SUSTAV HISTOKOMPATIBILNIH ANTIGENA HLA U OVJEKA

OSNOVE GLAVNOG SUSTAVA TKIVNE SNOLJIVOSTI U OVJEKA

Doc.dr.sc.Marija Crni-Martinovi

Sustav HLA (humani leukocitni antigeni) naziv je za glavni kompleks tkivne srodnosti (MHC) u ovjeka. Sadri veliki broj gena koji su u vezi s imunim sustavom. Nalaze se na kratkom kraku kromosoma 6, na odsjeku 6p21.3 (Sl. 1.) i kodiraju sintezu proteina koji predoavaju antigene imunoloki kompetentnim stanicama. Ovi geni prisutni su u svih vertebrata.

Sl. 1. Kromosom 6 Preuzeto iz: Parham P The Immune system 2005.S obzirom na razliite genske porodice, humana MHC regija podijeljena je u tri razreda koji zauzimaju oko 7,6 Mb (Mega baza):

geni HLA razreda I smjeteni su telomerino

geni HLA razreda II nalaze se centromerino

geni HLA razreda III smjeteni su izmeu njih.

Geni HLA razreda I i II odgovorni su za sintezu antigena HLA, dok su geni HLA razreda III odgovorni za sintezu komponenti komplementa. U regiji se nalazi vie od 252 gena. 28% ovih gena ima neku funkciju u imunom sustavu. Geni HLA nasljeuju se kodominantno.

Antigene HLA, uz koji su zdrueni peptidi iz citosola, prepoznaju citotoksini limfociti T (Tc).Peptide iz vezikula, vezane na antigene HLA razreda II prepoznaju pomoniki limfociti T (Th). Antigeni HLA jako su polimorfni i efektorska stanica moe prepoznati samo strani antigen vezan uz vlastitu molekulu HLA.

Zreli limfociti imaju stanini receptor T (TCR) koji prepoznaje peptid vezan uz molekulu HLA. Svaka molekula HLA ima samo jedno vezno mjesto za antigeni peptid. Ista molekula moe vezati razliite antigene peptide, ali u jednom momentu samo jedan peptid. Citokini, a posebno interferon , pojaavaju ekspresiju molekula HLA.

Analiza gena HLA primjenjuje se u: transplantaciji organa i tkiva, populacijskim istraivanjima, sudskoj medicini (identifikacija osoba i sluajevi osporavanog oinstva) prouavanju migracija stanovnitva, kao pomo pri postavljanju dijagnoze nekih autoimunih bolesti te u transfuzijskom lijeenju.1. Povijest2. Antigeni HLA razreda I 2.1. Graa

2.2.Funkcija3. Antigeni HLA razreda II 3.1 Graa 3.2. Funkcija4.Nomenklatura antigena i gena HLA5.Dokazivanje antigena i gena 5.1.Seroloko testiranje antigena HLA 5.1.1.Test limfocitotoksinosti 5.2 Molekularno testiranje gena HLA 6. Protutijela u sustavu HLA 7. Znaenje sustava HLA u klinikoj praksi 7.1. Transplantacija organa 7.2. HLA i bolesti 7.3. HLA i maligne bolesti 7.4. HLA u transfuzijskoj medicini 7.4.1 Transfuzije trombocita 7.4.2 Transfuzije granulocita 7.4.3. Transfuzijom uzrokovano akutno zatajenje plua-TRALI (engl.Transfusion-Related Acute Lung Injury ) 7.4.4.Bolest transplantata protiv primatelja- GVHD (engl.Graft Versus Host Disease)SKRAENICEBMDW Svjetska organizacija davatelja kotane sri (engl. Bone Marrow Donors Worldwide) CDC Citotoksinost ovisna o komplementu (engl. Complement-Dependent

Cytotoxicity)DNA Deoksi-ribonukleinska kiselinaDTT DitiotreitolELISA Imunoenzimski test za dokazivanje protutijela (engl. Enzime Linked Immunosorbent Assay)G-CSF Faktor rasta kolonija granulocita (engl. Granulocyte-Colony Stimulating

Factor)GVHD Bolest transplantata protiv primatelja (engl. Graft Versus Host Disease)

HLA Humani leukocitni antigenIL InterleukinIHWS Meunarodna radionica o tkivnoj podudarnosti (engl. International Histocompatibility Workshop)

MHC Glavni kompleks tkivne srodnosti (engl. Major Histocompatibility Complex)NK Prirodno ubilake stanice (engl. Natural Killer Cells)PCR Lanana reakcija polimerazom (engl. Polymerase Chain Reaction)PRA Panel reaktivna protutijela (engl. Panel Reactive Antibody)RA Reumatski artritissHLA Solubilni humani leukocitni antigenSLE Sistemski eritemski lupus

SSP Svjee smrznuta plazmaTAP Transporter antigenih peptida (engl. Transporter Associated with Antigen Processing)Tc Citotoksini limfociti TTh Pomoniki limfociti TTCR Stanini receptor T (engl. T Cell Receptor)TRALI Transfuzijom uzrokovano akutno zatajenje plua (engl. Transfusion Related Acute Lung Injury)1. Povijest

Pred neto manje od ezdeset godina otkriven je polimorfni sustav HLA. Jean Dausset ( Sl. 2.), Jon van Rood (Sl. 3.) i Rose Payne (Sl. 4) su 1958. god postavili osnove na kojima je dokazano postojanje HLA kompleksa. U svojim prvim radovima opisuju protutijela koja su pronali u serumima politransfundiranih bolesnika i trudnica.

