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MECANISMOS MOLECULARES Y PAPEL DEL MASTOCITO
EN LA INFLAMACIÓN DE LA MUCOSA INTESTINAL ASOCIADA AL SÍNDROME DEL INTESTINO IRRITABLE.
Memoria presentada por Cristina Martínez Martínez para optar al grado de Doctor del Programa de Doctorado en
Bioquímica, Biología Molecular y Biomedicina Barcelona, Julio de 2011
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Universitat Autònoma de Barcelona
Tesis Doctoral dirigida por Francisco Javier Santos Vicente y
María Vicario Pérez
FRANCISCO JAVIER SANTOS VICENTE, Doctor en Medicina, y MARÍA VICARIO
PÉREZ, Doctora en Farmacia.
HACEN CONSTAR
Que la memoria titulada ”Mecanismos moleculares y papel del mastocito en la
inflamación de la mucosa intestinal asociada al síndrome del intestino irritable”
presentada por Cristina Martínez Martínez para optar al grado de Doctor, se ha
realizado bajo su dirección y, al considerarla concluida, autorizan su presentación para
ser juzgada por el tribunal correspondiente.
Y para que conste a los efectos, firman la presente en Barcelona, Julio de 2011
Dr. Francisco Javier Santos Dra. Maria Vicario
Director Co-Directora
La imagen de la portada corresponde a una micrografía tomada por microscopía
confocal de la mucosa del yeyuno de un paciente con SII-D en la que se muestra el
marcaje de la forma fosforilada de la proteína MLC, que forma parte de los resultados
de esta tesis.
La imagen de la parte posterior corresponde a una micrografía tomada por
microscopía electrónica de barrido de la mucosa ileal de ratas Wistar-Kioto, cedida por
la Dra. María Vicario Pérez.
“Si he conseguido ver más lejos, es porque me he aupado en hombros de gigantes.”
Isaac Newton (1642-1727) Físico y matemático inglés.
AGRADECIMIENTOS
Supongo que todo el mundo que llega a este momento y echa la vista atrás tiene la
sensación de llevar toda una vida luchando para conseguir cruzar la barrera del
doctorado y seguir avanzando en la carrera investigadora. Mi camino, además de duro
y muy largo, ha sido bastante atípico.
No puedo evitar esbozar una sonrisa cuando recuerdo una conversación que
mantuve en la cafetería de la universidad durante mi último año de carrera. En aquel
momento tenía clarísimo que mi futuro profesional estaba ligado a alguna empresa
privada. Nada de investigación que es muy sacrificado y está mal pagado. Quién lo
hubiera dicho… No se muy bien cómo ni por qué, pero acabé metiéndome de lleno en
el mundo de la investigación y haciendo mil sacrificios para poder continuar hacia
delante. Pese a todo me considero enormemente afortunada porque he tenido la
oportunidad de conocer a personas extraordinarias que me han enseñado mucho
acerca del mundo de la ciencia, pero también de la vida. Son los gigantes de Newton a
los que me he aupado para poder ver mejor y más lejos.
Me niego rotundamente a escribir una lista interminable de nombres a los que
agradecer uno a uno su contribución personal y/o profesional, sobretodo porque son
demasiados y, inevitablemente, me olvidaría de alguien. Sin embargo, no puedo evitar
hacer una mención especial a dos grupos que han sido fundamentales para haber
llegado hasta donde estoy ahora mismo. El primero al inicio de mi camino como
investigadora, hace ya muchos años, y el otro al principio del final de esta larguísima
etapa pre-doctoral.
En primer lugar gracias a Jose Luis, Víctor, Pilar, Miguel, Ángeles y Adela. Por
transmitirme la pasión y el entusiasmo por la ciencia. Fuisteis los primeros en
enseñarme que pese a los malos momentos siempre es posible mantener la ilusión.
Aunque fueron muy duros, recuerdo aquellos dos años con muchísimo cariño. Y cómo
no, gracias a Alfredo por darme la oportunidad de incorporarme a este magnífico
equipo humano y estimularme para luchar por mis objetivos. Recuerdo como si fuera
ayer lo que me dijo el día que fui a expresarle mi preocupación por mi futuro
profesional: “Quiero saber si eres como un buque rompehielos que va abriéndose
camino, lenta pero inexorablemente”. En aquel momento me pareció bastante cruel,
dadas las circunstancias, pero la verdad es que consiguió que sacara lo mejor de mí y
me abrí paso, aunque más lejos de lo que probablemente él esperaba… Esas
palabras fueron el estímulo que hizo que se desencadenaran todos los
acontecimientos que finalmente me han traído hasta aquí.
El Show de Truman. La verdad es que en este punto me quedo sin palabras.
Cualquier cosa que dijera se quedaría corta para describir la calidad humana y
científica de este grupo. Javier, gracias por apostar por mí. Me diste una oportunidad
única y a lo largo de todos estos años me has apoyado y me has dado la libertad que
necesitaba para poner en marcha la línea de biología molecular. María, eres la
persona más extraordinaria que conozco. Gran amiga y mejor persona. Gracias por
co-pilotar la nave y llevarnos siempre a buen (aero)puerto. Porque un día vi la luz y
decidí incluirte como directora de tesis. Y, sobretodo, porque se que aunque no lo
hubiera hecho tu me habrías ayudado exactamente igual. Bea, gracias por ser como
eres. Por las carreras y las risas que nos hemos echado por los aeropuertos de medio
mundo, por pensar siempre en los demás antes que en ti misma. Porque el tiempo que
has pasado en el Show ha sido súper intenso y me he reído más que en toda mi vida.
Ana, por tu cariño y tus sonrisas incondicionales. Marc, por la dispensación gratuita de
abrazos y por tener siempre la solución más divertida a todos los problemas. Carmen y
Mar, junto con María las fundadoras del Show. Gracias por acogerme y ayudarme a
sentirme una más pese a la confusión inicial. Todo era demasiado novedoso, para mí
y para vosotras, pero nos ha ido bien y nos hemos reído mucho durante todos estos
años.
Gracias a todos los demás, aunque no sois nombrados uno a uno. Vosotros sabéis
quiénes sois y cuánto me habéis ayudado. Todos, en mayor o menor medida, me
habéis prestado vuestra ayuda, vuestra amistad, hemos compartido nuestros secretos
culinarios e incluso alguna que otra ha ejercido de segunda madre, lo cual valoro en
gran medida puesto que hace mucho tiempo que tengo a la mía lejos.
Ha sido un camino largo y duro en el que reconozco que, algunas veces, la fijación
por lograr mis objetivos me ha hecho olvidar un poco la importancia del contacto
humano. Los más perjudicados han sido mi familia y los amigos que están lejos. A
todos gracias, porque pese a todo seguís estando ahí. En especial a Ángela, por tu
amistad sincera e incondicional. Por tus valiosos consejos y por tener siempre un
punto de vista diferente y divertido para ayudarme a superar los malos momentos.
A mi familia, por apoyarme y dejarme elegir mi camino aunque muchas veces haya
podido ser complicado entenderlo. A mis sobrinos, Ana, Aitor y Gonzalo, por hacerme
sonreír incluso cuando no os veo y por recordarme constantemente a la niña que aún
llevo dentro.
Y, finalmente, le dedico esta tesis a Rubén que ha sufrido tanto o más que yo,
sobretodo durante los últimos meses que han sido particularmente duros. Gracias por
sentirte orgulloso de mí, por tu paciencia y por tu apoyo incondicional, por aguantar
estoicamente mis arrebatos de mal humor fruto del estrés, y mil cosas más… Gracias
porque tu contribución va más allá de todo esto y te has convertido en el voluntario
estrella del Show. Y, sobretodo, gracias por tener tan claro que por encima de todo lo
más importante es lo mucho que nos queremos.
A Rubén y a todo lo que está por venir en nuestra vida juntos
ÍNDICE -i-
ÍNDICE
OBJETIVOS .......................................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 5
1. Síndrome del Intestino Irritable .......................................................................... 5
1.1. Criterios diagnósticos ............................................................................... 5
1.2. Manifestaciones clínicas ........................................................................... 7
1.2.1. Dolor abdominal ............................................................................... 7
1.2.2. Patrón de deposiciones ................................................................... 8
1.3. Etiopatogenia .......................................................................................... 12
1.3.1. Factores relacionados en el inicio y/o perpetuación del SII ........... 12
1.3.2. Substrato biológico ........................................................................ 15
2. El Intestino: estructura y función ...................................................................... 18
2.1. Estructura histológica del intestino ......................................................... 18
2.2. Función del intestino delgado ................................................................. 20
2.2.1. Transporte a través del epitelio intestinal ...................................... 20
2.2.2. Función de barrera de la mucosa intestinal ................................... 22
3. Uniones intercelulares ..................................................................................... 24
3.1. Componentes de las uniones intercelulares ........................................... 24
3.2. Uniones estrechas .................................................................................. 26
3.2.1. Ocludina ......................................................................................... 28
3.2.2. Claudinas ....................................................................................... 28
3.3. Placa citoplasmática ............................................................................... 29
3.4. Citoesqueleto .......................................................................................... 30
4. Señalización intracelular a través de las TJ del intestino ................................ 31
4.1. Señalización por fosforilación / defosforilación ....................................... 31
-ii- ÍNDICE
4.1.1. Ser/Thr kinasas .............................................................................. 32
4.1.2. Ser/Thr fosfatasas .......................................................................... 34
4.2. Señalización por Rho GTPasas .............................................................. 34
4.3. Señalización por PI3K/AKT .................................................................... 35
5. Regulación de la permeabilidad intestinal ....................................................... 36
5.1. Estrés psicológico y la regulación de la permeabilidad intestinal ........... 39
5.2. Células y mediadores del sistema inmunológico implicados en la regulación
de la permeabilidad intestinal ........................................................................ 40
5.2.1. Mastocitos ...................................................................................... 40
5.2.2. Eosinófilos ...................................................................................... 42
5.2.3. Linfocitos T ..................................................................................... 43
CAPÍTULO I ........................................................................................................ 47
6. The jejunum of diarrhea-predominant irritable bowel syndrome shows molecular
alterations in the tight junction signaling pathway that are associated with mucosal
pathobiology and clinical manifestations ............................................................. 47
6.1. Introduction ............................................................................................. 48
6.2. Methods .................................................................................................. 49
6.2.1. Participants .................................................................................... 49
6.2.2. Clinical Assessment ....................................................................... 50
6.2.3. Biological Evaluation ...................................................................... 50
6.2.4. Statistical Analysis ......................................................................... 52
6.2.5. Pathway Analysis ........................................................................... 52
6.3. Results .................................................................................................... 54
6.3.1. Study population ............................................................................ 54
6.3.2. The jejunum of IBS-D shows hyperplasia of mucosal MCs ........... 54
ÍNDICE -iii-
6.3.3. The jejunal mucosa of IBS-D shows a distinctive transcriptional
profile linked to alterations in intestinal permeability, MC function and
TJ signaling .............................................................................................. 54
6.3.4. The altered expression of TJ-related proteins correlates with mucosal
MC activation and bowel dysfunction in IBS-D ........................................ 60
6.3.5. Integrative multivariate analysis of clinical and biological data
differentiates between IBS-D and healthy populations ............................ 64
6.4. Discussion .................................................................................................... 67
6.5. References ................................................................................................... 72
CAPÍTULO II ....................................................................................................... 77
7. Transcriptomic and proteomic profiling of the intestinal mucosa of diarrhea-IBS
patients reveals similar biological pathways as differentially active compared to
healthy subjects ................................................................................................... 77
7.1. Introduction ............................................................................................. 78
7.2. Methods .................................................................................................. 79
7.2.1. Participants .................................................................................... 79
7.2.2. Clinical assessment ....................................................................... 79
7.2.3. Biological evaluation of participants ............................................... 80
7.2.4. Statistical analysis .......................................................................... 83
7.3. Results .................................................................................................... 83
7.3.1. Study population ............................................................................ 83
7.3.2. The jejunum of IBS-D shows a distinctive transcriptomic profile ... 84
