MASTER RAD - pmf.ni.ac.rs · Ključne reči: Pinus mugo, etarsko ulje, varijabilnost, biološka aktivnost ABSTRACT This master paper includes analysis of chemical composition of essential

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Biološka aktivnost i varijabilnost hemijskog sastava

etarskog ulja Pinus mugo (Pinaceae)

MASTER RAD

Kandidat: Mentor:

Jelena Stojanović 185 Dr Zorica S. Mitić

Niš, 2017.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Biological activity and variability of chemical composition

of the essential oil of Pinus mugo (Pinaceae)

MASTER THESIS

Candidate: Mentor:

Jelena Stojanović 185 Dr. Zorica S. Mitić

Niš, 2017.

BIOGRAFIJA KANDIDATA

Jelena Stojanović rođena je 18. oktobra 1993. godine u Vranju, gde 2008. godine

završava osnovnu, a 2012. godine gimnaziju „Bora Stanković“ sa odličnim uspehom.

Prirodno-matematički fakultet u Nišu upisuje 2012. godine na Departmanu za biologiju i

ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2015. godine i iste godine upisuje Master

akademske studije, smer Biologija, koje u predviđenom roku završava.

ZAHVALNICA

Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru doc. dr Zorici Mitić na razumevanju,

strpljenju, nesebičnoj pomoći i savetima koje mi je pružila tokom izrade i pisanja master

rada. Takođe, najlepše se zahvaljujem i članovima Komisije za ocenu master rada prof. dr

Gordani Stojanović i prof. dr Petru Marinu.

Veliku zahvalnost dugujem i prof. dr Bojanu Zlatkoviću na dragocenoj pomoći u

sakupljanju biljnog materijala kao i doc. dr Snežani Jovanović na pomoći u realizaciji

hemijskih analiza. Zahvaljujem se i prof. dr Vladimiru Ranđeloviću na izradi geografske

karte distribucije koja prati ovaj master rad.

Na kraju, posebnu zahvalnost dugujem dragim ljudima oko sebe bez kojih ne bih

mogla da ostvarim svoje zamisli, a posebno sam zahvalna svojoj porodici i prijateljima na

pruženoj podršci, motivaciji i ljubavi.

Beskrajnu zahvalnost dugujem svojoj majci, osobi koja mi je bila najveća podrška u

životu.

Veliko Hvala!

SAŽETAK

U master radu je analiziran hemijski sastav etarskog ulja izolovanog hidro-

destilacijom iz četina Pinus mugo sa područja Kosova i Metohije (Šar-planina). Rezultati su

upoređeni sa literaturnim podacima o sastavu ulja krivulja poreklom iz različitih organa

biljke. Etarsko ulje četina P. mugo sa pomenutog područja odlikuje dominacija monoterpena

(75.7%) sa δ-3-karenom (21.3%) i α-pinenom (18.0%) kao glavnim komponentama. Sledeći

najzastupljeniji monoterpeni, limonen + β-felandren, terpinolen i bornil-acetat, detektovani su

u umerenim koncentracijama (7.6, 5.5 i 5.1%, respektivno). Sa druge strane, germakren D

(5.6%) i (E)-kariofilen (5.0%) predstavljaju najznačajnije metabolite u okviru

seskviterpenske frakcije koja čini 21.9% ulja. Manoil-oksid je jedina diterpenska komponenta

detektovana u koncentraciji manjoj od 1%. Na osnovu dosadašnjih istraživanja možemo

konstatovati da postoji velika varijabilnost hemijskog sastava ulja koje potiče iz različitih

organa, ali istovremeno i iz različitih delova areala pomenute vrste. Međutim, u većini

dosadašnjih istraživanja utvrđeno je da monoterpeni predstavljaju dominantnu grupu

jedinjenja u etarskom ulju krivulja, bez obzira na tip organa iz kojeg je ulje izolovano (četine,

izdanci ili šišarke) ili poreklo biljnog materijala (populacija iz prirode ili botanička bašta). U

odnosu na ostale vrste borova, prema dostupnim literaturnim podacima, etarsko ulje P. mugo

je relativno slabo ispitivano sa aspekta bioloških aktivnosti. Do sada je utvrđeno da poseduje

značajan antibakterijski (naročito protiv Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes i

Streptococcus agalactiae) i antioksidativni potencijal, dok se sa druge strane odlikuje

potpunim odsustvom larvicidne aktivnosti protiv moljca duvana Spodoptera litura.

Ključne reči: Pinus mugo, etarsko ulje, varijabilnost, biološka aktivnost

ABSTRACT

This master paper includes analysis of chemical composition of essential oils isolated

from needles of Pinus mugo from the territory of Kosovo and Metohija (Šar-planina) by

hydrodistillation. The results were compared to literature data on composition of P. mugo

essential oils collected from different plant organs. The essential oil of P. mugo needles from

the study area was characterized by dominance of monoterpenes (75.7%) with δ-3-carene

(21.3%) and α-pinene (18.0%) as the main components. The next group of the most abundant

monoterpenes, limonene + β-phellandrene, terpinolene and bornyl acetate, was detected in

moderate concentrations (7.6, 5.5 and 5.1%, respectively). On the other hand, germacrene D

(5.6%) and (E)-caryophyllene (5.0%) represent the most important metabolites within the

sesquiterpene fraction which forms 21.9% of studied oil. Manoyl oxide was the only

diterpene component, detected in concentration lower than 1%. According to the existing

studies it may be concluded that there is high variability in chemical composition of oils

collected from different organs, but also from different parts of range of P. mugo. However,

the results of most previous studies indicated that monoterpenes are the dominant group of

compounds in the essential oil of P. mugo, regardless of the type of organ from which the oil

was extracted (needles, twigs or cones) or origin of plant material (wild population or from

botanical garden). In comparison to other pine species, available literature data indicate that

essential oil of P. mugo was relatively poorly studied from the aspect of biological activity.

So far there is evidence of significant antibacterial (especially against Streptococcus

pneumoniae, Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae) and antioxidant

potential, while on the other hand there was a complete absence of any larvicide activity

against tobacco cutworm Spodoptera litura.

Keywords: Pinus mugo, essential oil, variability, biological activity

SADRŽAJ

1. UVOD .................................................................................................................................... 1

1.1. Opšte karakterisitke vrste Pinus mugo ............................................................................ 1

1.1.1. Habitus i anatomija .................................................................................................. 1

1.1.2. Stanište i distribucija ................................................................................................ 1

1.1.3. Privredni značaj........................................................................................................ 3

1.2. Opšte karakteristike etarskog ulja ................................................................................... 4

1.2.1. Fizičke osobine ........................................................................................................ 5

1.2.2. Hemijski sastav ........................................................................................................ 6

1.2.3. Varijabilnost sadržaja i sastava etarskog ulja .......................................................... 6

1.2.4. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja borova ................................................ 7

2. CILJEVI RADA ................................................................................................................... 9

3. MATERIJAL I METODE ................................................................................................ 10

3.1. Biljni materijal .............................................................................................................. 10

3.2. Izolacija etarskog ulja (hidro-destilacija) ..................................................................... 11

3.3. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja ........................................................................ 11

3.4. Identifikacija komponenti ............................................................................................. 12

4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................. 13

4.1. Hemijski sastav etarskog ulja P. mugo ......................................................................... 13

4.1.1. Etarsko ulje četina .................................................................................................. 13

4.1.2. Etarsko ulje izdanaka ............................................................................................. 23

4.1.3. Etarsko ulje četina i izdanaka................................................................................. 23

4.1.4. Etarsko ulje šišarki ................................................................................................. 24

4.2. Biološka aktivnost etarskog ulja P. mugo ..................................................................... 30

4.2.1. Antimikrobna aktivnost ......................................................................................... 30

4.2.2. Insekticidna aktivnost ............................................................................................ 31

4.2.3. Antioksidativna aktivnost ...................................................................................... 31

5. ZAKLJUČCI ...................................................................................................................... 33

6. LITERATURA ................................................................................................................... 35

Jelena Stojanović Master rad

1

1. UVOD

1.1. Opšte karakterisitke vrste Pinus mugo

1.1.1. Habitus i anatomija

Pinus mugo Turra (Pinaceae) - krivulj, planinski bor, klekovina je žbun retko viši od 3

(-4) m, sa krivim, ukošenim deblom, jednim ili više (slika 1.1). Kora je sivosmeđa, sa

nepravilnim ljuspama. Mlade grančice gole, svetlozelene, kasnije smeđe do crnkastosive.

Pupoljci su jako smolasti, dugi do 6 mm, sa kratkim vrhom. Četine po dve, traju 3-6 godina,

gusto stojeće, povijene na grani, malo uvrnute, tamnozelene, duge 3-8 cm, široke 2 mm.

Smoni kanali subepidermalno, 2-6 na preseku. Epidermalne ćelije palisadnog oblika, dva puta

više nego što su široke. Muške resolike šišarke (mikrostrobilusi) duge do 15 mm, na

prošlogodišnjem izbojku. Ženske šišarke (makro-, megastrobilusi) su jajolike do jajoliko-

konične, duge 2-6 cm, široke 1.5-2 cm. Apofize rombične do kvadratne, piramidalne ili

ravne. Grbica (umbo) izrazita, uokvirena tamnim prstenom. Zreli semeni zameci dugi do 5

mm, sa 2-3 puta dužim krilastim dodatkom. Oprašivanje je anemofilno, muški i ženski

strobilusi se pojavljuju VI-VII meseca, semeni zameci sazrevaju krajem druge godine

(Jovanović, 1992).

1.1.2. Stanište i distribucija

Habitus krivulja odražava teške, u prvom redu klimatske, uslove pod kojima on živi;

to su granični uslovi za život šumskog drveća, sa kratkim vegetacionim periodom (3-4

meseca) (slika 1.1). Na Suvoj planini se javlja u fitocenozi Sorbo-Pinetum mugo B. Jov.,

1953. Na Prokletijama (Koprivnik, Streočke planine) krivulj raste u fitocenozi Wulfenio-

Pinetum mugo M. Jank. et Bog., 1967. na kiselom humusno-silikatnom zemljištu, Pinetum

mugo serpentinicum M. Jank., 1982. i nekim drugim (Jovanović, 1992).


2

Slika 1.1. P. mugo sa Kosova i Metohije (Šar-planina, Ostrovica; foto: Zlatković, 2016).


3

Prema Flori Evrope (Gaussen et al., 1993) i Atlasu Flore Evrope (Jalas i Suominen,

1972), P. mugo je endemičan za Evropski kontinent i može se naći na planinama srednje

Evrope, Balkanskog poluostrva, i centralnog dela Apeninskog poluostrva. Pripadnost flornom

elementu: Srednjo-južnoevropski planinski (temp-submerid) – subalp-alp (Jovanović, 1992).

Na slici 1.2 je prikazana distribucija žbunastih taksona P. mugo kompleksa prema

Hamerník i Musil (2007): P. mugo sensu stricto (=var. mugo) i P. x pseudopumilio (=var.

pumilio).

Za područje Srbije, Jovanović (1992) navodi sledeće lokalitete: istočna Srbija - Suva

planina (Trem), Stara planina (Tri čuke, Tri kladenca); Metohija – Prokletije (Koprivnik,

Lumbardska planina, Nedžinat, Derviš kom, Đaravica, Juničke planine), Žljeb, Hajla, Maja

Rusolija, Mokra planina, Paštrik, Koritnik, Ošljak, Kodža Balkan; Kosovo – Šar-planina

(ispod Jažinačkog jezera, Jelovarnik), Ostrovica.

