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MECANISMOS MICROBIOLÓGICOS PARA LA DETECCIÓN DE MINAS ANTIPERSONAL

Abstract The research and development of different technologies for antipersonnel mine detection

has created a method that uses genetically modified microorganisms for explosives

detection. This article aims to show some of the methods developed in this field and

proposes a methodology for the proper identification of antipersonnel landmines in

Colombia using a biosensor.

Keywords: explosives, biosensors, BTEX, nitrates, ANFO

Resumen La búsqueda y desarrollo de tecnologías diferentes para la detección de minas

antipersonal, ha generado un método que emplea microorganismos genéticamente

modificados para la detección de explosivos. Este artículo pretende mostrar algunos de

los métodos desarrollados en este campo y proponer una metodología de identificación de

minas antipersonal en Colombia mediante el uso de un biosensor.

Palabras clave: explosivos, biosensores, BTEX, nitratos, ANFO

Introducción Los explosivos son sustancias que pueden causar liberación de calor, gas y una rápida

expansión de material. De acuerdo a sus propiedades los explosivos pueden ser

utilizados como detonadores o carga principal en múltiples actividades. Actualmente se

utilizan con fines militares, industriales y comerciales (Marshall & Oxley, 2009)

(International labour Organization, 2001)

Los explosivos militares de mayor uso corresponden al HMX, PETN, RDX y TNT1,

dependiendo del objetivo. Comercialmente existen diferentes tipos de formulaciones a

partir de dinamita, los más conocidos son mezclas de nitroglicerina (NG) y etilenglicol

(EGDN), sin embargo las dinamitas han sido reemplazadas por formulaciones basadas en

nitrato de amonio puesto que este tipo de explosivo ofrece mejor desempeño y representa

menores costos. Los explosivos comerciales modernos son en su mayoría mezclas de

nitrato de amonio y aceite combustible, denominado ANFO. Este es un tipo de explosivo

clasificado como oxidante y puede ser transportado libremente (Marshall & Oxley, 2009)

(Akhavan, 2011).

1 HMX: ciclo-tetrametilentetra-nitramina (High Melting explosive)

PETN: Pentaeritritol trinitrato RDX: Trimetilentrinitramina (Royal Demolition Explosive) TNT: Trinitrotolueno

2

En Colombia la fabricación de productos explosivos se encuentra regulada por la Industria

Militar (INDUMIL). Para el uso militar, INDUMIL produce cargas de demolición y utiliza los

explosivos anteriormente mencionados, mientras que para el uso civil se distribuyen

diferentes explosivos con fines específicos y bajo condiciones reguladas, incluyendo el

ANFO (Industria Militar de Colombia, 2012).

Los grupos al margen de la ley en Colombia crean minas antipersonal de manera

artesanal, utilizando como carga explosivos artesanales como el ANFO, R1, BENCLO y

Amonal2. El ANFO es de fácil preparación y las materias primas son de fácil acceso, pues

el nitrato de amonio es usado como fertilizante por lo que conseguirlo es relativamente

simple y el combustible generalmente empleado es aceite combustible para motor

(ACPM) o diesel.

Con el fin de detectar minas antipersonal o explosivos se han desarrollado métodos de

identificación microbiológica haciendo uso de organismos genéticamente modificados.

Estos microorganismos son empleados como biosensores que al entrar en contacto con la

sustancia explosiva, son capaces de generar una señal observable que permite su

identificación.

La detección de explosivos haciendo uso de biosensores ha sido enfocada hacia la

detección de TNT. Se ha utilizado Pseudomonas putida que contiene un plásmido con un

gen reportero que se expresa al entrar en contacto con el TNT. El reportero emite

generalmente una señal óptica mediante fluorescencia o bioluminiscencia que indica la

localización del compuesto objetivo (Kercel, Burlage, Patek, & Smith, 1997).

Los bioreporteros se han empleado del mismo modo para la detección de otras sustancias

como compuestos aromáticos y nitratos. En la detección de compuestos aromáticos los

más estudiados han sido los BTEX3. El plásmido que contiene la proteína regulatoria ha

sido ampliamente estudiado y manipulado en diferentes estudios, en los que se han

fusionado los genes de detección de tolueno con genes reporteros (gfp o Lux) que

permiten la emisión de una señal fluorescente o bioluminiscente al detectar BTEX

(Burlage, Hooper, & Sayler, 1989) (Li, Li, Ho, & Liao, 2008).

Del mismo modo, la detección de nitratos mediante biosensores ha sido posible en

diferentes ambientes. Generalmente estos biosensores han sido utilizados en medios

anaerobios y para aguas residuales, con el fin de determinar la contaminación debido a

fertilizantes en estas aguas. Sin embargo este tipo de sensores también han sido

empleados en suelos con el fin de detectar la biodisponibilidad de nitratos. En los estudios

mencionados se realizan fusiones entre los genes reporteros como Lux o gfp con genes

que regulan la expresión de nitrato reductasa en diferentes microorganismos. De este

modo, se logra obtener un sensor que produce una respuesta bioluminiscente o

fluorescente en presencia de nitratos.

