Master 1: 13 Avril 2011

Cellules Immunocompétentes

CSHématopoïétique

CS lymphoïde

CS myéloïdeProgéniteur GranulocytesMonocytes

Polynucléaires PN/PE/PB

MonocytesMacrophages

Dendritiques

Lymphocytes BLymphocytes TCellules NK

Moelle osseuse Sang

Exp

lora

tion

de

l ’i

mm

un

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éd

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on

cellu

lair

e

Diagnostic des déficits immunitaires primitifs

Caractérisation et suivi des déficits immunitaires secondaires

Objectifs

Exp

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de

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mm

un

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cellu

lair

e

Elément clé dans la réponse immune adaptative

L’étude des lymphocytes permet l’identification et la séparation de sous populations fonctionnellement distinctes

Le lymphocyte

Sources de lymphocytes

Sang veineux périphérique +++

Les lymphocytes peuvent être étudiés après lyse des globules

ou Les lymphocytes sont isolés par

centrifugation sur gradient de ficoll Seuls les lymphocytes recirculants sont

accessibles

Exp

lora

tion

de

l ’i

mm

un

ite

à m

éd

iati

on

cellu

lair

eGradient de ficoll

Sources de lymphocytes

Organes lymphoïdes (Animaux d ’expérience, occasionnellement chez l ’homme)

Rate Thymus Ganglion lymphoïde

Tissu lymphoïde associé à l ’intestin: GALT Tissu lymphoïde associé aux bronches: BALT Tissu lymphoïde associé aux muqueuses: MALT Autres: épithélium, réaction locale (ex: Synovie pour la PR)

Lymphocytes:Caractérisation dans le sang

périphérique

Morphologie: Haut rapport nucléo-cytoplasmique Noyau à chromatine mottée 12 um Cytoplasme petit , basophile, quelques (peu)

granulations azurophiles

Les cellules lymphoïdes portent sur leur membrane de nombreux antigènes

Ces antigènes sont identifiables grâce à des anticorps monoclonaux

Certains antigènes sont des marqueurs de différenciation

Immunophénotypage lymphocytaire

La cytométrie en flux a une définition très large.

C ’est un système pour mesurer et analyser les signaux émis par des particules entraînées par un courant et examinées une par une à travers un faisceau de lumière.

CMF: Définition

La cytométrie en flux3 exigences

Analyse individuelle des cellules comme au microscope

Analyse rapide de très nombreuses cellules, ce qui permet d ’accroître la fiabilité statistique

Analyse plus précise Chaque paramètre est quantifié avec

précision Etude simultanée de plusieurs

paramètres

La CMF analyse les interactions des cellules avec un faisceau de lumière (laser)

Les signaux lumineux engendrés dépendent

- De caractéristiques propres aux cellules

- De la présence de marqueurs chimiques ayant réagit avec ces cellules

Bases de la CMF

Une source de lumière. Le ban optique permet de diriger et de focaliser le faisceau de lumière.

Un système fluidique. Courants liquides pour entraîner et réguler le flot de particules afin de centrer les particules par rapport au faisceau lumineux.

Un matériel électronique pour mesurer l ’intensité des signaux lumineux, enregistrer conserver et réinterpréter les informations, trier les cellules lorsqu ’un module trieur est associé à l ’analyseur.

Un ordinateur pour analyser les signaux lumineux et les comparer entre eux.

L’analyseur en cytométrie

Paramètres étudiés en CMF

Les lumières diffusées

- forward scatter : FS- Side scatter : SS

Les fluorescences

Paramètres étudiés en CMF

Paramètres étudiés en CMF

Répartition cellulaire en CMF

Grâce aux anticorps monoclonaux, il est possible de détecter à la surface des cellules (mais aussi dans le contenu cytoplasmique) la présence de marqueurs.

Ces anticorps sont couplés à des substances fluorescentes, ce qui les rend détectables.

Les fluorescences en CMF

Histogramme monoparamétrique

Histogrammes biparamétriques

Histogrammes biparamétriques

- +

Tri cellulaire

Tube de collecte

Laser

Plaques de déflexion

Veine liquide d’entraînement

Non sélectionnées

Caractérisation des cellules en cytométrie de flux

Les différentes populations cellulaires sont identifiées et distinguées au moyen d ’anticorps spécifiques de leurs molécules de surface.