Sl. 2. Jean Dausset

Sl. 3. Jon van Rood

Preuzeto iz: Thorsby E A short history of HLA Preuzeto iz: Thorsby E A short history of HLA

Tissue Antigen 2009 Tissue Antigen 2009

Sl. 4. Rose Payne

Preuzeto iz: Thorsby E A short history of HLA Tissue Antigen 2009.Ubrzo su otkriveni mnogi antigeni unutar ovog sloenog sustava, to je zahtijevalo meunarodnu suradnju kako bi istraivai mogli usporediti reagense, tehnike i dobivene rezultate. Osnovan je International Hystocompatitility Workshops (IHWS). Impuls za prvi IHWS dao je Amos (Sl. 5.) 1964. godine.

Sl. 5. Bernard Amos Sl. 6. Ruggiero Ceppellini

Preuzeto iz: Thorsby E A short history of HLA Tissue Antigen 2009.Osnovni cilj prvog radnog sastanka bio je usporeivanje tehnika dokazivanja antigena HLA. Razliiti laboratoriji koristili su razliite tehnike testiranja (leukoaglutinaciju, indirektni antiglobulinski test, mijeanu aglutinaciju, test fiksacije komplementa, test mikrocitotoksinosti). Dvadeset i tri istraivaa testirala su iste serume i stanice vlastitim tehnikama. Drugi IHWS organizirao je Jon van Rood 1965., a trei 1967. godine poznati talijanski genetiar Ruggiero Ceppellini (Sl. 6.). Cilj treeg sastanka bila je genetska analiza do tada poznatih antigena. Istraivai su koristili vlastite serume i tehnike. Nekoliko istraivaa koristilo je test mikrolimfocitotoksinosti kojeg su razvili Terasaki (Sl. 7.) i McClelland i koji kasnije postaje standardna seroloka tehnika dokazivanja antigena HLA.Zbog otkria sve veeg broja antigena 1968. god. osnovan je odbor za nomenklaturu. Taj odbor, koji i danas postoji, odgovoran je za davanje slubenih imena gena i antigena HLA sustava. Do 2008. god. odrano je 15 radnih sastanaka, a 16. e se odrati u svibnju 2012. u Liverpoolu.

Sl.7. Paul Terasaki Preuzeto iz: Thorsby E A short history of HLA Tissue Antigen 2009.Kissmeyer-Nielsen (Sl. 8.) dokazao je postojanje dva lokusa: HLA-A, sa sedam alela i HLAB, sa osam alela. Dausset i Terasaki 1969. god. dokazuju postojanje treeg lokusa (HLA-C). Sl. 8. Kissmayer-Nielsen Sl. 9. Julia i Walter Bodmer

Preuzeto iz: Thorsby E A short history of HLA Tissue Antigen 2009.Julia i Walter Bodmer (Sl. 9.) su 1977. god. definirali HLA-D i HLA-DR lokus te je 1980. god. objavljena slika genske regije HLA na kratkom kraku kromosoma 6, s vrlo polimorfnim genima HLA-A, HLA-B i HLA-C, koji kodiraju antigene na svim stanicama s jezgrom i trombocitima. Genski produkti HLA-DR, HLA-DQ i HLA-DP nalaze se na limfocitima B i antigen predonim stanicama - monocitima i dendritikim stanicama.Sausset, van Rood, Ceppellini i Amos dokazali su da je HLA sustav vrlo bitan za preivljavanje transplantiranog organa.Trei IHWS 1967. god. posveen je izuavanju povezanosti antigena HLA i bolesti te je danas dokazana povezanost ovog polimorfnog sustava s vie od 100 bolesti s autoimunom pozadinom, s malignim i infektivnim bolestima.

Jon J.van Rood je 1967. god. pokrenuo zamisao o osnivanju Eurotransplanta (Eurotransplant International Fundation) kao neprofitne organizacije. Eurotransplant je pravno utemeljen 12. svibnja 1969.god.

Dausset J 1980. god. dobiva Nobelovu nagradu za otkrie gena MHC koji kodiraju molekule na povrini stanice, vane za imunoloko razlikovanje vlastitog od stranog.

Sl. 10. Peter Doherty i Rolf Zinkemagel dobivaju Nobelovu nagradu (1996.)

Preuzeto iz: Thorsby E A short history of HLA Tissue Antigen 2009.Zinkemagel i Doherty (Sl. 10.) 1996. god. dobivaju Nobelovu nagradu za otkrie mehanizma kojim limfociti T, preko staninih receptora T i antigena HLA, prepoznaju strane molekule.

Sredinom 1980-ih godina Kary Mullis i suradnici otkrili su kako zapoeti i zaustaviti djelovanje polimeraze na jednolananu molekulu DNA te utemeljili osnove tehnike lanane reakcije polimerazom (PCR). PCR tehnika se koristi za proizvodnju velikih koliina ciljnih DNA odsjeaka (100-30000 parova baza), pod uvjetom da nam je poznat odsjeak DNA koji elimo umnoiti. Tehnika PCR odmah se poela koristiti u molekularnom testiranju gena HLA.Zbog potrebe za pronalaskom HLA identinih nesrodnih davatelja matinih stanica u svrhu transplantacije kotane sri u mnogim zemljama su ustanovljeni nacionalni Registri davatelja krvotvornih matinih stanica. Ovi registri ine Svjetsku organizaciju davatelja kotane sri BMDW (engl. Bone Marrow Donors Worldwide). U meunarodnom Registru nalazi se vie od 17, 500 000 registriranih davatelja meu kojima se moe nai prikladan davatelj za nekog bolesnika

U Hrvatskoj je 2006. god. osnovana Zaklada Ana Rukavina. Registar sadri vie od 33000 potencijalnih davatelja krvotvornih matinih stanica. Ukljueni su u BMDW.Banka krvi iz pupkovine Ana Rukavina prva je javna banka u Hrvatskoj. Osnovana je u oujku 2007.god. i u njoj je pohranjeno vie od 1000 darovanih matinih stanica iz pupkovine.