1.1.3. Privredni značaj

S obzirom na to da raste i na staništima gde druge drvenaste vrste ne uspevaju, veoma

je značajan kao pionirska vrsta i čuvar zemljišta na starim, visokim planinskim terenima. Kao

"armatura" snežnih masa služi kao zaštita od lavina (zaštitne šume). Drvo sa

crvenkastosmeđom srčevinom i žućkastom beljikom, tvrdo i teško pogodno je za rezbarstvo i

Slika 1.2. Distribucija žbunastih taksona P. mugo kompleksa: mu (tamno zelena površina) –

P. mugo Turra (sensu stricto); pp (ljubičasta površina) – Pinus x pseudopumilio; svetlo

zelena površina predstavlja nesigurni deo areala (Hamerník i Musil, 2007).


4

gorivo (na planinskim pašnjacima). Iz četina se dobija etarsko ulje, koje se koristi u

kozmetičkoj industriji. Krivulj je korišćen u protiverozionim radovima i hortikulturi

(Jovanović, 1992).

1.2. Opšte karakteristike etarskog ulja

Etarska ulja predstavljaju specifične, najčešće tečne produkte biljnih tkiva. To su više

ili manje složene smeše isparljivih monoterpena, seskiviterpena i fenilpropanska jedinjenja

(Kovačević, 2004).

Etarska ulja su uglavnom lako pokretljive, mirisne tečnosti; pojedina su na sobnoj

temperaturi viskozna ili čvrste konzistencije. Glavni sastojci etarskih ulja su monoterpeni,

seskviterpeni i u manjoj meri derivati fenilpropana. To su različiti ugljovodonici (zasićeni ili

nezasićeni), alkoholi, fenoli, estri, aldehidi, ketoni, epoksidi ili karboksilne kiseline. Etarska

ulja su smeše oko 20-200 sastojaka. Ovi sastojci su, na osnovu koncentracije u etarskom ulju,

podeljeni na: glavne (20-95%), sporedne (1-20%) i zastupljene u tragovima (ispod 1%).

Etarska ulja su uglavnom produkti kopnenih biljaka (Embryophyta). Biljke koje

sadrže etarska ulja nazivaju se aromatičnim biljkama. Ove biljke su raspoređene u preko

pedeset familija, a najpoznatije su aromatične biljke familija Pinaceae, Cupressaceae,

Lauraceae, Zingiberaceae, Myrtaceae, Rutaceae, Lamiaceae, Apiaceae i Asteraceae. Etarska

ulja su lokalizovana u različitim delovima biljaka (korenu, rizomu, stablu, kori, semenu,

listovima, cvetovima i plodovima). Interensantno je da za jednu istu vrstu sastav etarskih ulja

varijabilan za različite organe, što zavisi od uslova sredine.

Prinosi etarskih ulja se obično kreću između 0.2 i 2.0%, mada postoje znatna

odstupanja. U zavisnosti od sadržaja etarskog ulja koji može da varira (prinos izuzetno

cenjenog ružinog ulja često ne prelazi 0.03%, dok prinos nekih drugih ulja može dostizati i

do 20%, npr. etarsko ulje karanfilića) biljke su podeljene u red bogatih ili siromašnih uljem

(Gašić, 1985).

Ove mirisne tečnosti nastaju u biljkama aktivnošću endogenih i egzogenih sekretornih

tkiva, koja se mogu javiti u obliku pojedinačnih ćelija u parenhimskim tkivima, žlezdanog

epitela šupljina ili kanala. Mada sekretorne ćelije nekada mogu biti organizovane i u

specijalne strukture, žlezde i žlezdane dlake.


5

Biološka funkcija etarskih ulja povezana je sa atraktantnim delovanjem na insekte,

čime je obezbeđeno prenošenje polena i oprašivanje biljaka. Sa druge strane, veoma je

značajna i uloga etarskih ulja u zaštiti biljaka od napada insekata i životinja, herbivora.

Takođe, gotovo sva ulja više ili manje intenzivno sprečavaju razvoj mikroorganizama, i tako

suzbijaju širenje infekcija na biljkama u kojima nastaju. Interesantni su i podaci o specifičnim

efektima ulja jedne biljke, koje prelazi u podlogu i inhibira klijanje semena drugih biljaka

(alelopatija). Neka etarska ulja sprečavaju klijanje sopstvenih semena i obezbuđuju životni

prostor svake individue. Stara je teorija, koja samo delimično može biti prihvaćena, da biljke

sintezom i odavanjem ovih isparljivih produkata stvaraju specifičnu mikroklimu, koja ih štiti

od prekomerne transpiracije u različitim nepovoljnim uslovima (Kovačević, 2004).

1.2.1. Fizičke osobine

Na sobnoj temperaturi, etarska ulja su najčešće tečnosti, ređe imaju viskoznu ili

polučvrstu konzistenciju (Kovačević, 2004). Lako su pokretljiva, bezbojna, žuta ili

žutozelena; pojedina su specifično obojena (npr. etarsko ulje cimeta i karanfilića

smeđecrveno). Droge sa proazulenima daju destilacijom vodenom parom plavo ili zeleno

obojena etarska ulja (npr. plava etarska ulja daju Matricariae flos, Absinthii herba i Millefolii

herba). Miris etarskih ulja potiče od sastojaka sa kiseoničnim funkcionalnim grupama. On je

intenzivan čak i kada su ovi sastojci zastupljeni u niskom procentu (etarsko ulje limuna)

(Petrović et al., 2009).

Etarska ulja su lipofilna, rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima, etanolu,

mastima i masnim uljima. Generalno, etarska ulja se ne rastvaraju u vodi. U stvari, samo mali

broj sastojaka ulja je rastvorljiv; ovakvi proizvodi nazivaju se aromatične vode.

Kao tečnosti, etarska ulja su definisana nekim fizičkim konstantama. Relativna

gustina ulja može biti manja ili veća od 1; ipak neuporedivo je manji broj etarskih ulja čija je

relativna gustina veća od 1. Kao parametar kvaliteta, značajne su vrednosti indeksa refrakcije

i ugla skretanja ravni polarizovane svetlosti. Kao specifična karakteristika definisana je i

rastvorljivost etarskog ulja u etanolu određenog razblaženja.

Specifičnost ove grupe biljnih proizvoda je da nemaju tačno definisanu temperaturu

ključanja. Pošto su to smeše različitih jedinjenja, svako od njih isparava na svojoj temperaturi

ključanja. Tako, etarska ulja frakciono ključaju u intervalu od 150-350 °C (Kovačević, 2004).


6

1.2.2. Hemijski sastav

Etarska ulja su složene mešavine dve različite klase jedinjenja: terpena i

fenilpropanskih derivata. U okviru terpenske frakcije, zastupljeni su isparljivi mono- i

seskviterpeni.

Monoterpeni se javljaju u obliku acikličnih (linearnih), mono- i bicikličnih, alifatičnih

i aromatičnih struktura. Na osnovu uvedenih funkcionalnih grupa, sastojci ulja mogu biti

ugljovodonici, alkoholi, aldehidi, ketoni, kiseline, estri, fenoli, etri, oksidi, peroksidi,

epoksidi.

U okviru frakcije seskviterpena, formirane su još raznovrsnije strukture osnovnog

skeleta; zbog dužine lanaca C atoma veća je mogućnost različitih ciklizacija. I ova grupa

terpena javlja se u obliku ugljovodonika, oksida, alkohola, ketona i estara.

U etarskim uljima su aromatični, fenilpropanski sastojci (C6-C3) zastupljeni u manjim

količinama. Postoje i izuzeci, kada glavninu ulja čine upravo ovakva jedinjenja. Najčešće su

to aril- ili propenilfenoli (eugenol, anetol) i aldehidi (cimetni aldehid). Ovakva jedinjenja su

uglavnom prisutna u etarskom ulju biljaka iz familija Apiaceae i Myrtaceae. Kao sastojci

etarskih ulja sreću se i C6-C1 jedinjenja, kao što je vanilin i derivati antranilne kiseline.

Tokom destilacije, iz biljne sirovine mogu predestilisati i različita alifatična jedinjenja

manje molekulske mase (zasićeni i nezasićeni ugljovodonici, alkoholi, aldehidi, estri, laktoni)

koji se rastvaraju u etarskom ulju i postaju njegov sastavni deo. Takođe, kod nekih droga koje

su izložene fermentaciji ili torefakciji, na primer, male količine prisutnog etarskog ulja

postaju obogaćene sumpornim i azotnim jedinjenjima koja nastaju tokom tih specifičnih

procesa; time se formira specifična aroma ovakvih droga (seme kafe, kakaovca; Kovačević,

2004).

1.2.3. Varijabilnost sadržaja i sastava etarskog ulja

Kao što je slučaj i s drugim sekundarnim metabolitima biljaka, i produkcija etarskih

ulja je genetski definisana. Samo do nekih granica, genetska kontrola je podložna uticajima

endogenih i egzogenih faktora. Ne postoje opšta pravila, tako da neke biljne vrste u različitim

klimatskim uslovima i različitim delovima sveta proizvode približne količine etarskog ulja,

gotovo identičnog sastava. S druge strane, pojedinačne jedinke u okviru iste populacije


7

biljaka mogu sintetisati međusobno različita etarska ulja. Ovakva varijabilnost biljnog

genoma, omogućava pojavu različitih hemijskih rasa (hemotipova biljaka), kao i mogućnost

izdvajanja visokoproduktivnih linija, i njihovo vegetativno kloniranje.

Najvažniji faktori koji mogu uticati na sastav etarskog ulja neke vrste (jedinke) su:

• genotip,

• fenofaza ontogenetskog razvoja, što je veoma značajno za definisanje optimalnog

vremena prikupljanja biljnog materijala,

• ekološki faktori (faktori sredine),

• način obrade biljne sirovine,

• način izolacije etarskog ulja.

Temperatura, vlažnost i aeracija zemljišta, mineralne soli u podlozi, nadmorska

visina, dužina izloženosti svetlu i kvalitet svetlosti, vlažnost vazduha i vazdušna strujanja,

mogu da utiču na promenljivost količine etarskog ulja u biljnom materijalu.

Svaka obrada aromatične sirovine (sušenje, usitnjavanje, ekstrakcija) uslovljava

delimičan gubitak etarskog ulja i promene njegovog sastava. Procesom industrijske

ekstrakcije uvek se dobija oko 20% manje ulja nego u laboratorijskim uslovima (Kovačević,

2004).

1.2.4. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja borova

Prema Dervendzi (1992), etarsko ulje borova (Pini aetheroleum) najviše se koristi u

narodnoj medicini za lečenje respiratornih infekcija praćenih kašljem, bronhitisom,

bronhijalnom astom, efizemom, traheitisom, sinuzitisom, laringitisom, faringitisom i

influencom. Pored toga, etarska ulja borova široko se koriste kao aditivi u prehrambenoj i

industriji alkoholnih pića. U mnogim proizvodima namenjenim za čišćenje, ulja borova

poznata su kao osvežavajuća i dezinfekciona sredstva. Takođe, ova ulja intenzivno se koriste

u farmaceutskoj, kozmetičkoj i parfimerijskoj industriji.

Na osnovu pregleda literaturnih podataka, možemo reći da etarsko ulje borova

poseduje čitav niz bioloških aktivnosti:


8

• antibakterijsku i antifungalnu (Toroglu, 2007; Kolayli et al., 2009; Politeo et

al., 2011; Karapandzova et al., 2011; Šarac et al., 2014);

• akaricidnu (Macchioni et al., 2002);

• larvicidnu i repelentnu aktivnost protiv Diptera (Culicidae): Aedes albopictus

(Koutsaviti et al., 2015), Aedes aegypti i Culex quinquefasciatus

(Fayemiwo et al., 2014);

• herbicidnu aktivnost protiv Phalaris canariensis, Trifolium campestre i

Sinapis arvesis (Amri et al., 2014).

