La criptosporidiosi nelle diaree neonatalidegli agnelli

RIASSUNTOLa criptosporidiosi è una patologia a diffusione mondiale che causa enterite di entità variabile in diverse specie animali com-preso l’uomo. La specie maggiormente riscontrata negli ovini è il Cryptosporidium parvum, riconosciuto agente zoonosico, chein alcuni contesti in Spagna è stato individuato come la principale causa di diarree neonatali negli agnelli. Il C. parvum nel-l’allevamento ovino causa sintomatologia principalmente in agnelli nei primi 90 giorni di vita, con un picco massimo in ani-mali tra 8 e 14 giorni. Un’appropriata diagnosi in corso di diarree neonatali è fondamentale per stabilire un trattamento spe-cifico, sia per ragioni di benessere animale, sia al fine di abbassare il tasso di escrezione di oocisti (particolarmente resistenti al-l’ambiente esterno) e di conseguenza la contaminazione ambientale. A tal riguardo le misure igieniche quali il tutto pieno-tut-to vuoto, la pulizia con acqua calda ad alta pressione dei locali, le disinfezioni con ammoniaca e la separazione dei capi am-malati risultano fondamentali nel controllo dei criptosporidi. In Italia non esistono farmaci registrati per gli ovini, tuttavia inletteratura due farmaci hanno dimostrato rilevante azione nei confronti di prevenzione e trattamento della malattia: la paro-momicina e l’alofuginone. La criptosporidiosi può causare perdite economiche nell’allevamento ovino sia per la mortalità deicapi sia per la perdita di peso degli agnelli sopravvissuti. Nel nostro paese sono carenti dati riguardo la prevalenza e l’impattoeconomico di tale patologia. Lo scopo di questa mini-review è quello di informare sull’importanza di diagnosi, profilassi e te-rapia per il controllo della criptosporidiosi, una crescente problematica per la sanità pubblica veterinaria.

PAROLE CHIAVECriptosporidium parvum, criptosporidiosi, ovini, agnelli, diarree ovine.

V. MARIANO & A. NARDI

Laboratorio di Diagnostica, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana,Sezione di Grosseto, Via Europa 30, Grosseto, Italy

INTRODUZIONE

Cryptosporidium spp. è un parassita ubiquitario a diffusionepressoché mondiale causa di enterite in diverse specie ani-mali1. La tassonomia di questo genere è in continuo muta-mento dato l’elevato numero di specie riconosciute negli ul-timi anni, Slapeta riporta 30 specie riconosciute fino al20132. La maggior parte delle specie di Cryptosporidium nonsono strettamente specie-specifiche. C. parvum, ad esempio,è stato identificato in topi, bovini, cavalli, uomo ed in moltialtri mammiferi3. Altre specie, incluso C. baileyi, C. canis, C.felis, C. meleagridis e C. muris, una volta ritenute specifiche dipolli, cani, gatti, tacchini e topi, rispettivamente, sono invecestate riconosciute come infettive per l’uomo e quindi devonoanche essere considerate zoonosiche1,4,5. La specie di Crypto-sporidium maggiormente diffusa a livello mondiale è C. par-vum3. Il ruolo zoonosico di tale agente è stato dimostrato piùvolte con gravità di sintomi soprattutto in pazienti immuno-depressi, quali malati di AIDS, bambini ed anziani5. Diversistudi epidemiologici sono stati condotti in Italia in campoumano (Figura 1). In particolare in Toscana è stata riscon-trata una prevalenza del 5,4% di criptosporidiosi in pazientidiarroici immunocompromessi6,7. Nella provincia di Grosse-to è stata di recente segnalata un’associazione tra un focolaiodi diarrea negli agnelli ed un grave episodio di diarrea in un

bambino di pochi mesi da C. parvum di un raro genotipo(IIaA20G2R1)8.L’infezione con C. parvum può causare diarrea più o menograve prevalentemente in agnelli di età compresa tra i 7 ed i90 giorni, con un picco massimo registrato tra gli 8 ed i 14giorni d’età degli animali10. All’esordio della sintomatologia

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Autore per la corrispondenza:Valeria Mariano (valeria.mariano@izslt.it).

Figura 1 - Distribuzione geografica degli studi epidemiologici sucasi umani di criptosporidiosi in Italia (i simboli si riferiscono alle re-gioni Italiane)9.

