Marcadores de ADN

¿Por qué usar marcadores de ADN en estudios de diversidad biológica?

Genotipo 1ambiente

Fenotipo 1

Fenotipo 2

Fenotipo 3

Dependiendo de las condiciones ambientales, un mismo genotipo puede expresarse como distintos fenotipos

FENOTIPO GENOTIPO

¿Cómo surgen las variantes genéticas (genotipos) en la naturaleza?

Mutaciones

Reordenamientos cromosómicos

Polimorfismo genético: presencia de múltiples formas alélicas para un mismo locus

Las mutaciones que no son reparadas son incorporadasa la población

?

¿Por qué se mantiene el polimorfismo genético en la naturaleza si la

selección natural actúa seleccionando a los

alelos mejor adaptados?

Eritrocitos normales Eritrocitos en anemia falciforme

El caso de la anemia falciforme

Plasmodium

Anopheles

Análisis cuali y cuantitativo dela diversidad biológica

EcologíaEvolución

SistemáticaAgronomíaSilvicultura

Biotecnología

Algunas aplicaciones de los marcadores de ADN

Mapeo y ligamiento a atributos de interés agrícola y forestal (MAS: Markers Assisted Selection)Detección de genotipos “exóticos” como fuente de genes de atributos de interés biotecnológico

En ciencia aplicada

En ciencia básica

Indicadores de diversidad genética para la aplicación de programas de manejo y conservación de recursos genéticos

Estudios de sistemática (taxonomía y filogenia)

Las técnicas de biología molecular ofrecen una gran variedad de herramientas para realizar

estudios de diversidad genética de alta resolución

Marcadores genéticos

Marcador genético multi-locus(ejemplo RFLP con sonda microsatélite)

Ejemplo de análisis:F y H: Siempre heredados juntos - ligados?A y B: En la progenie siempre A o B - alélicos?A y D: 4 combinaciones: A y D, A, D o ninguno - no ligados?Alelo P posiblemente ligado a I y C

Conclusiones que se pueden obtener del análisis con marcadores de ADN

ADN eucariótico

Genes funcionalesde copia única ADN repetido ADN espaciador

Secuenciasfuncionales

Secuencias sin función conocida

Familias de genes funcionales

(y pseudogenesrelacionados)

Secuencias funcionales

no-codificantes

Repeticiones de heterocromatina

centromérica

Repeticiones en tandem de número

variable

Transposones

Familias de genes dispersos

Familias de genes

en tandem

Características deseables en un marcador de ADN:

•Comportamiento altamente polimórfico.•Herencia codominante.•Presencia frecuente en el genoma.•Distribución regular en el genoma.•Comportamiento selectivamente neutro.•Altamente reproducibles.•Fácil acceso.

Genotipo

Marcador codominante(Ej. RFLP, VNTR)

Marcador dominante(Ej. RAPD, AFLP)

1,1 1,2 2,2

Clases de marcadores de ADN

Técnicas de análisis multi-locus basadas en la hibridación RFLP con sondas minisatélites y microsatélites (VNTRs clásico)

Técnicas de análisis multi-locus basadas en la PCR RAPD AFLP

Técnicas de análisis single-locus basadas en la PCR SSR (Análisis de VNTRs) PCR-RFLP PCR-Secuenciación

Técnicas de análisis multi-locus basadas en la hibridación RFLP con sondas minisatélites y microsatélites (VNTRs)

¿En qué se basa el análisis de Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP)?

Una Er cuya secuencia de reconocimiento es de 6pb es probable que encuentre su secuencia una vez cada 4096 pb (46 ) en un genoma

Se puede detectar la presencia de polimorfismo genético en una de cada 500 pb

Empleando 8 Er de 6 pb: 4096/8 = 500 pb

Se puede detectar la presencia de polimorfismo genético en una de cada 32 pb

Empleando 8 Er de 4 pb: 256/8 = 32 pb

Una Er cuya secuencia de reconocimiento es de 4pb es probable que encuentre su secuencia una vez cada 256 pb (44 ) en un genoma

¿Cómo se detecta el polimorfismo?