• antiagregantnu (antitrombocitnu; Tognolini et al., 2006);

• antikancerogenu (Hoai et al., 2015);

• antioksidativnu (Ustun et al., 2012).


9

2. CILJEVI RADA

Osnovni naučni ciljevi ovog istraživanja mogu se predstaviti u nekoliko teza:

1. Određivanje hemijskog sastava etarskog ulja četina poreklom iz jedne autohtone

populacije P. mugo sa područja Kosova i Metohije (Šar-planina)

2. Poređenje dobijenih rezultata sa literaturnim podacima o hemijskom sastavu

etarskog ulja P. mugo poreklom iz različitih organa biljke: četine, izdanci i

šišarke

3. Određivanje varijabilnosti sastava etarskog ulja P. mugo

4. Upoznavanje sa biološkim aktivnostima etarskog ulja P. mugo


10

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Biljni materijal

Biljni materijal (sveže četine) P. mugo sakupljen je u jednoj autohtonoj populaciji na

području Kosova i Metohije (Šar-planina, Ostrovica; tabela 3.1). Geografski položaj

populacije određen je uz pomoć GPS uređaja (GPS Garmin eTrex Vista® C). Orografske

karakteristike staništa, pre svega nadmorska visina i ekspozicija su preuzeti iz SRTM (Shuttle

Radar Topography Mission) (Reuter et al., 2007) digitalnog elevacionog modela rezolucije

90 x 90 m (Farr et al., 2007) pomoću softvera ArcGIS 10 (ESRI, 2011) (tabela 3.1).

Herbarski primerak je deponovan u Herbarijumu Departmana za biologiju i ekologiju,

Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu (“Herbarijum Moesiacum Niš” - HMN).

U odabranoj populaciji krivulja izvršeno je sakupljanje četina sa većeg broja odraslih

stabala. U ručnom frižideru materijal je sa mesta sakupljanja prenesen do zamrzivača (-20

°C) na skladištenje do momenta upotrebe.

Tabela 3.1. Geografski položaj i stanišne karakteristike odabrane populacije P. mugo.

Takson P. sylvestris

Lokalitet Šar-planina (Ostrovica)

Geografska širina (N) 42°14'12.80"

Geografska dužina (E) 20°55'13.53"

Nadmorska visina (m a.s.l.) 1734

Ekspozicija jugozapad

Geološka podloga serpentinit

Datum sakupljanja 13.08.2016.

Vaučer broj 12810 HMN


11

3.2. Izolacija etarskog ulja (hidro-destilacija)

Iz 335 g svežih i iseckanih četina P. mugo destilovano je etarsko ulje u aparatu tipa

Clavenger u toku 2.5 h. Ulje je ekstrahovano etrom, a etarski ekstrakt sušen anhidrovanim

Mg2SO4 (European Pharmacopoeia, 1983). Posle odvajanja sredstva za sušenje filtracijom,

etar je uklonjen destilacijom na rotacionom-vakuum uparivaču bez zagrevanja, a etarsko ulje

čuvano u zatvorenim hromatografskim vijalama na 4°C do analize. Prinos etarskog ulja je

izražen preko zapreminskih procenata (%) tj. w/w, obračunato u odnosu na 100 g biljnog

materijala. 40 µL svakog ulja razblaženo je etrom do 1mL za dalje hromatografske analize.

3.3. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja

Hemijski sastav etarskog ulja određen je pomoću GC-FID (gasna hromatografija sa

plameno jonizacionim detektorom) i GC-MS (gasna hromatografija-masena spektrometrija)

tehnika analize. Uzorak etarskog ulja koji je rastvoren u etru sniman je u triplikatu na

7890/7000B gasnom hromatografu (Agilent Technologies, USA) sa Combi PAL auto-

semplerom i HP-5 MS kolonom (5% fenil metil siloksan, 30 m x 0.25 mm i.d. i 0.25 µm

debljina filma) kuplovan sa plamenim jonizacionim detektorom 7890A (FID) i masenim

detektorom 5977A (MS). Temperaturni program: izotermalno prvih 2.25 minuta 50 °C, zatim

linearni porast temperature (gradijent 4 °C/min) od 50 do 290 °C. Temperatura injektora 250

°C, interfejsa 300 °C; protok nosećeg gasa – helijuma 1.0 mL/min. Injektovana zapremina

ulja 1µL, split 40:1. Bekfleš 1.89 min, na 280 °C, sa helijumom pod pritiskom od 50 psi. MS

uslovi (EI): jonizacija -70 eV, opseg masa 35 – 435 amu (3 skena u sekundi), vreme skenova

0.2 sekunde. GC-FID analiza je izvedena pod istim eksperimentalnim uslovima kao što je već

navedeno za GC-MS analizu. Procentni sastav je preračunat na osnovu površine GC-FID

pikova sa hromatograma snimljenih pod istim uslovima kao GC-MS, bez korekcionih

faktora.


12

3.4. Identifikacija komponenti

Komponente etarskog ulja identifikovane su pomoću AMDIS softvera (Automated

Mass Spectral Deconvolution and Identification System, Ver. 2.1, DTRA/NIST, 2011) na

osnovu lineranih retencionih indeksa (RI), koji su određeni na osnovu retencionih vremena

standardne serije n-alkana (C8-C40), snimljene na istom aparatu i pod istim uslovima kao i

uzorak ulja. RI su upoređivani sa literaturnim vrednostima (Adams, 2007 i NIST Chemistry

WebBook).


13

4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Hemijski sastav etarskog ulja P. mugo

4.1.1. Etarsko ulje četina

Biljni materijal P. mugo prikupljen je na Šar-planini (Ostrovica) sredinom avgusta

meseca 2016. godine (tabela 3.1). Iz svežih četina postupkom hidro-destilacije u aparatu po

Clevenger-u izolovano je etarsko ulje svetlo žute boje sa prinosom od 0.30% (w/w).

Kombinacijom GC-FID i GC-MS analize u etarskom ulju krivulja identifikovana je 71

komponenta čije su relativne koncentracije date u tabeli 4.1, a dobijeni hromatogram

prikazan je na slici 4.1. U cilju poređenja dobijenih rezultata sa literaturnim podacima u

tabeli 4.1. je, takođe, dat uporedni pregled pet studija sa sastavom etarskih ulja četina P.

mugo, koja su izolovana postupkom hidro-destilacije kao i u ovom radu (Kubeczka i

Schultze, 1987; Tsitsimpikou et al., 2001; Venditti et al., 2013; Ioannou et al., 2014; Hajdari

et al., 2015).

Etarsko ulje P. mugo, sa područja Šar-planine (ova studija), odlikuje dominacija

monoterpena (75.7%) sa δ-3-karenom (21.3%) i α-pinenom (18.0%) kao glavnim

komponentama. Sledeći najzastupljeniji monoterpeni, limonen + β-felandren, terpinolen i

bornil-acetat, detektovani su u umerenim koncentracijama (7.6, 5.5 i 5.1%, respektivno). Sa

druge strane, germakren D (5.6%) i (E)-kariofilen (5.0%) predstavljaju najznačajnije

metabolite u okviru seskviterpenske frakcije koja čini 21.9% ulja. Manoil-oksid je jedina

diterpenska komponenta detektovana u koncentraciji manjoj od 1%. Na ovaj način, prosečan

hemijski profil glavnih terpenskih komponenti (preko 5%) u etarskom ulju P. mugo možemo

predstaviti na sledeći način:

δ-3-karen > α-pinen >> limonen + β-felandren > germakren D = terpinolen = bornil-acetat =

(E)-kariofilen

(>> označava razliku od 5.1-15.0%, > razliku od 1.1-5.0%, = razliku od 0.1-1.0%, prema

Petrakis et al., 2001).

Jelena Stojanović_____________________________________________________________________________________________Master rad

14

(E)-kariofilen limonen β-felandren

3

germakren D

2

α-pinen

Slika 4.1. Hromatogram etarskog ulja četina P. mugo sa Šar-planine (Ostrovica).

2

1

3 4 7 6 5

δ-3-karen

1

terpinolen bornil-acetat

4 5 6 7

+

Jelena Stojanović______________________________________________ _______________________________________________Master rad

15

Tabela 4.1. Hemijski sastav etarskog ulja četina P. mugo izolovanog hidro-destilacijom.

Takson P. mugo P. mugo subsp.

mugo

P. mugo

subsp. mugo P. mugo

P. mugo var.

rostrata

P. mugo var.

pumilio

P. mugo

subsp.

mugo

P. mugo

P. mugo

subsp.

pumilio

Poreklo biljnog materijala

Kosovo,

Šar-

planina,

Ostrovica

Kosovo, Šar-

planina, različiti

sublokalitetia)

Kosovo,

Prokletije,

različiti

sublokalitetia)

Velika

Britanija,

Botanička

bašta

Univerziteta u

Kembridžu

Velika

Britanija,

Botanička

bašta

Univerziteta

u Kembridžu

Velika

Britanija,

Botanička

bašta

Univerziteta

u Kembridžu

Italija,

Nacionalni

park

Majela

Velika

Britanija,

Kraljevska

Botanička

bašta u

Edinburgu

Komercijalni

uzorak

Referenca ova studija Hajdari et al.

(2015)

Hajdari et al.

(2015)

Ioannou et al.

(2014)

Ioannou et

al. (2014)

Ioannou et

al. (2014)

Venditti et

al. (2013)

Tsitsimpikou

et al. (2001)

Kubeczka i

Schultze

(1987)

R.

br. Komponente Sadržaj (%)

min maks min maks

1. (Z)-2-Penten-1-ol tr - - - - - - - - - -

2. n-Heksanal 0.3 - - - - - - - - - -

3. (E)-2-Heksen-1-al 0.5 - - - - - - - - - -

4. (Z)-3-Heksen-1-ol 0.3 - - - - - - - - - -

5. (Z)-2-Heksen-1-ol tr - - - - - - - - - -

6. n-Heksanol 0.3 - - - - - - - - - -

7. Triciklen 0.8 0.7 0.9 0.9 1.1 0.5 1.6 1.7 - 1.2 0.4

8. α-Tujen 1.5 1.3 2.0 tr 1.0 1.2 - - - - -

9. α-Pinen 18.0 17.0 22.6 19.9 24.5 13.7 12.9 14.1 tr 33.3 13.1

10. α-Fenhen - - - - - - - - - 6.4 -

11. Kamfen 3.0 2.2 3.2 3.2 4.0 2.4 6.5 6.3 - - 1.8

12. Tuja-2,4(10)-dien - tr 0.2 tr 0.3 - - - - - -

13. Sabinen 1.0 0.8 1.0 0.8 1.0 1.1 0.7 4.8 - - 0.6

14. β-Pinen 4.1 1.6 5.5 2.7 3.4 2.1 2.8 0.8 0.1 2.8 7.6

15. β-Mircen 2.2 1.4 2.6 2.4 6.1 6.9 2.6 3.2 0.1 1.2 5.0

16. α-Felandren 0.4 tr 0.5 0.3 1.0 tr 0.6 tr tr - 0.5

17. δ-3-Karen 21.3 16.3 19.8 15.5 27.9 9.9 6.4 12.0 0.8 - 35.2

18. α-Terpinen 0.6 0.3 0.4 0.2 0.3 0.5 0.8 0.3 tr - 0.6

19. p-Cimen 0.1 0.2 0.5 0.2 0.3 - - - tr - 0.7

20. Limonen + β-Felandren 7.6 2.0 5.9 2.3 4.8 2.6 2.4 3.0 1.2 0.9 20.6


16

21. Silvestren - - - - - - 2.3 3.0 - - -

22. (Z)-β-Ocimen tr - - - - tr tr - - - -

23. (E)-β-Ocimen 0.5 tr 1.2 0.7 0.8 0.6 1.1 1.0 0.3 - 0.3

24. γ-Terpinen 0.7 0.5 0.8 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.1 - 0.6

