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MARCELA BALBI PALLA
ANÁLISE DE PIROGÊNIO EM PRODUTOS INJETÁVEIS E SOLUÇÕES PARENTERAIS
SÃO PAULO
2007
CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS
MARCELA BALBI PALLA
ANÁLISE DE PIROGÊNIO EM PRODUTOS INJETÁVEIS E SOLUÇÕES PARENTERAIS
Trabalho apresentado à disciplina Trabalho de Conclusão de Curso, do Curso de Farmácia/FMU, sob orientação da Profa. Ms. Elissa Arantes Ostrosky.
SÃO PAULO
2007
CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS
MARCELA BALBI PALLA
ANÁLISE DE PIROGÊNIO EM PRODUTOS INJETÁVEIS E SOLUÇÕES PARENTERAIS
Trabalho apresentado à disciplina Trabalho de Conclusão de Curso, do Curso de Farmácia da FMU, sob orientação da Profa. Ms. Elissa Arantes Ostrosky. Aprovado pela banca examinadora constituída pelos professores:
__________________________________________________
Professora Ms. Elissa Arantes Ostrosky
FMU e Orientadora
__________________________________________________
Professor Ms. Osvaldo Cirilo da Silva
FMU
__________________________________________________
Professora Dra. Maria de Fátima Borges Pavan
FMU
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus
pais e a minha irmã, que me
ensinaram os valores e a
honestidade do caráter e me
encorajaram a persistir pelos
meus sonhos e ao meu amor
Wagner, por estar do meu lado
sempre que preciso, me
aconselhando em todos os
momentos da minha vida.
AGRADECIMENTOS
A DEUS Que me presenteou com a liberdade e inteligência, me dando a graça de lutar para conquistar meus ideais. Com sua grandiosa sabedoria, me fez substituir as incertezas pela segurança e o medo pela vitória. A ele cabe o louvor e a mim, só agradecer. AOS QUE AMO Meus pais, minha irmã, ao meu amor Wagner e aos meus grandes amigos (em especial à Alba Valéria dos Santos, Luciana Regina dos Santos e Sergio Silva). “Sabemos que muitas vezes estive ocupada, tensa, nervosa e até mesmo distante. Tudo isso vocês agüentaram firmes; Em momentos instáveis e difíceis, em meio ao caos que, por muitas vezes, virava minha vida. Afinal, o amor, o estímulo e a compreensão de todos vocês, foram a essência dessa vitória”. AOS MESTRES A vocês, responsáveis pela minha conquista e estimuladores do meu crescimento, dedico esta sincera homenagem e minha eterna gratidão. A TODOS, MUITO OBRIGADA
POR TUDO!!!
RESUMO
Este trabalho demonstra as vias utilizadas para a administração parenteral, bem
como sua necessidade de ser utilizada e explica os métodos in vivo e in vitro para o
teste de pirogênio. O trabalho também determina os processos de despirogenização
para os materiais utilizados nos testes, evitando possíveis contaminações.
Objetivamente, explica as diferentes metodologias para detecção de endotoxinas
bacterianas investigadas em produtos farmacêuticos estéreis e em soluções
parenterais.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Parede celular da Bactéria Gram negativa...............................................13
Figura 2: Parede celular da Bactéria Gram positiva................................................14
Figura 3: Estrutura da Endotoxina Bacteriana.........................................................24
Figura 4: O Lipopolissacarídeo encontrado na membrana externa das bactérias
Gram negativas........................................................................................................26
Figura 5: Coelho para execução do teste................................................................40
Figura 6: Reagentes utilizados para execução do LAL teste..................................44
Figura 7: Limulus polyphemus.................................................................................45
Figura 8: Leitura dos resultados a partir do coágulo branco formado no fundo do
tubo de ensaio..........................................................................................................46
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................11 2. CARACTERÍSTICAS DA CÉLULA BACTERIANA............................................12 3. PRODUTOS FARMACÊUTICOS INJETÁVEIS..................................................15
3.1 Vias Parenterais de Administração...................................................................15
3.1.1 Via Intravenosa..............................................................................................16
3.1.2 Via Intramuscular...........................................................................................17
3.1.3 Via Subcutânea..............................................................................................17
3.1.4 Via Intradérmica.............................................................................................18
3.2 Tipos Oficiais de Injetáveis...............................................................................18
3.3 Solventes e Veículos para Injetáveis................................................................19
3.4 Preparação Industrial de Produtos Parenterais................................................20
4. HISTÓRIA DO PIROGÊNIO................................................................................20 5. PIROGÊNIO E SUAS FONTES...........................................................................22 6. PIROGÊNIO ENDÓGENO E O MECANISMO DA FEBRE.................................22
7. ENDOTOXINAS...................................................................................................23 7.1 Lipopolissacarídeo.............................................................................................25
7.2 Composição Química........................................................................................26
7.3 Atividade Biológica............................................................................................27
7.4 Níveis Pirogênicos.............................................................................................27
8. PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO..........................................................28 8.1 Despirogenização por Inativação da Endotoxina..............................................29
8.1.1 Hidrólise Ácido-Base......................................................................................29
8.1.2 Oxidação........................................................................................................29
8.1.3 Alquilação.......................................................................................................30
8.1.4 Processo Térmico...........................................................................................31
8.1.4.1 Tratamento por Calor Seco..........................................................................31
8.1.5 Radiação Ionizante.........................................................................................32
8.1.6 Polimixina B....................................................................................................32
8.2 Despirogenização por Remoção das Endotoxinas............................................32
8.2.1 Lavagem.........................................................................................................32
8.2.2 Destilação.......................................................................................................33
8.2.3 Ultrafiltração...................................................................................................33
8.2.4 Osmose Reversa............................................................................................34
8.2.5 Carvão Ativo...................................................................................................34
8.2.6 Atração Eletrostática......................................................................................35
8.2.7 Atração por membrana Hidrófoba..................................................................35
8.3 Obtenção de produtos Apirogênicos.................................................................35
9. O TESTE DO PIROGÊNIO.................................................................................36 9.1 Teste de pirogênio por método in vivo...............................................................36
9.2 Fundamento do Método....................................................................................37
9.2.1 Modelo Animal.................................................................................................38
9.2.2 Procedimento do Teste...................................................................................39
9.2.3 Critérios de Interpretação................................................................................40
9.3 Métodos Não-Oficiais........................................................................................41
10. TESTE DE ENDOTOXINA PELO MÉTODO in vitro.......................................41
10.1 Mecanismo de Reação....................................................................................43
10.2 Preparação do Lisado do Amebócito de Limulus (LAL)..................................44
10.3 Ponto Final de Gelificação...............................................................................45
10.4 Ensaio LAL: Aplicação e Equivalência............................................................46
11. MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETECÇÃO DE ENDOTOXINA...................47 11.1 Ensaio Turbidimétrico......................................................................................47
11.2 Método Colorimétrico da Proteína de Lowry...................................................48
11.3 Método Nefelométrico.....................................................................................48
11.4 Método Cromogênico......................................................................................49
11.5 Outros Métodos...............................................................................................49
12. VALIDAÇÃO DA METOLOLOGIA “in vitro”....................................................50
12.1 Sensibilidade do Lisado...................................................................................50
12.2 Testes de Inibição e Exacerbação de Resposta.............................................51
12.3 Limites de Endotoxina....................................................................................51
12.4 Teste de Compatibilidade do Produto.............................................................52
12.5 Abrangência da Validação...............................................................................52
13. AVALIAÇÃO COMPARATIVA DE TESTES DE PIROGÊNIOS EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS............................................................................53
14. CONCLUSÃO...................................................................................................54
11
1. INTRODUÇÃO
Este trabalho descreve sobre o pirogênio e a importância de sua detecção
nos produtos injetáveis e soluções parenterais. Dá-se início a este, relatando um
pouco sobre as características da citologia bacteriana (metabolismo bacteriano,
diferença das bactérias Gram positivas e Gram negativas e suas respectivas
funções). Os produtos farmacêuticos injetáveis, suas vias de administração
(intravenosa, intramuscular, subcutânea e intradérmica) e seus tipos, são citados
durante o desenvolvimento do trabalho.
O pirogênio tem um grande destaque no trabalho, citando-se sua história,
suas fontes e seu mecanismo de ação. As endotoxinas, o lipopolissacarídeo, sua
composição química, sua atividade biológica e os níveis pirogênicos são
detalhados ao longo do trabalho. Para evitar qualquer tipo de contaminação,
existem os processos de despirogenização dos materiais a serem utilizados ao
longo do teste.
O teste do pirogênio é fundamental para qualquer tipo de material estéril. Os
métodos citados no trabalho são o método in vivo e o in vitro, bem como todo o
procedimento do teste, fundamento do método, critérios de interpretação dos
resultados, mecanismo de reação, preparação do Lisado de Amebócito de
Limulus (LAL), métodos analíticos para detecção de endotoxinas, validação da
metodologia in vitro e para finalizar tem-se uma avaliação comparativa de testes
de pirogênios em produtos farmacêuticos.
12
2. CARACTERÍSTICAS DA CÉLULA BACTERIANA
Existem vários fatores que interferem no metabolismo bacteriano. Entre eles
podem-se citar os fatores fisiológicos (que interferem na síntese): a fonte de energia,
tensão de oxigênio, temperatura, pH e os fatores bioquímicos, que englobam a
respiração, a fermentação, a putrefação, entre outros (ANDRADE et al, 2003).
As bactérias são divididas em dois grupos através da coloração de Gram:
bactérias Gram positivas e bactérias Gram negativas, que têm a mesma importância.
A técnica de Gram acaba expressando muitas características, principalmente na
composição química, estrutura, permeabilidade da parede celular, fisiologia,
metabolismo e patogenicidade das bactérias (HENDERSON et al, 1996).
A parede das células Gram negativas é composta por muitas camadas
complexas e a parede das células Gram positivas é composta de uma única camada
(RIETSCHEL et al, 1994).