2 R1: Mezcla de nitrato de Amonio, aluminio en polvo y clorato de potasio

BENCLO: Mezcla de benzoato de sodio y clorato de potasio Amonal: Mezcla de nitrato de amonio y aluminio en polvo 3 BTEX: Benceno, Tolueno, Etilbenceno y Xileno.

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Según las observaciones presentadas anteriormente, la pregunta que surge es si es

posible obtener microorganismos modificados genéticamente para detectar minas

antipersonal. Esta pregunta será contestada por medio de una revisión bibliográfica

enfocada hacia los siguientes objetivos específicos.

Identificar los explosivos más comunes utilizados en las minas antipersonal en

Colombia.

Identificar bacterias modificadas genéticamente o metodologías de modificación

genética, encaminadas hacia la identificación de los principales componentes de

las minas antipersonal.

Desarrollar un planteamiento teórico para el diseño de un microorganismo

genéticamente modificado, que pueda ser utilizado para la identificación de minas

antipersonal en el territorio colombiano.

Marco teórico

Explosivos

Los explosivos son sustancias que contienen una gran cantidad de energía almacenada

que puede producir una explosión. Esta explosión es una expansión repentina del material

generalmente acompañada por la liberación de calor, presión, luz y sonido (Jannsen,

2011).

Los explosivos se clasifican en dos tipos, de bajo orden y de alto orden. Esta clasificación

se da de acuerdo a su estructura y desempeño. Los explosivos de baja magnitud u orden

se caracterizan por reaccionar a tasas bajas (cm/s) e incluyen sustancias como pólvora

negra, propelentes y juegos pirotécnicos, etc. Los explosivos de alto orden se caracterizan

por tener tasas de propagación altas (km/s) y se dividen en explosivos primarios y

explosivos secundarios. Los explosivos primarios son altamente susceptibles a la

iniciación, mientras que los secundarios son generalmente utilizados como carga

principal, dado que detonan bajo condiciones especiales. Dentro de estos explosivos se

encuentran los nitroaromáticos y los explosivos plásticos. Algunos de los explosivos más

utilizados en la industria militar son los nitroaromáticos, nitraminas y esteres de nitratos

(Singh, 2007).

A continuación se presenta una tabla con las principales categorías de explosivos:

Tabla 1. Principales categorías de explosivos

Clase del compuesto

Ejemplo Símbolo Fórmula Se encuentra comúnmente en

Nitro Alifáticos

Nitrometano Nitrato de hidracina

--- ---

CH3NO2 H5N3O3

Combustible para cohetes y componente de partes explosivas

Nitro aromáticos

Nitrobenceno Nitrotolueno 2,4,6-trinitrotolueno

NB NT TNT

C6H3NO2 C7H7NO2 C7H5N3O6

Compuesto B. (Contiene partes iguales de RDX,

4

2,4-dinitrotolueno 2,4,6 trinitrofenol

DNT TNP

C7H6N2O4 C6H3N3O7

pentolita y PETN).

Esteres de nitrato

Nitroglicerina Etilenglicol dinitrato Tetranitrato de pentaeritritol Nitrocelulosa

NG EGDN PETN ---

C4H5N3O7 C2H4N2O4 C5H8N4O12 [C8H13N3O11]n

Algunos tipos de dinamita y productos farmacéuticos contienen nitroglicerina. Los cordones detonantes tienen RDX.

Nitraminas

Trinitro- triazaciclohexano Tetranitro-tetrazaciclooctano Tetranitro-N-Metilanilina

RDX HMX Tetril

C3H6N6O6 C4H8N8O8 C7H5N5O8

C-4.

Sales ácidas

Nitrato de Potasio Nitrato de amonio

--- ---

--- H4N2O3

Polvora negra con carbón y azufre. Nitrato de amonio y aceite combustible (ANFO) por sus siglas en ingles.

Peróxidos

Hexametileno triperóxido de diamina Triperoxido de triacetona

HMTD TATP

C6H12N2O6 C3H6O6

Tomado de (Singh, 2007)

En Colombia un gran número de minas antipersonal son desarrolladas por grupos al

margen de la ley de manera artesanal. Las fuerzas militares han informado que para su

fabricación se utilizan explosivos como el nitrato de amonio (80%), aserrín (15%) y

aluminio en polvo (5%). Adicionalmente se ha notado que estos Artefactos explosivos

improvisados (AEI) contienen tornillos, vidrios, melaza, trozos de metal y materia orgánica

(Comando General Fuerzas Militares, 2008).

