Diagnosi differenziale delle encefaliti virali

Maria R. Capobianchi

Laboratorio di VirologiaIstituto Nazionale Malattie Infettive “L. Spallanzani”

Le procedure diagnostiche di routine comprendono una piccola schiera dipatogeni noti

Restano fuori Patogeni emergenti

Patogeni legati a situazioni epidemiche contingenti

Agenti che sono neuropatogeni solo in presenza di fattori individuali dirischio

Agenti noti di cui non si conosce o non è sospettato il potenzialeneuropatogeno

Una vasta schiera di agenti sconosciuti

L’innovazione tecnologica per migliorare l’efficienza diagnostica

La maggioranza dei casi di meningo-encefalite (fino a 80%) rimane

ad eziologia sconosciuta

0

20

40

60

80

100

120

140

2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016

Men NN Virale Haem. Pneu. Strep. Staph List. Altri

Virali: circa 70-130/180-230 segnalazioni per anno

Dati SIMI Lazio (analisi SERESMI non pubblicata)

Meningiti Virali Lazio 2005-2016

Courtesy of S. Lanini

Eziologia Lazio campione 2016-2017

17%

12%

1%70%

Entero Herpes WNV Ignoto

Altre malattie con manifestazioni SNC• Parotite, Varicella, Morbillo, Arbovirosi

Meningiti virali: spesso manifestazione (infrequente) di alcune malattie virali

Courtesy of S. Lanini

A causa della analogie nella presentazione clinica, è difficile distinguere tra infezionivirali e batteriche sulla base della presentazione clinica

Quindi la diagnosi di laboratorio è cruciale per la gestione clinica

Il liquor è il campione di scelta

Importanza della diagnosi di laboratorio

Indizi utili (ma non sufficienti a guidare unaterapia mirata):

• Conta cellulare (90% delle meningitibatteriche presentano >100 WBC/mm3)

• Glucosio (ridotto in meningiti batteriche e fungine, normali in forme virali)

• Proteine (elevate quasi sempre)

Metodi indirettiSiero,liquor

• ELISA• IFA• Test di neutralizzazione• Immunità cellulare

Metodi direttiliquor

• Microscopia• Antigeni• Coltura• Metodi molecolari

Diagnosi di laboratorio

Approccio di Laboratorio: pregi e difetti

Standard diagnostico per le forme batteriche: • Coltura

Risultato lento Elevata sensibilità, ma negativa nelle forme decapitate

• Esame microscopicoRisultato immediatoSensibilità fra 60 e 90% nelle forme floride, scarsa nelle forme decapitate

• AntigeniRisultato immediatoSensibilità bassa

• MolecolareRisultato rapidoSensibilità elevata; rileva infezioni decapitate e patogeni non coltivabiliCaratterizzazione per sequenziamento

Standard diagnostico per le forme virali:• Coltura

Gold standard, sensibilità bassa, risultato lento• Molecolare

Diamond standard, sensibilità elevata, risultato rapidoCaratterizzazione per sequenziamento

Game changers.1

Le tecniche molecolari di rilevazione degli acidi nucleici, ed inparticolare la PCR, hanno rivoluzionato la diagnosi di laboratoriodelle infezioni (virali) del SNC, aumentando in modo significativo la% di identificazione

Aspetti favorevoli:

Elevata sensibilità

Elevata specificità

Tempi rapidi di risposta

Costi contenuti

Metodi quali- e quantitativi

BETTER TEST BETTER CARE

Game changers.2

The multiplex revolution: paradigm shift from disease-based sequential diagnosis of etiological agents to a syndrome-based assessment

I saggi monoplex (ricerca mirata di agenti singoli) sono vantaggiosi in caso di indaginemirata per forte sospetto clinico, ma spesso si devono applicare in manierasequenziale a seguito di esclusione, oppure in batterie parallele complesse e costose, che richiedono volumi ampi di campione o rachicentesi ripetute

L’approccio sindromico ha stimolato lo sviluppo di pannelli multiplex(agenti eziologici più probabili associate ad un quadro sindromico)

Vantaggi:

•Piccolo volume di campione

•un singolo prelievo

•rapidità di risultato

•possibilità di rilevare rapidamente infezioni miste

Esistono numerose soluzioni commerciali sia per i saggi monoplex che per i saggimultiplex

The multiplex revolution: paradigm shift from disease-based sequential diagnosis of etiological agents to a syndrome-based assessment

Bacteria: Virus: Fungi:

E. coli K1 CMVC. neoformans o gattii

Haemophilusinfluenzae

Enterovirus

Listeria monocytogenes

HSV-1

N. meningitidis HSV-2)

S. agalactiae HHV-6

S. pneumoniaeHumanparechovirus

VZV

Meningitis-Encephalitis (ME) Panel (FilmArray)

Esempi di piattaforme basate su pannelli sindromici multiplex

Programma di intervento per la riorganizzazione della sorveglianza ed il miglioramento diagnostico delle

sindromi neurologiche di sospetta origine infettiva nella regione Lazio (DCA U00162/2018)