2. Antigeni HLA razreda I

Kodirani su genima koji se nalaze na kratkom kraku kromosoma 6. Po grai su glikoproteini. Nalaze se na svim stanicama s jezgrom i trombocitima. Vrlo malo ovih antigena nalazimo na spermatozoidima, oocitima, stanicama posteljice i stanicama sredinjeg ivanog sustava (imunoloki privilegirana tkiva). Manjak ekspresije ovih antigena na fetomaternalnoj barijeri omoguava preivljavanje fetusa. Klasini antigeni HLA razreda I podijeljeni su u tri lokusa: HLA-A, HLA-B i HLA-C. Neklasini antigeni su HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L i HLA-P. Antigeni HLA-C jesu prva meta koju prepoznaju prirodno ubilake (NK) stanice. Molekule HLA-G prisutne su na tkivu posteljice i vjerojatno su povezane s ouvanjem trudnoe.2.1. Graa

Molekula antigena HLA razreda I graena je od dva lanca (Sl. 11.). Teki lanac graen je od 350 aminokiselina. Ima tri dijela: citoplazmatski, transmembranski i ekstracelularni s tri domene 1,2 i 3.

Laki lanac je 2 mikroglobulin, iji se gen nalazi na 15. kromosomu. 2 mikroglobulin ima funkciju uvrivanja molekule i ne sudjeluje u prezentaciji antigena.

S. l1. Shematska graa antigena HLA razreda I Preuzeto iz: Janeway CA i sur. Immunobyology 2005.

Sl. 12. Predoavanje antigena preko antigena HLA razreda I

Preuzeto iz: Janeway CA i sur. Immunobyology 2005.Domena 3 reagira sa staninim receptorom T limfocita Tc. Domene 1 i 2 ine sekundarnu, tzv. -nabranu plou koja je sastavljena od osam nabora. Njihovi karboksilni krajevi ine strukturu -helixa koji oblikuje bone strane. Na taj se nain stvara lijeb u koji se vee strani antigen (Sl. 12.).

2.2. Funkcija antigena HLA razreda I

Preko antigena HLA razreda I ostvaruje se unutarnji put predoenja stranog antigena.

Molekule HLA predouju male peptide veliine oko 9 aminokiselina. Strani antigen, ukljuujui i viruse, razgrauje se na peptide. Ovi se peptidi, pomou specifinih prijenosnih proteina TAP1 i TAP2, transportiraju kroz endoplazmatsku mreicu u kojoj se sintetizira molekula HLA. Peptidi se veu na molekulu HLA, prolaze kroz Golgijev aparat te se putem vezikula egzocitozom eksprimiraju na povrinu stanice (Sl. 13.i 14.). Tako eksprimirane molekule budu prezentirane citotoksinim limfocitima T. Antigen specifini receptor T prepoznaje antigen peptida samo u kontekstu s vlastitim antigenom HLA razreda I. Ova je restrikcija rezultat direktnog kontakta molekule HLA i TCR glikoproteina na limfocitima Tc.

Sl. 13. Razgradnja endogenog antigena u endoplazmatskoj mreici Preuzeto iz: Parham P The Immune system 2005

Sl. 14.Vezanje peptida na antigen HLA razreda I

Preuzeto iz: Parham P The Immune system 2005.Gen za TCR smjeten je na kromosomu 2. Stanini receptor T prisutan je na citotoksinim limfocitima T, ali takoer i na NK i dendritikim stanicama. Pripada superobitelji imunoglobulina. Graen je od i lanca. Ekstracelularni dio molekule reagira s 3 domenom molekule HLA razreda I. Limfociti Tc lue perforin i druge lizine tipa serina i citozin proteaza uzrokujui apoptozu (programirana smrt stanice). Zbog luenja IL2 dolazi do klonalne ekspanzije aktiviranih citotoksinih limfocita T.

3. Antigeni HLA razreda II

Kodirani su genima koji su smjeteni centromerino (odsjeak 6p21.3) na kratkom kraku kromosoma 6.

Antigeni HLA razreda II organizirani su u vie podregija:HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, HLA-DM i HLA-DX. Svaka podregija ima gene koji kodiraju sintezu i lanaca. U regiji se nalaze brojni pseudogeni, ija funkcija jo uvijek nije poznata.

3.1. Graa

Molekuka antigena HLA razreda II graena je od jednog i jednog lanca. Ekstracelularni dio molekule ima etiri domene: 1, 2, 1 i 2. (Sl. 15.).

Sl. 15. Shematski prikaz molekule antigena HLA razreda II

Preuzeto iz: Janeway CA i sur. Immunobyology 2005.Molekula ima etiri regije. Prva je regija mjesto koje vee antigen, a grade je 1 i 1 domena i mjesto je najveeg polimorfizma. Druga je regija slina imunoglobulinu i ine je nepromjenjive 2 i 2 domene. 2 domena je mjesto na koje se veu limfociti Th. Trea je regija transmembranska i sadri hidrofobne aminokiseline. etvrta je citoplazmatska regija koja sadri mjesto za fosforilaciju i vee molekulu za elemente citoskeleta. Slika 16. prikazuje, shematski i kristalografski, grau i mjesto prezentacije stranog peptida preko molekule HLA razreda II.

Nepolimorfni polipeptid -invarijantni lanac, ima vanu ulogu u sintezi molekule HLA razreda II jer odreuje mjesto na koje e se vezati peptid za antigen molekule HLA razreda II. Sintetizira se u endoplazmatskoj mreici i vee se na mjesto peptida unutar antigena HLA razreda II te na taj nain sprjeava vezanje endogenog peptida. U sluaju da se endogeni peptidi veu na antigen HLA razreda II, tada bi i antigeni HLA razreda I i razreda II predoavali istu vrstu peptida, koji nastaju razgradnjom proteina. N-terminalni krajevi domene 1 i 1 ine vezno mjesto za peptid, pukotinu koja je strukturno slina pukotini antigena HLA razreda I. Domene 1 i 1 ine oko 90 aminokiselina koje pokazuju izrazitu varijabilnost. Krajevi su pukotine otvoreni tako da se mogu vezati i peptidi koji sadre vie od 30 aminokiselina.