25. p-Menta-2,4(8)-dien 0.1 tr tr tr tr - - - - - -

26. Terpinolen 5.5 3.2 4.3 2.2 3.3 3.8 1.5 2.5 0.5 - 3.6

27. Linalool 0.2 tr 0.3 tr tr - - - 0.3 - -

28. α-Pinen-oksid - - - - - - - - - 1.5 -

29. n-Nonanal tr - - - - - - - - - -

30. α-Tujon - - - - - - - - - 1.2 -

31. endo-Fenhol - - - - - - - - 0.1 - -

32. cis-p-Ment-2-en-1-ol - - - - - - - - 0.3 - -

33. trans-Pinokarvol - tr 0.2 0.3 0.4 - - - tr - -

34. trans-p-Ment-2-en-1-ol - - - - - - - - 0.5 - -

35. Kamfor tr tr 0.5 0.4 0.5 - - - 0.2 - -

36. Kamfen-hidrat tr - - - - - - - 0.3 - -

37. cis-Hrizantenol - - - - - - - - - 1.0 -

38. Izoborneol - - - - - - - - 0.1 - -

39. trans-Pinokamfon - - - - - - - - tr - -

40. Borneol 0.2 0.5 0.7 0.3 0.5 - 0.2 tr 1.5 - -

41. p-Menta-1,5-dien-8-ol - - - - - - - - 0.5 - -

42. Terpinen-4-ol 0.9 tr tr tr tr 0.2 0.1 tr 3.6 - -

43. m-Cimen-8-ol - tr 0.2 tr tr - - - 0.5 - -

44. Kripton - - - - - - - - 0.4 - -

45. p-Cimen-8-ol tr tr tr tr tr - - - 1.6 - -

46. α-Terpineol 0.4 0.2 0.3 tr 0.2 - - - 7.3 - -

47. Metil-salicilat - tr tr tr tr - - - - - -

48. cis-Piperitol - - - - - - - - 0.2 - -

49. Mirtenol tr 0.2 0.4 0.2 0.2 - - - 0.2 - -

50. trans-Piperitol - - - - - - - - 0.4 - -

51. trans-Karveol - - - - - - - - 0.2 - -

52. 2-Vinil-3-metil-anizol - - - - - - - - 0.1 - -

53. cis-Karveol - - - - - - - - 0.3 - -

54. Citronelol - - - - - - - - 0.2 - -

55. Timol-metil-etar 0.2 0.3 0.8 tr 0.2 tr tr tr 0.7 - -

56. Karvon - - - - - - - - tr - -

57. 3-Karen-2-on - - - - - - - - 0.1 - -

58. Piperiton - - - - - - - - 1.0 - -

59. Felandral - - - - - - - - 0.2 - -


17

60. Pregeijeren B - - - - - - - - 0.6 - -

61. Linalil-acetat 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.2 0.5 - - - -

62. Bornil-acetat 5.1 2.6 5.2 4.6 8.1 3.8 14.1 7.6 11.5 - 1.3

63. Izobornil-acetat - - - - - - - - - 2.0 -

64. p-Cimen-7-ol - - - - - - - - 0.3 - -

65. 2-Undekanon 0.1 - - - - - - - 0.2 0.8 -

66. Karvakrol - - - - - - - - - 1.6 -

67. izo-Dihidrokarveol-acetat - - - - - - - - 0.1 - -

68. Bicikloelemen - - - - - 0.4 0.6 0.3 - - -

69. δ-Terpinil-acetat - - - - - - - - tr - -

70. α-Kubeben - - - - - tr 0.1 - - - -

71. α-Terpinil-acetat 1.4 - - - - 1.3 1.0 0.7 2.4 3.6 -

72. β-Terpinil acetat - 0.2 0.2 0.2 0.3 - - - - - -

73. Citronelil-acetat - - - - - - - - 0.1 - -

74. α-Longipinen 0.1 - - - - - - - - - -

75. α-Kopaen 0.1 tr 1.5 tr tr 0.2 0.3 0.1 0.1 - tr

76. β-Burbonen 0.1 tr 0.2 tr 0.2 0.2 - 0.1 0.2 - -

77. β-Kubeben - - - - - - tr - - - -

78. β-Elemen 0.6 1.2 2.1 0.7 1.8 2.8 3.7 2.1 0.3 - -

79. Geranil-acetat tr - - - - - - - - - -

80. Longifolen - tr 0.5 tr tr - - - 0.2 - -

81. Junipen tr - - - - - - - - - -

82. (E)-Kariofilen 5.0 5.3 9.0 4.5 5.1 5.3 3.4 6.8 5.9 2.7 3.3

83. β-Kopaen - 0.2 0.3 0.2 0.3 0.2 0.2 0.1 - - -

84. Gvaja-6,9-diene - - - - - - - - 1.4 - -

85. Aromadendren - 0.3 1.5 tr 0.3 tr 0.1 tr 0.1 - -

86. cis-Muurola-3,5-dien 0.1 - - - - - - - - - -

87. trans-Muurola-3,5-dien 0.1 - - - - - - - - - -

88. α-Humulen 0.8 tr 0.6 0.5 0.8 1.1 0.7 1.2 1.2 - 0.5

89. cis-Kadina-1(6),4-dien - - - - - 0.3 0.1 0.1 - - -

90. Seskvisabinen - - - - - - - 0.3 - - -

91. 9-epi-(E)-Kariofilen 0.2 - - - - - - - - - -

92. (E)-β-Farnezen - - - - - - 0.1 0.1 0.1 - -

93. trans-Kadina-1(6),4-dien 0.1 - - - - - - - - - -

94. cis-Muurola-4(14),5-dien 0.2 tr 0.2 tr 0.2 - 0.1 - - - -

95. β-Hamigran - 0.2 0.7 0.2 0.5 - - - - - -

96. γ-Gurjunen - tr tr tr tr - - - - - -

97. γ-Muurolen 0.2 0.4 0.6 0.2 0.3 tr - tr 0.1 3.5 -

98. Germakren D 5.6 5.5 9.9 4.0 8.4 12.1 2.8 8.0 0.6 - 0.5


18

99. β-Selinen 0.1 0.2 0.5 0.2 0.3 0.2 0.5 0.2 tr 2.1 -

100. trans-Muurola-4(14),5-

dien 0.2 - - - - 0.1 - tr - - -

101. Biciklogermakren 1.7 2.1 3.0 2.2 3.4 4.2 5.7 2.9 0.3 - -

102. γ-Amorfen - 0.2 0.3 tr 0.2 - - - - - -

103. α-Muurolen 0.6 0.6 1.0 0.3 0.4 0.6 1.5 0.3 0.3 2.4 -

104. Germakren A 0.2 - - - - - 0.2 - - - -

105. δ-Amorfen - - - - - tr - - - - -

106. Bornil-izovalerat - - - - - - - - 0.3 - -

107. γ-Kadinen 0.8 0.7 2.2 0.6 0.8 1.3 1.6 0.5 0.3 9.0 -

108. Izobornil-izovalerat - - - - - - - 1.0 0.2 - -

109. Kubebol - - - - - 0.3 - - - 1.8 -

110. δ-Kadinen 2.6 2.1 3.6 2.2 2.3 2.2 - 1.5 1.2 - 0.4

111. Zonaren 0.1 - - - - - - - - - -

112. trans-Kadina-1,4-diene 0.1 tr tr tr 0.3 0.2 - - - - -

113. α-Kadinen 0.2 0.4 0.6 tr 0.2 0.2 - tr 0.1 - -

114. Furopelargon A - - - - - - - - 0.2 - -

115. (E)-Nerolidol - 0.4 0.7 0.6 0.7 - - - 0.1 - -

116. Germakren D-4-ol 0.2 - - - - 6.1 6.0 4.1 - - -

117. Spatulenol 0.1 1.1 1.4 1.2 1.3 1.5 0.6 0.8 0.8 3.5 -

118. Kariofilen-oksid 0.1 1.5 1.9 1.7 1.8 - - 0.2 2.0 6.1 -

119. Humulen-oksid II - - - - - - - - 0.4 - -

120. β-Oplopenon - - - - - - - - - 0.8 -

121. Heksadekan - - - - - - - - tr - -

122. Juneol - tr tr tr tr - - - - - -

123. 1,10-di-epi-Kubenol tr - - - - tr 0.1 tr 0.3 - -

124. 1-epi-Kubenol tr 0.3 0.4 0.2 0.3 0.1 0.2 tr - - -

125. Kariofila-4(12),8(13)-

dien-5-ol - - - - - - - - 0.1 - -

126. epi-α-Kadinol - 0.7 1.6 0.3 0.7 0.6 1.2 0.4 1.3 - tr

127. epi-α-Muurolol 0.7 - - - - 0.9 1.4 0.7 1.3 4.6 tr

128. α-Muurolol 0.1 tr 0.2 tr tr 0.4 0.6 0.2 0.5 0.2 -

129. α-Kadinol 0.9 - - - - 1.9 3.5 1.4 4.1 4.4 tr

130. 14-Hidroksi-9-epi-(E)-

kariofilen - - - - - - - - 0.6 - -

131. Amorfa-4,9-dien-2-ol - tr tr tr tr - - - - - -

132. Heptadekan - - - - - - - - 0.2 - -

133. Oplopanon - - - - - - - - 0.1 - -

134. Benzil-benzoat - - - - - - - - 0.3 1.5 -


19

135. Oktadekan - - - - - - - - 0.2 - -

136. Izopimara-9(11),15-dien - - - - - - - - 0.1 - -

137. Nonadekan - - - - - - - - 0.1 - -

138. Pimaradien - - - - - - - 0.2 0.1 - -

139. Sandarakopimaradien - - - - - - - - 0.3 - -

140. Manoil-oksid 0.1 tr 0.2 tr 0.2 2.1 tr 0.9 1.0 - -

141. 13-epi-Manoil-oksid - - - - - - - - 2.9 - -

142. Abietatrien - - - - - - - tr 0.7 - -

143. Abietadien - tr tr tr tr - tr 0.8 0.5 - -

144. Abieta-8(14),13(15)-dien - - - - - - tr tr 0.6 - -

145. Abienol - - - - - - - - 1.6 - -

146. 2-Keto-manoil-oksid - - - - - 2.0 - - - - -

147. Sandarakopimarinal - - - - - - - - 0.3 - -

148. Okso-manoil-oksid - - - - - - - - 0.6 - -

149. Abieta-6,8(14)-dien-18-

al - - - - - - - - 8.7 - -

150. Dehidroabietal - - - - - - - - 4.3 - -

151. Abietal - - - - - - - - 0.8 - -

152. 8,13-Abietadien-18-ol - - - - - - - - 0.3 - -

153. Metil-dehidroabietat - - - - - - - - 0.2 - -

154. Dehidroabietol - - - - - - - - 0.4 - -

155. Abieta-8,13(15)-dien-18-

al - - - - - - - - 0.7 - -

Ukupno 99.4 95.8 98.30 97.1 98.6 99.8 93.7 97.5 81.2 100 96.7

Monoterpeni 75.7 55.7 63.60 64.2 68.9 51.2 58.4 61.3 35.8 56.7 90.7

Seskviterpeni 21.9 29.9 34.10 22.9 27.1 43.4 35.3 33.4 24.7 41.1 5.96

Diterpeni 0.1 0.1 0.20 0.1 0.2 4.1 tr 2.8 25.8 - -

Ostalo 1.6 3.6 6.50 5.4 8.2 0.0 0.0 0.0 0.9 2.2 -

tr – detektovano u tragu (<0.1%), - nije detektovano a) Hajdari et al. (2015) su istraživali sastav etarskog ulja P. mugo sa po tri raličita lokaliteta na području Šar-planine i Prokletija; u ovom radu su prikazane samo minimalne i

maksimalne vrednosti sadržaja identifikovanih komponenti


20

Hemijski sastav etarskog ulja izolovanog hidro-destilacijom iz četina krivulja

ispitivao je veliki broj autora i u većini studija je pokazana dominacija α-pinena i δ-3-karena

kao i u ovom radu (tabela 4.1, slika 4.2). Sa druge strane, poznato je da u etarskom ulju

srodne vrste, P. uncinata, koja pripada P. mugo kompleksu (Hamernik i Musil, 2007)

dominiraju bornil-acetat (30.2%) i α-pinen (12.2%), a u ulju P. uliginosa (bor tresavskih

močvara koji ima veoma kontraverzan taksonomski status) α-pinen (8.1%), bornil-acetat