La tabla 2. Presenta los tipos más comunes de minas antipersonal o terrestres empleados

por grupos al margen de la ley en Colombia:

Tabla 2. Tipos de minas antipersonal comunes

Tipo de Mina Descripción Tipo de explosivo

Mina “quiebrapatas”

Este tipo de mina es la de mayor uso en Colombia y está diseñada para que explote al momento de ser pisada. Se fabrican artesanalmente, tienen un cuerpo compuesto de PVC y como carga generalmente contienen nitrato de amonio y dinamita y se acciona

Nitrato de amonio, ANFO o R1

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mediante ignición eléctrica. Además constan de un alambre de conducción eléctrica, una pila o batería, un detonador eléctrico y trozos de metal y vidrio.

Mina “quiebrapatas” química

Este tipo de mina está fabricada completamente en plástico y contienen un émbolo, ácido sulfúrico, pólvora negra y explosivo

Pólvora negra, ácido sulfúrico, ANFO o R1

Mina tipo abanico

Generalmente está compuesta por lámina galvanizada, explosivos y trozos de metal (metralla). El tamaño depende del objetivo de los grupos al margen de la ley.

ANFO o R1

Mina tipo sombrero chino

Está compuesta por lámina galvanizada, trozos de metal (metralla) y explosivo. El tamaño depende del objetivo de los grupos al margen de la ley.

ANFO o explosivos caseros

Mina tipo cajón Se compone de una lámina galvanizada, explosivo, brea y metralla.

R1, explosivos caseros

Mina tipo cumbo

Está compuesta por láminas galvanizadas, tubos de PVC, plásticos o de metal, brea, explosivo y trozos de otros materiales.

R1, explosivos caseros

Mina tipo costal Tiene un cuerpo de costal de fique que al interior contiene brea, explosivos y metralla.

Explosivos caseros

Tomado de “Características de los artefactos explosivos improvisados utilizados por los GAML4 como

minas antipersonal” (Programa Presidencial para la Acción Integral contra minas Antipersonal, 2010)

Para el año 2001 se estimó un número aproximado de cien mil minas antipersonal (MAP)

y AEI distribuidos en las diferentes regiones del territorio nacional (Lopera & Milisavljevic,

2007). Hasta la fecha, el programa Presidencial para la Acción integral contra Minas

Antipersonal, estima un total de 10557 víctimas siendo Antioquia, Meta y Caquetá los

departamentos más afectados (Programa Presidencial para la Acción Integral contra

Minas Antipersonal, 2013).

A partir de la información presentada previamente acerca de los explosivos de mayor uso

en las minas antipersonal en Colombia, se puede afirmar que los más utilizados

corresponden a R1 y ANFO. El R1 es una mezcla de nitrato de amonio, aluminio en polvo

y clorato de potasio. Aunque la composición del explosivo puede variar, generalmente los

anteriores componentes se asignan en un porcentaje de 60, 20, 20 respectivamente. Es

altamente explosivo y de fácil fabricación (Polanco & Prado, 2007).

4 GAML: Grupo Armado al Margen de la Ley

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El ANFO es una mezcla de nitrato de amonio y aceite combustible, la composición típica

del explosivo es aproximadamente 94% Nitrato de Amonio y 6% aceite combustible,

aunque esto puede variar. Es un explosivo de alto orden y se usa ampliamente en

procesos de minería y demolición (Wescott, 2007).

La fracción de aceite combustible contenida en el ANFO corresponde a Diesel. El Diesel o

aceite combustible para motor (ACPM), es una mezcla de hidrocarburos que contiene de

10 a 28 átomos de carbono provenientes de fracciones combustibles de diferentes

procesos realizados durante la refinación del petróleo. El nombre que se le asigna a este

producto en Colombia es Fuel Oil grado N° 2D (Ecopetrol S.A., 2012). El diesel contiene

una compleja mezcla de fracciones de hidrocarburos alifáticos y aromáticos, dentro de los

cuales se encuentran compuestos orgánicos volátiles, como los BTEX, olefinas y

parafinas, etc. (Agency for Toxic Substances & Disease Regulation, 1995).

Dicho esto se considera tomar como contaminante objetivo el ANFO por considerarse el

de mayor uso en los AEI.

Ingeniería genética y detección de explosivos

Biosensores

Un biosensor se define como un mecanismo o dispositivo capaz de detectar, registrar y

transmitir información concerniente a un cambio fisiológico o a la presencia de materiales

químicos o biológicos en el medio ambiente. (Rogers, 2006). Diferentes tipos de bacterias

modificadas genéticamente han sido utilizadas como biosensores con el fin de que emitan

una señal detectable, como luz, cuando se encuentran en presencia de un contaminante

de interés; a estas bacterias se les ha denominado bioreporteras. (Jacobson, 1996) Los

biosensores bacteriales generan productos genéticos identificados por genes reporteros

que están presentes en cepas bacterianas o que son introducidos mediante manipulación

genética (Sorensen, Burmolle, & Hansen, 2006).