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gli agnelli si presentano vigili ma al persistere della diarreaper 5-7 gg possono seguire disidratazione, inappetenza, ten-sione addominale, letargia e, sebbene nella maggior partedei casi la patologia sia autolimitante, è possibile anche lamorte dell’animale in 1-2 gg10,11. La mortalità è scarsa inagnelli allevati allo stato brado ma aumenta considerevol-mente in allevamenti semi-estensivi, in carenti condizioniigieniche ed in associazione ad altri agenti eziologici o ad er-rori alimentari5,10.

CICLO BIOLOGICODEL CRYPTOSPORIDIUM SPP.

Cryptosporidium spp. (dal greco: Kryptos = nascosto e Spó-ros = seme) è un protozoo classificato nel Phylum Apicom-plexa, classe Conoidasida, sottoclasse Coccidia, ordine Eu-coccidiorida, sottordine Eimeriorina, famiglia Cryptospori-diidae4,12. Il ciclo biologico del Cryptosporidium spp. è diret-to (Figura 2), sia la fase sessuata che quella asessuata si svol-gono in un unico ospite attraverso gli stadi di: sporozoite,trofozoite, schizonte, merozoite, microgamete, macrogame-te, zigote ed oocisti12. L’oocisti sporulata è il solo stadio eso-geno, contiene 4 sporozoiti (di circa 4-7 µm di lunghezza)racchiusi da una parete a doppio strato, che conferisce resi-stenza nell’ambiente esterno, ed è escreta tramite le feci dal-l’ospite infetto. La fase endogena inizia quando un ospite re-cettivo ingerisce le oocisti, gli sporozoiti si disincistano edentrano in contatto con le cellule epiteliali del tratto ga-stroenterico (respiratorio per C. baileyi) dell’ospite. Gli spo-rozoiti si legano alla membrana apicale delle cellule epitelia-li e stimolano la membrana dell’ospite ad estroflettersi al fi-ne di inglobare il parassita in un vacuolo intracellulare ex-tracitoplasmatico. Lo sporozoite si riproduce in maniera

asessuata fino a formare un trofozoite sferico e successiva-mente uno schizonte contenente merozoiti. I merozoiti ven-gono rilasciati nell’intestino, parassitano altre cellule epite-liali o maturano in gametociti, in grado di produrre oocistiche sporulano in situ. Le oocisti che sviluppano nel tratto ga-strointestinale (es. C. parvum) sono espulse con le feci1. Visono evidenze che le oocisti con parete sottile (circa il 20%)siano in grado di dare luogo a fenomeni di auto-infezione,mentre quelle a parete spessa (circa l’80%) sono destinate adabbandonare l’organismo che le ospita per infettare nuoviospiti1,13. A differenza delle oocisti di altri coccidi come Ei-meria ed Isospora, le oocisti di Cryptosporidium spp., nonsporulano nell’ambiente esterno, bensì vengono escrete giàsporulate e quindi, essendo direttamente infettanti, risultapiù facile la trasmissione ad altri soggetti14. Il periodo di pre-patenza varia dai 3-5 giorni alle 2 settimane nell’ambito del-le diverse specie ospiti e della specie di Cryptosporidium1,4,nelle pecore viene riportata una prepatenza di circa 4 gg15. Inuno studio condotto in Belgio su 10 aziende ovine, con unnumero medio di 176 animali e prevalenza di Cryptospori-dium spp. pari al 13,1%, la media di escrezione di oocisti ri-scontrata è stata di 6832 oocisti/grammo16, tuttavia in ani-mali diarroici Thompson et al. riportano picchi di escrezio-ne fino a 109 oocisti/grammo13. Tali oocisti, essendo partico-larmente resistenti nell’ambiente esterno, possono contami-nare le risorse idriche anche attraverso dilavamento del ter-reno contaminato dalle feci15. Le oocisti sopravvivono benenegli ambienti acquatici ed essendo possibile la loro trasmis-sione attraverso l’acqua, rientrano nella categoria dei patoge-ni idrotrasmessi, in particolare negli USA viene riconosciutoin medicina umana come uno dei principali appartenenti al-la categoria1 ed alcuni studi dimostrano che i molluschi bi-valvi possono rappresentare una fonte di rischio alimentareper l’uomo17,18.