A parede das bactérias Gram negativas possuem uma camada de
peptidioglicano e três outros componentes externos (lipoproteína, membrana externa
e LPS). A camada de peptidioglicano tem como função manter a forma das células e
proteger o citoplasma das diferenças de pressão osmótica entre os meios interno e
externo e também, confere rigidez ao corpo bacteriano. Está formado por dois
açúcares aminados, o N- acetil glicosamina e o ácido N- acetil murâmico. A camada
de peptidioglicano está localizada no espaço periplasmático entre a membrana
citoplasmática (interna) e a membrana externa, onde estão as enzimas hidrolíticas,
que mantém a nutrição bacteriana proteínas de ligação, que por sua vez fazem a
captação de açúcares e aminoácidos (DING; HO, 2001).
A camada externa apresenta como função uma barreira molecular, para
prevenir ou dificultar a perda de proteínas periplasmáticas, e para evitar o acesso de
enzimas hidrolíticas e alguns antibióticos ao peptidioglicano. Possui também
receptores para bacteriófagos e bacteriocinas e participa da nutrição microbiana
(TORTORA; FUNKE; CASE, 2005).
A composição da parede celular das bactérias Gram positivas e Gram
negativas são diferentes bem como a espessura das mesmas (sendo que a da
bactéria Gram negativa é menos espessa) (DINARELLO, 1984).
13
As bactérias Gram negativas são as mais encontradas na água de
hemodiálise (em torno de 90%). Esse tipo de bactéria se multiplica rapidamente,
mesmo em água estéril (> 100.000 col/ml), em menos de 48horas (SANTOS et al,
2000).
Figura 1: Parede celular da Bactéria Gram negativa
Fonte: VAL, 2007a.
A parede das células Gram positivas possuem uma única camada espessa,
quase toda composta de peptidioglicano, que tem como função a manutenção da
célula e sua rigidez. A camada de peptidioglicano é apenas uma camada espessa e
frágil. O componente da parede das células Gram positivas é o peptidioglicano
ligado diretamente de modo covalente ao ácido lipoteicóico. Para ativação celular,
pode-se citar o glicolipídeo e o ácido lipoteicóico, se ligando as membranas celulares
(linfócitos e macrófagos). Ativam também a cascata do complemento, induzindo à
inflamação (DANNER et al, 1990).
14
Figura 2: Parede celular da Bactéria Gram positiva
Fonte: VAL, 2007b.
O envelope celular das bactérias é formado pela membrana celular
juntamente com a membrana citoplasmática. O envelope das células Gram
negativas, consiste de fosfolipídeos (20 à 25%) e proteínas (45 à 50%). O restante é
composto de LPS (30%). A membrana citoplasmática está localizada junto à parede
celular e é formada por dupla camada fosfolipoproteica, tendo significativa
importância na estrutura bacteriana. Essa membrana atua como barreira osmótica e
é permeável aos íons sódio e aminoácidos. É importante por atuar também em
sistemas enzimáticos, biossíntese de lipídios, transporte de elétrons, além de
participar do processo de fosforilação oxidativa (LONNEMANN et al, 1988).
As bactérias necessitam de condições físico-químicas para seu devido
crescimento e reprodução. Dentre essas condições, pode-se citar: a temperatura, o
pH, pressão osmótica, concentrações de substrato, dióxido de carbono e oxigênio
(POOLE et al, 2001).
15
3. PRODUTOS FARMACÊUTICOS INJETÁVEIS
Injetáveis são preparações destinadas à administração parenteral, portanto,
devem ser estéreis e livres de pirogênios. O termo parenteral é um tipo de via de
administração de injetáveis e significa “fora do intestino”, denotando-se vias de
administração diferentes da oral (CRAWFORD; NARDUCCI; AUGUSTINE, 1991).
Essa via de administração é utilizada quando se deseja a ação rápida do
medicamento, em situações de emergência, quando o paciente está inconsciente ou
impossibilitado de aceitar ou tolerar medicamentos pela via oral, ou quando este
medicamento não é eficaz através de outras vias (HANSON, 1992). O primeiro
medicamento injetável oficialmente reconhecido foi a injeção hipodérmica de solução
de morfina. Hoje existem centenas de medicamentos e produtos farmacêuticos para
administração parenteral (ANSEL; POPOVICH; LOYD, 2000).
O teste de pirogênio em coelho foi baseado na injeção intravenosa de
soluções estéreis garantindo o controle de preparações parenterais (SILVEIRA et al,
2004).
3.1 VIAS PARENTERAIS DE ADMINISTRAÇÃO Geralmente, os medicamentos são injetados em órgãos e regiões do corpo:
nas articulações (intra-articular), áreas que contém líquidos nas articulações (intra-
sinovial), coluna vertebral (intravertebral), líquido cerebroespinhal (intratecal),
artérias (intra-arterial) ou até mesmo no coração (intracardíaca). Comumente são
executadas injeções em veias (intravenosa- IV), em um músculo (intramuscular- IM),
na pele (intradérmica- ID, intracutânea), ou debaixo da pele (subcutânea, SC,
hipodérmica), (HOFFMANN, 2005).
Os fármacos que são destruídos ou desativados pelo trato gastrointestinal ou
que são mal absorvidos, são administrados pela via parenteral (que também pode
ser usada quando se deseja uma rápida absorção). Esta via também é útil para
pacientes que não cooperam, que estão inconscientes ou que são incapazes de
aceitar a medicação oral (COUPE; DAVIS; WILDING, 1991).
16
A administração parenteral apresenta uma desvantagem que, quando o
fármaco é injetado, não há como retroceder (quando a substância está no interior
dos tecidos ou é colocada diretamente na corrente sangüínea é mais difícil de ser
retirada). Como esta forma de administração deve ser estéril, é mais cara e exige
profissionais competentes e treinados (HOFFMANN, 2005).
3.1.1 VIA INTRAVENOSA
A injeção intravenosa de medicamentos teve sua origem em 1656. Os
medicamentos intravenosos foram aplicados pela primeira vez em seres humanos
em 1662, mas foram abandonados durante certo tempo, devido à ocorrência de
trombose e embolia nos pacientes assim tratados (AKERS; WRIGHT; CARLSON,
1991).
Só a partir da invenção da seringa hipodérmica no século XIX, que foi
renovado o interesse pelas técnicas intravenosas e, no final deste mesmo século, a
administração intravenosa de soluções de cloreto de sódio e glicose tornou-se
popular. Atualmente, essa via de administração de medicamentos é uma ocorrência
rotineira nos hospitais, embora ainda sejam reconhecidos os perigos associados a
essa prática (KWAN, 1989).
Os medicamentos administrados por via intravenosa têm ação rápida em
comparação com as outras vias de administração e, como a administração do
medicamento não é um problema, concentrações sanguíneas ideais podem ser
alcançadas com precisão e rapidez impossíveis através de outras vias. As veias são
grandes, superficiais e fáceis de ver e perfurar (DABBAH et al, 1980).
Rígidas precauções de assepsia devem ser tomadas para evitar o risco de
infecções. Não só as soluções injetadas precisam ser estéreis, mas as seringas e
agulhas empregadas também devem ser esterilizadas e o ponto de entrada deve ser
desinfetado para reduzir a possibilidade de transportar bactérias da pele para o
sangue, através da agulha. Geralmente os medicamentos administrados pela via
intravenosa devem ter a forma de solução aquosa (ANSEL; POPOVICH; LOYD,
2000).
17
3.1.2 VIA INTRAMUSCULAR
Possui efeitos menos rápidos, mas com duração maior que os obtidos pela via
intravenosa. Soluções ou suspensões aquosas podem ser administradas pela via
intravenosa e a absorção vai depender do tipo de preparação empregada. As
injeções intramusculares são aplicadas diretamente nos músculos esqueléticos, e
devem estar longe dos nervos e vasos sanguíneos (DABBAH et al, 1980).
Os danos provocados por injeções intramusculares relacionam-se com o
ponto no qual a agulha entrou e onde o medicamento foi depositado. Estes danos
incluem paralisia por dano neurológico, abcessos, cistos, embolia, hematoma,
necrose da pele e formação de cicatriz (HOFFMANN, 2005). A injeção deve ser feita
a uma profundidade de 5 a 7,5 cm, com agulhas de calibre 19 ou 20 (CRAWFORD;
NARDUCCI; AUGUSTINE, 1991).
3.1.3 VIA SUBCUTÂNEA
Esta via é utilizada para injeção de pequenos volumes de medicamento.
Normalmente, a injeção é dada sob a superfície da pele nos tecidos intersticiais
frouxos da face lateral do braço, superfície anterior da coxa e na região inferior do
abdômen. Os medicamentos irritantes são aplicados na forma de suspensão
(AKERS; WRIGHT; CARLSON, 1991).
Os injetáveis intradérmicos, quando aplicados no paciente com frequência,
devem ter alternados os locais de aplicação, reduzindo assim as irritações teciduais
(COUPE; DAVIS; WILDING, 1991).
A irrigação sangüínea no local da injeção é um fator muito importante ao
considerar a velocidade de absorção, ou seja, quanto mais próximos estiverem os
capilares do local da injeção, mais rapidamente o fármaco entrará na circulação
sangüínea (KWAN, 1989).
18
3.1.4 VIA INTRADÉRMICA
A injeção intradérmica pode ser aplicada na face anterior do braço. Os
produtos administrados por essa via são geralmente para determinar diagnósticos,
sensibilização ou imunização (AKERS; WRIGHT; CARLSON, 1991).
Emprega-se a agulha curta (0,95 cm) e de calibre fino (23 a 26). Esta agulha é
inserida horizontalmente na pele com o bisel voltado para cima. A injeção é feita
quando o bisel desaparece no cório e, em geral, só 0,1 ml pode ser administrado
dessa maneira (ERSTAD; MEEKS, 1993).
3.2 TIPOS OFICIAIS DE INJETÁVEIS
Para preparar um medicamento para uso parenteral, deve-se levar em
consideração a natureza, os aspectos físicos e químicos e a eficácia terapêutica
deste. De acordo com ANSEL, POPOVICH e LOYD, (2000), existem cinco tipos de
injetáveis:
• Medicamentos, soluções ou emulsões adequados para injeção, com rótulos do
tipo “Injeção______”. Ex: Injeção de Insulina, United States Pharmacopeia (USP).
• Sólidos secos ou líquidos concentrados, que não contenham tampões, diluentes
ou outras substâncias que, com a adição de solventes, produzam soluções que
se adequam em todos os aspectos às exigências para injeções, e que se
distinguem por rótulos do tipo “_____ Estéril”. (Ex: Ampicilina Sódica Estéril,
USP).
