Maria Carla Petrellis Avaliação dos Efeitos do Azul de

Maria Carla Petrellis

Avaliação dos Efeitos do Azul de Metileno Fotoativado no Modelo

Experimental do Tumor de Walker 256

Tese Apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.

São Paulo 2014

Maria Carla Petrellis

Avaliação dos Efeitos do Azul de Metileno Fotoativado no Modelo


Tese Apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.

Área de Concentração: Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Álvaro B. L. Martins.

Versão original

São Paulo

2014

“Aos meus pais, pela formação, compreensão e principalmente apoio e

incentivo em todas as etapas da minha vida”.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais e familiares pelo estímulo, confiança e apoio recebido ao longo

da minha vida.

Ao Prof. Dr. Rodrigo Álvaro Brandão Lopes Martins, pela oportunidade,

confiança e por me aceitar como aluna de doutorado.

Aos professores Dr.Durvanei Augusto Maria do Instituto Butantan e Dra.

Marília Cerqueira Leite Seelaender do Departamento de Biologia Celular e do

Desenvolvimento do ICB, pelo apoio científico e experiência em pesquisas com

câncer durante a realização deste trabalho.

A Simone Aparecida Teixeira e Rosangela Aparecida dos Santos Eichler pelo

apoio e auxílio técnico em análises de biologia molecular recebido durante a

realização dos experimentos.

A toda e equipe do laboratório, em especial Patrícia de Almeida, pela

amizade, carinho, apoio, compreensão, paciência, incentivo e convivência durante

este período. Aos amigos Rodney Capp Pallotta e Rodrigo Labat, pela amizade,

paciência e ajuda científica recebida durante a realização deste trabalho.

Agradeço aos demais professores do Departamento de Farmacologia, em

especial ao Prof. Dr. Marcelo Nícolas Muscará e Profa. Dra. Maria Helena Catelli de

Carvalho, pela oportunidade e confiança na realização dos experimentos em seus

laboratórios.

A todos os funcionários do Departamento de Farmacologia do ICB, em

especial a Mônica Nunes e Camila Gonçalves Trindade, pela ajuda e orientação nos

prazos e datas durante o doutorado.

Agradeço a Capes pela conceção da bolsa de doutorado no Departamento de

Farmacologia do ICB - USP.

“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original”.

Albert Einstein

RESUMO

PETRELLIS, M. C. Avaliação dos efeitos do azul de metileno fotoativado no modelo experimental do tumor de Walker 256. 2014. 158 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Instituto de Ciências Biomédicas. Universidade São Paulo, São Paulo, 2014.

A TFD é considerada como uma nova modalidade terapêutica minimamente invasiva destinada ao tratamento localizado e destruição seletiva de diversos tipos de cânceres e desordens malignas. Esta terapia esta baseada na captação e retenção seletiva do agente fotossensibilizante em sítios alvos que por sua vez sofre ativação através da irradiação de uma fonte externa de luz levando à geração de efeitos citotóxicos induzindo a morte das células tumorais. O azul de metileno é um corante que pertence à classe dos corantes fenotiazínicos e que deperta grande interesse devido às suas propriedades eletrocatalíticas em face da NADH4, que é uma coenzima do grupo das dehidrogenases Além disso, o mesmo têm-se mostrado como um potente agente fotossensibilizante com excelentes propriedades

fotoquímicas em função de possuir alto rendimento na geração de 1O

2 e EROs na

presença de agentes redutores. Devido às suas características fotodinâmicas e fototóxicas e demonstrar alta afinidade com a membrana mitocondrial celular, o azul de metileno têm-se destacado como um efetivo fotossensibilizante de grande potencial para à aplicação médica como agente terapêutico na TFD. Objetivo principal deste estudo foi avaliar se os efeitos do azul de metileno fotoativado podem desencadear processos inflamatórios interferindo no desenvolvimento e na progressão tumoral empregando como modelo experimental o Tumor de Walker 256. Dessa forma investigamos a regulação e a expressão de mediadores inflamatórios, COX -1 e COX -2 por RT-PCR; a produção de prostanóides, citocinas, bem como a geração de EROs pelo método de TBAR e a presença neutrofílica pela análises da MPO na massa tumoral sólida. Além disso, verificamos as alterações morfológicas peri e intra-tumoral utilizando método histológico com coloração em H.E. Nossos resultados demosntraram que o grupo tratado com 0.1% de azul de metileno + 1J provocou um aumento extremamente expressivo e que foi estatísticamente diferente quando comparado em relação aos diferentes grupos tratado e o controle, nos níveis dos diferentes marcadores inflamatório IL-1β, IL-6, IL-10 e TNF-α,bem como na quantificação da expressão gênica de COX-1, COX-2, iNOS e na geração EROS e PGE2. A análise histológica também complementou com os resultados anteriores, indicando que no grupo tratado com 0.1% azul de metileno + 1J pode-se verificar alterações morfológicas representadas por grandes áreas de necrose na massa tumoral sólida com presença neutrofílica. Com bases em nossos resultados podemos concluir que há indícios que o tratamento com azul de metileno 0.1% + 1J foi capaz de gerar efeitos citotóxicos na geração de EROs que por consequência aumentando a expressão de mediadores inflamatórios promovendo inflamação e finalmente induzindo morte celular por necrose. Em decorrência deste fato podemos também verificar a possibilidade de haver uma resposta imune tumoricida em decorrência da presença de neutrófilios sugerindo um controle imunitário á longo prazo no tratamento contra o câncer.

Palavras-chave: Terapia Fotodiâmica. Laser. Agentes Fotosensibilizantes. Azul de Metileno. Câncer.Tumor de Walker 256.

ABSTRACT

PETRELLIS, M. C. Evaluation of the effects of methylene blue photoactivated in experimental model of Tumor Walker 256. 2014. 158 p. Ph. D. thesis (Pharmacology) - Instituto de Ciências Biomédicas. Universidade São Paulo, São Paulo, 2014. PDT is considered as a new minimally invasive therapeutic modality for the treatment localized and selective destruction of various types of cancers and malignant disorders. This therapy is based on the selective uptake and retention of the photosensitizing agent into target sites which in turn undergoes activation by irradiation of an external source of light leading to the generation of cytotoxic effects by inducing tumor cell death. Methylene blue is a dye which belongs to the class of phenothiazine dyes and great interest due to their electrochemical properties in the face of NADH4, which is a coenzyme of the group of dehydrogenases Moreover, the same have been shown to be a potent agent photosensitizer with excellent photochemical properties due to having high yield and ROS generation of 1O2 in the presence of reduced agents. Due to its photodynamic - phototoxic properties and show high affinity for mitochondrial membrane, methylene blue have been highlighted as an effective photosensitizer of great potential for medical application as a therapeutic agent in PDT. Main objective of this study was to evaluate the effects of photoactivated methylene blue may trigger inflammatory processes interfering with development and tumor progression using an experimental model of the Walker 256 tumor. Thus investigate the regulation and expression of inflammatory mediators COX-1 and COX - 2 by RT-PCR , the production of prostanoids , cytokines and ROS generation by the method of the present TBAR and neutrophils presence by MPO analyzes of the tumor mass solid . Furthermore , we checked the peri-and intra - tumor morphological changes using histological analysis by HE colorationOur results showed that treated group with 0.1 % methylene blue + 1J provoked an extremely significant increase , which was statistically different when compared for the different treated groups and the control on the levels of several inflammatory markers IL - 1β , IL - 6 , IL - 10 and TNF - α as well as the quantification of gene expression of COX - 1 , COX - 2 , iNOS and ROS generation and PGE2 . Histological analysis also complemented with previous results , indicating that the group treated with 0.1 % methylene blue + 1J can observe morphological changes represented by large areas of necrosis in the mass tumor solid with neutrophils presence. Based on our results we can conclude that treatment with 0.1% methylene blue + 1J was able to generate cytotoxic effects by increasing ROS which consequently increasing the expression of inflammatory mediators, promoting inflammation triggering cell death by necrosis. Due to this fact we can see that there is evidence of an immune response tumoricidal by neutrophils presence suggesting an immune response on control long term in cancer treatment. Keywords: Photodynamic Therapy. Laser. Photosensitizers Agents. Methylene Blue. Cancer. Walker Tumor 256

LISTAS DE FIGURAS

Figura 01 – Estimativa das curvas de Kaplan-Meier para os diferentes grupos

tratados com azul de metileno (A.M) e grupo controle ..............................................80

Figura 02 - Atividade enzimática sérica da ALT após o protocolo de tratamento para

os diferentes grupos experimentais............................................................................82

Figura 03 - Atividade enzimática sérica da AST após o protocolo de tratamento para

os diferentes grupos experimentais............................................................................83

Figura 04 - Atividade enzimática sérica da gama-GT após o protocolo de tratamento

para os diferentes grupos experimentais...................................................................83

Figura 05 – Estimativa das curvas de Kaplan-Meier para os grupos tratados com

azul de metileno (A.M) na concentração de 0.1% e laser nas diferentes doses de

energia e grupo controle.............................................................................................86

Figura 06 - Níveis de IL-1β após o protocolo de tratamento nas diferentes

concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256.......93

Figura 07 - Níveis de IL-1β após o protocolo de irradiação com Laser no

comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor

de Walker 256............................................................................................................93

Figura 08 - Níveis de IL-6 após o protocolo de tratamento nas diferentes


Figura 09 - Níveis de IL-6 após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento

de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker

256............................................................................................................................. 94

Figura 10 - Níveis de IL-10 após o protocolo de tratamento nas diferentes


Figura 11 - Níveis de IL-10 após o protocolo de irradiação com Laser no


de Walker 256............................................................................................................95

Figura 12 - Níveis de TNF-α Figura após o protocolo de tratamento nas diferentes


Figura 13 - Níveis de TNF-α após o protocolo de irradiação com Laser no


de Walker 256............................................................................................................96

Figura 14 - Níveis de IL-1β após a associação dos protocolos de tratamento do azul

de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no


de Walker 256............................................................................................................98

Figura 15 - Níveis de IL-6 após a associação dos protocolos de tratamento do azul



de Walker 256............................................................................................................98

Figura 16 - Níveis de IL-10 após a associação dos protocolos de tratamento do azul



de Walker 256............................................................................................................99

Figura 17 - Níveis de TNF-α após a associação dos protocolos de tratamento do

azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no


de Walker 256............................................................................................................99

Figura 18 – Quantificação da expressão gênica da COX-1 após o protocolo de

tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do

Tumor de Walker 256...............................................................................................106

Figura 19 - Quantificação da expressão gênica da COX-1 após o protocolo de

irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no

tecido tumoral do Tumor de Walker 256..................................................................106

Figura 20 – Quantificação da expressão gênica da COX-2 após o protocolo de


Tumor de Walker 256...............................................................................................107

Figura 21 - Quantificação da expressão gênica da COX-2 após o protocolo de



Figura 22 – Quantificação da expressão gênica da iNOS após o protocolo de


Tumor de Walker 256...............................................................................................108

Figura 23 - Quantificação da expressão gênica da iNOS após o protocolo de



Figura 24 – Quantificação da expressão gênica da eNOS após o protocolo de


Tumor de Walker 256...............................................................................................109

Figura 25 - Quantificação da expressão gênica da eNOS após o protocolo de



Figura 26 - Quantificação da expressão gênica da COX-1 após a associação dos

protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de



Figura 27 - Quantificação da expressão gênica da COX-2 após a associação dos




Figura 28 - Quantificação da expressão gênica da iNOS após a associação dos




Figura 29 - Quantificação da expressão gênica da eNOS após a associação dos protocolos

de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser

no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de

Walker 256............................................................................................................................112

Figura 30 - Níveis de PEG2 após a associação dos protocolos de tratamento do



de Walker 256..........................................................................................................114

Figura 31 - Níveis de TBARS após a associação dos protocolos de tratamento do



de Walker 256..........................................................................................................116

Figura 32 – Correlação níveis de atividade da MPO após a associação dos




Figura 33 – Microscopia óptica do grupo controle. As figuras A e B correspondem a

microscopia óptica nos aumentos de 100 e 400 vezes respectivamente. ..............121

Figura 34 – Microscopia óptica do grupo 0.1% azul de metileno + 1J. As figuras A e

B correspondem a microscopia óptica nos aumentos de 100 e 400 vezes

respectivamente.......................................................................................................122




Figura 36 – Mcroscopia óptica do grupo 0.1% azul de metileno + 6J. As figuras A e

B correspondem a microscopia ótica nos aumentos de 100 e 400 vezes


LISTA DE TABELAS

Tabela 01 - Esquema dos Grupos Experimentais.....................................................63



Tabela 04 – Esquema dos Grupos Experimentais....................................................68


Tabela 06 – Sequência de Primers empregados na análise da expressão de mRNA,

pela técnica RT-PCR em tempo real.........................................................................74

Tabela 07 – Resultados sumarizados da análise da sobrevida dos diferentes grupos

tratados. com azul de metileno e do grupo controle...................................................79

Tabela 08 - Testes para a igualdade das curvas estimadas de Kaplan-Meier entre os

diferentes grupos tratados com azul de metileno e o grupo controle.........................79

Tabela 09 - Correlação entre as atividades enzimáticas séricas de AST, ALT e

gama-GT dos diferentes grupos tratados...................................................................82

Tabela 10 – Resultados sumarizados da análise da sobrevida dos grupos tratados

com azul de metileno na concentração de 0.1% e Laser nas diferentes energias e do

grupo controle.............................................................................................................85


grupos tratados com azul de metileno na concentração de 0.1% e laser nas

diferentes energias e o grupo controle.......................................................................85

Tabela 12 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após o

protocolo de tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido

tumoral do Tumor de Walker 256...............................................................................91

Tabela 13 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após o

protocolo de irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes

energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256................................................92

Tabela 14 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após a

associação dos protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa

de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas

diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256................................97

Tabela 15 – Dados da quantificação da expressão gênica dos marcadores

inflamatórios após o protocolo de tratamento nas diferentes concentrações do azul

de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256..........................................104


inflamatórios após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de onda de

660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256...........105


inflamatórios após a associação dos protocolos de tratamento do azul de metileno

na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda de

660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256...........110

Tabela 18 – Dados dos níveis de PEG2 após a associação dos protocolos de

tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com

Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral

do Tumor de Walker 256..........................................................................................114

Tabela 19 – Dados dos níveis de TBARS após a associação dos protocolos de



do Tumor de Walker 256..........................................................................................116

Tabela 20 – Dados dos níveis de atividade da MPO após a associação dos




LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AIDS/HIV – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida/Vírus da Imunodeficiência

humana

INCA/MS – Instituto Nacional do Câncer / Ministério da Saúde

MS/INCA - Ministério da Saúde/ Instituto Nacional do Cãncer

O.M.S – Organização Mundial da Saúde

WHO - World Health Organization

IARC – Internacional Agency for Research on Cancer

UV – Ultravioleta

DNA – Ácido Desoxirribonucleico

RNA – Ácido Ribonucleico

Rb – gene Retinoblastoma

p53 – gene Phosphoprotein p53

BRCA - 1 – gene Breast Cancer 1

BRCA – 2 – gene Breast Cancer 2

NF-1 – gene Neurofibromatosis type 1.

APC – gene Adenomatous polyposis coli

Bcl 2 – gene B-Cell Lynphoma 2

Bcl-xl – gene B-Cell Lynphoma –extra large

Bax – gene BCL2-associated X protein

Bad – gene Bcl-2-associated death promoter

BER - Reparo por excisão de bases

NERB – reparo por excisão de nucleotídeos

TFD – Terapia Fotodinâmica

HP – Hematoporfirina

HPd – Derivado da Hematoporfirina

ALA – Ácido Aminolevulínico

EROs – Espécies Reativas de Oxigênio

1O2 – Oxigênio Singleto

O2

.- - Superóxido Aniônico

OH. - Radical Hidroxila

H2O

2 – Peróxido de Hidrogênio

Cyt c – Cytocromo C

CL – Cardiolipina

COX-1 – Cicloxigenase 1

COX-2 – Cicloxigenase 2

iNOS – Óxido Nítrico Sintase induzível

eNOS – Óxido Nítrico Sintase endotelial

IL-1 – Interleucina 1

IL-1β – Interleucina 1β




TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α

TGFβ – Fator de transformação do crescimento β

VEGF – Fator de crescimento vascular endotelial

NFkB – Fator Nuclear Kappa B

AP-1 – Proteína Ativadora 1

MIP-1 – Proteína Inflamatória de Macrófago 1

MIP-2 – Proteína Inflamatória de Macrófago 2

MMPs – Metalloproteinases de Matriz Extracelular

HSPs – Proteínas de choque térmico ou Chaperonas moleculares

APCs – Células Apresentadoras de Reconhecimento de Antígenos

CD8+ - Cluster de Diferenciação 8

C3 – Componente do complemento 3

C5 – Componente do complemento 5

E-Selectina – Moléculas de Adesão Celular endotelial

ICAM-1 – Moléculas de Adesão Intercelular

NADH4 – Nicotinamina Adenina Dinucleotídeo Desidrogenase tipo 4

NADPH – Nicotinamide Adenine dinucleotídeo Fosfato-Oxidase

D.P – Desvio Padrâo Relativo

E.R – Erro Padrão

ANOVA – Análise de Variância

pH – Potencial Hidrogeniônico

AST – Aspartato Amino Transferase

ALT – Alanina Amino Transferase

Gama GT – Gama Glutamil Transferase

CEEA - Comissão de Ética em Experimentação Animal

COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

TW 256 – Tumor de Walker 256

RT-PCR - Reação em Cadeia da Polimerase após Transcrição Reversa

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................21

1.1 Câncer.................................................................................................................21

1.2 Terapia Fotodinâmica (TFD) no Câncer...........................................................33

1.3 Azul de Metileno.................................................................................................52

2 HIPOTESE..............................................................................................................56

3 OBJETIVOS............................................................................................................57

4 METODOLOGIA.....................................................................................................58

4.1 Protocolos Experimentais no Modelo do Tumor de Walker 256...................58

4.2 Avaliações do Perfil Hepático no Protocolo de Tratamento do Azul de

Metileno na Massa Tumoral sólida..................................................................72

4.3 Avaliações dos níveis de citocinas na massa tumoral sólida.......................73

4.4 Análises de expressão gênica dos marcadores inflamatórios na massa

tumoral sólida pela reação em cadeia da polimerase após transcrição

reversa em tempo real (real time RT-PCR).......................................................74

4.5 Determinação da Prostaglandina E2 na massa tumoral sólida.....................75

4.6 Avaliações da Peroxidação Lipídica na massa tumoral sólida pelo Método

de TBARS............................................................................................................76

4.7 Análises da atividade da Mieloperoxidade (MPO)...........................................77

4.8 Análises Histológicas........................................................................................78

4.9 Análises Estatísticas..........................................................................................78

5 RESULTADOS........................................................................................................79

5.1 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno no Modelo

Experimental do Tumor de Walker 256...........................................................79

5.2 Avaliações do Perfil Hepátco no Protocolo de Tratamento do Azul de

Metileno na Massa Tumoral sólida...................................................................82

5.3 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno na concentração de

0.1% e Laser no Modelo Experimental do Tumor de Walker 256..................85

5.4 Avaliações dos níveis das citocinas na massa tumoral sólida.....................88

5.5 Análises da expressão gênica dos marcadores inflamatórios na massa


reversa em tempo real (real time RT-PCR)....................................................101

5.6 Determinação da Prostaglandina E2 na massa tumoral sólida....................114

5.7 Avaliação da Peroxidação Lipídica na massa tumoral sólida pelo Método

de TBARS.........................................................................................................116

5.8 Análises da atividade da Mieloperoxidade (MPO).........................................118

5.9 Análises Histológicas......................................................................................120

6 DISCUSSÃO.........................................................................................................126

REFERÊNCIAS........................................................................................................159

21

1 INTRODUÇÃO

1.1 Câncer

1.1.1 Panorama do Câncer no Mundo e no Brasil

O processo global de industrialização ocorrido principalmente no século

passado conduziu uma crescente integração das economias e das sociedades dos

vários países desencadeando a redefinição de padrões de vida com a uniformização

das condições de trabalho, nutrição e consumo (GUERRA et al., 2005; WALTERS,

2001). Assim, a industrialização e a urbanização contribuíram de forma significativa

na alteração demográfica mundial devido à redução nas taxas de natalidade e

mortalidade com o aumento da expectativa de vida e envelhecimento populacional

(GUERRA et al., 2005).

Este processo de reorganização global determinou importantes modificações

nos padrões de saúde-doença, e tais modificações são conhecidas como transições

epidemiológicas que foram caracterizadas pela mudança no perfil de mortalidade

com a diminuição da taxa de doenças infecciosas e concomitantemente o aumento

da incidência de doenças crônico-degenerativas especialmente as doenças

cardiovasculares e o câncer (ALBALA et al., 1997; JEMAL et al., 2008; LAURENTI,

1990; WHO, 2002). Esta transformação do perfil epidemiológico das populações

vem tornando-se ao longo dos anos, cada vez mais complexa e de difícil

entendimento em função do aparecimento de novas doenças e o ressurgimento de

antigos agravos à saúde como, AIDS/HIV, malária, dengue, tuberculose entre outras

no cenário da saúde pública mundial (GUERRA et al., 2005; SUSSER; SUSSER,

1998; WALTERS, 2001).

Dessa forma a urbanização, a industrialização juntamente com as mudanças

dos hábitos de vida e aumento da expectativa de vida preponderou

considerávelmente para o aumento da taxa de doenças crônico-degenerativas em

virtude da exposição dos seres humanos a agentes carcinogênicos (INSTITUTO

NACIONAL DO CÂNCER, 2001, 2005; RISI; NOGUEIRA, 2002; SANTOS; CRUZ,

2001). Apesar dos avanços tecnológicos na área da Medicina, a incidência e a

mortalidade por câncer têm aumentado nas últimas décadas e desta forma

importantes pesquisas científicas na área médica, esforços e medidas adotadas

22

devem ser mobilizados para o combate, na cura e prevenção do câncer

(FERNANDEZ; MAFRA, 2005; SANTOS; CRUZ, 2001).

O câncer é um importante problema de saúde pública em países

desenvolvidos e em desenvolvimento e segundo as estimativas da Organização

Mundial da Saúde (O.M.S.), desde o ano de 2000, o mesmo é responsável por mais

de 6 milhões de óbitos a cada ano, 10,9 milhões de casos incidentes e 26 milhões

de casos prevalentes. Além disso, o câncer representa cerca de 12.0 % de todas as

causas de morte no mundo, possuindo a maior taxa de mortalidade quando

comparado às outras taxas de mortalidade causadas por HIV/AIDS, tuberculose e

malária (GUERRA et al., 2005; WHO, 2002; WHO, 2008).

Embora as maiores taxas de incidência de câncer sejam encontradas em

países desenvolvidos, dos 10 milhões de casos novos anuais de câncer, 5.5 milhões

são diagnosticados nos países em desenvolvimento (GUERRA et al., 2005; WHO,

2002; WHO, 2003). Contudo, a O.M.S. estima um aumento de 50.0% nas taxas de

incidência desta patologia para o ano de 2020, sendo que mais de um terço dos

casos ocorrerão tanto nos países desenvolvidos como nos países em

desenvolvimento (WHO, 2003).

No período do ano de 2005, dados da taxa de mortalidade informaram que

um total de 35 milhões de mortes ocorridas no mundo, o câncer foi responsável por

7.5 milhões de óbitos representando cerca de 22.0% do total de mortes ocorridas

por esta condição patológica (WHO, 2005). No ano 2008, a Agência Internacional

para a Pesquisa em Câncer (IARC) da O.M.S., estimou que a ocorrência de 12.4

milhões de casos novos e 7.6 milhões de óbitos no mundo (WHO, 2008). Em 2012,

as estimativas do projeto Globoan 2012 desta mesma organização apontaram o

surgimento de 14,1 milhões de casos novos em um total de 8,2 milhões de óbitos de

câncer em todo mundo. Também há projeções para o ano de 2020 um número

maior de novos casos anuais que sejam na ordem de 15 milhões e até o ano de

2030 o câncer deverá alcançar a maior carga global correspondendo um total de

21,4 milhões de casos novos e 17 milhões de óbitos atingindo a maior taxa de

mortalidade quando comparado às outras doenças e até então consideradas como

de maior ocorrência (BRAYAND; MOLLER, 2006; INCA/MS, 2012; INCA/MS, 2014;

JEMAL et al., 2007; JEMAL et al., 2008; WHO, 2008). Para o ano de 2050, estima-

se 24 milhões de novos casos, mais do que o dobro dos casos estimados em 2002

23

na ordem de 10.8 milhões (JEMAL et al., 2008; SANDHU et al., 2010; THUN et al.,

2010; WHO, 2007).

Desde o ano de 2000, considerando as causas de morte por doenças,

excluindo as causas externas e as causas não definidas, o câncer vem sendo

definido como a terceira causa de mortalidade mundial, correspondendo 11.84% do

total de óbitos. Segundo a O.M.S. têm constantemente alertado a presença de um

fenômeno crescente na incidência anual o qual o câncer vem atingindo cerca de 9

milhões de pessoas e mata aproximadamente 5 milhões, sendo também

considerado como a segunda causa de mortalidade depois das doenças

cardiovasculares, correspondendo 27.63% do total de óbitos em países

desenvolvidos e em desenvolvimento (CUPPARI, 2005; INCA/MS, 2006; JEMAL et

al., 2007; PISANI et al., 2002; SILVA, 2006; WUNSCH; MONCAU, 2002).

A distribuição epidemiológica global do câncer demonstra um aumento entre

os tipos de cânceres de maior prevalência associados ao status socioeconômico, em

países desenvolvidos como os de pulmão, mama, próstata, cólon-reto, quanto aos

cânceres relacionados à pobreza presentes nos países em desenvolvimento, tais

como os de colo uterino, pênis, estômago e cavidade oral (GUERRA et al., 1997;

INCA/MS 2001; INCA/MS, 2002; INCA/MS, 2005; KOIFMAN; KOIFMAN, 2003; RISI;

NOGUEIRA, 2002).

