Biofilmy se vyskytují prakticky všude, kdejsou přítomné mikroorganismy. Kroměpřírodního prostředí se vyskytují i v mno-ha typech humánního prostředí, kde způ-sobují četné problémy. Znečišťují totižpovrchy, na nichž se tvoří (obr. 4–7), pří-padně je poškozují korozí (obr. 3); biofilmnapř. zvyšuje odpor lodního trupu připlavbě a poskytuje základ pro další usa-zování řas a larev bezobratlých. V potrubírozvinutý biofilm způsobuje turbulenciprotékající kapaliny a omezuje průsvit,v průmyslových výměnících tepla tvořítepelnou izolační vrstvu a snižuje jejichúčinnost. V mnoha odvětvích průmyslu,jako jsou biotechnologie, čištění odpad-ních vod nebo bioremediace (využití mi -krobiálního metabolismu k odstraňování

polutantů z vody nebo půdy), je naopakpřítomnost biofilmů nezbytná. Zcela samo-statnou, ale nesmírně důležitou a v sou-časnosti nejvíce studovanou otázkou jevýskyt biofilmů v medicíně, především nacizích tělesech v lidském těle, jako jsoukanyly, katétry nebo plastové protetickéimplantáty, kde mohou vyvolávat řadu ob -tížně léčitelných infekcí. Tvorba biofilmůbyla prokázána u většiny patogenníchbakterií, např. u zástupců rodů Pseudo-monas, Vibrio, Escherichia, Salmonella,Listeria, Streptococcus, Staphylococcusnebo Mycobacterium.

Proč vlastně biofilmy vznikají?Již jsme uvedli, že růst ve formě biofilmuje pro mikroorganismy výhodný. Oproti

bakteriím rostoucím v planktonní formě(jako planktonní se nadále v textu označujíbakterie suspendované nebo rostoucí v te -kutém médiu, jako protiklad k přisedlýma rostoucím na povrchu) biofilm poskytu-je bakteriálním buňkám ochranu. Vytvo-řená biofilmová vrstva obklopující buňkytedy představuje bariéru, která izoluje odokolí. Buňky v biofilmu tak mají např. vyš-ší odolnost vůči působení toxických láteka ultrafialového záření, proti mechanické -mu poškození, bakteriofágům i predátorům.V těle člověka nebo zvířete lépe odolávajíimunitnímu systému nebo antibiotikům.Vykazují rovněž vyšší metabolickou akti-vitu ve srovnání s planktonními bakterie-mi, čehož lze úspěšně využívat v různýchprůmyslových aplikacích (např. při čištěníodpadních vod).

Dosud ne zcela vyřešenou otázkou zů -stává, proč bakterie přecházejí z volně plo-voucí do biofilmové fáze růstu. Protožepřichycení se k povrchu je účinnějším pro-středkem, jak setrvat ve vhodném prostře-dí, než se nechat strhnout proudem, dalaby se v extrémním případě planktonní čivolně plovoucí mikrobiální fáze chápatjako mechanismus pro přemísťování z jed-noho povrchu na druhý, tedy pouze jakonutný mezikrok mezi biofilmovými, při-sedlými fázemi života bakterie. Někteříautoři však považují naopak biofilmy zastabilní fázi biologického cyklu, která za -hrnuje stadium vývoje, zrání, udržovánía rozpouštění. Vývoj biofilmu podle nichzačíná jako odpověď na specifické vnějšípodněty, např. dostupnost živin.

Vznik a vývoj biofilmuVznik, vývoj a stabilizace biofilmu probí-hají v několika následných krocích: trans -port a adsorpce organických molekul napevný povrch, transport mikrobiálníchbuněk k pevnému povrchu, zachycení mi -kroorganismů (v první fázi především bak-terií) na povrchu, replikace buněk a pro-dukce extracelulární matrice (blíže dálev textu), vývoj biofilmu na pevném povr-chu, odtrhávání a disperze buněk z bio-filmu zpět do kapaliny (obr. 1).

