Mark J. Alexander et al- Distribution of neurotensin/neuromedin N mRNA in rat forebrain: Unexpected abundance in hippocampus and subiculum

8/3/2019 Mark J. Alexander et al- Distribution of neurotensin/neuromedin N mRNA in rat forebrain: Unexpected abundance in

1/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 6 , p p . 5 2 0 2 - 5 2 0 6 , J u l y 1 9 8 9N e u r o b i o l o g y

D i s t r i b u t i o n o f n e u r o t e n s i n / n e u r o m e d i n N mRNA i n r a t f o r e b r a i n :U n e x p e c t e d a b u n d a n c e i n h i p p o c a m p u s a n d s u b i c u l u m( i n s i t u h y b r i d i z a t i o n / C A l / p r e c u r s o r )

MARK J . A L E X A N D E R * t , MARGARET A . M I L L E R t , D A N I E L M . D O R S A t , BRYANT P . B U L L O C K I 1RICHARD H . M E L L O N I , J R . I I , PAUL R . D O B N E R I I , AND SUSAN E . LEEMAN*D e p a r t m e n t s o f * P h y s i o l o g y a n d I ' M o l e c u l a r G e n e t i c s a n d M i c r o b i o l o g y , U n i v e r s i t y o f M a s s a c h u s e t t s M e d i c a l C e n t e r , W o r c e s t e r , MA 0 1 6 5 5 ; D e p a r t m e n t s o fS M e d i c i n e a n d l P h a r m a c o l o g y , U n i v e r s i t y o f W a s h i n g t o n , S e a t t l e , WA 9 8 1 9 5 ; a n d 1 G e r i a t r i c R e s e a r c h , E d u c a t i o n , a n d C l i n i c a l C e n t e r , V e t e r a n sA d m i n i s t r a t i o n M e d i c a l C e n t e r , S e a t t l e , WA 9 8 1 0 8C o m m u n i c a t e d b y S a m u e l M. M c C a n n , A p r i l 7 , 1 9 8 9 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w J a n u a r y 2 6 , 1 9 8 9 )ABSTRACT We h a v e u s e d i n s i t u h y b r i d i z a t i o n t o d e t e r -m i n e t h e r e g i o n a l d i s t r i b u t i o n o f mRNA e n c o d i n g t h en e u r o t e n s i n / n e u r o m e d i n N ( N T / N ) p r e c u r s o r i n t h e f o r e b r a i no f t h e a d u l t m a l e r a t . C e l l s c o n t a i n i n g NT/N mRNA a r e w i d e l yd i s t r i b u t e d i n t h e f o r e b r a i n . T h e s e a r e a s i n c l u d e t h e s e p t u m ,b e d n u c l e u s o f t h e s t r i a t e r m i n a l i s , p r e o p t i c a r e a , h y p o t h a l a -m u s , a m y g d a l a , a c c u m b e n s n u c l e u s , c a u d a t e - p u t a m e n , a n dp i r i f o r m a n d r e t r o s p l e n i a l c o r t e x . I n g e n e r a l , t h e r e g i o n a ld i s t r i b u t i o n o f NT/N mRNA c o r r e s p o n d s t o t h e p r e v i o u s l yd e t e r m i n e d d i s t r i b u t i o n o f n e u r o t e n s i n - i m m u n o r e a c t i v e c e l lb o d i e s ; h o w e v e r , s e v e r a l n o t a b l e e x c e p t i o n s w e r e o b s e r v e d .T h e m o s t s t r i k i n g d i f f e r e n c e o c c u r s s p e c i f i c a l l y i n t h e CA1r e g i o n o f t h e h i p p o c a m p u s , w h e r e i n t e n s e l a b e l i n g i s a s s o c i a t e dw i t h t h e p y r a m i d a l c e l l l a y e r d e s p i t e t h e r e p o r t e d a b s e n c e o fn e u r o t e n s i n - i m m u n o r e a c t i v e c e l l s i n t h i s r e g i o n . A n a l y s i s o fm i c r o d i s s e c t e d t i s s u e b y S 1 n u c l e a s e p r o t e c t i o n a s s a y c o n -f i r m e d t h e a b u n d a n c e o f a u t h e n t i c NT/N mRNA i n C A L . As e c o n d m a j o r d i s c r e p a n c y b e t w e e n NT/N mRNA a b u n d a n c ea n d n e u r o t e n s i n - i m m u n o r e a c t i v i t y o c c u r s i n t h e i n t e n s e l y l a -b e l e d s u b i c u l u m , a r e g i o n t h a t c o n t a i n s o n l y s c a t t e r e d n e u r o -t e n s i n - i m m u n o r e a c t i v e c e l l s i n t h e a d u l t . T h e s e r e s u l t s s u g g e s tt h a t , i n s p e c i f i c r e g i o n s o f t h e f o r e b r a i n , NT/N p r e c u r s o r i sp r o c e s s e d t o y i e l d p r o d u c t s o t h e r t h a n n e u r o t e n s i n . I n a d d i -t i o n , t h e s e r e s u l t s p r o v i d e a n a n a t o m i c a l b a s i s f o r s t u d y i n g t h ep h y s i o l o g i c a l r e g u l a t i o n o f NT/N mRNA l e v e l s i n t h e f o r e -b r a i n .N e u r o t e n s i n ( N T) , a t r i d e c a p e p t i d e w i t h w i d e s p r e a d d i s t r i -b u t i o n i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m a n d p e r i p h e r a l t i s s u e s o fm a m m a l s , i s o n e o f a f a m i l y o f s t r u c t u r a l l y r e l a t e d p e p t i d e sw i t h m e m b e r s m a n i f e s t i n g d i v e r s e b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s ( 1 ) .T h e s t r u c t u r e o f t h e r a t g e n e e n c o d i n g N T h a s r e c e n t l y b e e nd e t e r m i n e d ( 2 ) , a n d t h e g e n e r a l f e a t u r e s o f t h e p r e d i c t e d N Tp r e c u r s o r f o r t h e r a t a r e t h e s a m e a s t h o s e o f t h e p r e d i c t e dp r e c u r s o r s f o r t h e d o g ( 3 ) a n d cow ( 2 ) . I n e a c h s p e c i e s , ap r e c u r s o r p r o t e i n o f 1 6 9 - 1 7 0 a m i n o a c i d r e s i d u e s e n c o d e sb o t h NT a n d n e u r o m e d i n N , a p e p t i d e s i m i l a r i n s t r u c t u r e t oNT ( 4 ) . A c o m p a r i s o n o f t h e s e q u e n c e s o f t h e c o m p l e t en e u r o t e n s i n / n e u r o m e d i n N ( N T / N ) p r e c u r s o r f r o m r a t , d o g ,a n d cow r e v e a l s a h i g h d e g r e e o f c o n s e r v a t i o n . T h i s f i n d i n gi s c o n s i s t e n t w i t h t h e i d e a t h a t t h e p r e c u r s o r may b e p r o -c e s s e d t o y i e l d b i o l o g i c a l l y a c t i v e p e p t i d e s t h a t a r e a s y e tu n k n o w n .T h e r e i s i n c r e a s i n g e v i d e n c e t h a t N T f u n c t i o n s a s a n e u -r o r e g u l a t o r y s u b s t a n c e i n t h e m a m m a l i a n c e n t r a l n e r v o u ss y s t e m ( 1 , 5 ) . E f f e c t s p r o d u c e d b y N T a d m i n i s t r a t i o n i n t h ec e n t r a l n e r v o u s s y s t e m i n c l u d e h y p o t h e r m i a , h y p o t e n s i o n ,a n d a n t i n o c i c e p t i o n . N T h a s a l s o b e e n i m p l i c a t e d i n t h ec e n t r a l r e g u l a t i o n o f a n t e r i o r p i t u i t a r y f u n c t i o n ( 6 , 7 ) . NT-