Sl. 16. Nain predoavanja peptida preko antigena HLA razreda II

Preuzeto iz: Janeway CA i sur. Immunobyology 2005.3.2. FunkcijaEgzogeni put predoavanja antigena ostvaruje se preko antigena HLA razreda II. Put predoavanja stranog antigena poinje fagocitozom. Strani antigen ulazi u fagozom koji se spaja s lizozomom u fagolizozom, gdje dolazi do razgradnje antigena na male peptide veliine do 30 aminokiselina. Istovremeno u endoplazmatskoj mreici poinje sinteza molekule HLA. Sintetizirana molekula transportira se u fagolizozom, gdje se od molekule HLA odcjepljuje invarijantni lanac i vee antigeni peptid. Nakon toga molekula s vezanim antigenom putuje prema staninoj membrani antigen predone stanice (Sl. 17.). Na taj se nain antigen predouje limfocitima Th koji prepoznaju kompleks antigen-vlastiti antigen HLA i zapoinje imunoloki odgovor, sekrecija kemokina, IL i drugih citokina.

Sl. 17. Vezanje peptida na antigen HLA razreda II

Preuzeto iz: Parham P The Immune system 2005.4. Nomenklatura antigena i gena HLA

Sustav antigena HLA jedan je od najpolimorfnijih sustava (Sl.18.). Unutar sustava antigeni HLA-B i HLA-DRB1 lokusa jesu najpolimorfniji, s mnotvom alela i velikom mogunou vezanja antigena.

Sl.18. Polimorfizam antigena HLA

Imenovanje antigena i gena vrlo je sloeno. Seroloki dokazani antigeni imenuju se prvo oznakom lokusa HLA-A, HLA-B, HLA-C, a zatim se navodi specifinost antigena - npr. HLA-A1.

Kod molekularnog testiranja, gdje se dokazuje odreeni gen i njegov alel, imenuje se prema primjeru u Tablici 1. Oznaka * kazuje da se radi o genskom testiranju.

Tablica 1. Imenovanje HLA gena i alela

Preuzeto prema: http://hla allels.org/nomenclature/naming.html.Nomenclature for Factors of the HLA System

Nomenklatura

Znaenje

HLAHLA regija

HLA-DRB1Odreeni lokus, npr. DR

HLA-DRB1*13Grupa koju kodira alel DRB1*13

HLA-DRB1*13:01Specifinost alela

HLA-DRB1*13:01:02Sinonim za alel koji se razlikuje u mutaciji DRB1*13:01:01

HLA-DRB1*13:01:01:02 Alel koji sadri mutaciju izvan kodirane regije DRB1*13:01:01

HLA-A*24:09NNul alel, alel koji nije eksprimiran na stanici

HLA-A*30:14LAlel ija je ekspresija znaajno smanjena na povrini stanice

HLA-B*44:02:01:02SAleli koji su eksprimirani na skrivenim stanicama

HLA-A*32:11QAlel ija predhodna mutacija ima znaajan uinak na ekspresiju antigena na povrinu stanice

5. Dokazivanje antigena i gena HLA

5.1. Seroloko testiranje antigena HLA

Iz krvi uzete na heparin na gradijentu gustoe odvoje se limfociti (Sl.19.). Podesi im se gustoa i dodaju se u Terasakijeve ploice u koje su prethodno nakapani specifini serumi. Nakon inkubacije dodaje se zeji komplement i ponovo inkubira. Stanice se boje tripan plavom bojom i odmah se vri oitavanje. Ako elimo trajniji preparat, stanice se boje eozinom i fiksiraju formaldehidom te se oitavanje moe vriti i sljedeeg dana.

Sl. 19. Odvajanje limfocita na gradijentu gustoe5.1.1.Test limfocitotoksinosti

Sl. 20. Princip testa limfocitotoksinosti

Test se zasniva na principu aktiviranja komplementa (Sl.20.). Ako su na limfocitima prisutni odgovarajui antigeni, protutijela se veu na limfocite, a dodavanjem komplementa, dolazi do njegovog aktiviranja i stvaranja litikog kompleksa koji oteti stanice u koje ulazi boja. Kad antigen nije prisutan, stanice ostaju ive i u njih ne ulazi boja (Sl.21. i Sl. 22).

Sl. 21. Mikroskopska slika pozitivne reakcije u testu mikrolimfocitotoksinosti

(Preparat bojen tripan plavim)

Sl. 22. Mikroskopska slika negativne reakcije u testu mikrolimfocitotoksinosti

(Preparat bojen tripan plavim)

5.2. Molekularno testiranje gena HLA Prvi stupanj testa je izoliranje DNA, nakon ega slijedi PCR reakcija - lanana reakcija polimerazom. (Sl. 23.)

PCR je reakcija umnaanja dijela DNA pomou Taq polimeraze, uz prisustvo specifinih oligonukleotidnih poetnica (engl. primer) koje prepoznaju komplementarne dijelove DNA kao kalupa i veu se na njih. Za odabir odgovarajuih poetnica potrebno je poznavanje nukleotidnog slijeda onog dijela sekvencije ciljne DNA koji se eli umnoiti. U ovom sluaju to su geni HLA sustava.

Sl. 23. Shematski prikaz lanane reakcije polimerazom

Preuzeto iz: Andy Vierstraete 1999.

Mjeavina DNA, nukleotida i poetnica zagrijava se na 940 C kako bi se odmotala dvostruka zavojnica DNA. Zatim se poetnice veu na komplementarne dijelove DNA, a Taq polimeraza sintetizira odreeni gen HLA. Tako nakon 36 ciklusa od jedne molekule DNA koja slui kao kalup, dobije se 236 = 68 bilijuna kopija gena.