7.3.3. Gene and protein expression profiles in the jejunal mucosa of IBS-D
are associated with similar canonical pathways, biological functions and
disease mechanisms ............................................................................... 88
-iv- ÍNDICE
7.4. Discussion .............................................................................................. 88
7.5. References ............................................................................................. 91
CAPÍTULO III ...................................................................................................... 95
8. Altered jejunal tight junction signaling correlates with mucosal mast cell activation
and symptom severity in diarrhea-prone irritable bowel syndrome patients ........ 95
8.1. Introduction ............................................................................................. 96
8.2. Methods .................................................................................................. 97
8.2.1. Participants .................................................................................... 97
8.2.2. Clinical assessment ....................................................................... 98
8.2.3. Biological evaluation of participants ............................................... 98
8.2.4. Statistical analysis ........................................................................ 101
8.3. Results .................................................................................................. 102
8.3.1. The jejunum of IBS-D shows hyperplasia of activated mucosal
MCs ........................................................................................................ 102
8.3.2. Altered expression and distribution of structural TJ proteins correlates
with bowel dysfunction in IBS-D patients ............................................... 104
8.3.3. Phosphorylation of myosin light chain (MLC) is increased in
IBS-D ..................................................................................................... 107
8.3.4. TJ architecture is altered in IBS-D ............................................... 109
8.4. Discussion ............................................................................................ 111
8.5. References ........................................................................................... 115
DISCUSIÓN GENERAL .................................................................................... 121
CONCLUSIONES .............................................................................................. 133
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 137
ÍNDICE -v-
ANEXO .............................................................................................................. 149
9. Supplementary Material from Chapter 1 ........................................................ 149
9.1. Supplementary methods ....................................................................... 149
9.1.1. Microarray analysis ...................................................................... 149
9.1.2. Statistical Analysis of Microarray Data ......................................... 149
9.1.3. Ingenuity Pathway Analysis ......................................................... 150
9.1.4. Supplementary References ......................................................... 151
9.2. Supplementary Figures and Tables ...................................................... 152
9.2.1. Supplementary Table 1. Gene Expression Assays (GEA) used for
Q-RT-PCR ............................................................................................. 152
9.2.2. Supplementary Table 2. Individual counts of mucosal mast cells
(CD117+) and intraepithelial lymphocytes (CD3+) in jejunal biopsies ..... 153
9.2.3. Supplementary Table 3. Differentially expressed transcripts in IBS-D
patients compared with the healthy group ............................................. 154
9.2.4. Supplementary Figure 1. Quantitative Real Time PCR validation of
microarray data ...................................................................................... 163
9.2.5. Supplementary Table 4. All Networks identified .......................... 164
9.2.6. Supplementary Table 5. Identified canonical pathways associated to
the IBS-D transcripcional profile ............................................................ 167
9.2.7. Supplementary Table 6. Coordinates for selected genes from the
integrative multivariate analysis ............................................................. 169
10. Supplementary Material from Chapter 2 ...................................................... 174
10.1. Supplementary Figures and Tables .................................................... 174
10.1.1. Supplementary Table 1. Differentially expressed spots identified in
IBS-D patients compared with the healthy group ................................... 174
-vi- ÍNDICE
11. Supplementary Material from Chapter 3 ...................................................... 177
11.1. Supplementary Figures and Tables .................................................... 177
11.1.1. Supplementary Table 1. Antibodies used for western-blot (WB) and
confocal immunofluorescence (IF) ......................................................... 177
11.1.2. Supplementary Table 2. Gene Expression Assays (GEA) used for
Q-RT-PCR ............................................................................................. 178
11.1.3. Supplementary Figure 1. Relationships between differentially expressed
genes in the highest scored network and related Canonical Pathways (CP) and
Biological Functions (Fx) ........................................................................ 179
ABREVIATURAS -vii-
ABREVIATURAS
5-HT Serotonina (5-hidroxitriptamina)
Ǻ Angstrom
AKT v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1
AJ Uniones adherentes (del inglés, adherens junctions)
CLDN Claudina
CRF Factor liberador de corticotropina (del inglés, corticotropin releasing
factor)
CRH-F1 Receptor del factor liberador de corticotropina, subtipo 1 (del inglés
corticotropin releasing factor receptor)
CRH-F2 Receptor del factor liberador de corticotropina, subtipo 2 (del inglés
corticotropin releasing factor receptor)
DIGE Difference gel electrophoresis
EII Enfermedad inflamatoria intestinal
GALT Tejido linfoide asociado al intestino (del inglés gut associated lymphoid
tissue)
GAP Proteína activadora de GTPasa (del inglés GTPase activating proteins)
GEF Factor de intercambio de guanina (del inglés guanine nucleotide
exchange factos)
GSK-3β Kinasa glicógeno sintasa, beta 3 (del inglés glycogen synthase kinase 3
beta)
HPA Eje hipotálamo-pituitario-adrenal
IBS Irritable bowel syndrome
IBS-D Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome
IEL Linfocitos intraepiteliales (del inglés intraepithelial lymphocites)
-viii- ABREVIATURAS
IFNγ Interferón gamma
IL-1β Interleucina 1 beta
IL-4 Interleucina 4
IL-6 Interleucina 6
IL-6r Receptor de interleucina 6
IL-10 Interleucina 10
IL-13 Interleucina 13
IPA Ingenuity pathway analysis
JAM Molécula de adhesión de las uniones (del inglés, junctional adhesión
molecule)
kDa Kilodaltons
LIMK Proteína kinasa Lim
MAGI MAGUK inverted protein
MAGUK Membrane-associated guanylate kinase
MAPK Proteína kinasa activada por mitógenos (del inglés mitogen-activated
protein kinase)
MBP Proteína principal básica (del inglés major basic protein)
MC Mastocitos
MLC Cadena ligera de la miosina (del inglés myosin light chain)
MLCK Proteína kinasa de la cadena ligera de la miosina (del inglés myosin
light chain kinase)
MYPT Subunidad diana de la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina (del
inglés myosin phosphatase target subunit)
OCLN Ocludina
PAR-2 Receptor activado por proteasas 2 (del inglés protease activated
receptor 2)
ABREVIATURAS -ix-
PDK Proteínas kinasas dependientes de fosfoinositol (del inglés 3-
phosphoinositide dependent protein kinase)
PDZ Postsynaptic density-95/Drosophila disc large/Zonula occludens-1
protein
PI Fosfoinositol
PI3K Fosfoinositol 3-kinasa (del inglés phosphoinositide 3-kinases)
PKC Proteína kinasa C
PP1cδ Subunidad catalítica de la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina
(del inglés protein phosphatase 1C delta)
PP2A Fosfatasa 2A (del inglés protein phosphatase 2A)
PP2B Fosfatasa 2B (del inglés protein phosphatase 2B)
PTEN Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10
RNA Ácido ribonucleico (del inglés ribonucleic acid)
ROCK Proteína kinasa de rho
RXR Retinoid X receptor
Ser Serina
SIBO Sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado (del inglés, small
intestinal bacterial overgrowth)
SII Síndrome de intestino irritable
SII-A Síndrome de intestino irritable con patrón alternante
SII-C Síndrome de intestino irritable con predominio de estreñimiento
SII-D Síndrome de intestino irritable con predominio de diarrea
SII-PI Síndrome de intestino irritable post-infeccioso
SNC Sistema nervioso central
SNE Sistema nervioso entérico
TGF-β Factor de crecimiento tumoral, beta (del inglés tumoral growth factor
beta)
-x- ABREVIATURAS
Thr Treonina
TJ Uniones estrechas (del inglés tight junctions)
TNFα Factor de necrosis tumoral, alfa (del inglés tumor necrosis factor alpha)
Tyr Tirosina
ZO Zonula occludens
OOBBJJEETTIIVVOOSS
OBJETIVOS - 1 -
OBJETIVOS
Las enfermedades funcionales digestivas incluyen síndromes clínicamente muy
heterogéneos, como el síndrome del intestino irritable, caracterizados por
manifestaciones crónicas y recurrentes, cuya base estructural o biológica permanece
ignorada (Drossman, 1995). Consecuentemente, carecemos de biomarcadores
diagnósticos útiles para estas enfermedades funcionales, siendo el manejo terapéutico
y la calidad de vida deficientes, y el gasto sanitario creciente. En consecuencia, es de
gran importancia dirigir la investigación en este campo para permitir la identificación de
marcadores biológicos que faciliten el diagnóstico positivo y el diseño de nuevas
estrategias terapéuticas más eficientes.
El objetivo principal de esta tesis es determinar si la barrera mucosa intestinal del
SII-D presenta alteraciones moleculares y estructurales distintivas y establecer su
asociación patogénica con el sustrato patobiológico mucoso subyacente (hiperplasia y
activación mastocitaria) y con las manifestaciones clínicas predominantes.
Asimismo, es objetivo de esta tesis establecer las funciones biológicas y las vías
de señalización diferencialmente activas en la mucosa intestinal de pacientes con SII-
D, en comparación con controles sanos, especialmente de aquellas involucradas en el
control funcional de la barrera mucosa intestinal.
Afortunadamente, durante los últimos años la genómica, la proteómica y la
bioinformática se han desarrollado de forma sinérgica, lo que ha supuesto una
verdadera revolución en el diagnóstico y tratamiento de multitud de enfermedades. El
diagnóstico molecular ha resultado especialmente fructífero para el descubrimiento de
biomarcadores diagnósticos y dianas terapéuticas. La aplicación de las técnicas de
análisis masivo de la expresión génica y proteica en el síndrome del intestino irritable,
- 2 - OBJETIVOS
aquí empleada, puede mostrarse como un enfoque integrador e innovador de gran
utilidad potencial para el estudio de los mecanismos etiopatogénicos de esta
enfermedad y su significado biológico.
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
INTRODUCCIÓN - 5 -
INTRODUCCIÓN
1. SÍNDROME DEL INTESTINO IRRITABLE
El síndrome del intestino irritable (SII) es un trastorno funcional digestivo crónico
que se caracteriza por la presencia de dolor abdominal asociado a un cambio en el
número y/o consistencia de las deposiciones. El SII alcanza una prevalencia de hasta
el 20% de la población adulta (Mayer, 2008), constituye el diagnóstico más frecuente
del especialista en aparato digestivo y presenta, como otras enfermedades crónicas,
una clara, pero poco entendida, predominancia en el sexo femenino (2-3:1) (Chang &
Heitkemper, 2002). Además, la etiología y la fisiopatología de esta enfermedad no
están bien establecidas y tampoco existen métodos diagnósticos altamente sensibles
ni específicos, ni opciones terapéuticas claramente eficaces. A pesar de su elevada
prevalencia y de su gran impacto socio-económico, en la actualidad el diagnóstico
todavía se fundamenta en criterios derivados de las manifestaciones clínicas
principales, conocidos como los criterios de ROMA (Longstreth et al, 2006), y en la
exclusión de otras enfermedades orgánicas. Por todo ello, muchos pacientes con SII
experimentan un importante deterioro de su calidad de vida (El-Serag et al, 2002),
causa indirecta del progresivo crecimiento del gasto sanitario relacionado con esta
dolencia (Williams et al, 2007).
1.1. CRITERIOS DIAGNÓSTICOS
En la década de 1970-1979, Manning y colaboradores (Manning, 1978) realizaron
el primer intento para establecer unos criterios diagnósticos distintivos del SII. Estos
criterios se denominaron, por tanto, criterios de Manning. Posteriormente, el SII fue
adquiriendo cada vez mayor relevancia, lo cual propició la constitución de un comité de
expertos internacionales dedicado a la elaboración de criterios más detallados y
- 6 - INTRODUCCIÓN
precisos, desde entonces difundidos como los criterios de ROMA (así llamados por ser
el lugar de reunión del comité). En su primera versión, originada en 1990 (Drossman,
1990) y acordada en 1992 (Thompson et al, 1992), los criterios de ROMA I adoptaron
la mayoría de los criterios de Manning. Los criterios de ROMA II aparecieron en 1999
(Thompson, 1999) incorporando aspectos psicosociales, junto con nuevos
conocimientos y evidencias científicas en el campo de la neuro-gastroenterología.
Dichos criterios son los siguientes:
a. Presencia de dolor o molestia* abdominal durante más de 12 semanas, no
necesariamente consecutivas, en los últimos 12 meses.
b. Dicho dolor debe cumplir al menos dos de las siguientes características:
- Se alivia con la defecación.
- Comienzo asociado a una alteración en la frecuencia de las deposiciones.
- Comienzo asociado a una alteración en la consistencia de las deposiciones.
* Como molestia se entiende una sensación desagradable que no se describe como
dolor.
En 2006, se publicaron los criterios de ROMA III, que son los que están vigentes
en la actualidad. Estos criterios, menos restrictivos, modificaron el tiempo de evolución
necesario para establecer el diagnóstico, y revisaron los subtipos del SII (Longstreth et
al, 2006).
Al inicio de esta tesis los criterios ROMA III no estaban disponibles, por tanto todos
los pacientes incluidos fueron diagnosticados siguiendo los criterios ROMA II.