Figura 2 - Ciclo biologico del Cryptosporidium spp.1

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PATOGENESI DELLA SINTOMATOLOGIA

Negli agnelli il sintomo clinico principale risulta essere unadiarrea tipicamente giallognola dalla consistenza soffice-li-quida, associata spesso ad anoressia, depressione del sensorioe dolore addominale13. La gravità dei sintomi può variare inrelazione allo stato immunitario dell’ospite e talvolta puòportare a morte agnelli gravemente colpiti8,19. Anche la distri-buzione dell’infezione nell’ospite può determinare sintomidifferenti: infezioni dell’intestino tenue causano spesso unadiarrea acuta piuttosto severa, mentre infezioni localizzate al-l’ileo distale o all’intestino crasso risultano di frequente asin-tomatiche13,19. Alcuni studi sperimentali hanno tentato dispiegare la patogenesi della sintomatologia, che tuttora non ècompletamente accertata13. Si ritiene che il sintomo diarreasia dovuto e all’effetto del parassita e dei suoi prodotti sullecellule della mucosa intestinale e alla risposta infiammatoriadell’ospite19. Gli enterociti sono infettati dagli sporozoiti rila-sciati dalle oocisti a parete spessa ingerite o dalle oocisti a pa-rete sottile provenienti da altre cellule infettate. Le proteineapicali del criptosporidio quali ad esempio CSL, GP 900, GP40 e TRAP C1, favoriscono l’attacco dello sporozoite sulla su-perficie epiteliale dell’enterocita facilitando la formazione delvacuolo parassitoforo20,21. L’invasione e la colonizzazione del-la superficie degli enterociti determina una displasia dei mi-crovilli apicali, come un accorciamento dei villi o la loro fu-sione ed una iperplasia delle cripte13. Inoltre il criptosporidiosembra rompere le giunzioni epiteliali strette, determinandoun aumento della permeabilità epiteliale. Le lesioni epitelialiinducono uno scompenso nei meccanismi di trasporto di nu-trienti ed elettroliti, nonché una carenza di enzimi digestiviassociati alla membrana determinando una diminuita capa-cità di assorbimento13. È stata ipotizzata anche la secrezionedi una possibile enterotossina, ancora non confermata, chestimolando la secrezione di cloro potrebbe generare una diar-rea di tipo secretorio22. L’apoptosi cellulare indotta dal paras-sita, inoltre, determina il rilascio di mediatori dell’infiamma-zione quali interleukina 8, TGF b e chemiochine che incre-mentano la flogosi locale22. Dunque la diarrea da criptopsori-diosi è sia da malassorbimento che secretoria20.

DIAGNOSI DI CRIPTOSPORIDIOSI

La diagnosi si basa essenzialmente sul rinvenimento delleoocisti nelle feci tramite un esame copro-microscopico. Pre-feribilmente i campioni andrebbero consegnati freschi al la-boratorio di analisi, sebbene il criptosporidio sia particolar-mente resistente. Le tecniche utilizzate per l’analisi sonoquelle di concentrazione per flottazione con utilizzo di solu-zioni dense o di strisci a fresco dal materiale fecale, spesso se-guite da colorazioni estemporanee (es. carbolfucsina o verdemalachite) o permanenti (es. Ziehl-Neelsen modificata).Nella Figura 3 viene mostrata la caratteristica colorazionerossa assunta dalle oocisti utilizzando la colorazione diZiehl-Nelseen modificata. In commercio, sono anche dispo-nibili kit diagnostici di immunofluorescenza (IFA) ed ELISAcon anticorpi monoclonali per la ricerca delle oocisti sucampioni di feci. Per l’identificazione delle diverse specie egenotipi vengono invece utilizzate tecniche molecolari(PCR-RFLP o la RT-PCR)4,23.

DIFFUSIONE DEL CRYPTOSPORIDIUM SPP.

Negli ovini sono state isolate diverse specie di criptosporidiquali: C. parvum, C. bovis, C. xiaoi, C. ubiquitum, C. cervi-ne3,8. Tuttavia la specie di Cryptosporidium spp. più frequen-te in Europa risulta essere C. parvum25. Sebbene negli alleva-menti ovini vengano riportate prevalenze alquanto variabilidal 5 al 77%16,26-29, alcuni autori lo considerano uno dei mag-giori enteropatogeni implicati nelle diarree neonatali dei pic-coli ruminanti10,25. In particolare Munoz et al. (1996), in unostudio coprologico nel nord-est della Spagna, riportano C.parvum come l’agente eziologico principale delle diarreeneonatali con una prevalenza del 45% negli agnelli con diar-rea, rispetto al 30% di E. coli ed il 2,1% di rotavirus30. I datisulla distribuzione di Cryptosporidium spp. in Italia negli al-levamenti ovini sono alquanto scarsi7.