Kada se specifini dijelovi DNA umnoe PCR-om, separiraju se na 2% agaroznom gelu (Sl. 24.). Nalaz dokumentiramo snimanjem gela fotografskom kamerom. Interpretacija rezultata vri se prema uputstvu dobivenom od proizvoaa.

Sl.24. Primjer rezultata PCR analize gena HLA-A, HLA-B i HLA-DR lokusa (Gel slikan fotografskom kamerom)6. Protutijela u sustavu HLAProtutijela anti-HLA tipina su aloprotutijela koja se stvaraju nakon kontakta imunolokih stanica sa stranim antigenom HLA. Uzrok senzibilizacije su transfuzije krvi, trudnoe i transplantacije tkiva i organa. Najee pripadaju imunoglobulinima IgG i aktiviraju komplement. Prisustvo imunoglobulina IgM moe biti znak poetne senzibilizacije no najee se radi o auto-protutijelima koja nemaju kliniko znaenje u transplantaciji tkiva i organa.Ova protutijela mogla bi se koristiti u lijeenju tekih autoimunih bolesti koje su povezane s antigenima HLA.

Donor-specifina protutijela uzrok su odbacivanja presatka (bubreg, srce, plua, jetra i dr.). Zbog toga se sve bolesnike koji ekaju transplantaciju svaka etiri mjeseca testira na prisustvo limfocitotoksinih protutijela i odreuje se % panel reaktivnih protutijela (PRA). Prisustvo protutijela dokazuje se testom mikrolimfocitotokcinosti ovisnim o komplementu (CDC) sa i bez dodatka ditiotreitol-a (DTT). DTT reducira protutijela IgM, koja nemaju kliniko znaenje, u uzorku seruma bolesnika. Osim testa citotoksinosti ovisne o komplemenu za dokazivanje prisustva protutijela anti-HLA koriste se i osjetljivije metode ELISA (engl. Enzime Linked Immunosorbent Assay), protona citometrija i tehnologija Luminex kojom dokazujemo prisustvo samo protutijela IgG. 7. Znaenje sustava HLA u klinikoj praksiAntigeni HLA imaju veliko kliniko znaenje kako u transplantaciji tkiva i organa tako i u transfuzijskoj medicini, genetikim istraivanjima, istraivanjima migracija stanovnitva, forenzikoj medicini, dijagnostici mnogih autoimunih bolesti i dokazivanju ili osporavanju oinstva. 7.1. Transplantacija organa Ve je 1960. godine dokazano da imunoloki sustav primatelja napada molekule antigena HLA presatka. Upravo zbog toga mora biti to bolja podudarnost u antigenima HLA sustava izmeu primatelja i davatelja, posebno ukoliko se radi o transplantaciji kotane sri.

Bolesnik ne smije imati protutijela protiv antigena sustava HLA kojeg nosi davatelj organa. Ako su prisutna protutijela, dolazi do hiperakutnog odbacivanja presatka im se uspostavi cirkulacija krvi (Sl. 25.). Zbog toga se uvijek prije transplantacije izvodi krina reakcija testom mikrolimfocitotoksinosti (engl. crossmatch). Test se izvodi tehnikom CDC sa i bez DTT-a. Mijeaju se limfociti davatelja i serum primatelja uz dodavanje komplementa. Ako u serumu bolesnika nisu prisutna protutijela anti-HLA, test je negativan i organ se moe transplantirati. Pozitivna krina reakcija je kontraindikacija za transplantaciju.

Sl. 25. Primjer reakcije IgG protutijela s nepodudarnim antigenom presatka Preuzeto iz: Fotheringham, Nephron Clin Pract 2009

Sl. 26. Primjer nasljeivanja antigena HLA

Prije transplantacije tkiva ili organa neophodna je imunoloka obrada bolesnika i davatelja.

Kod obiteljskog darivanja organa prvo se odreuju krvna grupa ABO i Rh D bolesnika i moguih davatelja. Zatim slijedi klinika i imunoloka obrada onog davatelja koji je podudaran u krvnoj grupi. Imunoloko testiranje ukljuuje: tipizaciju antigena HLA primatelja i davatelja organa, izvoenje krine reakcije, testiranje bolesnika na limfocitotoksina protutijela anti-HLA (engl. screening) i odreivanje % PRA. Braa i sestre mogu biti meusobno HLA identini ako naslijede isti haplotip od oba roditelja, mogu biti poluidentini ili potpuno razliiti u antigenima HLA (Sl. 26.).Ako bolesnik nema ivog davatelja vri se obrada za stavljanje na Eurotransplantovu listu nesrodnih davatelja to ukljuuje: kliniku obradu, odreivanje ABO i RhD krvne grupe, biljega na krvlju prenosive bolesti, tipizaciju antigena HLA, testiranje na prisustvo limfocitotoksinih protutijela anti-HLA i % PRA. U Registru Eurotransplanta postoje odvojene liste bolesnika za transplantaciju bubrega te transplantaciju bubrega i pankreasa. Za ukljuivanje bolesnika na ove liste ekanja mora biti uinjena kompletna klinika i imunoloka obrada (krvna grupa ABO i Rh D, tipizacija antigena HLA, probir na prisustvo protutijela anti-HLA i % PRA).Za transplantaciju drugih organa (jetra, srce, plua, crijeva, ronica) dovoljna je podudarnost primatelja i davatelja u ABO krvnim grupama, osim u sluaju visoko rizinog bolesnika koji je ve odbacio transplantirani organ ili ima stvorena limfocitotoksina protutijela anti-HLA. Tada se moraju testirati davatelj i primatelj na antigene HLA (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR), a podudarnost meu njima mora biti to vea. Primatelj se mora testirati na prisustvo protutijela anti-HLA i %PRA. Prije transplantacije obavezno je izvoenje krine reakcije s uzorkom seruma neposredno prije transplantacije i svim uzorcima seruma koji su bili pozitivni u screening-u. Krina reakcija mora biti negativna. Kod obiteljske transplantacije kotane sri treba prvo uiniti seroloko i molekularno testiranje antigena HLA. Nakon izbora najpogodnijeg srodnika treba testiranje nastaviti metodom tipizacije HLA visoke rezolucije da se odredi specifinost podudarnog alela.Kod imunolokog testiranja nesrodnih davatelja kotane sri za uvrtavanje u Registar davatelja kotane sri testiranje HLA mora se napraviti najmanje metodom DNA tipizacije niske rezolucije.Prva transplantacija bubrega sa ivog donora (majka je dala bubreg sinu) na naim prostorima obavljena je 30. sijenja 1971. u Rijeci. Takoer je u Rijeci napravljena i prva transplantacija bubrega s umrle osobe, 15. svibnja 1971.