Settori di intervento

• Sorveglianza integrata della sindrome neurologica acuta a sospettaeziologia infettiva

• Gestione della sindrome neurologica nell’ambito della rete dellemalattie infettive

• Sistema di diagnostica avanzata a supporto dellarete e della sorveglianza (approccio comune estandardizzato basato su PCR multiplex rapida)

Hydration lysis Inject Sample Start run

Bacteria: Virus: Fungi:

1. Escherichia coli K1 1. Cytomegalovirus 1. Cryptococcus neoformans

2. Haemophilus influenzae 2. Enterovirus 2. Cryptococcus gattii

3. Listeria monocytogenes 3. Herpes simplex virus 1 (HSV-1)

4. Neisseria meningitidis (incapsulato)

4. Herpes simplex virus 2 (HSV-2)

5. Streptococcus agalactiae 5. Human herpesvirus 6 (HHV-6)

6. Streptococcus pneumoniae 6. Human parechovirus (HPeV)

7. Varicella zoster virus (VZV)

•Test eseguibile in urgenza (piattaforma maneggevole, semplice) •Risultati in poco più di 1 ora dal caricamento

INMI: Meningitis-Encephalitis (ME) Panel

1%3%7%

20%

69%

Viral

Bacterial

Prion

Parasitic

Fungi

26%

29%

3%4%

11%

12%

15%

Enterovirus

HSV-1

VZV

WNV

EBV

Measles

HSV-2

Dati del progetto California Encephalitis

1570 pazienti (1998-2005): agente eziologico identificato nel 16% dei casi

Borrelliaspecies

Candida

Aspergillo NeisseriameningitidisMycobacterium

tuberculosisTreponema pallidum 0

Bartonella henselae

ChlamydophilapsittaciChlamydia trachomatis

Legionella pneumophilaBaylisascaris procioni

influenza B

rubella virusinfluenza ASt Louis encephalitis

Powassan virus

Rabbies virus

Toscana

Western equine encephalitis virus

Kunjin virusKunjin virus

Nipha virusCoxiellaburnetii

Mycoplasma pneumoniae

LeptospiraBrucella

Group B StreptococcusMurray Valley encephalitis virus (MVEV)

Bacillus anthracis

Salmonella spp

Streptococcuspneumoniae

Streptococcuspiogene

Rickettsia rickettsia

Toxoplasma gondii

Histoplasma capsulatumBalamuthia mandrillaris

Coccidioides immitis

Cryptococcus gattiiù

EBV: Epstein-Barr virus

Listeria monocytogenes

Escherichiacoli

Streptococcus agalactiae

Cryptococcusneoformans

HSV1HSV2CMV

HHV6

humanenteroviruses

Humanparechovirus

mumps virus dengue: Dengue virus

WNV

La crosse virus

Rocio virus

Colorado tick fever vius

Venezuelan equine encephalitis virus (VEEV)

Eastern Venezuela equine encephalitis virus

Rift Valley virus

CHIK

Parvovirus B19

Adenovirus

Louping ill virus

HIV

JEV

~60% sconosciuto~ il 40% noto

Nella gran parte dei casi di meningo-encefalite l’eziologia rimane sconosciuta

60%

20%

“Il viroma noto"

“Il viroma grigio”

“Il viroma ignoto (dark)”

20%

Vir

om

a to

tale

“circa 90% delle sequenze hanno le sembianze di materiale genetico virale, ma non sono classificate tassonomicamente"

…esistono almeno 320.000 virus di mammiferi cheattendono di essere scoperti...

Courtesy of Fabrizio Maggi

Game changers.3

La sfida per il futuro (prossimo): oltre la PCR

Sviluppo di tecniche avanzate

CLINICAL METAGENOMICS: THE HOPE, THE HYPE, AND THE HERE AND NOW

RICERCADIAGNOSTICA

Advances in microbial communities studies from Leeuwenhoek to NGS

Escobar-Zepeda A. Front. Genet. 2015

Contemporary analysis of all genomes present in a sampleCurrent/future applications• Pathogen discovery• Description of microbial communities (virome, microbiome) • Analysis of microbial variability• Diagnostics the future lab

Metagenomics

Metagenomic next-generation sequencing (mNGS) is a

game-changing technology for infectious disease diagnosis as

nearly all pathogens – viruses, bacteria, fungi, and parasites – can

be detected in a single assay

NGS offers the potential to interrogate clinical specimens for the presence of infectious diseases

in a completely unbiased manner.