TERAPIA E PREVENZIONE DELLA CRIPTOSPORIDIOSI

Le oocisti di Cryptosporidium spp., estremamente resistentinell’ambiente esterno, rappresentano l’unica fonte di infe-zione per l’uomo e gli animali, pertanto le strategie di con-trollo della criptosporidiosi dovrebbero prevedere sia il trat-tamento dei soggetti malati sia strategie per ridurre il nu-mero di oocisti nell’ambiente31. Le oocisti dei criptosporidisono resistenti ai comuni disinfettanti rendendone difficilela scelta per la pulizia degli ambienti32. Perché un disinfet-tante sia efficace dovrebbe essere in grado di penetrare lostrato lipidico esterno dell’oociste per poi attaccare lo stratodi glicoproteine della parete interna dell’oociste ed infineraggiungere lo sporozoite31. Le alte concentrazioni necessa-rie all’efficacia dei comuni disinfettanti per la distruzionedelle oocisti sono o molto costose, o altamente tossiche, o ri-chiedono lunghi tempi d’azione o sembrano essere efficacisolo ad alte temperature e pertanto risultano improponibilial di fuori dei laboratori33. Tuttavia l’esposizione all’ammo-niaca e all’idrogeno perossido riduce la carica infestante del-le oocisti32. Le misure igieniche da adottare in corso di diar-ree neonatali quali pulizia a caldo e ad alta pressione dei lo-cali, disinfezione con ammoniaca, vuoto sanitario, alleva-mento in box molto puliti, isolamento degli animali malati

Figura 3 - Cryptosporidum spp. alla colorazione di Ziehl Neelseningrandimento 100X24.

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e separazione degli animali in base alle classi di età, risulta-no pertanto fondamentali sia per la prevenzione che per iltrattamento della criptosporidiosi33. Come per qualunquesindrome diarroica, terapie sintomatiche sono indicate perun più rapido recupero da parte dei soggetti con sintomato-logia conclamata. In particolare è importante supplire allaperdita di liquidi e di elettroliti con trattamenti reidratanti.Per i ruminanti sono stati condotti alcuni studi per tratta-menti terapeutici specifici soprattutto nei vitelli31,34. Nono-stante siano stati condotti pochi studi negli agnelli, due pro-dotti hanno dimostrato una reale efficacia: alofuginone lat-tato35 e paromomicina solfato36-38; un’altra molecola, il lasa-locid, ha fornito risultati interessanti nel corso di due provesperimentali, ma questi risultati non si sono rivelati ripro-ducibili33. In Italia non esistono farmaci registrati per il trat-tamento degli agnelli.La paromomicina è un amminoglicoside scarsamente assor-bito dal tratto intestinale che riduce ma non previene com-pletamente i sintomi clinici36,37. In uno studio sperimentalela differenza tra il gruppo di controllo ed il gruppo in trat-tamento con 100 mg/kg die per 3 giorni è risultata significa-tiva: nel gruppo di controllo il 75% degli agnelli presentavadiarrea mentre il 65% degli agnelli trattati restava asintoma-tico36. Inoltre lo stesso studio raccomanda la somministra-zione di paromomicina per ridurre la contaminazione am-bientale da oocisti in quanto il farmaco ne diminuisce l’e-screzione36.L’alofuginone lattato è un composto sintetico con attività an-tiprotozoaria. Ha fornito degli ottimi risultati nei vitelli31,34.In uno studio condotto in Francia sugli ovini la sommini-strazione di 100 mg/kg di alofuginone per 7 giorni si è di-mostrata efficace nel trattamento delle diarree da criptospo-ridiosi: la diarrea si concluse nella maggioranza degli agnelliin 1-2 giorni. Alcuni soggetti del gruppo particolarmente de-pressi a cui era stata somministrata la terapia dopo 5-7 gior-ni di diarrea, morirono nonostante il trattamento, probabil-mente a seguito di una severa disidratazione ed acidosi inquanto non fu applicata alcuna terapia di supporto con elet-troliti34. In Spagna si sono registrati risultati anche con alo-fuginone a 500 mg/kg per tre giorni39. Un trattamento di 7giorni ad un dosaggio più basso, quale quello testato da Gi-radins et al. nel 2007, sebbene possa sembrare più laborioso,dovrebbe essere preso in considerazione in casi in cui la sa-lute degli animali sia particolarmente compromessa in quan-to potrebbe risultare meno aggressivo34.