Po přichycení na vhodném povrchu sebuňky začnou dělit, shlukovat a produku-jí primární biofilm, na který se mohou při-

ziva.avcr.cz 104 živa 3/2012

Martin Rulík, Veronika Holá

Mikrobiální biofilmy 1. Všudypřítomný a přitom málo známý fenomén

Bakterie v přírodních populacích jeví zřetelnou tendenci přisedat k nejrůzněj-ším povrchům – existence v biofilmu je pro ně z mnoha důvodů výhodnějšíma ve většině prostředí také základním způsobem přirozeného výskytu. Za bio-film lze označit přisedlé společenstvo mikroorganismů charakterizované tím,že buňky, které jsou nevratně přichyceny k podkladu nebo jedna k druhé, jsouzapuštěné v matrici extracelulárních polymerních látek produkovaných těmi-to buňkami. Tyto buňky dále vykazují odlišný fenotyp s ohledem na rych-lost růstu a transkripci genů. Ačkoli převládající složkou mnoha biofilmů jsoubakterie, kromě nich se zejména v přírodních biofilmech nacházejí i další mikro -organismy – houby, bičíkovci, nálevníci aj. V následujícím volném seriálu sebudeme věnovat základní charakteristice, vzniku, vývoji a fungování biofilmua přiblížíme biofilmy v přírodě a v medicínském prostředí.

2

1 Fáze vývoje biofilmu. Blíže v textu.Orig. J. Kosturová (podle různých autorů)2 Schematická představa biofilmu tvořeného shluky mikrokolonií houbovitého tvaru, spojenými navzájemkanálky a póry. Orig. J. Kosturová, upra-veno podle: J. W. Costerton a kol. (1999)3 Poškození kamenných památek roz-vojem biofilmů. Kostel Nanebevzetí PannyMarie, Dobrá voda, Novohradské hory4 Mikrobiální biofilmy jsou běžnéi v našich koupelnách, kde způsobujínevzhledné povlaky.

Tvorba organickéhofilmu

Růst biofilmu Uvolňování buněk z biofilmu

Přisednutíbakterií

1

chytávat další buňky tzv. sekundárníhobiofilmu. Drsné povrchy, materiály s po -rézní strukturou nebo bohaté na živinyobvykle pozitivně ovlivňují utváření bio-filmu. K tomu může v zásadě docházet najakémkoli rozhraní dvou fází, tedy na hra-nici pevné a plynné (např. plicní infekce),pevné a kapalné (např. potrubí, katétrya kloubní implantáty) i kapalné a plynnéfáze (např. povlaky aerobních bakterií nahladině kultivačních médií a bakteriálnípovlaky na hladině znečištěných stojatýchvod). Buňky primárního biofilmu vyka-zují během svého růstu určitou prodlevu,která je pravděpodobně spojena s adapta-cí na podmínky přisedlého způsobu životanebo s fenotypovými změnami přisedlýchbuněk. Primární kolonizátoři povrchu sub-strátu mají relativně vysokou růstovourychlost, po určité době se však rychlostsníží a tloušťka biofilmu dosáhne ustálenéhodnoty. Zpomalení růstu je dáno omeze-ním transportu substrátu do hlubších vrs-tev biofilmu a zvýšením vlivu odumíránía rozkladu buněk ve stárnoucím biofilmu.