• Algumas preparações, exceto por conterem um ou mais tampões, diluentes ou
outros componentes, se distinguem por rótulos do tipo “ ______ para Injeção”.
(Ex: Meticilina Sódica para Injeção, USP).
• Sólidos suspensos em meio líquido adequado e que não devem ser injetados por
via intravenosa ou no canal vertebral e que se distinguem por rótulos do tipo
“Suspensão ______ Estéril”. (Ex: Suspensão de Acetato de Dexametasona
Estéril, USP).
19
• Sólidos secos que, com a adição de veículos adequados, geram preparações
que se conformam sob todos os aspectos às exigências para Suspensões
Estéreis, e que se distinguem por rótulos do tipo “______ Estéril para
Suspensão“. (Ex: Ampicilina Estéril para Suspensão, USP).
Se um fármaco for instável em solução, pode ser preparado como um pó seco
que poderá ser reconstituído com o solvente adequado no momento da
administração ou ser preparado como suspensão de partículas em veículo no qual o
fármaco seja insolúvel. Se o fármaco for instável na presença de água, esse
solvente será substituído por outro, parcialmente ou totalmente, no qual o fármaco
seja insolúvel (BUTLER; MUNSON; DELUCA, 1980).
O início e a duração da ação de um fármaco podem ser controlados, em certa
medida, pela forma química do fármaco, pelo estado físico do injetável e pelo veículo
empregado. É desejável uma ação prolongada do fármaco para reduzir a
necessidade de injeções frequentes e repetidas (KWAN, 1989).
3.3 SOLVENTES E VEÍCULOS PARA INJETÁVEIS
O solvente mais utilizado é a Água Estéril para Injeção, USP (pois esta é
purificada por destilação ou por osmose reversa). Não precisa ser estéril, mas
necessita ser livre de pirogênios. A Água Bacteriostática para Injeção USP, é a água
estéril para injeção que contém um ou mais agentes antimicrobianos (CRAWFORD;
NARDUCCI; AUGUSTINE, 1991).
A presença do agente antimicrobiano faz com que a água seja usada apenas
para administração parenteral de pequeno volume, pois, para grandes volumes, tem
a presença de muitos agentes antimicrobianos e que talvez sejam tóxicos para esse
tipo de administração (ANSEL; POPOVICH; LOYD, 2000).
Os veículos selecionados não devem ser irritantes, nem tóxicos nas
quantidades administradas, e não sensibilizantes. As propriedades físicas e
químicas devem ser levadas em consideração e devem ser avaliadas, como nos
solventes. Alguns aspectos que podem ser levados em consideração, são
20
estabilidade física e química, viscosidade, fluidez, temperatura, miscibilidade em
líquidos corporais, facilidade de purificação e padronização (KWAN, 1989).
3.4 PREPARAÇÃO INDUSTRIAL DE PRODUTOS PARENTERAIS
A endotoxina bacteriana foi aprovada para teste em produtos humanos
parenterais em 1980 nos Estados Unidos e foi seguida por outras nações
(YAMAMOTO et al, 2000).
Em indústrias, para manipulação de tais produtos, a área deve ser mantida
livre de bactérias através de luzes ultravioletas, ar filtrado, fabricação estéril e roupas
esterilizadas para as pessoas que trabalham na área. As matérias-primas
necessárias são dissolvidas de acordo com as Boas Práticas de Fabricação (BPF)
de água para injeção (CRAWFORD; NARDUCCI; AUGUSTINE, 1991).
As soluções são passadas por um filtro de membrana para ficarem limpas.
Após a filtração, as soluções devem ser passadas com o maior cuidado e
assiduidade possíveis para os recipientes adequados. Depois destes processos, o
produto é esterilizado em autoclave e, então, é feito o teste de esterilidade e
pirogênios (BOMMER; RITZ, 1987).
É necessário que todas as técnicas para preparação de produtos parenterais
sejam assépticas, para evitar qualquer tipo de contaminação cruzada (AKERS;
WRIGHT; CARLSON, 1991).
4. HISTÓRIA DO PIROGÊNIO O conhecimento científico do pirogênio existe há 50 anos, aproximadamente,
mas o conhecimento da febre, suas causas, mecanismos e efeitos, já existe a
aproximadamente 2.000 anos. Anteriormente, a febre era vista por médicos gregos
como um mecanismo terapêutico, e essa idéia durou séculos. Como etapa seguinte,
algumas preparações altamente pirogênicas eram feitas de células mortas de
Salmonella typhi e usadas como vacina (BUSSEY; TSUJI, 1984).
21
No começo do século XIX, dois farmacêuticos franceses isolaram um
antipirético: a quinina. Um professor dinamarquês de fisiologia, Panum, estudou
sobre a elevação térmica, e concluiu que a substância indutora da febre era
termoestável, diferente de bactérias vivas, sendo que poucos miligramas, quando
injetados por via intravenosa, induziam a febre elevada (apud RUSH et al, 1988).
O primeiro investigador a usar o termo pyrogen ou pirogênio para descrever o
princípio promotor da febre foi Billbroth. Os termos pyrogen e “substância pirogênica”
também foram usados por outros autores, como Burdon-Sanderson. Estes
escreveram sobre o processo da febre como originada de um agente exógeno
(bactéria), ou de origem endógena (célula do hospedeiro) (apud ISMAIEL; BECKER;
HAKIM, 1996).
No século XIX, Centanni realizou alguns estudos quanto aos agentes
responsáveis pela febre e descreveu o procedimento para isolamento da toxina
bacteriana responsável pela febre. Ele reconheceu a relação causa-efeito entre a
endotoxina (pirotoxina) e a febre. Logo depois, microbiologistas perceberam que as
endotoxinas eram encontradas em várias bactérias. Isto se deu graças à descoberta
de Gram, em 1884. Os investigadores logo perceberam que as endotoxinas estavam
associadas exclusivamente às bactérias Gram negativas (apud PEARSON, 1985).
Algumas injeções vinham acompanhadas da febre e efeitos colaterais através
da administração parenteral de agentes terapêuticos. A esterilização térmica ou
filtração não eram suficientes para eliminar as bactérias, não eliminando assim, a
pirogenicidade das preparações. Pesquisadores planejaram e padronizaram o teste
de pirogênio em coelhos, classificando as bactérias em pirogênicas e não
pirogênicas e concluíram que uma certa substância termoestável era a possível
causadora da febre de injeção (DABBAH et al, 1980).
Shear e Turner foram os que isolaram uma certa preparação de endotoxina
de Serratia marcescens, pois apresentava toxicidade, pirogenicidade e composições
iguais às encontradas por outros autores. Eles foram os primeiros a usar o termo
lipopolissacarídeo ao extrato da endotoxina. Westphal e outros colaboradores
utilizaram aproximadamente 20 anos de seus trabalhos para mostrar que a porção
lipídica do LPS (lipopolissacarídeo) é responsável por reações induzidas pela
endotoxina (apud PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
22
5. PIROGÊNIOS E SUAS FONTES
Os pirogênios são heterogêneos e apresentam composição e estrutura
variável que influenciam os efeitos biológicos como febre, mudança no quadro
leucocitário e choque séptico (HENDERSON et al, 1996; RIETSCHEL et al, 1994).
Formas farmacêuticas para uso parenteral, devem ser livres de pirogênio, que
podem ser originados da parede de bactérias Gram negativas, Gram positivas, vírus
ou fungos (BARTH et al, 2007).
O pirogênio pode estar presente em injetáveis (intramuscular e endovenoso),
correlatos ligados a injetáveis e qualquer produto implantado (fluidos para perfusão e
infusão). A origem dos pirogênios nos injetáveis, pode estar associada ao ambiente,
a matéria-prima, ao material de acondicionamento, ao operador ou ao tempo total
até a esterilização (ELISSON, 2000).
Existem várias produtoras de substâncias pirogênicas, como: cepas de
Estreptococos sp, que é uma exotoxina; o Mycobacterium tuberculosis;
enterotoxinas do Staphylococcus aureus; Vírus e Fungos (DING; HO, 2001).
6. PIROGÊNIO ENDÓGENO E O MECANISMO DA FEBRE
Existem duas classes de pirogênios: os exógenos e os endógenos. Os
exógenos são originados fora do corpo e levam a elevações térmicas ao serem
injetados no homem ou no animal. A endotoxina, (LPS), é a de maior importância,
mas existem outros produtos, que induzem, também, elevações de temperatura
quando injetados. Existem diversas fontes de origem exógena, dentre elas pode-se
citar: a bacteriana, fungos, vírus, componentes de bactéria Gram negativa e Gram
positiva (BOMMER; RITZ, 1987).
A outra classe de pirogênios é a endógena, onde o pirogênio endógeno é
produzido internamente pelo hospedeiro como resposta ao estímulo de pirogênios
exógenos. Este pirogênio é constituído de substância homogênea, que é sintetizada
por diferentes células do hospedeiro assim que é exposta ao pirogênio exógeno. É
considerado o mediador da febre. As moléculas de pirogênio endógeno possuem
23
alto peso molecular, e, apesar de ter estrutura química diferenciada para sua
espécie, não tem como habilidade produzir febre (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
As reações pirogênicas são caracterizadas por frio, febre e hipotensão. São a
segunda razão do desvio de infecções na admissão de pacientes no hospital. As
causas das reações foram traçadas pelo aumento da contaminação da endotoxina
na água utilizada para preparação de injetáveis (HINDMAN et al, 1975).
A febre é definida como a alta temperatura oral desenvolvida durante as
diálises, não estando presente no início do processo. Todas as amostras são
processadas para determinação da endotoxina e bactérias (RAIJ; SHAPIRO;
MICHAEL, 1973).
7. ENDOTOXINAS Endotoxinas constituem o maior composto lipídico da membrana externa de
bactérias Gram negativas. Tanto a endotoxina quanto seus fragmentos são muito
estáveis. Processos muito utilizados como autoclave e estufa não as retiram de
superfícies e soluções, sendo então necessária a utilização de bases ou ácidos
fortes ou um processo de pirólise para degradação da mesma (SANTOS et al, 2000).
As endotoxinas, por sua vez, são consideradas fontes de muita importância
na indústria farmacêutica, tendo alto peso molecular, associadas à membrana
externa que envolve a parede celular da bactéria Gram negativa. Quando não
purificadas, possuem lípides, carboidratos e proteínas e quando purificadas, são
consideradas lipopolissacarídeos (LPS) (BARTH et al, 2007).