(7.9%) i δ-3-karen (6.9%) (Bonikowski et al., 2015). Naime, prema mnogim autorima, bor

tresavskih močvara je hibrid između P. mugo i P. uncinata: hibrid na nivou vrste

(Holubičková, 1965) ili podvrste (Christensen, 1987a; 1987b; 1987c); ili hibrid između P.

mugo i P. sylvestris (Staszkiewicz i Tyszkiewicz, 1969). Iako se navedeni taksoni P. mugo

kompleksa razlikuju po svom fenotipu, geografskoj distribuciji i ekologiji (Hamernik i Musil,

2007), prethodna istraživanja na osnovu RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

markera, molekularne citogenetike i protočne citometrije ukazala su na konzervativnu

organizaciju genoma i odsustvo genetičke diferencijacije između njih (Monteleone et al.,

2006; Bogunić et al., 2011). Ipak, poređenjem dominantnih komponenti ulja P. mugo, P.

uncinata i P. uliginosa, možemo zaključiti da se svaki takson odlikuje posebnim hemotipom,

kao i da se terpenski profil P. uliginosa nalazi između P. mugo i P. uncinata, što ide u prilog

hipotezi da je reč o taksonu hibridnog porekla između ove dve bliske Pinus vrste.

Pored sastava etarskih ulja taksona P. mugo kompleksa dobijenih hidro-destilacijim,

Celiński et al. (2015) objavili su sastav terpena u četinama P. mugo, P. unicanata i P.

uliginosa na osnovu izolacije HS-SPME (headspace solid-phase microextraction). Autori su

potvrdili da se isparljive komponente četina mogu koristiti kao pouzdani taksonomski

markeri u identifikaciji ovih srodnih taksona. Utvrđeno je da su α-pinen (20.0%) i δ-3-karen

(18.1%) glavne isparljive komponente u četinama P. mugo, δ-3-karen (21.5%) i α-pinen

(16.1%) u četinama P. uliginosa, a α-pinen (28.4%) i bornil-acetat (10.8%) u četinama P.

uncinata.

Dosadašnja istraživanja sastava etarskog ulja P. sylvestris (vrsta koja se smatra

najbližom P. mugo kompleksu) ukazala su, generalno, na dominaciju α-pinena i mogu se

podeliti u dva hemotipa (grupe): hemotip bez ili sa niskom koncentracijom δ-3-karena i

hemotip sa visokom koncetracijom δ-3-karena (Thoss et al., 2007). Prema tome, drugi

opisani hemotip P. sylvestris odlikuje dominacija istih komponenti kao i P. mugo, što takođe


21

može da ukazuje na određeni stepen filogenetske sličnosti između ove dve vrste Dyploxlon

borova.

Iako je u većini dosadašnjih studija pokazana dominacija α-pinena i δ-3-karena u

četinama krivulja (tabela 4.1.), Ioannou et al. (2014) su objavili bornil-acetat i α-pinen kao

glavne komponente ulja P. mugo var. rostrata. Međutim, prema "The Plant List" (2013), P.

mugo var. rostrata je zapravo sinonim vrste P. uncinata, što bi se na osnovu dominantnih

komponenti ulja, takođe, moglo pretpostaviti. Ipak, veoma neobičan terpenski profil

objavljen je za P. mugo subsp. mugo iz Nacionalnog parka Majela u Italiji (Venditti et al.,

2013), u kome su bornil-acetat i terpineol glavne monoterpenske komponente ulja, dok su α-

pinen i δ-3-karen detektovani u koncentraciji manjoj od 1%. Ovo etarsko ulje se, takođe,

odlikuje neuobičajeno visokom količinom diterpena i to abietanskih derivata koji čine čak

25.8% ulja. Ovako visoka koncentracija diterpenskih jedinjenja nije utvrđena u nijednom

dosadašnjem istraživanju P. mugo. Prema Venditti et al. (2013), prisustvo više aldehidnih

diterpena kao što su abieta-6,8(14)-dien-18-al (8.7%), dehidroabietal (4.3%), abietal (0.8%) i

abieta-8,13(15)-dien-18-al (0.7%) u četinama P. mugo ima i taksonomski značaj, s obzirom

da su aldehidni diterpeni detektovani isključivo kod Pinus vrsta (npr. P. contorta, P. elliotti,

P. hunneywelli, P. ponderosa, P. rhaetica), a odsustvuju kod ostalih rodova familije Pinaceae

(Lambert et al., 2007). U svakom slučaju, u potpunosti drugačiji terpenski profil P. mugo

subsp. mugo sa Apeninskog poluostrva u odnosu na balkanski, može se objasniti i veoma

dugom izolacijom populacija krivulja iz ova dva evropska refugijuma.


22

Slika 4.2. Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) u etarskom ulju četina P. mugo.


23

4.1.2. Etarsko ulje izdanaka

Prema našim istraživanjima u literaturi postoji samo jedan rad u kome je ispitavan

hemijski sastav etarskog ulja izolovanog hidro-destilacijom iz izdanaka P. mugo - populacije

sa Šar-planine i Prokletija (tabela 4.2, slika 4.3). U populacijama sa oba planinska masiva

utvrđena je prosečna dominacija monoterpena (83.4 i 79.6%, resp.) sa δ-3-karenom (31.7 i

34.9%, resp.) i limonenom + β-felandrenom (18.3 i 19.5%, resp.) kao glavnim

komponentama. U okviru monoterpenske frakcije, u populacijama sa Šar-planine, sledeće

najzastupljenije komponente su β-pinen (11.8%) i α-pinen (8.8%), dok je u populacijama sa

Prokletija samo α-pinen utvrđen u umerenoj (6.6%), a β-pinen je detektvan u niskoj

koncentraciji (2.8%). Seskviterpenska frakcija je zastupljena sa svega 13.2 i 15.8%, resp., sa

(E)-kariofilenom kao glavnim metabolitom (6.4 i 7.2%, resp.). Dve diterpenske komponente,

manoil-oksid i 3-okso-manoil-oksid, detektovane su u većini populacija samo u tragovima

(Hajdari et al., 2015).

4.1.3. Etarsko ulje četina i izdanaka

Hemijski sastav etarskog ulja izolovanog iz zajedno samlevenih četina i izdanaka P.

mugo ispitivan je manje u odnosu na ulja koja su dobijena isključivo iz četina (tabela 4.2,

slika 4.3). Bojović et al. (2016) su publikovali sastav etarskog ulja dobijenog hidro-

destilacijom iz četina i izdanaka četiri populacije P. mugo sa područja Julijskih Alpa.

Dominantnu grupu jedinjenja predstavljaju monoterpeni (79.7%), a glavne komponente su δ-

3-karen (20.7%), β-felandren (16.4%) i α-pinen (15.0%). Za ovakav rezultat možemo reći da

je u potpunosti i očekivan, ako uzmemo u obzir da su dominantne komponente etarskog ulja

četina α-pinen i δ-3-karen, a ulja izdanaka δ-3-karen i limonen + β-felandren (tabele 4.1 i

4.2). Sledeći najzastupljeniji monoterpeni, β-mircen i β-pinen, detektovani su u umerenim

koncentracijama (7.8 i 5.8%, resp.). (E)-Kariofilen (5.3%) je najzastupljeniji metabolit u

okviru seskviterpenske frakcije koja čini 19.0% ulja. Manoil-oksid i 3-okso-manoil-oksid su

jedine identifikovane diterpenske komponente prisutne u koncentraciji manjoj od 1%.

Sa druge strane, Stevanovic et al. (2005) su objavili sastav ulja izolovanog

destilacijom vodenom parom iz četina i izdanaka P. mugo sa Šar-planine (Ostrovica).

Utvrđeno je da su δ-3-karen (23.9%), α-pinen (17.9%) i limonen + β-felandren (11.1%)

glavne komponente ulja, a pored njih samo je još β-pinen detektovan u koncentraciji većoj od


24

5%. Iako je u pitanju druga tehnika izolacije etarskog ulja (destilacija vodenom parom), kao i

činjenica da je da je u ovom radu analiziran materijal sa područja Balkanskog poluostrva

(Šar-planina), možemo primetiti sličnost u hemijskom sastavu sa uljem koje je izolovano

metodom hidro-destilacije iz četina i izdanaka populacija krivulja sa Julijskih Alpa (Hajdari

et al., 2015; Bojović et al., 2016).

4.1.4. Etarsko ulje šišarki

Hajdari et al. (2015) su, takođe, objavili hemijski sastav etarskog ulja šišarki P. mugo

u populacijama sa Šar-planine i Prokletija (tabela 4.2, slika 4.3). Monoterpeni predstavljaju

glavnu terpensku klasu jedinjenja u populacijama sa oba planinska masiva (prosečni sadržaj

40.3 i 44.8%, resp.), zatim slede seskviterpeni (31.2 i 39.8%, resp.), dok su diterpeni utvrđeni

u niskoj koncentraciji (0.9 i 1.9%, resp.). Dominantne komponente ulja, na oba planinska

masiva, su δ-3-karen (15.8 i 23.4%, resp.) i (E)-kariofilen (16.7 i 21.8%, resp.). Sledeći

najzastupljeniji metaboliti u ulju šišarki populacija sa Šar-planine su β-pinen (6.3%) i α-pinen

(4.2%), a u ulju populacija sa Prokletija α-pinen (5.1%) i germakren D (6.9%).