Růst, diferenciace a zrání biofilmuGenetické práce ukázaly, že tvorba biofil-mu vyžaduje mezibuněčnou signalizacia mikroorganismy rostoucí v této forměse od svých planktonních forem odlišujífyziologickými vlastnostmi. Vzniká takjakýsi biofilmový fenotyp. Cílem mnohastudií je proto porozumět přechodu meziplanktonní a biofilmovou fází růstu a na -opak. Těsně před přilnutím se u bakteriíspouští řada genů: při dotyku s vhodnýmpovrchem se aktivuje především vznikbičíků, v biofilmu se pak jejich tvorbave většině případů snižuje nebo úplněustává. V přichycení (adhezi) pomáhajíbakteriím další buněčné struktury, např.fimbrie, které na rozdíl od bičíků vypa-dají spíše jako třásně nebo chloupky a napovrchu buňky tvoří husté kartáčky. Bez-prostředně po kontaktu s povrchem seaktivují geny zajišťující produkci poly -sacharidů a polymerů potřebných provznik biofilmové vrstvy. Po úspěšném

při chycení bakterií k povrchu následujefáze růstu (akumulace), diferenciace a zrá-ní (maturace) biofilmu. V této době bakte-rie vylučují na svůj povrch poměrně vel-ké množství extracelulární polymernímatrice (EPM) – slizu různého chemické-ho složení. Společně s bakteriálními buň-kami je základní stavební složkou biofilmua výrazně ovlivňuje jeho vlastnosti. EPMprodukují kromě bakterií případně i euka-ryotní buňky v biofilmu a v této matricijsou bakterie fixovány. Extracelulární ma -trice významně přispívá k uspořádáníbiofilmového společenstva a působí takévětšinu ekonomických škod spojovanýchs tvorbou biofilmů. Její složení vycházíz kombinace vnitřních faktorů, jako jsougenotyp nebo druhové složení přisedlýchbuněk, a vnějších vlivů, které zahrnujíokolní fyzikálně-chemické prostředí a po -vahu kolonizovaného substrátu. Tvoří ji ažz 97 % voda a dále anorganické a organic-ké látky, přičemž významnou roli ve struk-tuře hrají (exo)polysacharidy. Ačkoli ne -jsou hlavní složkou matrice (představují

obvykle 1–2 %), považují se za hlavnístrukturní prvek, který staví kostru (frame -work) pro celý biofilm. Stručně řečeno,exopolymery poskytují skelet, do něhožjsou mikrobiální buňky a jejich bioaktiv-ní produkty zapuštěny. Z ostatních látekse v matrici spolu s vodou a mikrobiální-mi buňkami nachází komplex vyloučenýchpolymerů, absorbovaných živin a meta-bolitů, produktů buněčné lyze (rozkladu)a někdy i drobného materiálu a detrituz okolního prostředí. Vedle hlavních sku-pin makromolekul – proteinů, polysacha-ridů, DNA a RNA jsou zde přítomny rov-něž peptidoglykany, lipidy, fosfolipidya další složky buněk. Kromě fixace buněkslouží EPM jako vysoce selektivní sítoovlivňující pohyb plynů, rozpuštěnýchsolí a makromolekul do a z jednotlivýchmikrokolonií biofilmu.

Jinou významnou vlastností biofilmů jevychytávání a hromadění živin a organic-kých látek z okolního prostředí, což umož-ňuje bakteriím růst i v extrémně oligotrof-ních podmínkách. Biofilmy mohou takézadržovat a skladovat organické složky,které se později rozkládají v přítomnostiextracelulárních enzymů produkovanýchbakteriemi. Tak jsou schopny rozkládatvysokomolekulární látky, jako např. lig-nin, které jsou jinak jako potravní zdrojpro volně žijící buňky nedostupné. Dalšífunkcí EPM je velmi účinná ochrana přednepříznivými účinky vnějšího prostředí.

Struktura a fungování biofilmuStruktura vlastního biofilmu závisí na in -terakcích, jež v něm probíhají mezi fyzi-kálními a biologickými procesy. V pro-středí s vyšší rychlostí proudění, kdedochází k silnému tlaku na odtrhávání,jsou biofilmy hustší a hladší, naopak ty,které rostou při pomalejším proudění, jsouvíce porézní. Plně vyzrálý biofilm není ho -mogenní, ale má heterogenní strukturu –buňky a kupy buněk rozptýlených v ma -trici s mezerami a kanálky naplněnýmivodou a propojenými s okolní kapalnoufází. Z různých pozorování a měření, pře-devším za použití laserového konfokální-ho mikroskopu, byl vytvořen trojrozměrnýmodel architektury biofilmu (obr. 2). Bak-terie jsou v něm rozloženy nerovnoměrně,rostou v mikrokoloniích – shlucích kuže-lovitého nebo houbovitého tvaru – na -vzájem spojených spletitými kanálky, ježmohou většími mikrokoloniemi i prochá-zet; tyto kanálky jsou však tenčí.