Além disso, sua distribuição epidemiológica pode ser avaliada de acordo com

o sexo, onde cânceres mais incidentes e que acometem os homens são os de

próstata, pulmão e estômago e entre as mulheres os mais prevalentes são os de

mama, colo uterino e cólon-reto (INCA/MS, 2014; WHO, 2008). Dentre os diferentes

sítios primários de tumores, o câncer de mama representa o segundo tipo mais

frequente na população mundial e o mais prevalente entre as mulheres (PARKIN,

BRAY, DEVESA, 2001).

Vale destacar, que segundo a O.M.S., sobressaem-se, entre os cinco tipos de

câncer mais frequentes, os tumores de pulmão, de cólon-reto e de estômago, tanto

nos países industrializados, quanto nos países em desenvolvimento. Com relação

ao sexo, a prevalência de câncer entre homens e mulheres é muito similar nos

países desenvolvidos, enquanto nos países em desenvolvimento, a prevalência nas

mulheres é de 25% maior, o que reflete o predomínio, em homens, de localizações

de câncer com pior sobrevida, tais como fígado, esôfago e estômago (PISANI;

BRAY; PARKIN, 2002).

24

Assim, o contínuo crescimento populacional bem como o seu envelhecimento

afetará de forma significativa o impacto do câncer no mundo. Esse impacto recairá

principalmente sobre os países em desenvolvimento devido à contínua presença de

fatores como as disparidades socioeconômicas, carência nas condições de

saneamento básico, de moradia, de serviços de atenção à saúde, heterogeneidade

cultural e questões de variações geográficas que impedem o acesso aos serviços

sociais e de saúde pública. Em 1975, os índices de câncer no mundo inteiro

representavam 51% em países de médio e baixo desenvolvimento. Porém, esta

proporção aumentou para 55% em 2007 e está projetada para alcançar 61% em

2050, fato este se deve apenas pelo crescimento populacional e o envelhecimento,

como também por fatores de risco modificáveis como o tabagismo, inatividade física

e o lento declínio em cânceres relacionados à doenças infecciosas (INCA/MS, 2009;

THUN et al., 2010; WHO, 2008).

Nos países que fazem parte da América Latina, do contrário dos países

desenvolvidos, a transição epidemiológica ainda não se completou, observando um

aumento na ocorrência de doenças crônico-degenerativas, enquanto que a

frequência de doenças infecciosas e de doenças transmissíveis por vetores

biológicos como, malária e dengue permanecem elevadas, além da presença

constante de desnutrição. (ALBALA; YANES, 1997; GUERRA et al., 2005;

LAURENTI, 1990). Atualmente, considera-se a América Latina como a mais

urbanizada das regiões menos desenvolvidas do mundo, sendo que esta

urbanização tem sido acompanhada de pobreza urbana maciça que têm contribuído

para um agravamento das disparidades sociais (PARKIN et al., 2001). Deve-se levar

em consideração também, a repercussão da rápida mudança na condição nutricional

desta região, desencadeada pelo processo de industrialização o que afetou de

sobremaneira a prevalência de doenças crônicas como o câncer, doenças

cardiovasculares, diabetes tipo 2, doenças de Alzheimer e outros agravos

relacionados ao envelhecimento e a obesidade (ALBALA et al., 2001; GUERRA et

al., 2005; WALTERS, 2001).

Contudo, ainda observa-se a presença de menores taxas de mortalidade por

cânceres quando comparadas às taxas dos países da Europa Ocidental, Estados

Unidos e Canadá, mas de uma maneira, nestas últimas décadas houve uma

redução da taxa de mortalidade por câncer de pulmão, estômago, útero e cânceres

25

tabaco-relacionado. Porém é notória a ocorrência de um aumento na mortalidade

por cânceres de pulmão e mama acometidos nas mulheres (WHO, 2003).

Em virtude das desigualdades sociais existentes na América Latina, o mapa

global de distribuição dos tipos de câncer nesta região segue uma superposição

semelhante à encontrada no perfil de morbimortalidade global (GUERRA et al.,

1997).

O Brasil destaca-se como uma área interessante para o monitoramento e

controle das tendências na incidência de câncer, assim como para estudo das

variações geográficas nos padrões de doença. Entretanto a população brasileira

vem experimentando mutações significativas no seu perfil demográfico em

decorrência da queda da taxa de fecundidade e o aumento da expectativa de vida

devido às melhorias nas condições sanitárias que fizeram com que houvesse um

progressivo aumento na população de idosos (ROSAS et al., 2013). Em 1930, dados

de registros de base populacional de saúde indicavam que as doenças infecto-

parasitárias representaram 45,7% dos óbitos informados no Brasil, e em 1999, foram

responsáveis por apenas 5,9% das mortes com causas definidas (INCA/ MS 2001;

INCA/MS, 2005; RISI; NOGUEIRA, 2002). Portanto, a distribuição epidemiológica do

câncer no Brasil vem seguindo a mesma tendência mundial e encontra-se em

transição epidemiológica acelerada passando do predomínio das doenças infecto-

parasitárias para doenças crônico-degenerativas (INCA/MS 2012; ROSAS et al.,

2013).

Importante causa de doença e morte no Brasil, desde 2003, as neoplasias

malignas constituem-se a segunda causa de morte na população, representando

quase 17% (140 mil) dos óbitos de causa conhecida, notificados em 2007 no

Sistema de Informações sobre Mortalidade (MS/INCA, 2009). Apenas as doenças

circulatórias matam mais que o câncer, em torno de 27,9% do total de mortes no

mundo (MS/INCA, 2003). Têm-se observado o aumento entre os tipos de câncer

normalmente associados ao status socioeconômico, tais como o câncer de mama,

de próstata e do cólon-reto e, simultaneamente a presença de taxas de incidência

persistentemente elevadas de tumores geralmente relacionados à pobreza, como os

cânceres de colo uterino, pênis, estômago e cavidade oral (INCA/MS, 2012;

KOIFMAN; KOIFMAN, 2003; ROSAS et al., 2013). Esta distribuição certamente

resulta da exposição a um grande número de diferentes fatores de risco ambientais

relacionados também ao processo de industrialização – agentes químicos, físicos e

26

biológicos e de exposição a outros fatores relacionados às disparidades sociais.

(GUERRA et al., 2005; ROSAS et al., 2013).

No ano de 2005, as doenças cardiovasculares, as neoplasias, as causas

externas e o diabetes representaram 55,2% do total de óbitos com importante

contribuição das neoplasias em especial ao câncer de colo uterino (INCA/MS, 2001;

INCA/MS, 2005; RISI; NOGUEIRA, 2002). De acordo com os dados de dez registros

de câncer de base populacional no Brasil, os tumores mais frequentes são os de

próstata, pulmão, estômago, cólon-reto e esôfago na população masculina. Em

mulheres, predomina o câncer de mama, seguido pelos cânceres de colo uterino,

cólon-reto, pulmão e estômago (INCA/MS, 2012; ROSAS et al., 2013). Considerando

as principais causas de morte por câncer no Brasil desde 2001 podemos citar os

tumores de pulmão, próstata, estômago, esôfago, boca e laringe em homens e

tumores de mama, pulmão, cólon-reto, colo uterino e estômago em mulheres

(MS/BRASIL, 2004).

No Brasil, as estimativas para o ano de 2010 e 2011, apontaram para a

ocorrência de 489.270 casos novos de câncer/ano, sendo 236.240 para o sexo

masculino e 253.030 para o sexo feminino. Para o período de 2012 e 2013, as

expectativas indicavam o aparecimento de 518.510 mil casos novos de câncer

(INCA/MS, 2009). Nos próximos anos também há projeções que indicarão à

ocorrência de 576 mil casos novos impulsionados pelo constante crescimento

populacional bem como o seu envelhecimento (INCA/MS, 2009; INCA/MS, 2012;

INCA/MS, 2014; ROSAS et al.,2013). Os tipos mais incidentes, à exceção do câncer

de pele do tipo não melanoma, foram os cânceres de próstata e de pulmão no sexo

masculino e os cânceres de mama e do colo uterino no sexo feminino. Dentre a

população feminina, o câncer de mama apresenta uma estimativa de 49.240 novos

casos e 11.194 mortes (MS/INCA, 2009).

O câncer de mama representa o segundo tipo mais frequente na população

geral e o mais comum entre as mulheres (PARKIN et al., 2001). No Brasil, a doença

constitui a primeira causa de morte por câncer entre as mulheres (BOING et al.,

2007). No período de 1979 a 2000, a taxa de mortalidade por câncer de mama entre

as mulheres brasileiras apresentou um aumento considerável, passando de

5,77/100.000 a 9,74/100.000, correspondendo a uma variação percentual relativa de

80,3% (MS/INCA, 2003). Segundo dados do Ministério da Saúde, a taxa de

mortalidade nas mulheres por câncer de mama no Brasil no período de 1979 a 2004

27

aumentou 38,62%. Na Região Sudeste, o câncer de mama é o mais incidente entre

as mulheres, com um risco estimado de 65 casos novos por 100.000 habitantes

(MS/INCA, 2009).

1.1.2 Etiologia do Câncer

A palavra câncer vem do grego “karkinos” que significa caranguejo, referência

a sua capacidade de crescimento infiltrante comparado às pernas do crustáceo, que

as introduzem na areia ou na lama com finalidade de fixar-se e dificultar a sua

remoção (INCA/MS, 2012; KUMAR et al., 2008).

O termo câncer é utilizado genericamente para representar um conjunto de

mais de 100 doenças incluindo tumores malignos e benignos de diferentes

localizações (INCA/MS 2002; INCA/MS, 2009; INCA/MS, 2012). Também é definido

como uma enfermidade multifatorial crônica caracterizada pela presença de

alterações genéticas nas células que crescem de forma anormal em virtude da perda

do controle da proliferação celular. Em alguns casos como nos tumores malignos,

apresentam ganho da capacidade de invadir tecidos adjacentes sadios ou de sofrer

metastatização disseminando-se para outras estruturas orgânicas distantes

(FENECH, 2002; FERREIRA; ROCHA, 2004; INCA/MS, 2002; INCA/MS, 2008;

INCA/MS, 2009; INCA/MS, 2012; KOWATA et al., 2009; MAFRA; FERNANDEZ,

2005; RIBEIRO et al., 2003).

As neoplasias podem ser classificadas como benignas e malignas,

dependendo de suas características celulares (OLIVEIRA et al., 2007). As

neoplasias malignas são caracterizadas por constituintes celulares que apresentam

alto grau de diferenciação celular em relação ao comportamento biológico, possui

um crescimento desordenado refletindo-se na formação de um novo tecido

denominado de neoplasma ou tumor maligno. Também, as suas células cancerosas

se proliferam com alta autonomia e diferenciação celular invadindo tecidos

adjacentes sadios e frequentemente apresentam alta metastatização em tecidos

sadios ou em estruturas orgânicas distantes do tumor primário e normalmente

oferecem risco de vida ao paciente (ALBERTS et al., 2002; HANNAHAN;

WEINBERG, 2000; OLIVEIRA et al., 2007; SHACTER; WEITZMAN, 2002).

Diferentemente dos cânceres malignos, as neoplasias benignas são

caracterizadas por uma massa tissular bem definida contendo células cancerosas

28

que se multiplicam lentamente e que se assemelha ao tecido de origem. Possui

comportamento biológico não invasivo e raramente fornecem risco de vida ao

paciente (ALMEIDA et al., 2005; INCA/MS, 2002; OLIVEIRA et al., 2007; PLAYER et

al., 2004; ROBBINS; CONTRAN, 2005; WEINBERG, 2008).

Em relação à nomenclatura das neoplasias, normalmente o tipo de tumor é

denominado conforme o nome do tecido em que se originou e, portanto, a

designação é feita indicando o nome do tecido seguido pelo sufixo OMA. Por

exemplo, linfoma designa um tumor do tecido linfático. Assim essa nomenclatura

primária pode ser utilizada para nomear tanto tumores benignos quanto malignos.

Quando tumores malignos surgem do tecido mesenquimal, eles são

denominados de sarcomas, como ocorre nos tecidos de sustentação, tais como

ossos, tecido gorduroso, músculos e tecidos fibrosos. Os neoplasmas malignos

originários das células epiteliais são denominados de carcinomas. Estes constituem

o tipo mais comum de câncer maligno incluindo cânceres de pele, intestino, bexiga,

útero, ovários, ductos mamários, próstata e pâncreas. Além disso, carcinomas que

possuem padrão glandular recebem ainda a terminologia de adenocarcinoma

(ALBERTS et al., 2002; ALMEIDA et al., 2005; ROBBINS; CONTRAN, 2005).

Sabemos que o corpo humano é composto de por milhões de tipos de células

que crescem e dividem-se de forma controlada com a finalidade de produzir mais

células necessárias para a manutenção saudável corporal. Quando estas células

tornam-se velhas ou danificadas, elas morrem e são substituídas por novas células

sadias. Contudo, este processo pode ocorrer de forma anormal e dessa forma o

material genético celular danificado ou alterado passa a produzir mutações que

afetam o crescimento de células neoplásicas levando a formar uma massa de tecido

chamada de tumor (INCA/MS, 2009). Além disso, estas células cancerosas passam

a se comportar de forma anormal, multiplicando-se rapidamente e

desordenadamente em relação às células sadias presentes nos tecidos adjacentes,

invadindo-os e levando ao desenvolvimento de microvasos a partir das células

endoteliais presentes nos capilares situados próximos às células neoplásicas. Dessa

forma estabelecendo o processo de angiogênese, necessário para a manutenção e

do suprimento de oxigênio e nutrientes para a massa tumoral sólida. Observamos

também que algumas células neoplásicas adquirem a capacidade de se destacar da

massa tumoral sólida e disseminar através dos vasos sanguíneos e linfáticos

29

promovendo o surgimento de metástases (FERREIRA; ROCHA, 2004; INCA/MS,

2009; OPPENHEIMER, 2006).

Assim o câncer é uma doença que surge a partir de uma célula normal que

sofreu um acúmulo progressivo de mutações em seu material genético, as quais

acarretam em importantes alterações essenciais na fisiologia celular e que

coletivamente contribuem para o crescimento de malignidades. Dentre estas

alterações essenciais podemos citar (1) suficiência em relação aos fatores de

crescimento, (2) resistência à apoptose, (3) potencial ilimitado de replicação celular,

(4) angiogênese sustentada, invasão tecidual e disseminação à distância (DIXON;

KOPRAS, 2004; HANNAHAN; WEINBERG, 2000; SHACHAF; FELSHER, 2005;

ZHIVOTOVSKY; ORRENIUS, 2003).

O câncer sendo considerado como uma doença multifatorial, podemos

destacar que as causas primárias que levam ao aparecimento dessa patologia ainda

não estão totalmente esclarecidas. Porém sabemos que os fatores ambientais

possuem um importante papel na etiologia do câncer. Dentre eles podemos destacar

a presença de agentes cancerígenos físicos (radiações UV e ionizantes), químicos

(tabaco, álcool, xebobióticos, metais pesados, compostos aromáticos, pesticidas e

etc.), bem como agentes infecciosos (vírus, bactérias e parasitas), também hábitos e

estilo de vida. Portanto tais fatores contribuem para a desordem do ciclo celular

acarretando na formação de agrupamentos de clones de células neoplásicas, ou

seja, em tumores (ANAND et al., 2008; COTRAN et al., 2000; FERRARI; TORRES,

2003; INCA/MS, 2002; IRIGARAY et al., 2007; MAFRA; FERNANDES, 2005; SILVA

et al., 2004).

Também o câncer pode ser definido como uma doença genética, uma vez

que é desencadeado por alterações ou mutações no DNA celular. No entanto, ao

contrário das síndromes genéticas humanas, o câncer não é necessariamente uma

doença hereditária. Sabemos que os cânceres na sua maioria são de origem

somática resultantes da interação entre os fatores genéticos, envelhecimento e as

influências do ambiente externo (BLUME-JENSEN; HUNTER, 2001; CHEN;

HUNTER, 2005; COHEN et al.,1992; CURI et al., 2002; FOOTE, 2005; INCA/MS,

2012; KUMAR et al., 2008; PERERA, 1997; WHO, 2009). No caso do câncer

heredidário, as mutações germinativas estão diretamente associadas à

predisposição genética familiar para o desenvolvimento de tumores e nestes casos

específicos, o câncer é considerado uma doença genética e hereditária (CAMARGO

30

et al., 1999). Cerca de 5 á 10% dos cânceres são hereditários provenientes de

mutações nas linhagens germinativas e diversos genes vem sendo identificados e

investigados como sendo importantes alvos na etiologia destes tumores (FEARON,

1997; MINAMOTO et al., 1999).

Durante o processo da carcinogênese, uma célula sadia passa por várias

etapas sendo estas, iniciação, promoção, progressão e manifestação tumoral

(ALBERTS et al, 2010; CHAMMAS et al., 2004; COHEN, 1991; GUTIÉRREZ;

SALSAMENDI, 2000; HASEGAWA et al., 1998; MEHTA, 1995; OLIVEIRA et al.,

2007; TANNOCK; HILL, 1998; TROSKO, 2001).

A iniciação é o primeiro estágio que envolve passos nos quais o DNA de uma

célula sadia acumula uma série de mutações ou alterações genéticas induzidas por

agentes cancerígenos e, dessa maneira alterando suas respostas ao ambiente

celular (BRASILEIRO FILHO et al., 2006; HANNAHAN; WEINBERG, 2000;

OLIVEIRA et al., 2007; PLAYER et al., 2004; SANTELLA et al., 2005; SHACTER;

WEITZMAN, 2002; TROSKO, 2001; TROSKO, 2003).

Em geral, estas mutações genéticas incluem alterações de sequência,

perdas, ganhos, mutações pontuais, rearranjos cromossômico simples ou

complexos, os quais são responsáveis por sucessivas divisões celulares anormais

acarretando num processo de evolução clonal (CAVENEE; WHITE, 1995;

CHAMMAS et al., 2004; ESTELLER; HERMAN, 2002; FERREIRA; ROCHA, 2004;

GREAVES, M., 2000; POIRIER, 2004; SINGH; FARMER, 2006).

Atualmente entende-se que o câncer é causado em sua grande maioria dos

casos pela ação dos agentes cancerígenos, por erros durante a replicação do DNA

celular ou no reparo das lesões cromossômicas que alteram geneticamente e

funcionalmente os principais genes responsáveis pelo controle da homeostasia

celular (COTRAN et al., 2000; COUPIER; PUJOL, 2005; LOURO, 2000; SILVA et al.,

2004). Portanto, as ações destes fatores resultam em importantes modificações

progressivas afetando não só em diferentes fases do ciclo celular bem como na

interação do comportamento biológico da célula com o meio extracelular

(HANNAHAN; WEINBERG, 2000; OLIVEIRA et al., 2007; SILVA et al., 2004).

Contudo, ainda existem genes responsáveis e que participam dentro do

processo da carcinogênese principalmente tanto na ativação dos proto-oncogeneses

quanto na inativação de genes supressores de tumores (CHANG et al., 1995; CHEN;

HUNTER, 2005; DELFINO et al., 1997, HANNAHAN; WEINBERG, 2000; LUCH,

31

2005; OLIVEIRA et al., 2007; SILVA et al., 2004). Neste sentido, progressos no

entendimento das bases dos mecanismos da carcinogênese têm sido feito a partir

das descobertas e investigações dos papéis fundamentais dos proto-oncogeneses,

genes supressores de tumores e oncogeneses (STRAHM; CAPRA, 2005).

Os proto-oncogeneses são genes celulares normais que participam do

controle das funções vitais celulares como proliferação, diferenciação, migração e

morte celular. Assim agem no controle positivo, estimulando e codificando várias

proteínas do complexo sinalizador que permite à célula normal a responder aos

fatores de crescimento celular e dessa forma tais genes são capazes de induzir e

manter a diferenciação celular. Além disso, estes proto-oncogeneses podem tornar-

se oncogeneses por meio de mutações resultantes da exposição aos agentes

cancerígenos, e sua ativação pode ocorrer por meio de translocações

cromossômicas, amplificações gênicas ou mutações de ponto de maneira que

modificações em um único alelo são suficientes para transformá-los em

oncogeneses, contribuindo na transformação maligna (COOPER, 1994; CARRENÕ

et al., 1999; IRISH; BERNSTEIN, 1993; MCKINNELL, 1998; SILVA et al., 2004).

Os genes supressores de tumores atuam codificando proteínas com funções

específicas, por exemplo, agem impedindo o acúmulo de mutações no DNA celular

ou controlando a progressão da célula ao longo das fases do ciclo celular e, portanto

garantindo a integridade genômica. Além disso, possuem a habilidade de induzir a

morte celular programada (apoptose) suprimindo o crescimento de células tumorais

que contenham múltiplas alterações genéticas (ALFANO, 2006; CHAMMAS et al.,

2004; GOTTLIEB; KOPNIN, 2000; OREN, 1998; VELCULESCU; EL-DEIRY, 1996;

WEINBERG, 1994). Dentre os genes supressores tumorais podemos destacar

aqueles genes que regulam a transcrição nuclear e o ciclo celular (Rb, p53, BRCA-1

e BRCA-2), os genes que regulam a transdução de sinais (NF-1, APC), os

receptores da superfície celular (receptor TGFβ e caderinas), e os genes que

impedem (Bcl 2, Bcl-xl) ou induzem (Bax, Bad) à morte celular (BABENKO et al.,

2006; COOPER, 1995; COTRAN et al., 2000; DELFINO et al., 1997; DENG;

BRODIE, 2001; HANAWALT et al., 2003; INGVARSSON, 2001, KLAUNING et al.,

2000; LOURO, 2000; LUCH, 2005; MAREEL; LEROY, 2003; PERATONI, 1998;

SILVA et al., 2004).

Recentemente, alterações em genes que estão associados aos mecanismos

de reparo do DNA, reparo por excisão de bases (BER) e reparo por excisão de

32

nucleotídeos (NERB), tem sido relatados em diferentes tipos de cânceres, sendo

frequentemente associados às síndromes hereditárias que cursam com o

desenvolvimento de tumores (ABBOTTS et al., 2014; ADIMOOLAN; FORD, 2002;

CHAMMAS et al., 2004; CHAO; LIPKIN, 2006; FRIEDBERG, 2003; HARMS et al.,

2004; TAN; CHU, 2002). Normalmente estes genes são considerados como um

terceiro grupo que atuam diretamente ou indiretamente no processo da

carcinigênese (BOER; HOEIJMAKERS, 2000; COTRAN et al., 2000; FRIEDBERG et

al., 2005; HOEIJMARKERS, 2001; LINDAHL; WOOD, 1999; LOURO, 2000;

POIRIER, 2004).

Portanto, a identificação e a caracterização dos genes envolvidos na

carcinogênese são de fundamental importância para a compreensão das bases dos

mecanismos moleculares desta patologia (BERTRAM, 2001; KLAUNING et al., 2000;

OLIVEIRA et al., 2007; PARMIGIANI; CAMARGO, 2004).

Finalmente concluímos que o câncer é a resultante do crescimento de

sucessivas populações celulares nas quais, as mutações genéticas acumulam-se

em um processo de expansão monoclonal culminando na formação de uma massa

tumoral contendo células cancerígenas de diferentes padrões de alterações

genéticas com extensa heterogeneidade intratumoral (MICHOR et al., 2001;

SCHOR; SCHOR, 2001).

A promoção é a segunda etapa da carcinogenese e que consiste na

proliferação ou expansão das células “iniciadas” através da ação dos agentes

denominados de onco-promotores (SHILS et al., 2003). Estes agentes são

caracterizados por substâncias mediadoras inflamatórias que têm em comum a

propriedade de induzir irritação nos tecidos biológicos provocando reações

inflamatórias e ação proliferativa tumoral (COUSSENS; WEB, 2002; INCA/MS, 2012;

KEMPEN et al., 2006; KUMAR et al., 2008; WEISS, 2002).

Com a permanência dos onco-promotores, ocorre a terceira etapa da

carcinogenese, denominada de progressão. Nesta etapa é caracterizada pela

presença de alterações fenotípicas, ou seja, as células geneticamente mutadas

passam a multiplicar-se desordenadamente, adquirindo autonomia, tornando-se

agressivas e invasivas (BRASILEIRO FILHO, 2006; HANNAHAN; WEINBERG,

2000, INCA/MS, 2012; KUMAR et al., 2008)..

A manifestação dos sinais do tumor é o último passo na carcinogenese,

podendo levar até décadas para surgir os primeiros sintomas da doença (SHILS et

33

al., 2003). Dependendo da localização do tumor e da função da estrutura orgânica

acometida, os sintomas podem variar desde sangramentos, úlceras, emagrecimento,

caquexia, anorexia entre outros (BARACAT et al., 2000).

1.1.3 Tumor de Walker 256

O carcinossarcoma 256 de Walker foi descoberto em 1928 no laboratório de

George Walker do John Hopkins University School of Medicine a partir do

desenvolvimento espontâneo de um adenocarcinoma de mama em rata, que por sua

vez é mantido em vários laboratórios, por sucessivas inoculações (BRITO et al.,

2009; DORNELAS et al., 2006). É um dos poucos modelos de tumores, disponíveis

para estudos experimentais nas áreas médicas e biológicas em diferentes linhas de

pesquisa (BEVILACQUA et al., 1984; BLACK et al., 1994; EARLE, 1935; GUAITANI

et al., 1982; HURTADO et al., 1991; KLULBES et al., 1987; MOTA; REZKALLAH-

IWASSO, 1981; MUND et al., 2007; PEREIRA; GUASTALE, 1992).