INTRODUCCIÓN - 7 -
1.2. MANIFESTACIONES CLÍNICAS
1.2.1. Dolor abdominal
El dolor o molestia abdominal es la primera manifestación clínica que caracteriza a
esta enfermedad, según establecen los criterios de ROMA, y está asociado a la
función intestinal. Este dolor se alivia con la defecación y está relacionado con una
alteración en la frecuencia y/o consistencia de las deposiciones. Con frecuencia, el
dolor es difuso y cambiante, puntiforme, se presenta con intensidad variable, puede
verse agravado por la ingesta y puede localizarse en cualquier parte del abdomen,
aunque típicamente predomina en el hemiabdomen inferior.
En la actualidad, la hipótesis más aceptada para explicar el dolor abdominal
crónico característico del SII consiste en la existencia de una percepción anómala de
estímulos en el intestino también llamada hipersensibilidad visceral (Mayer & Gebhart,
1994). La hipersensibilidad visceral comprende dos fenómenos: la hiperalgesia o
percepción dolorosa más intensa y prolongada asociada con un descenso del umbral
de activación; y la alodinia o sensación dolorosa de un evento fisiológico que previa y
habitualmente no causaba dolor. La sensibilidad en el tubo digestivo es el resultado de
la estimulación de varios quimiorreceptores y mecanorreceptores situados en la pared
del intestino. Estos receptores transmiten las señales a través de las vías neuronales
aferentes hacia el asta dorsal de la médula espinal y, finalmente, al cerebro (Azpiroz et
al, 2007). Habitualmente, en individuos sanos, el flujo constante de información a
través de este circuito no provoca una sensación consciente. Sin embargo, el 20-90%
de los pacientes con SII tienen una hipersensibilidad a la distensión intraluminal
(Azpiroz et al, 2007; Barbara et al, 2011). Este dato sugiere que estos pacientes
podrían tener anomalías en el procesamiento de las señales sensoriales, bien a nivel
central debido a una alteración en el procesamiento de los estímulos nociceptivos
(Azpiroz et al, 2007); o bien a nivel periférico por alteraciones en la sensibilidad de los
- 8 - INTRODUCCIÓN
receptores de la mucosa intestinal o del plexo mientérico en respuesta a la activación
del sistema inmunológico o a la liberación de mediadores por las células
enteroendocrinas (Barbara et al, 2011).
Por otra parte, la hipersensibilidad visceral no solo se limita a estímulos
provocados como la distensión, sino que algunos pacientes con SII frecuentemente
relacionan el inicio o la exacerbación de los síntomas con factores fisiológicos o
patológicos, incluyendo los movimientos intestinales (Kellow et al, 1991), ciertos
alimentos (Simrén et al, 2001; Simrén et al, 2007a; Simrén et al, 2007b) y estrés
(Whitehead et al, 1992; Bhatia & Tandon, 2005).
1.2.2. Patrón de deposiciones
La segunda manifestación que define el SII es la alteración de la consistencia de
las deposiciones. Así, de acuerdo con los criterios de ROMA II, los pacientes de SII se
clasifican en varios subtipos según la consistencia de sus deposiciones evaluada
mediante la escala de Bristol (figura 1): pacientes con predominio de diarrea (SII-D),
pacientes con predominio de constipación o estreñimiento (SII-C) y pacientes que
presentan un patrón alternante de ambos episodios (SII-A). Los criterios en los que se
basa dicha clasificación son los siguientes:
a. SII-D: aquellos pacientes que presentan una o más de las siguientes
características:
- Más de 3 deposiciones por día.
- Más de la cuarta parte de las deposiciones son blandas o acuosas.
- Más de la cuarta parte de las deposiciones se producen con urgencia.
b. SII-C: aquellos pacientes que presentan una o más de las siguientes
características:
- Menos de 3 deposiciones por semana.
INTRODUCCIÓN - 9 -
- Más de la cuarta parte de las deposiciones son duras o en forma de bolas.
- Más de la cuarta parte de las deposiciones se producen con esfuerzo.
c. SII-A: aquellos pacientes que presentan episodios fluctuantes de los dos
patrones anteriores.
La transición evolutiva de estreñimiento a diarrea, o viceversa, no es muy
frecuente pero tampoco está claramente establecido, ya que los patrones clínicos son
heterogéneos, típicamente variables e intermitentes entre los distintos subtipos
(Drossman, 2005). Es un tema de debate pero el hecho fundamental es que la
transición de estreñimiento a diarrea, o viceversa, es infrecuente mientras que ambos
subtipos pueden terminar o provenir del tipo alternante.
Figura 1. Escala de Bristol (adaptado de Lewis & Heaton, 1997).
- 10 - INTRODUCCIÓN
Durante muchos años se ha considerado a las alteraciones de la motilidad
digestiva como un factor fisiopatológico de gran relevancia para el SII. La motilidad
intestinal se define como el conjunto de contracciones coordinadas de las capas
musculares del intestino que tienen por finalidad propulsar el contenido luminal en
dirección aboral. Sin embargo, no existe un patrón motor específico del SII, sino más
bien alteraciones de carácter cuantitativo respecto a personas sanas. Así pues, en los
pacientes con SII se han descrito las siguientes alteraciones:
- Un tránsito intestinal acelerado en los pacientes con SII-D, o ralentizado en los
pacientes con SII-C (Quigley, 2005).
- Mayor afectación de la función intestinal por transgresiones dietéticas o factores
psicosociales.
- Alteración del tráfico y de la tolerancia intestinal a una sobrecarga con gas (Serra
et al, 2001).
- Respuesta motora excesiva a: reflejo gastrocólico, distensión rectal, estrés
(Kellow et al, 1992; Chang, 2008) y a la administración de colecistoquinina, o de factor
liberador de corticotropina (CRF) (Fukudo et al, 1999).
Sin embargo, las alteraciones motoras observadas en los pacientes con SII no son
específicas ni consistentes y correlacionan parcialmente con la clínica, por tanto no
pueden considerarse marcadores para el diagnóstico (Quigley, 2005).
INTRODUCCIÓN - 11 -
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- 12 - INTRODUCCIÓN
1.3. ETIOPATOGENIA
Pese a que no disponemos de marcadores biológicos fiables, existen evidencias
que sugieren que el origen del SII es multifactorial, incluyendo determinantes
genéticos, ambientales, infecciosos, psicosociales y género-dependientes, entre otros.
La interacción dinámica entre estos factores conforma la base conceptual del modelo
biopsicosocial (figura 2), el cual define al SII como una enfermedad resultante de las
respuestas inadecuadas a factores fisiológicos, psicosociales, de conducta y
ambientales (Halpert & Drossman, 2005).
1.3.1. Factores relacionados con el inicio y/o la perpetuación del SII
En condiciones de homeostasis, la interacción entre el sistema nervioso central
(SNC) y el sistema nervioso entérico (SNE), denominado eje cerebro-intestino,
desempeña un papel crucial en la regulación de la función digestiva, en la modulación
del sistema inmunológico asociado al intestino y en la coordinación entre el estado
físico y emocional general del individuo y la actividad del tracto gastrointestinal (Kellow
et al, 2006). Se especula que la disfunción de este eje cerebro-intestino podría
contribuir a la generación de los síntomas del SII, siendo responsable de la
hipersensibilidad visceral y de la alteración de la motilidad intestinal (Drossman, 2006).
Aunque se desconoce la base fisiopatológica subyacente a esta alteración, se han
identificado algunos factores relacionados con el inicio, la perpetuación y la severidad
de las manifestaciones clínicas del SII. Estos factores son el estrés psicológico crónico
y las infecciones gastrointestinales (Faresjo et al, 2007; Bennet et al, 1998; Nicholl et
al, 2008; Spiller & Garsed, 2009), así como factores genéticos, tal y como se describe
a continuación.
a. Estrés psicológico: el estrés tiene un papel particularmente relevante en las
alteraciones del eje cerebro-intestino. Se ha demostrado que la exposición
INTRODUCCIÓN - 13 -
experimental a diferentes tipos de estrés tanto físico como psicológico, actuando a
través del SNC, provoca la alteración de la respuesta secreto-motora del tracto
gastrointestinal (Mayer et al, 2001). Además, existen evidencias que apoyan la
existencia de una comunicación multi-direccional entre todos los componentes del
circuito estrés-inflamación (Santos et al, 2002), que se consigue gracias a la liberación
de neuropéptidos, hormonas, neurotransmisores y otros mediadores. Numerosos
datos apoyan la relevancia funcional de estas interacciones en la modulación de los
procesos inmunológicos e inflamatorios en la mucosa intestinal a través de su
influencia sobre los procesos de secreción y absorción, transporte de macromoléculas
a través del epitelio, la atracción y activación de células del sistema inmunológico o de
la capacidad metabólica de la microbiota intestinal (Wood, 2007). La alteración de este
delicado equilibrio a cualquier nivel puede dar lugar al desarrollo de un proceso
inflamatorio.
Numerosas evidencias apoyan el papel esencial del estrés en la sintomatología del
SII (Taché et al, 2004; Chang, 2008). Diferentes estudios clínicos han demostrado que
hasta un 50% de los pacientes con SII presentan trastornos psiquiátricos como
ansiedad, depresión, somatización y alteraciones de la personalidad (Lydiard, 2001;
Whitehead et al, 2002). Además, el estrés psicosocial, ya sea agudo o crónico,
precede frecuentemente el inicio o la exacerbación de los síntomas (Chang, 2008) y
varios estudios han demostrado que estos pacientes sufren más estrés crónico que los
individuos sanos (Whitehead et al, 1992; Bennet et al, 1998; Guilarte et al, 2007). En
los últimos años, la aplicación de técnicas de imagen, como la resonancia magnética
funcional, ha permitido demostrar que en los pacientes con SII existen alteraciones en
la densidad de la materia gris en áreas clave del cerebro involucradas en la atención,
la inhibición de regulación de la emoción, el dolor y el tratamiento de la información
visceral (Seminowicz et al, 2010).
- 14 - INTRODUCCIÓN
b. Infecciones gastrointestinales: la activación del sistema inmunológico es un
mecanismo de defensa crucial frente a las infecciones, sin embargo la persistencia de
la respuesta inflamatoria tras la resolución del proceso infeccioso puede dar lugar a la
cronificación de los síntomas. En particular, la gastroenteritis, ya sea vírica o
bacteriana, es uno de los factores de riesgo más importantes asociados al desarrollo
del SII (Marshall et al, 2004; Mearin, 2005; Spiller & Garsed, 2009). Se calcula que un
4-36% de individuos que contraen una infección gastrointestinal desarrollará SII
(Spiller & Garsed, 2009). La sintomatología del llamado, por tanto, SII post-infeccioso
(SII-PI) se asemeja notablemente al SII-D. Uno de los hallazgos más significativos en
la mucosa del colon de pacientes con SII-PI es el incremento de células
enterocromafines y de linfocitos intraepiteliales que persiste hasta cuatro meses
después de la resolución de la infección aguda junto con el aumento de la expresión
de citocinas pro-inflamatorias (Spiller et al, 2000; Dunlop et al, 2003). Los mecanismos
que provocan la persistencia de las alteraciones inmunológicas y el desarrollo de SII-
PI no se conocen con exactitud, sin embargo se han identificado varios factores de
riesgo asociados. Entre estos factores de riesgo los más relevantes son el género
femenino, la severidad de la infección, la susceptibilidad genética y la presencia de
trastornos psicológicos previos como la ansiedad o la depresión (Gwee et al, 1999;
Thabane & Marshall, 2009).
c. Factores genéticos: Existen evidencias que apuntan a la contribución relativa del
componente genético como factor de riesgo para el desarrollo del SII. Los datos de
concordancia en gemelos monocigóticos, junto con el riesgo relativo de los parientes
de primer grado, representan una evidencia a favor del componente genético del SII
(Hotoleanu et al, 2008). Sin embargo, los estudios realizados hasta la fecha en este
sentido no permiten descartar un papel clave de los factores ambientales (Locke et al,
2000). De hecho, estudios de agregación familiar han descrito que el papel
INTRODUCCIÓN - 15 -
fundamental del aprendizaje social es tan importante como la carga genética, de
manera que la existencia de un familiar de primer grado con síntomas de dolor
abdominal o trastornos intestinales se asocia a la probabilidad de padecer SII ((Levy et
al, 2001; Kalantar et al, 2003).
Por otro lado, el papel de los factores genéticos también se ha puesto de
manifiesto gracias a la identificación de polimorfismos genéticos en pacientes con SII
que podrían conferir cierta susceptibilidad a desarrollar esta enfermedad (Camilleri,
2009; Saito, 2011). Los polimorfismos mejor estudiados se localizan en genes
implicados en la síntesis, metabolismo y receptores de la serotonina (o 5-
hidroxitriptamina, 5-HT); en mediadores inflamatorios, como la citocina anti-
inflamatoria interleucina 10 (IL-10); en genes relacionados con la función de barrera
epitelial; y en genes asociados a trastornos psiquiátricos (Saito, 2011).