7.2. HLA i bolestiZa povezanost antigena HLA i bolesti s autoimunom pozadinom postavljene su dvije hipoteze: okolina i genetika.

Okolina hipoteza polazi od pretpostavke da su imbenici okoline vani za pokretanje bolesti (nadmorska visina, postojanje zraenja, vode, vlano i umovito podruje i dr).Genetika hipoteza polazi od pretpostavke da su uzrok bolesti:

- geni koji se nalaze unutar MHC regije

- stanini receptori T - neki drugi geni, dok su geni HLA samo njihov marker.Jedna od pretpostavki je postojanje molekularne mimikrije - gdje se pretpostavlja da je

molekularna struktura patogena slina strukturi pojedinih tkiva, pa protutijela nastala tijekom humoralnog imunolokog odgovora prepoznaju vlastito tkivo kao strano i pokrenu autoimuni proces.

Danas je s genima HLA povezano vie od 100 bolesti (bolesti oka, sistemske bolesti s okularnom manifestacijom reaktivni artritis, Reiter syndrome, RA, celijakija i psorijatini artritis (Tablice 2 i 3).

Tablica 2. Povezanost antigena HLA s bolestima

Modificirano prema: Tjon 2010, Lincoln 2009, Grunewald 2010, Noble 2008.

BolestZdruenost s HLA antigenom/alelom

Birdshot horioretinopatijaHLA-A29

Bechet bolest HLA-B51

Ankilozni spondilitisHLA-B27

MalarijaHLA-B53

Inzulin ovisni dijabetes melitusHLA-DR3

HLA-DR4

NarkolepsijaHLA-DR15

HLA-BQB1*0602

HLADQA1*0102

Reumatoidni artritisHLA-DR4

CelijakijaHLA-DR3

HLA-DR7

HLA-DQB1*02/DQA1*0501

HLA-DQ8

Multipla sklerozaHLA-DR15

HLA-DQB1*0602

HLA-DQA1*0102

HemokromatozaHLA-A3

Tablica 3. Relativni rizik za bolesti zdruene s antigenima HLA Modificirano prema: Tjon 2010, Lincoln 2009, Grunewald 2010, Noble 2008.

BolestZdruenost s HLARelativni rizik

Ankilozni spondilitisHLA-B2787-95

Inzulin ovisni dijabetes melitusHLA-DR35

HLA-DR46

HLA-DR3/HLA-DR425

CelijakijaHLA-DR3/HLADQ29-11

HLA-DR3/HLA-DR79-11

NarkolepsijaHLA-DRB1*15;DQB1*0602; DQA1*010244,6

Goodpastuare sindromHLA-DR216

Pemfigus vulgarisHLA-DR414

Akutni prednji uveitisHLA-B2710

SLEHLA-DR36

Multipla sklerozaHLA-DR25

Gravesova bolestHLA-DR34

Reumatoidni artritisHLA-DR44

Miastenija gravisHLA-DR33

7.3. HLA i maligne bolesti

Osnovna funkcija HLA sustava je prepoznavanje vlastitog i razlikovanje vlastitog od stranog.

Onkolozi i imunolozi usmjerili su istraivanje na identifikaciju molekula, njihove osobitosti i mehanizme kojima tumorske stanice izbjegavaju prepoznavanje i imunoloku reakciju. Antigeni HLA nalaze se i na tumorskim stanicama. Kljuni su za generaciju tumorskih antigena. Mogu modulirati interreakciju izmeu NK stanica i subpopulacija limfocita s ciljnim stanicama.

Imunoloki sustav snano reagira na tumorske antigene i odmah unitava sve stanice u kojima je dolo do maligne aletracije. No tumorske stanice mogu na vie naina izbjegavati imunoloki odgovor:1. Moe doi do potpunog gubitka antigena HLA razreda I (HLA-A, HLA-B, HLA-C), to je uzrokovano gubitkom ekspresije ili funkcije 2 mikroglobulina.

2. Moe doi do selektivnog gubitka antigena HLA razreda I zbog gubitka gena HLA ili njegove mutacije koja inhibira transkripciju ili translaciju antigena.

3. Javlja se potpuni gubitak jednog HLA haplotipa, to je uzrokovano gubitkom jedne kopije kromosoma 6 koja kodira sintezu tekog lanca molekule antigena HLA.

4. Dolazi do potpunog poremeaja u sintezi antigena HLA zbog poremeaja cijelog sustava sinteze molekule HLA u koji su ukljueni i geni odgovorni za transport antigenih peptida, to opet rezultira poremeajem sinteze antigena HLA.

Neklasini antigeni HLA-G razreda I prirodno su eksprimirani na stanicama trofoblasta. tite plod od imunolokog sustava majke jer imaju imunosupresivno djelovanje. Ekspresijom antigena HLA-G na malignim stanicama moe se objasniti razvoj rezistencije tumora i ako imaju normalno eksprimirane klasine antigene HLA razreda I. Antigeni HLA-G smanjuju imunostimulatorni odgovor na kompleks tumorski antigen - molekula HLA. Dokazano je da inhibiraju aktivnost aloreaktivnih i antigen specifinih limfocita Tc u glioma, ovarijalnog karcinoma i tumora bubrega.