i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s a r e m o s t n u m e r o u s i n t h e f o r e -b r a i n , w i t h w i d e s p r e a d d i s t r i b u t i o n i n l i m b i c r e g i o n s s u c h a st h e s e p t u m , p r e o p t i c a r e a , h y p o t h a l a m u s , a n d a m y g d a l a ( 8 ) .O t h e r f o r e b r a i n r e g i o n s , s u c h a s t h e d o r s a l s u b i c u l u m , c o n -t a i n many N T - i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s d u r i n g e a r l y s t a g e so f d e v e l o p m e n t , b u t t h e n u m b e r o f n e u r o n s w i t h d e t e c t a b l eN T - l i ke i m mu n o r e a c t i v i t y d e c r e a s e s d r a m a t i c a l l y b y a d u l t -h o o d ( 9 ) .I n t h e p r e s e n t s t u d y we h a v e u s e d i n s i t u h y b r i d i z a t i o nh i s t o c h e m i s t r y t o i d e n t i f y c e l l s i n t h e f o r e b r a i n o f t h e a d u l tm a l e r a t t h a t s y n t h e s i z e mRNA e n c o d i n g t h e NT/N p r e c u r -s o r . U n e x p e c t e d l y , NT/N mRNA i s a b u n d a n t i n t h e CA1( f i e l d 1 o f Ammon's h o r n ) r e g i o n o f h i p p o c a m p u s a n dt h r o u g h o u t t h e s u b i c u l u m . O t he r w i s e , t h e r e g i o n a l d i s t r i b u -t i o n o f s u c h c e l l s c o r r e s p o n d s w e l l w i t h t h e p r e v i o u s l yd e t e r m i n e d d i s t r i b u t i o n o f N T - i m m u n o r e a c t i v e c e l l s .MATERIALS A N D M E T H O D S

A n i m a l s a n d T i s s u e P r e p a r a t i o n . A d u l t m a l e S p r a g u e -D a w l e y r a t s ( Z i v i c - M i l l e r ) w e r e h o u s e d u n d e r c o n t r o l l e dl i g h t c o n d i t i o n s ( l i g h t s o n 0 7 0 0 - 2 1 0 0 ) w i t h f o o d a n d w a t e ra v a i l a b l e a d l i b i t u m . A t - 8 0 d a y s o f a g e , r a t s w e r e s a c r i f i c e db y d e c a p i t a t i o n ( 1 7 0 0 - 1 8 0 0 h r ) , a n d c o r o n a l b r a i n s e c t i o n sw e r e p r e p a r e d f r o m b r a i n s t h a t h a d b e e n f r o z e n i n c o l di s o p e n t a n e . S e c t i o n s ( 2 0 , u m ) f r o m f o u r b r a i n s w e r e t ha w -m o u n t e d o n g e l a t i n - c o a t e d s l i d e s a n d s t o r e d a t - 7 0 C f o r i ns i t u h y b r i d i z a t i o n h i s t o c h e m i s t r y . S e c t i o n s ( 3 0 0 , m ) f r o mt h r e e b r a i n s w e r e t h a w - m o u n t e d o n s l i d e s a n d s t o r e d a t- 7 0 C f o r m i c r o d i s s e c t i o n . A 1 7 - g a u g e s t a i n l e s s s t e e l n e e d l ew a s u s e d t o s a m p l e t h e CA1 r e g i o n o f h i p p o c a m p u s b i l a t e r -a l l y f r o m s e v e r a l c o n s e c u t i v e s e c t i o n s . F o r c o m p a r i s o n , t h ec e n t r a l a m y g d a l o i d n u c l e u s w a s r e m o v e d w i t h a 1 4 - g a u g en e e d l e i n a s i m i l a r m a n n e r . S a m p l e s w e r e s t o r e d a t - 7 0 Cu n t i l a s s a y e d .S y n t h e s i s o f P r o b e a n d C o n t r o l R N A s . T e m p l a t e p l a s m i d( p r N T 4 ) w a s c o n s t r u c t e d b y l i g a t i n g a 3 3 6 - b a s e - p a i r ( b p )E c o R V / B g l I I f r a g m e n t ( n u c l e o t i d e s 6 2 6 - 9 6 1 ) o f t h e r a tNT/N g e n e ( 2 ) i n t o BamHI/Sma I - d i g e s t e d pGEM4( P r o m e g a ) . L a b e l e d a n t i s e n s e RNA p r o b e ( 7 x 1 0 8 c p m / , u g )w a s t r a n s c r i b e d f r o m E c o R I - l i n e a r i z e d t e m p l a t e w i t h T 7RNA p o l y m e r a s e ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m ) a n d [ a - 3 5 S ] C T P( 1 2 5 0 C i / m m o l ; 1 C i = 3 7 G B q ; A m e r s h a m ) a s d e s c r i b e d ( 1 0 ) .U n l a b e l e d a n t i s e n s e RNA was s y n t h e s i z e d s i m i l a r l y . L a -b e l e d s e n s e RNA was t r a n s c r i b e d f r o m a H i n d I I I - l i n e a r i z e dt e m p l a t e b y u s i n g S P 6 RNA p o l y m e r a s e ( B o e h r i n g e r M a n n -h e i m ) . U n i n c o r p o r a t e d n u c l e o t i d e s w e r e r e m o v e d b y c h r o -m a t o g r a p h y o v e r S e p h a d e x G - 5 0 , a n d t h e p r o b e s i z e wasr e d u c e d b y a l k a l i n e h y d r o l y s i s ( 1 1 ) .A b b r e v i a t i o n s : NT , n e u r o t e n s i n ; NT/N, n e u r o t e n s i n / n e u r o m e d i nN ; C A 1 , f i e l d 1 o f Ammon's h o r n .tTo whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

5202

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


2/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 6 ( 1 9 8 9 ) 5 2 0 3I n S i t u H y b r i d i z a t i o n . S l i d e - m o u n t e d b r a i n s e c t i o n s w e r ew a r m e d t o r o o m t e m p e r a t u r e , t r e a t e d s e q u e n t i a l l y w i t h 4%( w t / v o l ) p a r a f o r m a l d e h y d e , 0 . 2 5 % a c e t i c a n h y d r i d e ( i n 0 . 1 Mt r i e t h a n o l a m i n e , pH 8 . 0 ) , a g r a d e d a l c o h o l s e r i e s , a n d c h l o -r o f o r m a n d t h e n a i r d r i e d . P r o b e ( 2 p m o l / m l ) w a s a p p l i e d i n4 5 , 1 a o f h y b r i d i z a t i o n b u f f e r [ 5 0 % o ( v o l / v o l ) f o r m a m i d e / 1 0 %( w t / v o l ) d e x t r a n s u l f a t e / 0 . 3 M N a C l / 1 0 mM T r i s ' H C l , pH8 . 0 / 1 mM EDTA/0.2% b o v i n e s e r u m a l b u m i n / 0 . 2 %F i c o l l / 0 . 2 % p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e / y e a s t tRNA a t 0 . 5