1.3.2. Substrato biológico
La fisiopatología del SII es muy compleja y poco conocida. En los últimos años se
han producido una serie de hallazgos indicativos de la existencia de un substrato
biológico en esta enfermedad, lo cual ha llevado a cuestionar su naturaleza funcional,
al menos en algunos subgrupos de pacientes. Los factores mejor caracterizados son:
la presencia micro-inflamación en la mucosa intestinal, las alteraciones en la
señalización neuronal y las alteraciones en la microbiota intestinal.
a. Micro-inflamación: recientes observaciones en pacientes con SII denotan la
existencia de inflamación en la mucosa intestinal con hiperplasia y activación de
algunas estirpes de células inmunológicas (mastocitos, linfocitos T) (Chadwick et al,
2002; Barbara et al, 2004; Guilarte et al, 2007). Esta infiltración y activación celular se
asocia, en algunos subgrupos de pacientes, con el aumento de la expresión de
moléculas pro-inflamatorias como la interleucina 1 beta (IL-1β) en la mucosa intestinal
- 16 - INTRODUCCIÓN
(Gwee et al, 2003) y con una liberación en sangre periférica de citocinas pro-
inflamatorias como el factor de necrosis tumoral α (TNFα, del inglés tumor necrosis
factor alpha) y la interleucina (IL)-6 y su receptor (IL-6r) junto a una disminución de
citocinas anti-inflamatorias como IL-10 y el factor de crecimiento tumoral beta (TGF-β,
del inglés tumoral growth factor beta) (Dinan et al, 2006; Macsharry et al, 2008).
La persistencia de la activación inmunitaria junto a la liberación constante de
mediadores pro-inflamatorios en la mucosa intestinal podría ser el origen de la hiper-
excitabilidad de las terminaciones nerviosas en la mucosa intestinal contribuyendo a
iniciar o perpetuar la hipersensibilidad visceral en el subgrupo de pacientes con SII-D.
Esta hipótesis se ve reforzada por los estudios realizados en animales de
experimentación en los que se ha podido comprobar que incluso una inflamación leve
o anatómicamente distante puede provocar cambios persistentes en los nervios
entéricos y en la función muscular digestiva, siendo el mecanismo responsable de la
sensibilización de las terminaciones aferentes de la pared intestinal (Bercik et al, 2004;
Akiho et al, 2005). Además, la severidad del dolor abdominal en los pacientes con SII
se correlaciona positivamente con el número de unidades mastocito-nervio, sobre todo
nervios inmunorreactivos a substancia P (Barbara et al, 2007), y con la liberación por
parte del mastocito de potentes mediadores neuromoduladores como la histamina y la
triptasa, que son capaces de actuar sobre las terminaciones nerviosas aferentes.
El origen de dicha micro-inflamación es desconocido, pero podría ser
consecuencia de la alteración de la función de barrera del epitelio intestinal, la cual
juega un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis de la mucosa intestinal
(Turner, 2009). Esta función depende tanto de la conservación de la integridad física,
para prevenir interacciones descontroladas entre el huésped y el contenido y la
microbiota intestinal, como de la ejecución adecuada del programa de vigilancia
INTRODUCCIÓN - 17 -
inmunológica que modula el procesamiento de la enorme carga antigénica presente en
la luz intestinal.
b. Señalización neuronal: el neurotransmisor mejor estudiado en relación con la
fisiopatología del SII es la serotonina (o 5-hidroxitriptamina, 5-HT), la cual presenta
una amplia distribución en todo el tracto digestivo localizándose en las terminaciones
nerviosas del SNE y en las células enterocromafines de la mucosa intestinal. Tras su
liberación, la 5-HT actúa sobre receptores específicos en las neuronas aferentes de la
mucosa y del plexo mientérico provocando una respuesta secreto-motora que tiene
como consecuencia el aumento de la secreción intestinal, del reflejo peristáltico y, por
tanto, el desarrollo de diarrea (Spiller, 2008). Alteraciones en los niveles de 5-HT
podrían explicar la sintomatología de los pacientes con SII. De hecho, en el SII-PI y en
el SII-D se ha descrito un aumento de la liberación de 5-HT asociado a un defecto en
el metabolismo de este neurotransmisor (Dunlop et al, 2005; Atkinson et al, 2006). Por
otra parte, se ha estudiado una gran variedad de neuropéptidos entre los que se
encuentran la colecistoquinina, el neuropéptido Y, la somatostatina y la sustancia P,
entre otros (Clarke G et al, 2009).
c. Microbiota intestinal: la comunidad de bacterias comensales que habita el
intestino humano supera, en al menos 10 veces, el número total de células que forman
el cuerpo humano y contiene una carga genética total 100 veces superior al número de
genes que conforma el genoma humano (Gill et al, 2006). Estas bacterias tienen un
gran impacto en la fisiología del huésped y se ha sugerido que desempeñan una
función clave en la fisiopatología de diversas enfermedades inflamatorias y
autoinmunes (Chow et al, 2010). El sobrecrecimiento bacteriano en el intestino
delgado (SIBO, del inglés, small intestinal bacterial overgrowth) se ha asociado a la
sintomatología del SII, sin embargo, los resultados en este sentido no son
concluyentes (Ford et al, 2009). Por otra parte, varios estudios han demostrado
- 18 - INTRODUCCIÓN
alteraciones cualitativas y cuantitativas en la microbiota fecal de pacientes con SII.
Estos pacientes presentan una menor estabilidad temporal en las poblaciones
bacterianas que, además, se ha asociado a la sintomatología del SII a través del
incremento en la producción de ácido acético y de ácido propiónico (Lee & Tack, 2010;
Tana et al, 2010). El efecto de estos ácidos orgánicos podría estar mediado por un
aumento en la sensibilidad de las vías vagales aferentes a estímulos químicos que
contribuiría a la hipersensibilidad visceral en estos pacientes, tal y como se ha descrito
en un modelo de estrés experimental (Aerssens et al, 2007).
2. EL INTESTINO: ESTRUCTURA Y FUNCIÓN
Su función principal es la digestión y absorción de nutrientes esenciales para el
mantenimiento de las funciones del organismo y, al mismo tiempo, la protección frente
a la intrusión de agentes potencialmente nocivos. Para aumentar la superficie de
absorción, la mucosa intestinal presenta unas invaginaciones y evaginaciones
llamadas criptas de Lieberkühn y vellosidades, respectivamente, representado en la
figura 3. Esta estructura se denomina eje cripta-vellosidad y representa la unidad
funcional básica del intestino delgado (Reya & Clevers, 2005).
2.1. ESTRUCTURA HISTOLÓGICA DEL INTESTINO
La pared del intestino presenta una arquitectura histológica similar constituida por
4 capas concéntricas (figura 3): la mucosa, la submucosa, la muscular y la serosa
(Young & Heath, 2000).
a. Capa mucosa: es la más externa y en contacto con la luz intestinal, se divide a
su vez en tres subcapas concéntricas: el epitelio columnar, la lámina propria y la
muscularis mucosae.
INTRODUCCIÓN - 19 -
- Epitelio: formado por una monocapa de células epiteliales especializadas, los
enterocitos, cuyas funciones principales son la absorción de nutrientes, la
secreción de agua y de electrolitos y la función de barrera frente a bacterias y
sustancias nocivas.
- Lámina propria: formada por tejido conectivo que contiene numerosos vasos
sanguíneos y linfáticos, así como fibras nerviosas. Está compuesta de una gran
variedad celular con funciones defensivas y de comunicación. Esta capa de la
mucosa incluye el tejido linfoide asociado al intestino (GALT, del inglés Gut-
Associated Lymphoid Tissue). El GALT está formado por el tejido linfoide difuso y
los folículos linfoides prominentes, que contienen células del sistema inmunitario.
Las células presentadoras de antígenos (linfocitos, macrófagos y células
dendríticas) del GALT reconocen e inducen respuestas inmunológicas contra
microbios y otros antígenos, como las bacterias que penetran el epitelio.
- Muscularis mucosae: separa la mucosa de la submucosa y constituye el soporte
físico de ésta. Incluye una capa circular interna y una capa longitudinal externa de
músculo liso.
b. Capa submucosa: es la capa de tejido conectivo que se encuentra por debajo
de la mucosa. En la capa submucosa se encuentra el plexo submucoso o plexo de
Meissner que forma parte del SNE y su función principal consiste en regular la
secreción de las glándulas digestivas.
c. Capa muscular: formada por células musculares lisas distribuidas
estructuralmente en dos capas, la circular y la longitudinal. Es la capa responsable
de los movimientos peristálticos que desplazan el contenido de la luz a lo largo del
tubo digestivo. Entre sus dos capas se encuentra otro componente del SNE, el plexo
mientérico o plexo de Auerbach, que regula la actividad motora de esta capa.
- 20 - INTRODUCCIÓN
d. Capa serosa: formada básicamente por células epiteliales planas y tejido
conjuntivo.
Figura 3. Corte transversal del intestino delgado. (Fuente: http://www.bu.edu/histology/m/intro.htm) y Eje cripta-
vellosidad en el intestino delgado. (Reproducido de Reya & Clevers, 2005)
2.2. FUNCIÓN DEL INTESTINO DELGADO
2.2.1. Transporte a través del epitelio intestinal
La absorción es el proceso por el cual los nutrientes son transportados al interior
de la mucosa y al torrente circulatorio. Los enterocitos presentan una gran actividad
transportadora: se encargan del movimiento de grandes cantidades de sales y agua
desde la luz hacia el torrente circulatorio y viceversa. Dichas células epiteliales están
equipadas con canales iónicos, transportadores y bombas, localizados en la
membrana apical y basolateral, que participan en el movimiento de los electrolitos. El
transporte neto es el resultado del balance entre la absorción y la secreción.
INTRODUCCIÓN - 21 -
Existen tres rutas a través de las cuales el epitelio intestinal regula el transporte
selectivo de sustancias: la ruta transcelular, la ruta paracelular (figura 4) y la ruta de
endocitosis.
a. Transporte transcelular: consiste en el transporte de solutos a través de la
membrana del enterocito. Este transporte puede ser activo como resultado de
la acción de transportadores específicos (iones, aminoácidos, antígenos), o
bien puede producirse como resultado de la difusión pasiva a través de la
membrana apical del enterocito.
b. Transporte paracelular: consiste en el transporte pasivo a través del espacio
entre dos enterocitos adyacentes y está regulado por complejos proteicos
intercelulares localizados en las uniones latero-apicales de las membranas
celulares.
c. Transporte por endocitosis: las partículas más grandes como proteínas y
productos bacterianos no pueden pasar a través de la membrana celular ni del
espacio paracelular, pero son captados por las células mediante
invaginaciones de la membrana plasmática seguido de la formación de
vesículas en un proceso llamado endocitosis. Tras la endocitosis, las partículas
captadas son transportadas activamente mediante un proceso llamado
transcitosis vectorial, a través del citoplasma, hacia los lisosomas. Este es un
fenómeno esencial que media la captación de antígenos para la iniciación de
una respuesta inmunológica apropiada. Ambos procesos son susceptibles de
ser manipulados por bacterias patógenas, como parte de su estrategia
invasiva, para penetrar e infectar al huésped (Keita & Söderholm, 2010).
- 22 - INTRODUCCIÓN
Transcelular Paracelular
Membrana apical
Membrana basolateral
Unión estrecha
Membrana lateral
Transcelular Paracelular
Membrana apical
Membrana basolateral
Unión estrecha
Membrana lateral
Transcelular Paracelular
Membrana apical
Membrana basolateral
Unión estrecha
Membrana lateral
Figura 4. Rutas de transporte a través del epitelio intestinal. (Reproducido de Groschwitz & Hogan, 2009).
2.2.2. Función de barrera de la mucosa intestinal
El mantenimiento de la homeostasis intestinal depende fundamentalmente de la
existencia de una barrera intacta que impida el paso de antígenos presentes en la luz
intestinal y el consiguiente desarrollo de procesos infecciosos y daño tisular. Esta
barrera está compuesta por elementos físicos (epitelio, reflejo peristáltico) y químicos
(la capa de mucinas, la secreción de agua e iones y la liberación de compuestos
antimicrobianos). Además, existen células especializadas que dirigen la respuesta
inmunológica (GALT y células del sistema inmunitario sistémico). Estos elementos
actúan en la mucosa intestinal de manera coordinada, y están organizados en dos
niveles de protección:
INTRODUCCIÓN - 23 -
a. El primer nivel de protección está compuesto por elementos extracelulares como
el reflejo peristáltico, el glicocálix y la secreción de agua, iones y sustancias
antimicrobianas por parte de las células del epitelio.
