vienen

rotuladas con el logo de Riesgo biológico PELIGRO MATERIAL CONTAMINADO (ROJO)

Precauciones :

- Manipular con precaución, no comprimir ni apretar para evitar accidentes.

- No necesita descontaminación previa a su eliminación.

- Destino: Basura o desechos comunes, los receptáculos serán retirados de las respectivas

áreas sucias por el personal de aseo para transportarlas al área de recolección final (área del

compactador) siempre separadas del resto de la basura.

2.2. Material Corto-punzante: Este material necesita descontaminación e incineración previa a su

eliminación. Incluye material como: agujas, lancetas, capilares, tubos de vidrio con sangre o fluidos de

alto riesgo, bisturíes, hojas de afeitar, tubos venoject, simplate, etc., que han estado en contacto con

sangre o fluidos de alto riesgo.

- Recomendaciones: No deberán manipularse, doblarse o retaparse las agujas. En caso de ser

necesario, en su manipulación deberá utilizarse como intermediario una pinza.

- Disposición de eliminación:

El material corto-punzante deberá eliminarse en receptáculos especiales y exclusivos para este fin,

como: cajas de cartón grueso, rígida o semi-rígida, metal, plástico semi-rígido que permitan la

descontaminación por medio del calor.





9

- No debe manipularse el contenido por lo cual no se recomienda uso de recuperables.

- Los dispositivos o receptáculos para la eliminación deberán estar localizados lo más cerca posible de

las áreas de uso, por ej.: clínica, sala área sucia, unidad del paciente, bandeja de exámenes.

- Una vez lleno en sus 3/4 partes deberá sellarse para ser trasladado al área sucia de material

"CORTO-PUNZANTE".

- Si se usara receptáculos de cartón, tenga especial precaución de que no se moje o humedezca, en

estos casos cubrir el interior con una bolsa plástica antes de iniciar su uso.

- Las cajas serán retiradas desde el área sucia por el personal de Higiene Ambiental en horarios y

recorrido específico.

- Los servicios que no dependan del servicio de recolección, deberán llevar los receptáculos de

desechos corto-punzante directamente al área de compactación de basura.

Precauciones:

- Necesita descontaminación previo a su eliminación.

- No comprimir, apretar o estrechar ni cargar los receptáculos, manipule con precaución.

- Si no es impermeable el dispositivo, evite que se humedezca o moje durante el período de

servicio (proteger con bolsa plástica antes de llenarlo).

-

III. USO DE GUANTES DE PLÁSTICO, GOMA O LÁTEX:

El uso de guantes, puede evitar la contaminación de las manos con fluidos corporales de alto riesgo,

pero no protege de las heridas causadas por punción con instrumentos corto-punzantes. La

probabilidad de contaminarse con fluidos de alto riesgo depende de múltiples factores personales y

ambientales, razón por la cual se deben tener presente los siguientes aspectos:

- Uso de guantes: Al realizar una punción venosa o arterial u otro acceso vascular; Si va a tomar

contacto con fluidos de alto riesgo; Al manipular material sucio y/o contaminado; Al limpiar

superficies manchadas con sangre o fluidos de alto riesgo.

La Selección de los guantes dependerá del tipo de procedimiento y/o técnica a realizar, en relación al

riesgo.





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Recomendaciones generales

Lavado de manos antes y después de usar guantes.

Cambiarse los guantes entre cada paciente, si no fuera posible y está usando solo guantes limpios,

lavarse las manos con los guantes entre cada atención y entre paciente y paciente.

- Uso de guantes de látex estériles: En procedimientos y técnicas que conlleven contacto con

áreas normalmente estériles del organismo, en procedimientos invasivos y en los que esté

alterada la integridad de la piel. En general en todos los procedimientos que requieran de

técnicas aséptica.

- Uso de guantes limpios de látex : En procedimientos que impliquen que la persona que

ejecuta la acción esté en contacto con fluidos de alto riesgo o sangre. Es una medida de

protección para el que realiza el procedimiento.

- Uso de guantes de polietileno: Se utilizan en procedimientos en donde se tiene que tomar

contacto con fluidos de bajo riesgo.

- Uso de guantes domésticos : En todas las funciones de aseo que lo requieran según la

norma; en el lavado y preparación de material o instrumental sucio; manipulación de ropa

sucia y basura.

Para cualquier tipo de guante es necesario recalcar que:

- Deben ser de uso personal.

- Reponerse de inmediato si están rotos o pinchados.

- Cada usuario responde por su desinfección, secado y entalcado.

- Deben estar identificados.

IV. USO DE PECHERA PLASTICA:

Es necesario el uso de pechera plástica impermeable en todos los procedimientos en los que con

frecuencia se producen derrames o salpicaduras con sangre o fluidos de alto riesgo.

Ejemplos:

- Lavado de material sucio y/o contaminado.

- Procedimientos invasivos.

- Trabajo en Laboratorio de Urgencia, Laboratorio de rutina y Unidad de Donantes.





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Características de las pecheras:

- Impermeables.

- Largas (cubrir por lo menos bajo la rodilla).

- Es suficiente su desinfección con solución de cloro(30 cc por 900 de agua).

- Si se contaminan deben desinfectarse de inmediato con solución de cloro (100 cc por 900 de

agua).

V. USO DE MASCARILLA:

Su objetivo es proteger la mucosa bucal y nasal, así como también la piel de la cara de eventuales

salpicaduras y aerosoles de sangre y fluidos de alto riesgo.

VI. USO DE ANTEOJOS PROTECTORES:

Su objetivo es proteger la mucosa ocular ante eventuales salpicaduras o aerosoles de sangre y fluidos

de alto riesgo.

Recomendaciones:

Los anteojos no requieren esterilización, solo lavar con agua y jabón (solución desinfectante) si se

contaminan con sangre.





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PRECAUCIONES EN LOS LABORATORIOSLa sangre y otros fluidos de todos los pacientes deben considerarse infectados.

Recomendaciones:

1. Todas las muestras de sangre y fluidos corporales deben colocarse en cajas impermeables con unatapa segura, para prevenir accidentes, derrames o salpicaduras durante su transporte.

Debe tenerse cuidado al recolectar las muestras para evitar contaminar el exterior del tubo.

2. Todo el personal que procesa muestras de sangre y fluidos corporales debe usar guantes y pechera

impermeable.

Se deben usar mascarilla y anteojos si se prevee que las membranas mucosas entrarán en contacto

con sangre y fluidos corporales. Los guantes deben cambiarse y lavarse las manos después del

procesamiento de las muestras.

3. Se deberán usar siempre pipetas mecánicas para manipular todos los líquidos en los laboratorios.

4. El uso de agujas y jeringas debe estar limitado a situaciones en las cuales no hay otra alternativa.

Para prevenir lesiones o accidentes se deben seguir las siguientes recomendaciones:

Uso de jeringas desechable: Se recomienda su uso en todas las atenciones de pacientes. En ningún

caso se reutilizan.

Disposición de eliminación: En lo posible se eliminarán junto con la aguja, de no ser así se debe retirar

la aguja por medio de una pinza y eliminarla directamente en el reservorio destinado a la eliminación

del material corto-punzante; la jeringa se elimina en los dispositivos para basura contaminada.

Uso de Material de vidrio: En este tipo de material incluimos tubos de vidrio para exámenes, placas

de vidrio, láminas, pipetas, etc., y antes de comenzar el proceso de lavado se procede a su

desinfección, sumergiéndolos en una solución de cloro desinfectante por 30 minutos, posteriormente

se eliminan los restos de la mezcla (solución desinfectante y restos de muestra y/o reactivos) en el

desagüe. En este tipo de procedimientos se deben usar guantes domésticos.

5. La descontaminación de superficies y para la limpieza de mesones al finalizar la jornada de trabajo,

siempre y cuando las superficies estén libres de derrames de sangre y/o fluidos corporales debe

realizar con solución de alcohol al 70%. Cada vez que ocurran derrames de sangre y fluidos corporales

se debe limpiar la superficie afectada con hipoclorito de sodio al 0,5%.

Descontaminación de material inerte:

- Autoclave.

- Inmersión en solución desinfectante (hipoclorito de sodio al 0,5%).





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- Incinerar.

- Después de descontaminado se elimina a la basura común, de acuerdo a las normas.

6. Los equipos científicos que han sido contaminados con sangre u otros fluidos corporales deben

descontaminarse limpiándolos antes de ser reparados o transportados donde el fabricante (alcohol al

70%).

7. No está permitido comer o fumar en las áreas de trabajo y menos cuando se están procesando

muestras.

8. Las personas deben lavarse las manos después de terminadas las actividades en el laboratorio y

retirarse la ropa protectora antes de abandonar el laboratorio.

LA IMPLANTACION DE LAS PRECAUCIONES UNIVERSALES DE SANGRE Y FLUIDOS CORPORALES PARA

TODOS LOS PACIENTES ELIMINA LA NECESIDAD DE ETIQUETAR "CONTAMINADO" LAS MUESTRAS DE

LOS PACIENTES QUE SE CONSIDERAN INFECTADOS. LA ETIQUETA ACTUAL ES SÓLO PARA REFORZAR

LA PRECAUCIÓN.

Cada laboratorio debe establecer de acuerdo al área y al procedimiento que se realiza en esa área, las

medidas de protección necesarias.





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REACTIVOS USO FRECUENTE EN BANCO DE SANGRE EINMUNOHEMATOLOGIA

Solución salina (NaCl 0,9% o 0,15 M)

Buffer fosfato salino

900 ml de salino100 ml de mezcla de buffer (16 ml de solución A + 84 ml de solución B, Ph 7,3)

Solución A - buffer ácidoNaH 2 PO 4 H2 O 0,16 M en agua destiladaPh= 5

Solución B- buffer alcalinoNa2HPO 4 0,16 M en agua destiladaPh= 9,0

EDTA 1,5% (en suero fisiológico)

Ajustar a pH 7 con NaOH 10N o HCl 0.1 NUso y mantención: suspensión de glóbulos rojos testigos para la prueba inversa, se debemantener a 4º C.

Solución de sulfato de cobre

Solución de CuSO4 densidad 1.053 (Hb 12.5 gr./dl, varones)Solución de CuSO4 densidad 1.052 (Hb 12 gr./dl, damas)

CuSO2 x 5 H2O: 159 grsAgua destilada: 1000 mlMedir la densidad la que debe ser 1.053 (Hb= 12,5 g/dl), si es necesario, ajustar.Uso y mantención: medición semicuantitativa de la Hb de donantes de sangre.

Preparación de glóbulos rojos testigos A1 y B

Glóbulos seleccionados para uso en la prueba inversa. Se separan 2 unidades, una del grupo A

(cuyos glóbulos deben ser A1) y otra del grupo B.Reactivos: Lectina Dolichus Biflorus (anti A1).Antisueros monoclonales Anti A, anti B, anti AB y anti Rh.

Los glóbulos rojos A1 y B se lavan por 3 veces en abundante PBS y se resuspenden en EDTA 1,5% auna concentración de 2-4%.Hacer control con sueros anti A y anti B, para cada célula testigo.





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CALIBRACIÓN DE CENTRÍFUGA INMUNOHEMATOLÓGICA

Calibración de centrifugas para determinar tiempo de lavados y lectura de las células.

Las centrifugas de inmunohematología deben ser calibradas desde el momento de ser recibidas ydespués de ser ajustadas o reparadas.

La calibración de lectura y lavados se realiza preparando una batería de 10 tubos control, 5controles + y 5 controles – utilizándose suero que produzca aglutinación de 1 cruz y glóbulos rojoscon el antígeno correspondiente para el anticuerpo. Para evaluar el tiempo de lavado se debeobservar sobrenadante transparente y botón de GR definido, se bota todo el PBS y el botón sedebe resuspender con facilidad.

Se debe elegir el tiempo que cumpla con todos los requisitos detallados en la siguiente tabla:

Materiales:- Suero de Antiglobulina Humana- 5 tubos control +

- 5 tubos control – - PBS- Suero anti D- Suspensión de glóbulos rojos al 2-4%

Criterio lectura 10’’ 20’’ 30’’

Sobrenadante Transparente

Botón celular definido

Resuspensión fácil de las células

Intensidad de aglutinación

Control Negativo es negativo

Criterio lavados 45’’ 60’’ 90’’

Sobrenadante Transparente

Botón celular definido

Resuspensión fácil de las células





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Procedimiento:

5 tubos control +: Suspensión de Gr. D+ al 2-4% incubados 15 min. a 37º C con anti D que de 1+ alagregar suero AGH

5 tubos control – : suspensión de Gr. D+ al 2-4% incubados 15 min. a 37º C con solución dealbúmina al 6%.

Llenar con PBS todos los tubosCentrifugar de a pares uno positivo y uno negativo a diferentes tiempos 45, 60,90, 120 segundosAgregar PBS a ambos tubos + y – que de el tiempo óptimo para el lavado.Lavar 2 veces de acuerdo al tiempo de lavado establecidoEliminar todo el sobrenadanteAgregar a los 2 tubos (control – y control +) reactivo de CoombsEvaluar el tiempo de lectura a los 10, 20, 30 segundos





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PREPARACIÓN DE GLÓBULOS ROJOS SENSIBILIZADOSPrincipio

La prueba de Coombs usa el suero Antinmunoglobulina Humana para la detección de anticuerposunidos al glóbulo rojo in vivo e in vitro. En caso de resultados negativos en cualquiera de las dostécnicas se debe verificar la actividad del suero luego de realizar el análisis. Para esto se requierela adición de glóbulos rojos cubiertos con anticuerpos, los que deben ser pesquisados por el suerode Coombs.

Reactivos

- GR R1R1, R1R2 o R2R2.- Plasma de donante con Anti D, previamente separado, titulado y alicuotado en tubos

Eppendorf, para su uso como control.- PBS.

Metodología

Se deben mantener Glóbulos Rojos R1R1, R1R2 o R2R2 para este objetivo.Los glóbulos se seleccionan de las unidades más frescas disponibles para uso. Se determina sugenotipo Rh más probable mediante el uso de los reactivos correspondientes.Una vez que se tienen los Glóbulos disponibles, se deben tomar 2 tubos Vacutainer rojos donde secolocan aproximadamente 4 ml de glóbulos rojos en cada tubo y estos son lavados 4 veces conPBS. Una vez lavados los glóbulos, se toman 4 Tubos de vidrio de 10 ml, donde se coloca 1 ml deglóbulos lavados a cada tubo.Paralelo a esto, debe descongelarse el plasma control Anti D a usar. En caso de que el plasma

tenga un título mayor o igual a 128, se debe usar en proporción 1 es a 1, es decir, 1 ml de glóbulospor 1 ml de plasma Anti D. Por el contrario, si el título es menor a 128 debe usarse 1 ml deglóbulos y 2 ml de plasma, ya que esta es la cantidad necesaria para lograr una sensibilizaciónóptima de los glóbulos rojos (esto significa que al agregar dos gotas de suero de Coombs a unagota de éstos glóbulos, se pueda leer una aglutinación de intensidad ++ a +++), la que va adepender del título previo del plasma Anti D a usar.Incubar posterior mente los tubos a 37°C por 1 hora, Agitando por inversión al comienzo de laincubación y cada 15 minutos hasta su término.Una vez finalizado el tiempo de incubación, se debe controlar los glóbulos obtenidos previo a sulavado, para lo cual se toma una gota de los glóbulos concentrados en un tubo Kahn y se le realizauna prueba de Coombs Directo

Este resultado debe dar intensidad de aglutinación entre ++ y +++.Se debe lavar los glóbulos sensibilizados 4 veces con PBS, para eliminar el suero con anticuerposque quede libre y que podría interferir al momento de usar los glóbulos como control. Luegoresuspenderlos en PBS al 2-4%.





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Los glóbulos sensibilizados se deben alicuotar en frascos con gotario, los que deben ser rotuladoscomo tal, con fecha de sensibilización y vencimiento de esta, que corresponde a dos semanasdesde la fecha de su preparación.

Consignar en la hoja de registro correspondiente la fecha, el número de la bolsa anti D utilizada, eltítulo del Anti D, el número de la unidad de glóbulos rojos utilizados y la intensidad del CoombsDirecto.





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PREPARACIÓN CONTROL ANTI-D

Metodología

1. Tomar 2 tubos Eppendorff de plasma con Anti D.2. Diluir el anti D con PBS en un vaso precipitado. Si el título es mayor a 1/128, diluir 3 ml

aprox. (lo que tienen los tubos Eppendorff) en 100 ml de PBS. Si es menor, diluir los 3 mlen 50 ml de PBS.

3. Agregar a la dilución 0.5ml de Azida de sodio al 10% . Mezclar.4. Alicuotar el plasma diluido en frascos de vidrio con gotario.5. Marcar cada frasco con la etiqueta correspondiente, indicando fecha de elaboración y

fecha de vencimiento. La fecha de vencimiento es 1 mes después de su elaboración.





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CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUEROS CLASIFICADORES ABO

Cada uno de los antisueros clasificadores ABO y Rh, deben cumplir ciertas condiciones deespecificidad y potencia, y los criterios de avidez si se usan en lámina. El control de calidad deestos reactivos se debe realizar diariamente antes de su uso en el laboratorio.

Estos sueros son anticuerpos de tipo IgM monoclonales, se usan y actúan a temperaturaambiente, causando aglutinación directa de las células con su antígeno respectivo. Se conservanentre 2-8 º C.

Los reactivos anti A y anti B se deben controlar con células testigo A y B y para controlar el sueroanti D, se usan células O+.

Inspección visual1. Etiqueta clara y legible, donde se considere especificidad y fabricante.2. Fecha de vencimiento.3. Identificación del Lote .4. Incluye inserto, donde se especifique naturaleza del anticuerpo (monoclonal, policlonal) y

metodologías recomendadas (clasificación en tubo, lámina, y/o microplaca).5. Apariencia física no presentar hemólisis, turbidez, precipitados o gel.6. Cumple con los colores empleados internacionalmente (azul= anti-A, amarillo = anti-B,

incoloro = anti-AB ).7. Volumen es el correcto.





21

Avidez

Capacidad de un reactivo para dar una reacción observable (aglutinación) en un tiempodeterminado, debe dar como mínimo 3+ dentro de 1 minuto después de mezclar. Reactivos

usados para aglutinación en lámina con sangre total.

Los glóbulos rojos deben estar resuspendidos al 35-45 %.

Procedimiento:En la placa de vidrio deposite 2 gotas del antisuero a estudiar y agregue el antígeno adecuado a laconcentración utilizada. Inmediatamente encienda el cronómetro.Registre la intensidad de los aglutinados al tiempo adecuado para la concentración de lasuspensión empleada.

Especificidad

Capacidad de un anticuerpo para reaccionar selectivamente con su antígeno conocido, mediantela observación y estimación visual de la aglutinación. Se mide en cruces.

Procedimiento:

Utilizar muestra con EDTA con hematocrito entre 35-45%Depositar 2 gotas de los diferentes reactivos a evaluar anti A anti B anti AB y anti D en lalámina.Agregar una gota de la muestra de glóbulos rojos conocidos.Evaluar especificidad de los reactivos registrando la presencia o ausencia de aglutinaciónla que se informa como:Presencia de aglutinación = signo + (en grado de cruces +/-,1+,2+,3+,4+)Ausencia de aglutinación = signo menos encerrado entre paréntesis (-).

Potencia

Mide la fuerza de reacción del anticuerpo contenido en el suero con su antígeno respectivo. Serealiza mediante diluciones del suero en estudio (Título) y se expresa con el número recíproco dela dilución más alta en la cual se observe aglutinación de una cruz.

1- Numerar 10 tubos Kahn con los títulos correspondientes (2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256,512,1024)

2- A cada tubo agregar 500 l de PBS. Posteriormente agregar al primer tubo 500l de sueroa titular (dilución ½) y mezclar por agitación lateral.

3- De esta dilución tomar 500l y agregar al tubo siguiente (tubo n°4) y mezclar por agitaciónlateral. Hacer esto sucesivamente, en orden, con el resto de los tubos hasta obtener todaslas diluciones necesarias.

4- Numerar 10 tubos Kahn 1-10

5- Transferir a estos tubos 100l de cada uno de los tubos con diluciones madres.







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CONTROL DE CALIDAD DE LOS SUEROS Rh, anti D

Inspección visual1. Etiqueta clara y legible, donde se considere especificidad y fabricante.2. Fecha de vencimiento.3. Identificación del Lote .4. Incluye inserto, donde se especifique naturaleza del anticuerpo (monoclonal,

policlonal) y metodologías recomendadas (clasificación en tubo, lámina, y/omicroplaca).

5. Apariencia física no presentar hemólisis, turbidez, precipitados o gel.6. Cumple con los colores empleados internacionalmente ( incoloro = Sueros anti-Rh y

anti-D ).7. Volumen es el correcto.

EspecificidadCorresponde a la capacidad de un reactivo de reaccionar selectivamente con antígenos

conocidamente positivos y negativos, sin dar falsos positivos.

Para su evaluación se necesitan células positivas y negativas para los antígenos según como

muestras el siguiente cuadro.

PotenciaSe titula con un pool de por lo menos 4 glóbulos rojos Rh positivos; se debe obtener un título

mínimo de 16.

AvidezSe estudia con dos glóbulos RhD positivos; deben dar un grado tres dentro del primer minuto si seocupan glóbulos rojos al 35-45 % o 2 minutos en caso de ocupar glóbulos rojos al 10-20 %.

Células anti-D

D positivas 2

D negativas 4





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Recomendaciones de la OMS.





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CONTROL DE CALIDAD DE ANTICUERPOS DE OTRAS ESPECIFICIDADES

Esto se aplica para todos los otros anticuerpos utilizados en banco de sangre.

Especificidad

Estudiar por lo menos con dos glóbulos rojos que tengan dosis simple para el antígeno

dependiendo del anticuerpo utilizado y 4 glóbulos rojos que sean negativos para ese antígeno. Los

resultados deben ser positivos inequívocos y claros negativos.