m g / m l / 1 0 mM d i t h i o t h r e i t o l ] , a n d s l i d e s w e r e i n c u b a t e d a t4 5 0 C i n a m o i s t c h a m b e r o v e r n i g h t . T o r e m o v e u n h y b r i d i z e dp r o b e , s l i d e s w e r e w a s h e d f o r 1 5 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r ew i t h 2 x SS C ( l x SSC = 0 . 1 5 M s o d i u m c h l o r i d e / 0 . 0 1 5 Ms o d i u m c i t r a t e , pH 7 . 0 ) , f o l l o w e d b y R N a s e A d i g e s t i o n a sd e s c r i b e d ( 1 1 ) . A d d i t i o n a l w a s h e s w e r e p e r f o r m e d i n 2 x SSCf o r 1 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e , 0 . l x SSC f o r 3 0 m i n a t 6 2 0 C ,a n d O . 1 x SSC b r i e f l y a t r o o m t e m p e r a t u r e . S e c t i o n s w e r ed e h y d r a t e d i n a g r a d e d a l c o h o l s e r i e s i n w h i c h w a t e r w a sr e p l a c e d b y 0 . 6 M ammonium a c e t a t e a n d a i r d r i e d .To a s s e s s s p e c i f i c i t y o f l a b e l i n g , s o m e s e c t i o n s w e r et r e a t e d a s d e s c r i b e d e x c e p t f o r t h e s u b s t i t u t i o n o f l a b e l e ds e n s e p r o b e f o r l a b e l e d a n t i s e n s e p r o b e . I n a d d i t i o n , o t h e rs e c t i o n s w e r e t r e a t e d w i t h a m i xt u r e o f l a b e l e d a n t i s e n s ep r o b e a n d e x c e s s ( 2 5 0 x ) u n l a b e l e d a n t i s e n s e RNA.A u t o r a d i o g r a p h y . S l i d e s w e r e a p p o s e d t o H y p e r f i l m - , B m a x( A m e r s h a m ) f o r 4 4 h r , a n d t h e f i l m w a s d e v e l o p e d i n D 1 9s o l u t i o n ( K o d a k ) . S e l e c t e d s l i d e s w e r e s u b s e q u e n t l y d i p p e di n NTB2 e m u l s i o n ( K o d a k , d i l u t e d 1 : 1 w i t h 0 . 6 M a m m o n i u ma c e t a t e ) , e x p o s e d f o r 7 d a y s a t 5 C , d e v e l o p e d i n D 1 9 s o l u t i o nd i l u t e d 1 : 1 w i t h w a t e r , a n d c o u n t e r s t a i n e d w i t h c r e s y l v i o l e ta c e t a t e .L a b e l i n g w a s c o n s i d e r e d s p e c i f i c i f i t w a s ( i ) b i l a t e r a l l ys y m m e t r i c a l , ( i i ) c o n s i s t e n t f r o m s e c t i o n t o s e c t i o n a n d f r o mb r a i n t o b r a i n , a n d ( i i i ) a b s e n t i n s e c t i o n s t r e a t e d w i t h l a b e l e ds e n s e p r o b e o r a m i x t u r e o f l a b e l e d a n t i s e n s e p r o b e a n de x c e s s u n l a b e l e d a n t i s e n s e RNA.S 1 N u c l e a s e P r o t e c t i o n A s s a y . S 1 n u c l e a s e p r o t e c t i o n a s -s a y s w e r e d o n e a s d e s c r i b e d ( 1 2 ) . T o i s o l a t e a f u l l - l e n g t hNT/N c D N A f o r u s e a s p r o b e , a r a t b r a i n c D N A l i b r a r y w a s

c o n s t r u c t e d i n A g t l l a n d s c r e e n e d a s d e s c r i b e d ( 3 ) . T h eA

A

B,

E c o R IH i n d I I Ia -* *47

SP 6 ( s e n s e ) H i n d I I I- N N T I 3 ' UT IE c o R I

T 7 ( a n t i s e n . )1 4 33 6 4 1

N N T 3 ' UTEc o R I

697 24F I G . 1 . S c h e m a t i c d i a g r a m o f t e m p l a t e s u s e d f o r RN A a n d DNAp r o b e s y n t h e s i s . P l a s m i d s e q u e n c e s ( - ) , 3 ' u n t r a n s l a t e d s e q u e n c e s( - ) , a n d c o d i n g r e g i o n s ( o ) a r e s h o w n . T h e p o s i t i o n s o f t h e n e u r o -m e d i n N ( 3 ) a n d NT ( a ) c o d i n g d o m a i n s a r e i n d i c a t e d . T h e s i z e s( n u c l e o t i d e s ) o f v a r i o u s p r o b e r e g i o n s ( d e l i n e a t e d b y d o u b l e - h e a d e da r r o w s ) a r e s h o w n . ( A ) RN A p r o b e s w e r e s y n t h e s i z e d f r o m a p o r t i o no f e x o n 4 o f t h e r a t NT/N g e n e s u b c l o n e d i n t o pGEM4 a s t e m p l a t e .( B ) DNA p r o b e s w e r e s y n t h e s i z e d f r o m a r a t b r a i n NT/N cDNA( c o n t a i n i n g c o di n g s e q u e n c e s f r o m a m i n o a c i d s 6 - 1 6 9 a n d t h ep r o x i m a l 3 ' u n t r a n s l a t e d r e g i o n ) c l o n e d i n t o v e c t o r M 1 3 m p l l .

E c o R I i n s e r t o f a r e c o m b i n a n t ( r b N T / N - 1 ) , e n c o m p a s s i n gn e a r l y t h e e n t i r e c o d i n g r e g i o n ( a m i n o a c i d s 6 - 1 6 9 ) , w a ss u b c l o n e d i n t o v e c t o r M13mpll a n d u s e d t o s y n t h e s i z e3 2 P - l a b e l e d , s i n g l e - s t r a n d e d p r o b e . RNA w a s p r e p a r e d f r o mb r a i n p u n c h e s b y t h e l i t h i u m c h l o r i d e / u r e a p r o c e d u r e a sd e s c r i b e d ( 1 3 ) . P u l v e r i z e d s k e l e t a l m u s c l e ( 5 0 m g ) w a s a d d e db e f o r e e x t r a c t i o n t o s e r v e a s a c a r r i e r . No NT/N mRNA w a sd e t e c t e d i n RN A p r e p a r e d f r o m s k e l e t a l m u s c l e a l o n e ( d a t an o t s h o w n ) .

RESULTSNT/N mRNA i n H i p p o c a m p u s a n d S u b i c u l u m . T h e d i s t r i -b u t i o n o f NT/N mRNA i n t h e r a t f o r e b r a i n w a s d e t e r m i n e db y i n s i t u h y b r i d i z a t i o n w i t h a 3 5 S - l a b e l e d RNA p r o b e e n -c o m p a s s i n g t h e N T a n d n e u r o m e d i n N c o d i n g d o m a i n s a n d

p a r t o f t h e 3 ' u n t r a n s l a t e d r e g i o n ( F i g . 1 A ) . T h e r e w a s i n t e n s es. .. .

* : : .:i' ' : ' .