- Reflejo peristáltico: consiste en el conjunto de movimientos coordinados de
las capas musculares del intestino, cuya finalidad es propulsar el contenido luminal en
sentido aboral.
- Glicocálix: la superficie de la mucosa intestinal está recubierta por una densa
capa de moco compuesto por glicoproteínas, mucinas y diversos enzimas. Este moco
protege al epitelio frente al estrés mecánico e impide el contacto directo de las células
epiteliales con las bacterias presentes en la luz intestinal (Renes et al, 2002).
- Secreción de agua e iones: dificultan la adhesión de bacterias al epitelio.
Junto con el reflejo peristáltico la secreción de agua se incrementa en respuesta a
infecciones víricas o bacterianas, con la finalidad de arrastrar el contenido luminal
expulsando rápidamente el agente nocivo.
- Liberación de sustancias antimicrobianas: principalmente defensinas y
lisozimas producidas por las células de Paneth que ejercen su función produciendo
poros en la pared celular de las bacterias.
b. El segundo nivel de protección es el propio epitelio. Consiste en una monocapa
de células columnares especializadas llamadas enterocitos, las cuales mantienen un
delicado equilibrio entre dos funciones críticas para la homeostasis intestinal: la
función absortiva de nutrientes a través de la membrana apical, y la función de barrera,
que impide el paso de antígenos.
Además de los enterocitos, en el epitelio encontramos células del sistema
inmunológico, como los linfocitos intraepiteliales y otras células con funciones
secretoras, como las células caliciformes secretoras de moco (células de Goblet),
células enteroendocrinas secretoras de hormonas y neuropéptidos y las células de
- 24 - INTRODUCCIÓN
Paneth productoras de péptidos antimicrobianos (Young & Heath, 2000) (figura 5).
Bajo esta capa se encuentra la lámina propria que contiene diferentes células
inmunocompetentes que forman una unidad funcional junto con las células epiteliales
(Kato & Owen, 1999; Mayer, 2000).
Figura 5. Corte transversal de la mucosa del intestino delgado y detalle de las criptas de Lieberkühn (Fuente:
http://www.bu.edu/histology/m/intro.htm).
3. UNIONES INTERCELULARES
Los tejidos epiteliales están formados por láminas continuas de células que
revisten y protegen el interior de órganos y cavidades del organismo. Las uniones
intercelulares son necesarias para dar al epitelio la integridad estructural y la actividad
celular necesarias para llevar a cabo sus funciones específicas.
3.1. COMPONENTES DE LAS UNIONES INTERCELULARES
Se clasifican en tres grupos funcionales: uniones estrechas, uniones de anclaje
(uniones adherentes y desmosomas) y uniones comunicantes (figura 6).
INTRODUCCIÓN - 25 -
a. Uniones estrechas: las uniones estrechas (TJ, del inglés tight junctions) son las
uniones intercelulares más apicales. Forman una barrera selectiva y
semipermeable que facilita la difusión pasiva de solutos a través del espacio
intercelular mientras que, al mismo tiempo, bloquean la entrada de antígenos
luminales, microorganismos y toxinas (Balda & Matter, 2008).
b. Uniones de anclaje:
- Uniones adherentes: las uniones adherentes (AJ, del inglés adherens
junctions) regulan la adhesión entre células adyacentes mediante la unión del
citoesqueleto de actina de ambas células a través de moléculas de adhesión
transmembrana y los complejos proteicos asociados a éstas. El núcleo de
estas uniones consiste en dos unidades básicas de adhesión: la interacción
entre las glicoproteínas transmembrana de la superfamilia de las caderinas y
los miembros de la familia de las cateninas (Niessen & Gottardi, 2008).
- Desmosomas: son las uniones intercelulares más fuertes. Su función es
mantener unidas a las células del epitelio, asociando el citoesqueleto de
filamentos intermedios de las células vecinas, formando así una red
transcelular con una alta resistencia a la tracción mecánica. Esta disposición
permite que las células mantengan su forma y que la lámina epitelial exista en
forma estable. Además, son centros de señalización y participan en varios
procesos celulares como la diferenciación, la proliferación y la morfogénesis
(Garrod & Chidgey, 2008).
c. Uniones comunicantes: están formados por 6 proteínas transmembrana
llamadas conexinas. La función de estas uniones es formar un canal que
atraviese las membranas de células vecinas, permitiendo la comunicación
entre sus citoplasmas.
- 26 - INTRODUCCIÓN
Figura 6. Uniones intercelulares en el epitelio del intestino delgado. A. Fotografía de microscopía electrónica
que muestra las uniones entre dos enterocitos adyacentes (cortesía de la Dra. Vicario). B. Esquema de las
uniones donde se muestran las interacciones entre las proteínas integrales de las uniones y sus conexiones con el
citoesqueleto de acto-miosina (reproducido de Turner, 2009).
3.2. UNIONES ESTRECHAS
La función de las TJ es fundamental en el mantenimiento de la barrera del epitelio
intestinal, y de la polaridad celular, limitando la difusión de lípidos y proteínas desde la
región apical hacia la región basolateral de las membranas. Las TJ se componen de
complejos multiproteicos constituidos por cuatro familias de proteínas transmembrana:
ocludina, claudinas, moléculas de adhesión de las uniones (JAM, del inglés junctional
adhesion molecules) y tricelulina (figura 7).
INTRODUCCIÓN - 27 -
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9).
- 28 - INTRODUCCIÓN
3.2.1. Ocludina
La ocludina es una proteína integral de membrana de 60-82 kDa que posee cuatro
segmentos transmembrana (Balda & Matter, 2008). Se expresa de forma
predominante en células epiteliales y endoteliales, y también se ha descrito su
expresión en astrocitos, neuronas, macrófagos y células dendríticas (Bauer et al, 1999;
Blank et al, 2011). Existen varias isoformas de esta proteína, algunas de las cuales
están relacionadas con la alteración de su distribución subcelular y la interacción con
otras proteínas que forman parte de las TJ (Mankertz et al, 2002).
A pesar de ser la primera proteína específica de TJ descrita, la función de la
ocludina no está totalmente definida. Por una parte, varios estudios in vitro sugirieron
inicialmente un papel clave de esta proteína en la regulación de la función de barrera
de las TJ (Balda et al, 1996; Chen et al, 1997). Sin embargo, los ratones deficientes en
ocludina no muestran alteraciones aparentes en la estructura o función de las TJ del
epitelio intestinal (Schulzke et al, 2005) lo que sugiere la existencia de otras proteínas
capaces de compensar la función de la ocludina.
La localización de la ocludina y su participación en el ensamblaje y desensamblaje
de las TJ están reguladas mediante fosforilación en residuos específicos de Ser, Thr y
Tyr, de manera que la alteración en el patrón de fosforilación de esta proteína provoca
su translocación al citoplasma (Simonovic et al, 2000), desestabilizando las TJ con el
consiguiente aumento de la permeabilidad paracelular (Rao, 2009; Elias et al, 2009).
3.2.2. Claudinas
Las claudinas son proteínas integrales de membrana de 20-27 kDa con cuatro
segmentos transmembrana. Esta familia de proteínas consta de 24 miembros
identificados hasta la fecha. Presentan un patrón de expresión específico de tejido
(Chiba et al, 2008) y se localizan mayoritariamente en las TJ de células epiteliales y
INTRODUCCIÓN - 29 -
endoteliales. Sin embargo, recientemente se han detectado también en vesículas
citoplasmáticas, en células no epiteliales (macrófagos y células dendríticas) y en
neuronas de los sistemas nerviosos central y entérico (Blank et al, 2010; Karaki et al,
2007).
Las claudinas son el principal factor que determina la función de barrera de las TJ
controlando el paso de iones a través del espacio paracelular (Chiba et al, 2008).
Estas proteínas forman canales con propiedades biofísicas similares a los canales
iónicos tradicionales incluyendo la selectividad por la carga iónica y la permeabilidad
dependiente de la concentración iónica (Hartsock & Nelson, 2008).
Al igual que ocurre con la ocludina, la localización de las claudinas en las TJ y su
función están reguladas mediante la fosforilación específica de residuos de Ser y Thr.
3.3. PLACA CITOPLASMÁTICA
La denominada placa citoplasmática está formada por una red muy compleja de
proteínas adaptadoras que interconectan las proteínas integrales de las uniones
intercelulares y las acoplan al citoesqueleto de actina. Además, las proteínas que
forman esta placa son capaces de reclutar una gran variedad de componentes de
señalización incluyendo kinasas, fosfatasas y proteínas G (figura 7). Así, la placa
citoplasmática juega un papel fundamental en la regulación de la adhesión y la
permeabilidad paracelular, y también en la transmisión de señales desde las uniones
intercelulares hacia el interior de la célula para la regulación de procesos celulares
fundamentales como la migración y la expresión génica (Guillemot et al, 2008).
El eje estructural de la placa citoplasmática está compuesto por proteínas con
dominios PDZ (del inglés Postsynaptic density-95/Drosophila disc large/Zonula
occludens-1 protein). A este grupo pertenecen, entre otras, las proteínas de la familia
MAGUK (del inglés membrane-associated guanylate kinase), que incluye las proteínas
- 30 - INTRODUCCIÓN
zonula occludens (ZO)-1, ZO-2 y ZO-3; la familia MAGI (del inglés MAGUK inverted
protein), que incluye MAGI-1 y MAGI-3; y un grupo de proteínas implicadas en el
establecimiento de la polaridad apico-basal de las células epiteliales (Guillemot et al,
2008).
La proteína ZO-1 fue la primera proteína asociada a las TJ que fue identificada y
es una de las mejor caracterizadas. Esta proteína juega un papel fundamental para el
reclutamiento de las claudinas en la TJ, la formación de las TJ y el establecimiento de
la función de barrera (Umeda et al, 2006). Las proteínas ZO contienen, además, varias
señales que determinan la localización y la exportación nuclear de manera que, en
respuesta a estímulos nocivos como el estrés celular, se concentran en el núcleo
donde se asocian a factores de transcripción y a proteínas reguladoras del ciclo celular
(Matter & Balda, 2007).
3.4. CITOESQUELETO
El citoesqueleto de actina y miosina también tiene un papel fundamental en la
regulación de la estructura y la función de las TJ (Madara & Pappenheimer, 1987). En
las células epiteliales polarizadas los filamentos de actina forman un cinturón que
rodea la zona más apical de la membrana lateral sosteniendo las uniones
intercelulares. Varias proteínas de la placa citoplasmática interaccionan directamente
con la actina y la miosina. Dichas interacciones estabilizan el complejo de las uniones
y proporcionan la fuerza necesaria para su interrupción tras la contracción del anillo de
acto-miosina (Miyosi & Takai, 2008).
Además de los filamentos de actina, la proteína miosina II juega un papel clave en
la regulación de la permeabilidad paracelular. Esta proteína está compuesta de dos
cadenas pesadas de aproximadamente 200 kDa cada una y cuatro cadenas ligeras de
20 kDa, las cuales, agrupadas de dos en dos, reciben el nombre de cadena esencial
INTRODUCCIÓN - 31 -
(MLC1, del inglés myosin light chain 1), y cadena reguladora (MLC2), respectivamente.
El mecanismo por el cual se produce el desensamblaje de las TJ epiteliales implica la
fosforilación de MLC2 en el residuo de Ser19, lo cual provoca la contracción del anillo
de acto-miosina y la consiguiente pérdida de función de las TJ cuya consecuencia final
es el aumento de la permeabilidad paracelular (González-Mariscal et al, 2008; Turner,
2009).
4. SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR A TRAVÉS DE LAS TJ DEL INTESTINO
Además del papel en la regulación de la función de barrera y de la permeabilidad
paracelular del epitelio intestinal, las TJ también están vinculadas a varios
mecanismos de señalización intracelular que controlan la proliferación, la polarización
y la diferenciación de las células epiteliales (Balda & Matter, 2008). Tal y como se
describe anteriormente, las TJ se componen de una gran variedad de proteínas
integrales y periféricas que se asocian a diversas moléculas implicadas en cascadas
de señalización, como kinasas, fosfatasas y proteínas G. Estas interacciones permiten
la transmisión de información desde las uniones intercelulares hacia el interior de la
célula. Además, el ensamblaje y el desensamblaje de las TJ están regulados mediante
la comunicación entre varias vías de señalización, tal y como se detalla a continuación.