DICUSSIONI E CONCLUSIONI

I dati sulla distribuzione di Cryptosporidium spp. in Italia ne-gli allevamenti ovini sono alquanto scarsi9 e pertanto sonoopportuni ulteriori studi. Data la particolare persistenza del-le oocisti di Cryptosporidium nell’ambiente esterno sarebbeproficua una corretta diagnosi delle diaree negli agnelli al lo-ro esordio al fine di prevenire la diffusione del parassita al-l’interno degli allevamenti, nonché la sua diffusione comeagente zoonotico. Un’appropriata diagnosi in corso di diar-ree neonatali è fondamentale per stabilire un trattamentospecifico, sia per ragioni di benessere animale, sia al fine diabbassare il tasso di escrezione di oocisti (particolarmenteresistenti all’ambiente esterno) e di conseguenza la contami-nazione ambientale. Nonostante sia irreale pensare ad una

eradicazione del criptosporidio all’interno degli allevamenti,si possono ottenere ottimi risultati combinando trattamentiterapeutici dei soggetti ammalati ad un incremento delle mi-sure igieniche. A tal riguardo le misure igieniche quali il tut-to pieno-tutto vuoto, la pulizia con acqua calda ad alta pres-sione dei locali, le disinfezioni con ammoniaca e la separa-zione dei capi ammalati risultano fondamentali nel control-lo dei criptosporidi. Nondimeno una corretta diagnosi sirende necessaria al fine di intraprendere un’appropriata tera-pia evitando inutili trattamenti antibiotici (favorenti anchel’insorgere di fenomeni di antibiotico resistenza), riducendospese improduttive per gli allevatori e perdite dovute allamortalità e al calo produttivo dei capi coinvolti. Sebbene nonesistano studi di settore specifici volti all’individuazione deicosti sul bilancio aziendale delle diarree negli agnelli, in let-teratura viene riconosciuto che la criptosporidiosi determinanotevoli perdite economiche a causa della mortalità, della ri-tardata crescita degli animali, dei trattamenti terapeutici eper l’aumento di assistenza che si rende necessario25. Altraproblematica inerente il controllo della criptosporidiosi ne-gli agnelli in Italia risulta essere la carenza di farmaci regi-strati per gli ovini, tuttavia in letteratura due farmaci si sonodimostrati efficaci per la prevenzione e il trattamento dellamalattia: la paromomicina e l’alofuginone. Tali farmaci, as-sociati a trattamenti reidratanti e, a un utilizzo di appropria-ti interventi igienico-sanitari, possono essere utili al fine dicontrollare la criptosporidiosi negli agnelli e così cercare dicontrollare la diffusione di questo emergente patogeno in Sa-nità Pubblica Veterinaria.

❚ Cryptosporidiosis in neonatal lambs diarrhoea

SUMMARYCryptosporidiosis is a disease causing enteritis in many spe-cies, man included, with severe symptoms in immunode-pressed individuals and self-limiting infections in competenthosts. One of the most frequent Cryptosporidium spp. in ovi-ne is C. parvum, an established zoonotic agent, which in so-me contest in Spain has been recognised as the first agent ofdiarrhoea in lambs. It causes diarrhoea mainly in individualsduring the first 90 days of life with a maximum peak in ani-mals among 8 and 14 days. Diagnosis is made mainly by exa-mination of fecal samples. Having an appropriate diagnosisfor C. parvum in lamb diarrhoea outbreaks is very importantin order to start an appropriate treatment as for animal wel-fare, as to decrease the oocysts shedding in the environment.The oocysts of this parasite, having a double capsule, are veryresistant in the environment and to disinfectants. Hygienicmeasures such as “all in-all out” measures, cleaning with hothigh pressure, disinfections with ammonia, and isolation ofsick animals are fundamental to control the spreading of di-sease. For the therapy of ill animals is fundamental to treatfor dehydratation and acidosis together with a specific treat-ment. In Italy there are no drugs registered to be used in ovi-ne, but in literature the efficacy of paromomycin and halo-fuginone has been reported. In many countries criprospori-diosis has been recognised as an important agent for neona-tal lamb diarrhoeas and thus it can be causative of economiclosses due to the mortality and loss of weight of animals. Da-ta on the prevalence and economic impact of this disease in

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Italian lambs are unknown and further studies are required.The aim of this review is to inform on the importance of dia-gnosis, prophylaxis and therapy in order to control crypto-sporidiosis, an issue of growing concern in the VeterinaryPublic Health sector.

KEY WORDSCryptosporidium parvum, cryptosporidiosis, lamb diarrhoea,ovine, sheep.

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