L S_.. ;9 . P- a

P i r

C A I/ o "

" , i l l .j . ,,~ . " o .sAl s - z ' l k , , >MMP o

DD

SubI J..CI-- C eALH

F I G . 2 . D i s t r i b u t i o n o f N T / NmRNA i n c o r o n a l s e c t i o n s o f r a tf o r e b r a i n d e t e r m i n e d b y i n s i t uh y b r i d i z a t i o n w i t h a 3 5 S - l a b e l e da n t i s e n s e 'RNA p r o b e ( s e e F i g .1 A ) . S e c t i o n s w e r e a p p o s e d t oH y p e r f i l n - ( 3 m a x f i l m f o r 4 4 h r .A u t o r a d i o g r a m s w e r e i m a g e d w i t ha P a n a s o n i c C C D b l a c k - a n d - w h i t ev i d e o camera ' a n d S o n y v i d e op r i n t e r . F o ' r e b r a i n r e g i o n s w e r ei d e n t i f i e d a c c o r d i n g t o P a x i n o sa n d W a t s o n ( 1 4 ) . A p p r o x i m a t e a n -t e r i o r - p o s t e r i o r l e v e l o f s e c t i o n sr e l a t i v e t o b r e g m a w e r e 0 . 0 m ' m( A ) , - 0 . 3 mm ( B ) , - 3 . 0 mm ( C ) ,a n d - 3 . 8 mm ( D ) . B S T , b e d n u -c l e u s o f t h e s t r i a t e r m i n a l i s ; C A l ,f i e l d 1 o f A m m o n ' s h o r n ; C e A ,c e n t r a l a m y g d a l o i d n u c l e u s ; L H ,l a t e r a l h y p o t h a l a m u s ; L S , l a t e r a ls e p t u m ; M P o , m e d i a l p r e o p t i c n u -c l e u s ; P i r , p i r i f o r m c o r t e x ; S u b ,d o r s a l s u b i c u l u m . ( B a r = 2 m m . )

C

N e u r o b i o l o g y : A l e x a n d e r e t a l .


3/5

5 2 0 4 N e u r o b i o l o g y : A l e x a n d e r e t a l .

ZH~ ~ . ~~~0~~~~~~~~F I G . 3 . B r i g h t - f i e l d p h o t o m i c r o g r a p h o f a n a u t o r a d i o g r a m o f t h eCA1 p y r a m i d a l c e l l l a y e r h y b r i d i z e d w i t h r a d i o l a b e l e d a n t i s e n s eNT/N RN A a n d e x p o s e d f o r 7 d a y s . ( B a r = 3 0 , m . )

l a b e l i n g o f t h e CA1 r e g i o n o f h i p p o c a m p u s ( F i g . 2 C a n d D )t h a t was u n e x p e c t e d i n v i e w o f t h e r e p o r t e d a b s e n c e o fN T - i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s i n t h i s r e g i o n ( 8 , 9 , 1 5 - 1 7 ) .T h i s l a b e l i n g o c c u r r e d a t a l l s e p t o t e m p o r a l l e v e l s o f t h eh i p p o c a m p u s . E xa m i n a t i o n o f CA1 a t h i g h e r m a g n i f i c a t i o ns h o w e d l a b e l i n g t o b e d i s t r i b u t e d e v e n l y over t h e p y r a m i d a lc e l l l a y e r , n o t c o n c e n t r a t e d o ver a s u b s e t o f t h e c e l l b o d i e s( F i g . 3 ) . T h e r e was a n a b r u p t d e c r e a s e i n l a b e l i n g a t t h ea p p r o x i m a t e r e g i o n o f t r a n s i t i o n f r o m C A1 t o C A 3 . N e i t h e rC A 3 , C A 4 , n o r d e n t a t e gyrus d i s p l a y e d a p p r e c i a b l e s p e c i f i cl a b e l i n g .L i k e C A 1 , t h e s u b i c u l u m was l a b e l e d a l o n g i t s e n t i r es e p t o t e m p o r a l e x t e n t . Many i n t e n s e l y l a b e l e d c e l l s we re seeni n t h e d o r s a l s u b i c u l u m ( F i g . 2 D ; a n d F i g . 4 ) , d e s p i t e p r e v i o u sr e p o r t s o f l o w n u m b e r s o f N T - i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s i nt h e a d u l t ( 9 , 1 5 , 1 6 ) . L a b e l i n g i n t h e v e n t r a l s u b i c u l u m wasu n e x p e c t e d b e c a u s e N T - i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s h a v en o t b e e n r e p o r t e d i n t h a t r e g i o n o f t h e r a t a t a n y s t a g e o fd e v e l o p m e n t ( 8 , 9 , 1 5 - 1 7 ) . L a b e l i n g was r e s t r i c t e d t o t h es u b i c u l u m p ro per , a s n e i t h e r t h e p r e s u b i c u l u m n o r t h e para-s u b i c u l u m e x h i b i t e d l a b e l e d c e l l s .To d e t e r m i n e w h e t h e r t h e i n t e n s e l a b e l i n g i n t h e h i p p o -c a m p u s i n d i c a t e s a u t h e n t i c NT/N mRNA, S 1 n u c l e a s e pro-t e c t i o n assays we re d o n e w i t h a u n i f o r m l y l a b e l e d DNAp r o b e e n c o m p a s s i n g n e a r l y t h e e n t i r e c o d i n g d o m a i n o f t h eNT/N precu rsor ( d e p i c t e d s c h e m a t i c a l l y i n F i g . 1 B ) . T i s s u e