La CMF permet aussi de compter les cellules d’après leurs antigènes de surface

Les lymphocytes T matures: CD2-CD3 Lymphocytes T auxiliaires: CD4 Lymphocytes T suppresseurs/cytotoxiques: CD8

Cellules NK: CD56-CD16

Lymphocytes B: CD19-CD20

Monocytes: CD14

Immunophénotypage 5 couleurs:CD45-CD3-CD4-CD8-CD20

Immunophénotypage 5 couleurs:CD45-CD2-CD56-CD19-CD3

Fénêtrage en CMF

- De très nombreux anticorps ont été produits

- Certains reconnaissent la même molécule sans cependant être dirigés contre le même épitope

- Des ateliers internationaux (Workshop) ont permis de comparer ces Acs et de regrouper les Ags qu’ils reconnaissent en classe de différenciation (CD)

Les antigènes de différenciation

Marqueurs des lymphocytes T

TCR CD2, CD5, CD7 CD3 CD4 CD8 CD28 CD40L CD25 LFA1, ICAM-1 CD45 RA/RO

Récepteur de l’Ag Marqueurs de lignée T Transduction du signal Liaison MHC II Liaison MHC I Co-activation/B7 Co-activation CD40 Récepteur à l’IL2 Molécules d’adhésion Marqueurs de différenciation

Marqueurs des lymphocytes B

BCR CD19, CD20 CD79a/CD79b CD21 CD22, CD72 CD40 CD80/86

Récepteur de l’Ag Marqueurs de lignée B Transduction du signal Récepteur C3d/EBV Molécules d’adhésion Co-activation /CD4OL Co-activation /CD28

Caractérisation des cellules en cytométrie de flux

Comparaison compartiment mémoire et naïf CD45RO/CD45RA, CD62L, CD27

Marqueurs d’activation (CD25, CD69)

Cellules présentatrices (CP) : cellules dendritiques (CD myéloïdes et plasmacytoïdes), monocytes, lymphocytes B (CD11c/CD11b, CD123, DR, CD14, CD19)

Caractérisation fonctionnelle des lymphocytes

lymphocytes B naïfs (CD27 -, IgM +, IgD +)

lymphocytes B mémoires (CD27 +, IgM - IgD -)

lymphocytes B immatures (CD27 +, IgM +, IgD +)

lymphocytes T régulateurs (CD4+, CD25+, FoxP3+)

Marqueurs des cellules NK

KIR, LIR, CD94

NKp44,46,30,NKG2D

CD16

LFA-1, CD18/11, CD56

CD2

RIL2, RIL12, RIL15..

NK Récepteurs /CMH I

Récepteurs de cytotoxicité

Récepteur Fc IgG

Molécules d’adhésion

Co-activation

Récepteurs de cytokines

CD3-, CD56+et/ou CD16+

Compartiments cellulaires du système immunitaire

Seuls 2% des lymphocytes totaux se retrouvent dans le sang circulant.

Les cellules recirculent en permanence des tissus lymphoïdes vers le sang, la lymphe puis retour aux organes lymphoïdes.

La majorité des cellules se trouvent temporairement dans les organes lymphoïdes I (MO, thymus) ou II (rate, ganglion, plaque de Peyer)

Les relations entre les taux de lymphocytes dans le sang et les différents tissus ne sont pas connues

Répartition tissulaire des lymphocytes

Lymphos T Lymphos B Cellules NK

Sang périphérique

70-80% 10-15% 10-15%

Moelle osseuse

5-10% 80-90% 5-10%

Thymus 99% <1% <1%

Ganglion 70-80% 20-30% <1%

Rate 30-40% 50-60% 1-5%

Méthodes de séparation des lymphocytes

FACS: “Fluorescence activated cell sorter “ Rosette E:Les cellules T se lient sélectivement à des

globules rouges de mouton formant des rosettes.Une couronne de GR se forme autour des Lymphocytes T qui sédimentent et se séparent des autres cellules.

Microbilles: Des microbilles magnétiques recouvertes d ’anticorps monoclonaux spécifiques d ’un marqueur membranaire sont mises en présence de la suspension cellulaire. Le tube est alors placé dans un champ magnétique puissant qui retient les billes et les cellules qui y sont attachées

Paning ou élimination des cellules porteuses d ’un marqueur à l ’aide d ’Acs fixant le complément

Tri sur microbilles

Evaluation fonctionnelle des lymphocytes T

Réactions d ’hypersensibilité retardée

Réactions d  ’HSR in vivo

Test tuberculinique Test au DNCB

Intradermoréaction

Lecture : taille de l’induration à 48-72 heures

Antigènes:

TuberculineCandidineAnatoxine tétaniqueAnatoxine diphtériqueTrychophyton

Proliférations lymphocytaires

Au cours de la réponse adaptative , des lymphocytes spécifiques de l’antigène vont proliférer avant de se différencier en cellules effectrices.

La phase de prolifération est indispensable pour engendrer un nombre de cellules effectrices suffisant.

A la différence de la plupart des autres cellules de l’organisme les lymphocytes n’atteignent le stade terminal de leur différenciation qu’après avoir été stimulés par un antigène

Proliférations lymphocytaires

Il est difficile de détecter la prolifération de lymphocytes normaux en réponse à un antigène spécifique , parce que seule une proportion très faible de ces cellules va être stimulée et se diviser.