Solubilni antigeni HLA-G (sHLA-G) mogu se nai u cirkulaciji bolesnika s melanomom, u ascitesu bolesnika s progresivnim karcinomom dojke. Oni induciraju apoptozu citotoksinih limfocita T i inhibiraju aktivnost NK stanica. Visok nivo sHLA-G antigena lo je prognostiki znak u bolesnica s karcinomom jajnika.

7.4. HLA u transfuzijskoj medicini

Sustav HLA ima znaajno mjesto u transfuzijskom lijeenju bolesnika budui da se antigeni nalaze na leukocitima i trombocitima.

7.4.1 Transfuzije trombocita

Transfuzije trombocita koriste se u lijeenju bolesnika s trombocitopenijom. Trombocitopenija moe biti posljedica jakog krvarenja, hematolokih bolesti ili posljedica primjene kemoterapije. Koncentrati trombocita dobivaju se od zdravih darovatelja krvi, selektivnim centrifugiranjem pune krvi ili procesom trombafereze (od jednog davatelja dobiva se terapijska doza trombocita i ekvivalentna je pool-u koncentrata trombocita koji se dobije od 4 do 6 davatelja).

Trombociti na sebi, osim trombocitnih antigena, nose i antigene HLA razreda I. Alo anti- HLA protutijela koja se stvaraju kao posljedica senzibilizacije prethodnim transfuzijama ili trudnoom, mogu reagirati s antigenima na trombocitima i dovesti do razvoja refrakternosti (nema porasta broja trombocita) na transfuzije trombocita. Sami trombociti potiu stvaranje aloprotutijela, ali ako su prisutni leukociti, snaan su senzibilizirajui imbenik. Zbog toga se u lijeenju bolesnika koriste metode odstranjivanja leukocita iz koncentrata trombocita (filtrirani trombociti) kojima se maksimalno smanjuje broj leukocita. Ako su ve stvorena protutijela, preporua se davati HLA podudarne trombocite.

7.4.2. Transfuzije granulocita

Transfuzije granulocita koriste se za lijeenje bolesnika s granulocitopenijom, koji su ivotno ugroeni tekom infekcijom koja ne reagira na antibiotsku terapiju. Granulocite je najbolje uzimati postupkom afereze, no davatelja prethodno treba tretirati faktorom rasta kolonija granulocita (G-CSF). Preporua se prethodno ispitati serum bolesnika na prisustvo anti-HLA protutijela, a ako su ona prisutna, potrebno je davati HLA tipirane granulocite.

7.4.3. Transfuzijom uzrokovano akutno zatajenje plua-TRALI (engl. Transfusion-Related Acute Lung Injury) Vrlo je rijetka, ali osobito teka komplikacija transfuzijskog lijeenja. Nastupa tijekom ili unutar 6 sati od davanja krvnog pripravka. U mnogih bolesnika kliniki znakovi TRALI-a traju 48 do 96 sati. Infiltracija plua nestaje unutar prva etiri dana. U malog broja bolesnika hipoksija i infiltracija plua moe trajati do sedam dana. Uzrok su antileukocitna protutijela u krvnom pripravku (plazma ili koncentrat trombocita). Rijetko su uzrok antileukocitna protutijela bolesnika. Ova transfuzijska reakcija javlja se u 0,01% do 0,08% bolesnika koji su lijeeni nekim krvnim pripravkom te ima smrtnost od 5% do 14%.Opisuje se vie mehanizma na koji nastaje TRALI.

Prvi i najvjerojatniji mehanizam govori da su uzrok pasivno transfundirana antileukocitna protutijela davatelja krvi, koja reagiraju s antigenima na leukocitima bolesnika uzrokujui aglutinaciju i sekvestraciju leukocita na razini plunih kapilara, uz aktivaciju komplementa, to uzrokuje oteenje stijenke kapilara. Krvni su pripravci najee proizvedeni iz krvi ena s vie trudnoa. Takoer se moe raditi i o mukarcima koji su prethodno senzibilizirani transfuzijama krvi. U plazmi ovih davatelja nalaze se protutijela koja su usmjerena protiv antigena HLA razreda I i II ili antigena neutrofilnih leukocita. Ova protutijela moemo nai u 70% pripravaka koji su uzrokovali TRALI. U sluajevima kad nisu dokazana antileukocitna protutijela moda bi vanu ulogu u razvoju bolesti mogli imati bioloki aktivni lipidi.

Sl. 27. RTG snimka plua bolesnika s TRALI

Preuzeto iz: Brander L i sur. Anesth Analg 2005.Nakon reakcije antigen - protutijelo u kapilarama plua oslobaaju se bioaktivne supstancije koje uzrokuju zimicu, tresavicu, porast tjelesne temperature, dispneju, cijanozu, edem plua i respiratornu insuficijenciju te se na RTG snimci plua vidi mrljasto zasjenjenje poput virusne upale plua (Sl. 27.).

U 11 do 39% davatelja plazme, nakon ijeg se davanja razvio TRALI, nisu naena anti-leukocitna protutijela. Ovdje se radi o neimunolokom mehanizmu koji je potaknuo razvoj TRALI-a. Meu neimunoloke imbenike ubrajamo infuziju bioloki aktivnih lipida koji se nakuplaju u krvnim pripravcima tijekom proizvodnje i skladitenja krvi i mogu potaknuti oksidativne procese u tkivu plunih kapilara. Takoer trauma, operacija i infekcije praene oslobaanjem upalnih imbenika mogu aktivirati endotel plunih kapikara i potaknuti oslobaanje bioloki aktivnih tvari iz neutrofila vezanih na endotel.Spreavanje TRALI- a je teko. Jedan od naina je prestanak proizvodnje krvnih pripravaka od ena vierotkinja. Uestalost se moe smanjiti pretraivanjem krvi davatelja na prisustvo antileukocitnih protutijela te proizvodnjom svjee smrznute plazme (SSP) i koncentrata trombocita iskljuivo od mukih davatelja koji nisu primali transfuzije krvi..