Primenom hijerarhijske klaster analize - HCA (hierarchical cluster analysis), Hajdari

et al. (2015) ukazuju na jasno izdvajanje tri grupe P. mugo ulja koje odgovaraju sastavu tri

biljna organa iz kojih su ulja izolovana: prva grupa uključila je ulja iz izdanaka, druga grupa

ulja četina i treća ulja šišarki. HCA je, takođe, ukazala na sličniji sastav ulja četina i šišarki u

odnosu na ulja izdanaka. Analiza glavnih komponenti - PCA (principal component analysis)

potvrdila je grupisanje P. mugo ulja u odnosu na biljni organ iz kojeg su izolovana. Na

grupisanje ulja iz četina uticao je veći sadržaj kamfena (3.0%), α-tujena (1.0%),

biciklogermakrena (2.7%), bornil-acetata (5.3%), δ-kadinena (2.5), γ-kadinena (1.0%) i

germakrena D (6.5%) u odnosu na preostale dve grupe. Ulja izdanaka odlikuje veći sadržaj δ-

3-karena (33.3%), sabinena (1.4%), limonena + β-felandrena (18.9%) i β-pinena (7.3%), dok

ulja šišarki imaju veći sadržaj β-kariofilena (18.7%), aromadendrena (1.5%) i linaloola

(1.1%), a manji sadržaj α-pinena (4.6%). Ovako velike razlike u hemijskom sastavu etarskog

ulja iz različitih biljnih organa su i očekivane, s obzirom da se različiti organi odlikuju

potpuno drugačijom ekspresijom gena koja je prilagođena funkciji datog ograna.


25

Slika 4.3. Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) u etarskom ulju P. mugo poreklom iz različitih delova biljke

(četine i izdanci; izdanci; šišarke).


26

Tabela. 4.2. Hemijski sastav etarskog ulja P. mugo poreklom iz različitih delova biljke (četine i izdanci; izdanci; šišarke).

Takson P. mugo P. mugo P. mugo subsp.

mugo

P. mugo subsp.

mugo

P. mugo. subsp.

mugo

P. mugo subsp.

mugo

Poreklo biljnog

materijala Julijski Alpi

Kosovo, Šar-

planina (Ostrovica)

Kosovo, Šar-

planinaa) Kosovo, Prokletijea)

Kosovo, Šar-

planinaa) Kosovo, Prokletijea)

Organ Četine i izdanci Četine i izdanci Izdanci Izdanci Šišarke Šišarke

Način izolacije Hidro-

destilacija

Destilacija

vodenom parom Hidro-destilacija Hidro-destilacija Hidro-destilacija Hidro-destilacija

Referenca Bojović et al.

(2016)

Stevanovic et al.

(2005) Hajdari et al. (2015) Hajdari et al. (2015) Hajdari et al. (2015) Hajdari et al. (2015)

R.br. Komponente Sadržaj (%)

min maks min maks min maks min maks

1. Triciklen 0.5 0.4 tr 0.2 tr 0.2 tr tr tr tr

2. α-Tujen 0.6 0.8 0.2 0.3 tr 0.2 tr 0.2 tr 0.2

3. α-Pinen 15.0 17.9 7.9 9.7 5.6 7.4 3.1 5.4 4.6 5.7

4. Kamfen 1.8 1.7 0.2 0.9 0.5 0.8 0.3 0.7 0.2 0.4

5. Tuja-2,4(10)-dien - - 0.7 1.1 0.3 0.5 0.5 0.7 0.3 2.0

6. Sabinen 1.4 1.3 1.1 2.2 1.0 1.7 0.4 0.5 0.3 0.5

7. β-Pinen 5.9 7.8 5.5 15.4 2.2 3.5 1.6 14.2 1.4 1.6

8. β-Mircen 7.8 2.7 1.6 2.3 2.7 10.3 1.1 1.6 1.1 4.6

9. α-Felandren 0.3 0.2 0.3 0.4 0.2 0.3 tr 0.2 tr tr

10. δ-3-Karen 20.7 23.9 28.6 34.0 24.0 51.7 10.5 22.1 15.2 31.5

11. α-Terpinen 0.2 - 0.2 0.2 0.2 0.3 tr 0.2 tr tr

12. p-Cimen 0.2 1.1 0.4 0.6 0.3 0.4 0.3 0.4 0.3 0.5

13. Limonen + β-

Felandren 16.4 11.1 12.7 24.3 14.3 23.2 2.0 9.3 4.0 6.3

14. (E)-β-Ocimen tr tr tr tr tr 0.6 tr 0.2 tr 0.2

15. γ-Terpinen 0.4 - 0.4 0.5 0.4 0.6 0.3 0.4 0.2 0.4

16. p-Menta-2,4(8)-dien 0.3 - tr tr tr 0.2 tr tr tr tr

17. Terpinolen 3.2 0.4 2.6 2.7 2.5 4.3 0.9 2.1 1.3 2.3

18. Linalool - 0.3 tr 0.2 tr tr tr 3.6 tr tr

19. cis-p-Ment-2-en-1-ol tr - - - - - - - - -

20. trans-Pinokarveol - - tr 0.2 0.2 0.5 tr 0.3 tr 0.4

21. trans-p-Ment-2-en-1-ol tr - - - - - - - - -

22. Kamfor - - 0.3 0.4 tr tr tr 0.5 tr tr

23. Dekan-2-on 0.1 - - - - - - - - -


27

24. Borneol tr - 0.3 1.0 0.5 0.5 0.2 1.0 0.2 0.4

25. Terpinen-4-ol 0.2 1.3 0.2 0.2 0.2 0.3 tr tr tr 0.3

26. m-Cimen-8-ol - - 0.2 0.3 tr 0.3 tr tr tr 0.2

27. Kripton 0.1 1.3 - - - - - - - -

28. p-Cimen-8-ol - 0.9 0.2 0.4 0.2 0.3 tr tr tr 0.4

29. α-Terpineol tr 0.5 0.2 0.3 tr tr tr 0.8 tr tr

30. Metil-salicilat - - tr 0.3 tr 0.2 tr 0.2 tr tr

31. Mirtenol 0.1 - 0.7 1.2 0.6 0.9 tr 0.5 0.2 0.2

32. Timol-metil-etar 0.4 0.2 0.2 0.2 tr 0.2 tr 1.1 tr tr

33. Kumin-aldehid - 0.6 - - - - - - - -

34. Linalil-acetat 0.1 - tr 0.2 tr tr tr 1.2 tr 0.2

35. (E)-2-Decenal 0.1 - - - - - - - - -

36. Bornil-acetat 2.8 3.2 0.4 2.6 1.8 3.0 0.5 1.5 0.8 1.3

37. 2-Undekanon tr - - - - - - - - -

38. p-Vinilgvajakol 0.4 - - - - - - - - -

39. Piperitenon - 1.2 - - - - - - - -

40. α-Terpinil-acetat 0.9 2.5 - - - - - - - -

41. β-Terpinil-acetat - - tr tr tr tr tr tr tr tr

42. Citronelil-acetat tr - - - - - - - - -

43. α-Kopaen 0.1 - tr 0.4 tr tr tr 0.2 tr tr

44. β-Burbonen - - tr 0.3 0.2 0.3 tr tr tr tr

45. β-Elemen 1.1 - 0.6 1.0 1.0 1.2 0.2 0.6 0.3 0.5

46. Longifolen - - tr 0.4 tr tr tr 2.8 tr tr

47. (E)-Kariofilen 5.3 2.4 5.9 7.3 4.0 10.9 10.4 20.5 16.6 27.0

48. β-Kopaen 0.1 - tr tr tr tr tr 1.1 tr tr

49. Aromadendren - - tr 1.2 tr 0.6 tr 3.3 tr 1.0

50. α-Humulen 0.9 0.4 0.5 1.0 tr 1.8 tr 2.6 1.8 4.5

51. trans-Kadina-1(6),4-

dien 0.2 - - - - - - - - -

52. cis-Muurola-4(14),5-

dien - - tr tr tr tr tr 0.2 tr tr

53. β-Hamigren - - tr 0.3 0.2 0.5 tr 0.5 0.7 1.2

54. γ-Gurjunen - - tr tr tr tr tr tr tr tr

55. γ-Muurolen 0.2 - tr tr tr 0.6 tr 1.1 tr 1.2

56. Germakren D 4.4 0.7 0.4 0.6 tr 6.2 0.2 3.0 1.3 12.5

57. β-Selinen tr - tr 0.2 tr tr tr tr tr tr

58. Biciklogermakren 1.9 - 0.6 0.8 0.5 1.0 tr 0.5 tr 0.4

59. γ-Amorfen - - tr tr tr 0.2 tr 0.4 tr 0.4

60. α-Muurolen 0.1 - tr 0.2 tr tr tr 0.3 tr 0.2


28

61. γ-Kadinen 0.5 0.8 0.2 0.2 0.2 0.4 tr 0.6 tr 0.9

62. δ-Kadinen 1.5 1.1 0.5 0.9 0.4 0.9 0.3 1.5 tr 1.8

63. trans-Kadina-1,4-dien - - tr tr tr tr tr 0.5 tr 0.3

64. α-Kadinen tr - tr tr tr tr 0.4 0.8 0.4 1.0

65. (E)-Nerolidol - - tr 0.2 tr 0.2 tr 0.4 tr tr

66. Germakren D-4-ol 1.2 - - - - - - - - -

67. Spatulenol - 1.2 0.2 0.4 tr 0.2 tr 0.3 tr 0.5

68. Kariofilen-oksid 0.2 1.6 0.20 0.60 0.20 0.40 0.02 0.50 0.02 0.70

69. Juneol - - tr tr tr tr 0.5 0.8 0.2 0.2

70. 1-epi-Kubenol - - tr tr tr tr tr tr tr tr

71. epi-α-Kadinol - 0.7 0.2 0.3 tr 0.5 0.3 0.4 0.2 0.6

72. epi-α-Murrolol 0.6 1.1 - - - - - - - -

73. α-Murrolol - - 0.2 0.3 tr 0.5 1.3 2.6 1.3 3.0

74. α-Kadinol 0.7 1.0 - - - - - - - -

75. Amorfa-4,9-dien-2-ol - - tr tr tr tr 0.2 0.5 0.4 0.7

76. Heksadekanal tr - - - - - - - - -

77. Manoil-oksid 0.1 - tr tr tr 0.2 tr 0.7 0.9 1.1

78. 3-Okso-manoil-oksid tr - - - - - - - - -

80. Abietadien - - tr tr tr 0.2 0.2 1.1 0.6 1.1

Ukupno 99.7 93.7 96.8 98.1 95.8 98.6 68.9 81.5 79.1 94.8

Monoterpeni 79.7 82.7 82.8 84.4 69.5 88.7 28.9 59.3 37.7 51.9

Seskviterpeni 19.0 11.0 11.2 14.4 8.3 24.6 19.6 40.8 24.0 55.6

Diterpeni 0.2 - - - - 0.4 0.3 1.8 1.5 2.2

Ostalo 0.8 - 0.8 3.3 2.2 3.3 1.6 3.0 1.1 1.3

tr – detektovano u tragu (<0.1%), - nije detektovano a) Hajdari et al. (2015) su istraživali sastav etarskog ulja P. mugo sa po tri raličita lokaliteta na području Šar-planine i Prokletija; u ovom radu su prikazane samo

minimalne i maksimalne vrednosti sadržaja identifikovanih komponenti


29

Sa druge strane, utvrđeno je da razlike između ispitivanih populacija P. mugo (tri

populacije sa Šar-planine i tri populacije sa Prokletija) nisu toliko velike, kao razlike između

organa (Hajdari et al., 2015). S obzirom na izolovanost i udaljenost (oko 100 km) ispitivanih

planina, autori su očekivali postojanje dve distinktne grupe (Šar-planina i Prokletije) na

osnovu sastava etarskih ulja iz četina, izdanaka i/ili šišarki. Multivarijantne statističke analize

nisu podržale ovu hipotezu, s obzirom da su se neki uzorci sa Šar-planine i Prokletija

grupisali zajedno. Odsustvo diferencijacije između ispitivanih populacija P. mugo može se

objasniti činjenicom da je ova vrsta imala znatno širu i kontinuiranu distribuciju na ovim

prostorima u prošlosti. Naime, sadašnji areal P. mugo predstavlja samo ostatak nekadašnjeg

većeg areala koji je značajno redukovan tokom ledenih doba u Pleistocenu. S obzirom da su

populacije sa Šar-planine i Prokletija verovatno ostaci jedne veće, stare populacije do čijeg je

razdvajanja došlo u skorijoj prošlosti, odsustvo njihove trenutne diferencijacije (na osnovu

terpenskih markera) donekle je i očekivano. Pored toga, poznato je da se četinarske vrste,

generalno, odlikuju niskim stepenom genetičke diferencijacije populacija usled efektivnog

protoka gena putem rasejavanja polena i semena (Hamrick et al., 1979).