O carcinossarcoma de Walker 256 é uma neoplasia bem caracterizada,

facilmente mantida em laboratório com vantagem de ser obtido "in vivo" através da

inoculação de células em ratos e, desenvolve-se rapidamente e falhas de inoculação

e regressão espontânea são pouco frequentes (CAVALCANTE et al., 2003;

FERNANDES et al., 1990; FERNANDES, 1995; MORAES et al., 2000; PEREIRA;

GUASTALE, 1992; SCHANOSKI et al., 2004).

Possui comportamento biológico agressivo, sendo localmente invasivo e com

alto poder de desenvolver metástase por via linfática e hematogênica

(CAVALCANTE et al., 2003; FOLADOR et al., 2009; MORAES et al., 2000; OBA-

SHINJO et al., 2003; PAVLAKI et al., 2009; SEELANDER et al., 1996). É

amplamente empregado como modelo experimental em diversos estudos em câncer

como pulmão, estômago, rins, bexiga, cavidade oral e fígado (ALVES et al., 2004;

GUIMARAES et al., 1999; GUIMARAES et al., 2010; NETO et al., 2002; OLIVEIRA

et al., 1998; SILVA et al., 2002; VIDO et al., 2000; ZARUR et al., 2004).

1.3 Terapia Fotodinâmica (TFD) no Câncer

A luz tem sido empregada como terapia de forma empírica por milhares de

anos em função da descoberta de suas propriedades terapêuticas por antigas

34

civilizações como a egípcia, indiana e a chinesa que utilizavam para o tratamento de

várias enfermidades incluindo a psoríase, vitiligo e câncer (ACKROYD et al., 2001;

DOLMANS et al., 2003; DANIELL; HILLS, 1991; SPYKES, 1985). Entretanto, foi a

partir do final do século 19, que estabeleceu a sua importância terapêutica no

tratamento de diversas doenças cutâneas graças às pesquisas iniciadas por Niels

Finsen, onde ele observou que a exposição da luz vermelha era capaz de prevenir

pústulas da varíola e, portanto, ser utilizada para tratar tal doença. Também em

outras investigações, o mesmo utilizou a luz ultravioleta para o tratamento da

tuberculose cutânea (FINSEL, 1901). Assim, seus trabalhos científicos pioneiros

puderam contribuir de forma significativa na área médica e ganharam importância e

reconhecimento, tanto que em 1903 Finsel foi contemplado pelo Prêmio Nobel por

suas descobertas.

Na mesma época, outros pesquisadores, Oscar Raab e Von Tappeiner

iniciaram estudos científicos onde foi observado que em combinação com a luz,

certas substâncias químicas eram capazes de induzir morte celular em seres

unicelulares. Eles demonstraram que em certos comprimentos de onda da luz, os

compostos químicos podiam desencadear suas propriedades tóxico-fluorescentes,

por exemplo, empregaram acrinidina em combinação com a luz, levando a exercer

seus efeitos letais em espécies de protozoários do tipo Paramecium (ACKROYD et

al., 2001; RAAB, O.,1900). Dessa forma, concluíram que somente a captação da

energia solar na forma de fótons pelo composto químico era capaz de produzir

fluorescência, sendo condição necessária para que o mesmo exerça seus efeitos

tóxicos em organismos unicelulares. Em conclusão deste achado, o potencial

terapêutico da aplicação do efeito de fluorescência dos compostos químicos na

Medicina, ganhou grande importância e notoriedade, sendo considerado como uma

nova ferramenta terapêutica dentro do conjunto do arsenal de armas na terapia

médica (ACKROYD et al., 2001; DOLMANS et al., 2002; DOLMANS et al., 2003;

JUARRANZ et al., 2008; JUZCNIENE et al., 2007; VON TAPPEINER, 1900).

No mesmo período, o neurologista francês J. Prime observou que em

pacientes epiléticos tratados com eosina oralmente desenvolviam dermatite em

áreas da pele expostas ao sol (ACKROYD et al., 2001; PRIME, 1900). Esta

descoberta levou ao desenvolvimento da primeira aplicação médica da interação

entre o efeito fluorescente da substância química e a luz que, em trabalhos

posteriores em conjunto com outros pesquisadores, Von Tappeiner e Jesioneck,

35

empregaram a eosina topicamente em combinação com a luz branca no tratamento

de tumores de pele, por exemplo, o carcinoma de células basais da pele

(TRIESSCHEIJN et al., 2006).

Mais tarde, estes mesmos pesquisadores trabalhando em colaboração com

outro pesquisador Jodlbauer, demonstraram que a presença de oxigênio era uma

condição necessária para efetivar a reação de foto sensibilização. Assim em 1907,

este grupo de pesquisadores puderam descrever este fenômeno e introduzir o termo

“Ação Fotodinâmica” (ACKROYD et al., 2001; BLUM, 1941; PERVAIZ, 2001;

TAPPEINER; JESIONECK, 1903; TAPPEINNER; JODLBAUER, 1904; TAPPEINER;

JODLBAUER, 1907; TRIESSCHEIJN et al., 2006).

De fato, a principal aplicação biomédica da ação fotodinâmica é a Terapia

Fotodinâmica (TFD), que representa uma recente modalidade terapêutica para o

tratamento paliativo e curativo de algumas formas de cânceres e lesões pré-

cancerosas. Embora Tappeiner e Jesioneck fossem os primeiros pesquisadores a

utilizarem a terapia fotodinâmica no tratamento contra o câncer de pele, empregando

a luz juntamente com a eosina aplicada topicamente, foi Figge e colaboradores que

em 1950 demonstraram em suas investigações as propriedades seletivas de

retenção das Hematoporfirinas (HP) em tecidos tumorais por análises de detecção

de imagem por iluminescência.

Muitos agentes fotossensibilizantes que têm sido avaliados desde que a TFD

foi proposta, são baseados à partir de moléculas que apresentam núcleo semelhante

aos das porfirinas, composto por quatro anéis pirrólicos conectados por pontes de

metila ligadas em uma configuração espacial cíclica e com uma cadeia lateral

normalmente metálica (DETTY et al., 2004).

Durante a década de 60, Richard Lipson e seus colaboradores iniciaram a era

moderna da Terapia Fotodinâmica voltada em aplicações terapêuticas na Clínica

Mayo nos Estados Unidos, onde novas avaliações culminaram para o

desenvolvimento de novos tratamentos e o surgimento de novos compostos

fotossensibilizantes. O primeiro agente fotossensibilizante utilizado em estudos

experimentais na TFD foi a Hematoporfirina (HP) e posteriormente surgiram

compostos a partir da mistura de diferentes porfirinas com propriedades

fluorescentes composta por mono, di e oligômeros da hematoporfirina que foi

denominada mais tarde de “Derivado de Hematoforfirina” (HPd) (JUARRANZ et al.,

2008; JUZCNIENE et al., 2007; KELLY; SNELL, 1976; KESSEL et al., 1985).

36

Neste cenário, Lipson e seus colaboradores ainda deram continuidade em

suas investigações e demonstraram através de dados achados a confirmação que

tanto a hematoporfirina como seus derivados apresentam propriedades seletivas de

retenção em tecidos tumorais utilizando técnicas de análises de detecção de

imagem pelo método de captação de fluorescência. Dessa forma este fato levou a

abrir novas perspectivas não só na otimização da análise diagnóstica por imagem

para detecção de tumores como também no uso clínico de tais compostos em

combinação com a luz vermelha destinados no tratamento e erradicação de tumores

malignos de mama e bexiga inicialmente aplicados em modelos experimentais

(DOLMANS et al., 2002; DOLMANS et al., 2003; DOUGHERTY et al., 1978;

DOUGHERTY et al., 1998; GOMER et al., 2006; KELLY; SNELL, 1976; SCHWARTY

et al., 1955; TRIESSCHEIJN et al., 2006).

Já na década de 70, várias preparações de derivados hematoporfirínicos

começaram a ser testados para o uso em terapia fotodinâmica, culminando no

desenvolvimento do Photofrin® (Pinnacle Biologics Inc., USA), composto por uma

mistura sódica de derivados hematoporfirínicos. Em 1994, a Terapia Fotodinâmica

foi previamente aprovada para o uso clínico no Canadá utilizando como agente

fotossensibilizante o Photofrin® (Pinnacle Biologics Inc., USA) (JUARRANZ et al.,

2008; JUZCNIENE et al., 2007; TRIESSCHEIJN et al., 2006).

Embora a ativação sob a luz visível de compostos químicos tem sido aplicada

experimentalmente na Terapia Fotodinâmica com o objetivo de foto destruir tecidos

neoplásicos desde que foi introduzida no início de século 20, atualmente muitos dos

resultados obtidos na clínica têm sido cada vez mais promissores e, portanto, a TFD

vem ganhando maior reconhecimento como uma nova modalidade terapêutica

efetiva contra o câncer e enfermidades não malignas (DOUGHERTY, 2002;

GARCIA-ZUAZAGA et al., 2005; HAMBLIN; HASAN, 1996; SARIKA et al., 2007 .

Contudo, os mecanismos foto dinâmicos da TFD em tumores ainda continuam

sendo largamente investigados e, portanto com base em achados científicos recém-

publicados, atualmente a TFD vêm recebendo cada vez maior aprovação por órgãos

regulamentadores de saúde em diversos países no tratamento de um grande

número de enfermidades malignas que acometem severamente a população

mundial (SARIKA et al., 2007).

37

Em alguns países, tais como o Canadá e Estados Unidos, a TFD tem sido

aprovada para o uso na terapia primária nos casos de neoplasias e malignidades

que se encontram em estágios iniciais e como terapia paliativa em cânceres em

estágios avançados. Também, a TFD pose ser utilizada como adjuvante terapêutico

em procedimentos cirúrgicos no tratamento de cânceres de pulmão, bexiga, esôfago

e estômago em diversos países. Além disso, a TFD é extensivamente avaliada em

testes clínicos para o tratamento de muitos outros tipos de cânceres incluindo, os de

mama, cólon-reto, vesícula biliar e cérebro (DOUGHERTY et al., 1998; MAKOWISKI

et al., 2003; MCBRIDGE, 2002).

Atualmente os regimes de tratamento que são adotados com TFD,

normalmente têm como finalidade ação paliativa, entretanto, em função do tipo de

neoplasia e o estágio que se encontra a patologia, melhorias na resposta terapêutica

poderão ser alcançadas dispondo de ferramentas terapêuticas alternativas com

aplicação localizada ou segmentada que podem ser necessárias quando estão

envolvidos sítios anatômicos de maior complexidade localizados em estruturas

anatômicas intrínsecas e de conformidades tridimensionais, por exemplo, tumores

presentes nas cavidades abdominais e torácicas. Neste caso, alguns tipos de

cânceres já estão sendo tratados com TFD endoscopicamente tais como, cânceres

de pulmão, bexiga, neoplasias do trato gastrointestinal e ginecológico (JUARRANZ

et al., 2008; SARIKA et al., 2007). Assim, um pleno conhecimento da terapia bem

como o amplo desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas aliados ao

desenvolvimento de novos agentes fotossensibilizantes mais potentes e eficazes,

protocolos terapêuticos mais específicos e a modernização tecnológica de

equipamentos para área médica, serão de grande importância e necessários e

contribuirão de forma positiva na otimização e o melhoramento na eficácia

terapêutica na luta contra o câncer (HASAN et al., 2003; MCBRIDGE, 2002; SARIKA

et al., 2007).

A TFD é definida como tratamento localizado contra o câncer e está baseado

na captação e retenção seletiva do composto fotossensibilizante em sítios alvos que

por sua vez sofre foto ativação por intermédio de um comprimento de onda da luz

visível levando à geração de efeitos citotóxicos de forma direcionada e que por

consequência induzindo a morte das células tumorais (CALIN et al., 2005;

DOUGHERTY, 1987; JUARRANZ et al., 2008; SARIKA et al., 2007). Também, a

TFD pode ser considerada como uma nova modalidade terapêutica minimamente

38

invasiva, amplamente testada e aplicada na Clínica Médica destinada ao tratamento

e destruição seletiva de diversos tipos de cânceres e desordens não malignas

(DOUGHERTY et al., 1998; GOMER et al., 1989; HSI et al., 1999; KESSEL, 1992;

PERVAIZ, 2001).

O tratamento consiste na administração sistêmica ou local do agente

fotossensibilizante não tóxico que se acumula de forma seletiva nos tecidos

tumorais. A ativação do agente fotossensibilizante se dá através da exposição à

irradiação do espectro da luz na região alvo, preferencialmente em um comprimento

de onda apropriado, normalmente na faixa do vermelho do espectro da luz (ʎ≥

600nm), onde os tecidos biológicos são mais suscetíveis à ação da luz vermelha,

dessa forma, a mesma atinge com mais facilidade as camadas mais profundas dos

tecidos biológicos. A energia da luz vermelha captada pelo agente

fotossensibilizante na forma excitável é transferida para o oxigênio molecular,

convertendo-o em oxigênio singleto (1O2) e promovendo também a geração de

espécies reativas de oxigênio. Durante este processo, é de extrema importância

destacar o papel fundamental do 1O2 sendo responsável por causar os efeitos

citotóxicos mais severos diretamente nas células tumorais e contribuir para a

regressão tumoral (MAKOWSKI et al., 2003; SHARMAN et al., 2000).

Além disso, os fotos produtos citotóxicos gerados pelo processo da TFD,

iniciam uma cascata de eventos bioquímicos no microambiente tumoral induzindo

danos irreversíveis e importantes além de morte celular. (ACKROYD et al., 2001;

DANIELL; HILLS, 1991; DOLMANS et al., 2003; GARCIA-ZUAZAGA et al., 2005;

JUARRANZ et al., 2008; MAKOWSKI et al., 2003; MOAN; BERG, 1991; SARIKA et

al., 2007; SHARMAN et al., 2000; TAMIETTI et al., 2007).

Portanto, para produzir os efeitos desejáveis na TFD, é necessária a

presença dos três componentes e que atuem simultaneamente para garantir uma

eficácia terapêutica, sendo estes, a luz (FOSTER et al., 1993; HENDERSON et al.,

2006), oxigênio em quantidade suficiente no tecido biológico (CHEN et al., 2002;

FOSTER et al., 1991) e o agente fotossensibilizante (HENDERSON; DOUGHERTY,

1992).

As principais vantagens da TFD em comparação aos tratamentos

convencionais contra o câncer são: (1) baixa toxicidade sistêmica, pelo fato do

agente fotossensibilizante ser somente foto ativado na presença da luz vermelha e

possuir rápida eliminação corporal, (2) habilidade de destruir s células tumorais

39

seletivamente, (3) a TFD pode ser aplicada isoladamente ou em combinação com

outras modalidades terapêuticas, tais como quimioterapia, radioterapia, imunoterapia

e procedimentos cirúrgicos. Além disso, os agentes fotossensibilizantes podem ser

aplicados sistemicamente ou localmente dependendo do tipo de tumor e sua

localização (JUARRANZ et al., 2008).

Os resultados ou as respostas terapêuticas alcançadas pela TFD são vários,

que vão desde o retardamento do crescimento tumoral nos casos de neoplasias

malignas em estágios avançados acompanhado da melhora na qualidade e no

aumento da expectativa de vida do paciente até a completa regressão tumoral

(DOLMANS et al., 2003; JUARRANZ et al., 2008; PERVAIZ; OLIVO, 2006).

1.2.1 Agentes Fotossensibilizantes

Geralmente é aceito um bom composto fotosenssibilizante na TFD quando o

mesmo atende as seguintes condições: (1) pureza química e uma estrutura química

bem definida, (2) alta afinidade na captação e retenção por sítios alvos de tecidos

tumorais, (3) baixa toxicidade em condições no “escuro”, (4) rápida eliminação

corporal, (5) seja citotóxico quando sofre alta sensibilização por meio de uma fonte

externa de luz, (6) possuir estado tripleto e que seja suficientemente de longa

duração, (7) alto rendimento na geração do 1O2, (8) seja suficientemente solúvel nos

fluidos biológicos dos tecidos corporais e (9) alto coeficiente de extinção molar e alta

absorbância da luz na faixa do comprimento de onda do vermelho até o

infravermelho (ʎ = 600-800 nm) onde a luz penetra com mais facilidade até as

camadas mais profundas dos tecidos biológicos; neste caso, o composto químico

também deve apresentar um grau de permeabilidade relativo nos tecidos biológicos

(CALIN et al., 2005; DOUGHERTY et al.,1998; JUARRANZ et al., 2008;

TRIESSCHEIJN et al., 2006).

Com base nas propriedades ideais de um bom agente fotossensibilizante, um

número de compostos tem sido avaliado em teste in vitro e in vivo e alguns deles já

se encontram presentes em etapas avançadas em teste clínicos e ou aprovados

para o uso clínico no tratamento contra o câncer (DETTY et al., 2004; SARIKA et al.,

2007; SHARMAN et al.,1999).

Os primeiros agentes fotossensibilizantes utilizados na TFD foram

denominados como Agentes Fotossensibilizantes de 1ª Geração, nesta classe estão

40

incluídos as hematoporfirinas e seus derivados. Como representante principal desta

classe, podemos destacar o Photofrin® (Pinnacle Biologics Inc., USA), que é

constituído por uma mistura sódica de diferentes derivados das hematoporfirinas e

que apresenta uma alta seletividade por tecidos tumorais e dessa forma, possuindo

uma boa ação tumoricida em combinação com a luz vermelha (DOUGHERTY et

al.,1975; LIPSON et al.,1961). O Photofrin® (Pinnacle Biologics Inc., USA) possui

indicações clínicas para o tratamento de diversas formas de cânceres em estágios

iniciais e avançados, entre eles podemos citar os cânceres de bexiga, pulmão, do

trato gastrointestinal e principalmente o Câncer de Barrett do esôfago

(DOUGHERTY et al., 1978; JUARRANZ et al., 2008; KELLY; SNELL, 1976; SARIKA

et al., 2007; TRIESSCHEIJN et al., 2006).

Com relação aos agentes fotosensibilizantes de 2ª Geração, podemos

destacar o ácido aminolevulínico (ALA) cujo nome comercial Levulan® (DUSA

Pharmaceuticals, Inc., USA), foi aprovado na Clínica Médica em 1999 destinado ao

tratamento de queratoses actínias e cânceres de pele, da cavidade oral e do trato

gastrointerstinal. Outro derivado do ALA, o éster metílico do ALA (Metevix®,

Galderma Pharma, USA), foi aprovado em 2001 pelos órgãos regulamentadores de

saúde da União Européia e do Japão com indicação terapêutica no tratamento

paliativo de cânceres de cabeça e pescoço. Já a verteporfirina (Visudyne®, Novartis

Pharma, USA), outro agente fotossensibilizante de segunda geração têm sido

aprovado para o tratamento da degeneração macular senil (AZAB et al., 2005).

As principais vantagens do emprego dos agentes fotossensibilizante de

segunda geração em relação aos de primeira geração são: (1) apresentam melhor

seletividade ao tumor, (2) possuem rápida eliminação corporal, causando menos

efeitos adversos, (3) podem ser administrados oralmente ou topicamente (BOURRE

et al., 2002; DOUGHERTY, 2002; MA et al., 1994; REZZOUG et al.,1996; SARIKA et

al., 2007; TRIESSCHEIJN et al., 2006; VAN GEEL et al.,1995; YOW et al., 2000).

Desde o início do século passado, têm-se despertado um grande interesse

em investigar o fenômeno da foto sensibilização de substâncias com ação

potencialmente tumoricida e para fins de diagnóstico, graças às pesquisas pioneiras

iniciadas por Tappeiner e Jesioneck, o qual avaliou se o efeito da exposição à

irradiação da luz na presença de eosina e posteriormente na década de 60 trabalhos

realizados por Lipson e Schwartz empregando o uso das hematoporfirinas e seus

derivados em testes de detecção por imagem de tumores. Dessa forma contribuíram

41

significantemente para a inclusão de novos compostos químicos de diversas

naturezas com potencial ação fotosensibilizante para a TFD (DOUGHERTY et al.,

1998; JUARRANZ et al., 2008; PERVAIZ; OLIVO, 2006; TRIESSCHEIJN et al.,

2006).

Entretanto, a procura por novos compostos fotossensibilizantes de última

geração ainda permanece em curso, especialmente na busca de estabelecer novos

agentes fotossensíveis que possam ser fotoativados em longos comprimentos de

onda da luz e que provoquem uma efetiva ação de fotosensibilização e que

possuem alta especificidade por tecidos tumorais (DETTY et al.,2004; DOUGHERTY

et al.,1998; JUARRANZ et al., 2008; TRIESSCHEIJN et al., 2006). Assim, muitos

compostos fotossensibilizantes têm sido avaliados em teste clínicos, porém ainda

existem poucos resultados satisfatórios publicados na comunidade científica.

Atualmente têm-se proposto uma gama de agentes fotosensíveis de diversas

naturezas com potencial para a TFD, entre eles estão as porfirinas sintéticas,

benzoporfirinas, clorinas, bacterioclorofilas, feoforbidas, cianinas nos caso das

ftalocianinas e naftalocianinas, cromóforos naturais das hidroquinonas em especial

as hipericinas, porficenes (isômeros das porfirinas), purinas, xantinas e oxzinas

(ANDERSON et al.,1997; BROWN; MELLISH, 2001; CHAN et al., 2005; DIWU;

LOWN, 1994; FERREIRA et al., 2004; GARBO, 1996, KAPLAN et al., 1998;

KRYSKO et al., 2001; de LAEY et al., 2000; LUI et al., 2001; MANG et al., 1998;

PANDEY et al., 1991; STOCKERT et al., 2007; TABER et al., 1998; VERIGOS et al.,

2006).

1.2.2 Princípio da TFD

Com o advento da teoria quântica e as modernas pesquisas na área da

fotoquímica, tornou-se claro que os processos fotobiológicos são dependentes dos

limites da absorção do espectro da luz de diversas substâncias químicas com

propriedades fotossensibilizantes. Assim, para que uma substância química seja um

eficiente agente fotossensibilizante, a mesma deve ser capaz de tornar-se excitável

quando exposta à irradiação da luz e dessa forma, convertendo-se em um estado

altamente energético e relativamente de longa duração na forma tripleto (PERVAIZ,

2001; VOGELMANN; KRAMER, 1976).

42

A TFD envolve a administração local ou sistêmica do agente

fotossensibilizante seguido posteriormente pela irradiação da luz em um

comprimento de onda apropriado no sítio alvo para fotoativar o composto químico

(TRIESSCHEIJN et al., 2006).

Uma vez que a energia da luz é captada na forma de fótons pelo componente

químico, iniciam-se reações intercruzadas dentro da estrutura química, levando ao

salto de elétrons para um nível orbital altamente energético, seguido por uma

inversão em alta rotação orbital de elétrons, convertendo então o componente

químico em um estado altamente excitável na forma tripleto (CALIN et al., 2005;

DOLMANS et al., 2003; DOUGHERTY, 1992; HERDERSON; PERVAIZ, 2001;

JUARRANZ et al., 2008; OCHSNER, 1997; TRIESSCHEIJN et al., 2006;

VERMEERSCH et al., 1991).

Quando o componente químico retorna ao seu estado energético de repouso,

ele emite a energia sob forma de calor ou fluorescência, sendo esta última

propriedade utilizada na Clínica Médica para detecção de diversas patologias por

exames de diagnóstico por imagem (JUARRANZ et al., 2008; TRIESSCHEIJN et al.,

2006).

O agente fotossensibilizante estando na forma tripleto, ele pode sofrer dois

tipos de reações. Na primeira reação (Reação Tipo 1), o composto químico

fotossensibilizante pode reagir diretamente com o substrato biológico que pode ser

membranas celulares e biomoléculas (lipídeos, proteínas, ácidos nucleicos e etc.)

transferindo prótons (íons hidrogênio) ou elétrons, levando à geração de radicais

iônicos que por sua vez, interagem com o oxigênio produzindo espécies reativas de

oxigênio (EROs) tais como, superóxido aniônico (O2

.-), radical hidroxila (OH

.) e

peróxido de hidrogênio (H2O

2), culminando em danos importantes celulares (CALIN

et al., 2005; DOLMANS et al., 2003; FOOTE,1976; JUARRANZ et al., 2008;

PATHAK, 1982; PERVAIZ, 2001; TRIESSCHEIJN et al., 2006; VERMEERSCH et

al.,1991). Na segunda reação (Reação Tipo 2), a energia produzida pelo composto

químico na forma tripleto é transferida diretamente para o oxigênio molecular,

convertendo em 1O

2, sendo este considerado como uma das espécies altamente

reativas e extremamente eletrofílico, responsável por causar importantes alterações

nas membranas celulares, proteínas e DNA, levando à geração de danos severos e

citotóxicos até a morte celular durante o processo da TFD. Dessa forma, os danos

43

ocasionados em membranas celulares são de particular interesse para o processo

da TFD, uma vez que os compostos fotossensibilizantes tendem a acumular se

seletivamente em membranas celulares e ou organelas, e quando são fotoativados

produzem danos e morte celular. Em termos químicos, as alterações nos

fosfolipídeos de membranas e ou organelas celulares ocorrem devido à reação de

peroxidação lipídica que se inicia em consequência da formação de radicais livres e

oxigênio singleto (BALZANI; SCANDOLA, 1987; CALIN et al.,2005; CLAYTON,

1970; DOLMANS et al., 2003; DOUGHERTY et al., 1998; FOOTE, 1976; FOOTE,

1991; JUARRANZ et al., 2008; PERVAIZ, 2001; TRIESSCHEIJN et al., 2006).

Embora os mecanismos da ação da TFD ainda não são completamente

elucidados, normalmente é aceito que todos os efeitos citotóxicos gerados pela

fotoativação dos compostos químicos são dependentes da presença de oxigênio e

dessa forma, a reação de fotosensibilização não ocorre em áreas com anóxia nos

tecidos biológicos. Estudos in vivo demonstram que a indução de hipóxia do tecido

biológico por meio de clamping, abole os efeitos da TFD (DOLMANS et al., 2003;

GOMER; RAZUM, 1984).