4.1. SEÑALIZACIÓN POR FOSFORILACIÓN/DEFOSFORILACIÓN
Uno de los mecanismos más importantes de regulación de la función de las
proteínas es la fosforilación y la defosforilación de aminoácidos específicos. La
relación entre el grado de fosforilación de proteínas específicas de las TJ se empezó a
estudiar a finales de los años ochenta (Stevenson et al, 1989) y, desde entonces, se
han realizado importantes progresos en este campo.
- 32 - INTRODUCCIÓN
4.1.1. Ser/Thr kinasas.
Existen tres familias de Ser/Thr kinasas cuyos efectos sobre la permeabilidad
intestinal han sido bien descritos: la proteína kinasa de la cadena ligera de la miosina
(MLCK, del inglés myosin light chain kinase), la familia de proteínas kinasas C (PKC) y
la familia de proteínas kinasas activadas por mitógenos (MAPK, del inglés mitogen-
activated protein kinases).
a. Señalización por MLCK:
La MLCK es una Ser/Thr kinasa que fosforila específicamente a MLC2. Existen
varias isoformas de esta proteína, de las cuales sólo MLCK1 y MLCK2 se expresan en
el epitelio intestinal (Marchiando et al, 2010). La actividad de MLCK depende de la
unión a la proteína calmodulina en presencia de Ca2+. El dominio de unión a
calmodulina puede ser fosforilado por PKC provocando la inactivación de MLCK y la
consiguiente disminución en la fosforilación de MLC2, seguido de la relajación del
anillo de acto-miosina y la disminución de la permeabilidad paracelular (González-
Mariscal et al, 2008).
En el epitelio intestinal, la sobre-expresión del dominio catalítico de MLCK produce
un aumento de la permeabilidad paracelular, tanto in vitro como in vivo (Shen et al,
2006; Su et al, 2009; Weber et al, 2010). Este efecto de la activación de MLCK sobre
la función de la barrera intestinal se ha relacionado con diversos estímulos pro-
inflamatorios y con modelos de infección por bacterias enteropatógenas (Nusrat et al,
2000; Clayburgh et al, 2005; Wang et al, 2005). Todos estos resultados sugieren que
la disfunción de la barrera intestinal tras la activación de MLCK podría predisponer y
contribuir a la patogénesis de procesos inflamatorios intestinales. De hecho, la
expresión y la activación de MLCK son mayores en la mucosa intestinal de pacientes
con otras patologías asociadas a un aumento de la permeabilidad intestinal, como la
INTRODUCCIÓN - 33 -
enfermedad de Crohn, y, además, este aumento se correlaciona directamente con la
severidad de la inflamación (Blair et al, 2006).
b. Señalización por PKC:
La familia de PKC incluye 12 isoenzimas que difieren en su mecanismo de acción,
en su localización subcelular, en el substrato y en su expresión. Estas isoenzimas se
clasifican en tres subfamilias: convencionales o clásicas, nuevas y atípicas (Farhadi et
al, 2006).
En el intestino, la permeabilidad epitelial depende del equilibrio entre algunas de
las isoformas de PKC. La alteración de este equilibrio puede producir la
desestabilización del citoesqueleto de actina y, en consecuencia, la ruptura de la
integridad de la barrera intestinal, aunque los resultados en este sentido son
contradictorios (Farhadi et al, 2006).
c. Señalización por MAPK:
Las MAPK responden a estímulos extracelulares, como factores de crecimiento y
estrés celular, y modulan varios procesos celulares incluyendo la expresión génica, la
mitosis, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis. Esta vía de señalización
también modula el transporte paracelular, controlando la expresión génica de varias
proteínas de las TJ, o bien mediante la interacción directa de proteínas integrales de
las TJ con otras proteínas transmembrana necesarias para la activación de las MAPK
(González-Mariscal et al, 2008).
La activación de las isoformas JNK y p38 MAPK se ha asociado a la inflamación
crónica en la mucosa intestinal, aunque los resultados son controvertidos (Hommes et
al, 2002; Malamut et al, 2006; Docena et al, 2010). Ambas son, al mismo tiempo,
activadores y receptores para el TNFα, un mediador esencial para la iniciación y
amplificación de la inflamación. Uno de los mecanismos de acción clave del TNFα es
- 34 - INTRODUCCIÓN
la desestabilización de la función de barrera del epitelio intestinal a través del aumento
de la actividad de MLCK (Clayburgh et al, 2005; Wang et al, 2005).
4.1.2. Ser/Thr fosfatasas.
La fosfatasa 2A (PP2A, del inglés protein phosphatase 2A) induce la
defosforilación de ZO-1, ocludina y claudina-1, lo cual resulta en un incremento de la
permeabilidad paracelular. Además, la inhibición específica de PP2A con ácido
okadaico da como resultado la hiperfosforilación de estas proteínas acelerando el
ensamblaje de las TJ (Nunbhakdi-Craig et al, 2002; Seth et al, 2007).
Por otro lado, las Ser/Thr fosfatasas pueden ejercer efectos contrarios en la
función barrera de las TJ mediante la inhibición selectiva de diferentes isoformas de
PKC. Así, en una línea celular de epitelio renal se ha descrito que PP2A inhibe la
isoforma atípica PKCζ provocando el desensamblaje de las TJ (Nunbhakdi-Craig et al,
2002), mientras que en cultivos de células endoteliales se ha observado que PP2B
bloquea la actividad de la isoforma convencional PKCα y, en consecuencia, promueve
el ensamblaje de las TJ (Lum et al, 2001).
4.2. SEÑALIZACIÓN POR RHO GTPASAS
Rho es una familia de proteínas perteneciente a la superfamilia de pequeñas
proteínas de unión a GTP que incluye RhoA, Rac y Cdc42. La activación de estas
proteínas está mediada por la acción de factores de intercambio de guanina (GEF, del
inglés guanine nucleotide exchange factors) y proteínas activadoras de GTPasa (GAP,
del inglés GTPase activating proteins) (Terry et al, 2010).
La función principal de las proteínas Rho es la modulación de la permeabilidad
paracelular mediante la reorganización del citoesqueleto de acto-miosina. Los
INTRODUCCIÓN - 35 -
efectores de esta vía de señalización son la familia de proteínas Ser/Thr kinasas
ROCK, las cuales actúan a dos niveles:
a. Regulación de la estabilidad de los filamentos de actina: a este nivel, las
proteínas ROCK actúan estabilizando el citoesqueleto de actina a través de la
activación de la proteína kinasa Lim (LIMK). LIMK actúa fosforilando e inactivando a la
proteína de unión a actina cofilina, la cual interfiere en la polimerización de los
filamentos de actina (Bernard, 2007).
b. Regulación de la actividad de la miosina: las proteínas ROCK inducen la
contractilidad del citoesqueleto de acto-miosina mediante la fosforilación directa bien
de la MLC2 (Amano et al, 1996), o bien de la subunidad diana de la fosfatasa de
miosina (MYPT, del inglés myosin phosphatase target subunit) (Essler et al, 1998), lo
cual da lugar a la inactivación de esta fosfatasa y, en consecuencia, a la
hiperfosforilación de MLC2. Este efecto se asocia con un incremento en la
permeabilidad paracelular similar al descrito para MLCK.
4.3. SEÑALIZACIÓN POR PI3K/AKT
Las proteínas fosfoinositol 3-kinasas (PI3K, del inglés phosphoinositide 3-kinases)
son enzimas que fosforilan el grupo hidroxilo de fosfoinositol (PI) en la posición 3,
convirtiéndolo de PI(4,5)P2 a PI(3,4,5)P3. Esto inicia una serie de eventos moleculares
que tienen como resultado la modulación de varios procesos esenciales como la
supervivencia y la proliferación celular, cuyo efector es la proteína AKT (en inglés v-akt
murine thymoma viral oncogene homolog 1) (Hawkins et al, 2006).
La presencia de PI(3,4,5)P3 provoca la translocación de AKT, una Ser/Thr kinasa,
a la membrana plasmática. AKT se activa por fosforilación en los residuos Ser473 y
Thr308 por las proteínas kinasas dependientes de PI (PDK1 y PDK2 del inglés 3-
phosphoinositide dependent protein kinase). AKT, a su vez, activa varios mediadores
- 36 - INTRODUCCIÓN
incluyendo la kinasa glicógeno sintasa (GSK-3β, del inglés glycogen synthase kinase 3
beta), responsable de la degradación de β-catenina por la vía del proteasoma; y el
factor de transcripción snail, que inhibe la transcripción de E-caderina, ocludina y
claudinas. Por otra parte, PTEN (del inglés phosphatase and tensin homolog deleted
on chromosome 10) es una fosfatasa que antagoniza la vía de PI3K defosforilando
PI(3,4,5)P3. La activación de esta vía de señalización puede inducir efectos opuestos
sobre la modulación de la función barrera de las TJ, bien fortaleciéndola o bien
debilitándola, dependiendo de cuál sea el estímulo activador (González-Mariscal et al,
2008).
5. REGULACIÓN DE LA PERMEABILIDAD INTESTINAL
La barrera epitelial no es un elemento estático, al contrario, su función se
encuentra regulada por diversos estímulos fisiológicos, farmacológicos y patológicos.
Así, las TJ están sometidas a una reestructuración constante en respuesta a factores
dietéticos, señales humorales o neuronales, mediadores inflamatorios y una gran
variedad de vías de señalización celulares que incluso pueden ser usurpadas por
patógenos bacterianos o virales como estrategia para acceder a la mucosa intestinal
(Graham et al, 2009). Los cambios rápidos de permeabilidad suceden a través de la
contracción del citoesqueleto, inducida por la acción de la MLCK y por la endocitosis
de proteínas de las TJ (Shen & Turner, 2006; Utech et al, 2010); mientras que las
alteraciones de la permeabilidad más duraderas implican la regulación transcripcional
de las proteínas de las TJ, la apoptosis de las células epiteliales y la aparición de
alteraciones estructurales en el epitelio (Prasad et al, 2005; Schulzke et al, 2006).
La permeabilidad de la barrera epitelial difiere considerablemente dependiendo de
las características fisiológicas de cada epitelio (Anderson & van Itallie, 2009).
Concretamente, en el intestino, existe un cierto nivel de permeabilidad que permite el
INTRODUCCIÓN - 37 -
paso de sustancias desde la luz intestinal al interior de la mucosa. Sin embargo, el
correcto funcionamiento del sistema inmunológico es capaz de prevenir los efectos
negativos de la presencia de patógenos en la luz intestinal. Por otra parte, en la
mucosa del intestino delgado, la capacidad de las TJ para discriminar y restringir el
paso de solutos en base a su tamaño, varía a lo largo del eje cripta-vellosidad. De
manera que, conforme avanzamos desde la base de las criptas hacia la punta de las
vellosidades, más expuestas al contenido luminal, el número y el tamaño de los poros
disminuye sensiblemente (desde 50-60 Ǻ hasta 4-7 Ǻ) (Fihn et al, 2000). Este
gradiente de tamaño es concordante con la función absortiva y secretora del
enterocito, de manera que la absorción tiene lugar en las vellosidades intestinales,
mientras que la secreción se produce en las criptas (Curran, 1972; Desjeaux, 1977).
Además, en condiciones fisiológicas, este gradiente en el tamaño de los poros es
concordante con el estado de maduración y diferenciación de los enterocitos a lo largo
del eje cripta-vellosidad y contribuye a la selectividad de la barrera epitelial.
En condiciones fisiológicas, la barrera epitelial tiene la capacidad de restablecerse
una vez ha cesado el estímulo inductor. Sin embargo, en ciertas condiciones
patológicas, esta capacidad de autorregulación se puede perder, lo cual contribuiría a
que el incremento en la permeabilidad se perpetuara en el tiempo, facilitando el paso
de antígenos a la mucosa intestinal, dando lugar, consecuentemente, a la inflamación
intestinal crónica. Este es el caso de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal
(EII), enfermedad celíaca y también se ha sugerido en pacientes de SII (Arrieta et al,
2006).