Los bioreporteros se construyen por lo general, uniendo el ADN de una ruta reguladora, a

la región codificadora de un gen reportero, de tal modo que se genere otra proteína de

fácil medición. El bioreportero contiene el sensor o componente regulatorio necesario para

controlar la expresión del gen reportero, de esta manera al detectar la sustancia de interés

o efector, el componente regulatorio activará la transcripción del gen reportero para que

se emita una señal (Van der Meer, Tropel, & Jaspers, 2004).

Los bioreporteros se clasifican en tres clases: específicos (clase I), semi-específicos

(clase II) y generales (clase III). Los específicos o clase I, responden solo ante

compuestos específicos, pues contienen una fusión promotor-gen reportero, o una

proteína regulatoria que activa o desactiva el promotor, incrementando la señal emitida.

Los semi-específicos tienen un gen que se une a un promotor encargado de responder

ante un estimulo, de este modo el gen reportero se expresa cuando la cepa se expone

ante condiciones detonantes, produciendo una respuesta específica. Finalmente, los

bioreporteros generales reaccionan ante una gran variedad de compuestos manifestando

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una disminución en su actividad metabólica y reduciendo la intensidad de la señal

producida cuando entran en contacto con el contaminante (Sorensen, Burmolle, &

Hansen, 2006) (Van der Meer, Tropel, & Jaspers, 2004).

Bioluminiscencia y fluorescencia

Los reporteros más ampliamente utilizados corresponden a los genes Lux de las bacterias

bioluminiscentes o de las luciérnagas y al gen de la proteína verde fluorescente (GFP)

proveniente de la medusa Aequuorea victoria. Otro gen usado corresponde al gen LacZ

proveniente de Escherichia coli (Girotti, Stefano; Ferri, Elida; Furano, Maria Grazia;

Maiolini, Elisabetta, 2008) (Sorensen, Burmolle, & Hansen, 2006).

La bioluminiscencia es catalizada por la enzima luciferasa que reacciona con el sustrato

luciferina para producir una molécula en estado excitado que genera fotones a medida

que vuelve a su estado de equilibrio. Este sistema se enfoca en genes Lux y Luc (Xu,

Close, Sayler, & Ripp, 2013). Las reacciones de luminiscencia son controladas por un

operador de cinco genes Lux CDABE. Este permite la emisión de una señal continua e

independiente. Estos bioreporteros contienen el complemento completo de

luciferasa/luciferina para que se genere bioluminiscencia espontáneamente sin

intervención alguna. El gen Luc, derivado de Phtinus Pyralis, es un gen reportero dada su

alta emisión de luz y rápida respuesta cinética. El gen reportero Luc necesita un

componente exógeno (luciferasa como sustrato), pues la señal no reacciona ni de manera

autónoma ni continua. La GFP es una proteína clonada de la medusa Aequorea victoria y

produce luz en diferentes colores. No requiere substrato para ello, pero requiere de una

luz externa que active su fluorescencia y por ende se requiere de instrumentación para

ello (Xu, Close, Sayler, & Ripp, 2013).

Uno de los sistemas de bioreporteros se denomina de “encendido” (lights-on). En este, la

célula emite luz cuando se expone ante el químico o toxina de interés. La célula

determinada contiene un promotor que se encarga de responder ante la sustancia

química. La unión entre el promotor y los genes se manipula, reemplazándola con un gen

reportero que al momento de ser activado por el promotor se transcribe y traduce en una

proteína reportera que emite bioluminiscencia, fluorescencia o una señal colorimétrica

(Xu, Close, Sayler, & Ripp, 2013) (Belkin, 2003). Para reporteros específicos el promotor o

gen reportero se une directamente a un químico particular y la generación de luz y su

intensidad, identifica el químico e indica los lugares de concentración.

En el sistema “de apagado” (lights-off), el bioreportero está diseñado para emitir

continuamente una señal de luz visible. Si en algún momento la intensidad de esta luz se

ve alterada, es decir, si se presenta un decrecimiento en la intensidad puede indicar que

la interacción de la sustancia química con el bioreportero está causando una interrupción

en el metabolismo natural de la célula (Xu, Close, Sayler, & Ripp, 2013) (Girotti, Stefano;

Ferri, Elida; Furano, Maria Grazia; Maiolini, Elisabetta, 2008).

Plásmidos

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Un plásmido es una molécula de ADN extracromosómico y autoreplicativo. Los plásmidos

se caracterizan por tener forma circular y ser moléculas con doble hélice de ADN

completamente independientes del ADN cromosomal. Ocurren naturalmente en bacterias,

levaduras y algunas células eucariotas. Su tamaño varía de miles de pares de bases a

más de 100 Kilo-bases (Kb). El ADN de los plásmidos se duplica previamente a una

división celular. Durante la división, al menos una copia del ADN es transmitida a una

célula hija, asegurando la propagación de la información contenida en el plásmido

(Lodish, y otros, 1999).