Durante o processo da TFD, ambas as reações tipo 1 e 2 ocorrem

simultaneamente, contudo, a razão entre as duas reações e suas contribuições para

o desencadeamento dos processos de estress oxidativos levando à peroxidação

lipídica e por consequência gerando importantes efeitos citotóxicos até a morte

celular, são dependentes de alguns fatores tais como, natureza química do

composto químico fotossensibilizante, afinidade de retenção às estruturas

intracelulares e extracelulares , presença de oxigênio tissular e o tipo de substrato

biológico.

Estudo experimentais na TFD demonstram que em condições de hipóxia

tissular, a geração de radicais livres oriundos da reação de fotossensibilização Tipo

1 são primariamente responsáveis pela sensibilização. Porém, em condições de

média oxigenação tissular, o1O

2 gerado pela reação Tipo 2, desempenha um papel

fundamental por mediar amplamente todo o processo de fotossensibilização e

também dar suporte a ação dos radicais livres produzidos pela reação tipo 1 na

geração dos efeitos citotóxicos (JUARRANZ et al., 2008).

Devido à alta reatividade e a curta vida de duração das espécies reativas de

oxigênio, somente áreas próximas aos locais onde foram produzidos os efeitos da

44

TFD são afetados diretamente, pois a meia vida de duração do 1O

2 em sistemas

biológicos é menor que 0.04µs (micro segundos) e seu raio de ação é menor que

0.02 µm (micrômetro) (DOLMANS et al.,2003; JUARRANZ et al., 2008; PERVAIZ,

S., 2001; MOAN; BERG, 1991). Portanto, a extensão do foto dano é multifatorial e

depende do tipo do agente fotossensibilizante, da retenção seletiva extracelular ou

intracelular, do total da dose posológica do agente fotossensibilizante, da dose total

de exposição à irradiação da luz, da taxa de fluência da luz, da disponibilidade de

oxigênio tissular e do tempo entre a administração do agente fotossensibilizante e a

exposição à irradiação da luz (ACKROYD et al., 2001; DOLMANS et al., 2003).

1.2.3 Efeitos da TFD em Tumores

A TFD tem demonstrado possui efeitos a nível celular (HENDERSON, B.W.;

DOUGHERTY; MALONE, 1984) e subsequentemente atua na geração de

importantes alterações na vascularização tumoral contribuindo para a destruição de

tumores (ACKROYD et al., 2001; JUARRANZ et al., 2008; STAR et al., 1986).

Sabe-se que há três principais mecanismos pelos quais a TFD media a

destruição do tecido canceroso (DOLMANS et al., 2003; DOUGHERTY et al., 1998;

HASAN et al., 2003). No primeiro mecanismo, as EROs e principalmente o1O

2

gerados durante o processo de fotossensibilização da TFD produzem danos severos

diretamente às células tumorais promovendo à destruição tumoral (DOLMANS et al.,

2003; JUARRANZ et al., 2008). No segundo mecanismo, a TFD também pode gerar

danos relevantes nos vasos sanguíneos, prejudicando a vascularização tissular

levando ao colapso e falência vascular originando um quadro de severa hipóxia.

Dessa forma, a resposta vascular atua desempenhando um importante papel na

morte celular devido ao comprometimento do aporte de oxigênio e nutrientes

necessários para a manutenção e sobrevivência celular e também corroborando na

redução do fluxo sanguíneo possibilitando a ocorrência da formação de trombos

(ACKROYD et al., 2001; DOLMANS et al., 2003; REED et al., 1989; STAR et al.,

1986). E finalmente, o último mecanismo pelo qual a TFD atua é ativando a resposta

imune contra as células tumorais reminicentes do processo de fotossensibilização

(DOLMANS et al., 2003; DOUGHERTY et al., 1998; HENDERSON; GOLLNICK;

SNYDER et al., 2004; JUARRANZ et al., 2008; SOLBAN; RIZVI; HASANT, 2006;

45

TRIEESSCHEIJN et al., 2006). Portanto a contribuição de cada um desses

mecanismos durante o processo de fotosensibilização depende de vários fatores os

quais podemos incluir a natureza do agente fotossensibilizante, local de retenção

dentro do tecido tumoral, dose de exposição da luz adotada, tipo de tumor e seu

grau de vascularização (JUARRANZ et al.,2008; TRIESSCHEIJN et al., 2006).

Desde 1991, pesquisas experimentais têm mostrados que a TFD causa nas

células neoplásicas uma resposta de morte celular tanto por meio de apoptose

quanto de necrose (AGARWAL et al.,1991) fornecendo amplas bases na avaliação

da eficácia terapêutica da TFD. Normalmente, a apoptose é definida como um

processo de energia dependente que ocorre na maioria das células e que atua

regulando o processo de morte celular programada. Têm-se sugerido que o

processo apopótico é causado primariamente pelo dano mitocondrial (KESSEL;

LUO, 1998). Entretanto, injúrias fotooxidativas desencadeadas durante o processo

da TFD também estimulam um número de respostas, os quais incluíram efeitos

citotóxicos diretos dentro do microambiente tumoral (MOOR, 2000) e danos

relevantes nas células endoteliais vasculares que podem estar em combinação ou

não resultando em um colapso vascular que por consequência levando à morte

celular por severa hipóxia (ACKROYD et al., 2001; FINGAR, 1996; REED et al.,

1989). Portanto tais efeitos são imprescindíveis para o início da ablação da massa

tumoral no processo da TFD e que são determinantes na regulação da resposta

imunitária tanto no processo de ativação quanto na supressão. Além disso, os

processos inflamatórios são caracterizados pela geração de uma ampla variedade

de mediadores pró-inflamatórios e vem acompanhado pelo recrutamento leucocitário

e que normalmente ocorrem após o processo da TFD. Assim as amplificações de

suas ações, bem como a indução da resposta inflamatória aguda e a geração da

resposta imunitária tumor-específica desempenham um papel decisivo para garantir

o controle da resposta imunitária a longo prazo durante o processo da TFD

(DOLMANS et al., 2003; KORBELIK, 1996; KORBELIK; CECIC, 1999).

Ação Letal Direta nas células tumorais

Em experimentos com modelos tumorais in vivo utilizando a TFD observa-se

uma redução do número de células tumorais clonogênicas em virtude do foto dano

pela geração de EROs decorrentes da ação de peroxidação lipídica, foto oxidação

46

das bases de guanina do DNA e danos nas membranas do citoesqueleto e de outros

sítios intracelulares, dessa forma, desencadeando o processo de morte celular e a

destruição do tecido biológico (CASTANO et al., 2005; DOLMANS et al., 2003;

HUANG et al., 2005; KÜBLER, A.C., 2005; TAMIETTI et al., 2007).

Contudo, várias membranas celulares têm sido postuladas como sítios alvos

em potencial de interesse para a TFD com aplicação para os diferentes tipos de

agentes fotossensibilizantes entre elas podem citar membrana plasmática,

mitocondrial, nuclear, do lisossoma, do complexo de Golgi, do retículo

endoplasmático e estruturas biomoleculares do cito esqueleto (ACKROYD et al.,

2001; ASSUNÇÃO GUIMARÃES, C.; LINDEN, 2004; BUCKMANN et al., 2001;

CANDAL et al., 2005; CASTANO et al., 2004; CREGAN et al., 2002; HUANG, et al.,

2005; JUARRANZ et al., 2008; KLIONSKY; EMR, 2000; KÜBLER, 2005; PENG et

al.,1996; TAMIETTI et al., 2007). Assim, tais sítios têm sido extensivamente

considerados como um importante local constituído por biomoléculas que são

fortemente suscetíveis ao ataque do oxigênio singleto 1O

2 e EROs geradas a partir

da ação de peroxidação lipídica durante o processo de fotossensibilização da TFD

(HENDERSON; DOUGHERTY, 1992; PENG et al., 1996; PERVAIZ, 2001).

Portanto, o dano letal está intrinsecamente relacionado tanto ao processo de

peroxidação lipídica mediado pela ação do 1O

2 como importantes modificações

oxidativas de proteínas presentes nas membranas celulares (DAS; MUKHTAR et al.,

1985; DAVIES, 1987; PERVAIZ, 2001).

Os principais mecanismos de morte celular, apoptose e necrose têm sido

descritos após o emprego da TFD e parecem estarem relacionados com o local de

retenção celular do composto fotossensibilizante no tecido biológico (JUARRANZ et

al., 2008). A necrose é normalmente caracterizada pelo modo de morte celular que

está associado com a perda da homeostasia em decorrência do aumento do volume

celular, agregação da cromatina, desorganização do citoplasma, perda da

integridade da membrana plasmática e conseqüente ruptura celular. Assim durante o

processo da necrose, o conteúdo celular é liberado causando danos às células

vizinhas e uma reação inflamatória no local. Por outro lado, processo de morte

celular por apoptose que é regulado geneticamente, há à ocorrência da perda do

volume celular, formação de Blebbing na membrana plasmática, condensação

nuclear, agregação da cromatina e degradação endonucleocítica do DNA em

47

fragmentos nucleossomais e formação de corpos apoptóticos. Tais mudanças

celulares ocorrem após uma cascata de sinalização celular e eventos mediados por

caspases que regulam a expressão de proteínas pró e anti-apoptóticas

Posteriormente os corpos apoptóticos são rapidamente fagocitados por

macrófagos e removidos sem causar comprometimento às estruturas vizinhas e

inflamação (GRIVICICH et al., 2007; HU; KANAVAGH, 2003; RUPNARAIN et al.,

2006; ZIEGLER; GROSCURTH, 2004; ZONG; THOMPSON, 2006; WILLIANS;

SMITH, 1993).

Contudo a mitocôndria parece desempenhar um papel crucial no processo de

apoptose pela geração de fatores apoptóticos tais como cytocromo c (Cyt c) e

fatores intermembranários presentes no citoplasma celular. Este processo ocorre em

função da ação de peroxidação da cardiolipina (CL), um fosfolipídio essencial que

atua no metabolismo energético de organismos celulares e pluricelulares, presente

na membrana mitocondrial e que está envolvida nos mecanismos fisiológicos e em

alterações patológicas onde a via de síntese e metabólica desempenha um papel

chave na manutenção estrutural e funcional da mitocôndria e por consequência na

sobrevivência celular (TAMIETTI et al., 2007).

Embora o mecanismo de destruição direta da TFD nas células neoplásicas

ainda continua sendo objeto de investigação têm-se sugerido que a ação do 1O

2

durante a TFD apresenta tendência a induzir a morte celular por apoptose, enquanto

que a geração de danos celulares pelas EROs levam ao processo de morte celular

por necrose (FRUTOS; CORN, 1998; KOCHEVAR et al., 2000; LIN, 2000). Assim,

dependendo do sítio de geração do fotodano provocado pela ativação do composto

fotossensibilizante, tanto o mecanismo de apoptose quanto o de necrose estão

intimamente envolvidos na morte celular e que são descritos em trabalhos com

células e tecidos neoplásicos tratados com TFD (DAHLE et al., 1999; DAVIES, 1987;

PERVAIZ, 2001; VILLANUEVA et al., 1999).

Muitos trabalhos experimentais indicam que os agentes fotossensibilizantes

que se ligam em organelas celulares tais como, mitocôndria e retículo

endoplasmático são melhores indutores ao processo de apoptose, pois levam

principalmente à indução transitória da permeabilidade da membrana mitocondrial

liberando fatores pró-apoptóticos dentro do citosol celular e dessa forma

desencadeando a morte celular por apoptose (JUARRANZ et al., 2008; KESSEL;

48

LUO, 1999; KROEMER et al., 1997; KROEMER, 2003; PERVAIZ, 2001; TAMIETTI

et al., 2007). Por outro lado, agentes fotossensibilizantes que se ligam

predominantemente em membranas plasmáticas, lisossomos e estruturas do

complexo de Golgi ou que ficam totalmente difundidos no citosol celular tendem a

desencadear a morte celular por necrose (BUYTAERT et al., 2007; JUARRANZ et

al., 2008; KESSEL; LUO, 1999; KESSEL; VICENTE; REINERS, 2006; KROEMER et

al., 1997; KROEMER, 2003; OLEINICK et al., 2002; PERVAIZ, 2001; VILLANUEVA

et al., 2003).

Considerando que 1O

2 apresenta um uma curta vida de durarção, vale

destacar que o alvo primário a ser atacado deve estar necessáriamente bem

próximo do agente fotossensibilizante para que ocorra uma ação efetora de

fotodano. Além disso, relocalização do agente fotossensibilizante a nível celular têm

sido observado durante o proesso de irradiação, desta forma, afentando outros alvos

secundários. Neste caso, a localização do sítio primário pode não ser decisiva para

desencadear morte celular, mas sim provocar um efetivo fotodano que possa

amplificar seus efeitos em sites secundários onde o agente fotosenssibilizante é

relocalizado (BUYTAERT et al., 2007; JUARRANZ et al., 2008; KESSEL, 2002).

Portanto a eficácia na TFD é multifatorial e dependente da natureza química,

das propriedades físico químicas e da concentração dos agentes

fotossensibilizantes empregados, da via de administração adotada, do tempo de

incubação, da dose de energia da luz utilizada e finalmente do tipo de tumor e o seu

grau de vascularização tissular. Todos estes fatores descritos são extremamente

relevantes e determinam o sitio de retenção e geração tanto do 1O

2 como das EROs

no processo de fotoativação do componente fotossensibilizante levando ao

desencadeamento de danos celulares até a morte celular (JUARRANZ et al., 2008;

PERVAIZ, 2001).

Danos na Vascularização tumoral

A viabilidade das células tumorais é dependente principalmente da

manutenção do suprimento de oxigênio e nutrientes presentes nos vasos

sanguíneos e dessa forma, a formação e o controle da angiogênese são mediados

49

pela ação dos fatores de crescimento produzidos pelo ambiente tumoral (DOLMANS

et al., 2003).

Contudo, a vascularização é considerada como uma rota comum permitindo à

disseminação das células cancerosas para outros órgãos distantes do sítio primário

tumoral levando ao processo de metastatização. Além disso, a mesma tem como

finalidade garantir a viabilidade celular promovendo o aporte de oxigênio e nutrientes

necessários para a manutenção celular (DOLMANS et al., 2003; JUARRANZ et al.,

2008). Assim, a vascularização tumoral é apontada como uma importante e

promissora abordagem do ponto de vista terapêutico contra câncer (CARMELIET;

JAIN, 2000; DOLMANS et al., 2003; JAIN; CARMELIET, 2001; JUARRANZ et al.,

2008). Neste sentido, o dano vascular tem sido largamente investigado auxiliando de

certa forma no suporte e na garantia de se obter resultados mais confiáveis e

eficazes na aplicação da TFD com diversos tipos de agentes fotossensibilizantes na

terapêutica contra o câncer (DOLMANS et al., 2003; JUARRANZ et al., 2008).

Em experimentos iniciais com TFD têm descrito que normalmente todos os

agentes fotossensibilizantes invariavelmente induzem vasoconstrição e formação de

trombos pela ativação dos fatoresde agregação plaquetária, dessa forma, limitando

o suprimento de oxigênio e nutrientes para as células neoplásicas e finalmente

promovendo o colapso ou falência vascular levando a um quadro de severa hipóxia

ou anóxia tissular (BUSCH et al., 2002; CHEN et al.,1996; DOLMANS et al., 2002;

DOLMANS et al., 2003; FINGAR et al., 1997; FINGAR et al., 1999; HENDERSON;

FINGAR, 1987; JUARRANZ et al., 2008; STAR et al., 1986).

Também Henderson e seus colaboradores demonstraram em suas pesquisas

no modelo de fibrosarcoma o qual o Photofrin® (Pinnacle Biologics Inc., USA),

induzido pela TFD causa falência vascular com diminuição do aporte de oxigênio e

nutrientes no tecido tumoral (HENDERSON; FINGER, 1989). Em outros estudos pré-

clínicos com TFD os quais foram utilizados outros compostos fotossensibilizantes

tais como, derivados da Hematoporfirina, da feoforbida e da benzoporfirina

descrevem que a resposta ao dano vascular possui caráter bifásico. Geralmente é

observada uma vasoconstrição de efeito imediato e após 3 horas do processo da

TFD, uma resposta secundária e de longo prazo é caracterizada pela ocorrência de

formação de trombos retardando o crescimento tumoral (DOLMANS et al., 2003).

Assim tais efeitos que estão associados ao dano vascular são determinantes

para a inibição ou retardamento da progressão tumoral (CASTANO et al., 2006;

50

DOLMANS et al., 2002; DOLMANS et al., 2003; GOMER et al., 2006; JUARRANZ et

al., 2003; TOZER; KANTHON; BAGULEY, 2005). Além disso, nota-se durante o

processo de fotossensibilização há a ocorrência de danos as células endoteliais

vasculares em tumores tratados com TFD e que ativam uma cascata de eventos

levando à vasodilatação, alterações na permeabilidade vascular pelo aumento dos

fatores de adesão molecular, ativação de fatores de agregação plaquetária e

finalmente desencadeando um quadro inflamatório agudo, sendo este responsável

por atuar modulando a resposta imunológica (CASTANO et al., 2006; GOMER et al.,

2006; JUARRANZ et al., 2008). Assim a resultante da injúria vascular, uma vez

caracterizada pela resposta inflamatória aguda induzida pela TFD é também

responsável pela morte das células neoplásicas tanto pelo processo de necrose

quanto de apoptose, as quais são eliminadas rapidamente por macrófagos,

granulócitos e pelo infiltrado leucocitário presente no ambiente tumoral (JUARRANZ

et al., 2008). Contudo, os restos celulares resultantes do processo de

fotosensibilização da TFD estimulam o microambiente tumoral na ativação e no

aumento da expressão dos fatores pró-inflamatório tais como, fator de crescimento

endotelial vascular (VEGF), cicloxigenase-2 (COX-2), prostaglandinas, fator de

necrose tumoral (TNF-α), metaloproteinases de matriz extracelular (MMPs),

integrinas, interleucinas (IL-1, IL-6 e IL-8) e proteínas de choque térmico (HSPs),

promovendo dessa forma na viabilização de antígenos necessários para

sensibilização e na atração de macrófagos e células dendríticas oriundos dos

nódulos linfáticos ativando a resposta imunológica. Contudo, sugerem-se estudos

adicionais que serão necessários para se determinar com mais precisão os efeitos

dos danos vasculares induzidos pela TFD no controle da resposta imune a longo

prazo (DOLMANS et al., 2003; JUARRANZ et al., 2008).

Resposta Imunológica

A inflamação aguda é gerada a partir do dano celular (necrose/apoptose)

induzida pela TFD e que pode potencializar a resposta imunitária anti-tumoral

específica através da atração leucocitária ou seja, por neutrófilos, linfócitos,

macrófagos e células dendríticas para dentro do ambiente tumoral e

consequentemente aumentando o reconhecimento de antígenos (CASTANO et al.,

2006).

51

Um dos principais marcadores celulares induzíveis pelo processo TFD e

posteriormente liberado pelos restos celulares tumorais em decorrência do dano

celular é a proteína extracelular 70 de choque térmico (HSP70). Esta proteína é

eficientemente ativada após o estress oxidadativo celular e a mesma permenece

intracelularmente prevenindo a morte celular pela inibição da agregação de

proteínas celulares (YENARI et al., 2005). Esta propriedade não só permite a

inibição da morte celular, mas também promove a formação de um complexo estável

com antígenos citoplasmáticos das células tumorais. Estes complexos podem ser

expressos na superfície celular e escapam intactamente dos restos celulares

interagindo com as células apresentadoras de reconhecimento de antígenos (APCs)

estimulando a resposta imune (KORBELIK, M.; SUN, J.; CECIC, I., 2005). Portanto,

as chaperonas em especial a HSP70 atua ligando-se aos receptores de alta

afinidade de superfície das células APCs, promovendo a ativação, sensibilização

das células dendríticas, permitindo a apresentação cruzada do peptídeo do antígeno

de carga HSP70 das APCs para as células linfócitas citotóxica tipo CD8+ (TODRYK

et al., 1999).

Dessa forma este processo leva a sensibilização não só das células

dendríticas, mas também, macrófagos, linfócitos, neutrófilos que migram dos

nódulos linfáticos para o sitio tumoral ativando a resposta imune (Juarranz et al.,

2008). São previstas alterações induzidas pela TFD caracterizadas pelo aumento da

expressão da transcrição de fatores como NFkB (fator nuclear kappa B) e proteína

ativadora 1 (AP-1) que estimulam a ativação da transcrição de genes que codificam

diversas proteínas imunoreguladoras e pró-inflamatórias por consequência do dano

oxidativo celular (BAEUERLE; HENKEL,1994; CASTANO et al., 2006; HAEFNER,

2002; SUN; XIAO, 2003). Também há relatos que o processo inflamatóro induzido

pela TFD é controlado pelo aumento da expressão de mediadores inflamatórios tais

como IL-1 β, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, proteína inflamatória de macrófago (MIP-1 e

MIP-2), prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanas, COX-2, proteinases,

peroxidades, EROs, substâncias vasoativas , componentes do complemento (C3 e

C5), fatores de coagulação plaquetária, integrinas e fatores de crescimento (TGFβ,

VEGF). (CASTANO et al., 2006; DOLMANS et al., 2003; EVANS et al., 1990;

EVANS et al., 2001; GOLLNICK et al., 1997; GOLLNICK et al., 2003; JUARRANZ et

al., 2008; KICK et al., 1995; KORBELICK; KROSL, 1994; NSEYO et al., 1990;

STEUBING et al.,1991).

52

Pesquisas têm sugerido que o recrutamento neutrofílico para os sítios

tumorais que receberam tratamento com TFD é fortemente controlado não só pela

ação dos mediadores inflamatórios produzidos por macrófagos residentes e células

do estroma e células endoteliais do tumor sólido mas também por alterações na

permeabilidade vascular e no aumento da expressão de fatores de adesão vascular

(E-Selectina) e intracelular (ICAM-1) que colaboram nas etapas da cascata de

adesão celular necessárias para a diapedese neutrofílica, e dessa forma

contribuíndo para uma efetiva resposta tumoricida (BHUVANESWARI et al., 2009;

BOZIC et al., 1995; BUTCHER; PICKER, 1996; CASTANO et al., 2006; CHEN et al.

2006; DI CARLO et al., 2002; GOLLNICK et al., 2003; MACKAY, 2001)

Embora o dano vascular e a ocorrencia de hipoxia após a TFD contribui para

uma efetiva resposta inflamatória no ambiente tumoral, reduções dos níveis de

oxiigênio tissular durante o tratamento podem limitar a eficácia no controle de

progressão tumoral, induzindo à produção de marcadores inflamatórios pró-

angiogênicos tais como VEGF, TGFβ, COX-2, metaloproteinases entre outros

levando à ressurgência tumoral. (BHUVANESWARI et al., 2009). Portanto é

importante gerar dados no perfil das citocinas inflamatórias e outros marcadores em

sítios tumorais tratados com TFD desde que possam auxiliar a estabelecer

adequados parâmetros no esquema de tratamento e que garantem uma correta

resposta imunitária anti-tumoral específica tanto inata bem como adaptativa

(CASTANO et al., 2006; FERRARIO et al., 2000; FERRARIO et al., 2004;

FERRARIO et al., 2005; GARG et al., 2010).

1.3 Azul de Metileno

O azul de metileno é um corante que pertence à classe dos corantes

fenotiazínicos e que deperta grande interesse devido às suas propriedades

eletrocatalíticas em face da NADH4, que é uma coenzima do grupo das

dehidrogenases (SCHIRMER et al., 2011; WAINWRIGHT; AMARAL, 2005). Além

disso, o mesmo têm-se mostrado como um potente agente fotossensibilizante com

excelentes propriedades fotoquímicas em função de possuir alto rendimento na

geração de 1O

2 e EROs na presença de agentes redutores (CHEN et al., 2008;

GABRIELLI et al., 2004; PELOI et al., 2008; TARDIVO et al., 2004; TARDIVO et al.,

53

2005). Devido às suas características fotodinâmicas e fototóxicas e demonstrar alta

afinidade com a membrana mitocondrial celular, o azul de metileno têm-se

destacado como um efetivo fotossensibilizante de grande potencial para à aplicação

médica como agente terapêutico na TFD. Em face de suas propriedades físico-

químicas, o mesmo quando está na forma fotoativada, liga-se significantemente na

membrana mitocondrial, causando importantes alterações funcionais levando ao

quadro de falência mitocondrial que por consequência promovendo morte celular por

apoptose (BALL et al., 1998; CHEN et al., 2008; NOODT et al., 1998; ORTH et al.,

2000).

O azul de metileno também é definido como um inibidor da óxido nítrico

sintase e da guanilato ciclase, tendo diversas aplicações terapêuticas tanto na

Medicina como na Veterinária (AUERBACH et al., 2010; BURROWS, 1984; JENA;

CHAINY, et al., 2008; SHIRMER et al., 2011). Também um de seus empregos na

área médica está baseado no seu papel como transportador de elétrons em

sistemas inativos da metemoglobina redutase dependente de NADPH (BURROWS,

1984; SMITH, 1980) como implicações clínicas no tratamento de várias formas da

metemoglobinemia, mas principalmente na forma adquirida, que é uma

manifestação severa da infecção por malária levando ao quadro de uma profunda

anemia que pode levar ao óbito. Portanto, o azul de metileno é utilizado

classicamente como um efetivo agente antimalárico, principalmente nos países onde

há um aumento da resistência do Plasmodium falciparum (P. falciparum), pelo uso

de agentes antimaláricos de primeira geração relacionados ao grupo da cloroquina e

da pirimetamina-sulfadoxina (GINIMUGE; JYOTHI, 2010; MEISSNER et al., 2006;

SCHIRMER et al., 2003).

Como agente antiparasitário, o mesmo apresenta peliotropismo; primeiro ele

age interferindo no metabolismo da hemoglobina e do grupo heme presente nas

organelas digestivas do parasita, impedindo o seu crescimento e desenvolvimento.