En el caso del SII, existen numerosas evidencias que muestran que las
alteraciones de la permeabilidad intestinal podrían desempeñar un papel fundamental
en la fisiopatología de la enfermedad. Diversos estudios funcionales in vivo, en los que
se mide la excreción en orina de diversas sustancias no metabolizables
- 38 - INTRODUCCIÓN
(lactulosa/manitol, 51Cr-EDTA), han demostrado que los pacientes con SII-PI muestran
una permeabilidad intestinal aumentada en comparación con individuos sanos tanto en
el colon (Marshall et al, 2004) como en el intestino delgado (Spiller et al, 2000; Dunlop
et al, 2006). Este incremento es incluso mayor en pacientes con SII-D de origen no
post-infeccioso (Dunlop et al, 2006). Pese a que se ha demostrado que la
permeabilidad está alterada en toda la longitud del intestino, todos los estudios
dirigidos a desentrañar las bases moleculares de dicha alteración en el SII, se han
centrado en la mucosa del colon. Así, varios estudios in vitro con biopsias de colon de
pacientes con SII han demostrado que la disfunción de la barrera en estos pacientes
está asociada al aumento de la permeabilidad paracelular, a la disminución en la
expresión de proteínas integrantes de las TJ en la mucosa colónica, concretamente la
proteína adaptadora ZO-1 (Piche et al, 2009) y a la degradación de ocludina mediante
la vía del proteasoma (Coeffier et al, 2010). Es interesante destacar que este aumento
de la permeabilidad paracelular parece ser dependiente de la presencia del receptor
activado por proteasas PAR-2 (del inglés protease activated receptor 2) y de la
fosforilación de MLC2 (Gecse et al, 2008). Los mediadores responsables de este
efecto y su origen no han sido identificados, aunque los candidatos más plausibles son
las proteasas producidas y liberadas por la mucosa del intestino, en concreto la
triptasa liberada por los mastocitos y las proteasas derivadas de las bacterias
presentes en la luz intestinal (Jacob et al, 2005; Steck et al, 2009).
En la mucosa intestinal, las células del sistema inmunológico se encuentran en
estrecha conexión con las fibras nerviosas, lo cual propicia la comunicación
bidireccional entre el SNC, el SNE y el sistema inmunológico. Esta comunicación tiene
la misión de modular la permeabilidad intestinal, de manera que se favorezca el estado
de homeostasis en la mucosa. Dicha homeostasis puede verse alterada en respuesta
a diversos factores tal y como se detalla a continuación.
INTRODUCCIÓN - 39 -
5.1. EL ESTRÉS PSICOLÓGICO Y LA REGULACIÓN DE LA PERMEABILIDAD INTESTINAL.
La respuesta del organismo al estrés comprende una compleja cadena de
procesos neuro-hormonales que comienzan con la liberación en el hipotálamo del
factor liberador de corticotropina (CRF, del inglés corticotropin releasing factor),
seguida de la liberación de glucocorticoides y catecolaminas, que, para ser efectivas,
requieren de la integridad funcional del eje hipotálamo-hipofisario-adrenal y del
sistema autonómico periférico. El objetivo de esta respuesta es el mantenimiento del
equilibrio funcional interno. En algunos casos, cuando la homeostasis se ve
amenazada de manera continuada o excesiva (sobreestrés), el organismo puede
generar respuestas anómalas que pueden dar lugar a diversos procesos de naturaleza
inflamatoria, como el SII. De hecho, estudios clínicos han observado que los pacientes
con SII presentan más eventos vitales estresantes y empeoran cuando son expuestos
a factores estresantes (Bhatia & Tandon, 2005; Guilarte, et al 2007; O’Malley et al,
2011). Además, frecuentemente los pacientes de SII presentan co-morbilidad con
trastornos psiquiátricos asociados al estrés, particularmente ansiedad y depresión
(Lydiard, 2001; Whitehead et al, 2002; Tanaka et al, 2011) y se ha asociado el estrés
traumático en la infancia a un mayor riesgo de desarrollo de esta enfermedad
(Bennett et al, 1998; Tanaka et al, 2011).
En el ámbito experimental, diversos estudios en modelos animales y en humanos,
han demostrado que el estrés psicológico crónico provoca cambios importantes en la
secreción de agua e iones y en la permeabilidad del epitelio intestinal (Santos et al,
1999; Alonso et al, 2008; Vicario et al, 2010). Estos cambios se asocian a signos
ultraestructurales de daño epitelial (Vicario et al, 2010) y están mediados, al menos en
parte, por la activación de los mastocitos de la mucosa (Santos et al, 1999; Vicario et
al, 2010), por la activación de vías neuronales colinérgicas y adrenérgicas y por CRF
(Santos et al, 1999). Además, el estrés experimental puede iniciar y reactivar la
- 40 - INTRODUCCIÓN
inflamación de la mucosa y alterar la función epitelial (Qiu et al, 1999). Estas
alteraciones en la barrera intestinal podrían facilitar una penetración excesiva de
antígenos presentes en la luz intestinal a través del epitelio, con la consiguiente
activación del sistema inmunológico y el posterior desarrollo de la inflamación
intestinal.
5.2. CÉLULAS Y MEDIADORES DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO IMPLICADOS EN LA
REGULACIÓN DE LA PERMEABILIDAD INTESTINAL.
5.2.1. Mastocitos
Los mastocitos son granulocitos que se originan en la médula ósea, desde donde
migran a los tejidos para completar su maduración. Estas células son residentes
habituales de las mucosas del organismo y constituyen el 2-3% del total celular de la
lámina propria intestinal (Bischoff et al, 1996). Varios estudios han demostrado la
estrecha relación anatómica existente entre los mastocitos y las terminaciones
nerviosas de la mucosa intestinal (Park et al, 2003; Barbara et al, 2004). Esta
proximidad neuronal habilita la comunicación bidireccional entre el mastocito, el SNC y
el SNE, lo cual junto al incremento del número de mastocitos y sus mediadores,
observado en pacientes de SII, podría contribuir a la generación de los síntomas de
esta enfermedad (Guilarte et al, 2007; Barbara et al, 2004; Barbara et al, 2007).
Numerosos estudios han demostrado la implicación de los mastocitos en la
regulación de la función de barrera del intestino a través de la liberación de
mediadores específicos (Groschwitz et al, 2009; Groschwitz & Hogan, 2009; Keita &
Söderholm, 2010). Entre estos mediadores destacan particularmente el interferón
gamma (IFNγ), el TNFα y la proteasa específica de mastocitos triptasa (figura 8). La
capacidad de las citocinas, como el TNFα y el IFNγ, para regular la función de la
barrera epitelial fue descrita por primera vez hace 20 años. Desde entonces se han
INTRODUCCIÓN - 41 -
identificado varios mecanismos para explicar dicha pérdida de función de la barrera,
tales como la degradación, el aumento de la transcripción y la endocitosis de proteínas
de TJ, la activación de kinasas y la modulación del citoesqueleto a través de la
activación de MLCK (Turner, 2009; Utech et al, 2010). Por otro lado, la triptasa
liberada tras la activación de los mastocitos influye directamente sobre la
permeabilidad intestinal a través de los receptores PAR-2 presentes en la membrana
apical y basolateral de las células epiteliales, pero también de forma indirecta a través
de los receptores PAR-2 de las terminaciones nerviosas entéricas y en los propios
mastocitos (Keita & Söderholm, 2010).
Además de liberar mediadores pro-inflamatorios, los mastocitos expresan en su
membrana receptores de CRF (subtipos CRF1 y CRF2) (Wallon et al, 2008) y liberan
hormonas relacionadas, como la urocortina (Kempuraj et al, 2004), por lo que su
activación sería consistente con la participación del eje neuro-celular del estrés en la
generación de las alteraciones fisiopatológicas del SII. De hecho, los cambios
morfológicos y funcionales del epitelio intestinal en respuesta al estrés o a mediadores
como la CRF son revertidos tras la inhibición farmacológica de los mastocitos (Santos
et al, 1999; Barreau et al, 2007) y están ausentes en animales deficientes en
mastocitos (Santos et al, 2001). Asimismo, estudios realizados en humanos también
indican un marcado aumento de la secreción y la permeabilidad intestinal y colónica en
respuesta a la exposición a un estrés experimental; cambios que se acompañan de la
activación del mastocito y de la liberación luminal de sus mediadores como triptasa e
histamina (Santos et al, 1998). La participación de los mastocitos en las alteraciones
epiteliales inducidas por el estrés se ha confirmado en estudios con humanos que
demuestran la regulación de la permeabilidad epitelial en biopsias de colon humano
mediante la activación de receptores específicos (CRF1 y CRF2) en los mastocitos y la
- 42 - INTRODUCCIÓN
activación mastocitaria inducida por la CRF en pacientes con SII-D (Guilarte et al,
2004).
5.2.2. Eosinófilos.
Los eosinófilos son leucocitos polimorfonucleares de tipo granulocito que se
originan en la médula ósea donde completan su maduración antes de migrar a los
tejidos. Son células multifuncionales implicadas en la patogenia de numerosos
procesos inflamatorios, incluyendo infecciones, asma y enfermedades
gastrointestinales. Son células residentes a lo largo de todo el tubo digestivo, a
excepción de la mucosa del esófago, y se encuentran en mayor número en diversas
enfermedades digestivas como la gastroenteritis eosinofílica, la esofagitis eosinofílica y
la EII (Powel et al, 2010).
Al igual que los mastocitos, los eosinófilos son capaces de sintetizar y almacenar
en sus gránulos una gran cantidad de mediadores inflamatorios de naturaleza muy
diversa (proteínas catiónicas, factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas,
mediadores lipídicos y neuromoduladores) (Powel et al, 2010). Se ha descrito la
presencia de un mayor número de eosinófilos en la lámina propria del colon de
pacientes con SII (Park et al, 2008), aunque los resultados aún son controvertidos y no
se han relacionado aún con la fisiopatología de la enfermedad.
En cuanto a su participación en la modulación de la barrera epitelial, se ha descrito
la disminución de la resistencia transepitelial y la alteración de la permeabilidad en
estudios in vitro de co-cultivos de células epiteliales intestinales con eosinófilos o tras
la estimulación de las células epiteliales con la proteína principal del eosinófilo (MBP,
del inglés major basic protein). Esta alteración en la función de barrera se asocia a la
disminución de la expresión de ocludina (Groschwitz & Hogan, 2009) (figura 8).
INTRODUCCIÓN - 43 -
5.1.3. Linfocitos T
Los linfocitos T son leucocitos que se originan en la médula ósea a partir de
progenitores linfoides inmaduros, desde donde migran hacia el timo, donde se produce
todo el proceso de maduración. Los linfocitos T maduros dejan el timo y alcanzan el
torrente sanguíneo, diseminándose por todo el organismo hasta alojarse en los tejidos
linfoides.
Varios estudios han mostrado un aumento en el número y en la activación de los
linfocitos T CD4+ en el colon de pacientes con SII (Spiller et al, 2000; Chadwick et al,
2002; Cremon et al, 2009), los cuales participan en la alteración de la permeabilidad
paracelular del epitelio intestinal mediante la liberación de interleucinas y citocinas pro-
inflamatorias como el TNFα y el IFNγ (figura 8). Por un lado, TNFα e IFNγ estimulan la
actividad de MLCK lo cual conduce a un incremento en la fosforilación de MLC2 y la
consiguiente contracción del citoesqueleto (Clayburgh et al, 2005; Wang et al, 2005).
Por otra parte, el IFNγ provoca la redistribución de proteínas de las TJ ocludina,
claudina-1 y claudina-4 mediante macropinocitosis (Bruewer et al, 2005).
Alternativamente, ambas citocinas comprometen la estabilidad de las TJ e inducen un
incremento de la permeabilidad intestinal mediante la regulación de la expresión de
ocludina. Por otro lado, las interleucinas 4 y 13 (IL-4, IL-13) provocan un aumento de la
permeabilidad intestinal mediante la inducción de apoptosis epitelial y la regulación de
la expresión de claudina-2 (Wisner et al, 2008; Weber et al, 2010).
Por otra parte, los linfocitos intraepiteliales o gamma/delta (IEL, γδ+) también están
implicados en la modulación de la función de barrera intestinal en respuesta a
parasitosis entérica. La importancia de esta población celular en el mantenimiento de
la integridad epitelial, se ha demostrado en estudios con ratones deficientes en IEL.
Estos ratones presentan una deslocalización de claudina-3, ocludina y ZO-1; una
- 44 - INTRODUCCIÓN
disminución de la fosforilación de ocludina y formación anómala de TJ en el epitelio
(Groschwitz & Hogan, 2009) (figura 8).
Figura 8. Regulación de la función de barrera del intestino por estímulos inmunológicos. Los linfocitos T, a
través de la liberación de mediadores pro-inflamatorios como TNFα y IFNγ, estimulan la fosforilación de MLC2 y la
consiguiente contracción del citoesqueleto. Por otra parte, IFNγ provoca la redistribución de varias proteínas de las TJ.