However, significant challenges confront clinical microbiology laboratories attempting to

implement metagenomics using traditional clinical work flows

Il primo caso clinico (meningo-encefalite fulminante) in cui la metagenomica ha permesso la diagnosi eziologica tempestiva e la conseguente adozione di terapiamirata, efficace

Absence of mycobacteria (Panel G, acid-fast), fungi (PanelH, Gomori methenamine silver), and leptospira or other spirochetes (Panel I, Warthin–Starry silver). TEM revealed the presence of an inflammatoryinfiltrate and the absence of inclusion bodies, viral particles, or other evidence of microorganisms

Temporal trends in the publication of Encephalitis Cases

involving NGS in the last decade

Brown JR et al J of Inf 2018

Agenti identificati con tecniche di metagenomica (shot-gun) NGS

Agenti noti 16HSV-1, Varicella, Morbillo, Parotite, Coxsackie A9, JC virus, EBV, West Nilevirus, St Louis encephalitis virus, Echovirus 30, M. tubercolosis, Cryptococcus neoformans

Agenti nuovi 18Arenavirus, Squirrel bornavirus, Cyclovirus, Densovirus, Astrovirus, Gemycircuarlvirus

Patogeni inattesi 5Parvovirus 4, Coronavirus OC43, Astrovirus VA1/HMO-C, mumpsvaccine virus

Patogeni rari 5Balamuthia mandrillaris, Candida tropicalis, Brucella melitensis, Leptospira santarosai, Naegleriafowleri

Brown JR et al J of Inf 2018

44 CASE REPORTS

Il protocollo sindromico per la gestione del paziente (DCA U00162/2018)

ASPETTI DIAGNOSTICI IL LABORATORIO

• Analisi metagenomica (basata su NGS) su tutti i campioni di liquor negativi allo screening (F.A.)

• I risultati verranno riferiti al contesto territoriale, stagionale e individuale (fattori di rischio)

• La mappatura spazio-temporale servirà a disegnare pannelli diagnostici differenziati per i vari contesti della nostra regione

Sperimentazione di un modello di diagnostica avanzata che si avvale dell’ausilio della metagenomica per l’attribuzione eziologica delle meningoencefaliti

mNGS WORKFLOW (SISPA)

Total nucleic acid extraction

Reverse transcription and amplification of nucleic acid(non targeted amplification):

Sequence Independent Single Primer Amplification - SISPA

Amplicon purification & fragmentation

Sequencing with Ion Torrent S5 platform

Library preparation

Preliminary work included optimization of SISPA, using positive controls (true clinical CSF samples) or negative CSF samples spiked with known amount of DNA (HSV) and RNA (HCV) viruses

Bioinformatic workflow

1. Quality control of raw reads was performedusing BaseCaller and Cutadapt

2. High quality reads were mapped to humangenome using Bowtie2 (in very-sensitivemode)

3. No-human reads where mapped to NCBInucleotide database, with a cut-off E-valueof 10-5

Results. 2CSF negative to FilmArray were analyzed by metagenomics

Total CSF: 72

Age(years)

N° Gender (%M)

Diseases

60 17 58 1 Meningoencephalitis; 6 Encephalitis; 10 Not defined

Eukaryotic reads: 7.54 x 104 (range: 2.90x 104 -6.13 x 106 )

Bacterial reads: 2.41 x 104 (range: 6.90x 101 -2.68 x 107 )

Viral reads: 20.5 (range: 1 - 1.91 x 107 )

Human reads: 3.93 x 107 (range: 5.25x 105 -5.29 x 107 )

No hits reads: 4.41 x 105 (range: 2.06x 105 -2.45 x 106 )

viral reads ≈ 0,00005%(range: 0,000003 % - 34 %)

Average reads per sample: 4.17 x 107 ± 1.42 x 106 (95% CI)Median reads length: 190nt (30-390)

Results 3. 72 CSF analyzed by metagenomics

Conclusions (pros)

• Viruses excluded from FilmArray detected in ~15% (11/72) of CSF, in some cases confirmed a posteriori by targeted PCR

• Overall good agreement results between IonTorrent and Illumina platforms

• In some cases relevant number of reads (i.e. TTV), providing near full genome characterization

• Unbiased mNGS may represent a suitable approach to characterize the virome in samples containing small amounts of NA (i.e. CSF)

• Possible to foresee the eventual replacement of many single-agent assays performed in reference laboratories with a unified mNGS approach?

Conclusions (cons)• In some cases disagreement between NGS and targeted amplification

(PCR) RNA vs DNA? Amplified region?

• Lack of standardization for data analysis and interpretation

• So far timeframe not compatible for clinical decision-making

Open issues

• Difficulties in discriminating between pathogenic organisms or bystanders (non pathogenic) and contaminants (i.e. reagent and environmental contaminant background signatures) Need of algorithm correctly prioritizing etiologic pathogens

• Ethical implications of metagenomics: incidental findings

Laboratory diagnosis of meningitis/encephalitis is critical for patient care

Laboratory diagnosis of meningitis/encephalitis is multifaceted with many complexities, not suitable to one stop shopping

New assays are constantly being developed to aid in the diagnosis of meningitis/encephalitis

SUMMARY

Paris, May 1888

Work in progress

Barbara Bartolini

M. Beatrice Valli

Martina Rueca

Cesare Gruber

SERESMI

Giuseppe Ippolito