Elas são termoestáveis e inativadas por grandes ciclos de calor seco,
condições alcalinas/ ácidas e polimixina B. Inicialmente, a endotoxina foi
reconhecida como causadora da febre e recentemente por ter ações biológicas de
grande espectro, que estão associadas à porção lipídica da molécula. A porção
central é homogênea entre várias espécies, auxiliando na dispersão da molécula e
funcionando, de uma forma indireta, para ação biológica. Suas características
tornam sua detecção e eliminação um considerável desafio ao produtor de
parenterais de artigos relacionados à administração ou próteses (PINTO; KANEKO;
OHARA, 2003).
24
A atividade biológica da endotoxina está associada com o lipopolissacarídeo
(LPS). A toxicidade está associada a um componente lipídico (lipídio A) e a
imunogenicidade está associada com os componentes do polissacarídeo. As
paredes das células antígenas (antígenos O) da bactéria Gram negativa são
componentes do LPS. Comparando-se com a classe da exotoxina da bactéria, as
endotoxinas são menos potentes e menos específicas em suas ações, desde que
elas não tenham ação enzimática (RUMP et al, 1993).
As endotoxinas são mais estáveis (mesmo fervendo por 30 minutos não são
desestabilizadas), mas certamente o poder dos agentes de oxidação (peróxido,
superóxido e hipoclorito) têm sido utilizados para neutralizá-las (ISMAIEL; BECKER;
HAKIM, 1996).
Figura 3: Estrutura da Endotoxina Bacteriana
Fonte: GIROIR, 1993.
A eliminação das endotoxinas dos produtos parenterais poderia ser enfatizada
no futuro avanço tecnológico desses produtos (RAIJ; SHAPIRO; MICHAEL, 1973).
A Interleucina-1 é produzida pelas células mononucleares humanas (MNC)
quando induzidas pela Endotoxina. Esta Interleucina-1 tem vários efeitos biológicos,
dentre eles, pode-se destacar: febre, neutrofilia (ação na medula óssea), proliferação
25
de colágeno (estímulo de fibroblastos), liberação de aminoácidos de músculos, a
produção de IL-2 (para devida ação nas células T), e produção de anticorpos (ação
nas células B) (DINARELLO, 1989).
7.1 LIPOPOLISSACARÍDEO
O lipopolissacarídeo (endotoxina) é liberado da parede das bactérias Gram
negativas (HINDMAN et al, 1975).
Consiste no lipídeo A (endotoxina), ao qual estão ligadas duas regiões de
natureza polissacarídica, respectivamente o “core” e as cadeias laterais. O
lipopolissacarídeo (LPS) tem alto fator de virulência, com efeitos biológicos,
resultando na amplificação de reações inflamatórias (GAZENFIELD-GRAZIT;
ELIAHOU, 1969).
Esta endotoxina é um antígeno fraco não específico e é pobre em anticorpos,
ativando a cascata do complemento. Essa ativação faz com que se formem as
cininas, que é outro importante mediador da inflamação (HARDING et al, 1990).
O LPS induz os macrófagos a secretarem outras proteínas (interleucinas,
fator alfa de necrose tumoral, oxigênio reativo, nitrogênio quaternário, intérferon),
além de plaquetas, mastócitos, basófilos e células endoteliais. Pequenas
quantidades de endotoxinas induzem a resposta inflamatória periapical. A
multiplicidade de achados com endotoxinas é o fruto da variabilidade genética do
LPS de diversos microrganismos (ROSLANSKY; DAWSON; NOVITSKY, 1990).
O papel do LPS em outras membranas da bactéria Gram negativa é atuar
como barreira de permeabilidade. A outra membrana é impermeável para grandes
moléculas e componentes hidrofóbicos do ambiente (DING; HO, 2001).
26
Figura 4: O Lipopolissacarídeo encontrado na membrana externa das bactérias
Gram negativas
Fonte: MADIGAN, 2003.
7.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA
As endotoxinas exercem seu efeito quando bactérias Gram negativas morrem
e suas membranas celulares sofrem lise, liberando as endotoxinas, induzindo a
resposta pirogênica (febre). As endotoxinas, portanto, são formadas pelo núcleo
polissacarídico que liga a cadeia O-antigênica e a unidade lipídica A (parte interna)
que, por sua vez, é responsável pelas propriedades pirogênicas encontradas em
produtos injetáveis e de uso veterinário (BUTLER; MUNSON; DELUCA, 1980).
O lipídio A é composto de um dissacarídeo de glucosamina, que pode ser
substituído por ácidos graxos de cadeia longa e grupamentos amida e éster. Este
ácido graxo tem cadeia de 14 carbonos, e, quando ligados aos ésteres, são mais
variáveis. O lipídeo A é ligado a um núcleo de heteropolissacarídeos, um açúcar
ácido de 8 carbonos, de exclusividade do LPS bacteriano. Essa porção pode ser
chamada de cadeia central e tem como função ser transportadora de soluto no meio
aquoso para porção lipídica. Muitos açúcares e derivados são encontrados nas
cadeias O-específica e são de exclusividade do LPS (PINTO; KANEKO; OHARA,
2003).
27
7.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA
Muitas atividades biológicas são atribuídas ao lipídeo A da endotoxina, e as
principais atividades biológicas, podem ser demonstradas: pirogenicidade, toxicidade
letal, leucopenia seguida de leucocitose, fenômeno de Shwartzman, necrose de
medula óssea, ativação do complemento, indução de tolerância a endotoxina,
gelificação do lisado de amebócito de Limulus (ADNER et al, 1991).
A pirogenicidade causada pelo lipídeo A quando se complexa com albumina
de soro humano ou bovino, é semelhante àquela de endotoxina intacta, conforme
testes em coelhos. A injeção intravenosa em coelhos, de 0,01 mg, leva a uma
resposta de pico bifásico da febre, depois de 1 a 3 horas de inoculação (BUSSEY;
TSUJI, 1984).
A indução da febre envolve o processo de fagocitose do lipídeo A,
produzindo, assim, o pirogênio endógeno, que por sua vez, atravessa a Barreira
Hematencefálica, alterando pontos de equilíbrio dos neurônios reguladores de
temperatura do hipotálamo anterior. Os ratos e camundongos apresentam uma
resposta febril diferente de outros animais e humanos, após administração
parenteral da endotoxina (DANNER et al, 1990).
O sistema termorregulador dos ratos é capaz de responder ao lipídeo A,
quando se usa o recurso de injeção direta nos ventrículos cerebrais, promovendo a
febre. Esse aumento de temperatura se dá pelo efeito tóxico do lipídeo A sobre os
vasos da pele (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
7.4 NÍVEIS PIROGÊNICOS
Os níveis pirogênicos tornam-se muito importantes no que diz respeito à
liberação de produtos na área farmacêutica. Foi estabelecido um limite de 50 pg/ mL
para a devida liberação desses produtos, mas houve proposta de redução para 35
pg/ mL. O limite aceitável para soluções parenterais é de 100 pg/ mL e, assim, pode-
se ter uma boa segurança para o teste em coelhos. Os níveis de endotoxina não
foram estabelecidos quando se iniciou o teste em coelhos (MAN et al, 1988).
28
Apenas em 1956 que se estabeleceu um limite após alguns pesquisadores
estudarem como era importante a determinação da sensibilidade em coelhos e
humanos a diferentes endotoxinas, para que o medicamento parenteral possa ser
usado. Os níveis aceitáveis para coelhos e humanos são: 0,1 e 0,14 ng/ Kg para S.
thypi, 1,0 ng/Kg para E. coli e de 50 a 70 ng/Kg para Pseudomonas sp (DABBAH et
al, 1980).
A pirogenicidade pode depender ou não tanto da endotoxina como do nível
de dose. Conclui-se que o limite razoável seria 0,1 ng/ ml, pois estaria acima do
menor limite de confiança, sendo considerado o “padrão de referência de atividade
pirogênica” e seria comparado com o teste de endotoxina in vitro (PINTO; KANEKO;
OHARA, 2003).
8. PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO Os pirogênios podem ser muito difíceis de serem removidos da solução, pois
têm pesos moleculares bem distintos e sua estabilidade e pH são facilmente
alterados (PEARSON, 1985).
Assim sendo, existem dois métodos para despirogenização: pela inativação
das endotoxinas, através da detoxificação da molécula de LPS por tratamentos
químicos ou pela remoção das endotoxinas, que pode ocorrer de várias formas,
dependendo das características físicas da endotoxina. Os métodos de
despirogenização variam muito, dependendo de cada situação (DING; HO, 2001).
Existem outros métodos que podem despirogenizar os produtos, baseando-se
nas características físicas da endotoxina (tamanho, peso molecular, carga
eletrostática, e diferentes superfícies) (BOOMER; RITZ, 1987).
29
8.1 DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DA ENDOTOXINA 8.1.1 HIDRÓLISE ÁCIDO-BASE
Por esse método, reduz-se ou elimina-se a atividade biológica de LPS,
desativando o lipídeo A, presente no LPS bacteriano. A hidrólise ácida age na
ligação cetosídica lábil, separando o lipídio A do restante da molécula do
lipopolissacarídeo, sendo incapaz de ligar-se nas células endoteliais, submetendo-se
a inativação (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
Esta hidrólise também pode apenas agir sobre uma fração do lipídeo A,
alterando, assim, a conformação da molécula em sítios funcionais essenciais, ou
simplesmente, clivando ácidos graxos, afetando a solubilidade e pirogenicidade do
lipídeo (DING; HO, 2001).
A hidrólise ácido-base pode desnaturar uma proteína alvo, sendo imprópria
quando purifica uma proteína (ISMAIEL; BECKER; HAKIM, 1996).
8.1.2 OXIDAÇÃO Este método utiliza o peróxido de hidrogênio para destruição de pirogênios na
solução. O mecanismo desta destruição é desconhecido, mas o peróxido de
hidrogênio pode remover facilmente o pirogênio do processo de purificação
(BOMMER; RITZ, 1987).
Inicialmente, percebeu-se a inativação oxidativa da endotoxina observando-se
a perda da capacidade de produzir febre quando entram em contato com peróxido
de hidrogênio. Este é fundamental na eliminação de pirogênio na água estéril- USP
(PEARSON, 1985).