Los plásmidos se pueden utilizar como vectores de clonación y en este caso constan de

tres partes, el origen de replicación (ORI), una región para el marcador de selección y la

región donde se inserta el gen de interés. El origen de replicación es una secuencia

específica de ADN que debe estar presente para que se inicie la replicación del plásmido.

De este modo una vez iniciada, la replicación continúa alrededor del plásmido siendo

independiente de la secuencia de nucleótidos, lo que permite que cualquier secuencia de

ADN insertada en el plásmido se replique. Con el fin de clonar fragmentos específicos de

ADN en un plásmido, se utilizan enzimas de restricción y ligasas. Las enzimas de

restricción son enzimas de origen bacteriano que reconocen secuencias específicas de

bases llamados sitios de restricción, donde cortan la secuencia de ADN. Los extremos

resultantes son complementarios con otros fragmentos generados por la misma enzima

de restricción. De este modo los extremos cohesivos pueden unirse con otros fragmentos

de ADN exógenos que al haber sido generados por la misma enzima de restricción,

independientemente de su origen, permiten la inserción de información genética (Lodish, y

otros, 1999).

Métodos de detección de explosivos con biosensores

En 1998 Robert Burlage, David Patek y Kirk Everman, patentaron un nuevo método de

detección de explosivos utilizando un biosensor (Burlage, Patek, & Everman, 1999). Este

método en particular se enfocó en minas. El método consiste en esparcir un sensor

biológico sobre la superficie del área que se cree está contaminada para que el sensor

reaccione con el explosivo y emita una señal detectable. El biosensor creado, produce

una proteína que requiere de un sustrato para reaccionar y generar la señal. Tanto el

biosensor como el sustrato se esparcen sobre el terreno en conjunto (Kercel, Burlage,

Patek, & Smith, 1997).

Los autores crearon diferentes tipos de expresión con el fin de brindar distintas

alternativas de uso al biosensor. La expresión se puede dar mediante la producción de

una proteína que emite fluorescencia tras excitarla. Adicionalmente se puede utilizar luz

ultravioleta para confirmar la presencia de fluorescencia. La proteína que se genera puede

ser fluorescente o bioluminiscente. La alternativa final consiste en el uso de un organismo

genéticamente modificado que funciona como biosensor, una posibilidad que se planteó

fue usar Pseudomonas putida y Bacillus subtilis. Para la detección los autores también

propusieron distintas alternativas. La primera consistió en incluir una cepa recombinante

de una bacteria que responde al contacto con las sustancias químicas explosivas y emiten

una señal detectable. Otra alternativa consistió en insertar un elemento regulatorio

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perteneciente a un gen que reacciona ante el químico. El elemento regulatorio es una

proteína capaz de generar una señal (Burlage, Patek, & Everman, 1999).

El método descrito previamente, se desarrolló teniendo en cuenta que los explosivos sin

detonar bajo la superficie emiten vapores. Los vapores se concentran en el suelo y migran

a la superficie. Esta emisión de vapores suele ocurrir cuando hay presencia de sustancias

explosivas convencionales como TNT, RDX y HMX. Por este motivo el bioreportero

utilizado debe ser uno, que al ser expuesto a los vapores explosivos, produzca una

proteína que se exprese mediante la emisión de fluorescencia y se visualice ante la luz

ultra violeta (Burlage, Patek, & Everman, 1999).

A pesar de esta invención a finales de los años 90, en la literatura no se encuentra una

amplia investigación al respecto ni avances en el uso de biosensores para la detección de

minas antipersonal. Algunos autores han utilizado biosensores para examinar su

respuesta ante nitrotoluenos. Mediante PCR y alteración de la secuencia de ADN,

desarrollaron variaciones del efector de dominio de reconocimiento del regulador XylR,

sensible al tolueno y proveniente de Pseudomonas putida. Este regulador responde ante

la presencia de toluenos. En este estudio se comprobó que cuando las cepas que

contenían los reporteros de transcripción fusionados con una señal óptica (Lux AB, GFP),

se distribuyeron en el suelo que contenía nitrotoluenos, la señal se activó mediante el

promotor, lo que permitió la localización del compuesto objetivo en la superficie

(Garmendia, De las Heras, Galvão, & De Lorenzo, 2008).

Otros investigadores han utilizado biosensores para TNT haciendo uso de la microalga

Dictyosphaerium chlorelloides. Durante el estudio se utilizaron dos genotipos del alga con

el fin de determinar su sensibilidad y especificidad ante el compuesto. Se midió la

inhibición de la fluorescencia emitida por el alga ante la presencia del explosivo puesto

que este disminuye la actividad fotosintética de la microalga (Altamirano, y otros, 2004).