w a s o b t a i n e d b y m i c r o d i s s e c t i o n , a n d RN A i s o l a t e d f r o mCA1 ( n = 3 ; F i g . 5 , l a n e s 1 - 3 ) w a s c o m p a r e d w i t h RNA f r o ms a m p l e s o f t h e c e n t r a l a m y g d a l o i d n u c l e u s ( n = 3 ; F i g . 5 ,l a n e s 3 - 6 ) . T h e c e n t r a l a m y g d a l a w a s c h o s e n f o r c o m p a r i s o nb e c a u s e i t c o n t a i n s m a n y N T - i m m u n o r e a c t i v e n e u r o n s ( 8 , 1 8 )a n d b e c a u s e i t e x h i b i t e d d e n s e l a b e l i n g a f t e r i n s i t u h y b r i d -i z a t i o n w i t h t h e RN A p r o b e ( F i g . 2 C ) . I n a l l c a s e s , o n l y as i n g l e , f u l l - l e n g t h p r o t e c t i o n p r o d u c t ( F i g . 5 , l a n e s 1 - 6 ,a r r o w ) a n d r e s i d u a l u n d i g e s t e d p r o b e w e r e s e e n . I n a d d i t i o n ,t h e l e v e l s o f NT/N mRNA i n s a m p l e s o f CA1 w e r e c o m p a -r a b l e t o t h o s e s e e n i n s a m p l e s o f t h e c e n t r a l a m y g d a l o i dn u c l e u s ( n o t e t h a t CA1 s a m p l e s w e r e a n e s t i m a t e d 2 . 7 - f o l dl a r g e r t h a n c e n t r a l a m y g d a l a s a m p l e s ) . T h e s e r e s u l t s d e m -o n s t r a t e t h a t i t i s a u t h e n t i c NT/N mRNA t h a t i s a b u n d a n t i nt h e CA1 r e g i o n o f h i p p o c a m p u s e v e n t h o u g h N T - i m m u n o -r e a c t i v e c e l l b o d i e s h a v e n o t b e e n d e t e c t e d i n t h i s r e g i o n .D i s t r i b u t i o n o f NT/N mRNA i n O t h e r F o r e b r a i n R e g i o n s .L a b e l e d c e l l s w e r e w i d e l y d i s t r i b u t e d i n t h e f o r e b r a i n , a n dl a b e l i n g w a s p a r t i c u l a r l y h e a v y i n l i m b i c r e g i o n s ( F i g . 2 ) .B e g i n n i n g r o s t r a l l y , l a b e l i n g w a s p r e s e n t i n a n t e r i o r p o r t i o n so f p i r i f o r m c o r t e x . T h e m e d i a l p o r t i o n o f t h e a c c u m b e n sn u c l e u s e x h i b i t e d h y b r i d i z a t i o n s i g n a l t h a t w a s c o n t i n u o u sc a u d a l l y w i t h s i g n a l i n t h e v e n t r a l p a l l i d u m a n d b e d n u c l e u so f t h e s t r i a t e r m i n a l i s . S m a l l n u m b e r s o f i n t e n s e l y l a b e l e dc e l l s w e r e o b s e r v e d i n t h e e n d o p i r i f o r m r e g i o n . T h e c a u d a t e -p u t a m e n c o n t a i n e d l a b e l e d c e l l s c o n c e n t r a t e d d o r s o m e d i a l l ya n d v e n t r a l l y a t r o s t r a l l e v e l s a n d s p r e a d t h r o u g h o u t t h en u c l e u s a t c a u d a l l e v e l s . L a b e l i n g w a s c o n s i s t e n t l y s e e n i nc e r e b r a l c o r t e x j u s t m e d i a l t o t h e c i n g u l u m ; t h i s s i g n a l w a sf a i n t i n a n t e r i o r c i n g u l a t e c o r t e x b u t i n c r e a s e d i n i n t e n s i t y i nr e t r o s p l e n i a l c o r t e x .M o d e r a t e - t o - d e n s e l a b e l i n g o c c u r r e d i n a r o s t r o c a u d a lc o n t i n u u m f r o m t h e s e p t u m t h r o u g h t h e p r e o p t i c a r e a a n dh y p o t h a l a m u s ( F i g . 2 A - C ) . I n t h e s e p t a l r e g i o n , h y b r i d i z a -t i o n s i g n a l w a s i n t e n s e i n r o s t r a l p o r t i o n s o f t h e l a t e r a ls e p t u m , i n t h e d i a g o n a l b a n d o f B r o c a , a n d i n t h e l a t e r a ls u b d i v i s i o n o f t h e b e d n u c l e u s o f t h e s t r i a t e r m i n a l i s . L a b e l e dc e l l s a c c o m p a n i e d t h e m e d i a l f o r e b r a i n b u n d l e f r o m t h er e g i o n o f t h e d i a g o n a l b a n d o f B r o c a t h r o u g h t h e l a t e r a lp r e o p t i c a r e a a n d l a t e r a l h y p o t h a l a m u s . I n t h e m e d i a l p r e -o p t i c r e g i o n , o n l y l i g h t l a b e l i n g w a s o b s e r v e d i n p e r i v e n t r i c -u l a r s t r u c t u r e s , i n c l u d i n g t h e a n t e r i o r m e d i a l p r e o p t i c n u -c l e u s , w h e r e a s p a r t i c u l a r l y i n t e n s e l a b e l i n g o c c u r r e d i n t h ea d j a c e n t m e d i a l p r e o p t i c n u c l e u s . L a b e l e d c e l l s i n t h e p r e -o p t i c a r e a w e r e c o n t i n u o u s w i t h t h o s e i n t h e b e d n u c l e u s o ft h e s t r i a t e r m i n a l i s . I n t h e h y p o t h a l a m u s t h e i n t e n s i t y o fl a b e l i n g i n m e d i a l r e g i o n s w a s g e n e r a l l y l e s s t h a n i n l a t e r a l

F I G . 4 . D a r k - f i e l d p h o t o m i -c r o g r a p h o f a n a u t o r a d i o g r a m o ft h e d o r s a l s u b i c u l u m h y b r i d i z e dw i t h r a d i o l a b e l e d a n t i s e n s e NT/NRNA a n d e x p o s e d f o r 7 d a y s .C l u s t e r s o f s i l v e r g r a i n s i n d i c a t ec e l l s c o n t a i n i n g NT/N mRNA.T h i s c o r o n a l s e c t i o n ( o r i e n t e dw i t h m e d i al t o t h e r i g h t ) c o r r e -s p o n d s t o t h e a n t e r i o r - p o s t e r i o rl e v e l ( - 6 . 8 mm f r o m b r e g m a )s h o w n o n p l a t e 4 4 o f P a x i n o s a n dW a t s o n ( 1 4 ) . ( B a r = 3 0 0 , u m . )

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 6 ( 1 9 8 9 )


4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 6 ( 1 9 8 9 ) 5 2 0 5o n e s . T h e r e w a s l i t t l e , i f a n y , s i g n a l a s s o c i a t e d w i t h t h ep a r a v e n t r i c u l a r n u c l e u s o r t h e p e r i v e n t r i c u l a r r e g i o n , w h i c hw a s s u r p r i s i n g b e c a u s e N T - i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s h a v eb e e n s e e n c o n s i s t e n t l y i n t h e s e a r e a s ( 8 , 1 8 ) . L a b e l e d c e l l sw e r e o b s e r v e d i n t h e a r c u a t e n u c l e u s , d o r s o m e d i a l n u c l e u s ,a n d p e r i f o r n i c a l r e g i o n , w h e r e a s t h e v e n t r o m e d i a l n u c l e u sw a s d e v o i d o f a n y l a b e l i n g . I n t h e m a m m i l l a r y r e g i o n l i g h t -t o - m o d e r a t e l a b e l i n g w a s p r e s e n t i n t h e v e n t r a l p r e m a m m i l l -a r y n u c l e u s a n d t h e m e d i a l m a m m i l l a r y n u c l e u s .

I n t h e a m y g d a l a , l a b e l i n g w a s g e n e r a l l y r e s t r i c t e d t o m e d i a ls t r u c t u r e s ( F i g . 2 C ) . L a b e l e d c e l l s w e r e s e e n i n t h e a n t e r i o rc o r t i c a l , b a s o m e d i a l , m e d i a l , a n d c e n t r a l n u c l e i o f t h ea m y g d a l a ; t h e d e n s e s t l a b e l i n g w a s a s s o c i a t e d w i t h t h ec e n t r a l n u c l e u s . A c o n t i n u u m o f l a b e l e d c e l l s e x t e n d e dm e d i a l l y f r o m t h e r o s t r a l a m y g d a l o i d c o m p l e x a c r o s s t h es u b l e n t i c u l a r s u b s t a n t i a i n n o m i n a t a t o t h e l a t e r a l h y p o t h a l -a m u s a n d b e d n u c l e u s o f t h e s t r i a t e r m i n a l i s . L a b e l i n g w a sa l s o p r e s e n t i n t h e a m y g d a l o h i p p o c a m p a l t r a n s i t i o n a r e a .D I S C U S S I O N

T h e d i s t r i b u t i o n o f NT i n t h e r a t f o r e b r a i n h a s b e e n e x t e n -s i v e l y m a p p e d w i t h i m m u n o c y t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s ( 8 , 9 ,1 5 - 2 3 ) . DNA s e q u e n c e a n a l y s i s o f c D N A a n d g e n o m i cc l o n e s h a s r e v e a l e d t h a t NT i s s y n t h e s i z e d a s p a r t o f a l a r g e rp r e c u r s o r p r o t e i n t h a t a l s o c o n t a i n s a c o d i n g d o m a i n f o r t h eN T - l i k e p e p t i d e n e u r o m e d i n N ( 2 , 3 ) . T o d e t e r m i n e w h e t h e rt h e d i s t r i b u t i o n o f mRNA e n c o d i n g t h i s p r e c u r s o r c o r r e -s p o n d s t o t h e p r e v i o u s l y r e p o r t e d d i s t r i b u t i o n o f N T -i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s , i n s i t u h y b r i d i z a t i o n h i s t o c h e m -i s t r y w a s p e r f o r m e d o n s e c t i o n s o f a d u l t r a t f o r e b r a i n b yu s i n g a n RN A p r o b e d e r i v e d f r o m t h e r a t NT/N g e n e . I ng e n e r a l , t h e r e g i o n a l d i s t r i b u t i o n o f NT/N mRNA c o r r e -s p o n d s w e l l w i t h t h a t o f NT i m m u n o r e a c t i v i t y . H o w e v e r ,NT/N mRNA i s a b u n d a n t i n t h e CA1 r e g i o n o f t h e h i p p o -c a m p u s , a r e g i o n w h e r e N T - i m m u n o r e a c t i v e n e u r o n s h a v en o t b e e n d e t e c t e d ( 8 , 9 , 1 5 - 1 7 ) , e v e n w i t h t h e u s e o f c o l c h -1 23 45 6 7 P M