Por último, o azul de metileno atua como inibidor seletivo da enzima glutationa

redutase, promovendo depleção dos níveis de glutationa dentro do citosol

parasitário, revertendo o quadro de sensibilização P. falciparum à ação da

cloroquina, e também prevenindo a reação de polimerização do grupo heme em

hemozoin semelhante à ação dos agentes antimaláricos derivados de 4-

aminoquinolina (AKOMPONG et al., 2000; ATAMNA et al., 1996; BECKER et al.,

54

2003; DAVIOUD – CHARVET et al., 2001; GINIMUGE; JYOTHI, 2010; MEISSNER

et al., 2006; MÜLLER et al., 2001; RIDLEY, 2002; SCHIRMER et al., 2003).

Embora, o emprego do azul de metileno como agente antimalárico tenha sido

utilizado desde 1891 por Guttmann e Erlich exclusivamente no tratamento contra a

malária, atualmente suas indicações clínicas têm sido amplamente revisadas

(COULIBALY et al., 2009; FÄBER et al., 1998; SCHIRMER et al., 2011;

VENNERSTROM et al., 1995). Desde 2010, houve mais de 11.000 acessos de

procura do azul de metileno nas bases de dados científicos na área médica, e

observamos que tais ferramentas de pesquisa ainda não foram totalmente cobertas

por trabalhos anteriormente publicados ao uso do banco de dados e, portanto,

levando à aquisição de poucas informações relacionadas ao azul de metileno

(SCHIRMER, et al., 2011).

Recentemente as indicações terapêuticas do azul de metileno têm sido

aprovadas pelo FDA e estão sendo direcionadas não só para o tratamento de

diversas formas da metemoglobinemia (hereditária, aguda e adquirida), mas também

estão sendo indroduzidas clinicamente no tratamento de diversas condições tais

como na síndrome de vasoplegia refratária, em distúrbios cardiovasculares

realcionados ao choque séptico, na encefalopatia induzida pela isofosfamida em

pacientes com câncer e na síndrome hepatopulmonar que causa severa hipoxemia

(AUERBACH et al., 2010; GINIMUGE; JYOTHI, 2010; JENA; CHAINY, 2008; KWOL;

HOWES, 2006; PATEL, 2006; PELGRIMS et al., 2000; SCHIRMER et al., 2011;

SHANMUGAM, 2005). Contudo o azul de metileno ainda tem despertado grande

interesse na área médica por apresentar grande potencial uso terapêutico no

tratamento contra a doença de Alzheimer (AUERBACH et al. 2010; GINIMUGE;

JYOTHI, 2010; SCHEINDLIN, 2008).

Além disso, os efeitos do azul de metileno têm sido amplamente investigados

na TFD com destaque princincipalmente contra o câncer (GINIMUGE; JYOTHI,

2010; WONDRAK, 2007).

Considerando o azul de metileno como um pigmento com ação redutora, o

mesmo também apresenta atividade ant-fúngica, antimicrobiana e antiviral, sendo

muito efetiva sua utilização na clínica médica na prevenção de infecções no trato

urinário em pacientes idosos, no tratamento de úlceras e feridas que apresentam

resistência bacteriana, psoríases e afecções causadas pelo vírus da hepatite C e do

HIV em combinação com uma fonte de luz externa (CALZAVARA-PINTON et al.,

55

2005; GINIMUGE; JYOTHI, 2010; PELOI et al., 2008; PHOENIX et al., 2003;

WAINWRIGHT; CROSSLEY, 2002).

Atualmente as doses recomendadas em diferentes condições clínicas variam

de acordo com a indicação terapêutica e posologia (GINIMUGE et al., 2011;

SCHIMER et al., 2011). Em humanos o azul de metileno quando administrado, o

mesmo apresenta boa tolerância, excelente absorção e é amplamente difundido

para outros tecidos e órgãos tais como, coração, pulmão, fígado, rins e também

atravessa a barreira hematoencefálica. Sua biodisponibilidade é aproximadamente

de 73% e sua eliminação é exclusivamente renal na forma leuco- azul de metileno e

metabólitos demetilados (azure a e b) (AUERBACH et al., 2010; GAUDETTE;

LODGE, 2005; PETER et al., 2000; SCHIRMER et al., 2011; WALTER–SACK et al.,

2009). Reações adversas podem ocorrer quando o azul de metileno é administrado

em altas doses acima de 7mg/kg peso corporal (i.v), entre elas podemos citar

náuseas, distúrbios gastrointestinais, dores abdominais e peitorais, cianose,

sudorese, cefaleias, tonturas, confusão mental e metemoglobinemia (AUERBACH et

al., 2010; CLIFTON; LEIKIN, 2003; SCHIRMER et al., 2011).

56

2 HIPOTESE

O presente estudo visa investigar a hipótese deque baixas doses de azul de

metileno, como agente fotossensível, associado à radiação do Laser de baixa

oitência em baixas doses pode ativar ou amplificar um processo inflamatório

intra=tumoral, e desta forma modular o processo da progressão tumoral.

57

3 OBJETIVOS

Estudar a regulação e expressão de mediadores inflamatórios no

desenvolvimento e progressão do Tumor de Walker 256, com o emprego da Terapia

Fotodinâmica e a utilização do azul de metileno como agente fotossensibilizante

quimioterápico.

Dessa forma, investigaremos a expressão de COX -1 e COX -2 por RT-PCR

na massa tumoral; a produção de mediadores inflamatórios, prostanóides e citocinas

no tumor com e sem a PDT e as alterações morfológicas peri e intra-tumoral

utilizando método histológico com coloração em H.E

58

4 METODOLOGIA

4.1 Protocolos Experimentais no Modelo do Tumor de Walker 256

O experimento foi realizado no Laboratório de Farmacologia e Terapêutica

Experimental do Departamento de Farmacologia do Instituto de Ciências Biomédicas

localizado na Universidade São Paulo, seguindo todas as normas e procedimentos

de biossegurança.

4.1.1 Animais

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo CEEA do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo seguindo os princípios

éticos em experimentação animal elaborados pelo Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA), sobre os protocolos de experimentação que

envolva o uso de animais.

Ratos albinos machos da linhagem Wistar com idade mínima de oito semanas,

pesando cerca de 200 gramas, provenientes do Biotério Central do Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo foram empregados semanalmente

neste modelo experimental para manutenção in vivo das células tumorais de Walker

256 no peritônio. Os animais foram alocados, em grupos de no mínimo três animais,

em caixa de polietileno com medidas de 40 x 60 x 18 cm, sendo mantidos no

Biotério do Departamento de Farmacologia, para a devida ambientação , durante

três dias; que antecederam o início do experimento; sob condições padrão de

higiene, com ciclo de luz de 12h/dia, temperatura e umidade constantes, ruído

mínimo e água e ração ad libitum.

4.1.2 Procedência das células tumorais de Walker 256

A linhagem do tumor de Walker 256 foi cedida gentilmente pela Profa. Dra.

Marília Cerqueira Leite Seelaender responsável do Laboratório do Metabolismo e

Câncer do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo para o Laboratório de

Farmacologia e Terapêutica Experimental do Departamento de Farmacologia do

59

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade São Paulo, com finalidade do

estabelecimento e manutenção in vivo da mesma linhagem no laboratório para o

emprego nesta pesquisa.

As células tumorais de Walker 256 foram recebidas em vials criogênicos

correspondendo a uma alíquota de dois mL do líquido hemorrágico peritoneal numa

concentração final de 5x107 células TW 256/ml. Os vials criogênicos foram

estocados e mantidos em condições de congelamento sob nitrogênio líquido antes

do início do procedimento experimental. A manutenção das células tumorais de

Walker 256 foi realizada semanalmente através de transplantação de animais numa

concentração de 2x107 células TW 256/ml.

4.1.3 Materiais e Reagentes

A metodologia empregada utilizou de materiais e reagentes que foram

devidamente documentados para a realização do procedimento operacional padrão.

Materiais

Material cirúrgico de inox: pinça dente de rato, tesoura de ponta curva e de ponta

reta;

Algodão e gazes descartáveis para curativos;

Seringas descartáveis de 3 mL, BD Plastipack; Brasil

Seringas descaráveis de insulina de 1 mL BD Plastipack; Brasil

Agulhas descartáveis 0.45x13 26G ½, BD Precision Glide;Brasil

Agulhas descartáveis 0.70x25 22G 1, BD Precision Glide;Brasil

Eppendorfs; Unilab, São Paulo; Brasil

Pipetas ajustáveis (2, 20, 200, 1000 e 5000 L) Gilson DistrimanT.M

; France

Ponteiras descartáveis de plástico na cor branca (1-20 L); amarela (1-200 L) e

azul (200 – 1000 L), Unilab, São Paulo; Brasil

Proveta volumétrica graduada com volume de 100 mL, Laborglass ; Brasil

Tubos tipo Falcon graduado com volume de 50 mL; SPLabor; Brasil

Pipeta Pasteur descartável de vidro de 230 mm, Bioline; Brasil

Câmara de Neubauer e lamínula de vidro; Ciencor Scientific; Brasil

60

Contador de células manual;

pH-metro Quimis, modelo Q400P, part n.610874; USA

Microscópio Biológico Binocular – E200 – Nikon, Nikon Corpotation

Sistema de Laser de baixa potência, Thera lase, DMC®, São Carlos, Brasil.

Reagentes e soluções

Fosfato monossódico mono-hidratado (NaH2PO4 . 1H2O), Sigma-Aldrich

Fosfato dissódico hepta-hidratado (Na2HPO4 . 7H2O), Sigma-Aldrich

Cloreto de Sódio (NaCl), Merck

EDTA dissódico, Sigma - Aldrich

Azul de Tripan, Merck

Água Deionizada (Sistema Milli-Q ou Elga UHQ)

Solução Fisiológica – NaCl 0.9%

Solução de Tampão Fosfato 0.1mM pH= 7.4

Solução de EDTA dissódico 5%

Solução de Azul de Tripan 0.4%

Solução de azul de metileno 3%

A solução de Azul de Metileno 3% foi cedida gentilmente pelo Prof. Dr.

Maurício S. Baptista responsável pelo laboratório de cinética rápida e fototermia do

Departamento de Bioquímica do Instituto de Quimica da Universidade São Paulo

Preparo das Soluções

Todas as soluções preparadas foram acondicionadas a + 4C em tubos tipo

falcom e devidamente identificados com a concentração final da solução obtida, bem

como a sua data de preparo.

Solução Fisiológica - NaCl 0.9%

Solução Fisiológica foi preparada dissolvendo 81,82 g de Cloreto de Sódio

(NaCl) em 1L de água deionizada, obtendo uma concentração final de 0,9 g/mL.

61

Solução de Tampão Fosfato (PBS) 0.1mM pH = 7,4

Para a solução de tampão fosfato (PBS), primeiramente foi preparada a

Solução A dissolvendo 27,8 g do Fosfato monossódico mono-hidratado (NaH2PO4

1H2O) em 1 L de água deionizada, obtendo uma concentração final de 0,028 g/mL

ou 0,2 Molar de NaH2PO4, Depois foi preparado a Solução B dissolvendo 53,65 g de

Fosfato dissódico hepta-hidratado (Na2HPO4 . 7H2O) em 1 L de água deionizada,

obtendo uma concentração de 0,054 g/mL ou 0,2 Molar de (Na2HPO4 . 7H2O). A

solução de tampão fosfato (PBS) foi então preparada transferindo 19 mL da Solução

A e 81 mL da Solução B para uma proveta graduada de 200 mL , em seguida o

volume final foi completado Solução Fisiológica 0,9%. Ajustar o pH = 7,4 se

necessário.

Solução de EDTA dissódico 5%

A solução de EDTA dissódico (Ácido Etilenodiamino dissódico) foi preparada

dissolvendo 5 g do reagente em 100 mL de Solução Fisiológica, obtendo uma

concentração final de 0,05 g/mL.

Solução salina de Azul de Tripan 0,4%

A solução de Azul de Tripan foi preparada dissolvendo 0,4 g do reagente em

100 mL de Solução Fisiológica, obtendo uma concentração final de 0,004 g/mL.

Solução de Azul de Metileno

As diferentes concentrações de azul de metileno 0.1%, 0.3% e 1.0% foram

preparadas a partir da solução primária de azul de metileno na concentração de 3%

utilizando a seguinte equação:

C

A.M 3% x V

A.M 3% = Cfinal x V

final

Onde:

CA.M 3%

= Concentração da solução primária de azul de metileno

VA.M 3%

= volume a ser pipetado da solução primária de azul de metileno

62

Cfinal

= Concentração final da solução de azul de metileno

Vfinal

= volume final da solução de azul de metileno

4.1.4 Obtenção do Tumor de Walker 256 Intraperitoneal

Após o desenvolvimento da ascite, os animais foram eutanaziados em câmara

de CO2. Após a eutanazia, realizou-se uma laparotomia para a exposição da

cavidade abdominal do animal. O líquido hemorrágico presente na cavidade

abdominal foi coletado através de uma pipeta descartável de 5 mL e transferido para

um tubo tipo falcom de 50 mL contendo previamente 1 mL da solução de EDTA 5%,

dessa forma, obtendo o líquido ascítico do Tumor de Walker 256.

Contagem das células viáveis do Tumor de Walker 256

A contagem das células viáveis do Tumor de Walker 256 foi realizada por meio

de leitura no quadrante central da câmara de Neubauer utilizando o método de

exclusão do Azul de Tripan, com o emprego de um microscópio óptico no aumento

de 400 vezes e um contador de células manual. Para a realização da contagem

celular, primeiro foram preparadas as diluições das células tumorais de Walker 256

de acordo com o seguinte procedimento:

a) Pipetar 1L do tumor ascítico e transferir para um eppendorf contendo 999

L de solução tampão fosfato (PBS), obtendo a Solução A com fator de diluição

1000.

b) Pipetar 50 L da Solução A para outro eppendorf e adicionar 50 L da Solução

de Azul de Tripan 0,4%, obtendo assim a Solução B com fator de diluição 2

c) Pipetar 50 L da Solução B e preencher com este volume o espaço entre a área

espelhada da câmara de Neubauer e a lamínula de vidro.

A contagem das células tumorais de Walker 256 foi determinada através da

seguinte equação:

Concentração de células / mL = n de células contadas x 1.000 x 2 x 104

63

Onde:

fator de diluição da Solução A = 1.000

fator de diluição da Solução B = 2

contagem na câmara de Neubauer = 104

4.1.5 Protocolo de implantação das células do Tumor de Walker 256 nos animais

Preparo da solução de inoculação

A solução de inoculação das células do Tumor de Walker 256 foi preparada

numa concentração final de 1x107células/mL em solução tampão fosfato (PBS) a

partir da solução do tumor ascítico com sua concentração previamente determinada

através do procedimento de contagem e utilizando a seguinte equação:

CTA

x VTA = CD

x VD

Onde:

CTA

= Concentração do tumor ascítico (n de células x 107/mL)

VTA

= volume do tumor ascítico em mL

CD= Concentração de 1 x 10

7/mL da diluição em solução tampão fosfato (PBS)

VD= volume da diluição correspondente

Procedimento de implantação via subcutânea das células do Tumor de

Walker 256 nos animais

Para o procedimento de implantação do Tumor de Walker 256, todos os animais

foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano na dose de

1mg/mL. Durante a anestesia, a implantação do tumor nos animais foi realizada

através da inoculação de 1 mL via subcutânea (s.c) da suspensão de células do

Tumor de Walker 256 na concentração de 1 x 106/mL, na região dorsal, empregando

a técnica clássica de “Air Pouch”. Após o procedimento, os animais retornaram ao

biotério, os quais foram mantidos em observação para a avaliação do

desenvolvimento da massa tumoral sólida.

64

4.1.6 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno no Modelo


Protocolo de tratamento com Azul de Metileno na massa sólida do Tumor

de Walker 256.

Após o período de avaliação de 14 dias do crescimento da massa tumoral

sólida, os animais foram randomizados em cinco grupos com n=5, conforme

apresentado a Tabela 1 a seguir.

Tabela 1 - Esquema dos Grupos Experimentais

Tratamento dos grupos

n=5

Salina

NaCl

0.9% (mL)

Azul de Metileno

Dose

(mg/mL)

Controle 0.1 -

Azul de Metileno 0.1% - 1




Os animais foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano na

dose de 1 mg/mL. O procedimento do tratamento foi realizado sob anestesia, que

consistiu na administração intratumoral de 0,1 mL de salina para grupo controle e

0,1 mL de azul de metileno nas concentrações de acordo com os seus respectivos

grupos tratados em seis pontos diferentes da massa tumoral, compreendendo no

total de 3 tratamentos em dias alternados.

Após o procedimento, os animais retornaram ao biotério, os quais foram

mantidos em observação para a avaliação da sobrevida, por um período de 30 dias

a partir do primeiro dia de tratamento.

65

Análise Estatística

Os dados da sobrevida foram analisados com o emprego do teste Kaplan-Meier

(KM) que é um método não-paramétrico utilizado para a estimação da curva de

sobrevivência, até a ocorrência de algum evento de interesse (morte, por exemplo).

Para comparar as curvas de sobrevivência entre os diferentes grupos tratados,

foram utilizados os testes Log-rank (Mantel Cox), Log-rank for trend e Gehan-

Breslow-Wilcoxon. As medidas de mediana para a variável tempo (dias) foram

calculadas por interpolação utilizando-se as informações das estimativas da

sobrevivência O software estatístico empregado foi o GraphPad Prism Version 5.0

(Graph Pad Software Inc.). O nível de significância foi ajustado para p ≤ 0,05.

4.1.7 Protocolos de tratamento da Curva Dose-Resposta do Azul de Metileno e do Laser no Modelo Experimental do Tumor de Walker 256

Protocolo de tratamento com Azul de Metileno na massa sólida do Tumor

de Walker 256


sólida os animais foram randomizados em quatro grupos com n=5, conforme

apresentado a Tabela 2 à seguir.



n=5

Salina

NaCl

0.9% (mL)

Azul de Metileno

Dose

(mg/mL)

Controle 0.1 -





66

Os animais foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano

na dose de 1mg/mL. O procedimento do tratamento foi realizado sob anestesia, que

consistiu na administração intratumoral de 0,1mL de salina para grupo controle e 0,1

mL de azul de metileno nas concentrações de acordo com os seus respectivos

grupos tratados em seis pontos diferentes da massa tumoral, compreendendo no

total de 3 tratamentos em dias alternados. Após 24 horas do último tratamento,

todos os animais foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano na

dose de 1mg/mL para a coleta do material biológico e posteriormente foram

eutanaziados através do deslocamento cervical.

Durante o procedimento de retirada do material biológico os animais foram

mantidos sob anestesia sendo os quais foram coletados amostras de sangue obtidas

através de uma punção na veia porta hepática e amostras de tecido vivo da massa

tumoral sólida.

Após o procedimento, as amostras de sangue foram centrifugadas durante 15

minutos a 4000 rpm para a obtenção do plasma. Todas as amostras do material

biológico, plasma e tecido da massa tumoral sólida foram acondicionadas em tubos

tipo eppendorf de 2 mL devidamente identificados, armazenados e mantidos em bio-

freezer nas condições de temperatura de -80 °C para posterior análise do perfil

toxicológico e dos mediadores inflamatórios no desenvolvimento e progressão do

Tumor de Walker 256.

Protocolo de tratamento com Laser na massa sólida do Tumor de Walker

256

Para o procedimento do protocolo de tratamento com laser, um sistema de laser

de baixa potência – Thera Lase / DMC® Brasil equipado com um terminal de saída

do laser acoplado ao cabo de fibra óptica, responsável pela transmissão da luz do

laser, foram utilizados.

O tempo de irradiação é variável para cada energia apresentada, de acordo com

a seguinte fórmula de Densidade de Energia (DE):

DE= E/A ou DE= P * t / A

67

Onde:

DE= densidade de energia

E= energia em J(Joules)

P= potência (Watts)

A= área (cm2)

t = tempo (segundos)





Tratamento dos

grupos

n=5

Dose

Energia

(J/cm2)

Energia

J (Joules)

Potência

(mwatts)

Área de

Aplicação

(cm2)

Tempo

(segundos)

Controle - - - - -

Laser 1J 33,5 1 100 1 10

Laser 3J 100 3 100 1 30

Laser 6J 200 6 100 1 60

Os animais foram previamente anestesiados por via inalatória com halotano na

dose de 1 mg/mL. O procedimento do tratamento com Laser foi realizado com

anestesia, onde a massa tumoral sólida foi irradiada em quatro pontos eqüidistantes

no comprimento de onda de 660 nm com uma energia de 1 J/cm2 e na potência de

100 mW de acordo com os seus respectivos grupos de tratamento em diferentes

doses de energia, compreendendo no total de 3 tratamentos em dias alternados.

Após 24 horas do último tratamento, todos os animais foram previamente

anestesiados por via inalatória com halotano na dose de 1 mg/mL para a coleta do

material biológico e posteriormente foram eutanaziados através do deslocamento

cervical. Durante o procedimento de retirada do material biológico os animais foram

mantidos sob anestesia, sendo os quais foram coletados amostras de tecido vivo da

massa tumoral sólida.

68

Após o procedimento, todas as amostras do tecido da massa tumoral sólida

foram acondicionadas em tubos tipo eppendorf de 2 mL devidamente identificados,

armazenados e mantidos em bio-freezer nas condições de temperatura de -80°C

para posterior análise do perfil hepático no protocolo de tratamento do azul de

metileno na massa tumoral sólida e dos mediadores inflamatórios no

desenvolvimento e progressão do Tumor de Walker 256.

4.1.8 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno na concentração

de 0.1% e Laser no Modelo Experimental do Tumor de Walker 256

Protocolo de tratamento com Azul de Metileno na concentração de 0.1% e

Laser na massa sólida do Tumor de Walker 256

Para o procedimento com aplicação de laser, um sistema de laser de baixa

potência – Thera Lase / DMC® Brasil foi utilizado equipado com um terminal de saída

do laser acoplado ao cabo de fibra óptica, responsável pela transmissão da luz do

laser, foram utilizados.

O tempo de irradiação é variável para cada energia apresentada, de acordo com

a seguinte fórmula de Densidade de Energia (DE):


Onde:




A= área (cm2)





69


Tratamento dos

grupos

n=5

Salina

NaCl

0.9%

(mL)

Azul de

Metileno

Dose

(mg/mL)

Dose

Energia

(J/cm2)

Energia

(Joules)

Potência

(mwatts)

Área de

Aplicação

(cm2)

Tempo

(s)

Controle 0.1 - - - - - -

AM 0.1% + Laser 1J - 1 33,5 1 100 1 10

A.M 0.1% + Laser 3J - 1 100 3 100 1 30

A.M 0.1% + Laser 6J - 1 200 6 100 1 60

A.M, Azul de Metileno; s, segundos ; J, Joules.


na dose de 1mg/mL. O procedimento do tratamento foi realizado sob anestesia, que


0,1 mL de azul de metileno na concentração de 0,1% de acordo com os seus

respectivos grupos tratados em seis pontos diferentes da massa tumoral. Após uma

hora do tratamento com o azul de metileno, a massa tumoral sólida foi irradiada em

quatro pontos equidistantes no comprimento de onda de 660 nm com uma energia

de 1J/cm2 e na potência de 100 mW de acordo com os seus respectivos grupos de

tratamento em diferentes doses de energia, compreendendo no total de três

tratamentos em dias alternados.

Após o procedimento, os animais retornaram ao biotério, os quais foram mantidos

em observação para a avaliação da sobrevida, por um período de 30 dias a partir do

primeiro dia de tratamento.

Análise Estatística

Os dados da sobrevida foram analisados com o emprego do teste Kaplan-

Meier (KM) que é um método não-paramétrico utilizado para a estimação da curva

de sobrevivência, até a ocorrência de algum evento de interesse (morte, por

exemplo). Para comparar as curvas de sobrevivência entre os diferentes grupos

tratados, foram utilizados os testes Log-rank (Mantel Cox), Log-rank for trend e

Gehan-Breslow-Wilcoxon. As medidas de mediana para a variável tempo (dias)

70

foram calculadas por interpolação utilizando-se as informações das estimativas da

sobrevivência O software estatístico empregado foi o GraphPad Prism Version 5.0

(Graph Pad Software Inc.). O nível de significância foi ajustado para p ≤ 0,05.

4.1.9 Protocolo de tratamento do Azul de Metileno na concentração de 0.1%

e Laser no Modelo Experimental do Tumor de Walker 256

Protocolo de tratamento com Azul de Metileno na concentração de 0.1% e

Laser na massa sólida do Tumor de Walker 256

Para o procedimento com aplicação do laser, um sistema de laser de baixa

potência – Thera Lase / DMC® Brasil dói utilizado equipado com um terminal de

saída do laser acoplado ao cabo de fibra óptica, responsável pela transmissão da luz

do laser, foram utilizados.

O tempo de irradiação é variável para cada energia apresentada, de acordo

com a seguinte fórmula de Densidade de Energia (DE):


Onde:




A= área (cm2)




apresentado a Tabela 5 á seguir.

71


Tratamento dos

grupos

n=5

Salina

NaCl

0.9%

(mL)

Azul de

Metileno

Dose

(mg/mL)

Dose

Energia

(J/cm2)

Energia

(Joules)

Potência

(mwatts)

Área de

Aplicação

(cm2)

Tempo

(s)

Controle 0.1 - - - - - -

AM 0.1% + Laser 1J - 1 33,5 1 100 1 10

A.M 0.1% + Laser 3J - 1 100 3 100 1 30

A.M 0.1% + Laser 6J - 1 200 6 100 1 60

A.M, Azul de Metileno; s, segundos; J, Joules.


na dose de 1 mg/mL. O procedimento do tratamento foi realizado sob anestesia, que


0,1 mL de azul de metileno na concentração de 0.1% de acordo com os seus

respectivos grupos tratados em seis pontos diferentes da massa tumoral,

compreendendo no total de 3 tratamentos em dias alternados. Uma hora após do

tratamento com azul de metileno, a massa tumoral sólida foi irradiada em quatro

pontos eqüidistantes no comprimento de onda de 660 nm com uma energia de

1J/cm2 e na potência de 100 mW de acordo com os seus respectivos grupos de

tratamento em diferentes doses de energia, compreendendo no total de 3

tratamentos em dias alternados.