Okolní kapalina obsahuje molekulyživin a dalších nezbytných organickýcha anorganických látek, prostřednictvímkanálků a pórů v mikrokoloniích vstupu-je do biofilmu, těmito živinami ho záso-buje a naopak odnáší metabolické pro-dukty. Z kanálků proudí kapalina póry donitra větších mikrokolonií a dále se jiždostává pouhou difuzí. Ta je však účinnápouze do určité hloubky biofilmu. S ros-toucí hloubkou proto dochází ke zřetel-nému úbytku koncentrace kyslíku a dal-ších životně důležitých látek. Protožematrice izoluje mikrokolonie od proudícíkapaliny, umožňuje biofilmová vrstva me -tabolické aktivity zcela odlišné od okolí.Tak je možné, aby např. anaerobní aktivity(produkce metanu) probíhaly v aerobnímprostředí a aerobní i anaerobní procesy,

živa 3/2012 105 ziva.avcr.cz

3

4

jako např. oxidace sulfidů a redukce síra-nů, v odlišných vrstvách téhož biofilmu.Struktura biofilmu a koncentrační gra -dienty různých látek se odrážejí rovněžv distribuci metabolicky aktivních a ne -aktivních buněk: v bazální části jsou obvyk -le buňky neživé, zatímco v nejsvrchnějšívrstvě dominují rostoucí buňky. Zdá se, žeběhem vývoje biofilmu primární kolonizá -toři – aerobní bakterie, které byly původ-ně v kontaktu s okolní kapalinou, přerostlyvyvíjejícím se biofilmem, staly se neaktiv-ními a postupně odumírají.

Buňky v biofilmu vzájemně metabolickyspolupracují a dochází u nich k vyššímustupni genetické výměny – díky poměrněúzkému kontaktu se mezi nimi intenziv-ně vyměňuje genetická informace, zvláš-tě konjugací a přenosem plazmidů. Tímtozpůsobem se mohou mezi jednotlivýmipopulacemi v biofilmu rychle šířit např.plazmidy kódující rezistenci k antibioti-kům (viz také seriál Horizontální přenosgenetické informace; Živa 2006, 1–6).

Regulace tvorby biofilmuNěkteré buňky se z kolonií odlučují, pře-cházejí do planktonního stavu a mohoukolonizovat další části povrchu. Pravdě-podobnou příčinou tohoto chování je zvy-šující se konkurence mezi buňkami v bio-filmu. Produkované chemické signályupozorňují okolní buňky na jejich přítom-nost a zabraňují dalšímu zahušťování po -pulace. Produkce signálních látek stoupáse zvyšující se hustotou populace a tytolátky se ve vysokých koncentracích hro-madí v buňkách a jejich okolí. Tento způ-sob vnitrobiofilmové komunikace se ozna-čuje pojmem vnímání množství (quorumsensing, QS) a v současnosti už mámeo tomto fenoménu řadu informací. Quo-rum sensing byl poprvé rozpoznán v 70.letech 20. stol. u mořské bakterie Vibriofischeri, kde kontroluje luminiscenci. Tytobakterie fungují často jako mutualistickýsvětelný orgán (fotofor) v symbióze s urči-tými mořskými organismy a jsou schopnéluminiscence pouze tehdy, když dosáhnoudostatečné buněčné hustoty. Dosud bylopopsáno několik rozdílných typů signá-lu – gramnegativní bakterie využívají jakosignální molekulu v QS systému nejčas-těji N-acyl-homoserin laktony složenéz mastné kyseliny a aminokyseliny serinu,u grampozitivních mikrobů jde obvykleo krátké oligopeptidy, které lze přirovnatk feromonům nebo hormonům. Signálnílátky řídí dělení buněk, a tím hustotu po -pulace v biofilmu a tvorbu slizové polysa -charidové matrice.