Sondas: Minisatélites: repeticiones de 10 a 35 pb Microsatélites: repeticiones de 2 a 10 pb

Análisis de paternidad basado en el análisis de VNTRs (clásico)

Análisis forense mediante VNTRs (clásico)

Técnicas de análisis multi-locus basadas en la PCR

RAPD AFLP

ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD)

Denaturación

Unión del partidor

Extensión

Separación electroforética de los productos amplificados

ADN molde, partidor, dNTPs, Taq pol

Patrones de amplificación RAPD de 7 cepas de D. salina analizadas, con los partidores de RAPD P-100 (ranuras 2 a 8) y OPA-11 (ranuras 9-15)

CONC-001: ranuras 2 y 9 CONC-006: ranuras 3 y 10 CONC-007: ranuras 4 y 11 México: ranuras 5 y 12 China: ranuras 6 y 13 Australia: ranuras 7 y 14D. bardawil: ranuras 8 y 15

P-100 OPA-11

Análisis de agrupamiento UPGMAderivado de la data de RAPD

Cepa 1

Cepa 2

Cepa 3

Cepa 4

Cepa 5

Cepa 6

Cepa 7

I

II

III

IV

0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

SimilitudAnálisis de

datos

nabS =

na+nb

nab: nº bandas compartidasna: nº bandas en anb: nº bandas en b

AFLP (Amplified fragment lenght polymorphism)

Técnicas de análisis single-locus basadas en la PCR

SSR (Análisis de VNTRs) PCR-RFLP PCR-Secuenciación

Los marcadores SSR (Simple sequence repeat) o microsatélites, presentan la

ventaja de que las regiones que flanquean las repeticiones son, generalmente,

conservadas entre genotipos de la misma especie

Diseño de partidores

Heterocigoto Homocigoto

Las diferencias detectadas están dadas por cambios en el número de repeticiones de las secuencias microsatélites (flanqueadas por los partidores) en los distintos alelos

Actualmente la determinación de paternidad se hace analizando SSRs utilizando partidores específicos

Madre Hijo Padre?

Análisis single locus por RFLP o secuenciación

18S 5.8S 28SITS-1 ITS-2

Región ITS

IGS IGS

Distribución de las secuencias ribosomales en el ADN nuclear eucarionte

Forward

Reverse

Análisis de PCR-RFLP en cepas de Haematococcus pluvialis

AluI

Fragmento ITS sin digerir

Taq I

Las diferencias en la secuencia son más

específicamente reveladas por secuenciación

Secuenciación de la región ITS en cepas de Dunaliella salina

Tamaño del fragmento ITS en cepas de Dunaliella salina

1.- CONC-0012.- CONC-0063.- CONC-0074.- México

1500

700500

M 1 2 3 4 5 6 7

pb

5.- China6.- Australia7.- D. bardawil

Cepa ITS-1 (pb) ITS-2 (pb)

CONC-001 213 232CONC-006 214 225CONC-007 214 231México 214 225China 213 226Australia 213 226D. bardawil 213 227

Longitud de los espaciadores ITS-1 e ITS-2

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1. CONC-001

2. CONC-006

3. CONC-007

4. México

5. China

6. Australia

7. D. bardawil

8. D. viridis

9. D. tertiolecta

- 0.1019 0.0275 0.0989 0.1014 0.0906 0.1014 0.1416 0.1085

- 0.1145 0.0778 0.0829 0.0751 0.0880 0.1519 0.1244

- 0.1007 0.1034 0.0980 0.1032 0.1613 0.1298

- 0.0023 0.0209 0.0092 0.1380 0.1275

- 0.0232 0.0115 0.1409 0.1304

- 0.0304 0.1291 0.1105

- 0.1407 0.1239

- 0.1164

-

Matriz de divergencia de las secuencias ITS-1 e ITS-2

Arbol de MP y MLbasado en las secuencia ITS

91 (MP)

94 (ML)

98 (MP)

96 (ML)

100 (MP)

100 (ML)

99 (MP)

98 (ML)

99 (MP)

100 (ML)

D. salina México

D. salina China

D. bardawil

D. salina Australia

D. salina CONC-006

D. salina CONC-001

D. salina CONC-007

D. viridis

D. tertiolecta

A

B

C

D

Análisis de diversidad genética en comunidades

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) ADN

Ambiental 1

PCR conpartidores específicos

ADNAmbiental 2

Gel de agararosade los productos de PCR

Concentración de denaturante

DGGE profiles of archaeal 16S rRNA gene fragments from a full-scale activated sludge plant showing changes in the archaeal communities over time.

ADNambiental

PCR conpartidores específicos

Secuenciación

...etc...

Secuenciación

Genoteca