A inativação por este método depende da concentração, do pH e do tempo. É
facilmente eliminado da solução e inativa endotoxinas em condições não extremas à
5%. Além de ser um agente oxidativo muito importante na degradação de solutos e
soluções, fornece vantagens em aplicações específicas. Existem outros agentes
oxidantes a serem citados, como por exemplo, ácido hipoclorito, ácido periódico,
30
permanganato de potássio diluído, neutro, ácido nítrico, dicromato e dióxido de
selênio (SILVEIRA et al, 2004).
8.1.3 ALQUILAÇÃO A alquilação ocorre por substituição eletrofílica na ligação glucosamina no
lipídeo A ou na etanolamina do núcleo. Através deste método, ocorre redução de
atividade, observando-se resultados satisfatórios, com redução de 100 a 1000
vezes, quando se usa anidrido acético e succínico. Além destes, um outro agente
alquilante utilizado seria o óxido de etileno, pois também gerou resultados bons,
considerando sua eficácia na destruição das endotoxinas (PINTO; KANEKO;
OHARA, 2003).
Este tipo de esterilização é usada para materiais que são sensíveis ao calor e
à umidade (como, por exemplo, materiais médicos e cirúrgicos, cateteres, agulhas,
seringas descartáveis na embalagem plástica), além de outras preparações
termolábeis, como antibióticos e outros medicamentos. O óxido de etileno ou gás de
óxido de propileno são gases inflamáveis, que se diluídos com o gás inerte
adequado, podem ser empregados com total segurança. Para este processo de
esterilização, utiliza-se um equipamento especializado igual à autoclave (ANSEL;
POPOVICH; LOYD, 2000).
Vários estudos devem ser feitos para conhecer o nível de atividade deste
agente frente a quantidades de endotoxina, pois o processo é compatível com
materiais termolábeis usados na fabricação de produtos médico-hospitalares
(PINTO, 2005).
31
8.1.4 PROCESSO TÉRMICO 8.1.4.1 TRATAMENTO POR CALOR SECO
A busca por solventes ativos fluorados, obriga a desenvolvimentos de
processos aplicáveis à fabricação de produtos médico-hospitalares. A perspectiva do
uso do peróxido de hidrogênio para devida inativação de endotoxinas motivou a
consideração do processo sem permanência do próprio agente oxidante (PINTO,
2005).
O tratamento por calor seco é realizado em estufas específicas para este fim,
que funcionam com gás ou eletricidade, controladas por termostato. Este tratamento
é considerado menos eficaz para matar microrganismos do que o calor úmido, pois
utiliza altas temperaturas por períodos mais longos (ANSEL; POPOVICH; LOYD,
2000).
Este método é utilizado para materiais termoresistentes, principalmente
frascos de vidro e instrumentos metálicos. Os materiais são submetidos a
temperaturas maiores que 250 ºC por mais de 30 minutos, para devida incineração e
inativação. O LPS apresenta duas vezes mais resistência térmica ao se comparar
com a endotoxina ativa da qual foi derivada. Quando a exposição é menor do que a
citada anteriormente, não ocorre a redução do LPS e não se destrói as bactérias
Gram intactas (BOOMER; RITZ, 1987).
Vários parâmetros devem ser levados em consideração para
despirogenização por calor seco: bioburden, pyroburden, desafios biológicos,
posicionamento de registradores de temperatura, tempo de ciclo, perfil de
penetração de temperatura e velocidade da esteira no caso de túneis. Ás vezes, a
autoclavação não é suficiente para a destruição das endotoxinas, portanto, a ação
oxidante do peróxido de hidrogênio e a adsorção em carvão ativo são
potencializadas por esse método. Apesar das endotoxinas serem termo-resistentes,
quando se submetem a essa alta temperatura, resultam na diminuição de 3 log no
nível de endotoxina (DING; HO, 2001).
32
8.1.5 RADIAÇÃO IONIZANTE
Esse método consiste em reduzir a toxicidade das endotoxinas (alterações
físicas e biológicas) e aumenta a chance de alterações químicas de fármacos e
soluções parenterais. Alguns riscos de toxicidade superam o que é benéfico com
relação às propriedades do método (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
A radiação aplicada em produtos farmacêuticos altera as substâncias
presentes nos microrganismos ou as que os protegem. A destruição celular, que é
irreversível e completa, ocorre através de uma combinação de efeitos da radiação
(ANSEL; POPOVICH; LOYD, 2000).
8.1.6 POLIMIXINA B A polimixina B pode anular a atividade biológica do lipopolissacarídeo,
inativando-o (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
Deve-se tomar cuidado na interpretação dos resultados envolvendo esta
inativação, até que outros estudos sejam feitos para maior conhecimento a respeito
desta (DING; HO, 2001).
8.2 DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DAS ENDOTOXINAS 8.2.1 LAVAGEM
A lavagem é um método bem antigo e mais simples para remover endotoxinas
de superfícies sólidas. Esse método geralmente acontece com uso da Água Estéril
para Injeção USP (AKERS; WRIGHT; CARLSON, 1991). Pequenas quantidades de
endotoxina podem ser retiradas de vidrarias, tampas e dispositivos de acordo com
procedimento correto de lavagem (HARDING et al, 1990).
A lavagem com água pode ser monitorada durante o processo com o teste
LAL, para validar a remoção de endotoxinas (HANSON, 1992).
33
8.2.2 DESTILAÇÃO Esse método é o mais antigo, mas não o menos efetivo com relação à retirada
de pirogênio da água. Essa água passa por duas variações de fase: de líquida para
vapor e de vapor para líquida. Na primeira fase, ocorre uma fervura rápida levando
ao vapor de água, enquanto o LPS mantém-se no estado líquido. Se houverem
umas dessas moléculas de LPS no estado de vapor, com a força da gravidade elas
tendem a cair, pois tem alto peso molecular (ISMAIEL; BECKER; HAKIM, 1996).
A destilação é usada para grandes pesos moleculares e na estabilidade das
endotoxinas. Os baixos pesos moleculares presentes em soluções podem ser
purificados pela fervura e condensação em forma de vapor (BUTLER; MUNSON;
DELUCA, 1980).
As grandes moléculas de lipopolisacarídeos não são facilmente vaporizadas.
Este é um método de escolha para purificação da água (BOOMER; RITZ, 1987).
8.2.3 ULTRAFILTRAÇÃO Esse método ocorre por exclusão de peso molecular e é um método
considerado efetivo como filtro despirogenizante. Portanto, as endotoxinas que
excedem o peso molecular, são retidas na superfície da membrana. A ultrafiltração é
muito utilizada para remoção de pirogênios também em fármacos e soluções de
baixo a médio peso molecular (GAZENFIELD-GRAZIT; ELIAHOU, 1969).
Se a solução tiver alto peso molecular, também pode ser ultrafiltrada e com
resultados eficazes utilizando-se a desagregação das endotoxinas empregando-se
tensoativos ou agentes alquilantes (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
Normalmente, o peso molecular das endotoxinas são 10 kD, portanto, às
vezes este método pode servir como base para separação de tamanho. Pode ser
difícil de selecionar a membrana correta e por esta razão, o método é apenas usado
quando todas endotoxinas presentes são maiores do que 300.000 Da (YAMAMOTO
et al, 2000).
34
8.2.4 OSMOSE REVERSA
O sistema de osmose reversa é utilizado principalmente no tratamento da
água, sendo considerada a solução do problema da presença da endotoxina para
preparar fluidos parenterais (HINDMAN et al, 1975).
A Osmose Reversa aplica o princípio da pressão hidrostática elevada, através
da membrana semipermeável para preparar a solução purificada (ISMAIEL;
BECKER; HAKIM, 1996).
Para esse método, utiliza-se membrana de acetato de celulose ou poliamida,
com pequenos poros para exclusão de íons. Membranas convencionais são
utilizadas para remover endotoxinas por exclusão de tamanho, já que os poros não
permitem a passagem de pirogênios (MAN et al, 1988).
Na despirogenização não é muito efetivo, pois moléculas distintas e pequenas
da água passam através desses poros, mas são muito utilizados para remover
endotoxina da água. Essas membranas retém 99,5% a 99,9%dos pirogênios. Por
isso, além da destilação, a osmose reversa também é um método reconhecido pela
USP (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
8.2.5 CARVÃO ATIVO
Esse processo consiste na adição do carvão à solução e, após agitação, esta
é filtrada ou precipitada para remoção do carvão (DING; HO, 2001).
O carvão ativo tem grande afinidade por substâncias não ionizadas de alto
peso molecular, podendo ser usado em várias faixas de pH (KWAN, 1989).
Existe uma limitação adicional encontrada na remoção dos traços de carvão,
que é contornada com o uso de carvão sinterizado (BUTLER; MUNSON; DELUCA,
1980).
35
8.2.6 ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA As fibras finas, juntamente a atração eletrostática, atuam como eficiente filtro
de profundidade. Através dos profundos poros, ocorre a retenção de partículas por
ação mecânica (DING; HO, 2001).
As endotoxinas negativamente carregadas são adsorvidas por membranas
revestidas por poliamida ou por amina covalente (DABBAH et al, 1980). Para
soluções farmacêuticas, utilizam-se membranas com potencial negativo para devida
despirogenização (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
8.2.7 ATRAÇÃO POR MEMBRANA HIDRÓFOBA
A endotoxina tem afinidade por alguns polímeros através dos grupos hidrófilos
ionizáveis presentes nestes. Alguns destes polímeros são: polímeros alifáticos,
polipropileno, polietileno, polifluoreto de vinilideno e politetrafluoretileno (ELISSON,
2000).
Ocorre então um processo de filtração em membrana, permitindo a retenção
de 10 microgramas de LPS por centímetro quadrado da área filtrada (HARDING et
al, 1990).
Estudos demonstraram que o mecanismo de ação sugeriu que interações
iônicas e hidrófobas contribuíram para adsorção da endotoxina (HINDMAN et al,
1975).