Potencia

Deben dar un título de 4 como mínimo con glóbulos rojos que tengan dosis simple para el

anticuerpo estudiado. Tanto el suero puro como el diluido 1 en 2 deben dar una reacción de +++

como mínimo

Control de calidad reactivos celulares

Células recubiertas con IgG (Células control Coombs)

Estas células se utilizan en la técnica de antiglobulina humana, para controlar que la antiglobulina

humana no se neutralice total o parcialmente, se usa en todos los test de Coombs directos e

indirectos negativos.

Los glóbulos rojos O Rh positivos se les deben agregar suficiente anti-D como para que den un

resultado negativo con antiglobulina humana, al agregar un volumen de glóbulos rojos y un

volumen de suero diluido 1 en 1000, pero deben permanecer positivos si en vez de suero diluido

se adiciona un volumen se suero fisiológico.





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CONTROL DE CALIDAD REACTIVOS MISCELANEOS

La soluciones de salina de baja fuerza iónica deben tener las siguientes parámetros:

pH 6,5 – 7 a 22 ± 1 ºC.

Conductividad 3,4 – 4 mS/com

Osmolaridad 285 – 305 mOsmol/Kg.





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CONTROL DE CALIDAD DEL SUERO DE COOMBS

ANTI-GLOBULINA HUMANA (SAGH)

Para analizar el título y la sensibilidad del suero de Coombs se utilizan glóbulos rojos sensibilizados

con anticuerpos a diferentes concentraciones.

Materiales:

-Pipetas de 1ml

-Baño termoregulado a 37º C

-Centrífuga inmunohematológica

-Tubos de 10x75 mm

-Fuentes iluminadora

Reactivos

-Suero anti-D IgG Humano

-Glóbulos rojos O Rh Positivo

Metodología

Preparar diluciones seriadas del suero anti-D ( ½......1/1024), 1 ml de cada solución.

Preparar glóbulos rojos lavados al menos 3 veces (3 a 4) con P.B.S. y resuspenderlos al

5%.

Agregar GR preparados Volumen /Volumen a cada dilución del suero anti-D. Colocar

control negativo con PBS

Incubar 60 minutos a 37º C.

Luego de la incubación centrifugar y leer. Anotar sus resultados.

Lavar 4 veces con PBS los GR sensibilizados y resuspenderlos en PBS a una concentración

final de 2-4%.





28

En el último lavado eliminar enérgicamente el sobrenadante, secar en toalla absorbente de tal

manera de dejar un botón globular lo más seco posible.

Agregar 2 gotas de suero de Coombs conocido a cada suspensión de GR. Anotar sus

resultados.

Preparar el suero de Coombs en estudio haciendo diluciones seriadas desde ½ a 1/64teniendo presente de dejar un volumen final de 1,5 ml.

Preparar 54 tubos enumerados según esquema adjunto (tablero Ajedrez)

Agregar 2 gotas de GR sensibilizados con una dilución de ¼ a los tubos 1, 10, 19, 28, 37 y

46. Efectuar lo mismo con todas las diluciones de GRs.

Agregar 2 gotas de la dilución de suero de Coombs ½ a los tubos que están en la fila 1, 2,

3, 4, 5,....9. Efectuar lo mismo con las demás filas.

Mezclar la gradilla y centrifugar todos los tubos con procedimiento estándar.

Leer en fuente luminosa, anotar sus resultados.

INTERPRETACIÓN

Título mínimo del suero de Coombs de ser de 1/64 (tubo 46)

La sensibilidad del suero de Coombs debe ser como mínimo con un título de

1/1024 (tubo 9), 200 a 300 IgG por GR.

El título del suero de Coombs está dado por la columna que se utilizaron GRs

tratados con anti-D ¼.

La potencia está determinada por la fila en donde se utiliza la dilución de ½ delsuero de Coombs.

El control de sensibilidad y potencia del suero de Coombs se debe realizar cada vez que se cambia

de lote y/o proveedor del reactivo y como control rutinario utilizando los títulos de sensibilidad y

potencia límites.





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Diluciones

SAGH

Glóbulos Rojos Sensibilizados con anti-D IgG

1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024

1/2 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1/4 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1/8 19 20 21 22 23 24 25 26 27

1/16 28 29 30 31 32 33 34 35 36

1/32 37 38 39 40 41 42 43 44 45

1/64 46 47 48 49 50 51 52 53 54





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TÍTULO DE LA FRACCIÓN IgM y DE LA FRACCIÓN IgG DEL REACTIVO ANTI-D.

Título de la fracción IgM: Se realiza una dilución madre del suero a evaluar y el suero de referencia

(Novaclone IgM/IgG). Se usan GRO R2R2 al 3% para el título, los cuales están previamente lavadosdos a tres veces.

Realizar título, detallado anteriormente.

Título de la fracción IgG: Se debe tratar el suero para eliminar la IgM en forma previa, esto serealiza con el tratamiento del suero con DTT (Dithiothreitol), el cual está congelado-30°C.

Se diluye el DTT 0.2 M a una concentración 0.01 M. Por ejemplo 100l de DTT 0.2M y 1900l dePBS.

Mezclar con el suero a tratar en proporción 1:1 (ej. 500l de DTT 0.01M y 500l suero).

Al mismo tiempo hacer un tubo control, el cual se agrega un volumen de suero y PBS enproporción 1:1. Incubar ambos tubos a 37°C por 1 hora.

Una vez terminado el periodo de incubación, probar la eliminación de la fracción IgM, para lo cualse rotulan dos tubos, uno para el suero con DTT 0.01M y el otro con PBS.

Agregar dos gotas de suero con DTT 0.01M y dos gotas de suero con PBS a cada tubo segúncorresponda y agregar a los tubos una gota de GR O+.

Centrifugar y leer, El tubo tratado con DTT debe dar una aglutinación negativa, mientras que el

control con PBS debe dar una aglutinación fuertemente positiva, esto evidencia que el DTT fuecapaz de inactivar la fracción IgM del Anti-D y que el suero no se inactiva por la incubación (tubocontrol).

Realizar título, detallado anteriormente.

Después del punto 7 incubar los tubos a 37º C por 5 minutos, luego de eso lavar tubos por 4 veces,repetir lavado por 3 veces más, luego del último lavado eliminar todo el PBS, agregar 2 gotas desuero de Coombs, centrifugar y leer.

Registrar en cruces y score.

El título que se lee no es el real, puesto que el antisuero ya está diluido ½ (tratado con DTT), por lotanto el título es una dilución más de la que se observa, y el score son 10 puntos más.





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DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO ABO Y RH EN LAMINA Y TUBO

Introducción

Los antígenos A y B pertenecientes a este sistema, han sido la base para clasificar a losindividuos en cuatro grupos sanguíneos: A, B, AB y O.

Están presentes en la mayoría de las células del organismo, excepto en las del SNC y deltejido conectivo.

Las personas con sangre del tipo A tienen glóbulos rojos que expresan antígenos de tipo Aen su superficie y anticuerpos contra los antígenos B en el suero de su sangre.

Las personas con sangre del tipo B tienen la combinación contraria, glóbulos rojos conantígenos de tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antígenos A en el suero de su sangre

Los individuos con sangre del tipo O no expresan ninguna de los dos antígenos (A y B) enla superficie de sus glóbulos rojos pero pueden fabricar anticuerpos contra ambos tipos, mientrasque las personas con tipo AB expresan ambos antígenos en su superficie y no fabrican ninguno delos dos anticuerpos.Los anticuerpos contra el antígeno que no se expresa, son llamados anticuerpos naturales,generalmente de tipo IgM y aparecen a los 3 meses de vida.

La clasificación ABO consta de 2 métodos:

Método directo: se usan los sueros clasificadores, investigar antígenos en los glóbulos rojos.Método inverso: Se usan los glóbulos rojos testigos, investigar anticuerpos naturales (IgM) en elsuero en estudio.

1. Método directo: prueba en lámina y tubo.

Muestra: sangre total con o sin anticoagulante

Materiales-Pipetas Pasteur-Tubos Kahn-Centrífuga para Inmunohematología.-Fuente de luz.-Láminas-Bagueta

Reactivos-Sueros anti A, anti B, anti AB.-Glóbulos rojos testigos A1 y B lavados y resuspendidos en EDTA o PBS, al 4 %.La suspensión debe prepararse diariamente.-EDTA-PBS





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Técnica en lámina

Sólo para reclasificar muestras sanguíneas.

1. En lámina de vidrio disponer de 1 gota de cada antisuero monoclonal conocido2. Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos 50% en solución salina, suero o plasma.3. Mezclar con bagueta y hacer girar la lámina manualmente4. Leer en un máximo de 2 minutos.

Técnica en tubo

Los tubos de Kahn se rotularán de la siguiente manera: A, B, AB, TS (testigo salino), y con lasiniciales del paciente o número de donante.

1. Colocar una gota de anti-A monoclonal en un tubo limpio y rotulado.2. Colocar una gota de anti-B monoclonal en un segundo tubo limpio y rotulado.3. Colocar una gota de anti-AB monoclonal en un tercer tubo limpio y rotulado.4. Añadir a cada tubo una gota de suspensión de glóbulos rojos problema al2-4%.6. Mezclar suavemente el contenido de los tubos y centrifugarlos según el tiempo estandarizadode lectura.7. Resuspender suavemente los sedimentos de glóbulos rojos y examinar la aglutinación.8. Anotar los resultados de la prueba. Confirmar los resultados con los obtenidos en las pruebasABO en suero.

2. Método inverso.

Muestra: suero o plasma

Materiales-Pipetas Pasteur-Tubos Kahn-Centrífuga para Inmunohematología.-Fuente de luz.

ReactivosGlóbulos rojos testigos A1 y B lavados y resuspendidos en EDTA 1,5 % o PBS, al 2-4 %. La

suspensión debe prepararse diariamente.

Técnica en tubo

Los tubos de Kahn se rotularán de la siguiente manera: A 1, B, (opcional A2), y con las iniciales delpaciente o número de donante.





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1. Colocar una gota de glóbulos rojos reactivos comerciales del grupo A1 en un tubo limpio yrotulado.2. Colocar una gota de glóbulos rojos reactivos comerciales del grupo B en un segundo tubo limpioy rotulado.3. Colocar una gota de glóbulos rojos reactivos comerciales A2 en un tercer tubo, si van arealizarse pruebas en paralelo con este reactivo.(Nota: las pruebas con glóbulos rojos A2 son opcionales. Ej.: Discrepancias o subgrupo del sistemaABO.)4. Añadir a cada tubo una gota de suero problema.5. Mezclar suavemente el contenido de los tubos e incubarlos a temperatura ambiente durante 5minutos para potenciar reacciones débiles.6. Centrifugar según el tiempo estandarizado de lectura.7. Anotar los resultados de la prueba. Confirmar los resultados de la prueba en suero con losobtenidos en la prueba globular.

Interpretación

-La aglutinación de los glóbulos rojos en estudio y la hemólisis o la aglutinación en el suero,constituyen resultados positivos.-La suspensión uniforme después de la resuspensión de las células, constituye un resultadonegativo.-Todas las discrepancias entre los resultados de las pruebas en el suero y las células debenresolverse antes de registrar el informe del grupo ABO y Rh de la muestra.

Protocolo de registro de resultados

Muestra Método directo Grupo Rh Método inverso InterpretaciónAnti-A Anti B Anti-AB Anti-D A1 A2 B

12

34

Lectura de aglutinación:

La lectura de aglutinación debe hacerse en forma lenta y sobre una fuente de luz. De acuerdo a loque se vea en los tubos se gradúa en cruces (+), según lo detallado:

4+ o ++++ : Aglutinado grande y firme, fondo claro.3+ o +++ : Varios Aglutinados grandes, fondo claro.2+ o ++ : Aglutinados medianos y/o pequeños, fondo claro.1+ o + : Aglutinados muy pequeños, fondo rosado, reacción débil a simple vista.W o +/- : Aglutinados más pequeños aún, fondo rosado, reacción muy débil, difícil de leer.





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Score de aglutinación:

Este indicador se usa para hacer control de calidad en antisueros y el reactivo que muestre mayorscore en una titulación posee mayor potencia.

El Score es la suma de cada uno de los scores individuales obtenidos, para ello se ha asignadovalores a cada grado de aglutinación.

Interpretación aglutinación en tubo Score(Puntaje)

Negativo (-) Suspensión de glóbulos rojos uniforme 0

Positivo W+/-

Granularidad débil en la suspensión de glóbulos rojos. 3

1+ Muchos aglutinados de pequeño tamaño y un fondo de

glóbulos rojos libres.

5

2+ Aglutinados grandes en un mar de aglutinados más

pequeños, sin glóbulos rojos libres.

8

3+ Reacción potente. Varios aglutinados grandes. 10

4+ Aglutinado único. No se detectan glóbulos rojos libres 12

Ref. Manual Técnico AABB 13ª Edición.





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CLASIFICACIÓN Rh

El sistema Rhesus, está constituido por unos 40 antígenos siendo 5 de estos importantes desde el

punto de vista clínico. Son los llamados antígenos mayores D, C, E, c, e.En los bancos de sangre generalmente solo se estudia el antígeno D, ya que produce laaloinmunización más frecuente.Los anticuerpos anti D son de tipo IgG y se producen por aloinmunizaciones previas, ya sea porembarazo o transfusiones.Reaccionan mejor en SAGH a 37 º C.El 85% de los individuos caucásicos expresan el antígeno D y se les denomina Rh positivos, si elantígeno no se expresa 15% , se denomina Rh negativos.

MuestraSangre completa con o sin anticoagulante

ReactivosSuero anti D (mezcla IgM e IgG)PBS

Técnica en lámina

1. En lámina de vidrio disponer de 1 gota de suero anti D2. Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos 50% en solución salina, suero o plasma.3. Mezclar con bagueta y hacer girar la lámina manualmente4. Leer en un máximo de 2 minutos.

Técnica en tubo

Los tubos de Kahn se rotularán de la siguiente manera: D, TA (testigo albuminoso), y con lasiniciales del paciente o número de donante.

1. Colocar una gota de antisuero anti-D en un tubo limpio y rotulado.2. Colocar una gota de albúmina al 30% como testigo en un segundo tubo limpio y rotulado.3. Añadir a cada tubo 1 gota de la suspensión de glóbulos rojos problema al 2-5%.4. Mezclar y centrifugar según el tiempo estandarizado de lectura..5. Resuspender suavemente el sedimento de glóbulos rojos y examinar la aglutinación.6. Anotar los resultados de la prueba y los controles.

Interpretación-Si hay aglutinación, se denomina Rh D positiva-Si no hay, seguir estudiando la muestra para investigar presencia de antígeno D débil.





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CLASIFICACIÓN ABO Y RH EN MICROPLACAS

Tipificación ABO de los glóbulos rojos y suero en microplacas.

La microplaca es una matriz de 96 microcubetas en forma de U o de V.

La más utilizada es la microcubeta en forma de U, porque permite leer los resultados después decentrifugar la placa.

Las técnicas en microplacas pueden usarse para investigar antígenos ABO en los glóbulos rojos yanticuerpos en el suero.

MaterialesMicroplacasMicropipetas automáticasTubos khan

EquiposCentrifuga con porta microplacas, estandarizadasAgitador estandarizado para resuspensión de Gr.

MuestraSangre coagulada o anticoagulada.

ReactivosAnti A monoclonalAnti B monoclonalAnti ABEstandarizados para microplacaGlóbulos rojos A1, A2 (opcional) y B (suspensión al 2-5%)

Procedimientos:

Prueba en glóbulos rojos

1. Colocar 1 gota de cada antisuero en cada una en distintas microcubetas2. Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 2-5% en solución salina3. Mezclar, golpeando el borde de la microplaca4. Centrifugar bajo condiciones apropiadas5. Resuspender las células manualmente o mediante agitador mecánico





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6. Leer. Comparar resultados con los obtenidos en el suero.

Pruebas en suero

1. Agregar 1 gota de glóbulos rojos A1, A2 (opcional) y B (suspensión al 2-5%) en cada una endistintas microcubetas

2. Agregar 1 gota de suero o plasma en estudio a cada microcubeta3. Mezclar, golpeando el borde de la microplaca4. Centrifugar bajo condiciones apropiadas5. Resuspender las células manualmente o mediante agitador mecánico6. Leer. Comparar resultados con los obtenidos en los glóbulos rojos.

Nota: Para potenciar reacciones débiles, es factible incubar las placas a temperatura ambientedurante 5-10 minutos y repetir centrifugación, lectura y registro.

Tipificación Rh en microplacas.

Reactivos

Anti D monoclonal IgG o IgG + IgM, además tener un suero anti D de otra marca para repetir lasmuestras negativas en tubo o gel.

Procedimiento

1. Colocar 1 gota de anti D en 1 microcubeta de una microplaca2. Agregar 1 gota de suspensión de glóbulos rojos al 2-5% en solución salina

3.

Mezclar, golpeando el borde de la microplaca4. Centrifugar bajo condiciones apropiadas5. Resuspender las células manualmente o mediante agitador mecánico6. Leer, interpretar y registrar los resultados.

Interpretación

- La aglutinación en las microcubetas de los glóbulos rojos en estudio y la hemólisis o laaglutinación en las microcubetas del suero, constituyen resultados positivos.- La resuspensión uniforme de las células, constituye un resultado negativo.- Todas las discrepancias entre los resultados de las pruebas en el suero y las células debenresolverse antes de registrar el informe del grupo ABO y Rh de la muestra.





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Equipamiento Sistema Automatizado

Equipo de carga para microplacas.Centrífuga.Agitador.Lector de reacción.Programa computacional

Reactivos

Antisueros diluidos.Glóbulos rojos testigos.Diluyente.Solución de lavado.Microplacas.

96 pocillos en forma de U.Fila A dispensar 1 gota de anti-AFila B dispensar 1 gota de anti-BFila C dispensar 1 gota de anti ABFila D dispensar 1 gota de anti-DFila E dispensar 1 gota de anti-DFila F dispensar 1 gota de PBSFila G y H dispensar 1 gota glóbulos rojos testigos a cada pocillo para prueba inversa.





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DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO POR TÉCNICA EN GELES BIO-TYPE®

Consiste en una tarjeta gel, constituida por 6 microtúbulos, cada uno de ellos conformado por unacolumna y una cámara de dispersión/ incubación.

La tecnología de microtipificación en gel se basa en la separación por tamaño de los glóbulos rojosaglutinados, durante el proceso de centrifugación en un gel poroso, los aglutinados grandesquedan atrapados en la zona superior y los pequeños a lo largo de la columna, esta aglutinaciónse produce al reaccionar el antígeno con los anticuerpos correspondientes. Los eritrocitos que noreaccionan quedan en el fondo de la columna.

Materiales

- Pipetas automáticas 100 µl.- Puntas de pipetas desechables- Tubos de vidrio- Tarjetas Gel Bio-Type ABO/D/D/PI, ABO / Rh con Prueba Inversa- Incubador para Tarjetas Gel- Centrífuga para Tarjetas Gel- Hematíes Testigos A1 y B para prueba inversa.- Solución I (Liss)

ReactivosLa tarjeta Bio-Type ABO/D/D/PI contiene anticuerpos Monoclonales Anti-A Anti-B, Anti-D IgM,Anti-D IgM/IgG y Anti-D IgG.

Suspensión neutra adecuada para realizar la prueba inversa en presencia de glóbulos rojos A1 y B.

Preparación de la muestra

a.- Determinación ABO y Rh (prueba directa) Preparar una suspensión de Glóbulos Rojos al 1% en la solución I de la siguiente forma:Dispensar 2 volúmenes de solución I (Liss) (1 ml) a un tubo y agregar 10 ul de glóbulos rojosconcentrados.

b.- Prueba Inversa.Se puede utilizar suero o plasma. Los G.R. A1 + B deben se diluidos al 1% en solución I, de acuerdoa la siguiente proporción:

Dispensar un volumen (500 ul) : 4 gotas de GR.Dispensar dos volúmenes (1000 ul) : 8 gotas de G.RDispensar tres volúmenes (1500 ul ) : 12 gotas de G.R





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1.- Determinación de antígenos de sistema ABO/Rh

- Identificar tarjetas y muestras a utilizar. - Añadir 50 ul de la suspensión de glóbulos rojos del paciente a c/u de los pocillos 1 al 4. ( A, B, D).

2.- Determinación prueba inversa ABO

- Añadir 50 ul de glóbulos rojos A1 al pocillo 5, y 50 ul de glóbulos rojos B al pocillo 6.- Agregar 50 µl de suero o plasma del paciente a los pocillos 5 y 6.- Incubar 10 min a Tº Ambiente- Centrifugar 10 min a velocidad estandarizada, leer resultados.

Resultados

NEGATIVO - Banda de hematíes al fondo de la columna, resto de la columna sin

aglutinados

POSITIVO

+/- Escasos glutinados de pequeño tamaño en la columna.

1+ Algunos aglutinados pequeños en la columna

2+ aglutinados pequeños en la columna y a lo largo de la columna

3+ Banda superior de aglutinado

4+ Banda de aglutinados en la parte superior de la columna.

DP Doble población (doble banda de hematíes , en el fondo y en la partesuperior.





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ANÁLISIS DE CAUSAS DE DISCREPANCIAS EN LA CLASIFICACIÓN ABO/Rh

Discrepancias en la clasificación ABO/Rh

La mayoría de los grupos sanguíneos ABO que se determinan en el banco de sangre cumplen conleyes establecidas de antígenos y anticuerpos correspondientes para ese sistema, pero hay unapoblación que presenta discrepancias que deben ser resueltas para definir el grupo exacto. Estasdiferencias se pueden presentar al detectarse subgrupos débiles de A ( A 3, Am, Ax, Ael, Aend ) y de B(B3, Bx y Bm) que se resuelven generalmente con técnicas de adsorción-elusión e investigación desustancias A, B y H en la saliva de secretores que presentan estas incongruencias. Otro tipo dediscrepancias se presentan en personas con anticuerpos naturales irregulares como anti-A1, anti-H, -M, -N, -P1, Lea, Leb; anticuerpos inmunes que se detectan en medio salino como producto deuna reacción primaria o en pacientes con anemia hemolítica autoinmune y en sujetos concomplejos inmunes relacionados a SIDA o con proteínas anormales como en el mieloma múltiple.