Adicionalmente se desarrolló un diseño computacional de una proteína que tiene

receptores para TNT, específicamente en sitios de unión para el compuesto. Estos se

incorporan a un camino sintético de traducción de la señal, regulando la expresión del gen

en respuesta a la presencia de TNT (Harper & Furton, 2007). La proteína de unión,

predice los cambios que se darán en una secuencia de aminoácidos para crear nuevas

proteínas capaces de unirse específicamente a una sustancia como el TNT. El ADN que

codifica la proteína de unión se sintetiza y clona en una bacteria. Las propiedades de

florescencia de la proteína se alteran al unirse al TNT, brindando una medición en tiempo

real de la unión al TNT (Existing and Potential Standoff Explosives Detection Techniques,

2004) (Looger, Dwyer, Smith, & Hellinga, 2003).

La última investigación desarrollada al respecto se llevó a cabo durante 2009 por Alistair

Elfick y su equipo durante el IGEM5 de 2009. El equipo de la Universidad de Edimburgo

desarrolló un proyecto en el que se creó un biosensor y biorremediador para explosivos

como el TNT y el RDX. El biosensor identifica tanto la presencia de TNT, como de nitritos

5 IGEM: International Genetically Engineered Machine (iGEM) Foundation

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y nitratos, mediante un promotor diseñado computacionalmente, que al entrar en contacto

con los nitritos, nitratos o el explosivo, emite una señal directamente visible como una

combinación de luz y florescencia. El receptor diseñado computacionalmente recibió el

nombre de TNT.R1, que al entrar en contacto con el TNT, le permitirá interactuar con una

proteína de fusión que tiene la función de activar diferentes promotores (Edinburgh

University iGEM Team , 2009).

Métodos de detección de nitratos con biosensores

En la literatura se registra la construcción de biosensores de fluorescencia y

bioluminiscencia para la detección de nitratos.

Un biosensor construido consistió de un plásmido (pSB450) que contenía el promotor de

nitrato reductasa de Escherichia coli (narG) y el operón lux de Photorhabdus

luminescens, al entrar en contacto con nitratos producía bioluminiscencia. (Prest, Winson,

Hammond, & G.S.A.B., 1997) En otra de las investigaciones realizadas, se desarrolló un

sensor a partir de Escherichia coli. El sensor contiene un plásmido (pPNARGFP) en el

cual se fusionaron el promotor específico para nitrato reductasa y su región regulatoria,

con el gen gfp codificando la proteína verde fluorescente. El biosensor fue utilizado para

determinar la presencia de nitratos en agua en condiciones anaerobias (Taylor, Bain, &

Richardson, 2004).

En otro estudio, el promotor de nitrato reductasa (narG) de Escherichia coli fue fusionado

con el gen reportero de nucleación del hielo (InaZ) y el de la proteína verde fluorescente

(GFP) para construir plásmidos que permitieran generar una respuesta ante la presencia

de nitratos en la rizosfera. Se obtuvieron resultados exitosos bajo condiciones aerobias y

anaerobias (DeAngelis, Ji, Firestone, & Lindow, 2005).

Otro Biosensor con Lux se utilizó en 2007 para la detección de Nitritos y nitratos en agua

residual, en este estudio se construyó un bioreportero bioluminiscente (W6-1) haciendo

uso del promotor nasR, este regula la expresión de los genes que codifican la

nitrito/nitrato reductasa en Klebsiella oxytoca, y el gen luxCDABE de Vibrio Fischeri

(Desouky, Ripp, Zaki, & Sayler, 2007).

Métodos para la detección de BTEX con biosensores

El plásmido TOL (pWW0) es conocido por codificar enzimas que degradan el tolueno. Sin

embargo también se ve involucrado en la degradación de m-xileno, p-xileno y otros

compuestos relacionados (Burlage, Hooper, & Sayler, 1989). Este plásmido contiene dos

genes regulatorios, xylR y xylS. La proteína XylR se une al tolueno y compuestos

similares y activa la transcripción del promotor Pu. Este mecanismo de activación ha sido

descrito en diferentes investigaciones y usado para la detección de BTEX (Li, Li, Ho, &

Liao, 2008).

Generalmente los biosensores construidos expresan fluorescencia o bioluminiscencia

para la detección de tolueno y compuestos relacionados. Los genes reporteros utilizados

son gfp y luxCDABE. Los biosensores se basan en el plásmido TOL que incorpora el

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activador transcripcional xylR. El sistema se induce en presencia de diferentes

compuestos aromáticos como tolueno, naftaleno, o-xileno, p-xileno, catecol, etilbenceno,

fenol, acetofenona y benzaldehído. La expresión de los reporteros se da cuando se

fusionan los genes al promotor Pu. En la mayoría de los estudios los genes y el promotor

son clonados en diferentes vectores para obtener plásmidos biosensores de compuestos

aromáticos. Los resultados muestran una respuesta positiva ante la detección de tolueno

con ambos biosensores, obteniendo un incremento en la fluorescencia y/o

bioluminiscencia al entrar en contacto con el tolueno (Li, Li, Ho, & Liao, 2008) (De las

Heras & De Lorenzo, 2011). Existen diferentes variaciones de estos biosensores para

BTEX, sin embargo todos hacen uso del promotor Pu y el regulador xylR. Algunas

construcciones incluyen el uso de plásmidos que expresan el gen de luciferasa en

respuesta a BTEX (pBTEX-W, PBTEX-SD y pBTEX-SE) (Yu, y otros, 2011).