8.3 OBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÊNICOS
Para cada produto, deve-se verificar um tipo de despirogenização, seja ele
por remoção ou por inativação de endotoxinas, pois cada um deles tem um tipo de
natureza diferente. Devem-se manter as normas de higiene no local produtivo, para
que se consiga o produto apirogênico desde o início do processo, sem se preocupar
com maiores tratamentos (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
36
Todas etapas críticas devem ser monitoradas e devem-se validar
periodicamente estufas ou túneis de despirogenização (DING; HO, 2001).
As monitorações de processo (como matérias-primas), devem empregar
técnicas analíticas validadas, com metodologia clássica utilizando coelhos ou
diferentes métodos empregando a técnica in vitro do LAL (ADNER et al, 1991).
9. O TESTE DO PIROGÊNIO
O teste de pirogênio determina a presença de endotoxinas bacterianas que
podem estar presentes em injetáveis (intramuscular e endovenoso); em correlatos
ligados a injetáveis ou em qualquer produto implantado, fluídos para perfusão e
infusão (CRAWFORD; NARDUCCI; AUGUSTINE, 1991). Este teste é obrigatório
para produtos injetáveis e determinam, em níveis aceitáveis, os riscos de uma
possível ação febril em pacientes receptadores do produto injetado (ANDRADE et al,
2003).
Os testes da hipertermia realizado em coelhos (teste in vivo) e do LAL (teste
in vitro), são muito importantes para o devido controle de contaminantes pirogênicos
em produtos injetáveis e na validação de metodologias de investigação (BARTH et
al, 2007).
9.1 TESTE DE PIROGÊNIO POR MÉTODO in vivo
O método in vivo baseia-se na elevação da temperatura corporal de coelhos,
ao injetar a substância em análise. O teste só é aplicável onde não se tem
metodologia alternativa (F. BRAS., 1988). Para outros casos, o método utilizado é o
teste in vitro, pois gerou uma alta confiabilidade, apesar de ter limitações. O teste in
vivo envolve toda situação fisiológica do animal, assegurando a pureza dos produtos
injetáveis, líquidos para infusão e perfusão e correlatos, (PINTO; KANEKO; OHARA,
2003).
Até 25 anos atrás, a presença de endotoxina bacteriana (lipopolissacarídeo
bacteriano) em soluções parenterais e biológicas, era detectada pelo método in vivo,
37
mas, atualmente, este método foi substituído pelo método in vitro Gel-Clot (BUSSEY;
TSUJI, 1984).
A comprovação da apirogenicidade de produtos injetáveis já existe há mais de
50 anos (não se sabia, então, das composições das endotoxinas), mas já se
entendia sobre a alteração do sistema termoregulador do coelho, permitindo um
estudo para evitar o surgimento frequente de febre nos pacientes (DING; HO, 2001).
O método in vivo é considerado um teste limite, pois aprova ou reprova a
amostra (HINDMAN et al, 1975). Apesar das grandes transformações e evoluções
tecnológicas, ao lado de conhecimento cada vez maior no campo das ciências
biológicas, pode-se dizer que o método in vivo não tem modificações profundas,
longe de se constituir em determinação quantitativa (LOURENÇO; KANEKO; PINTO,
2005).
9.2 FUNDAMENTO DO MÉTODO
O teste de pirogênios baseia-se no aumento da temperatura corporal dos
coelhos, após injetar intravenosamente a solução estéril que está sendo analisada
(10 ml por kg de peso), não ultrapassando 10 minutos (F. BRAS. 1988).
Algumas modificações, desde a oficialização do teste, foram feitas com
intenção de diminuir a variação biológica. Deve-se verificar a interpretação individual
dos resultados de cada coelho. Após receber a injeção intravenosa, observam-se os
coelhos durante um período de 3 horas para ver se houve alguma alteração na
temperatura (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
Ao analisar critérios de interpretação, a conceituação exata torna-se
necessária sobre a elevação térmica individual dos coelhos. Este valor é definido
como sendo a diferença entre a temperatura máxima após a injeção e a de controle,
devendo ser um valor positivo, e, nos casos negativos, considere-se zero (SILVEIRA
et al, 2004).
38
9.2.1 MODELO ANIMAL
O animal (coelho) deve pesar entre 1.5 e 4.0 Kg, podendo ser de ambos os
sexos, porém, não no mesmo teste. Os animais devem ser mantidos em temperatura
uniforme (+/- 22º C), sem perturbações e, uma semana antes do teste, os coelhos
devem iniciar exercícios de acondicionamento (F. BRAS., 1988).
Vários mamíferos foram testados para detectar substâncias pirogênicas, mas
o coelho foi o modelo animal escolhido por muitas razões, principalmente por ter o
sistema termoregulador semelhante ao do ser humano (existe também equivalência
entre as 2 espécies). Utilizam-se raças albinas, com orelhas bem desenvolvidas,
mas preferem-se outras raças como: a holandesa, que tem vantagens com relação
ao peso, mas como desvantagem, tem o pigmento da pele que dificulta a
visualização da veia e também tem as orelhas muito pequenas. Outras raças são a
Himalaia e a polaca (BARTH et al, 2007).
Pode haver alguma interferência com relação aos resultados falso-positivos
(os que não receberam treinamento ou os que descansaram por mais de 3
semanas). Para os animais que nunca receberam o treinamento, deve-se submeter
um teste parecido, mas sem injeção da amostra, podendo-se utilizar uma solução
fisiológica apirogênica. Se os períodos de descanso do animal forem respeitados (2
a 3 dias), o coelho pode ser reutilizado, se o produto que foi utilizado estava
apirogênico (HINDMAN et al, 1975).
No biotério de coelhos, a faixa de neutralidade térmica deve ser seguida (+/-
3ºC) e se o biotério estiver em manutenção por algum período, a quarentena é muito
importante, a fim de colocar animais externos para a realização dos testes (PINTO;
KANEKO; OHARA, 2003).
Seringas, agulhas e vidrarias utilizadas para o desenvolvimento do teste
devem ser despirogenizadas à 250ºC durante 30 minutos (F. BRAS. 1988).
Todo material que for utilizado para injeção intravenosa deve ser
despirogenizado ou pode-se trabalhar com material apirogênico descartável. Para
que este teste seja realizado, os coelhos devem estar sadios, sem maiores
problemas de infecção intestinal e bom condicionamento (BARTH et al, 2007).
O peso corporal é um item muito importante com relação à saúde do animal,
pois os que estão com menos peso corpóreo, podem estar apresentando um quadro
39
de doença respiratória ou até mesmo, intestinal. Portanto, deve-se certificar que
nenhum animal perdeu peso na semana que antecede a realização do teste
(DABBAH et al, 1980).
9.2.2 PROCEDIMENTO DO TESTE
Todos materiais usados para terapia parenteral (equipos de transfusão,
infusão, dispositivos implantáveis e injetáveis) devem oferecer alta segurança ao
paciente e sem contaminantes pirogênicos. Portanto, todos produtos injetáveis
necessitam ser testados (PEARSON, 1985).
Os injetáveis de grande volume possuem grande perigo de contaminação em
relação aos de pequeno volume. Dependendo do volume, há uma padronização de
dose para realização do teste (em injetáveis de grande volume, o valor da dose
estipulada é de 10 mL/ kg) (PINTO, 2005).
Para garantir a segurança do teste, deve-se dar uma dose maior no coelho
(maior que a terapêutica), pois, a dose mínima é idêntica no coelho e no homem.
Para realizar o teste num determinado grupo de animais, utiliza-se uma dose de 4-6
mL/ min, não ultrapassando 4 minutos (abre-se exceção para animais que possuem
mais de 3 kg, pois deve-se injetar uma dose de 10 mL/ kg). Algum produto contém
fármacos que alteram o sistema termo-regulador, inibindo o estado febril. Como
ocorrem reações tóxicas, pela presença do pirogênio, deve-se alertar com relação à
segurança do paciente (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
Deve-se tomar muito cuidado para não alterar a hipersensibilidade do animal
durante o manuseio. No dia do teste, não se devem fornecer alimentos, mas sim,
água em abundância. Cada animal, respeitando o período de descanso, deve ser
pesado e colocado em contentor (BARTH et al, 2007).
Inicialmente, pesam-se três coelhos (estes devem possuir pesos constantes).
Deve-se determinar a temperatura corporal 40-90 minutos antes da injeção (não é
aconselhável usar animais com temperatura maior que 39,8ºC). Prepara-se, então, a
amostra (aquecer a 37-38ºC). Injeta-se a solução (amostra) na veia marginal da
orelha dos três coelhos (essa injeção não dura mais de 10 minutos), registrando a
temperatura corporal por 3 horas. Deve-se ter, pelo menos, três determinações em
40
escalas de uma hora. Interpretam-se os dados experimentais, que podem ser:
apirogênico, pirogênico ou duvidoso (F. BRAS., 1988).
Figura 5: Coelho para execução do teste
Fonte: PESSOA, 2007.
9.2.3 CRITÉRIOS DE INTERPRETAÇÃO Cada temperatura registrada pelos coelhos é considerada sua resposta ao
teste (quando as temperaturas medidas após o teste forem menores que a
temperatura de controle, a resposta equivale à elevação de temperatura zero. Se
nenhum dos três coelhos apresentarem elevação de temperatura de 0,6ºC, o
produto cumpre os requisitos de ausência de pirogênio. Se algum coelho apresentar
aumento na temperatura de 0,6ºC ou mais, repetem-se os resultados usando outros
cinco animais (F. BRAS. 1988).
Cada amostra deve ser testada num grupo de 3 animais e os dados
experimentais devem ser verificados de acordo com a elevação da temperatura (a
soma das elevações térmicas, quando inferior a 1,15ºC, aprova a amostra como
apirogênica. Quando está com valor superior a 2,65ºC, está rejeitada). No Brasil, a
elevação de temperatura é de 1,1ºC, permitida para 1 dos 3 animais testados
(PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
41
Várias pesquisas visaram à comparação do método in vitro com a do animal,
então utilizaram grupos com 8 animais sem a fragmentação do teste em 3 a 5
coelhos. Valores cumulativos entre 3,7ºC e 4,0ºC têm grande probabilidade de
acusar resultado falso-negativo, o que foi verificado em estudos combinatórios da
temperatura (BARTH et al, 2007).
9.3 MÉTODOS NÃO OFICIAIS Juntamente com a padronização do teste para detecção de pirogênio, a
resposta está relacionada com as endotoxinas. Um dos métodos utilizados é o da
toxicidade de pirogênio bacteriano em embrião de galinha (que é susceptível à
endotoxina) (PEARSON, 1985).