Las posibles causas de discrepancias en la clasificación se pueden deber a diversos factores,entre los cuales los más comunes son:

Los subgrupos sanguíneos

Doble población

Presencia de gelatina de Wharton en las muestras de recién nacidos

Incompatibilidad materno-fetal, que en el momento de la clasificación se hace evidente.

ANÁLISIS DE SUBGRUPOS SANGUÍNEOS

Los subgrupos son fenotipos ABO que difieren en la cantidad de antígeno presente en loseritrocitos y en la saliva de los secretores. Se hallan con mayor frecuencia y tienen más relevanciaclínica los de A, que los de B.

Al utilizar lectinas se definen los subgrupos: A1 y A2: con el extracto de Dolichos biflorus seaglutinan los eritrocitos A1, pero no los de A2; y el anti-H, proveniente de la semilla Ulex europeus,aglutina los eritrocitos que tienen antígeno H. Los eritrocitos de recién nacidos que songenéticamente A1 reaccionan de forma relativamente débil con el anti-A1 humano. Los eritrocitosfetales A2 se comportan como los Ax adultos porque las transferasas actúan de manera lenta enlos RN.

Cuando se comparan las reacciones de los eritrocitos de los niños y adultos de grupo A con suerosanti-A, sólo se encuentran pequeñas diferencias en cuanto la aglutinación de los eritrocitossuspendidos en medio salino, pero las diferencias son más evidentes en la prueba de antiglobulinaindirecta (anti-IgG) y las pruebas de LISS (Low Ionic Strength Solution).





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Lectina Anti- A1 (Dolichos biflorus)

El sistema de grupos sanguíneos ABO sigue siendo el primero a tener en cuenta en el momento derealizar una transfusión de sangre. Los antígenos A y B son productos génicos fácilmentedetectables y constituyen marcadores genéticos de gran valor. Entre los individuos A, sedistinguen 2 categorías: A1 y A2.

La diferenciación entre ambas se realiza mediante la utilización de anticuerpos monoclonales ylectinas específicas de grupo sanguíneo Dolichos biflorus (anti A1), la cual reacciona aglutinandolas células que poseen el antígeno A1.

MATERIAL Y EQUIPO MUESTRA BIOLÓGICA REACTIVO

· Tubos Kahn· Cronómetro· Marcador· Centrífuga serológica

Glóbulos rojos de donante opaciente

· Lectina anti-A1

Adicione una gota de anti-A1 a tubos adecuadamente marcados.

Adicione una gota de una suspensión de eritrocitos a una concentración aproximada del 4% ensolución salina (PBS). Mezcle completamente el contenido del tubo.

Centrifugar según el tiempo estandarizado de lectura.Agite suavemente el tubo y resuspenda el botón celular. Examine las reacciones resultantesmacroscópicamente. Registre resultados.





43

Lectina Anti – H (Ulex europeaus)La lectina Ulex europeaus tiene la propiedad de aglutinar las células que expongan el antígeno Hen su superficie.

Existe un fenotipo eritrocitario relativo a la ausencia del antígeno H en la superficie llamado“Fenotipo Bombay”, en el cual el paciente que necesitase recibir transfusión de glóbulos rojos,

necesita exclusivamente eritrocitos con la ausencia del antígeno H, ya que puede poseeranticuerpos anti-H; antígeno presente en la mayor parte de la población.

MATERIAL Y EQUIPO MUESTRA BIOLÓGICA REACTIVO· Tubos Kahn· Cronómetro· Marcador

· Centrifuga serológica

Glóbulos rojos de donante opaciente

· Lectina anti-H

Adicione una gota de una suspensión de eritrocitos a una concentración aproximada del 4% ensolución salina (PBS) en un tubo de ensayo debidamente marcado. Mezcle completamente elcontenido del tubo.

Adicione dos gotas de lectina anti-H y mezcle completamente el contenido del tubo. Incubedurante 5 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar según el tiempo estandarizado de lectura.Agite suavemente el tubo y resuspenda el botón celular. Examine las reacciones resultantesmacroscópicamente. Registre resultados.





44

· Prueba positiva: Aglutinación de los globulos rojos.· Prueba negativa: Ausencia de aglutinación de los globulos rojos

CONCLUSIONES:

Para realizar una transfusión sanguínea se debe tomar en cuenta los subgrupos del donante y delreceptor. Los subgrupos con mayor frecuencia y tienen más relevancia clínica los de A, que los deB. Se identifican por medio de lectinas. Los subgrupos A más importantes son: A1 y A2.





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ANTIGENO B ADQUIRIDO POR INDIVIDUOS A1

El “B adquirido” podría deberse a la acción de la desacetilasa bacteriana, que convierte la N-

acetilgalactosamina en α-galactosamina, la cual es muy similar a la galactosa, el principaldeterminante de B. Las células B adquiridas se hacen más reactivas frente al extracto de Dolichusbiflorus.

También pueden presentar activación T o Tk, estando mediadas todas esas alteraciones porenzimas bacterianas en pacientes que cursan con una infección importante como la de colon.Otro mecanismo de producción de grupo B adquirido secundario a la absorción de sustanciasbacterianas semejante al grupo B se observa en personas infectadas por Proteus vulgaris oEscherichia coli .

Se ha descrito un grupo B adquirido que se detecta sólo en células del grupo A de expresión débil.

Debilitamiento de antígenos A, B y H

El debilitamiento de la expresión de antígenos AB puede observarse en las personas de edadavanzada (aparentan ser grupo O); los anticuerpos anti-AB también pueden sufrir cambios enestos sujetos.En pacientes que estén recibiendo quimioterapia inmunosupresora la concentración deanticuerpos disminuye significativamente. En ocasiones la sangre parece contener una mezcla decélulas de los grupos A y O, o de A1 y A débil; en otros casos, los eritrocitos reaccionan débilmentecon el anti-A y se comportan de manera parecida al A3 o al Am.

Secretores y no secretores

Los genes secretores Se y se controlan la secreción de H, A y B. Alrededor de 80 % de losindividuos son secretores y segregan la sustancia H, independientemente de su grupo ABO; así lasaliva de secretores de grupo O contiene H y la de secretores de grupo A contiene A y H. 20% delos individuos que no segregan sustancia H (no secretores) tampoco segregan A ni B.

Aglutinación de campo mixto

Término que trata de describir la presencia de eritrocitos aglutinados y no aglutinados ensuspensiones tratadas con una aglutinina. Esto quiere indicar que existen dos poblacionesfenotípicamente distintas, como sucede en pacientes transfundidos, en mujeres que contienen encirculación eritrocitos fetales, o cuando alguno de los eritrocitos de un sujeto ha sufridotransformación T o Tn.





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Puede verse una morfología similar en mezclas de suspensiones eritrocitarias de un únicofenotipo, cuando los eritrocitos tienen pocos lugares antigénicos (por ejemplo, variantes débilesde A), o cuando la aglutinina es de título bajo.

Discrepancias entre pruebas con eritrocitos y suero

Los resultados de las pruebas con eritrocitos y con suero pueden ser discrepantes debido a losproblemas intrínsecos de los eritrocitos o del suero, debido a problemas relacionados con laprueba, o a errores técnicos, ya sea que se han obtenido resultados negativos cuando seesperaban positivos o viceversa.

Falsos negativos Falsos positivos

Pueden tener lugar debido a la omisión de:- Agregar reactivo o suero de prueba a un tubo.

- No Identificar la hemólisis como una reacciónpositiva.- Uso de una relación inapropiada entre suero(reactivo) y eritrocitos.- Centrifugar insuficientemente las pruebas.- Interpretar o registrar incorrectamente losresultados de las pruebas.

Los resultados pueden ocurrir por:- Sobrecentrifugación de los tubos.

- Uso de reactivos, eritrocitos o solución salinacontaminados.- Uso de material de vidrio sucio.- Autoaglutinación de los eritrocitos del paciente yrealización sólo del grupo directo sin autotestigo.- Interpretación o registros incorrectos de losresultados de las pruebas.

Resolución de discrepancias ABO

El primer paso debe ser la repetición de las pruebas en la misma muestra. Si las pruebas inicialesfueron efectuadas con eritrocitos suspendidos en suero o plasma, se debe repetir la prueba,usando una suspensión salina de células lavadas. Si persiste la discrepancia se procede a losiguiente:

Obtener una nueva muestra (donante o receptor) y someter ésta a prueba; esto resuelvelas discrepancias debidas a un rotulado equivocado o contaminación de muestra.

Lavar los eritrocitos varias veces para eliminar componentes séricos o químicos quepuedan estar causando reacciones positivas.

Someter a prueba los eritrocitos con anti-A, B, anti-A1 o anti-H, según corresponda.

Si se sospecha anti-A1, examinar el suero contra varios ejemplos de eritrocitos del grupoA2.

Revisar los resultados de la prueba de investigación de anticuerpos contra eritrocitos delgrupo O para detectar efectos de interferencia por aloanticuerpos fríos inespecíficos.

Incubar las pruebas durante 30 minutos a temperatura ambiente para facilitar ladetección de antígenos o anticuerpos débiles.





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Resolución de discrepancias debidas a la ausencia de antígenos esperados

Se pueden usar los siguientes procedimientos para intensificar la detección de antígenos

débilmente expresados:

Incubar eritrocitos lavados con anti-A y anti-A, B durante 30 minutos a temperaturaambiente para incrementar asociación de anticuerpos con escasa cantidad de antígeno.Incubar a 4 °C puede intensificar aún más la fijación del anticuerpo, pero deben sercontroladas con eritrocitos de grupo O y autólogos para asegurar que las reacciones sondebidas a anti-A y anti-B y no a otras aglutininas frías.

Tratar los eritrocitos del paciente con una enzima proteolítica, como ficina, papaína, obromelina. El tratamiento enzimático incrementa la reacción antígeno-anticuerpo conanti-A o anti-B. Paralelamente se deben incluir eritrocitos del grupo O tratados conenzimas como control de la especificidad de la reacción ABO.

Realizar adsorción-elusión con anti-A o anti-B humanos para adsorber el anticuerpo a loscorrespondientes antígenos eritrocitarios. No se debe usar anti-A1 o reactivosmonoclonales y debe hacerse en paralelo con eritrocitos de grupo O para control.

Buscar en la saliva la presencia de sustancias H, A o B.

Resolución de discrepancias debidas a reacciones inesperadas con anti-A y anti-B

Las pruebas de agrupación de eritrocitos dan reacciones inesperadas, pueden ser responsablesalelos variantes en el locus ABO o problemas no relacionados con los genes ABO. Para confirmarque los eritrocitos del grupo A1 portan la estructura adquirida B:

Verificar el diagnóstico del paciente. Los antígenos adquiridos B suelen relacionarse conafecciones hísticas que permiten ingresar a las bacterias del colon a la circulación.

Someter a prueba el suero del paciente contra eritrocitos autólogos. El anti-B delindividuo no aglutina sus propios eritrocitos que portan el B adquirido.

Someter a prueba los eritrocitos con suero anti-B humano que ha sido acidificado a pH6,0. El anti-B humano acidificado no reacciona con el antígeno B adquirido.

Si el paciente es secretor, comprobar la presencia de A y B en la saliva. Los secretorescuyos eritrocitos portan estructuras B adquiridas tienen sustancias A, pero no B en susaliva.





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Eritrocitos revestidos por anticuerpo

Los eritrocitos de lactantes con EHRN, o adultos que padecen de afecciones autoinmunes oaloinmunes, pueden estar tan intensamente revestidos de moléculas de anticuerpos IgG comopara aglutinarse en forma espontánea en presencia de diluyentes de reactivos que contengan

altas concentraciones de proteínas.

Se puede usar una elusión suave a 45 °C o con glicina a pH ácido, para eliminar gran parte de esteanticuerpo de los eritrocitos de modo que se pueda someter a prueba en forma confiable conanti-A y anti-B.Los eritrocitos de una muestra que contenga autoaglutininas IgM reactivas con el frío puedenaglutinar en forma espontánea en pruebas de solución salina. Por lo común, los anticuerpospueden ser eliminados incubando la suspensión celular a 37°C y luego lavando varias veces consolución salina calentada a 37 °C. Si la aglutinación relacionada con IgM no es eliminada por estatécnica, los eritrocitos pueden ser tratados con ditiotreitol (DTT).

Resolución de discrepancias debidas a reacciones séricas inesperadas

Algunos acontecimientos pueden ocasionar resultados inesperados o erróneos de pruebas ensuero, que pueden ser resueltos.

Los pacientes inmunodeficientes pueden no producir niveles detectables de anti-A y anti-B; estos anticuerpos están ausentes del suero de recién nacidos, o ser muy débiles enpersonas seniles normales, pacientes que cursan con hipogamaglobulinemias y pacientescon transplantes de medula ósea. Cuando esto sucede en la prueba inversa:aumentar el tiempo de incubación 15-30 minutos a temperatura ambiente.incubar a 4 º C junto con tubo que lleve Gr O y un autocontrol (PA).

Concentraciones anormales altas de anti-A y anti-B han causado reacciones prozona quedieron lugar a resultados falsos negativos; en estos casos, el grupo ABO se puede inferirmediante pruebas en eritrocitos por dilución del suero mediante el uso de suero tratadocon EDTA.

El anti-A en el suero de individuos A2, A2B u otros subgrupos aglutina eritrocitos testigosA1.

Las autoaglutininas frías como anti-I y anti-IH, pueden aglutinar los eritrocitos de todos los

adultos, incluidas las células autólogas y eritrocitos testigos, cuando esta reactividadinterfiere en la interpretación de las pruebas:

- Calentar el suero y los eritrocitos testigos a 37 ° C antes de mezclarlos y realizar laspruebas en suero a 37 ° C y convertirlas a la fase antiglobulina si es necesario.

- Eliminar la autoaglutinina fría del suero mediante un método de autoadsorción fría, elsuero adsorbido puede ser sometido contra eritrocitos testigos A1 y B.- Tratar el suero con DTT y usar el suero tratado para pruebas de agrupación inversa.





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Aloanticuerpos inesperados que reaccionan a temperatura ambiente como anti-P oanti-M, pueden aglutinar los eritrocitos usados en las pruebas con suero si portan elcorrespondiente antígeno, para ver el tipo correcto de ABO de un suero que contengaotros aloanticuerpos fríos realizar:

- Elevar la temperatura a 30-37 °C antes de mezclar el suero y las células, si la temperatura

del aloanticuerpo es inferior a la cual reaccionan anti-A y anti-B, esto puede resolver la

discrepancia.





50

DETECCIÓN DE ANTÍGENOS SOLUBLES EN SECRECIONES

Identificación de antígenos solubles A, B, H en la Saliva. Determinación del estado secretor.

La secreción de la sustancia ABH se produce en individuos que presentan el gen secretor ya sea

homocigotos SeSe o heterocigotos Sese para dicho gen.Aquellos individuos secretores tienen en su saliva la sustancia H, independiente de su grupo ABO,así los individuos del grupo O tienen o secretan en su saliva la sustancia H y los del grupo A, lasustancia H y A.

La determinación de individuos secretores o no, se basa en la detección de antígenos solublespresentes en la saliva inactivada. Si esta está presente, neutralizará la actividad de sus anticuerposcorrespondientes por lo tanto, no se observará aglutinación de los glóbulos rojos una vez queestos se agreguen, si el líquido orgánico no contiene el antígeno, no se producirá la neutralizacióndel anticuerpo por lo que estos aglutinarán los glóbulos rojos respectivos.

El 80 % de los individuos caucásicos, heredan el gen Se y son llamados secretores. El 20 % restanteno son secretores y de genotipo sese.

La determinación de secretores tiene escasa importancia tanto clínica como de laboratorio, peropuede ser útil en la determinación de grupo sanguíneo ABO de un individuo si el grupo de sushematíes no es constituyente.

MuestraSaliva

Reactivos

Suero clasificador ABOLectina anti HGlóbulos rojos A-B-O lavadosPBS

Técnica1. Enjuagar la boca2. Recolectar 5-10 ml de saliva en un tubo de centrifuga3. Centrifugar durante 9 min.4. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y colocar en baño termoregulado durante 8-

10 min. Para inactivar la saliva.

5. Centrifugar 9 min. Extraer el sobrenadante transparente o algo opalescente en otro tubo,descartar el material opaco o semi sólido.6. Diluir el sobrenadante (500ul) con un volumen igual de PBS (500ul).7. Por otra parte prepare diluciones de los antisueros para tipificar, esta dilución debe

permitir una aglutinación de las células correspondientes de 2 +





51

8. Colocar una gota de reactivo para tipificar (antisuero diluido) en dos tubos, una marcadocomo solución salina (control +) y el otro como desconocido. Para cada anticuerpo enanálisis.

9. Agregar una gota de solución salina al tubo marcado como control+ y una gota de salivadiluida e inactivada al tubo respectivo.

10. Mezclar e incubar a temperatura ambiente 10 min.11. Agregar una gota de glóbulos rojos testigos suspendidas al 3 % a cada tubo del grupo A, B

u O.12. Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 10 min.13. Centrifugar bajo condiciones estandarizadas, leer y registrar los resultados.

InterpretaciónEjemplo:

Saliva en estudio + anti A + Gr A PBS+ anti A+ Gr A Interpretación

++ ++ Sese o No Secretor- ++ SeSe, Sese o Secretor







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5. En los estudios inmunohematológicos (no rutinarios), incubar a temperatura ambientedurante10 minutos, centrifugar y leer de nuevo.

6. En caso de un resultado positivo, repetir la reacción con los sueros antiglobulina humanamonoespecíficos anti-IgG, anti-C3d y eventualmente anti- IgA.

Interpretación

Si se observa aglutinación de los eritrocitos, indica de que estos fueron recubiertos poranticuerpos IgG o fracciones del complemento in vivo.

Prueba antiglobulínica indirecta con albúmina en tubo

Se rotularán 2 tubos de Kahn con las iniciales del paciente o el número de donante y número delvial (ej.: I y II).1. Añadir 1 gota de suero a dos tubos rotulados.2. Añadir 1 gota de albúmina bovina al 3%.3. Añadir 1 gota de suspensión de glóbulos rojos (reactivo o de donantes) al 2-5% a cada tubo y

mezclar.4. Incubar a 37º C durante 30 minutos.5. Centrifugar y observar en busca de hemólisis y/o aglutinación. Clasificar y anotar los resultados.6. Lavar los glóbulos rojos 3 veces con solución salina y descartar totalmente el sobrenadante delúltimo lavado.7. Añadir 1 gota de antiglobulina humana, centrifugar durante 15 segundos a 2.500 rpm.

Leer y anotar los resultados.

Interpretación

Si después de incubar a 37º C y de centrifugar hay aglutinación significa que en el suero delpaciente hay anticuerpo tipo IgM, si se intensifica la aglutinación a 4 º C, significa que haypresencia de una crioaglutinina.

Si después de agregar la AGH y de centrifugar, se observa aglutinación de los eritrocitos, indica deque en el suero del paciente hay anticuerpos de tipo IgG o fracciones del complemento in vivo.

Control del test

Adicionar 1 gota de células sensibilizadas o células control de Coombs a todos los tubos negativospara asegurar que la AGH está activa y no se ha neutralizado por alguna proteína presente en el

tubo.

Estas deben ser aglutinadas por la antiglobulina, si no es así, esta prueba queda invalidada y sedebe volver a repetir.

Se debe obtener una lectura positiva de 1+ a 2+ .





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TÉCNICA EN GEL PARA PRUEBA DE COOMBS DIRECTA E INDIRECTA(Bio-Type)

Detección de anticuerpos irregulares en gel

PRINCIPIO

El reactivo de Coombs o prueba de Antiglobulina Humana Poliespecífica, es una prueba utilizada

de rutina en la detección de aloanticuerpos, pruebas de compatibilidad y pruebas de Coombs

Directo.

Sueros de Coombs poliespecíficos contienen anticuerpos dirigidos hacia IgG de origen humano y el

componente C3d del complemento humano.

Indudablemente, la detección de la fracción IgG es la de mayor importancia.

La importancia en la detección de fracciones de complemento como C 3d se manifiesta

principalmente en las pruebas de Coombs Directo, en la investigación de anemias hemolíticas

autoinmunes.

Pruebas de Coombs Directo positivas, generalmente son indicativas de glóbulos rojos

sensibilizados in vivo, por inmunoglobulinas y/o complemento.

Reactivo

La tarjeta Bio-Type AHG contiene suero de Coombs Poliespecífico con fracción anti-IgG obtenidade conejos inmunizados con IgG humana purificada, y anticuerpos Monoclonales MurinosAnti-C3d. (BRIC 8).

Glóbulos rojos sensibilizados con fracción de complemento C4d no reaccionan con este reactivo.

Este reactivo ha sido formulado para uso en Detección e Identificación de anticuerpos irregulares,

Pruebas de Compatibilidad y Coombs Directo.

Precauciones

Este reactivo contiene 0.1% p/v Azida de Sodio.

Puede ser tóxico al ser ingerido y reacciona con las tuberías de plomo y cobre.





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Almacenaje

Almacenar entre 18-25ºC.

El reactivo se mantendrá estable por todo el período indicado.

Toma de la muestra

La muestra de sangre debe ser extraída en forma aséptica y preferentemente en Citrato, EDTA,

Heparina o CPD-A. Para obtener resultados confiables se recomienda el uso de sangre fresca.

Se puede utilizar suero o plasma frescos. Reacciones de Hemólisis dependientes de complemento

podrían pasar desapercibidas al utilizar plasma en vez de suero.

La muestra de suero o plasma, una vez separada, puede ser almacenada durante 48 horas a

temperatura de refrigeración (2-8 °C), o congelarse entre –20 a –80 °C por períodos mayores.

Al utilizar suero, este debe ser aclarado mediante centrifugación a 1.500 g por 10 minutos, para

evitar residuos de fibrina que pudieran interferir con la reacción.