Desarrollo La alternativa propuesta consiste en la inserción del plásmido pBTEX-SD, en una cepa de

E. Coli DH5α, y la inserción del plásmido pNgfp en otra cepa de Enterobacter cloacae.

Esto con el fin de lograr su crecimiento en el medio Luria-Bertani (LB) separadamente

(DeAngelis, Ji, Firestone, & Lindow, 2005) (Yu, y otros, 2011).

Manipulación de plásmidos

El plásmido seleccionado para la detección de nitratos corresponde a pNgfp, presentado

en la figura 1. Este plásmido tiene la capacidad de expresar el gen de fluorescencia gfp

cuando se encuentra en presencia de nitratos. Adicionalmente contiene el gen L28Hfnr

que codifica de modo diferente el regulador transcripcional Fnr en presencia de oxigeno,

con el fin de permitir la transcripción por parte del promotor narG (DeAngelis, Ji, Firestone,

& Lindow, 2005). Se selecciona este plásmido dada su capacidad de detectar nitratos y

emitir una señal fluorescente en presencia de oxigeno. Esta característica es importante

para la detección del nitrato de amonio presente en el ANFO.

El plásmido seleccionado para la detección de BTEX corresponde a pBTEX-SD,

presentado en la figura 2. Este plásmido utiliza el promotor Pu y el regulador xylR

provenientes del plásmido TOL de Pseudomonas putida. Este plásmido difiere en su sitio

de unión al ribosoma (RBS) pues tiene una variación en el gen reportero luc que

incrementa la intensidad de la señal emitida y la sensibilidad del gen reportero. De este

modo el gen de luminiscencia luc se expresa cuando se encuentra en presencia de BTEX

(Yu, y otros, 2011). Este plásmido fue seleccionado dada su capacidad de expresar

bioluminiscencia en presencia de BTEX, puesto que el ANFO contiene diesel y por ende

fracciones de compuestos como BTEX.

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Figura 1. Plásmido pNgfp. Adaptado de (DeAngelis, Ji, Firestone, & Lindow, 2005)

Figura 2. Plásmido PBTEX. Adaptado de (Yu, y otros, 2011)

Los plásmidos mostrados anteriormente serán insertados separadamente en una cepa de

E. coli DH5α.

Cultivo de la cepa

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Alternativa 1

Reactivar la cepa recombinante de E. coli DH5α, que contiene el plásmido pBTEX-SD

para posteriormente sembrar la cepa en el medio de cultivo LB a una temperatura de

37°C. Se debe agregar un suplemento de antibióticos, en este caso, ampicilina en una

concentración de 100 μmol L-1. Luego, se debe realizar una suspensión del

microorganismo en solución salina (0.85% p/v), asegurando que este cultivo se realice

bajo las siguientes condiciones; agitación de 150 rpm, temperatura de 37°C y tiempo de

12 horas.

La cepa que contiene el plásmido pNgfp también debe reactivarse para ser sembrada en

el medio LB. El suplemento de antibióticos que debe ser agregado es de kanamicina en

una concentración de 50 μg mL-1. Luego se debe realizar una suspensión del

microorganismo en solución salina. (0.85% p/v), bajo condiciones de agitación de 150 rpm

y temperatura de 37°C, durante 12 horas.

Cuando ambas cepas alcancen un crecimiento máximo, se debe almacenar la nueva

solución en caldo y esparcirla sobre el terreno.

Alternativa 2

Se debe reactivar la cepa E.coli DH5α con el plásmido pBTEX-SD y sembrar la cepa

recombinante en el medio de cultivo LB, con el respectivo suplemento de ampicilina en

una concentración de 100μmol L-1. Luego se debe realizar la suspensión del

microorganismo en solución salina (0.85%p/v). El cultivo esterilizado debe ponerse a

agitar a 150 rpm durante 12 horas, para posteriormente someter la cepa a centrifugación

a una temperatura de 37°C y velocidad de 50000 rpm. A continuación, se debe liofilizar la

biomasa para almacenarla. Cabe mencionar que esta segunda alternativa es más costosa

debido al proceso de liofilizado.

La manipulación de la cepa de Enterobacter cloacae que contiene el plásmido pNgfp, se

realiza del mismo modo que la de E.coli DH5α, reemplazando el suplemento antibiótico

por kanamicina en una concentración de 50μg mL-1, los demás procedimientos

mencionados previamente se repiten para esta cepa.

Cuando ambas cepas hayan alcanzado un crecimiento máximo se esparcen sobre el

terreno potencialmente afectado por la presencia de minas antipersonal.