Certaines substances, les mitogènes induisent la prolifération de beaucoup de lymphocytes voir de tous

Si la stimulation par les mitogènes est non spécifique, cependant elle déclenche une réponse cellulaire identique à la réponse observée en cas de stimulation antigénique

Les mitogènes

La plupart des mitogènes polyclonaux sont des lectines d’origine végétale ou animale.

Ils sont très utiles pour étudier la capacité des

lymphocytes à répondre à un stimulus non spécifique.

Certaines lectines peuvent présenter une certaine spécificité à l’égard d’un type cellulaire

Mitogènes non spécifiques

Concanavalline A: ConA (T)

Phytohémagglutine: PHA (T)

Pokeweed mitogen: PWM (T et B)

Extrait de Nocardia opaca: NWSM

Autres activateurs polyclonaux

Anticorps: Anti-cellules T: anti CD3 Anti-immunoglobulines

Endotoxines bactériennes (B)

Protéine A du staphylocoque (B)

Sulfate de dextran (polysaccharide)

Virus: EBV

Sélectivité des activateurs

La PHA (phytohémagglutinine A) et la ConA (concanavaline A) sont spécifiques des cellules T

Les endotoxines activent électivement les lymphocytes B

Le Pokeweed stimule à la fois les cellules T et les cellules B.

L’activation des cellules B par les endotoxines et la protéine A du staphylocoque ne nécessite pas la présence de cellule T alors que celle induite par le pokeweed la requiert.

Proliférations lymphocytaires spécifiques

Réponse allogénique: la réaction lymphocytaire mixte:

met en présence des cellules T répondantes et des cellules stimulantes irradiées

Ne nécessite pas de préimmunisation

Réponse antigénique après présensibilisation in vivo Vaccination antérieure Infection fréquente

Mise en évidence de l’activation

Observation des cellules au microscope

Mesure de l’incorporation de précurseurs radiomarqués d’ADN (thymidine tritiée), d’ARN ou des protéines dont la synthèse est augmentée.

Incorporation de BrdU

Analyse du cycle cellulaire

Diminution du CFSE

Le cycle cellulaire

La phase G0 correspond à un état de repos. Au cours de la phase G1 la cycle entre en

cycle. La taille de la cellule augmente, ainsi que son contenu en ARN et en protéines.

Au cours de la phase S la cellule synthétise de l’ADN

La phase G2 précède le stade M qui correspond à la division de la cellule-mère

Fonction effectrice des LyT

La fonction effectrice des LyT peut être évaluée par le dosage de médiateurs tels que cytokines et cytotoxines

Le dosage des cytokines peut être réalisé par ELISA sandwich ou test ELISPOT

Mesures de la production d ’interleukines

Méthodes:

RIA ELISA Luminex CMF Elispot: sécrétion Effet biologique

Différenciation des lymphocytes T CD4+

TH0

IL-2IL-4IFNg

TH2

IL-4IL-5IL-6IL-10

TH1

IL-2IFN gTNF b

Lymphocytes T CD4 auxiliaires

Lymphocytes T CD4 inflammatoires

Cytotoxicité non restreinte au CMH

Les cellules NK

Morphologie: Lymphocyte de grande taille

Phénotype: CD56+; CD57+; CD16+; CD3-

Cible cellulaire:lignée K 562-

Etude des fonctions des cellules phagocytaires

Locomotion

Capacité d ’ingestion

Métabolisme oxydatif

Bactéricidie

Sécrétion de cytokines

Etude de l’adhérence

Expression des molécules d’adhérence à la surface des PN

Sang total à +4°C Etat de base + fMLP à 37°C Capacité de réponse des

PN

Ac anti-CD15, CD11b, CD18, CD62L

Repos Stimulation

Etude du mouvement

Etude du contenu des granules

Morphologie: Aspect des PN sur frottis

Mesure de la capacité à dégranuler après stimulationCMF: CD11b, CD35…ELISA: libération du contenu granulaire dans le

milieu extracellulaire

Histochimie: mesure des différents marqueurs des granulations

granulations azurophiles: MPOgranules spécifiques: CD11bgranules sécrétoires: CD35

Etude de l’ingestion

Adhérence de E.Coli à la surface des cellules phagocytaires : CMF

Ingestion de levure: MOIngestion de E. Coli opsonisées: CMF

Etude du métabolisme oxydatif

Activation des phagocytes par des stimuliSolubles: PMA, fMLP, endotoxineParticulaires: zymosan, bactéries opsonisées

Mesure de la production globale des formes réactives de l’oxygène

Réduction du cytochrome c: spectrophotométrieChimioluminescence

Evaluation du % des PN produisant des FRORéduction cytochimique du NBTCMF

CONCLUSION:Applications futures

Ces nouveaux examens permettront d'améliorer la prise en charge de certaines pathologies:

* La transplantation d'organe.Prévention du rejetSurveillance des traitements IS

* Caratérisation des déficits immunitaires, MAI* Mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l'induction de la tolérance * Cancers, maladies auto-immunes, maladies chroniques ou tout simplement dues au grand âge,

Merci pour votre attention….