UFTCAMPUS GURUPI

FUNDAMENTOS DE GENÉTICAVOLTADA À BIOTECNOLOGIA

PROFESSOR RAIMUNDO WAGNER

ASSUNTO: MARCADORES MOLECULARES

ALUNA: MAUREN SILVEIRA

MARCADORES MOLECULARES

Os marcadores moleculares podem ser vários para várias técnicas de identificação, seja

sobre DNA, RNA ou proteínas. Eles são usados como ferramentas das técnicas de

elucidação de cadeias de DNA ou RNA, ou para identificação de proteínas.

RFLP

Técnica de identificação de DNA: a técnica de RFLP’s (Restriction Fragment Length

Polymorphisms) baseia-se na hidrólise do DNA com enzimas de restrição e através da

eletroforese, usam-se os fragmentos gerados para visualização. As enzimas de restrição

só cortarão onde tiver complementaridade específica, portanto, correspondem a padrões

de restrição específicos. Estes padrões podem ser característicos ao nível da espécie ou

mesmo ao nível da estirpe.

Estirpes distintas apresentam diferenças mínimas ao nível do genoma, mas as enzimas

de restrição usadas podem indicar onde há semelhança e onde há diferença entre duas

estirpes diferentes ou iguais.

O RFLP pode ser feito para DNA plasmídico ou cromossômico.

O DNA plasmídico é menor e não apresenta fielmente a composição genômica, ficando

mais específico a elucidação de proteínas seletivas (como nas bactérias, com resitência a

antibióticos, por exemplo)

O DNA cromossômico é completamente representativo do ser pesquisado, mas

apresenta uma dificuldade: a técnica acaba por produzir um número tão grande de

fragmentos que fica impossível visualizá-los no gel de eletroforese. Para contornar este

problema recorre-se à análise do Polimorfismo de Macro-fragmentos de Restrição

separados por Eletroforese em Campo Pulsado (RFLP-PFGE). Pode ainda recorrer-se à

combinação da técnica de RFLP com técnicas de hibridação que evidenciam regiões

particulares do genoma. Existem várias variantes desta combinação, mas a mais

utilizada e de maior interesse taxonômico e epidemiológico, é conhecida por

Ribotipagem. Mas tanto a técnica de Robotipagem quanto a RFLP-PFGE perdem em

tempo para o PCR, mas não em especificidade.

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Efetuado através da amplicação de DNA genômico em PCR, utilizando primers de

sequência arbitrária com 10 nucleotídeos. Requer uma quantidade mínima de DNA para

a reação (10 a 25 ng). Por utilizar primer de uma sequencia arbitrária, a técnica permite

a realização de análises genéticas diretamente ao nível do DNA sem a necessidade de

nenhum conhecimento prévio sobre a genética da espécie a ser estudada, pois se fossem

utilizados primers com sequencias específicas, dificilmente poderiam ser usadas em

análises de DNA para espécies que não se tem nenhum conhecimento do seu código

genético. Além disso, os marcadores antigos como as isoenzimas, não são suficientes

para indicar polimorfismo entre espécies ou populações muito parecidas geneticamente.

As isoenzimas revelam o produto de alguns genes, então revelam apenas as regiões

codificadoras, o RAPD revela regiões repetitivas e de sequencia única e regiões

codificadoras e não docificadoras.

Mecanismo de ação de RAPD

O primer se liga em sequências complementares em fitas opostas ao DNA, e a

amplificação do pedaço de DNA, catalisada pela enzima Taq polimerase, ocorre entre

dois primers adjacentes.

Há uma condição limitante para esta técnica: os primers tem que cortar no máximo

pedaços de 3 a 4 mil pb, pois a enzima Taq polimerase não é capaz de percorrer

segmentos maiores.

Como os primers são pequenos, ele pode se ligar a inúmeros lugares do genoma,

resultando, então em inúmeros fragmentos, de vários tamanhos. A combinação de vários

primers é que vai determinar que tipo de fragmentos que se deseja amplificar e isolar.

A separação dos fragmentos amplificados pode ser feita em gel de agarose (0,8-2%)

corado com brometo de etídio, ou em gel de poliacrilamida. Nessa visualização, ou o

fragmento está presente ou ausente. Fragmentos de tamanhos diferentes são

considerados em diferentes lócus.

Marcadores RAPD são dominantes. Isso significa que indivíduos heterozigotos não

poderão ser diferenciados de indivíduos homozigotos dominantes, pois ambos

apresentarão uma banda no mesmo lócus do gel. Por outro lado é muito bem vinda essa

característica por se conseguir identificar indivíduos híbridos.

Diferenças entre RAPD e RFLP

RAPD é mais simples, requer menos quantidade de DNA e não precisa de compostos

radioativos.

RAPD não é capaz de diferenciar indivíduos heterozigotos.

AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorfism)

É uma técnica semelhante ao RAPD com a vantagem de haver mais repetibilidade, pois

usa primes maiores, porém, também não diferencia indivíduos heterozigotos.