Preparar una suspensión de Glóbulos Rojos al 1% en la solución I de la siguiente forma:

1. Las Células de screening deben ser diluidas al 1% en Solución I de acuerdo a la siguienteproporción, dependiendo del número de muestras diarias:

Vol. Gr (uL) Vol. Solución I (uL) Vol. Total (uL) Nº de pruebas40 100 140 2

200 (4 gotas) 500 ( Dispensar 1 Volumen) 700 14

400 (8 gotas) 1000 ( Dispensar 2 Volúmenes) 1400 28

2. Agregar 50 ul (1 gota) de Glóbulos rojos I y II al 1% a cada pocillo3. Agregar 25 ul de suero o plasma4. Incubar 15 minutos a 37ºC5. Centrifugar 10 minutos6. Leer





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Coombs directo en gel

1. Agregar 50 ul de G.R. lavados y resuspendidos al 1% (diluidos en Solución I) a cada

pocillo.2. Centrifugar 10 minutos3. Leer

Falsos negativos

Neutralización del reactivo antiglobulínico humano.Interrupción de la prueba.Almacenamiento incorrecto de los reactivos.Procedimientos incorrectos.Complemento.

Solución salina.Exceso de antígenosOmisión de adición de AGHTiempo de incubación y temperatura inadecuada

Falsos positivos

Células aglutinadas antes de los lavados.Presencia de coágulos de fibrinaProblemas con la limpieza de materialCélulas con PAD positiva.

Complemento.Contaminación de AGH





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INVESTIGACIÓN DE MUESTRAS Rh NEGATIVAS, Rh POSITIVAS DÉBILES o RhPOSITIVA PARCIAL

Principio

El antígeno Rh D puede expresarse de forma completa y por lo tanto estamos en presencia de unresultado Rh D Positivo o simplemente no expresarse y por tanto ser un Rh D Negativo o hacerlode forma débil o parcialmente y por lo tanto ser clasificado como un Rh D Positivo débil. Dichaexpresión obedece al gen RHD que se encuentra en el brazo largo del cromosoma 1, siendoheredado tanto del padre como de la madre

1. Colocar una gota de antisuero anti-D en un tubo limpio y rotulado.2. Añadir una gota de la suspensión al 2-5% en solución salina de glóbulos rojos problema.3. Mezclar y centrifugar durante 15 segundos a 1800 rpm o 10 segundos a 2000 rpm4. Resuspender suavemente el sedimento de glóbulos rojos y examinar en busca de

aglutinación. Si se observara en este punto una aglutinación mayor a 1+, informar como Dpositivo. No será necesario continuar con la fase de AGH.

5. Si los glóbulos rojos problema no se hubiesen aglutinado o mostrasen una aglutinacióndudosa, incubar por 15 a 30 minutos a 37 grados Celsius, una vez terminada la incubación,

6. Lavar los tres a cuatro veces con abundante solución salina tamponada (PBS). Después delúltimo lavado, descartar totalmente el PBS y secar los bordes, invirtiendo el tubo en formaenérgica de una sola vez sobre papel absorbente.

7. Añadir 2 gotas de AGH, puede utilizarse un reactivo poliespecífico anti-IgG y anti-C3d omonoespecífico anti-IgG.

8. Mezclar suavemente y centrifugar durante 15 segundos a 1800 rpm.9. Posteriormente en la fase de lectura resuspender suavemente el sedimento de glóbulos

rojos, examinar en busca de aglutinación y anotar el resultado de la prueba.10. Si el resultado fuera negativo, la reacción podrá confirmarse añadiendo glóbulos rojos

sensibilizados por IgG, centrifugar de nuevo para lectura y volver a examinar en busca deaglutinación. La aparición de aglutinación en este punto confirma la presencia deantiglobulina humana activa en la mezcla de la prueba.

Interpretación

Si el resultado es negativo, se puede afirmar que esa persona es Rh D negativa.Si el resultado es positivo puede ser porque la persona tiene un antígeno D débil o un D parcial.





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DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Rh-Hr Y CÁLCULO DEL GENOTIPO MÁSPROBABLE

La existencia de genes estrechamente ligados en el mismo cromosoma, heredándose como unaunidad, en donde cada gen determina un antígeno eritrocitario específico fue la propuesta deFischer y Race en el año 1943 y le asignaron el nombre de Sistema Rh, siendo los tres alelos másimportante: D, C-c, E-e que están codificados por dos genes, el gen D y el gen CE.

La presencia de cada antígeno (D,C,c,E,e) puede realizarse con antisueros específicos, exceptopara el antígeno d cuyo anticuerpos aún no ha sido descubierto, por tanto la ausencia de D sedebe anotar como d.

El cálculo de la probabilidad genotípica se basa en la frecuencia con que se asocian los alelos en elcromosoma.

Materiales.

- Centrífugas Inmunohematológicas

- Pipetas Pasteur.

- Recipiente para desechos.

- Tubos Kahn.

- GR R1R2 como control positivo para cada antisuero del Sistema Rh-Hr

- GR R1R1 (E, c), R2R2 (C, e), como control negativo para cada antisuero del Sistema Rh-Hr

- Centrífuga para muestras.

- Pizetas plásticas con PBS.

- Papel desechable.

- Guantes.

- Parafilm.

- Refrigerador para guardar muestras y reactivos en general.





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Técnica

En el refrigerador de Inmunohematología se deben mantener Glóbulos Rojos R1R1, R1R2 o R2R2

como control (-) o +. Los glóbulos se seleccionan de las unidades (Concentrados de GlóbulosRojos) más frescas disponibles para uso. Se determina su genotipo Rh más probable mediante eluso de los reactivos correspondientes.

1. Preparar 5 tubos de Kahn marcados como D, C, E, c, e2. Colocar en cada tubo lo que corresponda, 1 gota del antisuero anti-Rh es decir una gota

de antisuero D al tubo marcado D, etc.3. Hacer una suspensión de los glóbulos rojos a estudiar del 2-4% en solución salina y

añadir una gota a cada tubo.

No olvidar los controles Negativos y positivos para cada antisuero (D, C, c, E, e). Para los

controles se puede usar cada antisuero a una dilución de ¼ en PBS. Para esto tomar 50microlitros de antisuero y resuspenderlo en 150 microlitros de PBS quedando un volumenfinal de 200 microlitros, que nos alcanza para realizar 2 determinaciones y 2 controles paracada uno.

Luego de lavados los glóbulos y hechas las diluciones,

4. Tomar 50 microlitros de antisuero diluido y ponerlo en un tubo Kahn,

5. Agregar 50 microlitros de glóbulos a analizar mezclar. Realizar esto con los tubosrotulados como Anti D, Anti C, Anti c, Anti E y Anti e, y también para los controles

Negativos y positivos de cada antisuero.

6. Centrifugar los tubos y leer sobre la fuente luminosa.

7. Validar los resultados con los controles.

8. Interpretar el resultado registrando la intensidad de aglutinación observada de cada tuboen la plantilla de resultados, luego según lo observado asignar un genotipo Rh másprobable de acuerdo a la tabla adjunta.





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Tabla 1. Genotipos probables.ANTI Genotipo probable

D C E c EWiener FischerRace

+ + 0 + +

R

1

rDCe/dce

+ + 0 0 + R1R1 DCe/DCe

0 0 0 + + rr dce/dce

+ + + + + R1R2 DCe/DcE

+ 0 + + + R2r DcE/dce

+ 0 + + 0 R2R2 DcE/DcE

+ 0 0 + + Ror Dce/dce

0 + 0 + + r´r dCe/dce

0 0 + + + r´´r dcE/dce

Tabla 2. Frecuencia Genética en Población de Santiago. CuadroComparativo.

WienerHaplotipo

FischerRace Chile%

FrecuenciaBlancos Negros

R1 DCe 49,9 42 17

r dce 22,2 37 26

R2 DcE 22,2 14 11

R0 Dce 2,3 4 44

r’ dCe 0,9 2 2

r’’ dcE 1,4 1 0

Rz DCE 0,9 0 0

ry dCE 0 0 0

Rev.Méd.Chile 116:28-33, 1988

Tabla 3. Frecuencia Genética de Antígenos Rh

GEN Frecuencia (%)

D

d(Ausencia de D)CEce

85

1570308098







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CLASIFICACIÓN ABO Y RH EN EL RECIÉN NACIDO EN GEL(Bio-type)

Principio

El fenotipo ABO de un individuo es determinado por la aglutinación de sus glóbulos rojos en lapresencia de suero Anti-A, Anti-B y Anti-AB. (Prueba directa). En adultos, la confirmación del

grupo ABO puede llevarse a cabo por la reacción del suero de este individuo con una suspensión

de glóbulos rojos A1 y B. ( Prueba Inversa).

Debido a que la presencia de estos anticuerpos no ocurre antes de los 4-6 meses de vida, la

prueba inversa no puede llevarse a cabo en recién nacidos.

Los antígenos A y B no se encuentran totalmente desarrollados en los recién nacidos, motivo por

el cual sus reacciones de aglutinación pueden ser más débiles y subgrupos no pueden ser

identificados.

La tarjeta Bio-Type Recién Nacido le permite al usuario efectuar la prueba directa, determinación

del grupo Rh y la prueba de Coombs directo.

Los pacientes que presenten un grupo D (-) pueden ser llevados a Du de acuerdo a las normas de

cada institución.

Sangre de cordón o de talón puede ser utilizada. Generalmente no es necesario lavar la sangreprevio a su clasificación. Se recomienda lavar 1 vez la muestra de cordón en PBS, para una mejorestandarización. Hay que lavar la sangre de cordón si no está anticoagulada para eliminarmicrocoágulos.

Reactivo

La tarjeta Bio-Type Recién Nacido consta de los siguientes pocillos:

1-Anticuerpos Monoclonales Anti-A (Línea celular BIRMA-1).

2- Anti-B (Línea celular KLB-2).

3- Anti-AB (Línea celular BIRMA-1, ES-4, ES-15).

4 - Anti-D IgM/IgG (Anti-D IgM línea celular TH-28 y Anti-D IgG derivado de la línea celular MS-26).

5- Gel neutro para control Rh.

6-Suero de Coombs Poliespecífico con fracción anti-IgG obtenida de conejos inmunizados con IgG

humana purificada, y anticuerpos Monoclonales Murinos Anti-C3d. (BRIC 8).

Glóbulos rojos sensibilizados con fracción de complemento C4d no reaccionan con este reactivo.





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Este pocillo ha sido diseñado para detección de muestras con Coombs Directo Positivo (+).

Precauciones

Este reactivo contiene 0.1% p/v Azida de Sodio.

Puede ser tóxico al ser ingerido y reacciona con las tuberías de plomo y cobre.

Almacenaje

Almacenar entre 18-25ºC.

El reactivo se mantendrá estable por todo el período indicado.

Toma de la muestra

Sangre de cordón o punción de talón puede ser utilizada. Generalmente no es necesario lavar la

sangre previo a su clasificación. Cuando se utilice sangre de cordón debe evitarse la

contaminación con gelatina de Wharton.

La muestra de sangre debe ser extraída en forma aséptica y preferentemente en Citrato, EDTA,

Heparina o CPD-A. Para obtener resultados confiables se recomienda el uso de sangre fresca.


Preparar una suspensión de Glóbulos Rojos al 1% en la solución I de la siguiente forma:

En un tubo de ensayo limpio, colocar 1 ml de “Solución I” y 10 ul de sedimento de glóbulos rojos.

Procedimiento.

No utilizar tarjetas que presenten deshidratación o variación en su presentación al examen ocular.

No utilizar muestras hemolizadas o contaminadas.

1.- Identificar cada tarjeta con el nombre del paciente.

Retirar el sello que recubre la tarjeta.

2.- Añadir 50 ul de glóbulos rojos suspendidos al 1% en solución I a los pocillos 1 al 6.

3-Centrifugar por 10 minutos a la velocidad indicada.

4- Leer y anotar los resultados.

Interpretación

Las muestras positivas se presentan como una línea roja en la superficie del reactivo, (4+) o

dispersadas a través del pocillo (1-3 +).





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Las muestras negativas forman un botón compacto en el fondo del pocillo.

La reacción en el tubo control debe ser negativa.

En el caso que diera positiva, la reacción en el tubo D(Rh) es invalida y debe ser repetida de la

siguiente forma:

Lavar los glóbulos rojos en solución salina tibia o solución I. Luego proceder a preparar

nuevamente la solución de trabajo al 1%.

Una reacción positiva en el tubo Coombs, indica que los glóbulos rojos de la muestra se

encuentran sensibilizados.





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IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES

Los anticuerpos irregulares detectados en pacientes previamente expuestos a antígenos externos

como en politransfundidos, embarazos y menos frecuente en donantes, deben identificarse con elobjetivo de conocer su especificidad, importancia clínica y antes de realizar la prueba cruzada.

Para esta identificación se utilizan un set de 11 células grupo O IV cada una de un solo donante,suspendidas en una solución preservante, en una concentración del 2 al 4%, con antígenos deimportancia clínica conocidos que presentan expresión de doble dosis (homocigotos), estas seutilizan para la determinación de anticuerpos irregulares clínicamente significativos.

La identificación de los anticuerpos detectados previo a la prueba cruzada tiene la finalidad deencontrar sangre compatible para el paciente que la necesita, por lo tanto negativa para elantígeno correspondiente al anticuerpo encontrado.

Es de importancia clínica la investigación de estos anticuerpos en reacciones postransfusionales(causen hemólisis), enfermedad hemolítica del recién nacido (atraviesen placenta) o anemiahemolítica autoinmune, estos anticuerpos son en su mayoría anticuerpos IgG que reaccionan a37°C y en antiglobulina humana.

La técnica se realiza entre el suero en estudio y el panel o set de células (glóbulos rojos) conantígenos conocidos además del medio y temperatura adecuada.

Reactivos:

Panel de GR (DE 11, 12 o 16 células)

Plasma o suero del paciente o donantePBSSuero de CoombsCélulas control de Coombs

Técnica en tubo

1. Rotular los tubos para cada una célula a usar (11), Se puede incluir una prueba autólogacomo tubo número 12.

2. Poner 2 a 3 gotas de suero o plasma a ser evaluado en cada uno de los tubos.3. Agregar una gota de la suspensión globular en los tubos correspondientes, en la prueba

autóloga, agregar una gota de glóbulos del paciente o donante al 2- 4%, resuspendidas enPBS o en su propio suero.4. Mezclar los tubos y centrifugar según condiciones estandarizadas5. Leer los tubos en busca de aglutinación o hemólisis sobre la fuente de luz. Registrar

resultados positivos.6. Incubar los tubos por 45 a 60 minutos a 37° C.





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7. Centrifugar. Leer los tubos en busca de aglutinación o hemólisis sobre la fuente de luz.Registrar resultados positivos.

8. Lavar los tubos cuatro veces con PBS. En el último lavado luego de botar el PBS, secar lostubos sobre un papel absorbente, a fin de dejar el botón de glóbulos seco en el fondo deltubo.

9. Agregar dos gotas de suero de Coombs a cada tubo. Mezclar.10. Centrifugar los tubos y leer.

Interpretación:

Ausencia de aglutinación en todos los tubos indica que no se encuentra antígeno para elanticuerpo.

Presencia de antígenos para el anticuerpo, estos se deben comparar con la tabla deantigenicidad que proporciona el kit.

Control de calidad

Se utilizan las células control de Coombs para validar los resultados con AGH negativos.





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CALCULO DE PROBABILIDAD MÉTODO EXACTO DE FISHER

Compara el número de resultados positivos y negativos con el número de células que expresan o

carecen de los antígenos correspondientes.El valor de p de 0,05 es el máximo aceptado para que la interpretación se considere

estadísticamente valida, por lo tanto habría un 95% de posibilidades de que la interpretación de

los datos sea correcta.

Interpretación Resultados Antígeno Presente Antígeno Ausente TOTAL

Positivo A B A+B

Negativo C D C+D

TOTAL A+C B+D N

A=Número de reacciones positivas con células que poseen el Ag

B= Número de reacciones positivas con células que carecen el Ag

C= Número de reacciones negativa con células que poseen el Ag

D= Número de reacciones negativa con células que carecen el Ag

Luego p:

P: (A+B)! x (C+D)! x (A+C)! x (B+D)!

N! x A! x B! x C! x D!





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TITULACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES

La titulación de anticuerpos es un método semicuantitativo usado para determinar la

concentración de anticuerpos en muestras de suero o comparar la intensidad de la expresiónantigénica en distintas muestras de glóbulos rojos.

Durante el embarazo, la titulación de anticuerpos se realiza para identificar a las mujeres conniveles significativos de anticuerpos que podrían provocar una EHRN.

En este caso es importante no utilizar técnicas potenciadoras como albúmina, PEG, LISS o glóbulosrojos tratados con enzimas, porque podrían observarse títulos falsamente elevados.

Para la titulación de anti-D usar glóbulos rojos R2/R2 para evitar efectos de posición.

Aplicaciones:

1. Madres embarazadas alo inmunizadas.2. Estudio de Auto anticuerpos.3. Estudio de anticuerpos con alto título y baja avidez.4. Evaluar el efecto de reactivos sulfhidrilos usados en el reconocimiento de

inmunoglobulinas.

Muestras: suero a titular.

Reactivos y Materiales:

1. Glóbulos rojos que expresan los antígenos correspondientes a los anticuerpos enestudio, en suspensión al 2% - 5% en solución salina.

2. Solución salina.3. Tubos de vidrio de 10x75 mm.4. Pipetas de 0,1 – 0,5 ml.5. Suero de antiglobulina humana.

Procedimiento

1. Rotular 10 tubos de acuerdo con la dilución del suero 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512.2. Colocar 1 volumen de solución salina en todos los tubos (se recomienda usar

volúmenes de 0,5 ml para evitar errores causados por la inexactitud de lasmediciones).3. Agregar al tubo marcado como 2 un volumen de suero igual al agregado de solución

salina ya adicionado.4. Con una pipeta limpia, mezclar varias veces cuidando de no hacer burbujas el

contenido de la dilución 1 en 2 y transferir 1 volumen al tubo siguiente (dilución 1 en4).





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5. Repetir el paso anterior para todas las diluciones, cuidando de usar una pipeta limpiapara mezclar y transferir cada dilución. Retirar 1 volumen de suero diluido del tubofinal y guardarlo para diluciones siguientes.

6. Marcar 10 tubos de 10x75 mm, para las diluciones apropiadas.7. Usando pipetas individuales para cada dilución, transferir 2 gotas de suero a cada uno

de los tubos del paso 6 y agregar 1 gota de la suspensión de glóbulos rojos. Se puedeocupar la misma pipeta si se comienza del tubo más diluido al más concentrado.

8. Mezclar bien e incubar según la técnica empleada para la detección e identificacióndel anticuerpo en estudio.

9. Examinar los resultados y registrar las reacciones. Se recomienda comenzar desde eltubo más diluido.

Interpretación

1. Observar la dilución más alta que produce aglutinación macroscópica de 1+.2. En los estudios comparativos la diferencia significativa en los títulos es de tres o más

diluciones.

Observaciones

1. En el caso de madres sensibilizadas con especificidad anti-D se deben utilizar glóbulosrojos con fenotipo R2R2, al igual que para cualquier antígeno que presente efecto dedosis se deben enfrentar glóbulos rojos con antígeno en doble dosis.

2. Para cada control de título se debe hacer en paralelo con la muestra de controlanterior y se debe realizar una nueva identificación para cada control.

3. En los estudios con anticuerpos dirigidos contra antígenos de baja incidencia,4. considerar el empleo de glóbulos rojos paternos.

No usar técnicas potenciadoras (como PEG y medios de baja fuerza iónica LISS) o glóbulos rojostratados con enzima porque podrían obtenerse títulos elevados.





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ESTUDIO DE MUESTRAS CON TEST DE ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTAPOSITIVA

El estudio de muestras con PAD +, se emplea para determinar la existencia de glóbulos rojosrecubiertos con anticuerpos IgG y/o complemento in vivo.

Sin embargo la presencia tanto de IgG o C3 en glóbulos rojos no significa necesariamente que esosglóbulos rojos se destruyen in vivo, se debe buscar evidencia adicional, como presencia deanemia.

Se utiliza la AGH poliespecífica que reaccione tanto con IgG como C3 presentes en los glóbulosrojos.

Si la PAD es + se podría utilizar y repetirse con reactivos anti IgG y anti C3 por separado.

Causas de pruebas de Coombs directas positivas

Enfermedad hemolítica del recién nacido

En esta patología se puede observar una prueba de Coombs Directa positiva, debido a que eleritrocito del recién nacido está recubierto por los anticuerpos maternos que se unen a losantígenos complementarios presentes en la membrana del glóbulo rojo.

Anemia hemolítica autoinmune por anticuerpos calientes y Lupus eritematoso sistémico

El Coombs Directo resulta positivo debido a que el paciente genera una respuesta inmune contrasus propios antígenos, por lo que sus anticuerpos se unen a estos y atacan sus propias células conel fin de hemolizarlas.

Transfusión previa incompatible con hemólisis extravascular

Si previamente el receptor estaba sensibilizado contra algún anticuerpo irregular o fuetransfundido con un plasma incompatible (grupo O a otro grupo sanguíneo o donante conanticuerpo irregular), genera una hemólisis extravascular, por lo que la prueba de Coombs Directoresultaría positiva.

Medicamentos e infecciones

Algunos medicamentos tales como el antihipertensivo alfa-metildopa, penicilina, cefalotina, oinfecciones virales pueden causar Coombs Directo positivo, lo importante en estos casos es saberdeterminarlo, esto puede ser a través de la ficha clínica del paciente y/o la comunicación con elmédico tratante.





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Metildopa induce la formación de autoanticuerpos mediante su efecto inhibidor sobre las célulasT suprimiendo estas la producción de anticuerpos por las células B. la mayor parte de estospacientes no presentan hemólisis pero si una PAD +.