Identificación de minas antipersonal mediante microorganismos

El medio de cultivo que contiene los microorganismos puede ser directamente esparcido

sobre la zona deseada al seleccionar la alternativa 1, pues el caldo de cultivo contiene los

microorganismos listos para ser empleados como se mencionó previamente. Del mismo

modo, si se desea obtener la cepa recombinante liofilizada la mezcla sólida puede ser

esparcida desde un medio aéreo sobre una zona con alta probabilidad de contener minas

antipersonal.

14

Cuando las cepas recombinantes entren en contacto con ambos compuestos, los genes

específicos se expresaran emitiendo bioluminiscencia en presencia de BTEX y

fluorescencia en presencia de nitratos. De esta manera al expresarse estas dos

características se tiene una alta probabilidad de detección de una mina que contiene

ANFO como carga principal.

La cantidad de microorganismos a ser utilizados depende del área que pueda estar

potencialmente minada y sobre la cual se pretenda aplicar el biosensor. Tomando como

referencia la patente “Method for detection of buried explosives using a biosensor” donde

se esparce el biosensor sobre un área minada, la cantidad estimada de bacterias a

esparcir es de 1000 bacterias por centímetro cuadrado. Con una cantidad de 55 galones

de bacterias se puede abarcar un área aproximada de 100 acres (Burlage, Patek, &

Everman, 1999). La metodología que se plantea, sugiere utilizar un número similar de

bacterias al anteriormente mencionado realizando una equivalencia de acuerdo al área

que se quiera abarcar.

Es importante mencionar que para la visualización de la fluorescencia emitida por los

microorganismos es necesario el uso de una lámpara que emita luz ultravioleta.

Discusión Este método de detección presenta ventajas y desventajas, a continuación se presentan

algunos factores importantes que se deben tener en cuenta para su aplicación y algunas

recomendaciones.

La metodología propuesta puede presentar un método alternativo de cultivo en el que se

manipulen los plásmidos con el fin de que sean insertados en un mismo microorganismo y

cultivados en un único medio. En ese caso se debería examinar la compatibilidad de los

orígenes de replicación y examinar la resistencia a antibióticos de cada plásmido.

En cuanto al esparcimiento del microorganismo en el caso de decidir liofilizar y obtener

una matriz sólida, los microorganismos se pueden dispersar en el momento de ser

arrojados en el aire y no cumplir con la cantidad deseada en el suelo, lo que podría

complicar su detección pues posiblemente las tasas de emisión de luminiscencia y

fluorescencia no serían lo suficientemente altas como para permitir la visualización de la

señal emitida.

La necesidad de uso de la luz ultravioleta implica el uso de mayores herramientas. Una

sugerencia que se hace es dotar al personal de las fuerzas armadas de lámparas UV que

les permita la detección del microorganismo.

La metodología que aquí se propone debería reducir algunos costos de detección de

minas, pues muchas de las tecnologías que se aplican actualmente implican altos costos

y no son específicas para explosivos como el ANFO.

El costo de implementación de este método incluiría la mano de obra por la aspersión de

los microorganismos desde el aire, el costo de los equipos de luz UV necesarios para

15

detectar la fluorescencia, los trabajos de investigación necesarios para la producción del

microorganismo, la generación del mismo y la mano de obra para detectar las cepas. Si

bien esos son algunos de los costos más generales en los que se puede incurrir, no se

presenta un valor aproximado pues es necesario en primer lugar realizar pruebas de

laboratorio. Sin embargo podría reducir costos al ser específico para un explosivo, abarcar

grandes extensiones de tierra y reducir el uso de equipos de alto costo por personal con

entrenamiento militar.

Es de gran importancia realizar pruebas piloto con el fin de determinar el tiempo de

supervivencia de la cepa recombinante en ausencia de antibióticos en su medio. El tiempo

que se estima actualmente para el crecimiento de la cepa es de 12 a 24 horas, a partir de

las cuales el crecimiento debería detenerse. Las pruebas de laboratorio deben incluir

muestras de suelos contaminados con el explosivo, que permitan probar la viabilidad de la

técnica y hacer estimaciones precisas de las cantidades de microorganismos necesitados

y las condiciones en las cuales deben ser cultivados.

En caso de que las pruebas piloto resultaran exitosas, el método debe contar con los

debidos permisos ambientales aprobados para su implementación. El ministerio de medio

ambiente es la entidad encargada de estudiar y aprobar el uso de microorganismos

genéticamente modificados para la detección de minas antipersonal, bajo el debido marco

de bioseguridad, comprobando que no tenga ningún impacto o efecto adverso sobre el

ecosistema.

Finalmente cabe mencionar que la metodología que se presentó es solo una

aproximación teórica para la detección de minas antipersonal cuya carga principal sea

ANFO y que se necesita una investigación más amplia al respecto para que tenga validez.

Adicionalmente

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