Após 24 horas do último tratamento, todos os animais foram previamente

anestesiados por via inalatória com halotano na dose de 1mg/mL para a coleta do

material biológico e posteriormente foram eutanaziados através do deslocamento

cervical. Durante o procedimento de retirada do material biológico os animais foram

mantidos sob anestesia, sendo os quais foram coletados amostras de tecido vivo da

massa tumoral sólida.

Após o procedimento, todas as amostras do tecido da massa tumoral sólida

foram devidamente acondicionadas e identificadas em tubos tipo eppendorf de 2 mL

devidamente identificados, armazenados e mantidos em bio-freezer nas condições

de temperatura de -80 °C para posterior análise no protocolo de tratamento do azul

de metileno na concentração 0.1% e Laser na massa tumoral sólida dos mediadores

inflamatórios no desenvolvimento e progressão do Tumor de Walker 256. Amostras

72

de tecido da massa tumoral sólida também foram coletadas e devidamente

acondicionadas e identificadas em recipientes do tipo coletor universal contendo

uma solução de formol a 10% com volume suficiente para cobrir a amostra do

material biológico para posterior análise histológica.

4.2 Avaliações do Perfil Hepático no Protocolo de Tratamento do Azul de

Metileno na Massa Tumoral sólida

A determinação dos níveis de Aspartato Amino Transferase (AST ou TGO),

Alanina Amino Transferase (ALT ou TGP) e Gama GT nas amostras de plasma

sanguíneo foram realizadas pelo método enzimático, ou seja, teste cinético,

seguindo as instruções do fabricante do kit comercial (Bioclin, Brasil).

Para a quantificação de Aspartato Amino Transferase (AST ou TGO) e

Alanina Amino Transferase (ALT ou TGP) em uma placa de 96 poços pipetar 100 μl

de cada amostra em cada poço e depois adicionar 1mL do Reagente de Trabalho. A

leitura foi realizada em espectrofotômetro Espectra Max plus 384 (Sunnyvale, CA,

EUA) em comprimento de onda de 340nm, 37 °C, fazendo uma leitura inicial,

disparando simultaneamente o cronômetro e repetir as leituras após 1, 2 e 3

minutos. Após as leituras, calcular a média das diferenças de absorção por minuto

(ΔA/min.) e utilizando o seguinte cálculo.

AST e ou ALT (U/L) 340nm = ΔA/min. X 1746

Sendo que os resultados são expressos em U/L e posteriormente convertidos

em U/mL

Para a quantificação de Gama Glutamil Transferase (gama GT), em uma placa

de 96 poços pipetar 50 μl de cada amostra em cada poço e depois adicionar 1 mL

do Reagente de Trabalho. A leitura foi realizada em espectrofotômetro Espectra Max

plus 384 (Sunnyvale, CA, EUA) em comprimento de onda de 405 nm, 37 °C, fazendo

uma leitura inicial, disparando simultaneamente o cronômetro e repetir as leitura

após 1, 2 e 3 minutos. Após as leituras, calcular a média das diferenças de absorção

por minuto (ΔA/min.) e utilizando o seguinte cálculo.

Gama GT(U/L) 405nm = ΔA/min. X 2121

73

Sendo que os resultados são expressos em U/L e posteriormente convertidos

em U/mL

4.3 Avaliações dos níveis de citocinas na massa tumoral sólida

Após as amostras do tecido da massa tumoral sólida serem homogeneizadas por

meio de um homogeneizador tipo mix Dremel® 300 (Racine, WI, USA), o conteúdo

proteico presente no sobrenadante foi determinado pelo método de Bradford (1976),

empregando o kit comercial (Bio Rad, USA) e albumina de soro bovino para a

construção da curva padrão.

As dosagens das citocinas TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10 nas amostras de tecido

tumoral foram realizadas pelo teste imunoenzimático (ELISA), seguindo instruções

do kit comercial (R&D System, EUA). Para isto, placas de 96 poços foram

sensibilizadas com 100 μL de anticorpo monoclonal para cada citocina: anti-IL1β e

IL-6 foram diluídos em tampão carbonato de sódio (0,1M, pH 9,6), enquanto anti IL-

10 e TNF-α foram diluídos em tampão fosfato de sódio (0,2 M, pH 6,5). As placas

foram incubadas (4 ºC) por 18 h. Para o bloqueio, as placas foram lavadas com

PBST (solução PBS contendo 0,05% de Tween 20) por 4 vezes e depois

preenchidas com 300 μl/poço de solução de bloqueio (3 % gelatina em PBST,

Sigma) à 37 ºC por 3 horas e submetidas a novo ciclo de lavagens. A seguir, 100 μL

das amostras devidamente diluídas ou dos padrões das citocinas recombinantes

foram adicionados à placa e deixadas por 18 h em temperatura de 4 ºC. Após

lavagem, 100 μL dos respectivos anticorpos biotinilados específicos de detecção

para cada citocina foram acrescentados e deixados por 1 h em temperatura

ambiente. Após lavagem das placas, o volume de 100 μL de estreptavidina –

peroxidase foi adicionado e deixado por 1 h em temperatura ambiente (22 ºC)

seguida de novas lavagens. A reação foi revelada pela adição de 100 μL/poço da

solução de 3.3’5.5’ tetrametilbenzidina (TMB) e interrompida pela adição de 50

μl/poço de ácido sulfúrico (2 N). A leitura foi realizada em espectrofotômetro

Espectra Max plus 384 (Sunnyvale, CA, EUA) em comprimento de onda de 450nm

com correção a 570 nm. As concentrações das amostras foram calculadas a partir

das curvas-padrão obtidas com as citocinas recombinantes utilizando o programa de

aquisição de dados SOFTmax Pro Version 3.1.2 (Molecular Devices Corp, USA) do

espectrofotômetro Espectra Max plus 384 .

74

O limite de detecção para IL-1β, IL-10 e TNF-α foi de 1.95 pg/mL, enquanto

para IL-6 foi de 15.6 pg/mL.

4.4 Análises de expressão gênica dos marcadores inflamatórios na massa


reversa em tempo real (real time RT-PCR)

A expressão gênica da enzima COX-1, COX-2. iNOS e eNOS foram

quantificadas pela reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Uma

biópsia massa tumoral, foi removida e imediatamente congelada em nitrogênio

líquido e mantido a -80 ºC até o processamento. O RNA total foi extraído usando o

reagente Trizol (Gibco BRL, EUA) de acordo com instruções do fabricante.

Posteriormente o RNA isolado, foi dissolvido em água tratada com PEPC foi

quantificado por método de espectrofotometria no comprimento de onda de 260nm,

verificando a razão entre 260/280. A análise da sua integridade foi verificada através

de eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etídio, para a revelação das

bandas sob luz ultravioleta (UV). Após tratamento com DNAse, a síntese dos cDNAs

foram processadas pelo método da transcriptase reversa empregando a enzima

SuperScript (Invitrogen) a partir de 2 g de RNA total e na presença de mistura de

primers randômicos e oligo dT, incubando a 42 C por 50 minutos para otimizar a

reação de transcriptase reversa e posteriormente, inativando a enzima incubando a

70 C por 15 minutos. Os experimentos de Real-Time PCR foram programados da

seguinte maneira: 1 ciclo de desnaturação inicial de 10 min a 95 °C, e 40 ciclos de

amplificação (30 seg de desnaturação a 95 C e 1 min de anelamento e extensão a

60 C); as sequências dos primers que foram utilizados constam no trabalho de

Ferraz et al. (2004) . Os resultados foram interpretados usando a fórmula 2-Ct

(Ct: número de ciclos necessários para atingir o limiar de fluorescência acima do

valor de fundo - background) que relaciona a expressão do gene de interesse

comparado aquela do gene endógeno de controle HPRT (Hypoxanthine

Phosphoribosyltransferase).

As sequências dos primers utilizados neste trabalho são apresentados na

Tabela 6 conforme as referências utilizadas para a correta seleção durante os

experimentos.

75

Tabela 6 – Sequência de Primers empregados na análise da expressão de mRNA, pela

técnica RT-PCR em tempo real.

4.5 Determinação da Prostaglandina E2 na massa tumoral sólida

Para análise de prostaglandina E2 (PGE2), logo após a coleta, as amostras de

tecido foram armazenadas em freezer a -80 °C até o momento de sua

homegenização. A quantificação dos níveis de PGE2 foi feita através de um kit

comercial (Prostaglandin E2 EIA – Monoclonal; Cayman Chemicon, EUA). De acordo

com instruções do fabricante, as amostras foram homogeneizadas em 5 ml de

tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH7,4 contendo EDTA 1 mM e indometacina 10 M,

para cada 1 g de tecido. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 3000 g por

10 min a 4 C e o sobrenadante foi purificado utilizando-se colunas de extração C-18

(Waters, EUA). Primeiramente, o sobrenadante foi acidificado (50 L de HCl 2 M

para 1 mL de sobrenadante, ~pH 3,5) e em seguida, as amostras foram

centrifugadas novamente a 10.000 g por 10min a 4 °C. As colunas C-18 foram

previamentes preparadas passando-se 2 mL de metanol seguidos de 2 mL de água

deionizada. As amostras foram aplicadas vagarosamente às colunas C-18 e lavadas

com 2 ml de água deionizada e depois com 2 L de hexano. O eluído foi descartado e

a coluna foi seca. O conteúdo de PGE2 das amostras foram eluídos com 4 mL de

acetato de etila. Esse conteúdo foi evaporado usando-se gás nitrogênio. A amostra

foi ressuspendida adicionando-se 500 l de “EIA Buffer”.

Primer Forward/ Sense/ Left Reverse/ Anti-Sense/ Right Referência

HPRT AAG CTT GCT GGT GAA AAG GA TGA TTC AAA TCC CTG AAG TGC Bustin S.A.,

1997

COX-1 GCAGCTCTTCCAGACCACTC GCTGCAGGAAATAGCCACTC Ferraz et al.,

1997

COX-2 TGAGCACAGGATTTGACCAG CCTTGAAGTGGGTCAGGATG Ferraz et al.,

1997

iNOS GGATATCTTCGGTGCGGTCTT GCTGTAACTCTTCTGGGTGTCAGA Ferraz et al.,

1997

eNOS TTCTGGCAAGACCGATTACACGAC

AT

AAAGGCGGAGAGGACTTGTCCAA

A

Ferraz et al.,

1997

76

O método de dosagem dos níveis de PGE2 é baseado na competição entre a

PGE2 da amostra e um conjugado de PGE2-acetilcolinesterase (PGE2 Tracer) para

uma quantidade de anticorpo monoclonal de PGE2.

Para tal, amostras e curva padrão de PGE2 (com concentrações que variaram

de 7,8 a 1.000 pg/ml) foram aplicadas em placa pré-tratada com anticorpo IgG

policlonal anti-camundongo, juntamente com anticorpo monoclonal de PGE2 e tracer,

durante 18 horas a 4 °C. Em seguida, a placa foi lavada 4 vezes com 200 µl de

solução “wash buffer” e, incubada na presença de solução substrato “Ellman´s

reagent”. A leitura das absorbâncias geradas a cada 15 s foi realizada em

espectrofotômetro Espectra Max plus 384 (Sunnyvale, CA, EUA) em comprimento de

onda de 405 nm durante 1 hora. Os resultados foram obtidos através do emprego do

programa de aquisição de dados SOFTmax Pro Version 3.1.2 (Molecular Devices

Corp, USA) do espectrofotômetro Espectra Max plus 384 e expressos em ng

PGE2/g de tecido.

4.6 Avaliações da Peroxidação Lipídica na massa tumoral sólida pelo Método

de TBARS

O teste do ácido tiobarbitúrico (TBA) é uma das técnicas mais usadas para a

medida de aldeídos resultantes de peroxidação de lipídios de membranas e ácidos

graxos. Trata-se de um método simples descrito por Draper e colaboradores (1993)

e que consiste na formação de um cromóforo entre o MDA (malonalaldeído) e o TBA

com máximo de absorbância a 535 nm.

As amostras da massa tumoral sóilida foram pesadas e homogeneizadas em

tampão fosfato de potássio 0.1 M (pH 7,4 Mallinckrodt AR, México) na proporção de

5 mL de tampão para cada 1 g de tecido. Duzentos microlitros de homogenato foram

misturados a 400 L de uma solução que continha: ácido tricloroacético 15% (Merck,

Alemanha), ácido tiobarbitúrico 0,37% (Merk, Alemanha) e ácido clorídrico 0.25 N

(Mallinckrodt AR, México), e incubadas durante 45 minutos a 90 oC. Os tubos foram

centrifugados durante 15 minutos a 2000 g e a absorbância de 200 L do

sobrenadante foram lidas a 535 nm e corrigidas a 570 nm em um leitor de Elisa

(Spectramax plus 384, E.U.A.).

77

Nos brancos de reação, a amostra foi substituída pelo tampão fosfato. Os

resultados foram expressos em nmol de aldeído formado / mg de proteína, utilizando

o programa de aquisição de dados SOFTmax Pro Version 3.1.2 (Molecular Devices

Corp, USA) do espectrofotômetro Espectra Max plus 384 através do cálculo do

coeficiente de extinção molar do produto resultante da reação do TBA com o MDA

1,55 M-1 cm-1.

4.7 Análises da atividade da Mieloperoxidade (MPO)

A presença de neutrófilos foi avaliada pela dosagem da atividade da

mieloperoxidase (MPO), sendo considerado um marcador específico da presença

deste tipo celular. Portanto, avaliou-se a atividade desta enzima como um indicador

da presença e da quantidade de neutrófilos presentes na massa tumoral sólida. O

método da medida da atividade da MPO baseia-se na velocidade de oxidação do

substrato o-dianisidina na presença da água oxigenada, que é evidenciada pela

mudança da absorbância medida por espectrofotometria a 460 nm.

Após o procedimento de anestesia nos animais, foi retirada amostras do

tecido da massa tumoral sólida e transferidas para um tubo tipo eppendorf de 2 mL e

foi adicionado um volume correspondente 10x ao peso em gramas da massa da

amostra biológica, em seguida foi realizada homogenização através de um

homogeneizador tipo mix Dremel® 300 (Racine, WI, USA) durante 1 minuto. Os

tubos foram aquecidos durante 2h a 60 ºC em estufa, para a inativação da atividade

endógena da Catalase (Sato, et al., 2003), e então centrifugados a 12.000 g durante

2 minutos. Dez microlitros do sobrenadante foram pipetados em duplicatas em

microplaca de 96 poços e acrescidos com 200 microlitros de uma solução de tampão

fosfato de potássio (pH=6,0) contendo 0,164 mg/mL de dihidrocloreto de o-

dianisidina (Sigma Chemical Co., USA) e 0,0005% de peróxido de hidrogênio

(Merck, Alemanha). A mudança de absorbância a 460nm foi medida em um leitor de

microplacas (Espectra Max plus 384, USA) durante 10 minutos. Atividade da MPO

foi calculada a partir da velocodade máxima da reação por segundos utilizando o

programa de aquisição de dados SOFTmax Pro Version 3.1.2 (Molecular Devices

Corp, USA) do espectrofotômetro Espectra Max plus 384. Os resultados foram

expressos em Unidade (U) de MPO/peso da massa tumoral sólida, sendo que uma

78

unidade de MPO é definida como a quantidade em µmol de H2O2 degradado por

minuto.

4.8 Análises Histológicas

Após a fixação do tecido tumoral em uma solução de formol a 10%,por um

período mínimo de 24 horas, as peças foram lavadas e desidratadas em

concentrações crescentes de álcool por um período total de 12 horas. No dia

seguinte, as amostras de tecido tumoral foram diafanizadas com xilol por 2 horas,

trocando a solução de xilol mais uma vez e novamente deixa em repouso por mais 2

horas. Para impregnação do tecido, as peças foram então depositadas em um

recipiente de vidro com parafina liquida aquecida na estufa a 58 ºC por 2 horas.

Novamente foi trocado a solução de parafina líquida e foi deixada a peça

permenecer por mais 2 horas. Após a impregnação do corte histológico, este foi

colocado em um pequeno recipiente coberto com parafina fundida por inteiro e

deixando por endurecer, formando um bloco contendo o tecido.

Para a microtomia foram realizados cortes de 5 µm de espessura em

micrótomo LEICA RM 2125 RT Os cortes semi-seriados com espessura de 5µm

obtidos foram colocados em banho-maria a 40ºC para o posicionamento nas

lâminas, depois foram levados a estufa por no mínimo de 4 horas para posterior

reidratação e coloração com hematoxilina e eosina. Finalmente os cortes foram

cobertos com lamínulas em meio de montagem e observados sob microscopia

óptica e fotografados no aumento de100x, 400x e 1000x.

4.9 Análises Estatísticas

A análise estatística foi realizada através da ajuda com o emprego do

software Graph Pad Prism Version 5.0. Os dados foram expresssos como médias ±

EPM e submetidos à análise de variância (ANOVA) seguida da aplicação do teste

de Turkey-Kramer de comparação múltiplas. Valores de P<0,05 foram considerados

estatisticamente significativos.

79

5 RESULTADOS

5.1 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno no Modelo


Os resultados da análise da sobrevida dos diferentes grupos tratados com

azul de metileno conforme apresentados na tabela 07, apresentaram valores do

tempo mediano de sobrevida de 30 dias para os grupos tratados com azul de

metileno nas concentrações de 0.1% e 0.3%, caracterizando uma probabilidade

maior de sobrevida, Em relação aos grupos tratados com azul de metileno nas

concentrações de 1.0% e 3.0%, apresentaram tempos medianos de sobrevida de 21

dias e 15dias, respectivamente, sendo semelhante o tempo mediano de sobrevida

do grupo controle e, portanto mantendo o mesmo padrão e a dinâmica do tempo de

sobrevida do Tumor de Walker 256 que varia de 15 a 20 dias quando implantado vis

subcutânea.

Na Tabela 08 são apresentados os resultados na análise do Teste para

igualdade das curvas estimadas de Kaplan- Meier, entre os diferentes grupos

tratados com azul de metileno, assim podemos observar que não houve diferença

estatisticamente significante (p< 0.9241 – Teste Long-rank e p< 0.6762 - Teste

Long-rank for trend) quando comparado com o grupo controle.

A Figura 01 apresenta os resultados da estimativa das curvas de

sobrevivência de Kaplan-Meier dos diferentes grupos tratados com azul de metileno

quando comparado com o grupo controle, podemos verificar que os grupos tratados

com azul de metileno nas concentrações de 0.1% e 0.3% mostraram uma maior

probabilidade de sobrevida quando comparado o grupo controle. Com relação aos

grupos tratados com azul de metileno nas concentrações de 1.0% e 3.0%

promoveram a mesma probabilidade de sobrevida quando comparados com o grupo

controle.

80

Tabela 07 – Resultados sumarizados da análise da sobrevida dos diferentes grupos

tratados. com azul de metileno e do grupo controle

Grupos

(n=5)

Controle

(salina)

Azul de

Metileno

0.1%

Azul de

Metileno

0.3%

Azul de

Metileno

1.0%

Azul de

Metileno

3.0%

Animais

censurados 1 2 1 1 1

Morte/evento 4 3 4 4 4

Sobrevida

Mediana

(dias)

20 30 30 21 15


diferentes grupos tratados com azul de metileno e o grupo controle.

Teste Qui-Quadrado g.i Significância (P)

Long-rank 0.9035 4 0.9241

Longrank for

trend 0.1744 1 0.6762

g.i., grau de liberdade.

81

Figura 01 – Estimativa das curvas de Kaplan-Meier para os diferentes grupos tratados com

azul de metileno (A.M) e grupo controle. (A): Comparação das curvas estimativas de Kaplan-

Meier do grupo tratado azul de metileno 0.1% com grupo controle. (B): Comparação das

curvas estimativas de Kaplan-Meier do grupo tratado azul de metileno 0.3% com grupo

controle. (C): Comparação das curvas estimativas de Kaplan-Meier do grupo tratado azul de

metileno 1.0% com grupo controle. (D): Comparação das curvas estimativas de Kaplan-

Meier do grupo tratado azul de metileno 3.0% com grupo controle.

82

5.2 Avaliações do Perfil Hepátco no Protocolo de Tratamento do Azul de

Metileno na Massa Tumoral sólida

A tabela 09 mostra a correlação obtida entre as diferentes atividade

enzimáticas séricas de AST, ALT e Gama-GT nos diferente grupos tratados,onde os

dados são expressos pela média ± EPM (Erro Padrão da Média) com n=5.

A figura 02 representa a atividade enzimática sérica da ALT dos diferentes

grupos de tratamento do azul de metileno na massa tumoral sólida. Ao compararmos

as atividades enzimáticas da ALT para os diferentes grupos tratados com azul de

metileno em relação ao grupo controle observamos que não ocorreu nenhum

aumento estatisticamente significativo.

A figura 03 ilustra a atividade enzimática sérica da AST dos diferentes grupos

de tratamento do azul de metileno na massa tumoral sólida. Quando comparamos as

atividades enzimáticas da AST para os diferentes grupos tratados com azul de

metileno em relação ao grupo controle não observamos nenhum aumento

estatisticamente significativo.

A figura 04 representa a atividade enzimática sérica da Gama-GT dos

diferentes grupos de tratamento do azul de metileno na massa tumoral sólida.

Nenhum aumento estatisticamente significativo foi observado ao compararmos as

atividades da gama-GT para os diferentes grupos tratados com azul de metileno em

relação ao grupo controle.

83

Tabela 09 - Correlação entre as atividades enzimáticas séricas de AST, ALT e gama-GT

dos diferentes grupos tratados. Os dados são expressos pela média ± EPM, n=5.


n=5

Salina

NaCl

0.9%

(mL)

Dose

(mg/mL)

ALT

(U/mL)

AST

(U/mL)

Gama-GT

(U/mL)

Controle 0.1 - 18.73 ± 2.53 65,17 ± 6.13 31.46 ± 6.44

Azul de Metileno 0.1% - 1 17.56 ± 4.83 68.61 ± 3.83 37.92 ± 5.04

Azul de Metileno 0.3% - 3 18.18 ± 3.67 55.50 ± 3.11 22.63 ± 4.48

Azul de Metileno 1.0% - 10 8.26 ± 2.14 68.57 ± 5.81 27.61 ± 2.21

Azul de Metileno 3.0% - 30 16.04 ± 2.02 56.01 ± 4.09 24.51 ± 1.97

ALT

Contr

ole

0.1%

AM

0.3%

AM

1.0%

AM

3.0%

AM

0

10

20

30

40

U/m

L

Figura 02 - Atividade enzimática sérica da ALT após o protocolo de tratamento para os

diferentes grupos experimentais. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05

quando comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de

comparação múltipla).

84

AST

Contr

ole

0.1%

AM

0.3%

AM

1.0%

AM

3.0%

AM

0

40

80

120

U/m

L

Figura 03 - Atividade enzimática sérica da AST após o protocolo de tratamento para os

diferentes grupos experimentais. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05



Gama - GT

Contr

ole

0.1%

AM

0.3%

AM

1.0%

AM

3.0%

AM

0

15

30

45

60

U/m

L

Figura 04 - Atividade enzimática sérica da gama-GT após o protocolo de tratamento para

os diferentes grupos experimentais. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05



85

5.3 Estudo de Sobrevida: Emprego do Azul de Metileno na concentração de

0.1% e Laser no Modelo Experimental do Tumor de Walker 256

Os resultados da análise da sobrevida dos grupos tratados com azul de metileno

na concentração de 0.1% e laser nas diferentes energias conforme apresentados na

tabela 10, apresentaram valores do tempo mediano de sobrevida de 21 dias para os

grupos tratados com azul de metileno na concentração de 0.1% e laser na energia

de 1J, caracterizando uma probabilidade maior de sobrevida, Em relação aos grupos

tratados com azul de metileno na concentração de 0.1% e laser na energia de 3 e 6J

respectivamente, apresentaram tempos medianos de sobrevida de 6 dias, sendo

semelhante o tempo mediano de sobrevida do grupo controle e portanto mantendo o

mesmo padrão e a dinâmica do tempo de sobrevida do Tumor de Walker 256 que

pode variar até 20 dias quando implantado vis subcutânea.

Na Tabela 11 são apresentados os resultados na análise do Teste para

igualdade das curvas estimadas de Kaplan- Meier, entre os grupos tratados com

azul de metileno na concentração de 0.1% e laser nas diferentes energias, assim

podemos observar que não houve diferença estatisticamente significante (p< 0.6871

– Teste Long-rank e p< 0.6566 - Teste Long-rank for trend) quando comparado com

o grupo controle.

A Figura 05 apresenta os resultados da estimativa das curvas de sobrevivência

de Kaplan-Meier dos grupos tratados com azul de metileno na concentração de

0.1% e laser nas diferentes energias, quando comparado com o grupo controle,

podemos verificar que os grupos tratados com azul de metileno na concentração de

0.1% e laser na energia de 1J mostrou uma maior probabilidade de sobrevida

quando comparado o grupo controle. Com relação aos grupos tratados com azul de

metileno na concentração de 0.1% e laser na energia de 3J e 6J respectivamente,

promoveram a mesma probabilidade de sobrevida quando comparados com o grupo

controle.

86

Tabela 10 – Resultados sumarizados da análise da sobrevida dos grupos tratados com

azul de metileno na concentração de 0.1% e Laser nas diferentes energias e do grupo

controle

Grupos

(n=5)

Controle

(salina)

Azul de Metileno

0.1% + 1J

Azul de Metileno

0.1% + 3J

Azul de Metileno

0.1% + 6J

Animais

censurados 0 3 2 2

Morte/evento 5 2 3 3

Sobrevida

Mediana

(dias)

5 21 6 6


grupos tratados com azul de metileno na concentração de 0.1% e laser nas diferentes

energias e o grupo controle.