> * - 1 1 9 8

-517

- 3 9 6A- 3 54

& -211*-1 89

F I G . 5 . S 1 n u c l e a s e p r o t e c -t i o n a n a l y s i s o f RN A f r o m t h eCA1 r e g i o n o f h i p p o c a m p u s . I n -d i v i d u a l p u n c h e s o f CA1 a n d t h ec e n t r a l a m y g d a l o i d n u c l e u s wereo b t a i n e d f r o m t h r e e a d u l t r a tb r a i n s , a n d RNA was p r e p a r e db y e x t r a c t i o n w i t h 3 M l i t h i u mc h l o r i d e / 6 M u r e a . A p o r t i o n( 4 0 o ) o f t h e RNA r e c o v e r e df r o m e a c h p u n c h ( l a n e s 1 - 3 , cen-t r a l a m y g d a l a f r o m r a t s 1 - 3 ; l a n e s4 - 6 , CA1 f r o m r a t s 1 - 3 ) , o r 2 0 j i go f y e a s t RN A ( l a n e 7 ) w a s h y -b r i d i z e d w i t h a 3 2 P - l a b e l e d an -t i s e n s e D N A p r o b e , f o l l o w e d b yd i g e s t i o n w i t h 5 0 u n i t s o f S 1 n u -c l e a s e . T h e p r o b e ( l a n e P ) en -c ompas ses n e a r l y a l l o f t h eNT/N precursor c o d i n g r e g i o na n d t h e p r o x i m a l p o r t i o n o f t h e 3 'u n t r a n s l a t e d r e g i o n ( s e e F i g . 1 B ) .P r o d u c t s o f t h e r e a c t i o n s werea n a l y z e d on 5% p o l y a c r y l -a m i d e / 7 M urea s e q u e n c i n g g e la n d v i s u a l i z e d b y a u t o r a d i o g r a -p h y f o r 1 2 h r w i t h a n i n t e n s i f y i n gs c r e e n . S i z e s o f 3 2 P e n d - l a b e l e dH i n f l r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s o fp S P 6 5 ( P r o m e g a B i o t e c h ) ar e i n -d i c a t e d ( l a n e M ) . P o s i t i o n o f t h ef u l l - l e n g t h p r o t e c t i o n p r o d u c t i si n d i c a t e d b y a n arrow.

i c i n e t o e n h a n c e d e t e c t i o n . S i m i l a r d i s c r e p a n c i e s b e t w e e nn e u r o p e p t i d e mRNA a b u n d a n c e a n d n e u r o p e p t i d e i m m u n o -s t a i n i n g h a v e b e e n a l r e a d y n o t e d ( 2 4 ) . O u r r e s u l t s o b t a i n e db y S 1 n u c l e a s e p r o t e c t i o n a s s a y c o n f i r m t h a t h i g h l e v e l s o fa u t h e n t i c NT/N mRNA e x i s t i n C A L . T h e s e r e s u l t s e f f e c -t i v e l y r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t c e l l s i n CA1 u s e a na l t e r n a t i v e s p l i c i n g m e c h a n i s m ( 2 5 ) t o g e n e r a t e o n e o r m o r emRNAs t h a t l a c k t h e N T c o d i n g d o m a i n .T h e a b s e n c e o f N T - i m m u n o r e a c t i v e c e l l s i n t h e h i p p o c a m -p u s c o u l d b e t h e r e s u l t o f p o s t t r a n s l a t i o n a l c o m p a r t m e n t a l -i z a t i o n o f N T . I n a d u l t r a t s t h e d e t e c t i o n o f N T - i m m u n o r e -a c t i v e c e l l b o d i e s i n m a n y b r a i n r e g i o n s r e q u i r e s c o l c h i c i n e ,w h i c h b l o c k s a x o n a l t r a n s p o r t . W i t h o u t c o l c h i c i n e N T i sp r e s u m a b l y t r a n s p o r t e d r a p i d l y o u t o f c e l l b o d i e s t o a x o n a lp r o j e c t i o n s i t e s , a n d , t h u s , t h e c e l l b o d i e s c o n t a i n i n s u f f i c i e n tN T t o b e d e t e c t e d i m m u n o c y t o c h e m i c a l l y . H o w e v e r , r a p i da x o n a l t r a n s p o r t o f N T c a n n o t r e a d i l y a c c o u n t f o r t h e a b -s e n c e o f N T - i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s i n t h e C A1 r e g i o n ,b e c a u s e t h e s u b i c u l u m , w h i c h r e c e i v e s a m a j o r p r o j e c t i o nf r o m CA1 ( 2 6 ) , c o n t a i n s r e l a t i v e l y l o w l e v e l s o f NT ( 2 7 ) .P o s t t r a n s l a t i o n a l r e g u l a t i o n c o u l d o c c u r a t t h e l e v e l o fp r o c e s s i n g o f t h e NT/N p r e c u r s o r p r o t e i n t o y i e l d p r o c e s s e d ,b i o a c t i v e p e p t i d e s . T i s s u e - s p e c i f i c p r o c e s s i n g o f t h e p r o o p -i o m e l a n o c o r t i c o t r o p i n p r e c u r s o r p r o t e i n y i e l d s d i f f e r e n t s e t so f p e p t i d e s i n t h e a n t e r i o r a n d i n t e r m e d i a t e l o b e s o f t h ep i t u i t a r y ( 2 8 ) . B y a n a l o g y , t h e NT/N p r e c u r s o r p r o t e i n m i g h tb e d i f f e r e n t i a l l y p r o c e s s e d t o y i e l d d i s t i n c t s e t s o f p e p t i d e s i nd i f f e r e n t b r a i n r e g i o n s . An o b v i o u s c a n d i d a t e f o r o n e p r o d u c to f d i f f e r e n t i a l p r o c e s s i n g i s n e u r o m e d i n N . To o u r k n o w l -e d g e , t h e d i s t r i b u t i o n o f n e u r o m e d i n N - i m m u n o r e a c t i v e c e l l si n m a m m a l i a n t i s s u e s h a s n o t b e e n d e t e r m i n e d . I n o t h e rv e r t e b r a t e s , h o w e v e r , g a s t r o i n t e s t i n a l c e l l s e x p r e s s i n g N T ,n e u r o m e d i n N , o r b o t h p e p t i d e s , h a v e b e e n d e t e c t e d ( 2 9 ) . I na d d i t i o n , p e p t i d e s o t h e r t h a n NT a n d n e u r o m e d i n N c o u l d b eg e n e r a t e d f r o m t h e NT/N p r e c u r s o r ( 2 , 3 ) .A l t h o u g h d i f f e r e n t i a l p r o t e i n p r o c e s s i n g s e e m s t h e m o s tl i k e l y e x p l a n a t i o n f o r t h e d i s c r e p a n c y b e t w e e n NT/N mRNAa b u n d a n c e a n d N T - i m m u n o s t a i n i n g , we c a n n o t r u l e o u t t h ep o s s i b i l i t y o f t r a n s l a t i o n a l r e g u l a t i o n . F o r e x a m p l e , NT/NmRNA m a y b e s e q u e s t e r e d i n t h e n u c l e i o f C A1 p y r a m i d a lc e l l s a n d r e m a i n u n t r a n s l a t e d . A n o t h e r p o s s i b i l i t y i s t h a tNT/N mRNA i s t r a n s p o r t e d t o t h e n e u r o n a l c y t o p l a s m b u tt r a n s l a t e d i n e f f i c i e n t l y . A l t e r n a t i v e l y , t h e r e may b e r a p i dd e g r a d a t i o n o f t h e NT/N p r e c u r s o r p r o t e i n a f t e r t r a n s l a t i o n .I m m u n o c y t o c h e m i c a l s t u d i e s w i t h a n t i s e r a t h a t s p e c i f i c a l l yd e t e c t t h e NT/N p r e c u r s o r , n e u r o m e d i n N , a n d o t h e r p o -t e n t i a l p r o c e s s i n g p r o d u c t s s h o u l d a i d e x p e r i m e n t a l t e s t i n g o ft h e s e p o s s i b i l i t i e s .T h e a b u n d a n c e o f NT/N mRNA i n t h e s u b i c u l u m w a s a l s ou n e x p e c t e d . E f f e r e n t s o f t h e d o r s a l a n d v e n t r a l s u b i c u l u m o ft h e r a t p r o j e c t d i f f e r e n t i a l l y , b u t w i t h s o m e o v e r l a p , t o t h ee n t o r h i n a l a n d p r e s u b i c u l a r c o r t e x , l a t e r a l s e p t u m , b a s a lf o r e b r a i n , a n d h y p o t h a l a m u s ( 2 6 , 3 0 ) . To o u r k n o w l e d g e ,t h e r e h a v e b e e n n o r e p o r t s o f N T - i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e si n t h e v e n t r a l s u b i c u l u m . I n t h e d o r s a l s u b i c u l u m o f t h e r a t ,t h e n u m b e r o f c e l l b o d i e s w i t h d e t e c t a b l e N T - l i k e i m m u n o -r e a c t i v i t y r e a c h e s a maximum d u r i n g t h e f i r s t p o s t n a t a l w e e k( 9 ) a n d t h e n d e c r e a s e s m a r k e d l y b y a d u l t h o o d , s o t h a t o n l ys c a t t e r e d c e l l s a r e v i s i b l e ( 9 , 1 5 , 1 6 ) . T h e r e a r e i n d i c a t i o n s o fa s i m i l a r r e d u c t i o n i n N T - i m m u n o r e a c t i v e c e l l s d u r i n g d e -v e l o p m e n t o f t h e h u m a n s u b i c u l u m ( 3 1 ) . P a r a l l e l c h a n g e so c c u r i n t h e d e n s i t y o f N T - i m m u n o r e a c t i v e f i b e r s i n t h em a m m i l l a r y b o d y , a n d a N T - i m m u n o r e a c t i v e p a t h w a y f r o ms u b i c u l u m t o m a m m i l l a r y b o d y h a s b e e n i d e n t i f i e d i n t h en e o n a t a l r a t ( 1 7 ) a n d h u m a n n e o n a t e ( 3 1 ) . A N T - i m m u n o r e -a c t i v e p a t h w a y f r o m d o r s a l s u b i c u l u m t o a n t e r i o r c i n g u l a t ec o r t e x i n t h e a d u l t r a t h a s a l s o b e e n r e p o r t e d ( 1 6 ) . T h ea b u n d a n c e o f NT/N mRNA i n t h e d o r s a l s u b i c u l u m o f t h ea d u l t r a t i n d i c a t e s t h a t t h e d e v e l o p m e n t a l r e d u c t i o n i n N T -i m m u n o r e a c t i v e n e u r o n s s e e n i n t h i s r e g i o n i s t h e r e s u l t o f