7.4.4. Bolest transplantata protiv primatelja-GVHD (engl. Graft Versus Host Disease)

Bolest transplantata protiv primatelja GVHD (engl. Graft Versus Host Disease) je izuzetno rijetka posljedica transfuzijskog lijeenja no u 80 - 90% sluajeva smrtonosna. Opaa se nakon transfuzije pripravaka u kojima se nalaze leukociti. Davateljevi limfociti T napadaju i ubijaju bolesnikove stanice.Posljedica je transfuzija krvi od davatelja koji je homozigotan za jedan bolesnikov haplotip HLA. Bolesnikov imunoloki sustav ne prepoznaje davateljeve antigene HLA kao tue i ne dolazi do njihovog odbacivanja. GVHD se opaa u bolesnika nakon transplantacije krvotvornih matinih stanica, transfuzije krvi prematurusima, transfuzije krvi srodnicima te u bolesnika s priroenom ili steenom imunodeficijencijom. Bolest se javlja etiri do 10 dana po transfuziji krvi. Obino poinje povienom temperaturom, osipom, eritrodermom, muninom, povraanjem i proljevom. Najvaniji simptom je anemija uz moguu trombocitopeniju, neutropeniju i poremeaj funkcije jetre. Dijagnoza se postavlja na osnovu biopsije kotane sri i HLA tipizacije kojom se dokazuju cirkulirajui limfociti s razliitim antigenima HLA.Spreavanje se provodi tako da se imunodefijentni bolesnici lijee ozraenim pripravcima krvi. Izbjegava se davanje transfuzija krvi od bliskih srodnika posebno ako su srodnici homozigotni za jedan bolesnikov haplotip HLA. Preporua se i koritenje pripravaka krvi sa smanjenim brojem leukocita.Literatura

1. Thorsby E, A short history of HLA- Review article; Tissue antigens 2009:74:101,16

2. Parham P The Immune syste 2. izd. New York: Garland Science; 2005, str.371.

3. Wassmuth R. Primers on the HLA System, Basic Concepts-Medical Relevance-Laboratory Methods-Quality Managment. Heidelberg-Mnchen-Landsberg-Frechen-Hamburg: Verlagsgruppe Hthig jehle Rehm GmbH; 2010, str.118

4. Janeway CA, Traves P, Walport M i Shlomchic MJ. Immunobiology The immune system in health and disease. 6. izd. New York, London: Garland Science; 2005., str.800.

5. Marsh SGE,Parham P,Barber LD, The HLA FactsBook. San Diego, San Francisco, New York, Boston, London, Sydney, Tokyo: Academic Press ; 2000 str.398.

6. Fotheringham J, Angel CA, McKane W. Transplant Glomerulopathy, Associations and Mehanism Nephron Clin Pract 2009; 113: c1-c7.

7. Brander L,Reil A, BuxJ, Taleghani BM, Regli B, Takala J. Severe Transfuzion-Related Acute Lung Injury. Anesth Analg 2005; 101; 499-501.8. Junior AF, Lopes LB, Bordin JO. Transfusion-related acute lung injury. J Bras Pneumol 2007; 206: 206-12.9. Triulzi DJ. Transfusion-Related Acute Lung Injury: Current Concepts for the Clinician. Anesth Analg 2009; 108:770-6.10. Tjon JM, vanBergenJ, Koning F. Celiac disease:how complicated can it get?. Immunogenetic 2010; 62: 641-51.

11. Lincoln MR, Romagoptan SV, Chao MJ i sur. Epistasis among HLA-DRB1,HLA-DQA1 and HLA-DQB1 loci determines multiplesclerosis susceptibility. PNAS 2009; 106:7542-47

12. Grunewald J, Brynedal B, Darlington P i sur. Different HLA-DRB1 allele distributions in distinct clinical subgrups of sarcoidosis patients. Resp Res 2010; 11: 11-25

13. Noble JA, Martin A, Valdes AM i sur. Type diabetes risk for HLA-DR3 haplotypes depends on genotype context: Association of DPB1 and class I loci among DR3 and DR$ matched Italian patients and controls. Hum Immunol 208; 69: 291-300.

14. Grgievi D. i sur. Transfuzijska medicina u klinikoj praksi. Zagreb: Medicinska naklada; 2006. str.571.15. Balen S. Prirunik-Osnove transfuzijske medicine. Osijek: Medicinski fakultet Osijek; 2010. str.140.

16. Dausset J. The challenge of the early days of human histocompatibility. Immunogenetics 1980; 10(1): 1-5.

17. http://users.ugent.be/~avierstr/index.html Homepage of Andy Vierstraete 1999.,Principle of the PCR

18. http://pathmicro.med.sc.edu/bowers/mhc.htm Microbiology and Immunology on line, University of South Carolina School of Medicine, Immunology-capter ten, Major hictocompatibility complex(MHC) and T-cell receptors-role in immune respons

19. http://pathmicro.med.sc.edu/bowers/mhc.htm Microbiology and Immunology on line, University of South Carolina School of Medicine, Immunology-capter fifteen, MHC genetics and role in transplantation

20. http://hla allels.org/nomenclature/naming.html.Nomenclature for Factors of the HLA System

Stanina membrana memmemebranamembrane

citoplazma

CHO

CHO

CHO

NH2

NH2

COOH

COOH

1

2

2

1

HLA-A3,B7,DR15/

HLA-A2,B44,DR13

HLA-A1,B8,DR/

HLA-A28,B27,DR1

HLA-A3,B7,DR15/

HLA-A28,B27,DR1

HLA-A1,B8,DR3/

HLA-A2,B44,DR13

HLA-A2,B44,DR13/

HLA-28,B27,DR1

HLA-A1,B8,DR3/

HLA-A3,B7,DR15

PAGE 2