Síndrome de Crioaglutininas

Las Crioaglutininas son anticuerpos inespecíficos que generalmente se pueden visualizar atemperatura de 4ºC, generalmente sin relevancia clínica pero que es necesario estudiarlas ydemostrar su inocuidad. Una crioaglutinina puede estar enmascarando un anticuerpoclínicamente significativo (Aloanticuerpo; alo de griego Allo=otro) o estar relacionado con algunapatología como por ejemplo Síndrome de aglutininas frias, que se da en pacientes conenfermedades lifoproliferativas, mononucleosis infecciosa, o neumonía atípica por Mycoplasma pneumoniae, Hemoglobinuria paroxística por frío o Síndrome de Donath-Landsteiner,hemoglobinuria paroxística nocturna pueden desarrollar anticuerpos IgM debido a cierta similitudantigénica frecuentemente contra el antígeno I (antígeno i grande) del glóbulo rojo generando unfenómeno autoinmune lo que se refleja en la producción de autoanticuerpos fríos dirigidos en

contra del huésped, por tanto hay una relación directa entre el título del anticuerpo y la severidaddel cuadro clínico de Neumonía.

Estudio serológico para evaluar la PAD +

- Analizar con anti IgG y anti C3d para determinar qué tipo de proteínas recubren los glóbulosrojos.- Analizar suero/plasma para detectar e identificar anticuerpos contra antígenos eritrocitariossignificativos.- Examinar el eluato preparado a partir de los glóbulos rojos recubiertos. Este se examina con unabatería de células reactivas, para determinar si son aloanticuerpos (reacción transfusional o EHRN)

o fracciones del complemento en donde los eluatos no son reactivos.

Para facilitar los resultados de las pruebas, se debe revisar la historia clínica, eldiagnóstico, antecedentes terapéuticos, gestacionales y transfusiones recientes del paciente.

Además complementar con los resultados de laboratorio: Hematocrito, bilirrubina,haptoglobina y recuento de reticulocitos.

Observar destrucción eritrocitaria: reticulositosis, hemoglobinemia, hemoglobinuria,disminución de la haptoglobina sérica, elevación de la lactato deshidrogenada, además pacientese observa anémico.Averiguar si el paciente fue transfundido en fecha reciente: La fijación de anticuerpos en losglóbulos rojos, puede ser indicador de una respuesta inmunológica en desarrollo. En lainmunización primaria los anticuerpos podrían aparecer ya a los 7-10 días de la transfusión y en la

secundaria a los 2-7 días.

Elución:Libera los anticuerpos de los eritrocitos sensibilizados y los recupera en forma utilizable.

Cuando no se conoce la causa de TCD se puede preparar eluido y probarlo contra un panel deeritrocitos.





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Por lo general se puede detectar la misma especificidad en el suero del paciente. Cuandoel eluído reacciona con todas las células del panel la explicación más probable es la de unautoanticuerpo.

Cuando no hay presentes anticuerpos irregulares en el suero y el paciente no ha sidotransfundido recientemente no es necesaria otra prueba serológica para la detección de unautoanticuerpo aislado

Criterios para diagnosticar AHAI

- Evidencia serológica de un autoanticuerpo:TCD positivoAutocontrol positivoIdentificación de un autoanticuerpo en el eluato y suero.

- Evidencia clínica o de laboratorio de Hemólisis

Investigación de autoanticuerpos AHAI

Suero debe ser separado a 37ºC; para permitir la cuidadosa evaluación de la amplitud térmica ytitulación de cualquier autoanticuerpo frío presente. Esto permite evitar la absorción deanticuerpo frío por los GR.

EDTA inhibe la activación de complemento in vitro, por lo tanto cualquier componente delcomplemento detectado será debido a activación in vivo

Test en eluatos de GR AHAI

-Para dilucidar la causa de un TCD positivo.

-Permiten conocer la clase de Inmunoglobulina presente-Si no se encuentra anticuerpo en el eluato se puede deber a:Drogas como PenicilinaPacientes con grandes cantidades de complejos inmunes

-Se pueden encontrar aloanticuerpos que simulen un autoanticuerpo: EHRN, RHT

Problemas serologicos que plantean los autoanticuerpos:

- Si hay presencia de aglutininas frías lavar con PBS calentado las células y hacer clasificación ABOy Rh a 37°C. Mantener la muestra a 37° C. Usar control paralelo de albúmina al 6 % en soluciónsalina para verificar si continua la autoaglutinación. Para la prueba inversa hacer control autólogo

- Si se emplea soluciones de Albúmina bovina o enzimas proteolíticas los GR sensibilizados puedenaglutinar espontáneamente. Lavar previamente en PBS

- Como las crioaglutininas casi siempre son IgM, tratar los glóbulos rojos con reactivossulfidrilos DTT o ZZAP.





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TÉCNICA DE AUTOADSORCIÓN DE ANTICUERPOS CALIENTES

Principio

La técnica de autoadsorción se realiza a pacientes en los que existe la presencia deautoanticuerpos. Esto generalmente es solicitado cuando un paciente necesita transfusión.

El Suero del paciente es puesto en contacto con glóbulos autólogos tratados, que permiten retirarel autoanticuerpo de su suero, para así probarlo y eventualmente descartar aloanticuerpos.Existen dos técnicas para realizar la autoadsorción, una usando ZZAP y otra usando PEG, las quepueden usarse indistintamente dependiendo de la disponibilidad de muestra del paciente yurgencia de la transfusión.

Esta autoadsorción se hace más efectiva, si se retiran primero los autoanticuerpos, se tratan lascélulas con enzimas, se dejan los sitios antigénicos libres para que se unan los autoanticuerposlibres del suero y así retirarse los aloanticuerpos del mismo. La autoadsorción no debe realizarseen pacientes que han sido recientemente transfundidos, ya que los eritrocitos transfundidoscirculantes, pueden adsorber los aloanticuerpos libres.

Materiales y Reactivos

- Muestra de sangre total con EDTA- Células de Screening I y II R1R1, R2R2 - Tubos de Khan, gradilla para tubos.

- PBS.- Suero Antinmunoglobulina humana o suero de Coombs.- Glóbulos rojos sensibilizados (Control Positivo).- Baño de incubación a 37°C.- Centrífuga inmunohematológica.- Timer.- Lápiz Marcador.- Papel Absorbente.- Fuente de Luminosa- Papaína al 1% (activada con cisteína), almacenada a -18ºC.- DTT stock 0.2 M, almacenado a -18ºC.-

Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.3.- Gamma PEG (Gamma Biologicals INC).

ZZAP: Reactivo preparado con papaína y DTT (Dithiothreitol), que permite “limpiar” la superficie

de los glóbulos rojos a usar para la adsorción.PEG: Polímero soluble en agua usado como potenciador de reacción antígeno-anticuerpo.





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Metodología

AUTOADSORCION CON ZZAP

Modificación de los glóbulos rojos con reactivo ZZAP

Preparación del reactivo ZZAP. Para 1 ml de ZZAP preparar:0,5 ml de DTT stock 0.2 M.0,1 ml de papaína stock 1%0,4 ml de PBS.

Tratamiento de los Hematíes:

Centrifugar los glóbulos rojos autólogos con TAD positivo del paciente o glóbulos rojoscontrol (+); remover el plasma de tal manera de dejar el concentrado de glóbulos rojos, nose requiere lavar.

Mezclar un volumen de GR concentrados (según disponibilidad de muestra) más 2volúmenes de ZZAP. Ej.

0,5 ml de GR autólogos con TAD +, y otro tubo control GR sensibilizados

Incubar 30min a 37º C. Mezclar por inversión cada 15 minutos durante la incubación.

Terminada la incubación, lavar 4 veces con abundante PBS (llenar hasta ¾ del tubo deKhan) mediante el uso de la centrifuga inmunohematológica.

En el último lavado, centrifugar 3 minutos en vez de 1 minuto en High para dejar bienconcentrados los glóbulos rojos tratados.

Realizar un TAD a los glóbulos rojos tratados para verificar que la cantidad de IgG unidahaya disminuido (verificado en intensidades de cruces)

Adsorción:

a. Agregar a razón de 1 /2 un volumen del suero paciente que se va a adsorber con dos

volúmenes de GR modificados y tratados con ZZAP concentrados.b. Incubar 15 minutos a 37ºC.c. Centrifugar y extraer el suero autoadsobido.d. Con el suero autoadsorbido hacer un TAI con células I y II, el cual debería ser

Negativo, si no lo es, repetir la autoadsorción usando una nueva alícuota de GRtratados con ZZAP.





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AUTOADSORCION CON PEG

Mezclar

0.5 ml de plasma a autoadsorber0.5 ml de glóbulos rojos concentrados (no es necesario lavar los glóbulos)0.5 ml de PEG

Incubar 15 minutos a 37ºC.

Centrifugar 7 minutos a 1.200 rpm en centrífuga inmunohematológicaSeparar el plasma autoadsorbido.

Hacer un TAI al suero autoadsorbido para lo cual colocar4 gotas de plasma autoadsorbido con 1 gota de células I , TUBO I y4 gotas de plasma autoadsorbido con 1 gota de células II , TUBO II

Incubar 15 minutos a 37ºC.

Luego de la incubación, lavar 4 veces con PBS, en el último lavado no olvidar secar bien con tuboinvertido sobre toalla nova.

Agregar dos gotas de anti IgG (suero anti-Inmunoglobulina humana monoespecífico), tenercuidado de NO usar suero anti-Inmunoglobulina humana poliespecífico ya que la presencia de

anti-Complemento genera falsos positivos.

Si este resultado es negativo, guardar el resto de plasma autoadsorbido para realizar pruebas decompatibilidad, usar la misma relación anterior, es decir, 4 gotas de plasma autoadsorbido + 1gota de los glóbulos a transfundir, incubar 15 minutos a 37ºC, lavar 4 veces con PBS,resuspenderlos en PBS a una concentración del 4% y finalmente agregar dos gotas de anti IgG(suero anti-Inmunoglobulina humana monoespecífico)

Si el resultado es positivo, se debe repetir la autoadsorción del plasma con un nuevo volumen deGR concentrados, no se requiere agregar PEG de nuevo.





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TÉCNICA DE ELUCIÓN ÁCIDA

El Término elución ácida consiste en alterar las fuerzas de unión no covalente entre los complejosantigenos anticuerpos, mediante la modificación del Ph liberando los anticuerpos de los glóbulosrojos sensibilizados y permite recuperarlos.Esta técnica es usada para la investigación de hemólisis producida por auto y/o aloanticuerposcalientes. También usada para la fenotipificación de eritrocitos cubiertos con IgG en AHAI poranticuerpos calientes.

MuestraGlóbulos rojos concentrados PAD positiva

ReactivosSolución de elución: Ácido cítrico, fosfato de potasio monobásico y solución salina cuyo pH es de2,7Solución neutralizante: Buffer Tris pH 9,5, su función es neutralizar la acidez en el eluido.Sobrenadante salino: salino del lavado final de los glóbulos rojos en estudio.

Técnica1. Lavar 4 veces 1 ml de glóbulos rojos concentrados PAD + con PBS.2. Guardar el último sobrenadante del lavado para utilizarlo posteriormente como control

negativo al realizar la identificación del anticuerpo.

3. Agregar 1 ml de la solución de elución. Mezclar por inversión 5 a 6 veces. Dejar atemperatura ambiente por 1,5 a 2 minutos.

4. Centrifugar de acuerdo al tiempo de lavado estandarizado. Remover el eluídosobrenadante, colocarlo en un tubo kahn previamente rotulado que contenga la cantidadde solución neutralizante necesaria para que el pH del eluído quede entre 6,8 y 7,2. Estodepende de la cantidad de eluído obtenido, es decir por cada ml de eluído, son 200microlitros de sol. neutralizante.

5. Mezclar por inversión varias veces y centrifugar para remover algún precipitado que sepudo haber formado después de la neutralización. Traspasar el eluído neutralizado a untubo kahn limpio, previamente rotulado.

6. Realizar la identificación del anticuerpo del eluído, sin dejar de incluir como control

negativo un test de Coombs indirecto con el sobrenadante del último lavado reservadopreviamente.







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Determinación de crioaglutininas

Para este análisis se requiere que la muestra sea extraída y puesta inmediatamente en un baño a37ºC.

1. Marcar 3 tubos, I, II y PA.2. Agregar 0.1 ml de suero del paciente a cada uno.3. Agregar a cada uno de estos tubos 0.05 ml de glóbulos correspondientes, es decir,

screening cells I y II y glóbulos autólogos.4. Incubar los tubos por 1 hora a 4°C5. Leer los tubos sin centrifugarlos previamente, en busca de aglutinación o hemólisis sobre

la fuente de luz.

Interpretación

Si no hay reacción en ningún tubo luego de 60 minutos a 4ºC, el resultado es negativo.

Si existe aglutinación en los tubos de células I, II o ambos y no en el tubo antólogo, noestamos en presencia de crioaglutininas, sino de un aloanticuerpo frío.

Si aglutinan los tres tubos por igual, estamos en presencia de crioaglutininas.Si va desde +/- hasta ++ en los tres tubos, se informa como débilmente positivas, sin

realizar título.Si va de +++ o mayor, se realiza título para lo cual se debe marcar 11 tubos con las

diluciones a realizar para titular. (1/2,1/4,…….,1/2048).





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Títul o de crio aglu tin inas

Procedimiento

1. Marcar 3 tubos, I, II y PA.

2. Agregar 0.1 ml de suero a cada tubo.

3. Agregar a cada uno de estos tubos 0.05 ml de glóbulos rojos de células de screening I y II y

glóbulos autólogos.

4. Mezclar los tubos por agitación lateral.

5. Incubar los tubos por 60 Minutos a 4°C. Una vez terminada la incubación.

6. Leer los tubos sin centrifugarlos previamente, en busca de aglutinación o hemólisis sobre lafuente de luz, anotar y registrar sus resultados. De no haber reacción en ningún tubo, el resultado

es negativo.

7. Si existe aglutinación en los tubos de células I,II o ambos y no en el tubo autólogo, no estamos

en presencia de crioaglutininas, sino de un aloanticuerpo frío.

8. Si aglutinan los tres tubos por igual, estamos en presencia de crioaglutininas.

9. Si la aglutinación es desde +/- hasta ++ en los tres tubos, se informa como débilmente

positivas, sin realizar título.

10. Si la intensidad de aglutinación es de +++ o mayor, se realiza título para lo cual se debe marcar

11 tubos con las diluciones a realizar para titular. (1/2,1/4,…….,1/2048).

11. Colocar a cada uno de los tubos 0.1 ml de PBS.

12. Agregar al primer tubo de dilución (1/2) 0.1 ml de suero a investigar.

13. Mezclar por agitación manual y tomar 0.1 ml de la mezcla. Transferir estos 0.1 ml al tubo con

PBS de la dilución siguiente (1/4). Realizar esto hasta el último tubo de la serie.

14. Preparar como primer tubo de la serie el tubo sin diluir, marcarlo como 1 y agregar 0.1 ml de

suero a analizar.

15. Agregar a cada uno de los tubos 0.05 ml de glóbulos rojos, escoger screening cells I o II en la

cual la aglutinación en el paso anterior haya sido más alta.

16. Mezclar los tubos por agitación lateral.





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17. Incubar los tubos por 60 Minutos a 4°C en BSUI-R1.

18. Leer los tubos sin centrifugarlos previamente, agitándolos en busca de aglutinación o

hemólisis sobre la fuente de luz, desde el tubo de la dilución mayor al menor.

Registrar el tubo de mayor dilución donde se observa aglutinación.

El informe se hace según el siguiente ejemplo:

Crioaglutininas positivas +++ (aquí colocar la intensidad mayor)

Título: positivo a dilución 1/256. (aquí colocar la mayor dilución a la que se observó aglutinación).

Anotar en el libro de exámenes especiales el resultado obtenido.

Informar en el sistema SILC y revisar en conjunto a la auxiliar de turno.

Determinación de rango térmico.

Esto debe realizarse solo en caso que lo soliciten expresamente en la orden del examen. El

rango térmico incluye la incubación del set anterior de tubos correspondiente al título a

distintas temperaturas. Deben incluirse incubaciones a 4°C, 16°C, 24°C y 37°C.

La de 4ºC se realiza en el refrigerador del Banco de Sangre. La de los 16°C debe ser preparada,

tomando una caja de plumavit , y colocar allí un ice-pack que se encuentran , agregar agua de

la llave y controlar temperatura, manteniéndola a 16°C por 1 hora. La incubación a 24°C se

hace en el plaquetario y la de los 37°C en el baño termoregulador. La lectura de resultados

debe hacerse de la misma forma y el informe también, es decir en positividad de la reacción y

el título, para las distintas temperaturas.





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ESTANDARIZACIÓN DEL LISS

INTRODUCCIÓN:

El medio de baja fuerza iónica nos permite acortar el periodo de incubación de un test de Coombsindirecto o test de antiglobulina humana AGH de una hora a 15 minutos o menos.Esto debido a que disminuye el potencial zeta. Este hecho es de particular importancia en launidad de transfusiones ya que nos permite tener las pruebas cruzadas de las transfusionessolicitadas en menos de 30 minutos.

DEFINICIONES

LISS medio de baja fuerza iónica preparado en nuestro laboratorio.

PANELES DE SCREENING E IDENTIFICACIÓN kits comerciales con glóbulos rojos o células conanfígenos conocidos. Nos permiten detectar e identificar a nuestros anticuerpos controles.

ANTICUERPOS CONTROLES sueros de nuestra seroteca con anticuerpos conocidos detectados eidentificados en nuestro trabajo diario que se guardan para este fin.

CÉLULAS O GLÓBULOS ROJOS CONTROL heterocigotos para el anfígeno investigado.

CÉLULAS CONTROL AGH glóbulos rojos recubiertos con anticuerpos, se usan para control decalidad de los test de AGH.

TIEMPO ÓPTIMO tiempo mínimo que muestra una aglutinación igual o superior a la lograda alincubar durante una hora la prueba de AGH entre el suero control y las células apropiadas.

MATERIALES

- Tubos Kahn- Centrifuga y lector de Inmunohematología- Pipetas Pasteur y micro pipeta.- Baño termo regulable.- Timer.- Células o glóbulos rojos Control heterocigotos para los anfígenos investigados- Anticuerpos Controles Anti D, Anti Fya, Anti con una reacción débil

- Suero Antiglobulina Humana o Suero de Coombs- Suero AB sin anticuerpos o Coombs Indirecto negativo- Células control AGH





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ACTIVIDAD PRÁCTICA

Sacar de nuestra seroteca los anticuerpos control. Un anti D marcado débil, si no está disponibleel de más bajo título que se disponga. También un anti Duffy A o B y un anti K.

Diluya los sueros 1: 4 o 1: 3 para que la reacción al hacer un test de Coombs indirecto, la reacciónobtenida sea de una a dos cruces.

Incube durante una hora los sueros control con los anticuerpos elegidos y diluidos segúnintensidad.

Ejemplo

Anti D débil con célula del panel de identificación R1 r

Anti Fya con célula del panel screening que contengan antígenos Fya+ Fyb+

Anti Kell con célula del panel screening que contengan antígenos K+ k+

Mientras se están incubando estos Coombs indirectos lave dos veces en PBS una cantidadsuficiente (aprox. 1ml) de células control adecuadas a los anticuerpos elegidos, en el ejemploserían célula 4 del panel de identificación R1/r y célula I del screening de anticuerpos, déjelossecos esperando diluirlos al 3- 4% en el nuevo lote de LISS.

Preparar una batería de tubos marcados con los diferentes tiempos de incubación 8-10-12-15minutos, en el ejemplo seria para anti D débil, anti Fya, anti Kell y suero AB sin anticuerpos.

Una vez cumplido el tiempo de los Coombs indirectos lave y aplique la AGH. Registre losresultados para luego compararlos con los diferentes tiempos del nuevo LISS.

Repartir los sueros a los tubos según su marca en una proporción idéntica entre suero y glóbulos océlulas apropiadas, es decir tres gotas de suero para tres de glóbulos rojos. Proporción 1:1

Prepare los glóbulos que había dejado secos al 3 % en el nuevo LISS.

Comience a incubar los tiempos previamente establecidos comenzando por el mayor es decir 15minutos. Coloque tres gotitas de glóbulos apropiados a los tubos marcados D débil, Fya, Kell y ABC. Ind. Neg. Incube por 15 minutos a 37º C. Programe el timer en 15 min. Cuando el timer marque12 min. 15 segundos reparta las tres gotas de glóbulos apropiados a los tubos marcados 12minutos e incube a 37º C .Repita lo mismo para los tiempos 10 minutos, a los 10 min. 15 seg. y alos 8 min. 15 seg. para el tiempo 8 min.

Nota: Para el suero AB sin anticuerpos puede usar cualquiera de los glóbulos preparados serealiza para descartar reacciones falsas positivas de nuestro reactivo.

Al terminar los tiempos de incubación se realiza un test de AGH a todos los tubos es decir se lavan4 veces con PBS y se les agregan dos gotas de AGH a cada tubo.





83

Lea y registre los resultados cuidadosamente discriminando el grado de aglutinación en cantidadde cruces.

Valide los resultados negativos con células control AGH.

Ejemplo

MEDIO Y TIEMPO

DE REACCION

AGH COOMBS INDIRECTO

ANTI-D ANTI - Fya ANTI - K SUERO AB

LISS – 8 +/- +/- +/- -

LISS - 10 + + +/- -

LISS - 12 + ++ + -

LISS - 15 + ++ + -

AGH – 1 Hr + ++ + -

RESULTADOS

El tiempo de incubación a elegir para el nuevo lote es el que muestre una aglutinaciónigual o superior a la lograda al incubar los mismos sueros por una hora a 37 C y terminados enAGH.

El tiempo óptimo en el ejemplo es de 12 minutos. Se selecciona el tiempo menor donde lareacción es igual a la obtenida en AGH en incubación 1 hora.

MEDIO Y TIEMPODE REACCIÓN

AGH COOMBS INDIRECTO

ANTI-D ANTI - Fya ANTI - K SUERO AB

LISS – 8

LISS - 10

LISS - 12

LISS - 15

AGH – 1 Hr





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TÉCNICA DEL POLIBRENE

El Polibrene al igual que el LISS y el PEG incrementan la reactividad de los anticuerpos y abrevianla incubación.