N e u r o b i o l o g y : A l e x a n d e r e t a L


5/5

5 2 0 6 N e u r o b i o l o g y : A l e x a n d e r e t a l .p o s t t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n . T h i s f a c t r a i s e s t h e i n t e r e s t i n gp o s s i b i l i t y o f a d e v e l o p m e n t a l c h a n g e i n p r o c e s s i n g o f t h eNT/N p r e c u r s o r p r o t e i n . R e c e n t e v i d e n c e s u g g e s t s t h a tt r a n s i e n t p e r i n a t a l e x p r e s s i o n o f n e u r o t r a n s m i t t e r s i n t h ed e v e l o p i n g n e o c o r t e x i s i m p o r t a n t f o r t h e e s t a b l i s h m e n t o fp r o p e r n e u r o n a l c o n n e c t i v i t y ( 3 2 ) .N o t a l l r e g i o n s p r e v i o u s l y n o t e d t o c o n t a i n NT-i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s w e r e f o u n d t o p o s s e s s NT/NmRNA. L a b e l i n g w a s c o n s p i c u o u s l y a b s e n t f r o m t h e h y p o -t h a l a m i c p a r a v e n t r i c u l a r n u c l e u s a n d t h e a d j a c e n t p e r i v e n -t r i c u l a r r e g i o n , a r e a s p r e v i o u s l y r e p o r t e d t o c o n t a i n N T -i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s ( 8 , 1 8 ) . O n e p o s s i b l e e x p l a n a t i o nf o r t h e s e r e s u l t s i s t h a t t h e c o n t e n t o f NT/N mRNA i n c e l l so f t h e s e r e g i o n s may b e b e l o w t h e l i m i t s o f d e t e c t a b i l i t y b yi n s i t u h y b r i d i z a t i o n . A l t e r n a t i v e l y , p r e v i o u s l y r e p o r t e d NTi m m u n o s t a i n i n g i n t h e s e r e g i o n s may n o t r e p r e s e n t a u t h e n t i cN T . An a n a l o g o u s s i t u a t i o n h a s b e e n d e s c r i b e d f o r t h et h y r o i d - r e l e a s i n g h o r m o n e p r e c u r s o r a n d i t s mRNA i n c e r -t a i n r e g i o n s o f t h e r a t b r a i n ( 2 4 ) .We t h a n k J o h n B r e i n i n g e r , L i s a W i l l i a m s , a n d D a l e W i l l i a m s f o rt e c h n i c a l a s s i s t a n c e a n d e x t e n d s p e c i a l t h a n k s t o D r . J a m e s Hamosa n d D o n n a P u l a s k i S a l o f o r a s s i s t a n c e w i t h i m a g i n g . T h i s w o r k w a ss u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h t o S . E . L .