Teste Qui-Quadrado g.i Significância (P)

Long-rank 1.479 3 0.6871

Longrank for

trend 0.1976 1 0.6566

g.i., grau de liberdade.

87

Figura 05 – Estimativa das curvas de Kaplan-Meier para os grupos tratados com azul de

metileno (A.M) na concentração de 0.1% e laser nas diferentes doses de energia e grupo

controle. (A): Comparação das curvas estimativas de Kaplan-Meier do grupo tratado azul de

metileno 0.1% e laser 1J com grupo controle. (B): Comparação das curvas estimativas de

Kaplan-Meier do grupo tratado azul de metileno 0.1% e laser 3J com grupo controle. (C):

Comparação das curvas estimativas de Kaplan-Meier do grupo tratado azul de metileno

0.1% e laser 6J com grupo controle.

88

5.4 Avaliações dos níveis das citocinas na massa tumoral sólida

As tabelas 12 e 13 ilustram os níveis dos diferentes marcadores do processo

inflamatório após o tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no

tecido tumoral do Tumor de Walker 256 e também após o tratamento com irradiação

do Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido

tumoral do Tumor de Walker 256 Os dados são expressos pela média ± EPM, n=5.

A figura 06 representa os níveis de IL-1β dos diferentes grupos de tratamento

do azul de metileno na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno 0.1%, azul

de metileno 0.3%, azul de metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24 horas após o

último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-1 β para os diferentes grupos

tratados com azul de metileno em relação ao grupo controle, observamos que não

foi encontrada nenhuma diferença estatisticamente significativa.

Na figura 07 apresenta os níveis de IL-1β dos diferentes grupos de tratamento

do Laser no comprimento de onda de 660 nm na massa tumoral sólida (controle, 1J,

3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-1 β

para os diferentes grupos tratados com Laser observamos que ocorreu um aumento

estatisticamente significativo nos níveis de IL-1 β no grupo de 1J, quando

comparado ao grupo controle e aos grupos de 3J e 6J respectivamente.

Os níveis de IL-6 dos diferentes grupos de tratamento do azul de metileno na

massa tumoral sólida (controle, azul de metileno 0.1%, azul de metileno 0.3%, azul

de metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24 horas após o último tratamento são

apresentados na figura 08. Ao compararmos os níveis de IL-6 para os diferentes

grupos tratados com azul de metileno e o grupo controle, podemos observar um

aumento expressivo nos níveis de IL-6 no grupo 0.1% azul de metileno, sendo este

estatisticamente de extrema significância quando comparado aos diferentes grupos

tratados e ao grupo controle.

A figura 09 apresenta os níveis de IL-6 dos diferentes grupos de tratamento

do Laser no comprimento de onda de 660 nm na massa tumoral sólida (controle, 1J,

3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-6 para

os diferentes grupos tratados com Laser e o grupo controle, observamos que

ocorreu um aumento estatisticamente significativo nos níveis de IL-6 no grupo de 3J,

quando comparado o grupo 3J com os demais grupos tratados e o grupo controle.

89

Os níveis de IL-10 dos diferentes grupos de tratamento do azul de metileno na

massa tumoral sólida (controle, azul de metileno 0.1%, azul de metileno 0.3%, azul

de metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24 horas após o último tratamento são

demonstrados na figura 10. Ao compararmos os níveis de IL-10 para os diferentes

grupos tratados com azul de metileno e o grupo controle, observamos um aumento

bastante expressivo e estatisticamente significativo nos níveis de IL-10 do grupo

0.1% azul de metileno quando comparado aos demais grupos tratados e o grupo

controle.

Na figura 11, apresentamos os níveis de IL-10 dos diferentes grupos de

tratamento do Laser no comprimento de onda de 660 nm na massa tumoral sólida

(controle, 1J, 3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis

de IL-10 para os diferentes grupos tratados com Laser e o grupo controle,

observamos uma expressiva redução estatisticamente significativa, quando

comparado o grupo 1J em relação aos demais grupos tratados 3J e 6J, porém não

foi demonstrada diferença estatística significativa quando comparado os níveis de IL-

10 do grupo 1J em relação aos níveis de IL-10 do grupo controle.

A figura 12 representa os níveis de TNF-a dos diferentes grupos de

tratamento do azul de metileno na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno

0.1%, azul de metileno 0.3%, azul de metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24

horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis de TNF-a para os

diferentes grupos tratados com azul de metileno e o grupo controle, observamos um

aumento bastante expressivo e estatisticamente significativo nos níveis de TNF-a do

grupo 0.1% azul de metileno quando comparado aos demais grupos tratados e o

grupo controle.

Na figura 13 apresenta os níveis de TNF-a dos diferentes grupos de


(controle, 1J, 3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis

de TNF-a para os diferentes grupos tratados com Laser e o grupo controle,

observamos que ocorreu uma diminuição estatisticamente significativa, quando

comparado o grupo 1J em relação aos grupos de 3J e 6J, porém não encontramos

diferenças estatisticamente significativas quando comparamos o grupo de 1J com o

grupo controle.

A tabela 14 ilustra os níveis dos diferentes marcadores do processo

inflamatório após a associação dos protocolos de tratamento do azul de metileno na

90

concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda de

660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256.

Na figura 14 apresenta os níveis de IL-1β dos diferentes grupos com azul de

metileno na concentração 0.1% em diferentes doses de energia do laser no

comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida (controle, azul de metileno

0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1% + 6J) 24 horas após

o último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-1 β para os diferentes grupos

tratados na associação de azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do

laser observamos que ocorreu um aumento expressivo sendo estatisticamente

significativo nos níveis de IL-1 no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando

comparado ao grupo controle e aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de

metileno 0.1% + 6J respectivamente.

Na figura 15 apresenta os níveis de IL-6 dos diferentes grupos com azul de




o último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-6 para os diferentes grupos






Na figura 16 apresenta os níveis de IL-10 dos diferentes grupos com azul de




o último tratamento. Ao compararmos os níveis de IL-10 para os diferentes grupos






Na figura 17 apresenta os níveis de TNF-a dos diferentes grupos com azul de


91



o último tratamento. Ao compararmos os níveis de TNF-a para os diferentes grupos



significativo nos níveis de TNF-a no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando



92

Tabela 12 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após o protocolo de

tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de

Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p

Tratamento

dos grupos

n=5

Salina

NaCl

0.9%

(mL)

Dose

(mg/mL)

IL-1β

(ρmol/mg

prot.)

IL-6

(ρmol/mg

prot)

IL-10

(ρmol/mg

prot)

TNF-α

(ρmol/mg

prot)

Controle 0.1 -

32.29 ± 6.40 80.96 ± 16.74 5.20 ± 1.30 3.70 ± 0.75

Azul de

Metileno

0.1%

- 1 44.32 ± 9.44 235.06 ± 14.22 17.64 ± 0.25 13.40 ± 0.81

Azul de

Metileno

0.3%

- 3 37.25 ± 2.01 99.63 ± 16.82 9.38 ± 0.95 4.96 ± 0.53

Azul de

Metileno

1.0%

- 10 42.48 ± 4.0 86.33 ± 11.02 5.73 ± 0.67 4.22 ± 1.14

Azul de

Metileno

3.0%

- 30 44.80± 2.02 92.82± 5.62 6.00 ± 1.03 4.48 ± 0.66

93

Tabela 13 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após o protocolo de

irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido

tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5,

Tratamento

dos grupos

n=5

Dose

Energia

(J/cm2)

IL-1β

(ρmol/mg prot.)

IL-6

(ρmol/mg prot)

IL-10

(ρmol/mg prot)

TNF-α

(ρmol/mg prot)

Controle - 17.75 ± 2.80 27.36 ± 0.56 3.26 ± 0.68 1.63 ± 0.22

1J 33,5 45.53 ± 2.51 60.40 ± 5.58 4.54 ± 1.10 2.57 ± 0.26

3J 100 30.35 ± 1.57 124.93 ± 8.42 12.90 ± 1.27 3.99 ± 0.36

6J 200 21.34± 0.81 82.83 ± 7.95 23.05 ± 2.31 5.53 ± 0.27

J, Joules

94

IL-1

Contr

ole

0.1%

AM

0.3%

AM

1.0%

AM

3.0%

AM

0

20

40

60

80

pm

ol/

mg

pro

t

Figura 06 - Níveis de IL-1β após o protocolo de tratamento nas diferentes concentrações do

azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados representam a média

± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de

Turkey-Kramer de comparação múltipla).

IL-1

Controle 1 J 3J

6J 0

20

40

60

***##

pm

ol/m

g p

rot

Figura 07 - Níveis de IL-1β após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de

onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os

dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle

(ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 1J vs.

Controle; ***p˂ 0.001 1J vs. 6J; ##p˂ 0.01 1J vs. 3J.

95

IL-6

Controle

0.1%

AM

0.3%

AM

1.0%

AM

3.0%

AM

0

75

150

225

300

***

pm

ol/m

g p

rot

Figura 08 - Níveis de IL-6 após o protocolo de tratamento nas diferentes concentrações do

azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados representam a média

± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de

Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 0.1% AM vs. Controle, vs. 0.3% AM,

vs. 1.0% AM, vs. 3.0%AM.

IL-6

Controle 1 J 3J

6J 0

50

100

150

200

***##

pm

ol/m

g p

rot

Figura 09 - Níveis de IL-6 após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de



(ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 3J vs.

Controle, vs. 1J; ##p˂ 0.01 3J vs. 6J

96

IL-10

Controle

0.1%

AM

0.3%

AM

1.0%

AM

3.0%

AM

0

5

10

15

20

25

***

pm

ol/m

g p

rot

Figura 10 - Níveis de IL-10 Figura após o protocolo de tratamento nas diferentes

concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados

representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo controle (ANOVA,

seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 0.1% AM vs.

Controle, vs. 0.3% AM, vs. 1.0% AM, vs. 3.0%AM.

IL-10

Controle 1 J 3J

6J 0.0

7.5

15.0

22.5

30.0

***

***

##

##**

pm

ol/m

g p

rot

Figura 11 - Níveis de IL-10 após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de



(ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). *** p˂ 0.001 1J vs. 6J;

*** p˂ 0.001 6J vs. Controle; **p˂ 0.01 3J vs.Controle; ## p˂ 0.01 1J vs. 3J, 3J vs.6J

97

TNF-

Controle

0.1%

AM

0.3%

AM

1.0%

AM

3.0%

AM

0

5

10

15

20

***

pm

ol/m

g p

rot

Figura 12 - Níveis de TNF-α Figura após o protocolo de tratamento nas diferentes

concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados


seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p ˂ 0.001 0.1% AM vs.

Controle; vs. 0.3% AM; vs. 1.0% AM; vs. 3.0%AM.

TNF-

Controle 1 J 3J

6J 0

2

4

6

8

###

***

***

#

*

pm

ol/m

g p

rot

Figura 13 - Níveis de TNF-α após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de



(ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). *** p˂ 0.001 6J vs.

Controle, 3J vs. Controle; ###p˂ 0.001 1J vs. 6J; #p˂ 0.05 3J vs. 6J; *p˂ 0.05 1J vs. 3J.

98

Tabela 14 – Dados dos níveis dos diferentes marcadores inflamatórios após a associação

dos protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de

irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido

tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5.

Tratamento

dos grupos

n=5

Salina

NaCl

0.9%

(mL)

Dose

(mg/m)

Dose

Energia

(J/cm2)

IL-1β

(ρmol/mg

prot.)

IL-6

(ρmol/mg

prot)

IL-10

(ρmol/mg

prot)

TNF-α

(ρmol/mg

prot)

Controle 0.1 - - 5.47 ± 0.69 3.75 ± 0.73 2.05 ± 0.35 0.96 ± 0.1

AM 0.1% +

1J - 1 33,5 14.14 ± 0.76 9.81 ± 0.52 6.47 ± 0.90 3.00 ± 0.06

AM 0.1% +

3J - 1 100 6.53 ± 1.22 1.69 ± 0.41 1.69 ± 0.33 0.90 ± 0.11

AM 0.1% +

6J - 1 200 4.23 ± 1.33 1.74 ± 0.43 2.18 ± 0.69 0.95 ± 0.17

A.M, Azul de Metileno; J, Joules.

99

IL-1

Contr

ole

0.1%

AM

+1J

0.1%

AM

+3J

0.1%

AM

+6J

0

5

10

15

20

***

pm

ol/m

g p

rot

Figura 14 - Níveis de IL-1β após a associação dos protocolos de tratamento do azul de

metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda

de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados


seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001 0.1% AM + 1J vs.

Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J.

IL-6

Contr

ole

0.1%

AM

+1J

0.1%

AM

+3J

0.1%

AM

+6J

0.0

3.5

7.0

10.5

14.0

***

pm

ol/m

g p

rot

Figura 15 - Níveis de IL-6 após a associação dos protocolos de tratamento do azul de






100

IL-10

Contr

ole

0.1%

AM

+1J

0.1%

AM

+3J

0.1%

AM

+6J

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

***

pm

ol/m

g p

rot

Figura 16 - Níveis de IL-10 após a associação dos protocolos de tratamento do azul de






]

TNF-

Contr

ole

0.1%

AM

+1J

0.1%

AM

+3J

0.1%

AM

+6J

0

1

2

3

4

***

pm

ol/m

g p

rot

Figura 17 - Níveis de TNF-α após a associação dos protocolos de tratamento do azul de






101

5.5 Análises da expressão gênica dos marcadores inflamatórios na massa


reversa em tempo real (real time RT-PCR)

As tabelas 15 e 16 ilustram a quantificação da expressão gênica dos

diferentes marcadores do processo inflamatório após o tratamento nas diferentes

concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker 256 e

também após o tratamento com irradiação do Laser no comprimento de onda de

660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256 Os dados

são expressos pela média ± EPM, n=5.

A figura 18 representa a quantificação da expressão gênica de COX-1 por PCR em

tempo real dos diferentes grupos de tratamento do azul de metileno na massa

tumoral sólida (controle, azul de metileno 0.1%, azul de metileno 0.3%, azul de

metileno 1.0% e azul de metileno 3.0%) 24 horas após o último tratamento. Ao

compararmos a expressão gênica de COX-1 para os diferentes grupos tratados com

azul de metileno em relação ao grupo controle, observamos um aumento

estatisticamente significativo nos níveis de expressão gênica de COX-1 no grupo de

0.1% de azul de metileno, quando comparado ao grupo controle aos grupos de

0.3%, 1.0% e 3.0% respectivamente.

Na figura 19 apresenta a quantificação da expressão gênica de COX-1 dos

diferentes grupos de tratamento do Laser no comprimento de onda de 660 nm na

massa tumoral sólida (controle, 1J, 3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao

compararmos a expressão gênica de COX-1 para os diferentes grupos tratados com

Laser observamos que ocorreu um aumento estatisticamente significativo nos níveis

de expressão gênica de COX-1 no grupo de 1J, quando comparado ao grupo

controle e aos grupos de 3J e 6J respectivamente.

A quantificação da expressão gênica de COX-2 dos diferentes grupos de



horas após o último tratamento são apresentados na figura 20. Ao compararmos a

expressão gênica de COX-2 para os diferentes grupos tratados com azul de metileno

e o grupo controle, podemos observar um aumento expressivo nos níveis de

expressão gênica de COX-2 no grupo 0.1% azul de metileno, sendo este

102

estatisticamente de extrema significância quando comparado aos demais grupos

tratados e ao grupo controle.

A figura 21 apresenta a expressão gênica de COX-2 dos diferentes grupos de


(controle, 1J, 3J e 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos a

expressão gênica de COX-2 para os diferentes grupos tratados com Laser e o grupo

controle, também observamos que ocorreu um extremo aumento, sendo

estatisticamente significativo nos níveis de expressão gênica de COX-2 no grupo de

1J, quando comparado com os demais grupos tratados e o grupo controle.

A quantificação da expressão gênica de iNOS dos diferentes grupos de



horas após o último tratamento são demonstrados na figura 22. Ao compararmos

expressão gênica de iNOS para os diferentes grupos tratados com azul de metileno e

o grupo controle, observamos um aumento extremamente expressivo e

estatisticamente significativo nos níveis de expressão gênica de iNOS do grupo


controle.

Na figura 23, apresentamos a quantificação da expressão gênica de iNOS dos



compararmos os níveis expressão gênica de iNOS para os diferentes grupos

tratados com Laser e o grupo controle, observamos um expressivo aumento

estatisticamente significativo, quando comparado o grupo 1J em relação aos demais

grupos tratados e o grupo controle.

A quantificação da expressão gênica de eNOS dos diferentes grupos de



horas após o último tratamento são demonstrados na figura 24. Ao compararmos os

níveis de expressão gênica de eNOS para os diferentes grupos tratados com azul

de metileno e o grupo controle, observamos um aumento bastante expressivo e

estatisticamente significativo nos níveis de expressão gênica de eNOS do grupo


controle.

103

Na figura 25, apresentamos a quantificação da expressão gênica de eNOS dos



compararmos os níveis de eNOS para os diferentes grupos tratados com Laser e o

grupo controle, observamos uma redução expressiva nos níveis expressão gênica

de eNOS sendo estatisticamente significativa, quando comparado os grupo 3J e 6J

em relação ao grupo controle, porém não observamos diferenças estatisticamente

significativas quando comparadas entre si. Também observamos uma redução com

significância nos níveis de expressão gênica de eNOS do grupo tratado com 1J, uma

vez comparados em relação aos do grupo controle. Entretanto os níveis de

expressão gênica de eNOS em 1J formam maiores e estatisticamente significativos

quando comparados com os grupos de 3J e 6J respectivamente.

A tabela 17 ilustra a quantificação da expressão gênica dos diferentes

marcadores do processo inflamatório após associação do tratamento do azul de

metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento

de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker

256.

Na figura 26 apresenta a quantificação da expressão gênica de COX-1 dos

diferentes grupos com azul de metileno na concentração 0.1% em diferentes doses

de energia do laser no comprimento de onda de 660nm na massa tumoral sólida

(controle, azul de metileno 0.1% + 1J, azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno

0.1% + 6J) 24 horas após o último tratamento. Ao compararmos os níveis de

expressão gênica de COX-1 para os diferentes grupos tratados na associação de

azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do laser em relação o grupo

controle, observou que nenhuma diferença estatisticamente significativa foi

encontrada.

Na figura 27 apresenta a quantificação de expressão gênica de COX-2 dos





expressão gênica de COX-2 para os diferentes grupos tratados na associação de

azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do laser observamos que

104

ocorreu um aumento expressivo sendo estatisticamente significativo nos níveis de

expressão gênica de COX-2 no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando



Na figura 28 apresenta a quantificação de expressão gênica de iNOS dos





expressão gênica de iNOS para os diferentes grupos tratados na associação de azul

de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do laser observamos que ocorreu

um aumento expressivo sendo estatisticamente significativo nos níveis de expressão

gênica de iNOS no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando comparado ao

grupo controle e aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1%

+ 6J respectivamente.

Na figura 29 apresenta a quantificação de expressão gênica de eNOS dos





expressão gênica de eNOS para os diferentes grupos tratados na associação de

azul de metileno 0.1% em diferentes doses de energia do laser observamos que

ocorreu uma redução expressiva sendo estatisticamente significativa nos níveis de

expressão gênica de eNOS no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando

comparado aos grupos de azul de metileno 0.1% + 3J e azul de metileno 0.1% + 6J,

porém foi maior e estatisticamente diferente quando comparado aos níveis de

expressão gênica de eNOS do grupo controle.

105

Tabela 15 – Dados da quantificação da expressão gênica dos marcadores inflamatórios

após o protocolo de tratamento nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido

tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados são expressos pela média ± EPM,n=5.

HPRT, Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase

Tratamento

dos grupos

n=5

Salina

NaCl

0.9%

(mL)

Dose

(mg/mL)

COX-1/HPRT

COX-2/HPRT

iNOS/HPRT

eNOS/HPRT

Controle 0.1 - 0.49 ± 0.13 0.43 ± 0.02 0.28 ± 0.10 0.28 ± 0.02

Azul de

Metileno

0.1%

- 1 2.54 ± 0.22 0.95 ± 0.11 1.83 ± 0.23 0.49 ± 0.07

Azul de

Metileno

0.3%

- 3 1.32 ± 0.20 0.09 ± 0.07 0.22 ± 0.06 0.25 ± 0.22

Azul de

Metileno

1.0%

- 10 1.38 ±0.24 0.14 ± 0.08 0.20 ±0.07 0.21 ± 0.07

Azul de

Metileno

3.0%

- 30 1.02 ±0.27 0.11 ± 0.06 0.40 ± 0.15 0.17 ± 0.07

106


após o protocolo de irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes

energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados são expressos pela média ±

EPM, n=5.

Tratamento

dos grupos

n=5

Dose

Energia

(J/cm2)

COX-1/HPRT

COX-2/HPRT

iNOS/HPRT

eNOS/HPRT

Controle - 1.26 ± 0.12 1.25 ± 0.23 0.69 ± 0.13 0.65 ± 0.06

1J 33,5 1.97 ± 0.10 18.18 ± 0.25 1.49 ± 0.05 0.45 ± 0.04

3J 100 1.13 ± 0.13 0.77 ± 0.21 0.68 ± 0.08 0.17 ± 0.05

6J 200 1.35 ±0.19 3.60 ± 0.18 0.34 ± 0.11 0.18 ± 0.03

HPRT, Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase; J, Joules

107

COX-1 AM

Contr

ole

0.1%

AM

0.3%

AM

1.0%

AM

3.0%

AM

0

1

2

3

4

***

#

CO

X-1

/HP

RT

Figura 18 – Quantificação da expressão gênica da COX-1 após o protocolo de tratamento

nas diferentes concentrações do azul de metileno no tecido tumoral do Tumor de Walker

256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao grupo

controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂ 0.001

0.1% AM vs. Controle, 0.1% AM vs. 3.0% AM; #p˂ 0.05 0.1% AM vs. 0.3% AM, 0.1% AM vs.

1.0% AM.

COX-1 Laser

Contr

ole 1 J

3J

6J

0.00

0.75

1.50

2.25

3.00

CO

X-1

/HP

RT

**

Figura 19 - Quantificação da expressão gênica da COX-1 após o protocolo de irradiação

com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do

Tumor de Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando

comparado ao grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação

múltipla). **p˂ 0.01 1J vs. Controle, vs. 3J, 6J

108

COX-2 AM

Contr

ole

0.1%

AM

0.3%

AM

1.0%

AM

3.0%

AM

0.00

0.35

0.70

1.05

1.40

***

CO

X-2

/HP

RT

##

Figura 20 – Quantificação da expressão gênica da COX-2 após o protocolo de tratamento




0.1% AM vs. 0.3% AM, vs. 1.0%, vs. 3.0%; ## p˂ 0.01 0.1% AM vs. Controle..

COX-2 Laser

Contr

ole 1 J

3J

6J

0.0

7.5

15.0

22.5

30.0

CO

X-2

/HP

RT

***

Figura 21 - Quantificação da expressão gênica da COX-2 após o protocolo de irradiação




múltipla). ***p˂ 0.001 1J vs. Controle, vs. 3J, 6J

109

iNOS AM

Contr

ole

0.1%

AM

0.3%

AM

1.0%

AM

3.0%

AM

0.0

0.6

1.2

1.8

2.4

***

iNO

S/H

PR

T

Figura 22 – Quantificação da expressão gênica da iNOS após o protocolo de tratamento




0.1% AM vs. Controle, vs. 0.3% AM, vs. 1.0% AM, vs. 3.0%AM.

iNOS Laser

Contr

ole 1 J

3J

6J

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

***

iNO

S/H

PR

T

Figura 23 - Quantificação da expressão gênica da iNOS após o protocolo de irradiação com

Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do



múltipla). ***p˂ 0.001 1J vs. Controle, vs. 3J, 6J.

110

eNOS AM

Contr

ole

0.1%

AM

0.3%

AM

1.0%

AM

3.0%

AM

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

**

eN

OS

/HP

RT

#

Figura 24 – Quantificação da expressão gênica da eNOS após o protocolo de tratamento



controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). **p˂ 0.01 0.1%

AM, vs.0.3% AM, vs. 1.0% AM, vs. 3.0%AM; #p˂ 0.5.1% AM, vs. Controle.

eNOS Laser

Contr

ole 1 J 3J 6J 0.0

0.3

0.6

0.9

1.2

eN

OS

/HP

RT

*** ***

*##

Figura 25 - Quantificação da expressão gênica da eNOS após o protocolo de irradiação




múltipla). ***p˂ 0.001 6J vs. Controle, 3J vs. Controle; *p˂ 0.5 1J vs. Controle; ##p p˂ 0.01

1J vs. 3J, vs. 6J.

111


após a associação dos protocolos de tratamento do azul de metileno na concentração fixa

de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento de onda de 660nm nas diferentes

energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os dados representam a média ± EPM,

n = 5.

Tratamento

dos grupos

n=5

Salina

NaCl

0.9%

(mL)

Dose

(mg/mL)

Dose

Energia

(J/cm2)

COX1/

HPRT

COX2/

HPRT

iNOS/

HPRT

eNOS/

HPRT

Controle 0.1 - - 1.08 ± 0.21 0.92 ± 0.27 0.90 ± 0.20 1.07 ± 0.24

AM 0.1% +

1J - 1 33,5 0.82 ± 0.25 3.01 ± 0.26 2.58 ± 0.21 2.79 ± 0.14

AM 0.1% +

3J - 1 100 0.97 ± 0.17 1.19 ± 0.26 1.12 ± 0.23 6.90 ± 0.26

AM 0.1% +

6J - 1 200 1.42 ± 0.20 1.31 ± 0.14 0.99 ± 0.27 10.03 ± 0.21

A.M, Azul de Metileno; HPRT, Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase;,J, Joules.