Um parâmetro que pode ser aproveitado, mas que ainda não foi aplicado no
controle de qualidade de medicamentos, é a determinação dos níveis de leucopenia,
pois são dose-dependentes do pirogênio bacteriano (ROSLANSKY; DAWSON;
NOVITSKY, 1990).
A inversão da resposta imunológica não foi de aplicação para o controle de
medicamentos quanto à inocuidade por substâncias pirogênicas (DINARELLO,
1989).
10. TESTE DE ENDOTOXINA PELO MÉTODO in vitro
Desde 1885, Howell descreveu a coagulação do sangue do Limulus
polyphemus, o caranguejo em forma de ferradura de cavalo. Na década de 1950,
Bang descobriu que as bactérias Gram negativas causavam a coagulação do
sangue do Limulus. Em 1964, Levin e Bang determinaram que a reação é
enzimática, mostrando que a coagulação é iniciada por um componente estrutural
único da parede celular bacteriana denominado endotoxinas (apud PINTO;
KANEKO; OHARA, 2003).
Este método determina a presença de endotoxinas bacterianas (bioprodutos
causadores da febre provenientes de bactérias Gram negativas) e é obrigatório para
42
produtos injetáveis. Determinam, em limites aceitáveis, os riscos de uma ação febril,
em paciente receptador do produto injetado. Para execução deste tipo de teste, usa-
se um derivado do lisado de amebócitos do caranguejo Limulus polyphemus (LAL).
O teste pode apresentar resultados falso- negativos ou falso- positivos em produtos,
antibióticos e vacinas virais (SANTOS et al, 2000).
O método se baseia na reação entre a endotoxina e um componente protéico
do LAL. Esse método “in vitro”, começou com os trabalhos de Frederik Bong, na
Universidade Jonh Hopkins, que observou a reação de coagulação intravascular
causada por bactérias em caranguejos de espécie Limulus polyphemus. Assim, o
cientista descobriu que o fenômeno de coagulação estava nos amebócitos ou
células sanguíneas circulantes do caranguejo, e que a endotoxina produzia uma
reação de gelificação com o lisado obtido desses amebócitos por processo
enzimático (apud ADNER et al, 1991).
A endotoxina juntamente com cátions divalentes ativam zimógenas de serina-
protease, encontrados em amebócitos, iniciando uma reação em cascata, alterando
uma proteína chamada coagulágeno, levando à formação do gel proteináceo
(LOURENÇO; KANEKO; PINTO, 2005).
Um estudo feito em 1970 mostrou que o teste de LAL é mais sensível do que
os testes realizados em coelhos, pois a intensidade com que o gel é formado é
semelhante à concentração das endotoxinas (LEVIN; BANG, 1964).
43
Quadro 1: LAL e a formação de coágulo (reação positiva) na presença de
Endotoxina, (BIERNAT, 2005).
10.1 MECANISMO DE REAÇÃO
A ativação pela endotoxina de enzimas de alto peso molecular é o resultado
da reação: Esta endotoxina, no final do teste de LAL, faz com que ocorra a
gelificação de proteínas coaguláveis de baixo peso molecular (PINTO; KANEKO;
OHARA, 2003). A reação do LAL requer um pH neutro e é dependente do tempo, da
temperatura e concentração da endotoxina (UNITED, 2004).
O mecanismo baseia-se na observação de que a endotoxina induz a
gelificação do lisado obtido dos amebócitos de ferradura de cavalo, Limulus
polyphemus. A possibilidade é de que o teste de “Limulus” poderia ser positivo na
presença de outras substâncias em que a endotoxina não tem sido absolutamente
excluída (RAIJ; SHAPIRO; MICHAEL, 1973).
Entende-se que, quando há formação de gel, ocorre uma reação típica de
teste positivo (reação de cascata em enzimas). Esta reação ocorre devido à
clivagem do coagulogênio (proteína de coagulação) através de uma enzima
44
coagulante ativada, ocorrendo clivagem de produtos insolúveis, que se ligam a
proteínas coagulantes, formando o gel característico do teste de LAL positivo
(SANTOS et al, 2000).
Figura 6: Reagentes utilizados para execução do LAL teste
Fonte: SANTOS et al, 2000a
10.2 PREPARAÇÃO DO LISADO DO AMEBÓCITO DE LIMULUS (LAL)
Submetem-se os caranguejos Limulus polyphemus à sangria, introduzindo
uma agulha estéril e apirogênica de 18 G no músculo entre as regiões cefalo-
torácica e abdominal. A mistura de N- etilmaleimida em 3% de cloreto de sódio
estabiliza a membrana do amebócito. Após centrifugação por 10 minutos desta
mistura, despreza-se o sobrenadante azul, que contém hemocianina. Lavam-se os
amebócitos em cloreto de sódio 3%, para retirada dos componentes do soro e dos
anticoagulantes (YAMAMOTO et al, 2000).
45
Figura 7: Limulus polyphemus
Fonte: VICTOR, 2007.
Ao adicionar água destilada apirogênica, ocorre choque osmótico e
consequente rompimento da membrana, para liberação do líquido intracelular. O
produto na forma aquosa é liofilizado, ficando estável à 4ºC por 3 anos, no mínimo
(PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
Uma das críticas feitas ao uso do LAL, para detecção de endotoxinas, foi a
variabilidade estação-a-estação e lote-a-lote. Pesquisas conduziram ao
desenvolvimento de um tratamento com clorofórmio, visando reduzi-la e aumentando
a sensibilidade. Mesmo utilizando íons bivalentes, a variabilidade não foi
influenciada, porém a sensibilidade do reagente foi aumentada (LOURENÇO;
KANEKO; PINTO, 2005).
10.3 PONTO FINAL DE GELIFICAÇÃO O método Gel-Clot é muito simples, econômico e mais sensível do que o teste
in vivo realizado em coelhos (BUSSEY; TSUJI, 1984). Um estudo feito em meados
do século 70 demonstrou que o teste de LAL é mais sensível que o ensaio feito em
coelhos e que a intensidade de formação do gel estava diretamente relacionada à
concentração da endotoxina (SANTOS et al, 2000).
46
É um método que consiste em transferir volumes iguais de reagente de lisado
e solução-teste (0,1 ml cada) para tubos de ensaio despirogenizados. Deve-se
homogeneizar a mistura e, em seguida, incubar na temperatura de 37ºC por uma
hora. Os tubos não podem ser manuseados, para não atrapalhar a gelificação
(ADNER et al, 1991).
Para verificação dos resultados, devem-se inverter os tubos num ângulo de
180 ºC: se o gel se manter firme no fundo do tubo durante a inversão, há presença
de endotoxina, portanto o teste é positivo. caso não haja formação do gel, significa
que não há presença de endotoxina, portanto o resultado é negativo (PINTO;
KANEKO; OHARA, 2003).
Figura 8: Leitura dos resultados a partir do coágulo branco formado no fundo do
tubo de ensaio
Fonte: SANTOS et al, 2000b.
10.4 ENSAIO LAL: APLICAÇÃO E EQUIVALÊNCIA
Desde os anos 70, o teste de LAL foi preferível para ser usado em
radiofármacos, após longos estudos. Portanto a aplicação deste também foi utilizada
em produtos biológicos, visando minimizar concentrações de endotoxina nos
47
produtos. Para o teste de equivalência, vários testes foram realizados usando
ensaios de endotoxina, deduzindo a equivalência do teste in vitro (LONNEMANN et
al, 1988).
Para estabelecer a equivalência ou superioridade do ensaio LAL para
endotoxinas, numerosos testes paralelos foram realizados utilizando-se, em ambos
os ensaios, níveis especificados de endotoxina, deduzindo a equivalência ou
superioridade do teste in vitro (SANTOS et al, 2000).
A aplicação se estende também à determinação do efeito de procedimento de
limpeza e outros nos níveis de endotoxinas, minimizando concentrações de
endotoxina nos produtos terminados. Estes limites de endotoxina situam-se bem
abaixo daqueles indutores de respostas pirogênicas no homem (RUSH et al, 1988).
11. MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DETECÇÃO DE ENDOTOXINAS 11.1 ENSAIO TURBIDIMÉTRICO
Este método tem uma considerável medida quantitativa da endotoxina, ao
contrário do ponto final de gelificação, que impede a quantificação da endotoxina a
níveis abaixo daqueles em que se forma o gel consistente (DING; HO, 2001). É um
método sofisticado, que exige equipamentos complexos, aumentando os custos de
execução (SANTOS et al, 2000).
Desde que os reagentes de LAL foram formulados para serem usados para
leituras turbidimétricas, tais testes podem ser usados se mostrados de acordo com
os requerimentos para métodos alternativos. Os procedimentos incluem incubação
para reação da endotoxina e controle de soluções com reagente de LAL e leitura em
espectrofotômetro de absorbância (UNITED, 2000).
48
11.2 MÉTODO COLORIMÉTRICO DE PROTEÍNA DE LOWRY
Este método quantitativo é considerado muito importante na detecção de
endotoxinas, baseando-se em concentrações crescentes de endotoxinas que são
proporcionais à proteína do reagente de LAL, formando coagulogênio (proteína
coagulante). O teste é semelhante ao da gelificação, mas a quantidade do lisado-
específico é determinado usando-se a proteína de Lowry (usa-se um
espectrofotômetro, com leitura à 660nm). Comparam-se os resultados com uma
curva padrão (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
É necessário que se acompanhe o ensaio com controles positivo e negativo,
para assegurar a não interferência de amostras e ausência de contaminantes
(SANTOS et al, 2000).
No método colorimétrico, a absorbância é medida durante todo o período da
reação e os valores da taxa são determinados naquelas leituras. A reação chega ao
seu final pela adição de um agente de enzimas finalizadoras de reações, antes das
leituras (UNITED, 2000).
11.3 MÉTODO NEFELOMÉTRICO
Este método tem sido pesquisado para detectar a presença do pirogênio em
parenterais de grande volume (CRAWFORD; NARDUCCI; AUGUSTINE, 1991). A
diferença deste para o método espectrofotométrico é que este usa um nefelômetro
(empregando-se a luz relativa dispersa) enquanto o outro método consiste em
utilizar a concentração da endotoxina para leitura da densidade óptica. Usa-se o
sulfato de dodecil sódico para finalizar a reação enzimática e como estabilizador da
suspensão, utiliza-se a Carboximetilcelulose (CMC). O teste de LAL é rápido sendo
finalizado em 1 hora (DING; HO, 2001).