30

4.2. Biološka aktivnost etarskog ulja P. mugo

4.2.1. Antimikrobna aktivnost

U odnosu na ostale vrste borova, prema dostupnim literaturnim podacima, etarsko ulje

P. mugo je relativno slabo ispitivano sa aspekta bioloških aktivnosti. U ovom odeljku

prikazan je uporedni pregled literaturnih podataka o antibakterijskoj i antifungalnoj aktivnosti

etarskog ulja krivulja.

Mnoga etarska ulja su poznata po svojim antifugalnim svojstvima zbog čega imaju

potencijalnu primenu kao antimikotici. Tampieri et al. (2005) su proučavali efikasnost 16

komercijalnih etarskih ulja i 42 čiste komponente (alkohole, aldehide, ketone, fenole i

ugljovodonike) protiv jednog soja Candida albicans korišćenjem SAAS metode (semisolid

agar antifungal susceptibility). Candida albicans je diploidna gljiva (vrsta kvasca) koja se

normalno nalazi u digestivnom sistemu čoveka. Izazivač je gljivičnog oboljenja kože,

sluzokože, noktiju i unutrašnjih organa. Kandidijaza je skoro uvek posledica autoinfekcije, tj.

infekcije gljivicama koje normalno nastanjuju čovekov organizam i koje se najčešće zbog

pada imuniteta intenzivno razmnožavaju. U pomenutom istraživanju je utvrđeno da etarska

ulja Origanum vulgare, Satureja montana, Mentha piperita, Cinnamomum verum,

Cymbopogon flexuosus pokazuju maksimalnu inhibitornu aktivnost (MIC = 500 ppm) nakon

7 dana, dok etarska ulja Santalum album i Pinus mugo ne deluju inhibitorno na rast C.

albicans čak i u najvećim koncentracijama (MIC > 5000 ppm nakon 7 dana). Prema

rezultatima ispitivanja čistih komponenti, β-felandren se pokazao kao najinteresantnija

komponenta među cikličnim monoterpenskim ugljovodonicima, s obzirom da je pokazao

snažnu antifungalnu aktivnost (MIC = 50 ppm). Najaktivniji fenol bio je karvakrol (MIC =

100 ppm), aciklični alkohol 1-dekanol je bio najaktivniji među testiranim alkoholima (MIC =

50 ppm), a među aldehidima kao najaktivniji se pokazao trans-cinamaldehid (MIC = 50

ppm).

Sa druge strane, Karapandzova et al. (2011) su testirali antimikrobni potencijal

etarskog ulja četina P. mugo sa područja Makedonije protiv 13 bakterijskih izolata

(uključujući Gram (+) i Gram (-) bakterije) i jedan soj C. albicans koristeći metodu disk

difuzije. Bujon diluciona metoda je korišćena za testiranje minimalne inhibitorne

koncentracije (MIC) etarskog ulja. Utvrđeno je da etarsko ulje P. mugo poseduje značajnu

antimikrobnu aktivnost, naročito protiv Gram (+) bakterija kao što su Streptococcus


31

pneumoniae, Streptococcus pyogenes i Streptococcus agalactiae sa minimalnim inhibitornim

koncentracijama od 15.26 µl/ml, 7.5 µl/ml i 31.25 µl/ml, resp. (Karapandzova et al., 2011).

4.2.2. Insekticidna aktivnost

Prema dostupnim literaturnim podacima, isekticidni potencijal etarskog ulja P. mugo

je veoma slabo istraživan. Naime, u recentnoj literaturi postoji samo jedan rad u kome je

testiran larvicidni potencijal 21 etarskog ulja (uključujući i ulje P. mugo) protiv moljca

duvana Spodoptera litura (Isman et al., 2001). Etarska ulja Satureja hortensis, Thymus

serphyllum i Origanum creticum uzrokovala su smrtnost preko 90% larvi u roku od 24h u

dozi od 100 µg po larvi. Toksičnost etarskog ulja Thymus vulgaris (koje nije bilo uključeno u

prvoj skrining fazi) (LD50 = 46.7 µg) uporediva je sa toksičnošću ulja T. serphyllum (LD50 =

50.0 µg) i S. hortensis (LD50 = 48.4 µg), dok je etarsko ulje O. creticum manje toksično za

larve moljca duvana u odnosu na prethodne tri vrste (LD50 = 66.0 µg). Autori smatraju da su

monoterpenski fenoli timol i karvakrol, glavne komponente etarskog ulja Thymus i Satureja

vrsta, odgovorne za utvrđenu larvicidnu aktivnost. Preostalih 18 etarskih ulja, uključujući i

ulje P. mugo, uzrokovalo je stopu smrtnosti manju od 50%.

4.2.3. Antioksidativna aktivnost

Grassmann et al. (2003) su testirali antioksidativni potencijal etarskog ulja P. mugo

pomoću nekoliko biohemijskih test sistema (npr. Fenton sistem, ksantin-oksidaza test, ili

oksidacija lipoproteina male gustine (LDL) indukovana bakrom). Rezultati su pokazali da

postoji umerena ili slaba antioksidativna aktivnost u vodenim sredinama: Fenton sistem,

formiranje superoksid radikala indukovano ksantin oksidazom ili fragmentacija 1-

aminociklopropan-1-karboksilne kiseline (ACC) indukovana hipohlorastom kiselinom

(HOCl). Nasuprot tome, u lipofilnijim sredinama (npr. fragmentacija ACC aktiviranim

neutrofilima u krvi) etarsko ulje P. mugo pokazuje dobru antioksidativnu aktivnost. Etarsko

ulje P. mugo pokazalo je dobru antioksidativnu aktivnost i u drugim lipofilnim test sistemima

npr. kod LDL oksidacije indukovane bakrom. Autori su, takođe, testirali i pojedine čiste

komponentne etarskog ulja krivulja (npr. δ-3-karen, kamfen, α-pinen, (+)-limonen i

terpinolen). Kao i etarsko ulje, one pokazuju slabu ili odsustvo antioksidativne aktivnosti u

vodenim sredinama, ali se ponašaju kao efikasni antioksidansi u odnosu na fragmentaciju


32

ACC aktiviranim neutrofilima u krvi ili LDL oksidaciju indukovanu bakrom. Interesantno je

da terpinolen kao komponenta koja je detektovana u niskoj koncentraciji u etarskom ulju P.

mugo značajno sprečava oksidaciju LDL.


33

5. ZAKLJUČCI

1. Etarsko ulje P. mugo, sa područja Kosova i Metohije (Šar-planina) odlikuje

dominacija monoterpena (75.7%) sa δ-3-karenom (21.3%) i α-pinenom (18.0%) kao

glavnim komponentama. Sledeći najzastupljeniji monoterpeni, limonen + β-felandren,

terpinolen i bornil-acetat, detektovani su u umerenim koncentracijama (7.6, 5.5 i

5.1%, resp.). Sa druge strane, germakren D (5.6%) i (E)-kariofilen (5.0%)

predstavljaju najznačajnije metabolite u okviru seskviterpenske frakcije koja čini

21.9% ulja. Manoil-oksid je jedina diterpenska komponenta detektovana u

koncentraciji manjoj od 1%. Na ovaj način, prosečan hemijski profil glavnih

terpenskih komponenti (preko 5%) u etarskom ulju četina P. mugo možemo

predstaviti na sledeći način:

δ-3-karen > α-pinen >> limonen + β-felandren > germakren D = terpinolen = bornil-

acetat = (E)-kariofilen

(>> označava razliku od 5.1-15.0%, > razliku od 1.1-5.0%, = razliku od 0.1-1.0%, prema

Petrakis et al., 2001).

2. Na osnovu dosadašnjih istraživanja možemo konstatovati da postoji velika

varijabilnost hemijskog sastava etarskog ulja koje potiče iz različitih organa, ali

istovremeno i iz različitih delova areala krivulja. Međutim, u većini dosadašnjih

istraživanja utvrđeno je da monoterpeni predstavljaju dominantnu grupu jedinjenja u

etarskom ulju P. mugo, bez obzira na tip organa iz kojeg je ulje izolovano (četine,

izdanci ili šišarke) ili poreklo biljnog materijala (populacija iz prirode ili botanička

bašta).

3. Većina dosadašnjih istraživanja ukazala je na dominaciju α-pinena (0.0 - 22.8%) i δ-

3-karena (0.8 – 35.2%) u etarskom ulju četina P. mugo. (E)-Kariofilen (2.7 – 9.0%) i

germakren D (0.0 – 12.1%) predstavljaju glavne metabolite u okviru seskviterpenske

frakcije koja čini od 6.0 – 43.4% ulja četina. Ipak, veoma neobičan terpenski profil

objavljen je za P. mugo subsp. mugo iz Nacionalnog parka Majela u Italiji, u kome su

bornil-acetat i terpineol glavne monoterpenske komponente, dok su α-pinen i δ-3-

karen detektovani u koncentraciji manjoj od 1% (Venditti et al., 2013). Ovo etarsko

ulje se, takođe, odlikuje neuobičajeno visokom količinom diterpena i to abietanskih


34

derivata koji čine čak 25.8% ulja. U potpunosti drugačiji terpenski profil P. mugo

subsp. mugo sa Apeninskog poluostrva u odnosu na balkanski, može se objasniti

veoma dugom izolacijom populacija krivulja iz ova dva evropska refugijuma.

4. Prema našim istraživanjima u literaturi postoji samo jedan rad u kome je ispitavan

hemijski sastav etarskog ulja izolovanog iz izdanaka kao i etarskog ulja šišarki P.

mugo u populacijama sa Šar-planine i Prokletija (Hajdari et al., 2015). U etarskom

ulju izdanaka utvrđena je prosečna dominacija δ-3-karena (31.7 i 34.9%, resp.) i

limonena + β-felandrena (18.3 i 19.5%, resp.). Sa druge strane, dominantne

komponente etarskog ulja šišarki, na oba planinska masiva, su δ-3-karen (15.8 i

23.4%, resp.) i (E)-kariofilen (16.7 i 21.8%, resp.).

5. Hemijski sastav etarskog ulja izolovanog iz zajedno samlevenih četina i izdanaka P.

mugo ispitivan je manje u odnosu na ulja koja su dobijena isključivo iz četina.

Dosadašnja istraživanja ukazala na dominaciju δ-3-karena (20.7 – 23.9%), α-pinena

(17.9 – 15.0%) i limonena + β-felandrena (11.1 - 16.4%), što je i očekivan rezultat,

ako uzmemo u obzir da su glavne komponente etarskog ulja četina α-pinen i δ-3-

karen, a ulja izdanaka δ-3-karen i limonen + β-felandren.

6. Takođe, za ovako velike razlike u hemijskom sastavu etarskog ulja P. mugo poreklom

iz različitih delova biljke (četine, izdanci i šišarke) možemo reći da su donekle

očekivane, s obzirom da se različiti biljni organi odlikuju potpuno drugačijom

ekspresijom gena koja je prilagođena funkciji datog ograna.