El Polibreno es un polímero de amonio cuaternario catiónico de baja potencia iónica, que es capazde interactuar con las cargas negativas de los glóbulos rojos sensibilizados con anticuerpos delsuero y producir su agregación irreversible.

Se incuban los glóbulos rojos con suero en un medio de baja fuerza iónica que facilita la fijación delos anticuerpos y luego se añade polibreno, se centrifuga para lograr la agregación de loshematíes. Luego se resuspenden las células adicionando citrato de sodio.La aglutinación mediada por anticuerpos persistirá, pero las cedulas no recubiertas se dispersaran.Su principal utilidad es potenciar la reactividad antígeno-anticuerpo de algunos sistemas como elRh, pero no del sistema Kell.

Usos: Detección e identificación de anticuerposDeterminación de antígenos eritrocitarios.

Muestra: suero o plasma

Reactivos:Solución salina normalMedio de baja fuerza iónica o MBPI (dextrosa al 5%, EDTA disódico).Solución de trabajo: Polibreno al 0,05% de una solución madre al 10% preparando 0,5 ml de

Polibreno + 99,5 ml de suero fisiológicoSolución de resuspensión: citrato trisódico 0,2 M, dextrosa al 5%Antiglobulina Humana con Polibrene.

Técnica

1. En un tubo Khan poner 0,1 ml de suero en estudio y una gota de glóbulos rojosresuspendidos 2-5% en PBS, además agregar 0,1 ml de MBPI

2. incubar a TA por 1 minuto3. agregar 0,1 ml de Polibreno 0,05%. Mezclar y centrifugar. Eliminar sobrenadante, sin

resuspender las células.

4.

agregar 0,1 ml de solución de resuspensión5. leer muestra en estudio junto con los controles + y – 6. informar en cruces7. si desea continuar con AGH se deberá lavar 4 veces y agregarle el reactivo de Coombs.







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Técnica

1. Pesar 1 gr. de Papaína Sigma y poner en un vaso pp.

2. Pesar 0.44 gr de Cisteína Sigma y poner en el otro vaso pp.

3. Poner el gramo de papaína en el mortero y pulverizar, adicionando 50 ml de buffer sorensen.

Preparación Buffer Sorensen.

- KH2PO4 2.2 grs.- Na2HPO4 x 2 H2O 0.09 grs.- Disolver en 100 ml aprox. De agua destilada.- Ajustar pH a 5.4, y llevar a volumen final de 250 ml.- Conservar refrigerado

4. Poner sobre un embudo Papel whatman sin que queden espacios entre el papel y el embudo.Poner el embudo en un matraz de aforo de 100ml. Filtrar la mezcla sin mover.

5. Disolver los 0.44 grs de cisteína en la solución de papaína filtrada.6. Enrasar a 100 ml con buffer sorensen e incubar 60minutos a 37°C.7. Envasar en tubos Eppendorf en alícuotas de 0.5 ml.





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BANCO DE SANGRE Y MEDICINA TRANSFUSIONAL

PUNCIÓN SANGRE VENOSA EN BANCO DE SANGRE

Preparación del sitio de venupunción.

Para la adecuada elección del sitio de punción, se debe inspeccionar ambos brazos, extrayendo lasangre finalmente, de una vena de la región antecubital de gran calibre y libre de lesionescutáneas. El torniquete incrementa la prominencia venosa, también es útil que el donante abra ycierre su mano varias veces.

Para preparar la piel, se utiliza una solución antiséptica yodada para desinfectar el sitio de punción

de la vena, esta se debe secar completamente después de su aplicación o limpiar con una gasaestéril seca antes de la venopunción (revisar las recomendaciones del fabricante). El áreapreparada no se debe tocar con los dedos antes de la punción.Donantes sensibles al yodo, usar clorhexidina o Alcohol al 70%.

Preparación de las bolsas de extracción de sangre.

Para la correcta recolección de sangre, se debe utilizar bolsas de extracción aprobadas por la FDA,las cuales deben cumplir con requisitos de esterilidad y ser apirógenas.

Las bolsas deben ser inspeccionadas en busca de cualquier defecto, tener fecha vigente y

anticoagulante suficiente de aspecto claro y transparente.

Si el envoltorio exterior de las bolsas estériles llega a estar húmedo estas no se deben utilizar.

Soluciones anticoagulantes-conservantes mg

CPD CP2D CPDA-1

Relación solución/sangre 1,4 : 10 1,4 : 10 1,4 :10

Vida útil días 21 21 35

Citrato de sodio 1.660 1.660 1.660Ácido cítrico 188 188 188Dextrosa 1.610 3.220 2.010

Fosfato de sodio monobásico 140 140 140

Adenina 0 0 17,3





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Venupunción

Esta se debe realizar en una sala que sea cómoda, equipada y aireada.

Debe ser realizada por personal capacitado, mediante una venopuntura única, con aguja dediámetro de 16 G desechable y estéril. Antes de romper el sello de la aguja de extracción debeestar pinzada la tubuladura que comunica con la bolsa (ASEGURA CIRCUITO CERRADO).

Durante la extracción de la sangre es de suma importancia mezclarla con el anticoagulante(agitación mecánica o inversión manual de la bolsa).

La recolección de la sangre debe tener un flujo continuo, se puede extraer en un tiempo que varíaentre 8-10 minutos, aceptable hasta 15 minutos.

Reacciones adversas a la donación:

Si bien el procedimiento es bien tolerado por la mayoría de los donantes existe un número depersonas que reaccionan inesperadamente a la donación de sangre, por lo que es necesario estar

preparado para reconocer y atender a estos donantes. Por lo mismo se hace necesario que exista

entrenamiento en Reanimación Cardio Pulmonar (RCP) y los elementos básicos para atender un

paro cardiorrespiratorio, así como manejar la cadena de sobrevivencia de apoyo vital básico de la

institución a que pertenece el banco de sangre.





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EXAMEN FÍSICO AL DONANTE DE SANGRE

Introducción

La selección del donante de sangre debe ser de forma obligatoria y se basa en un breve

examen físico y en un historial clínico, que determina que la donación no sea perjudicial para el

donante ni el receptor (Reacciones adversas).

Examen Físico

El examen físico considera además de la impresión general el control de peso, pulso

periférico, presión arterial, temperatura y hemoglobina.

Control de Peso

Determinar peso exacto en los donantes que no sepan su peso o que al entrevistador le

revista duda el peso aparente.

Personas que pesen menos del mínimo son más propensas a experimentar efectos adversos

(mareos, debilidad) ya que la donación representa una mayor proporción de su volumen

sanguíneo.

Materiales

Pesa o balanza

Valores de referencia

Peso mínimo es 50 Kg. en mujeres y 55 Kg. en hombres, la extracción representa

aproximado el 12% del volumen sanguíneo.

Pulso Periférico

Son los latidos que experimentan las arterias producto del bombeo de la sangre realizado por el

corazón. Indica la frecuencia cardiaca, en otras palabras, el número de veces que el corazón late

por minuto.

Materiales

Reloj con segundero.


50-100 pulsaciones por minuto.





90

Presión Arterial

La presión arterial representa la presión ejercida por la sangre contra la pared de las arterias.

La presión arterial tiene dos componentes:

La presión sistólica: Se refiere al efecto de presión que ejerce la sangre eyectada del corazón

sobre la pared de los vasos.

La presión diastólica: Se refiere al efecto de distensibilidad de la pared de las arterias, es

decir el efecto de presión que ejerce la sangre sobre la pared del vaso.

La presión de pulso es la diferencia entre la presión sistólica y la diastólica.

La presión arterial varía en las personas a lo largo de las 24 horas. Los factores que influyen son las

emociones, la actividad física, la presencia de dolor, estimulantes como el café, tabaco o algunas

drogas, etc.

Materiales

Esfigmomanómetro de mercurio


Sistólica 100-160 mm Hg.

Diastólica 60-100 mm Hg.

Valores fuera de los rangos normales son causa de exclusión.

Temperatura

La temperatura axilar del donante no debe ser superior a 37° C. Temperaturas inferiores a lo

normal, no suelen ser significativas.

Valor de referencia

No mayor a 37° C





91

TÉCNICA DE DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA (Hb)

Método del Sulfato de Cobre

Principio

Este método se basa en la gravedad específica de una solución de sulfato de cobre

equivalente a la concentración de Hemoglobina de una gota de sangre analizada. La gota al caer

es encapsulada en un saco de proteinato de cobre que preserva su peso específico durante 15

segundos; durante este tiempo la gota queda en suspensión, se va al fondo o queda suspendida

en la solución, así la lectura se realiza dependiendo del límite fijado de la hemoglobina.

Materiales

Solución de CuSO4 densidad 1.053 ( Hb 12.5 gr./dl, varones)

Solución de CuSO4 densidad 1.052 ( Hb 12 gr./dl, damas)

Estas soluciones deben ser cambiadas diariamente o después de cada 25

determinaciones.

HemoCue

Celdilla capilar del HemoCue para calibrar

Metodología

El sitio de punción capilar debe limpiarse con una solución antiséptica y secarse con una

gasa o algodón limpio. La piel debe ser puncionada firmemente, a un costado del dedo en su parte

distal, con una lanceta estéril o con dispensador de lanceta. La primera gota de sangre se debe

descartar.





92

Para medir la hemoglobina, se debe desinfectar la yema de uno de los dedos del donante con

alcohol 70%.

Puncionar rápida y suavemente la yema del dedo con una lanceta estéril.

Con un algodón limpiar la primera gota de sangre. Tomar un poco de sangre en un capilar

y dejar caer una gota en un vaso con sulfato de cobre a una altura de 2 cm del líquido.

En caso de tener lector automático, encender lector y calibrar. Con otra celdilla capilar de

HemoCue tomar una gota de sangre del donante que cubriendo el círculo central del capilar o

idealmente que este quede lleno.

Colocar en el lector de hemoglobina HemoCue y cerrar. El resultado aparecerá en la pantalla en

unos segundos.





93

Interpretación en sulfato de cobre

La gota debe observarse por 15 segundos. Si la gota de sangre tiene un peso específico

más alto que la solución, se irá al fondo dentro de los 15 segundos, por el contrario, la gota se

quedara suspendida o subirá.

Interpretación en HemoCue

Hombres: > 12,5 g/dLMujeres: > 12,0 g/dL

Valores menores son causa de exclusión.





94

INSTRUCTIVO PARA LA SELECCION DE UN DONANTE DE SANGRE

1.- INTRODUCCIÓN:La seguridad de la transfusión de sangre o de sus componentes comienza con la apropiada

selección del donante. Para lograr este objetivo se dispone de una serie de preguntas (encuesta),

las que formuladas durante una entrevista, la que debe ser realizada en un ambiente privado y

que asegure la confidencialidad, permita obtener una correcta selección de los donantes.

Enfatizando que este proceso tiene como objeto la protección de la salud del donante como

también proteger la salud del receptor. La entrevista debe ser apoyada con folletos informativos

acerca de las enfermedades que se transmiten por la sangre, de la seguridad de la extracción

sanguínea, de la importancia de la donación de sangre y que entregue información que favorezca

la autoexclusión de los individuos con conducta sexual de riesgo. Es necesario ofrecer al Donante

en forma permanente un proceso seguro y controlado.

La atención que se realiza al donante, consta de una entrevista, de un pequeño examen físico y

del acto de donación de sangre, todo lo cual debe quedar registrado en un documento escrito.

El registro de la atención del donante debe tener los siguientes datos:

1. La Fecha y hora de atención

2. La identificación del donante: Contiene la información necesaria para identificar con

seguridad al donante, debiendo llenar con el máximo de precisión todos los datos.

3. Examen físico que documente el estado general del donante: Incluye peso, pulso,

presión arterial, hematocrito y/o hemoglobina y aspecto general del donante.

4. La encuesta: Comprende una serie de preguntas específicas que tienen por objeto

recoger una clara información del donante, para determinar si cumple o no con los

requisitos exigidos por el Banco de Sangre.

5. El consentimiento informado escrito del donante: Todo donante debe firmar su

consentimiento al procedimiento, y declarar que entiende las preguntas formuladas y que

la información entregada es verdadera.

6. Tipo y causa de rechazo: debe registrarse la causa del rechazo y el tipo, si el donante no

cumple con los requisitos exigidos para una donación de sangre segura.

7. Las características de la donación: debe registrarse el tipo de punción y la duración de la

donación.







96

DONACION FRUSTRA: Procedimiento que no logró ser efectivo por dificultad en acceso

venoso, dificultad en la Sangría, Reacción Adversa a la donación o por problema técnico,

incluyendo fallas en las bolsas.

Si la causa es motivada por prolongación en el tiempo de la Sangría, se le denomina donación

lenta.

UNIDAD O BOLSA FRACCIONABLE: Es toda bolsa de recolección de sangre completa, que

cumple con los requisitos de calidad volumen/peso ; aspecto ; ausencia de coágulos, etc.

susceptible de ser fraccionada mediante procedimientos específicos para cada hemocomponente.

UNIDAD O BOLSA POR AFÉRESIS : Es toda unidad o bolsa colectada mediante máquina de

aféresis, que contiene un hemocomponente programado, específico y obtenida de

donante previamente seleccionado, y susceptible de ser transfundida.

REACCION ADVERSA A LA DONACIÓN FISICA/MENTAL : Es toda Reacción negativa, que se presenta

en el donante, durante cualquier etapa del procedimiento y que puede también producirsedurante o post donación. En este último caso la relación causa efecto dependerá de la patogenia

de la Reacción Adversa.

DONANTE AUTOEXCLUIDO: Persona que acudiendo al Banco de Sangre con el fin de donar sangre

se autoexcluye sin necesidad de precisar causa en cualquier etapa.

AUTOEXCLUSION PRE DONACION: La autoexclusión ocurre en la pre selección o durante la

selección.

AUTOEXCLUSION POST DONACION: Aquél que por cualquier medio verbal - por escrito, en

documento Autoexclusión - teléfono Mail - carta correo etc. indica al centro colector que susangre o hemocomponente no debe ser ocupada para transfusión.

DONANTE PARA AUTOTRANSFUSION: Es toda persona sana o enferma, en condiciones de

someterse al procedimiento de Sangría, que dona en forma autodirigida (Donante / Receptor) y

requiere cumplir los requisitos que el centro de colección determine.





97

2.- NORMAS PARA EL LLENADO DE LA ENCUESTA:

a)

Quién: El personal profesional capacitado responsable de la sección .

b) Cómo: Preguntando al donante uno a uno los aspectos que contiene la encuesta,

recogiendo la información pertinente, teniendo presente la importancia de explicar

en términos simples cada punto y de ganar la confianza del donante para lograr

respuestas verdaderas. Dar las facilidades para la autoexclusión.

c) Cuándo: Una vez que el posible donante ha leído la información acerca de las

enfermedades de transmisión sanguínea, del procedimiento de la extracción y ha

decidido no autoexcluirse

3.- NORMAS DE SELECCION DEL DONANTE:

a) El donante será entrevistado por un profesional capacitado .

b) Se evaluará la información recogida, determinando la aceptación o rechazo del

posible donante.

c) En caso de rechazo se explicará al donante en la forma más clara y completa posible,

si la causa es definitiva o transitoria, se darán las recomendaciones pertinentes,verificando que el donante ha comprendido la situación, y se registrará

detalladamente dicha causa en la ficha del donante.

d) Si no hay motivos de rechazo, se someterá a un examen físico dirigido a revisar

especialmente las zonas de punción y a la toma de signos vitales. La piel de la zona de

venopunción en ambos brazos no debe presentar lesiones o signos que indiquen que

es adicto a drogas endovenosas. Lesiones poco importantes como Dermatitis y Sarna

serán causa de rechazo temporal.

4.- CRITERIOS DE SELECCIÓN:

1.- EDAD: - 18 a 65 años.





98

- La excepción debe ser avalada por un médico.

- Si se trata de una primera donación, la edad máxima será de 60 años.

2.- PESO: -Mínimo 50 kilos.

Los donantes que pesan 50 Kg o más, pueden donar 450+/- 45 ml de sangre ya

que tienen una volemia aproximada de 3750 ml, y por lo tanto la extracción representa más o

menos el 12% del volumen sanguíneo, es importante que las muestras para los test

pretransfusionales del donante, no deben exceder los 30 ml. La obtención de más del 15% de la

volemia en un donante de 50 Kg puede significar una mayor frecuencia de reacciones adversas.

3.- PRESION ARTERIAL: -Sistólica: 100 - 160

-Diastólica: 60 - 100

4.- PULSO: - Entre 50 y 100 pulsaciones por minuto, regular y

palpado a lo menos por 30 segundos.

5.- HEMOGLOBINA: 12.5 gr/dl en hombre

12.0 gr/dl en mujeres

6.- HEMATOCRITO: 38% en hombres

36% en mujeres





99

7.- PREGUNTAS DE LA ENCUESTA:

1.- ¿ Se siente Ud. bien hoy y goza de buena salud?

Dirigida a detectar cualquier patología o antecedentes que no estén cubiertos por laspreguntas de la encuesta y que pudieran causar daño ya sea al donante o al receptor. Eldonante debe tener un aspecto saludable, sin síntomas o signos de intoxicación poralcohol o drogas. Donantes bajo la influencia del alcohol, deben rechazarsetransitoriamente hasta cumplir 12 horas sin ingesta de alcohol, debido a quegeneralmente no es posible obtener antecedentes clínicos fidedignos, la donación ademáspuede ser dañina para el propio donante.Preguntar sobre antecedentes de alcoholismo crónico, daño hepático crónico,

hemorragias digestivas etc. Si existen estos antecedentes, rechazar en forma definitiva aldonante.Una pequeña cantidad de alcohol ingerida recientemente, en especial durante lascomidas, no es causa de rechazo ya que en ese caso no existe riesgo para donante nireceptor.

Pregunta adicional:

a.- Ayuno de más de 6 horas, en cuyo caso debe rechazarse temporalmente al donante

hasta que ingiera algún alimento.

2.- ¿Ha donado sangre alguna vez, cuando, donde?:

Dirigida a tener antecedentes sobre el lugar, fecha, de donaciones previas, con el objeto

de proteger tanto al donante como al receptor.

SI: Se acepta solo si su donación fue hace más de 3 meses. Si tiene acceso a

antecedentes previos del donante, estos deben estar de acuerdo con los

requisitos de cualquier donante.

NO: Se acepta.





100

3.- ¿Ha sido rechazado alguna vez como donante de sangre? ¿por qué?

Dirigida a conocer alguna causa temporal o definitiva que lo inhabilite como donante.

Enfatizar acerca del conocimiento de resultados alterados de exámenes realizados a su

sangre. Rechazar todo donante con antecedentes de exámenes positivos para : Hepatitis,

Chagas, Sida, HTLV-I. En caso de Sífilis dependerá si hubo tratamiento, aceptándolo si existió

y fue dado de alta hace un año por lo menos.

Evaluar si el rechazo anterior fue por una causa definitiva o transitoria, en este último

caso, el donante se acepta si el plazo determinado se ha cumplido.

SI: Preguntar la causa y verificar si es causal o no de rechazo.

NO: Se acepta como donante.

4.- ¿Tuvo algún problema con la donación?:

Dirigida a detectar alteraciones o problemas en donaciones previas. Debe quedar

registrada las características de la reacción adversa a la donación.

SI: Debe rechazarse todo aquel que haya presentado complicaciones mayores como

vómitos, palpitaciones, desmayo, etc.


5.- ¿Ha consultado por problemas de salud en los últimos 12 meses?:

Dirigida a detectar patologías que lo inhabiliten como donante.

a) Enfermedades Cardiovasculares: Se rechazan: Cardiopatías con insuficiencia cardíaca,

Enfermedad reumática en tratamiento y Enfermedad coronaria (angina, infarto), por laposibilidad de una nueva crisis.

b) Diabetes: Se rechaza quienes están bajo tratamiento con medicamentos normoglicemiantes.

Se aceptan los que controlan su diabetes sólo con régimen.





101

c) Hipertensión: Se rechaza aquellos que estén en tratamiento. En caso de detectar valores de

presión fuera de los rangos establecidos, se debe esperar 15 minutos y volver a tomar la

presión con el donante acostado.

d) Enfermedades Gastrointestinales: Se rechaza las diarreas agudas o crónicas reactivadas. Se

aceptan donantes con antecedentes de úlcera péptica asintomáticos y sin tratamientos. Otraspatologías como pólipos rectales o hemorroides, pueden ser aceptados como donantes si en

el momento del interrogatorio están asintomáticos y sin tratamiento médico.

e) Enfermedades Respiratorias: Se rechaza las enfermedades broncopulmonares activas,

Tuberculosis activa. Cuadros respiratorios agudos se rechazan hasta su curación.

Se acepta a las personas que han padecido tuberculosis y que después de 1 año de haber

cumplido el tratamiento y dado de alta. Resfríos activos se rechazan transitoriamente.

f) Cáncer: Se rechaza. Se aceptará solo con autorización médica, después de 5 años sin tratamiento.

g) Enfermedades Hematológicas: Se rechaza si ha presentado anemia crónica o enfermedades

oncohematológicas como Linfomas, Leucemia, etc.

h) Enfermedades Inmunológicas no alérgicas: Se rechaza en forma definitiva a quienes presenten

enfermedades tales como: Lupus Eritematoso Sistémico, Artritis Reumatoídea, Enfermedad

Mixta del Tejido Conectivo, Esclerodermia.

i) Enfermedades Endocrinológicas: Se rechaza en forma definitiva como donante a las personas

que sufran endocrinopatías activas y las que han recibido hormona del crecimiento de origen

humano.

j) Enfermedades Hepáticas: Hepatitis ver pregunta Nº 15

Se rechaza en forma definitiva a quienes sufran Hepatopatías (cirrosis hepática).

k) Malaria: Se rechaza por un período de 3 años a quienes hayan sufrido de Malaria, tomado drogas

antimaláricas, o quienes han vivido en países endémicos.

l) Piel: Se rechaza a quienes presenten lesiones en la piel especialmente en las áreas de punción

venosa o vecinas. Lesiones poco importantes como dermatitis y sarna serán causa de rechazo

temporal.

m) Enfermedades Renales: Se rechaza personas con enfermedades crónicas. Se rechazan por 2meses las pielonefritis aguda. No se rechaza personas con antecedentes de cálculos renales

(Litiasis).

n) Retraso mental: Se rechaza en forma definitiva por no tener discriminación y por pertenecer a

grupo de riesgo de enfermedades de transmisión sexual.