112

COX-1

Contr

ole

0.1%

AM

+1J

0.1%

AM

+3J

0.1%

AM

+6J

0.0

0.6

1.2

1.8

2.4

CO

X-1

/HP

RT

Figura 26 - Quantificação da expressão gênica da COX-1 após a associação dos protocolos



Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5, p<0.05 quando comparado ao

grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla).

COX-2

Controle

0.1%

AM+1J

0.1%

AM+3J

0.1%

AM+6J

0.00

1.25

2.50

3.75

5.00

***

CO

X-2

/HP

RT

Figura 27 - Quantificação da expressão gênica da COX-2 após a associação dos protocolos




grupo controle (ANOVA, seguido teste de Turkey-Kramer de comparação múltipla). ***p˂

0.001 0.1% AM + 1J vs. Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J.

113

iNOS

Contr

ole

0.1%

AM

+1J

0.1%

AM

+3J

0.1%

AM

+6J

0

1

2

3

4

***

iNO

S/H

PR

T

Figura 28 - Quantificação da expressão gênica da iNOS após a associação dos protocolos





0.001 0.1% AM + 1J vs. Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J

eNOS

Contr

ole

0.1%

AM

+1J

0.1%

AM

+3J

0.1%

AM

+6J

0

4

8

12

16

***

eN

OS

/HP

RT

Figura 29 - Quantificação da expressão gênica da eNOS após a associação dos protocolos





0.001 0.1% AM + 1J vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J.

114

5.6 Determinação da Prostaglandina E2 na massa tumoral sólida

A tabela 18 ilustra os níveis de PGE2 após a associação dos protocolos de



do Tumor de Walker 256.

Na figura 30 apresenta os níveis de PGE2 dos diferentes grupos com azul de




o último tratamento. Ao compararmos os níveis de PGE2 para os diferentes grupos



significativo nos níveis de PGE2 no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando



115

Tabela 18 – Dados dos níveis de PGE2 após a associação dos protocolos de tratamento do

azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no comprimento

de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de Walker 256. Os

dados representam a média ± EPM, n = 5.


PGE2

Contr

ole

0.1AM

+ 1

J

0.1AM

+ 3

J

0.1AM

+ 6

J

0

400

800

1200

1600

***

pg

PG

E2/

mg

pro

t

Figura 30 - Níveis de PGE2 após a associação dos protocolos de tratamento do azul de





Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J,


n=5

Salina

NaCL

0.9%

(mL)

Dose

(mg/mL)

Dose

Energia

(J/cm2)

PGE2

pg/mg prot.

Controle 0.1 - - 163.2 ± 2.3

AM 0.1% + 1J - 1 33,5 1186.2 ± 3.0

AM 0.1% + 3J - 1 100 187.1 ± 2.2

AM 0.1% + 6J - 1 200 160.7 ± 1.7

116

5.7 Avaliação da Peroxidação Lipídica na massa tumoral sólida pelo Método

de TBARS

A tabela 19 ilustra os níveis de TBARS após a associação dos protocolos de



do Tumor de Walker 256.

Na figura 31 apresenta os níveis de TBARS dos diferentes grupos com azul

de metileno na concentração 0.1% em diferentes doses de energia do laser no



o último tratamento. Ao compararmos os níveis de TBARS para os diferentes grupos



significativo nos níveis de TBARS no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando



117

Tabela 19 – Dados dos níveis de TBARS após a associação dos protocolos de tratamento

do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no

comprimento de onda de 660nm nas diferentes energias no tecido tumoral do Tumor de

Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5.


TBARS

Controle

0.1%

AM+1J

0.1%

AM+3J

0.1%

AM+6J

0

1

2

3

4

***

TB

AR

S n

mo

l/g

Figura 31 - Níveis de TBARS após a associação dos protocolos de tratamento do azul de





Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J,


n=5

Salina

NaCL

0.9%

(mL)

Dose

(mg/mL)

Dose

Energia

(J/cm2)

TBARS

nmol/g

Controle 0.1 - - 1.43 ± 0.14

AM 0.1% + 1J - 1 33,5 2.75 ± 0.26

AM 0.1% + 3J - 1 100 1.32 ± 0.11

AM 0.1% + 6J - 1 200 1.32 ± 0.13

118

5.8 Análises da atividade da Mieloperoxidade (MPO)

A tabela 20 ilustra os níveis de atividade da MPO após a associação dos



tecido tumoral do Tumor de Walker 256.

Na figura 32 apresenta os níveis de MPO dos diferentes grupos com azul de




o último tratamento. Ao compararmos os níveis de MPO para os diferentes grupos



significativo nos níveis de MPO no grupo de azul de metileno 0.1% + 1J, quando



119

Tabela 20 – Dados dos níveis de atividade da MPO após a associação dos protocolos de

tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no


Walker 256. Os dados representam a média ± EPM, n = 5.

A.M, Azul de Metileno; L, Joules.

MPO

Contr

ole

0.1AM

+ 1

J

0.1AM

+ 3

J

0.1 +

6J

0

200

400

600

800

***

UM

PO

/g

Figura 32 – Correlação níveis de atividade da MPO após a associação dos protocolos de

tratamento do azul de metileno na concentração fixa de 0.1% e de irradiação com Laser no




0.001 0.1% AM + 1J vs. Controle, vs. 0.1% AM + 3J, vs. 0.1% AM + 6J,

Tratamento dos

grupos

n=5

Salina

NaCL

0.9%

(mL)

Dose

(mg/mL)

Dose

Energia

(J/cm2)

MPO

UMPO/g

Controle 0.1 - - 0.8 ± 0.4

AM 0.1% + 1J - 1 33,5 537.6 ± 0.6

AM 0.1% + 3J - 1 100 4.3 ± 0.6

AM 0.1% + 6J - 1 200 2.8 ± 0.7

120

5.9 Análises Histológicas

A análise histológica da massa tumoral sólida do Tumor de Walker 256 foi

realizada utilizando o emprego da coloração hematoxilina eosina. As figuras 33 A e

B correspondem à microscopia óptica do grupo controle nos aumentos de 100 e 400

vezes respectivamente. Nestas figuras evidenciou-se que as células tumorais

apresentam um volume maior que o normal, contornos irregulares e formas bizarras,

caracterizando moderado a acentuado pleomorfismo, ou seja, variação no tamanho

e forma. Podemos observar que os núcleos das células tumorais apresentam-se de

forma central, oval; são hipercromáticos, estão aumentados, em desproporção ao

tamanho da própria célula e normalmente possuem cromatina periférica. A

cromatina está aumentada ou condensada e distribuída de forma aleatória, e os

nucléolos se tornam evidentes, frequentemente apresentam lobulação ou então em

forma irregular, podendo mostrar a mesma tendência ao pleomorfismo da própria

célula. A quantidade de núcleo-proteína está aumentada e as mitoses são atípicas,

originando células multinucleadas. Entre as células, há a presença de pequenos

feixes de tecido conjuntivo e moderada quantidade de vasos, sendo que em

algumas áreas podemos observar a presença de células tumorais nos seus

interiores.

As figuras 34 A e B ilustram a microscopia óptica do grupo tratado 0.1% azul

de metileno + 1J nos aumentos de 100 e 400 vezes respectivamente. Nestas figuras

observam-se grandes áreas de necrose com presença neutrofílica. A microscopia

óptica do grupo tratado 0.1% azul de metileno + 3J está representada nas figuras 35

A e B nos aumentos de 100 e 400 vezes respectivamente. Nestas figuras podemos

notar algumas áreas de necrose, entretanto, ainda há presença de células

neoplásicas multinucleadas, apresentando pleomorfismo celular com

hipercromatização nuclear e cromatina condensada distribuída irregularmente.

As figuras 36 A e B correspodem a microscopia óptica do gurpo tratado 0.1%

azul de metileno + 6J nos aumentos de 100 e 400 vezes respectivamente. Nota-se

nestas figuras segue o mesmo comportamento em relação a microscopia óptica do

grupo tratado 0.1% azul de metileno + 3J apresentando algumas áreas de necrose,

porém podemos observar a presença de células neoplásicas também

121

multinucleadas, apresentando pelomorfismo celular com hipercromatização nuclear

e cromatina condensada distribuída irregularmente.

122

Figura 33 – Microscopia óptica do grupo controle. As figuras A e B correspondem a

microscopia óptica nos aumentos de 100 e 400 vezes respectivamente.

A

B

123



respectivamente.

A

B

124



respectivamente.

B

A

125

Figura 36 – Mcroscopia óptica do grupo 0.1% azul de metileno + 6J. As figuras A e

B correspondem a microscopia ótica nos aumentos de 100 e 400 vezes

respectivamente.

A

B

126

6 DISCUSSÃO

A Análise Estatística de Sobrevida têm sido amplamente empregada no

tratamento de dados de sobrevivência em estudos de laboratórios, ou seja, ela

avalia, por exemplo, o tempo em que um indivíduo sobrevive a um determinado

tratamento e o tempo de resposta a um dado tratamento e por meio desta análise,

os quais buscam novos produtos farmacêuticos e terapias mais adequados para

cada situação.

Em relação ao presente estudo, os resultados da análise da sobrevida dos

diferentes grupos tratados com azul de metileno na massa tumoral sólida

apresentaram valores do tempo mediano de sobrevida de 30 dias para os grupos

tratados com azul de metileno nas concentrações de 0.1% e 0.3%, caracterizando

uma probabilidade maior de sobrevida, Em relação aos grupos tratados com azul de

metileno nas concentrações de 1.0% e 3.0%, apresentaram tempos medianos de

sobrevida de 21 dias e 15 dias, respectivamente, sendo semelhante o tempo

mediano de sobrevida do grupo controle e, portanto mantendo o mesmo padrão e a

dinâmica do tempo de sobrevida do Tumor de Walker 256 que varia de 15 a 20 dias

quando implantado via subcutânea. Na análise do teste para igualdade das curvas

estimadas de Kaplan- Meier, entre os diferentes grupos tratados com azul de

metileno observa-se nenhuma diferença estatisticamente significante (p< 0.9241 –

Teste Long-rank e p< 0.6762 - Teste Long-rank for trend) quando comparado com o

grupo controle. Os resultados da estimativa das curvas de sobrevivência de Kaplan-

Meier dos diferentes grupos tratados com azul de metileno quando comparado com

o grupo controle, podemos verificar que os grupos tratados com azul de metileno

nas concentrações de 0.1% e 0.3% mostraram uma maior probabilidade de

sobrevida quando comparado o grupo controle. Com relação aos grupos tratados

com azul de metileno nas concentrações de 1.0% e 3.0% promoveram a mesma

probabilidade de sobrevida quando comparados com o grupo controle. Com base

nestes dados podemos concluir que os tratamentos nas concentrações de 0.1% e

0.3% do azul de metileno demonstraram uma maior probabilidade de sobrevida do

animal quando comparado aos grupos controle e nas concentrações de 1.0% e

3.0%.

Em relação aos grupos das concentrações de 1.0% e 3.0% do azul de metileno

não apresentaram diferenças significativas na probabilidade de sobrevida quando

127

comparado ao grupo controle, o que podemos sugerir indícios de efeitos de uma

toxicêmia, visto que dados encontrados na literatura recomenda-se a dose

terapêutica do azul de metileno na faixa de 1-2 mg/kg peso (i.v).

Muitos medicamentos empregados rotineiramente na clínica podem

apresentar como reação colateral indesejável, a agressão ao fígado, o que poderá

limitar seu uso e os benefícios esperados. O dano hepático induzido por

medicamentos pode ser hepatocelular, o que se traduzirá por aumento das

transaminases pirúvica e oxalacética (ALT e AST), ou colestático, o que levará ao

aumento de bilirrubinas, da fosfatase alcalina e da gama-glutaril transferase (G-GT).

Desde 1950, têm-se procurado teste de avaliações das condições do fígado

para determinar o potencial hepatotóxico de medicamentos empregados na

terapêutica. As determinações bioquímicas prontamente disponíveis e usadas

universalmente sãos testes das transaminases (ALT e AST) e gama-GT. As

aminotransferases são um indicativo de integridade celular e são enzimas

intercelulares. As provas de laboratório para medir essas enzimas baseiam-se na

ação sobre diferentes substratos que no final vão fornecer os substratos alanina

glutamato ou aspartato. A ALT é a enzima mais utilizada para medir processo

inflamatório ou necrótico no fígado. A mesma é encontrada no fígado e está

localizada no citosol da célula hepática. A AST é uma enzima que se encontra tanto

no citoplasma como nas mitocôndrias dos hepatócitos. Esta enzima está presente

em muitos órgãos além do fígado, incluindo coração e músculos. Segundo Gayoto e

Alves (2001) a AST é muito útil na caracterização de doenças hepáticas crônicas.

A gama glutamil transferase (gama GT) é uma enzima envolvida na

transferência de um resíduo gama glutamil de alguns peptídeos para outros

compostos (água, aminoácidos e outros peptídeos menores). Fisiologicamente, está

envolvida na síntese protéica e peptídica, regulação dos níveis teciduais de glutation

e transporte de aminoácidos entre membranas. É encontrada em vários tecidos: rins,

cérebro, pâncreas e fígado (quase a totalidade da gama GT corpórea está presente

nos hepatócitos). No fígado, esta enzima está localizada nos canalículos das células

hepáticas e particularmente nas células epiteliais dos ductos biliares. Devido a esta

localização característica, a enzima aparece elevada em quase todas as desordens

hepatobiliares, sendo um dos testes mais sensíveis no diagnóstico destas

condições. Nas células do parênquima hepático, a enzima é localizada tipicamente

128

no retículo endoplasmático liso, estando sujeita a indução microssomal hepática e

fazendo dela um marcador sensível a agressões hepáticas induzidas por

medicamentos e álcool. Valores aumentados de gama GT são indicativos de

doenças hepáticas em geral (hepatites agudas e crônicas, carcinomas, cirrose,

colestase, metástases etc.), pancreatites, infarto agudo do miocárdio, lupus

eritematoso sistêmico, obesidade patológica, hipertireoidismo, estados pós-

operatórios, carcinoma de próstata, uso de medicamentos hepatotóxicos ou capazes

de ativar indução enzimática (barbituratos, fenitoína, antidepressivos tricíclicos,

acetaminofen).

Apesar de não ser o objetivo principal do nosso projeto, avaliamos a

hepatoxocidade do tratamento com azul de metileno nas concentrações empregadas

de 0.1%, 0.3%, 1.0% e 3.0% no modelo tumoral, pois surgiu uma grande

preocupação quanto ao emprego e segurança de tais concentrações, visto que se

encontram muito acima dos limites de dose terapêutica recomendada pela literatura

que é de 1-2 mg/kg de peso (i.v). Além disso, dados encontrados na literatura

informam que o tecido tumoral é caracterizado presença de alta angiogênese, ou

seja, neovascularização para o aporte de oxigênio e nutrientes no desenvolvimento

e progressão tumoral. Assim, também surgiu o fato da possibilidade da dose via

intratumoral (i.t) das quatro concentrações de azul de metileno poder alcançar à

corrente sanguínea e exercer seus efeitos toxicêmicos. Portanto, nossos resultados

da avaliação da hepatotoxicidade puderam demonstrar que o emprego das

concentrações de 0.1%, 0.3%, 1.0% e 3.0% de azul de metileno bem como a via de

administração adotada não apresentaram nenhum aumento estatisticamente

significativos nos níveis dos marcadores de lesão hepática, AST, ALT e gama- GT

quando comparado ao grupo controle. Com bases nos resultados obtidos, podemos

concluir que o azul de metileno apresentou uma segurança e tolerância quanto ao

emprego das quatro concentrações, bem como na sua via da administração, sem

causar efeito hepatotóxico pelo aumento dos níveis de AST, ALT e gama-GT.

Atualmente a TFD é considerada como uma nova modalidade terapêutica

minimamente invasiva e suas aplicações têm sido direcionadas ao tratamento

localizado bem como na destruição seletiva de diversos tipos de cânceres e

desordens malignas (DOUGHERTY et al., 1998; GOMER et al., 1989; HSI et al.,

1999; KESSEL, D., 1992; PERVAIZ, S., 2001). Esta terapia está baseada na

129

captação e retenção seletiva do agente fotossensibilizante em sítios alvos que por

sua vez sofre ativação através da irradiação de uma fonte externa de luz levando à

geração de efeitos citotóxicos induzindo a morte das células tumorais. (CALIN et al.,

2005; DOUGHERTY et al., 1987; JUARRANZ et al., 2008; SARIKA et al., 2007).

Os principais mecanismos pelos quais a TFD media a destruição do tecido

canceroso são, primeiro as espécies reativas de oxigênio (EROs) e principalmente o

1O

2 gerados durante o processo de fotossensibilização da TFD produzem danos

severos diretamente às células tumorais promovendo à destruição tumoral (DENNIS

et al., 2003; DOUGHERTY T. et al., 1998; HASAN et al., 2003; JUARRANZ et al.,

2008). No segundo mecanismo, a TFD atua gerando danos relevantes nos vasos

sanguíneos levando a formação de trombos e dessa maneira, prejudicando a

vascularização tissular levando ao colapso e falência vascular originando um quadro

de severa hipóxia. Também, a resposta ao dano vascular atua desempenhando um

importante papel na ação tumoricida por induzir alterações na permeabilidade dos

vasos sanguíneos estimulando a ativação dos fatores de adesão molecular (E-

selectina/ ICAM) colaborando para a diapedese neutrofílica (ACKROYD et al., 2001;

DENNIS et al., 2003; REED et al., 1989; STAR et al., 1986). E finalmente, o último

mecanismo pelo qual a TFD atua é ativando a resposta imune contra as células

tumorais reminicentes em decorrência do dano oxidativo celular pelo aumento da

expressão de proteínas imunoreguladoras e pró-inflamatórias sensibilizam não só

das células dendríticas, mas também, macrófagos, linfócitos, neutrófilos que migram

dos nódulos linfáticos para o sitio tumoral (DOUGHERTY et al., 1998; DOLMANS et

al., 2003; HENDERSON, B.W., GOLLNICK, S.O., SNYDER, J.W. et al., 2004;

JUARRANZ et al., 2008; SOLBAN, N.; RIZUI, I.; HASANT, T., 2006;

TRIEESSCHEIJIN et al., 2006).

O azul de metileno é um corante que pertence à classe dos corantes

fenotiazínicos e que deperta grande interesse devido às suas propriedades

eletrocatalíticas em face da NADH4, que é uma coenzima do grupo das

dehidrogenases (SCHIRMER et al., 2011; WAINWRIGHT; AMARAL, 2005). Além

disso, o mesmo têm-se mostrado como um potente agente fotossensibilizante com

excelentes propriedades fotoquímicas em função de possuir alto rendimento na

geração de 1O

2 e EROs na presença de agentes redutores. Devido às suas

130

características fotodinâmicas e fototóxicas e demonstrar alta afinidade com a

membrana mitocondrial celular, o azul de metileno têm-se destacado como um

efetivo fotossensibilizante de grande potencial para à aplicação médica como agente

terapêutico na TFD (CHEN et al., 2008; GABRIELLI et al., 2004; PELOI et al., 2008;

TARDIVO et al., 2004; TARDIVO et al., 2005).

Em nosso trabalho avaliamos a expressão dos principais mediadores pró-

inflamatórios na massa tumoral sólida nos tratamentos tanto com azul de metileno

em diferentes doses bem como com laser aplicado em diferentes energias e em

associação com azul de metileno na concentração fixa de 0.1% com o objetivo de

investigar se seus efeitos podem desencadear processos inflamatórios interferindo

no desenvolvimento e na progressão tumoral.

Assim nossos resultados demonstraram que o tratamento com azul de

metileno na concentração de 0.1% na massa tumoral desencadeou um processo

inflamatório pela elevação não só dos níveis das citocinas IL-6, IL-10 e TNF-α como

na expressão gênica de COX-1, COX-2, iNOS e eNOS, sugerindo que há indícios da

ocorrência de efeitos citotóxicos em decorrência da alta afinidade do azul de

metileno pela membrana mitocondrial mas também de uma resposta imune

tumoricida contra as células tumorais o que levaria a desencadear morte celular.

Com relação aos tratamentos com azul de metileno nas concentrações de 0.3%,

1.0% e 3.0%, os dados dos mediadores envolvidos em processos inflamatórios na

massa tumoral sólida, foram semelhantes em relação ao grupo controle, o que

podemos indicar uma possível perda do efeito farmacológico devido à saturação de

tais concentrações nos ligantes da membrana mitocondrial. Este fato também pode

corroborar de forma consistente com os dados da análise de sobrevida do

tratamento do azul de metileno de diferentes concentrações na massa tumoral

sólida, onde foi observada uma menor probabilidade do tempo de sobrevida dos

grupos tratados com azul de metileno nas concentrações de 1.0% e 3.0% quando

comparado com o tempo de sobrevida do grupo controle, sugerindo a permanência

da progressão tumoral nestas condições. Diferentemente em relação aos grupos

tratados com 0.1% e 0.3% que tiveram uma probabilidade do tempo de sobrevida

maior que o do grupo controle. Também estes dados puderam complementar de

forma contundente no sentido de descartar qualquer dúvida sobre a ocorrência de

131

efeitos toxicêmicos no emprego das quatro concentrações do azul de metileno do

tratamento na massa tumoral sólida.

Com relação aos resultados prévios do tratamento com Laser, no grupo de 1J

observou um aumento bem expressivo nos níveis de IL-1 β, na expressão gênica de

COX-1, COX-2 e iNOS e uma redução na expressão gênica de eNOS em relação

aos demais grupos. Este fato leva presumir a existência de um quadro inflamatório

agudo, sugerindo indícios da ocorrência de uma resposta imunitária contra a massa

tumoral sólida. Além disso, os dados dos níveis de IL-6 também corroboram para

este fato, pois no grupo tratado com 1J foi observada uma redução dos níveis de IL-

6 quando comparado ao grupo de 3J, e com isto tendo menor ocorrência de

inflamação crônica. Neste mesmo grupo de 1J nota-se também uma menor resposta

biológica da massa tumoral sólida frente ao tratamento, em decorrência da redução

dos níveis de IL-10 quando comparado aos outros grupos de tratamento, dessa

forma mantendo a massa tumoral sólida em estado de inflamação aguda,

possibilitando a uma melhor resposta imune contra o tumor. Também foram

observados reduções dos níveis de TNF-α no grupo de 1J quando comparado com

as outras energias e consequentemente podemos indicar indícios de uma redução

do efeito necrótico severo, o que poderia ativar o aumento da expressão de fatores

de crescimento levando a estimular a proliferação das células reminiscentes

tumorais do dano celular e com isso favorecer a progressão ou ressurgência

tumoral.

De acordo com nossos resultados, podemos sugerir a energia do laser de 1J

como mais favorável para aplicação na TFD no tratamento de tumores, pois nesta

condição demonstrou-se a ocorrência de um quadro inflamatório agudo gerado a

partir do dano celular pelo aumento da expressão de IL-1β, COX-1, COX-2, iNOS,

colaborando na sensibilização neutrofílica e com isto desencadeando uma resposta

imunitária contra o tumor. Por outro lado nas energias de 3 e 6J, nestas condições

um quadro inflamatório crônico com necrose pode ser observado pelo aumento dos

níveis de IL-6, IL-10, TNF-α e redução da expressão gênica de eNOS, caracterizado

por danos mais severos não só celular como vascular, o que não seria bom do ponto

de vista terapêutico pois pode levar ao aumento da expressão de antígenos ativando

fatores de crescimento e fatores angiogênicos estimulando a proliferação das células

tumorais reminiscentes e dessa forma permitindo a ressurgência tumoral.

132

Os resultados do protocolo de tratamento com azul de metileno na

concentração de 0.1% em diferentes energias do laser pode-se verificar que no

grupo 0.1% azul de metileno + 1J um aumento extremamente expressivo nos níveis

de importantes marcadores envolvidos no processo inflamatório tais como, IL-1β, IL-

6, IL-10, TNF-α, COX-2, iNOS, PGE2 quando comparado com os demais grupos.

Além disso, dados da quantificação de EROs por TBARS e da atividade da MPO na

massa tumoral sólida também corroboraram com os resultados anteriores onde

também pode-se demonstrar elevados níveis de TBARS e na atividade da MPO no

grupo 0.1% azul de metileno +1J quando comparado em relação aos outros grupos

tratados. Este fato nos leva a indicar que nesta condição há ocorrência de uma

efetiva ação fotodinâmica do azul metileno na massa tumoral sólida em decorrência

da geração não só de radicais livres como do 1O2 responsáveis por causar

importantes danos oxidativos no ambiente tumoral, os quais foram confirmados pela

análise de TBARS. Consequentemente resultados de elevados níveis dos

mediadores inflamatórios também foram confirmados ocorrendo inflamação

necessária para a sensibilização das células dendríticas, macrófagos, linfócitos,

neutrófilos que migram dos nódulos linfáticos para o sitio tumoral e dessa forma

contribuindo para uma resposta imunitária tumoricida sendo esta última confirmada

através da análise da MPO, sugerindo a presença neutrofílica. A Análise histológica

também complementou com os resultados das citocinas (IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α),

COX-2, iNOS, PGE2 e MPO, onde no grupo 0.1% azul de metileno + 1J observa-se

grande áreas de necrose com presença de neutrófilos.

Com bases em nossos resultados podemos concluir que existem evidências

de uma ação tumoricida do azul de metileno em associação com 1 J de energia do

laser, em virtude da geração de importantes danos oxidativos celulares no ambiente

tumoral levando à morte celular, no aumento da expressão de importantes

marcadores pró-inflamatórios desencadeando inflamação que por sua vez

colaborando para sensibilização e atração neutrofílica numa efetiva resposta

imunitária tumoral específica. Entretanto, sugere-se a adição de novas pesquisas no

sentido de investigar outros parâmetros principalmente relacionados não só a fatores

de crescimento como indicadores de morte celular apoptose/necrose com o objetivo

de estabelecer uma efetiva ação terapêutica de controle á longo prazo contra o

câncer.

133

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Maria Carla Petrellis Avaliação dos Efeitos do Azul de