7. U odnosu na ostale vrste borova, prema dostupnim literaturnim podacima, etarsko ulje

P. mugo je relativno slabo ispitivano sa aspekta bioloških aktivnosti. Do sada je

utvrđeno da poseduje značajan antibakterijski (naročito protiv naročito protiv Gram

(+) bakterija Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes i Streptococcus

agalactiae) i antioksidativni potencijal, dok se sa druge strane odlikuje potpunim

odsustvom larvicidne aktivnosti protiv moljca duvana Spodoptera litura.


35

6. LITERATURA

Adams R. P. (2007). Identification of Essential Oil Component by Gas

Chromatography/Quadrupole Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation,

Carol Stream, IL.

Bogunić F., Siljak-Yakovlev S., Muratović E., Ballian D. (2011). Different karyotype

patterns among allopatric Pinus nigra (Pinaceae) populations revealed by molecular

cytogenetics. Plant Biology. 13, 194-200.

Bojović S., Jurc M., Ristić M., Popović Z., Matić R., Vidaković V., Stefanović M., Jurc D.

(2016). Essential oil variability in natural populations of Pinus mugo Turra from the

Julian Alps. Chemistry & Biodiversity, 13, 181-187.

Bonikowski R., Celiński K., Wojnicka-Półtorak A., Maliński T. (2015). Composition of

essential oils isolated from the needles of P. uncinata Ramond ex. Mirb and P.

uliginosa Neumann ex Wimmer grown in Poland. Natural Product Communications

10, 371–373.

Celiński K., Bonikowski R., Wojnicka-Półtorak A., Chudzińska E., Maliński T. (2015).

Volatiles as chemosystematic markers for distinguishing closely related species

within the Pinus mugo complex. Chemistry & Biodiversity 12, 1208–1213.

Christensen K. I. (1987). Taxonomic revision of the Pinus mugo complex and P. × rhaetica

(P. mugo × sylvestris) (Pinaceae). Nordic Journal of Botany, 7(4), 383-408.

European Pharmacopoeia. (1997). Biological tests. 3th ed. Paris: Council of Europe, 123–7.

Farr T. G., Rosen P. A., Caro E., Crippen R., Duren R., Hensley S., Kobrick M., Paller M.,

Rodriguez E., Roth L., Seal D., Shaffer S., Shimada J., Umland J., Werner M., Oskin

M., Burbank D., Alsdorf D. (2007). The shuttle radar topography mission. Reviews of

Geophysics, 45, RG2004.

Gašić M. J. (1985). Etarska ulja. IHTM, Beograd.

Gaussen H., Heywood V. H., Charter A. O. (1993). Pinus L. In: Tutin T. G., Heywood V. H.,

Burges N. A., Valentine D. H., Walters S. M., Webb B. A., editors. Flora Europea.

Vol. 1, 2nd edn. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 40-44.


36

Grassmann J., Hippeli S., Vollmann R., Elstner E. F. (2003). Antioxidative properties of the

essential oil from Pinus mugo. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 7576-

7582.

Hajdari A., Mustafa B., Ahmeti G., Pulaj B., Lukas B., Ibraliu A., Stefkov G., Quave C. L.,

Novak J. (2015). Essential oil composition variability among natural populations of

Pinus mugo Turra in Kosovo. SpringerPlus 4, 828.

Hamerník J., Musil I. (2007). The Pinus mugo complex–its structuring and general overview

of the used nomenclature. Journal of Forest Science, 53(6), 253-266.

Hamrick J. L., Mitton J. B., Linhart Y. B. (1979). Levels of genetic variation in trees:

Influence of life history characteristics. Presented at the Symposium on Isozymes of

North American Forest Trees and Forest Insects, Berkeley, Calif.

Holubičková B. (1965). A study of the Pinus mugo complex (variability and diagnostic value

of characters in some Bohemian populations). Preslia, 37, 276-288.

Ioannou E., Koutsaviti A., Tzakou O., Roussis V. (2014). The genus Pinus: a comparative

study on the needle essential oil composition of 46 pine species. Phytochemistry

Reviews, DOI 10.1007/s11101-014-9338-4.

Isman M. B., Wan A. J., Passreiter C. M. (2001). Insecticidal activity of essential oils to the

tobacco cutworm, Spodoptera litura. Fitoterapia, 72, 65-68.

Jalas J., Suominen J. (1973). Atlas Florae Europaeae. 2 Gymnospermae (Pinaceae to

Ephedraceae). Helsinki.

Jovanović B. (1992). Pinus L. In: Sarić M, editor. Flora Srbije 1. Srpska akademija nauka i

umetnosti, Beograd, pp. 194-208.

Karapandzova M., Stefkov G., Trajkovska Dokik E., Kadifkova Panovska T., Kaftandzieva

A., Kulevanova S. (2011). Chemical characterization and antimicrobial activity of the

needle essential oil of Pinus mugo (Pinaceae) from Macedonian flora. Planta Medica

77, PL59.

Kovačević N. (2004). Osnovi farmakognozije. Treće izdanje. Srpska školska knjiga, Beograd.

Kubeczka K.-H., Schultze W. (1987). Biology and chemistry of conifer oils. Flavour and

Fragrance Journal, 2, 137-148.


37

Lambert J. B., Kozminski M. A., Fahlstrom C. A., Santiago-Blay J. A. (2007). Proton nuclear

magnetic resonance characterization of resins from the family Pinaceae. Journal of

natural products, 70, 188-195.

Mirov N. T. (1967). The genus Pinus. The Ronald Press, New York.

Monteleone I., Ferrazzini D., Belletti P. (2006). Effectiveness of neutral RAPD markers to

detect genetic divergence between the subspecies uncinata and mugo of Pinus mugo

Turra. Silva Fennica, 40(3), 391–406.

Petrakis P. V., Tsitsimpikou C., Tzakou O., Couladis M., Vagias C., Roussis V. (2001).

Needle volatiles from five Pinus species growing in Greece. Flavour and Fragrance

Journal, 16, 249-252.

Petrović S., Maksimović Z., Kundaković T. (2009). Analiza sastojaka biljnih droga. Priručnik

za teorijsku i praktičnu nastavu iz predmeta Farmakognozija. Farmaceutski fakultet,

Beograd.

Reuter H. I., Nelson A., Jarvis A. (2007). An evaluation of void filling interpolation methods

for SRTM data. International Journal of Geographycal Information Science, 21, 983-

1008.

Staszkiewicz J., Tyszkiewicz M. (1969). Naturalne mieszańce Pinus mugo Turra × Pinus

sylvestris L. w Kotlinie Nowotarskiej. Fragmenta Floristica et Geobotanica, 15(2),

187–212.

Stevanovic T., Garneau F.-X., Jean F.-I., Gagnon H., Vilotic D., Petrovic S., Ruzic N.,

Pichette A. (2005). The essential oil composition of Pinus mugo Turra from Serbia.

Flavour and Fragrance Journal, 20, 96-97.

Tampieri M. P., Galuppi R., Macchioni F., Carelle M. S., Falcioni L., Cioni P. L., Morelli I.

(2003). The inhibition of Candida albicans by selected essential oils and their major

components. Mycopathologia, 159, 339-345.

Thoss V., O’Reilly-Wapstra J., Iason G. R. (2007). Assessment and implication of

intraspecific and phonological variability in monoterpene of Scots pine (Pinus

sylvestris) foliage. Journal of Chemical Ecology, 33, 477-491.

Tsitsimpikou C., Petrakis P. V., Ortiz A., Harvala C., Roussis V. (2001). Volatile needle

terpenoids of six Pinus species. Journal of Essential Oil Research, 13, 174-178.


38

Venditti A., Serrilli A. M., Vittori S., Papa F., Maggi F., Di Cecco M., Ciaschetti G., Bruno

M., Rosselli S., Bianco A. (2013). Secondary metabolites from Pinus mugo Turra

subsp. mugo growing in the Majella National Park (Central Apennines, Italy).

Chemistry & Biodiversity, 10, 2091-2100.

Прилог5/1

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Јелена Стојановић

Ментор, МН: Зорица С. Митић

Наслов рада, НР: Биолошка активност и варијабилност хемијског састава етарског уља

Pinus mugo (Pinaceae)

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2017.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/

цитата/табела/слика/графика/прилога)

38 страна; 5 слика; 3 табеле

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Ботаника

Предметна одредница/Кључне речи,

ПО: Pinus mugo, етарско уље, варијабилност, биолошка активност

УДК 581.5 : 544.02 + 665.52 : 582.475

Чува се, ЧУ: Библиотека Извод, ИЗ: У мастер раду је анализиран хемијски састав етарског уља изолованог

хидро-дестилацијом из четина Pinus mugo са подручја Косова и Метохије (Шар-планина). Резултати су упоређени са литературним подацима о саставу уља кривуља пореклом из различитих органа биљке. Етарско уље четина P. mugo са поментог подручја одликује доминација монотерпена (75.7%) са δ-3-кареном (21.3%) и α-пиненом (18.0%) као главним компонентама. На основу досадашњих истраживања можемо констатовати да постоји велика варијабилност хемијског састава уља које потиче из различитих органа, али истовремено и из различитих делова ареала поменуте врсте. У односу на остале врсте борова, према доступним литературним подацима, етарско уље P. mugo је релативно слабо испитивано са аспекта биолошких активности. До сада је утврђено да поседује значајан антибактеријски (нарочито против Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae) и антиоксидативни потенцијал, док се са друге стране одликује потпуним одсуством ларвицидне активности против мољца дувана Spodoptera litura.

Датум прихватања теме, ДП: 17.05.2017.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Др Гордана Стојановић

Члан: Др Петар Марин

Члан,

ментор: Др Зорица Митић

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Jelena Stojanović

Mentor, MN: Zorica S. Mitić

Title, TI: Biological activity and variability of chemical composition of the essential oil of Pinus mugo (Pinaceae)

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2017

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

38 p.; 5 pictures; 3 tables

Scientific field, SF: Biology Scientific discipline, SD: Botany

Subject/Key words, S/KW: Pinus mugo, essential oil, variability, biological activity

UC 581.5 : 544.02 + 665.52 : 582.475

Holding data, HD: Library Note, N: Abstract, AB: This master paper includes analysis of chemical composition of essential oils

isolated from needles of Pinus mugo from the territory of Kosovo and Metohija (Šar-planina) by hydrodistillation. The results were compared to literature data on composition of P. mugo essential oils collected from different plant organs. The essential oil of P. mugo needles from the study area was characterized by dominance of monoterpenes (75.7%) with δ-3-carene (21.3%) and α-pinene (18.0%) as the main components. According to the existing studies it may be concluded that there is high variability in chemical composition of oils collected from different organs, but also from different parts of range of P. mugo. In comparison to other pine species, available literature data indicate that essential oil of P. mugo was relatively poorly studied from the aspect of biological activity. So far there is evidence of significant antibacterial (especially against Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae) and antioxidant potential, while on the other hand there was a complete absence of any larvicide activity against tobacco cutworm Spodoptera litura.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

17.05.2017.

Defended on, DE:

Defended Board, DB:

President: Dr. Gordana Stojanović

Member: Dr. Petar Marin

Member, Mentor: Dr. Zorica Mitić

Documents

MASTER RAD - pmf.ni.ac.rs · Ključne reči: Pinus mugo, etarsko ulje, varijabilnost, biološka aktivnost ABSTRACT This master paper includes analysis of chemical composition of essential