102

o) Sífilis y Gonorrea: Se rechaza por un período de 12 meses, ya que pudieran asociarse con

transmisión de VIH.

6.- ¿Ha sido sometido a operaciones en los últimos 12 meses?

NO: Acepte al donante

SI: Se rechaza toda cirugía por 12 meses.

Se acepta solamente cirugía menor localizada a nivel de piel.

7.- ¿Ha recibido transfusiones en los últimos 12 meses?

NO: Acepte al donante.

SI: Se rechaza hasta cumplir 12 meses desde el momento de la transfusión. Consultar

la causa de la transfusión y registrarla en la hoja de encuesta, sección observaciones.

8.-¿Ha tenido sangramiento dentario, digestivo, y/o ginecológico?


SI: Consultar causa, frecuencia y temporalidad. Se rechaza si es frecuente, importante y

activo.

9.-¿Ha tenido convulsiones, desmayos o sufre de epilepsia?

Dirigido a detectar personas que hayan sufrido desmayos frente a estímulos banales

(stress, extracción de sangre, etc.), durante su vida adulta, o que estén en tratamiento por

epilepsia.






103

SI: Se rechaza si ha presentado desmayos frente a estímulos banales (stress,extracción de sangre, etc.).

Se acepta si ha cumplido 3 años sin tratamiento para la epilepsia.

10.- ¿ Ha tomado aspirina o antinflamatorios en los últimos 3 días?

La aspirina y productos que la contengan (Ewin, Mejoral, Gluspirin, Cafiaspirina,

Cardioaspirina etc.), inhiben la actividad plaquetaria durante 1 a 3 días. La sangre de

donantes que estén ingiriendo estos medicamentos hasta 3 días antes de la donación, no

debe ser utilizada para preparar concentrados plaquetarios. Lo mismo se aplica para

aquellos que tomaron Piroxicam o similares.(antinflamatorio)

SI: Se acepta como donante, rotulando la bolsa "NO PREPARAR PLAQUETAS".


11.- ¿Ha tomado algún medicamento en el último tiempo? ¿Cuál?

En general los medicamentos que toma un donante no son perjudiciales para el receptor.

Pueden ser aceptados como donantes la mayoría de las personas que toman

medicamentos, incluso los que lo hacen por indicación médica.

Normalmente el rechazo debido a la ingesta de algún medicamento no se debe a las

propiedades de este sino a las características de la enfermedad que justifica su

administración. Debe quedar registrado el medicamento que tomó el donante y cuando.


SI: Preguntar cual y en que dosis.

No son causa de rechazo: Anticonceptivos orales, analgésicos comunes, vitaminas,

sustitutos hormonales y pastillas para adelgazar.

La aspirina y productos que la contengan (Ewin, Mejoral, Gluspirin, Cardioaspirina etc.),

inhiben la actividad plaquetaria durante 1 a 3 días. La sangre de donantes que estén

ingiriendo estos medicamentos hasta 5 días antes de la donación, no debe ser utilizada

para preparar concentrados plaquetarios. Lo mismo se aplica para aquellos que tomaron

Piroxicam.

Se rechazan personas con antecedentes de ingestión reciente (1 semana atrás) o actual de

los siguientes medicamentos:





104

Antibióticos

Antihistamínicos

Corticoides

Neurolépticos (Antipsicóticos y tranquilizantes mayores)

Antiepilépticos - anticonvulsivantes.

12.- ¿Tiene alguna enfermedad crónica?



SI: Analizar si es o no causal de rechazo, en caso positivo, explicarle que nunca debe

donar sangre y por qué.

13.- ¿Ha sufrido perdida inexplicable de peso?

El peso es el parámetro biomédico de gran importancia. En el adulto tiende a mantenerse

estable en el tiempo. La ganancia de peso por sobre los valores normales para estatura y

sexo se definen como obesidad.

La pérdida de peso inexplicada (4 - 5 kg y más en los últimos meses sin causa aparente)

puede constituir un elemento de juicio médico indicador de enfermedad crónica como:

cáncer, SIDA, TBC, hipertiroidismo, anorexia psicógena, etc. Por lo tanto, constituye

motivo de rechazo como donante de sangre. Hace excepción la baja de peso motivada por

régimen, asistida por médico.


SI: Analizar si es o no causal de rechazo, en caso positivo, explicarle las razones, y

sugerirle que consulte un médico

14.- ¿ Ha tenido diarrea en los últimos 10 días?





105

La diarrea es a menudo, un signo de infección del aparato digestivo, especialmente de su

segmento intestinal. En este caso puede ser motivado por bacterias, virus, parásitos,

hongos. Como estas infecciones pueden traspasar la barrera intestinal y pasar a la sangre

constituyendo "bacteremias", "viremias". Al momento de la entrevista, al no poder hacer

diagnóstico diferencial, con aquellas infecciones que no lo hacen, ni tampoco con diarreas

de causa no infecciosa (como la secundaria a colon irritable) se debe rechazar comodonante.


SI: Se rechaza en forma transitoria hasta que cumpla 10 días del último episodio.Sugerirle que consulte un médico

15.- .- ¿Ha recibido hormona de crecimiento de origen humano?

Esta pregunta está enfocada a prevenir la transmisión de la enfermedad de Creutzfeldt-

Jacob, una alteración rara, degenerativa y fatal del sistema nervioso. No se ha demostrado

aún la transmisión de la enfermedad por la transfusión sanguínea, sin embargo, no hay test

para detectar la enfermedad, por lo tanto, se recomienda que no donen sangre aquellas

personas que han recibido hormona del crecimiento de origen humano, Hormona Pituitaria

de origen humano o injertos de duramadre o quienes tienen algún familiar que padezca de la

enfermedad de Creutzfeldt-Jacob.


SI: Se rechaza en forma definitiva si la hormona recibida es de origen humano o con

historial familiar de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jacob.

16.- ¿Ha viajado fuera del país en los últimos 3 años? ¿Dónde?

Esta pregunta está enfocada a prevenir la transmisión de enfermedades parasitarias yotras tales como la malaria, Babeiosis, y otras infecciones como el Dengue. Las personas

deben detallar su estadía en las zonas endémicas para ser diferidas temporal odefinitivamente. La Historia de Babesiosis, Dengue es causal de rechazo definitivo.

NO: Se acepta como donanteSI: Se evalúa la condición de diferido o rechazado.





106

Para la malaria , se recomienda que aquellos que la han tenido, deben ser diferidos portres años desde que se vuelven asintomáticos, diferir por un año a aquellos que hanestado en alguna zona endémica para malaria (ver anexo zonas endémicas), y diferir portres años a aquellos que han vivido en una zona endémica. Exposición al riesgo con o sinprofilaxis, rechazar por 3 años

17.- Ha estado privado de libertad en los últimos 12 meses?

Los individuos que han estado en una institución correccional (cárcel o prisión), por más

de 72 hrs. consecutivas, se rechazan como donantes por 12 meses desde la fecha de

última detención, por riesgo sexual y/o drogas.

18.- ¿Ha sido vacunado en los últimos 12 meses?



SI: Analizar si es o no causal de rechazo, en caso positivo, explicarle si es definitivo o

transitorio.





107

TIPO VACUNA VACUNA PERIODO DE RECHAZO

Agentes VivosAtenuados

BCG

FIEBRE AMARILLA

PAPERA

POLIO ORAL (SABIN)

SARAMPION

2 – 3 SEMANAS

Agentes VivosAtenuados

RUBEOLA

VARICELA ZOSTER 4 SEMANAS

Agentes Muertos ,Toxoides

DIFTERIA

TIFOIDEA

TIFUS

PARATIFOIDEA

TETANOS

COLERA

COQUELUCHE

INFLUENZA

Aceptar si el donante no presenta síntomas commalestar y fiebre

HEPATITIS B ANTIGENO RECOMBINANTE

POLIO (SALK)

DIFTERIA

RABIA 1 AÑO

Anticuerpos INMUNOGLOBULINAS:

HEPATITIS B:

ANTI-TETANOS:

PROFILACTICA: NO se rechaza

EXPOSICIÓN AL VIRUS

Rechazo por 1 año.

Rechazo por 4 semanas





108

19.- ¿Está Ud. embarazada, ha tenido parto o aborto en los últimos 6 meses?

Mujeres embarazadas y que han tenido parto o aborto en los últimos 6 meses, no deben

donar sangre debido a los altos requerimientos de fierro en éste período. Excepciones a

esta regla deben ser hechas por el médico del Banco de Sangre.


SI: Se rechaza transitoriamente.

20.- ¿Ha tenido hepatitis después de los 12 años?

Dirigida a detectar antecedentes de hepatitis viral. Es necesario en algunos casos explicar

el término hepatitis en base a "ponerse amarillo".

NO: Se acepta al donante.

SI: Se rechaza. Debe instruírsele en que nunca puede ser un donante de sangre. Solo

se acepta un donante que refiere ictericia de causa obstructiva comprobada. Si

documenta una hepatitis de tipo A, puede ser aceptado como donante.

21.- ¿Ha tenido relaciones sexuales con personas con hepatitis, dializados o politransfundidos,

en los últimos 12 meses?

Dirigida a identificar pacientes que pueden estar en fase de incubación de Hepatitis.

Aunque el período de incubación es generalmente menor de 6 meses, debe rechazarse

hasta 12 meses después de la última exposición.

Personal de salud no se considera grupo de riesgo, a menos que haya sufrido accidentes

corto-punzantes con material presuntamente contaminado, en cuyo caso debe rechazarse

por 12 meses.

NO: Se acepta

SI: Donantes con antecedentes de este tipo de contacto se rechazan por 12 meses.

22.-¿Usted o su pareja, se han inyectado drogas por vía de piel o venas?

Dirigido a detectar personas que están en riesgo de infección por VIH y otras

enfermedades infecciosas que podrían ser transmitidas al receptor de productos

sanguíneos. Averiguar el tipo de droga, el período en que se consumió, rechazar en forma





109

permanente si es drogadicto crónico, drogadicto endovenosos, o si ha tenido conductas

de riesgo en los últimos 12 meses, producto de su drogadicción..

NO: Se acepta como donante

SI: Se rechaza en forma definitiva.

23.- ¿Se ha hecho tatuajes, sometido a acupuntura o realizado perforaciones en el cuerpo en los

últimos 12 meses?

Dirigida también a la identificación de personas que pueden estar en fase de incubación

de hepatitis u otra enfermedad de transmisión sanguínea.

En caso de personal de salud pregunte sobre algún accidente como corte o punción que

haya sufrido en los últimos 12 meses, en cuyo caso debe rechazarse por igual período.

NO: Se acepta al donante.

SI: Tatuajes: se rechaza por un período de 12 meses.

Acupuntura y perforación auricular: se rechaza por un período de 12 meses.

NOTA: Preguntar sobre tratamientos inyectables con material no desechable ya

que sería causal de rechazo por 12 meses.

24.-Si es hombre. ¿Ha tenido relaciones sexuales con otros hombres?



sanguíneos.

NOTA: Algunas personas pueden desear dar otro tipo de explicación a sus acompañantes

por haber sido rechazados en cuyo caso podrá ofrecerse respuestas factibles de ser

utilizadas: resfrío, presión arterial elevada, etc.

NO: Se acepta






110

25.- ¿Ha tenido relaciones sexuales con prostitutos/as, drogadictos o personas privadas de

libertad?



sanguíneos.



26.- ¿Ha tenido relaciones sexuales con más de una persona en los últimos 12 meses?

Dirigido a detectar personas que están en riesgo de infección por VIH y otrasenfermedades infecciosas que podrían ser transmitidas al receptor de productos

sanguíneos.


SI: Evaluar el riesgo real , y la promiscuidad de la conducta sexual. Si es el caso,

rechazar por 12 meses.

27- ¿Usted quiere donar sangre para hacerse el examen del SIDA?

Si es así consultar el porqué y enviarlo a los consultorios de CONASIDA en que lo hacen en

forma gratuita.


SI: Rechazarlo como donante

28.- ¿Ha sido trabajador sexual, o ha aceptado dinero o drogas por sexo?



sanguíneos.





111


SI: Rechazar en forma definitiva.

29.- ¿Viene a donar sangre por dinero?

Dirigida a detectar donantes pagados. Explicar en forma clara y precisa la inconveniencia de

la donación pagada. Asegurarse que el donante comprendió el concepto. Se le otorga al

donante la oportunidad de aclarar sus motivaciones para donar sangre.


SI: Rechazarlo en forma transitoria, asegurándose que él comprendió el concepto.

NOTA: Cualquier duda que se presente frente a las respuestas entregadas por un donante, que

signifique aplicar un criterio diferente al escrito en este instructivo, o aparezcan aspectos noconsignados en él, deben ser consultados al médico Jefe del Banco de Sangre.





112

MEDICAMENTOS DISPONIBLES EN CHILE QUE PUEDEN AFECTAR LAAGREGACIÓN PLAQUETARIA

Ac Acetilsalicilico Lertus (diclofenaco)

Action (piroxican) Meclomen ( ac meclofenamico)

Adona (ibuprofeno) Merpal (diclofenaco)

Alka- Seltzen (aspirina) Midol (ibuprofeno)

Algipres (ketorolaco) Mitrotil (tenoxicam)

Artren (diclofenaco) Mobex (meloxicam)

Aspirina efervescente Motrim (ibuprofeno)

Aspirina Moviflex ( indometacina)

Astodol (ibuprofeno) Naprosym ( naproxeno)

Antigripales Maver (ac. acetilsalicilico) Naproxeno

Bioflan (tenoxicam) Naproxeno Sodico

Bodil (ibuprofeno) Niofen (Ibuprofeno)

Bladex (ibuprofeno) Notagol (piroxican)

Brevedol (diclofenaco) Pediaprofen ( ibuprofeno)

Brexicam (piroxican) Pemar (piroxican)

Burten (ketorolaco) Pevoran ( diclofenaco)

Butartrol (ibuprofeno) Pirexyl ( sup.diclofenaco)

Cafiaspirina (ac acetilsalicilico) Piroflan (diclofenaco )

Cardioaspirina (ac acetilsalicilico) Pironal (ibuprofeno )

Cataflan (diclofenaco) Piroxicam

Desinflan (tenoxicam) Profenil (ketoprofeno)





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Diclofenaco Propalgin (piroxican)

Diclofenaco Sodico Recaflex (tenoxican)

Dignofenac Sicadol (ac mefenamico)

Diclotaren (diclofenaco sodico) Silartrin (ibuprofeno )

Diclotaren-R ( diclofenaco sodico) Sipirax (diclofenaco )

Dolgenal (Ketorolaco trometanol) Syndol (ketorolaco trometanol)

Dolmix (ibuprofeno) Talflex (ketoprofeno)

Dolofar ( ketoprofeno) Templadol (ac mefenamico)

Dolo-Ketazon (ketoprofeno) Tenoxicam

Dolonase (ibuprofeno) Tepronac (piroxican )

Dolo-octirona (ibuprofeno) Texicam DU (tenoxicam )

Ecotrin 100 (ac. acetilsalicilico) Trigesico ( ac acetilsalicilico)

Ecotrin 325 ( ac acetilsalicilico) Turbogesic (diclofenaco potasico)

Efexicam ( tenoxicam) Veradin ( ac acetilsalicilico)

Ewin (ac acetil salicilico) Voltaren ( diclofenaco sodico)

fabudol (piroxican) Zadetin (ketotifeno )

Facitor ( ac acetilsalicilico) Zolimin (tenoxicam)

Fastum (ketoprofeno)

Feldene ( piroxican)

Felis ( tenoxicam)

Flexono ( indometacina)

Foldox ( piroxican)

Hassapirin ( ac acetilsalicilico)

IBU-2 (ibuprofeno)





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IBU-4 “

IBU-6 “

Ibupirac “

Ibuprofeno

Indometacina

Ketoprofeno

Ketorolaco

Ketorolaco trometadol

Ketotisin (ketorolaco)

Kin (ibuprofeno)





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MEDICAMENTOS CONTRAINDICADOS PARA DONAR SANGRESi el donante de sangre a estado tomando o alguna vez ha tomado uno de los medicamentos quea continuación se señalan deben diferirse como donante de sangre.

Proscar© (finasteride) Tratamiento del agrandamiento prostático

Avodart© (dutasteride) Tratamiento del agrandamiento prostático

Propecia© (finasteride) Tratamiento para la calvicie

Accutane© (Amnesteem, Claravis, Sotret, isotretinoin) Tratamiento para el acné

severo

Soriatane© (acitretin) – Tratamiento para la soriasis severa

Tegison© (etretinate) – Tratamiento para la soriasis severa

Hormona del crecimiento de la gládula pituitaria Utilizada sólo hasta 1985 en niños

con retardo en el crecimiento

Insulina Bovina (Bovine, or Beef, Insulin) Usada en el tratamiento para la diabetes

Inmunoglobulina contra la Hepatitis B – Utilizada en los que pudieron estar

expuestos a la Hepatitis B

NOTE: Esta es diferente a la vacuna, que es preventiva y que se da en tres dosis enun período de seis meses.

Vacunas no licenciadas – Usualmente asociadas con protocolos de investigación

Si el donante está tomando Proscar, Avodart, Propecia, Accutane, Soriatane, or Tegison, debe

saber que estas drogas pueden causar malformaciones, la sangre donada a una embarazada

podría contener suficiente para causar daño al feto. Debe diferirse por un mes después de la

última dosis.

Hormona del crecimiento de la glándula pituitaria . Se difiere en forma permanente, riesgo a

contraer Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD, for short).





116

Insulina Bovina (Bovine, or Beef, Insulin), Esta insulina proviene de países que tienen el mal de las

vacas locas, y por tanto puede estar infectada por los agentes causales de la enfermedad. Se

difiere en forma permanente.

Hepatitis B Immune Globulin (HBIG) Riesgo a exposición de personas que han sufrido de hepatitis

B. Diferir por 12 meses.

Vacunas no licenciadas Diferir por al menos un año, a no ser que el médico jefe del servicio diga

lo contrario.





117

RECONOCIMIENTO Y MANEJO INICIAL DE LAS REACCIONES ADVERSAS A LADONACION

INTRODUCCIÓN:

Las reacciones adversas a la donación de sangre ocurren en aproximadamente un 4% de los

donantes. Los más propensos a las reacciones son los más jóvenes, aquellos que donan por

primera vez, los que antes de la donación tienen un pulso alto, y aquellos con una presión arterial

baja. También tienen importancia los factores ambientales, la experiencia del personal que realiza

la flebotomía, las características del local (lleno, caluroso), el tiempo de espera, y el estado

anímico del donante.

Las complicaciones se previenen con un personal amable, que transmita confianza y con una

buena técnica de punción venosa.

Se clasifican en tres grupos principales

Efectos vasovagales

Síncope

Bradicardia

Diaforesis

Palidez

Mareos

Náuseas

Convulsiones

Tetania

Venipuntura Dermatitis local

Hematoma

Punción arterial

Daño del nervio

Infección local

Tromboflebitis superficial





118

El sindrome vasovagal o fatiga es la complicación más frecuente. Es provocado por motivos

sicológicos o neurofisiológicos, pueden ser causados por la visión de la sangre, por ver a otros

donando o por motivos inexplicados. Se caracterizan por sensación de debilidad general,

sudoración, palidez, mareos, pudiendo llegar a pérdida de conciencia, convulsiones y relajación de

esfínteres. La piel es pálida y sudorosa, el pulso disminuye en amplitud y frecuencia, lo que ayuda

a distinguir las reacciones vasovagales de las hipovolémicas en las que es frecuente encontrartaquicardia.

El estado ansioso puede producir hiperventilación que causa una disminución del C02 sanguíneo

que puede llevar a una alcalosis respiratoria y a tetania.







120

• Pueden ocurrir en la cara, en los brazos y en las manos

• El personal, al observar a un donante ansioso, debe tranquilizarlo, desviando su atención a

través de la conversación, y así disminuir la hiperventilación.

• Si no cede se puede usar una bolsa de papel para que respire en ella

Hematoma

• Puede ocurrir durante o después de la flebotomía

• Remover la ligadura, sacar la aguja e intentar vaciar el hematoma por medios mecánicos

• Colocar parches de gasa estéril sobre la zona de punción y presionar firmemente durante 7 a

10 minutos, manteniendo el brazo elevado sobre el nivel del corazón

Punción arterial.

• Se debe sospechar punción arterial si el llenado de la bolsa es muy rápido, si la sangre es muy

roja.

• Se debe retirar la aguja, presionar firmemente por 10 minutos la zona de punción , controlar el

pulso arterial, y si este es ausente, avisar al jefe del Banco de Sangre o al médico de urgencia

en su ausencia.

Convulsiones

• Pedir ayuda inmediatamente y prevenir que el donante se golpee.

• Mantenerlo en el sillón de donación y si no es posible por la fuerza que desarrolla, colocarlo

en el suelo evitando que se golpee.

Mantener vía aérea permeable, avisar al médico del Banco de Sangre o al médico de

urgencia en su ausencia.

Ante cualquier reacción que no ceda en pocos minutos o que sea muy intensa se debe avisar al

médico del Banco de Sangre. En su ausencia, se avisará o se referirá al médico residente o de

urgencia.





121

Todas las reacciones adversas a la donación deben ser registradas en la ficha del donante, con

una indicación clara si la persona es o no apto para una próxima donación.

La mantención de stock de medicamentos para tratar las reacciones adversas a la donación será

definida por el médico jefe del Banco de Sangre, así como las personas autorizadas para

administrarlos





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PREPARACIÓN DE HEMODERIVADOS Y CONTROL DE CALIDAD

Objetivo

El objetivo del servicio de banco de sangre, es la obtención de hemoderivados producidospor la separación aséptica de los componentes celulares de la sangre y del plasma, mediante unsistema cerrado estéril, el cual permite mantener la integridad de los hemocomponentes y asíasegurar la calidad y seguridad que beneficien al receptor de estos.