Mezibuněčná komunikace zprostředko-vaná QS systémem se podílí na regulacitvorby biofilmu a ovlivňuje zároveň expre-si faktorů virulence u celé řady patogen-ních bakterií. Absence jedné či několikasložek QS systému může způsobit výraz-né snížení virulence. Otázkou je, jaký mápro bakterie vlastně význam tato kontrolapomocí QS. Zdá se, že je ekonomické tvo-řit extracelulární faktory až poté, co bylodosaženo kritické populační hustoty. QStotiž umožňuje bakteriálnímu patogenukoordinovat syntézu extracelulárních fak-torů virulence tak, že se neuplatní v ranéfázi infekce, kdy je bakteriální populaceslabá. Naopak načasované pozdější uvol-

nění těchto faktorů umožní, že se patogendostatečně pomnoží bez přílišného upo-zorňování na svou přítomnost a pak pře-kvapí útokem, kdy vypustí faktory virulen-ce v koordinované a ohromující podobě.

Uvolňování buněk a šíření biofilmuAkumulace biofilmu na určitém povrchuje určována rovnováhou mezi procesypřichycení, růstu a disperze. Z těchto třídějů je zatím nejméně známo o disperzi –tedy uvolňování jednotlivých mikrobiál-ních buněk i jejich shluků obalených v ex -tracelulární matrici z biofilmu do okolníkapaliny a jejich další šíření. Bylo popsá-no několik mechanismů, jež mohou půso-bit jako významné faktory disperze, někte-ré z nich jsou čistě fyzikální, jiné mohoubýt založeny spíše na biologických princi-pech. Z hlediska fyzikálního je nejčastěj-ší působení hydraulických střižných sil(proudění kapaliny). Z biologického po -hledu se odtrhávání obvykle vysvětlujereakcí buněk na malé množství živin.Lokální nedostatek živin v biofilmu totiž

u některých buněk indukuje tzv. univer-zální odpověď na stres, jejímž výsledkemmůže být právě oddělování. Dříve byloodtrhávání části biofilmu považováno zapasivní chování závislé na rychlosti prou-dění nebo nedostatku živin. Může být všakchápáno i jako strategie, kterou bakterieaktivně kolonizují nové niky ještě dříve,než se prostor a živiny na jejich původnímmístě stanou limitujícími. Určité druhybakterií mohou totiž aktivně opouštět bio-film během procesu, který se v angličtiněnazývá rozptyl (dispersion) nebo rozpuš-tění, zánik (dissolution). Dochází k němupravděpodobně koordinací dvou kroků:štěpením extracelulární matrice produkcípolysacharidových lyáz nebo ektoenzymůa aktivací mobilních funkcí bakteriálníchbuněk (k nimž patří např. plavání pomocíbičíků). Předpokládá se, že tato aktivitapředstavuje závěrečný krok vývoje bio-filmu, v němž se buňky vracejí do plank-tonní fáze.

V příštím článku si povíme podrobnějio biofilmech ve vodním prostředí.

ziva.avcr.cz 106 živa 3/2012

5 Nárůst biofilmu bakterie Pseudomo-nas aeruginosa na filtru z umělých vláken určeného pro úpravu pitné vody.Foto D. Erben6 Biofilm na vnitřních stěnách pisoáru7 V biofilmu z pisoárů byly dominantnímikroskopické houby (např. Alternariaalternata a Cladosporium cladosporioi-des) a sinice. Snímky M. Rulíka, pokud není uvedeno jinak

5

6

7