O método pode ser automatizado, com resultados mais sensíveis que o
método cromogênico. Este método não tem sido aceito como promissor como o
método colorimétrico da proteína de Lowry (ADNER et al, 1991).
49
11.4 MÉTODO CROMOGÊNICO
O ensaio de LAL cromogênico foi otimizado usando um LAL reativo,
designado para o método Gel-Clot, e um substrato cromogênico. O procedimento
deste método envolve a incubação do LAL reativo e um padrão de endotoxina (ou
uma amostra), seguido de incubações subsequentes com o substrato cromogênico
(BUSSEY; TSUJI, 1984). Como no método turbidimétrico, este método consiste na
exigência de equipamentos complexos, pois é um método sofisticado, com
consequente aumento do custo (SANTOS et al, 2000).
Este é um método quantitativo e específico para enzima de coagulação
ativada. O teste requer mistura de 0,1 mL do LAL com 1,0 mL da amostra,
incubando-se por 8 minutos. Depois de devida incubação, adiciona-se 0,5 mL de
substrato cromogênico na solução e incuba-se novamente por 3 minutos. Para
finalizar a reação, utiliza-se 0,1 mL de ácido acético glacial em água, a 25% v/v e,
em espectrofotômetro, lê-se a densidade óptica (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
11.5 OUTROS MÉTODOS
Além do ensaio da microdiluição, ensaio de LAL e fluorescente, um outro
método utilizado é a automação, pois aplica-se o sistema semi-automático cinético
(onde utiliza-se placas, leitor tipo Elisa e Software específico), permitindo a análise
de 176 amostras por 1 hora. Este método é utilizado para parenterais de pequeno e
grande volume (PEARSON, 1985). Embora alguns fármacos não podem ser
testados por este método, a maioria não provocou alterações cinéticas significantes,
podendo ser ensaiada com ajuste de pH e diluições. A questão de custo, devido o
substrato cromogênico, assim como limitação de amostras opacas ou coloridas
tendem a deslocar vantagens ao método cinético turbidimétrico (DING; HO, 2001).
Outros métodos que podem ser citados são: a espectrometria de massa e o
radioimunoensaio (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
50
12. VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA “in vitro”
Esta validação tem como objetivo liberar o produto acabado, com base no
limite de endotoxinas e comprovando a sensibilidade do LAL (ADNER et al, 1991).
Os controles são necessários para que um teste seja validado, usando-se
controles positivos e negativos (em 2 tubos contendo Endotoxina (controle positivo),
adiciona-se a água e apirogênica (livre de pirogênio). Em 2 outros tubos sem
Endotoxina (controle negativo), em um deles adiciona-se água a ser testada e no
outro, adiciona-se água apirogênica. Coloca-se as amostras no banho-maria por 1
hora junto com as amostras a serem testadas. Após este processo, verificam-se os
resultados (SANTOS et al, 2000).
A validação do teste é realizada através da inibição ou potencialização da
reação de formação do gel. Quando há inibição do gel, ou seja, quando há
quantidade suficiente pode ocorrer formação de gel, porém a amostra impede a sua
formação, tem-se média geométrica menor que a sensibilidade do LAL
(LOURENÇO; KANEKO; PINTO, 2005).
12.1 SENSIBILIDADE DO LISADO
A sensibilidade é a habilidade do método detectar uma amostra
verdadeiramente positiva como positiva (BUSSEY; TSUJI, 1984).
Em coelhos, o limite de confiabilidade é de 5,0 Ue/mL, embora em lisados
este limite é menor que 0,25 Ue/mL (sabendo-se que o teste realizado em coelhos,
determina a presença de endotoxina que provoca a ação febril e o teste de LAL
mede a concentração de endotoxinas). A sensibilidade do LAL é avaliada usando 2
séries de diluições (utilizando-se Água Estéril para Injeção USP), do controle padrão
de endotoxina, definido a partir do padrão de referência de endotoxina (F. BRAS.
1988). Os resultados são considerados conformes se a sensibilidade determinada do
LAL diferir de não mais que uma única série de duplicata de diluição do valor
nominal do produto (PEARSON, 1985).
51
12.2 TESTES DE INIBIÇÃO E EXACERBAÇÃO DE RESPOSTA
A inibição é determinada para cada formulação, antes da liberação final do
produto. As respostas são comparadas com aquelas das diluições do mesmo
controle de padrão de endotoxina em água, tendo resultado satisfatório quando as
diferenças não excederem duas séries de diluição. Se o produto diluído não for
inibitório, procede-se a diluição, respeitando o valor da diluição máxima válida (DMV)
(YAMAMOTO et al, 2000).
A inibição ou exacerbação pode ser eliminada com diluição, aquecimento,
ajuste de pH, adição de substância que neutralize a inibição ou adição de agente
dispersante de endotoxina (ROSLANSKY; DAWSON; NOVITSKY, 1990).
Esta inibição/potencialização da resposta deve ser considerada e a avaliação
desses efeitos é efetuada contaminando-se a amostra na diluição em que é testada
com quantidades determinadas de endotoxina bacteriana, de forma a permitir
verificar se a amostra interfere (inibe ou potencializa) a reação de formação do gel
(F. BRAS, 1988).
12.3 LIMITES DE ENDOTOXINA
O padrão de referência de endotoxina (RSE) tem sua potência definida de
10.000 Unidades de Endotoxina (EU) por frasco. Constitui-se cada frasco com 5 mL
de água apirogênica. Agita-se por 30 minutos no vortex e usa-se então este
concentrado para fazer diluições em série apropriadas. Mantém-se esta
concentração no congelador, para subseqüentes diluições, por não mais de 14 dias
(UNITED, 2000).
A atividade da Endotoxina foi relativamente calculada e aquela referência
padrão de Endotoxina foi expressa como unidades de Endotoxina por Milímetro
(Eu/mL) (YAMAMOTO et al, 2000).
Para produtos parenterais, o limite é correspondente a K/M, onde K é igual a 5
Ue/kg de peso corpóreo e M é igual à dose máxima humana recomendada por
quilograma. Para correlatos, os limites são de 0,5 UE/ mL e para aqueles em contato
com a medula espinal, o limite é de 0,06 UE/ mL. São isentos do limite de
52
endotoxina: os produtos para novas aplicações ou produtos biológicos com limites
distintos e produtos farmacêuticos ou biológicos, que não possam ser testados pelo
método LAL (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003).
12.4 TESTE DE COMPATIBILIDADE DO PRODUTO
Para verificação da inibição ou da potencialização de um produto, vários
testes devem ser feitos por métodos específicos. A não interferência do produto é
muito importante durante a realização do teste. Se for detectada em primeira
instância a interferência do produto, deve-se aplicar a Concentração Máxima Válida
(CMV), que consiste numa etapa preliminar para determinar a diluição máxima de
um produto na qual a concentração limite de endotoxina possa ser detectada ou a
Diluição Máxima Válida (DMV), onde a concentração pode ser calculada
(ROSLANSKY; DAWSON; NOVITSKY, 1990).
A Diluição Máxima Válida (DMV) é a diluição máxima permitida para um
produto com um determinado limite de especificação para que a endotoxina
bacteriana, caso presente, possa ser detectada (UNITED, 2004). Esta é apropriada
para injetáveis ou para soluções para administração parenteral na forma constituída
ou diluída para administração, ou onde for aplicável uma quantidade de droga,
dependendo do volume da dosagem para administração, este volume pode ser
variado (UNITED, 2000).
12.5 ABRANGÊNCIA DA VALIDAÇÃO
O fabricante do produto, ao empregar o teste de LAL, deve-se preocupar em
obter dados quanto à sensibilidade, inibição/ potencialização (PINTO; KANEKO;
OHARA, 2003).
Após a validação do teste, pode ser aplicado à rotina de trabalho para
aprovação ou rejeição dos lotes produzidos. O teste é usado quando a monografia
apresenta as especificações para o limite de endotoxina e, na situação de escolha
53
entre os diferentes métodos (gelificação, fotométrico e turbidimétrico), a decisão final
é baseada no ensaio de gelificação (LOURENÇO; KANEKO; PINTO, 2005).
13. AVALIAÇÃO COMPARATIVA DE TESTES DE PIROGÊNIOS EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS
Os produtos farmacêuticos para uso parenteral devem ser estéreis e
apirogênicos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005).
Algumas comparações de metodologias foram feitas para esse tipo de
avaliação. Em coelhos, foi realizado o teste de hipertemia para elaboração da curva
dose-resposta com o 2º Padrão de endotoxinas bacterianas. Observou-se que o
limite forneceu resultados comparáveis com as doses pirogênicas para o homem
(BARTH et al, 2007).
O teste do LAL (lisado de amebócito do Limulus) é padronizado para
determinação do produto final cromogênico e por gelificação, que é bastante
utilizado para avaliação de produtos farmacêuticos. Observaram-se algumas
diferenças em amostras com resultados falso-positivos, decorrentes das respostas
de reagentes do LAL reativos e não-reativos à B-glicanos. Os resultados obtidos
através do teste, garantem a importância e limitações no Controle de Qualidade de
produtos farmacêuticos parenterais, reduzindo e substituindo o teste realizado em
animais (SILVEIRA et al, 2004).
54
14. CONCLUSÃO
Os testes de pirogênio são necessários para avaliar a contaminação de
fármacos, produtos injetáveis e materiais de uso hospitalar. Atualmente, as
indústrias farmacêuticas estão muito centradas com relação às Boas Práticas de
Fabricação de injetáveis, prevenindo a contaminação dos produtos por substâncias
termogênicas. O tempo de manipulação e de esterilização também são fatores
importantes para evitar a contaminação por pirogênio, pois a endotoxina é muito
termoestável.
A metodologia in vitro para determinação de endotoxina tem sido muito estudada
e evolui cada vez mais, sendo bastante aplicável para produtos acabados.
A indústria deve estar atenta na qualidade inadequada de produtos
farmacêuticos, colocando a venda apenas produtos que sejam seguros e eficazes
para os pacientes.
55
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