La sangre se recolecta en bolsas de extracción plásticas con bolsas de transferencia osatélite (doble, triple, cuádruple) o con solución aditiva. La bolsa de extracción contienesoluciones anticoagulantes-conservantes, destinada a evitar la coagulación y preservar laviabilidad y función celular, durante su almacenamiento.

Las bolsas de extracción de sangre están diseñadas para un volumen de 450 ± 45 ml (405-495 ml) con un 63 ml de anticoagulante-conservante. Para los pacientes que pesan menos de 50Kg para los casos de autotransfusión pediátrica o en aquellas situaciones que el volumen extraídosupere el 15% de la volemia se deben extraer una parte del anticoagulante.

Cálculo para la extracción de sangre de donantes que pesan menos de 50Kg.

A = volumen a extraer (*) = (peso del donante Kg / 50 * 450 ml)

(*) = alrededor del 12 % de la volemia.

B = Cantidad de anticoagulante necesaria (¥) A / 100 * 14

(¥) = para las soluciones de CPD o ACDA-1 anticoagulante / sangre (1,4 / 10).

C = cantidad de anticoagulante a eliminar de la bolsa colectora 63 ml – B.

La solución anticoagulante usual contiene citrato (fija calcio del plasma), fosfato (sustratopara mantener el 2,3-DPG), dextrosa (azúcar), adenina (nucleótido).

Según el hemocomponente que se desee, dependerá la temperatura de conservación yvelocidad de centrifugación de la sangre recolectada.





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FRACIONAMIENTO DE LA SANGRE

Comienza con un donante sano (evitar bacteriemia transitoria) y punción venosa

limpia (minimizar contaminación bacteriana).

La sangre se debe extraer de forma rápida (evitar activación de la coagulación) sintraumatizar el tejido, esta se puede extender hasta 15 minutos sin alterar las plaquetas y elplasma congelado. Al finalizar, la sangre se puede refrigerar a 1-6 º C, excepto si se empleara parala producción de plaquetas.

La sangre se fracciona antes de 8 horas post extracción.

La separación se realiza de acuerdo al peso específico de cada uno de loscomponentes, mediante centrifugación diferencial y de acuerdo a la calibración establecida(velocidad y duración para cada componente).

Densidad g/ml

Plasma 1.023Plaquetas 1.03

Glóbulos rojos 1.100

Para cálculo de volumen de la bolsa de hemocomponente:Descontar al peso total del hemocomponente, el peso de la bolsa vacía.El volumen se calcula por la relación entre masa (g) y densidad (g /ml).

Sangre Total

Es la sangre fresca no separada, contiene la solución anticoagulante y conservante(450 ml sangre + 63 ml anticoagulante-conservante.).

Plaquetas y leucocitos dejan de ser funcionales.Hematocrito 35-45%Se conserva a 1-6° CSin factores de coagulación lábilesActualmente los bancos de sangre no la utilizan, sólo cuando es necesario reponer la

masa eritrocitaria y la volemia (hemorragia masiva).

Glóbulos rojos

Son unidades de sangre casi sin plasma obtenidas por centrifugación fuerte.Este preparado contiene un concentrado de hematíes de 200 ml más unos 100 ml de plasmaresidual.Si la sangre se recoge en CPD-A, los concentrados pueden conservarse por 35 días a 4ºC.Hematocrito 60-80% CPD-A





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Si los glóbulos rojos son suspendidos en 100 ml de solución aditiva (SAG-M, ADSOL), puedenconservarse por 42 días, hematocrito 55-65%.

Indicación: componente de elección en las anemias sintomáticas y en las transfusionesquirúrgicas.

Glóbulos rojos leucodepletadosConsisten en la suspensión o concentrado de glóbulos rojos contenidos en 5 x 10 6 leucocitos por

unidad, que se preparan mediante el paso de estos a través de un filtro de leucodepleción,generalmente realizado antes de la transfusión.

Indicación: Estos componentes pobres en leucocitos tienen valor en pacientes con reaccionestransfusionales no hemolíticas febriles, evitar la aloinmunizacion HLA, disminuir transmisión dealgunos virus (CMV, Epstein Barr).

Glóbulos rojos irradiadosConsiste en prevenir la proliferación de linfocitos T transfundidos en los receptores con riesgo de

enfermedad injerto versus huésped. La dosis mínima necesaria de irradiación gamma es de 25 G.Los glóbulos rojos irradiados se conservan por un máximo de 28 días después de la colecta yprocedimiento de irradiación.

Indicación: Transfusiones intrauterinas, inmunocompetentes sometidos a trasplantes de medulaósea, unidades de donantes consanguíneos, neonatos bajo peso.

Glóbulos rojos lavadosSe requiere realizar en condiciones de asepsia, en 1-2 litros de solución salina normal, donde se

remueve proteínas, electrolitos y anticuerpos plasmáticos.Estos deben usarse dentro de las 24 horas, debido a la realización del procedimiento con sistemas

abiertos y se corre el riesgo de proliferación bacteriana.

Indicación: En pacientes que tienen reacciones a las proteínas del plasma y en aquellos con antiIgA.

Plaquetas

Se preparan a partir de sangre total a temperatura ambiente. Se obtienen plasma rico enplaquetas por centrifugación suave, mediante el sistema cerrado, el PRP se transfiere a la segundabolsa (satélite), el que se centrifuga fuerte para obtener el concentrado plaquetario sedimentadasy resuspendidas en 40-60 ml de plasma. Estas se conservan a temperatura ambiente 20-24 º C por

no más de 5 días en agitación constante.

Indicación: pacientes con trombocitopenias o disfunción plaquetaria.Para prevenir hemorragias espontáneas o detener las existentes.





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Plasma fresco congelado

Se obtiene a partir de la sangre total con menos de 6 horas de extraída. Se conserva congelado a-30 º C por 12 meses.Contiene factores de la coagulación lábiles y estables (cerca de 1 UI/ml).Su volumen aproximado es sobre 100 ml.Antes de usarse se debe descongelar en agua a 37º C.

Indicación: se emplea para tratamiento de hemorragias secundarias a déficit de factores de lacoagulación.

Crioprecipitado

Se prepara a partir de plasma congelado dentro de las 6 horas de extraída.El PFC se descongela entre 1-6 º C, luego se somete a centrifugación fuerte para sedimentar el

crioprecipitado, este se resuspende en 15 ml de plasma y se conserva a -30°C por 12 meses.El crioprecipitado contiene aproximadamente 250 mg de fibrinógeno y 80 U de FVIII.Antes de usarse se debe descongelar en agua a 37º C.

Indicación: hemorragias secundarias a deficiencias de FVIII, hemofilia, enfermedad de VonWillebrand.







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PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES

Pruebas pretransfusionales

El objetivo de las pruebas pretransfusionales, es prevenir las reacciones adversas a la transfusiónpor incompatibilidad entre donante y receptor.

Los estudios pretransfusionales comprenden:

• Identificación inequívoca del receptor de la transfusión. • Identificación inequívoca de las muestras del receptor de la transfusión. • Comprobación de los resultados obtenidos de las muestras con los obtenidos previamente yregistrados, en el caso de anteriores transfusiones.• Determinación del grupo ABO y Rh en las muestras del receptor de la transfusión.

• Descubrimiento de anticuerpos presentes en el suero del receptor de la transfusión. • Selección de los componentes sanguíneos apropiados para el receptor de la transfusión.. Reclasificación del grupo sanguíneo de la bolsa de GR del donante desde la tubuladura de esta.• Realización de las pruebas cruzadas de compatibilidad entre el suero del receptor y los hematíes

del donante, excepto en casos de extrema urgencia en donde la falta de suministro de la sangrecomprometa la vida del paciente, esto debe ir indicado por escrito por el médico responsable, enel laboratorio se debe proseguir con el estudio de compatibilidad luego de entregar la sangre.• Etiquetado de los componentes sanguíneos con la información adecuada del receptor de la

transfusión.

Tipo de muestra:

Sangre con EDTA para la determinación del grupo ABO y Rh.Sangre sin anticoagulante para obtener suero o con EDTA para determinar anticuerpos irregularesy prueba cruzada. No deben utilizarse muestras hemolizadas.(Las muestras pueden conservarse a 1-6º C hasta por 1 semana en el caso de necesitarse otratransfusión dentro de la misma)





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DESPACHO DE TRANSFUSIONES

Selección de unidades a cruzar

Antes de iniciar las pruebas de compatibilidad y una vez seleccionadas las unidades acruzar, se debe confirmar el grupo ABO y Rh de las unidades.

Compatibilidad ABO

Siempre que sea posible, todos los pacientes deben recibir unidades de concentrado dehematíes ABO idénticos. Cuando ello no es posible, pueden seleccionarse componentes de gruposABO compatibles, en función de los antígenos presentes en los hematíes y de los anticuerposexistentes en el plasma del receptor.

Compatibilidad RhLos componentes sanguíneos Rh positivos deben destinarse a los receptores D positivos,

en tanto que las unidades Rh negativas, aunque sean compatibles con receptores D positivos,deben reservarse para los receptores D negativos

En ocasiones y ante cuadros de urgencia y carencia de unidades Rh negativas un receptorD negativo puede recibir unidades Rh positivas, siendo consciente de que se va a producir unainmunización, valorando los riesgos y la posible administración ulterior de inmunoglobulina anti-Rh.

Pruebas cruzadas de compatibilidad

En todo paciente que precisa una transfusión y en aquellos que son sometidos aprocedimientos quirúrgicos en donde es muy probable la administración de sangre, se debenrealizar las pruebas cruzadas de compatibilidad, que consisten en enfrentar el suero del receptorcon los hematíes del donante.

Por medio de esta prueba debemos demostrar la compatibilidad ABO, Rh y la ausencia deanticuerpos antieritrocitarios significativos. Si se identifican anticuerpos relevantes, el pacientedebe recibir sangre sin los antígenos correspondientes, aunque los glóbulos rojos del donante conlos antígenos fuesen compatibles in vitro.





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Método:

Pruebas de compatibilidad en tubo

1. Marque un tubo con el No de la unidad a transfundir2. Lavar 4 veces con PBS los eritrocitos del dador obtenidos de la tubuladura de la bolsa, en elúltimo lavado eliminar todo el PBS.

3. Preparar una suspensión al 2 % en Liss (19 gotas de Liss por 1 gota de glóbulos concentrados).4. En un tubo previamente marcado colocar 2 gotas del suero del receptor y 2 gotas de eritrocitosdel dador previamente preparados.5. Centrifugar y leer. Lea en busca de hemólisis o aglutinación rotando suavemente el tubo frentea una fuente de luz. Registre el resultado.

6. Incubar según el tiempo estandarizado para el Liss a 37º C.7. Centrifugar y leer.8. Lavar 4 veces con abundante PBS y en el último lavado tener la precaución de eliminar la mayorcantidad de salino.9. Agregar 1 gota de suero antiglobulina humano poliespecífico.10. Centrifugar y leer11. En los tubos con resultados negativos colocar 1 gota de células control de antiglobulinahumana (Coombs). Centrifugar y leer.





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PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD EN GEL

1. Glóbulos rojos lavados 4 veces en PBS, se deben diluir de la siguiente manera:Dispensar 1 volumen de Solución I (LISS) (500 ml) a un tubo y agregar 10 ul de Glóbulos Rojos

lavados2. Agregar 50 ul de G.R. al 1% a cada pocillo3. Agregar 25 ul de suero o plasma del receptor4. Incubar 15 minutos a 37ºC5. Centrifugar 10 minutos6. Leer

PRUEBA DE COMPATIBILIDAD RUTINARIA SALINA-POPIETILENGLICOL

(PEG) 37ºC- anti-IgG

Método 1. Rotular el tubo con las iniciales del receptor y número de unidad del donante.2. Colocar 2 gotas de suero del receptor.3. Añadir 1 gota de glóbulos rojos (reactivo o de donante) en suspensión al 2- 5% y mezclar.4. Centrifugar y observar la presencia de hemólisis y/o aglutinación. Clasificar y anotar los

resultados.5. Mezclar 2 gotas de polietilenglicol e incubar a 37º C durante 15 minutos.6. NO CENTRIFUGAR. Lavar 3 veces con solución salina. Eliminar el sobrenadante del último

lavado. Agregar 1 gota de Suero de Coombs Anti-IgG. Centrifugar y leer en busca de aglutinación.

Interpretación de las pruebas de compatibilidad

Investigación deanticuerpos irregulares

Pruebacruzada

Causa de la aglutinación Compatible ptransfusión

+ - El anticuerpo reacciona con algúnantígeno de los hematíes reactivos

Fenotipar don

- + El anticuerpo reacciona con antígeno debaja incidenciaLos hematíes del donante son PAD +Error en la técnica

No

+ + El anticuerpo reacciona con un antígenodel donante y de hematíes del reactivo

No

- - No se detecta anticuerpo si





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Inspección de la unidadAntes del despacho de la transfusión se debe verificar la integridad de la bolsa, evidenciar

hemólisis en el plasma, presencia de turbidez, grumos o burbujas, evidenciar grandes coágulos.

Identificación de la unidadIdentificar la unidad a transfundir (etiqueta con nombre del receptor)

Identificación del receptorAl receptor de la transfusión para ser identificado se le pide que diga su nombre completo

o se puede identificar mediante un brazalete de identificación si este está inconsciente. Sus datosdeben coincidir con su ficha clínica.

Explicar al paciente el procedimiento

Resolver la vía de administración (preexistente o instalar vía)

Reclasificación ABO y Rh del paciente en la cabecera, y debe concordar con la unidad atransfundir y con la clasificación original del paciente.





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INDICACION DE LA TRANSFUSION

(Extractos: 2ªEdición 2003 Sociedad Española de Transfusión Sanguínea Apartado de correos 40078, 28080 Madrid Deposito Legal:Copyright: SETS 2003© GUÍA SOBRE LA TRANSFUSIÓN DE COMPONENTES SANGUÍNEOS Y DERIVADOS PLASMÁTICOS)





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REACCIONES ADVERSAS A LA TRANSFUSIÓN SANGUÍNEA

Se entiende por reacción transfusional a cualquier efecto desfavorable que se presenta enun paciente durante la administración de sangre total o de algún derivado de ella. Los efectos

adversos y riesgos asociados a la transfusión de hemocomponentes se clasifican en:

Agudos: Aparecen durante el acto transfusional, o poco tiempo después(Hasta 24 horas).

Retardados: Tienen lugar más allá de las 24 horas después del inicio de la transfusión.

Mecanismo productor inmune: Por reacción antígeno del donante con anticuerpo significativodel receptor.

Mecanismo productor no inmunológico: Por administración de sangre lisada “in vitro”, o por la

propia condición clínica del paciente, donde la hemólisis se produce “in vivo”.

Principales reacciones transfusionales agudas

Tipo de reacción Etiología Signos y síntomas

Hemolítica inmune Incompatibilidad eritrocitaria Escalofríos, fiebre, dolor en lazona de infusión, dolor óseo,hemoglobinuria, fallo renalagudo, oliguria, coagulaciónintravascular diseminada

Hemolítica no inmune Destrucción eritrocitaria por

agentes físicos o químicos

hemoglobinuria

Febril no hemolítica Anticuerpos antileucocitarios,Antiplaquetarios, pirógenos.

Fiebre(>1°C) cefalea, escalofríos,nauseas, vómitos, malestargeneral

Alérgica Alergia del paciente al productosoluble en plasma del donante

eritema local, prurito

Anafiláctica Anticuerpos anti-IgA en pacientes condéficit de IgA

Tos, broncoespasmo, calambresabdominales, vómitos, diarrea,shock, pérdida de conciencia

Sobrecarga circulatoria Anticuerpos anti-HLA o antineutrófilos en el plasma del donante

Distres respiratorio agudo con osin hipotensión que aparece

generalmente entre 1-2 horaspost transfusión

Lesión pulmonaraguda

Anticuerpos anti-HLA o anti-neutrófilos en el plasma delDonante

Distres respiratorio agudo con osin hipotensión que aparecegeneralmente entre 1-2 horaspost transfusión





143

Hipocalcemia Transfusión masiva dehemocomponentes y disminución delmetabolismo del citrato.

Parestesias, tetania, arritmias

Contaminaciónbacteriana

Administración de hemoderivadoscontaminados por bacterias

Fiebre (generalmente>40°C), taquicardia,shock, CID, náuseas yvómitos, hipotensión,colapso circulatorio

Hipotermia Infusión rápida dehemocomponentes fríos

Arritmia cardiaca

Hiperkalemia Administración de varias unidades dehemocomponentes con niveles altosde potasio

Arritmia cardiaca

Embolia gaseosa Introducción de aireen la vía venosa

Hipotensión, cianosis,colapso circulatorio





144

Principales reacciones transfusionales retardadas

Tipo de reacción Etiología Signos y síntomas

Hemolítica Respuesta anamnésica a

antígenos eritrocitarios

Malestar general,

inadecuado aumentode los niveles dehemoglobina, elevación de labilirrubina sérica

Aloinmunización Respuesta inmune frente aantígenos de las célulassanguíneas

Generalmente ninguno, peropuede dar un estado derefractariedad a la transfusión deplaquetas, dificultad paraencontrar unidadescompatibles, reaccioneshemolíticas tardías

ulterioresEnfermedad injertocontra huésped

Acción de los linfocitosfuncionales infundidos sobreel sistema inmune

Eritrodermia,rash maculopapular,anorexia, náuseas, vómitos,diarrea, hepatitis, pancitopenia,fiebre

Púrpura posttransfusional AnticuerposPlaquetarios

Cuadro purpúrico,hemorragia, a los 8-10 días post-transfusion

Sobrecarga férrica Múltiples transfusionesde hemocomponentes enpacientes con necesidades

reiteradas

Transtornos endocrinos,arritmias,miocardiopatía, fallo hepático y

pancreáticoTransmisión deEnfermedades

Contaminación por agentespatógenos de las unidadesadministradas

Las propias de cada agentepatógeno transmitido





145

Pasos a seguir frente a una reacción adversa a la transfusión sanguinea

• Detener inmediatamente la transfusión manteniendo la vena con suero fisiológico.

• Tomar los signos vitales, anotar y describir sintomatología.

• Verificar la etiqueta de la bolsa con los datos del paciente y que esta coincida, con eldestinatario a quien se transfunde.

• Notificar la incidencia al médico responsable del paciente para valorar la intensidad de la

reacción, el tratamiento oportuno y la continuidad o no de la misma.• Realizar por otra vía distinta a la de la transfusión, la extracción de 10 mL de sangre con EDTA y10 mL de sangre coagulada.

• Enviar al banco de sangre la hoja de reacción transfusional, la bolsa de sangre con su equipo deinfusión y las muestras extraídas (incluida la orina).

• Comprobar toda la documentación administrativa, etiquetas, identificaciones en busca de

posibles contradicciones o diferencias.

• Inspeccionar visualmente las muestras plasmáticas pre y post-transfusionales para detectar lapresencia de hemólisis (color rosado) o ictericia.

• Realizar una prueba de aglutinación directa (Test de Coombs) en la muestra con EDTA pre ypost-transfusional

• Repetir la determinación de grupo ABO y Rh en las muestras pretransfusionales, post-

transfusionales y en el componente o hemoderivado administrado.

• Determinar el estudio de anticuerpos irregulares en las muestras pre y post-transfusionales delpaciente. Pueden ser negativos en un principio por estar adsorbidos sobre los hematíestransfundidos. En este caso hacer eluido si la PAD es positiva.

• Pueden repetir las pruebas cruzadas con la muestra pre y post-transfusional.

• Determinar la posible existencia de hemoglobina libre en la orina del paciente emitida tras elincidente transfusional.

• Realizar una tinción de Gram en una muestra de la unidad, así como cultivos microbiológicos si

están indicado.





146

SOLUCIONES INTRAVENOSAS Y SU RELACIÓN CON LA TRANSFUSIÓN SANGUINEAY HEMOCOMPONENTES

HemocomponenteSoluciones

INCOMPATIBLES

Soluciones en caso de

malos accesos

Soluciones

Compatibles

Sangre

- Suero glucosado

- Dextrosa

- Ringer Lactato

- Soluciones que

contengan calcio

- Antibióticos

- Calmantes

- Cloruro de sodio

hipotónico

- Albúmina 5% Suero fisiológico

Plasma Compatible

Glóbulos Rojos

- Suero glucosado- Dextrosa- Ringer Lactato- Soluciones quecontengan calcio- Antibióticos- Calmantes- Cloruro de sodiohipotónico

- Albúmina 5% - Suero fisiológico- Plasma Compatible

Plasma

- Ringer Lactato

- Soluciones quecontengan calcio- Antibióticos- Calmantes

- Suero glucosado

- Dextrosa

- Suero fisiológico

Plaquetas

- Ringer Lactato

- Soluciones quecontengan calcio

- Antibióticos

- Calmantes

- Suero glucosado

- Dextrosa


Crioprecipitados

- Ringer Lactato- Soluciones quecontengan calcio- Antibióticos- Calmantes

- Suero glucosado- Dextrosa




147

BIBLIOGRAFÍA

1. Manual de la AABB 13ª Edición 2001. Traducido por la Asociación Argentina deHemoterapia e inmunohematología.

2. Modern Blod Banking and Transfusión Practices. 4ª Edición. Denise M.Harmening. 1999.

3. Manual de la AABB. 15ª Edición. 2007. Traducido por la Asociación Argentina de

Hemoterapia e inmunohematología.

4. Methods in immunohematology. 2° edition. W.John Judd, FIBMS, MIBiol. 1994

5. Blood Transfusion Therapy. A Physician’s Handbook. 7 edition. 2002

6. Administración de sangre y hemoderivados. Compendio de medicina transfusional. Elias

Aguilar Ligorit. 2004

7. Guía para el uso clínico de la sangre. Tercera edición enero 2007. Asociación Mexicana de

Medicina Transfusional, A.C.

8. Transfusión sanguínea. Bases teóricas y aplicación clínica. J.G. Kelton. Ed. Doyma 1988.

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