( D K - 2 9 8 7 6 ) , P . R . D . ( H L - 3 3 3 0 7 ) , a n d D . M . D . ( N S - 2 0 3 1 1 ) . M . J . A .w a s s u p p o r t e d b y a N a t i o n a l R e s e a r c h S e r v i c e A w a r d F e l l o w s h i p( D K - 0 8 1 2 5 ) f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h .1 . E l l i o t t , P . J . & N e m e r o f f , C . B . ( 1 9 8 6 ) i n N e u r a l a n d E n d o c r i n eP e p t i d e s a n d R e c e p t o r s , e d . M o o d y , T . W. ( P l e n u m , NewY o r k ) , p p . 2 1 9 - 2 4 5 .2 . K i s l a u s k i s , E . , B u l l o c k , B . , M c N e i l , S . & D o b n e r , P . R . ( 1 9 8 8 )J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 4 9 6 3 - 4 9 6 8 .3 . D o b n e r , P . R . , B a r b e r , D . L . , V i l l a - K o m a r o f f , L . & M c K i e r -n a n , C . ( 1 9 8 7 ) P r o c . N a t I . A c a d . S c i . USA 8 4 , 3 5 1 6 - 3 5 2 0 .4 . M i n a m i n o , N . , K a n g a w a , K . & M a t s u o , H . ( 1 9 8 4 ) B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . Commun. 1 2 2 , 5 4 2 - 5 4 9 .5 . N e m e r o f f , C . B . , L u t t i n g e r , D . & P r a n g e , A . J . , J r . ( 1 9 8 3 ) i nH a n d b o o k o f P s y c h o p h a r m a c o l o g y , e d s . I v e r s e n , L . I . ,I v e r s e n , S . D . & S n y d e r , S . H . ( P l e n u m , New Y o r k ) , V o l . 1 6 ,

p p . 3 6 3 - 4 6 6 .6 . M c C a n n , S . M . , V i j a y a n , E . , K o e n i g , J . & K r u l i c h , L . ( 1 9 8 2 )A n n . N . Y . A c a d . S c i . 4 0 0 , 1 6 0 - 1 7 1 .7 . F r o h m a n , L . A . , M a e d a , K . , B e r e l o w i t z , M . , S z a b o , M . &T h o m i n e t , J . ( 1 9 8 2 ) A n n . N . Y . A c a d . S c i . 4 0 0 , 1 7 2 - 1 8 2 .

8 . J e n n e s , L . , S t u m p f , W. E . & K a l i v a s , P . W. ( 1 9 8 2 ) J . C o m p .N e u r o l . 2 1 0 , 2 1 1 - 2 2 4 .9 . H a r a , Y . , S h i o s a k a , S . , S e n b a , E . , S a k a n a k a , M . , I n a g a k i , S . ,T a k a g i , H . , K a w a i , Y . , T a k a t s u k i , K . , M a t s u z a k i , T . & T o -h y a m a , M . ( 1 9 8 2 ) J . C o m p . N e u r o l . 2 0 8 , 1 7 7 - 1 9 5 .1 0 . M e l t o n , D . A . , K r i e g , P . A . , R e b a g l i a t i , M . R . , M a n i a t i s , T . ,Z i n n , K . & G r e e n , M . R . ( 1 9 8 4 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 2 , 7 0 3 5 -7 0 5 6 .1 1 . C o x , K . H . , D e L e o n , D . V . , A n g e r e r , L . M . & A n g e r e r , R . C .( 1 9 8 4 ) D e v . B i o l . 1 0 1 , 4 8 5 - 5 0 2 .1 2 . D o b n e r , P . R . , T i s c h l e r , A . S . , L e e , Y . C . , B l o o m , S . R . &D o n a h u e , S . R . ( 1 9 8 8 ) J . B i o l . C h e m . 2 6 3 , 1 3 9 8 3 - 1 3 9 8 6 .1 3 . R o b i n s o n , B . G . , F r i m , D . M . , S c h w a r t z , W. J . & M a j z o u b ,J . A . ( 1 9 8 8 ) S c i e n c e 2 4 1 , 3 4 2 - 3 4 4 .1 4 . P a x i n o s , G . & W a t s o n , C . ( 1 9 8 6 ) T h e R a t B r a i n i n S t e r e o t a x i cC o o r d i n a t e s ( A c a d e m i c , S y d n e y , A u s t r a l i a ) , 2 n d E d .1 5 . R o b e r t s , G . W . , W o o d h a m s , P . L . , P o l a k , J . M . & C r o w , T . J .( 1 9 8 4 ) N e u r o s c i e n c e 1 1 , 3 5 - 7 7 .1 6 . R o b e r t s , G . W . , C r o w , T . J . & P o l a k , J . M. ( 1 9 8 1 ) P e p t i d e s 2 ,S u p p l . 1 , 3 7 - 4 3 .1 7 . K i y a m a , H . , S h i o s a k a , S . , S a k a m o t o , N . , M i c h e l , J . - P . , P e a r -s o n , J . & T o h y a m a , M . ( 1 9 8 6 ) B r ai n R e s . 3 7 5 , 3 5 7 - 3 5 9 .1 8 . K a h n , D . , A b r a m s , G . M . , Z i m m e r m a n , E . A . , C a r r a w a y , R .

& L e e m a n , S . E . ( 1 9 8 0 ) E n d o c r i n o l o g y 1 0 7 , 4 7 - 5 4 .1 9 . I n a g a k i , S . , S h i n o d a , K . , K u b o t a , Y . , S h i o s a k a , S . , M a t s u z a k i ,T . & T o h y a m a , M . ( 1 9 8 3 ) N e u r o s c i e n c e 8 , 4 8 7 - 4 9 3 .2 0 . K o h l e r , C . & E r i k s s o n , L . G . ( 1 9 8 4 ) A n a t . E m b r y o l . 1 7 0 , 1 - 1 0 .2 1 . W o l f s o n , B . , M a n n i n g , R . W . , D a v i s , L . G . & B a l d i n o , F . , J r .( 1 9 8 5 ) D e v . B r a i n R e s . 1 8 , 2 4 1 - 2 5 0 .2 2 . S i m e r l y , R . B . , G o r s k i , R . A . & S w a n s o n , L . W. ( 1 9 8 6 ) J .C o m p . N e u r o l . 2 4 6 , 3 4 3 - 3 6 3 .2 3 . Z a h m , D . S . ( 1 9 8 7 ) N e u r o s c i . L e t t . 8 1 , 4 1 - 4 7 .2 4 . S e g e r s o n , T . P . , H o e f l e r , H . , C h i l d e r s , H . , W o l f e , H . J . , W u ,P . , J a c k s o n , I . M . D . & L e c h a n , R . M . ( 1 9 8 7 ) E n d o c r i n o l o g y1 2 1 , 9 8 - 1 0 7 .2 5 . N a w a , H . , H i r o s e , T . , T a k a s h i m a , H . , I n a y a m a , S . & N a k a n -i s h i , S . ( 1 9 8 3 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 6 , 3 2 - 3 6 .2 6 . S w a n s o n , L . W. & C o w a n , W. M . ( 1 9 7 7 ) J . C o m p . N e u r o l . 1 7 2 ,4 9 - 8 4 .2 7 . E m s o n , P . C . , G o ed e r t , M . , H o r s f i e l d , P . , R i o u x , F . & S t .P i e r r e , S . ( 1 9 8 2 ) J . N e u r o c h e m . 3 8 , 9 9 2 - 9 9 9 .2 8 . S m i t h , A . I . & F u n d e r , J . W. ( 1 9 8 8 ) E n d o c r . R e v . 9 , 1 5 9 - 1 7 9 .2 9 . R e i n e c k e , M. ( 1 9 8 5 ) P r o g . H i s t o c h e m . C y t o c h e m . 1 6 , 1 - 1 7 5 .3 0 . S o r e n s e n , K . E . & S h i p l e y , M . T . ( 1 9 7 9 ) J . C o m p . N e u r o l . 1 8 8 ,

3 1 3 - 3 3 4 .3 1 . S a k a m o t o , N . , M i c h e l , J . - P . , K i y a m a , H . , T o h y a m a , M . ,K o p p , N . & P e a r s o n , J . ( 1 9 8 6 ) B r a i n R e s . 3 7 5 , 3 5 1 - 3 5 6 .3 2 . P a r n a v e l a s , J . G . & C a v a n a g h , M . E . ( 1 9 8 8 ) T r e n d s N e u r o s c i .1 1 , 9 2 - 9 3 .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 6 ( 1 9 8 9 )

Documents

Mark J. Alexander et al- Distribution of neurotensin/neuromedin N mRNA in rat forebrain: Unexpected abundance in hippocampus and subiculum