Los linfocitos intraepiteliales (IEL) participan, mediante un mecanismo no descrito, en la modulación de la fosforilación
en serina de la ocludina. Los mediadores mastocitarios, incluyendo TNFα, proteasas como la triptasa, histamina y
prostaglandinas aumentan la conductancia a iones Cl- incrementando así la permeabilidad intestinal. Las proteasas del
mastocito, además, pueden participar en la degradación de la ocludina con la consiguiente alteración de la función de
barrera. Por último, la MBP derivada de los eosinófilos provoca la reducción en la expresión de ocludina en células
epiteliales de colon. (Reproducido de Groschwitz & Hogan, 2009).
CCAAPPÍÍTTUULLOO II
CAPÍTULO I - 47 -
CAPÍTULO I
6. THE JEJUNUM OF DIARRHEA-PREDOMINANT IRRITABLE BOWEL
SYNDROME SHOWS MOLECULAR ALTERATIONS IN THE TIGHT JUNCTION
SIGNALING PATHWAY THAT ARE ASSOCIATED WITH MUCOSAL
PATHOBIOLOGY AND CLINICAL MANIFESTATIONS.
Authors: Cristina Martínez1, María Vicario1, Laura Ramos1, Beatriz Lobo1, Jose Luis
Mosquera2, Carmen Alonso1, Alex Sánchez2,6, Mar Guilarte1,3, María Antolín1, Inés de
Torres4, Ana M. González-Castro1, Marc Pigrau1, Esteban Saperas1, Fernando
Azpiroz1,5, Javier Santos1,5.
1Digestive System Research Unit and 2Statistics and Bioinformatics Unit, Institut de
Recerca Vall d’Hebron; Departments of 1Gastroenterology, 3Allergy, and 4Pathology,
Hospital Universitari Vall d’Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona,
Spain. 5Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y
Digestivas (Ciberehd). 6Statistics Department, Facultad de Biología, Universidad de
Barcelona, Barcelona, Spain.
Grant Support: Supported in part by the Fondo de Investigación Sanitaria and
CIBERehd, Instituto Carlos III, Subdirección General de Investigación Sanitaria,
Ministerio de Ciencia e Innovación (CM05/00055, LR; CP10/00502, MV; CM08/00229,
BL; CM04/00019, CA; MTM2008-00642, AS; CM10/00155, MP; PI05/1423,
EC07/90148, PI/080940 & CB06/04/0021, JS; CB06/04/0021, FA), Agència de Gestió
d’Ajuts Universitaris i de Recerca, Generalitat de Catalunya (2009 SGR 219, to FA &
JS); the International Foundation for Functional Gastrointestinal Disorders (2008 IFFGD
to JS) and the 2010 Rome Foundation Award (to JS).
- 48 - CAPÍTULO I
6.1. INTRODUCTION
There is convincing epidemiological evidence to support the connection between
psychosocial determinants1-3 and gastrointestinal infections4 and the onset,
persistence, and severity of IBS manifestations, although a pathophysiological hallmark
has not been elucidated. Our general hypothesis is that a leading event in such
connection is the breakdown of intestinal epithelial barrier’s surveillance. This is
inferred from converging observations describing abnormal intestinal permeability in
IBS subpopulations5-8 related to the onset and severity of visceral hypersensitivity and
bowel habit6,9,10. Barrier dysfunction might facilitate unfettered penetration of food and
bacterial antigens to stimulate disruptive immunological responses favoring the
development of mucosal inflammation11,12. Interestingly, both stress and infections
display significant ability to disturb the mucosal barrier and to initiate and reactivate
mucosal inflammation in animal models and humans9,10,13-15. Additional support to this
hypothesis comes from several reports showing the presence of low-grade
inflammation and immune activation as a frequent, yet not universal16,17, pathological
hallmark in the intestinal mucosa of certain IBS subgroups18,19. This pathobiological
substrate is dominated by activated mast cells (MCs) in both the small bowel and the
colon20-22. Upon activation, MCs release multiple potent biological mediators, some of
which have been involved in the regulation of the intestinal barrier function and in the
generation of gastrointestinal motor abnormalities and visceral pain in IBS16,23,24.
Although clinical studies have shown that increased intestinal permeability occur along
the whole intestine, studies aimed at unraveling the molecular underpinnings of this
abnormality in IBS are focused on the large bowel. In this sense, recent reports have
shown that barrier dysfunction in IBS is linked to the down-regulation of the tight
junction (TJ) scaffolding protein zonula occludens 1 (ZO-1)9 and to the degradation of
the TJ structural protein occludin by the proteasome in the colonic mucosa10.
CAPÍTULO I - 49 -
Luckily, the intense efforts to unravel the mechanistic basis of IBS pathogenesis
may be experiencing a giant leap forward with the incorporation of innovative and
powerful tools, such as microarray analysis, into biomedical research. Indeed, recent
genomic studies of colonic biopsies of IBS describe significant changes in the
expression and secretion of selected pro-inflammatory cytokines and the impairment of
mucosal immune response to microbial pathogens25,26. To elucidate differential
pathways operating in IBS we applied a new strategy consisting of transcriptomic
profiling in the jejunal mucosa combined with canonical signaling pathway analysis and
regulatory network identification. Since TJ signaling and mast cell biology emerge as
the most altered pathways linked to the transcriptomic signature of IBS-D, we further
studied the expression of TJ proteins and mast cell activation and its relation to clinical
symptoms in this disorder.
6.2. METHODS (see also supplementary methods section in page 149)
6.2.1. Participants
Newly diagnosed IBS-D patients meeting the Rome II criteria27 and H volunteers,
aged ≥18 or ≤60 years, were prospectively recruited from the gastroenterology unit and
by public advertising, respectively. Additionally, all IBS patients were experiencing daily
watery or mushy stools at inclusion. A complete medical history and physical
examination were carried out. Food allergy was excluded using a battery of skin prick
tests (Leti) for 32 common food allergens in all candidates. Reasonable exclusion of
past episodes of infectious gastroenteritis and gastrointestinal comorbidities was
achieved by means of a broad biochemical and serological profile including anti-
transglutaminase antibodies, upper and lower fiberoptic and small bowel capsule
endoscopy, abdominal sonography and barium studies, when considered pertinent.
The study protocol was approved by the Ethics Committee at Hospital Vall d´Hebron
(PR(AG)76/2006). Written informed consent was obtained from each participant.
- 50 - CAPÍTULO I
6.2.2. Clinical Assessment
The following parameters were recorded in all participants for the last 10 days prior
to the biopsy:
a) Background stress by the Modified Social Readjustment Scale of Holmes-
Rahe28.
b) The severity of abdominal pain by a 100-point visual analogue scale.
c) The frequency of abdominal pain (number of days with pain).
d) The stool frequency (maximum number of bowel movements).
e) The stool consistency by the Bristol scale29.
6.2.3. Biological evaluation
Jejunal biopsy
A single mucosal biopsy per participant was obtained from the proximal jejunum, 5-
10 cm distal to the Treitz’s angle, using a Watson’s capsule. Tissue samples were
immediately split into two similar pieces with a sterile scalpel. One fragment was fixed
in formalin and embedded in paraffin for further microscopic examination. The
remaining fragment was placed in RNAse free tubes containing 500 μL of RNA Later
Solution (Ambion) and stored at -80ºC until processed for RNA isolation.
Histology and Immunohistochemistry
Tissue sections were processed for routine hematoxylin & eosin following general
procedures to assess epithelial morphology and eosinophilic infiltration. In addition, the
number of MCs and IELs was determined at x 400 magnification using anti-human c-kit
(CD117) and CD3 antibodies (Dako), as previously described21. Specimens were
blindly examined by one experienced pathologist.
CAPÍTULO I - 51 -
Immunofluorescence
Sections were blocked with Blocking Solution (Dako) for 10 minutes followed by 60
minutes room temperature incubation in mouse anti-human ZO-1 and ZO-2 monoclonal
antibodies (Invitrogen) or rabbit anti-human ZO-3 monoclonal antibody (Cell Signaling
Technologies). Secondary antibodies were Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG and
488 goat anti-mouse IgG (Molecular Probes). Nuclei were counterstained with 4',6-
diamidino-2-phenylindole (DAPI) before mounting in Prolong antifade reagent
(Molecular Probes). Negative control slides were set by exposing the serial sections
under similar conditions but without the primary antibody. Images were acquired with a
laser scanning confocal microscope (FV-10) and quantification of TJ protein expression
was performed in a blinded manner measuring the average of fluorescence intensity in
10 non-overlapping fields per subject using the FV-10-ASW Olympus software.
Microarray analysis
Five jejunal biopsy samples per group were randomly selected for this analysis
aimed at identifying genes showing consistent differential expression between groups.
See the supplementary methods section for a detailed protocol. The complete dataset
is available at the NCBI Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo;
accession number GSE14841).
Quantitative Real Time PCR
Amplification of cDNA was used to further validate microarray results and to assess
ZO-1, ZO-2 and ZO-3 gene expression. cDNA synthesis was performed using 1 μg of
total RNA with the High Capacity Reverse Transcription Reagents Kit (Applied
Biosystems). Q-RT-PCR was performed on an ABI PRISM® 7500 FAST Sequence
Detection System (Applied Biosystems) using validated TaqMan Gene Expression
Assays (GEA), and the human 18S subunit ribosomal RNA gene as the endogenous
control (supplementary table 1) (Applied Biosystems). Each sample, including distilled
- 52 - CAPÍTULO I
water as negative control, was run in triplicate and data were analyzed by the 2-ΔΔCt
method, as previously described30. The expression of each gene was normalized to the
endogenous control and the fold-change was calculated individually respect to the
average of the H group.
6.2.4. Statistical analysis
Two-tailed parametric or nonparametric tests were used when appropriate
(unpaired Student’s t-test, Mann-Whitney U test) using GraphPad Prism 5.0 software.
Relationships between clinical variables and gene expression were assessed by
Spearman’s rho correlation. Randomization of patients (microarray study) and genes
(validation of microarray data) were performed using a standard random number
generator (a linear congruential generator was used to generate uniform random
values, followed by a transformation to obtain integer values in a set with the same size
as the number of patients/genes). Data are expressed as mean ± standard deviation
(SD), unless otherwise stated; P-values of < 0.05 were considered significant. To
control errors derived from multiple simultaneous testing, P-values were adjusted to
obtain strong control over the “false discovery rate” (FDR).
6.2.5. Pathway Analysis
To highlight relevant biological pathways implicating those genes differentially
expressed, we applied IPA methodology (IPA Software 7.0, Ingenuity® Systems,
www.ingenuity.com). IPA integrates selected genomic data sets with mining techniques
to predict functional linkages and their interpretation in the context of protein networks
that comprise protein-protein interactions and related biological functions and canonical
signaling pathways. The list of genes was overlaid onto a global molecular network
developed from information contained in the IPA knowledge base. Focus genes were
defined as those with a mean fold-change of ≤0.7 and ≥1.4, compared to H individuals.
Detailed explanation of IPA methods is included in the supplementary methods section.
CAPÍTULO I - 53 -
Table 1. Clinical and demographic characteristics of participants.
Stool consistency: 1 (hard) to 7 (entirely liquid). Holmes-Rahe scale: 0-150, low stress; 151-300, moderate stress;
>300 severe stress.
Note: IBS-D, diarrhea-predominant irritable bowel syndrome; H, healthy; F, female; M, male; NA, non-applicable.
Other exclusion criteria: active smoking, major psychiatric and organic diseases, those having taken any drug,
pharmaceutical compound, or herb in the last 2 weeks, those having taken steroids, anti-allergic or immunosuppressive
and related drugs in the last 3 months, and those having received radiotherapy or chemotherapy in the last 6 months.
- 54 - CAPÍTULO I
6.3. RESULTS
6.3.1. Study population
Twenty-three H volunteers and twenty-five IBS-D patients were included in the
study. Study groups were similar in age (H, 31.4 [95% CI: 27.8-34.9]; IBS-D, 35.2 [95%
CI: 31.0-39.5] years); P=0.16) (table 1). In IBS-D, the severity of abdominal pain was
52.8/100 (SD 22.3; 95% CI 43.6 to 62.0), the frequency of abdominal pain was 5.3/10
days (SD 2.9; 95% CI 4.1 to 6.5), and the stool consistency was 5.3 (SD 0.9; 95% CI
5.0 to 5.7). H volunteers had low stress levels while IBS-D patients showed higher yet
moderate stress levels in the last year (H: 85.0 [25-75% percentile: 64.0-152.0]; IBS-D:
157.0 [25-75% percentile: 117.5-278.5]; P=0.0006).
6.3.2. The jejunum of IBS-D shows hyperplasia of mucosal MCs
All biopsies disclosed normal epithelial architecture, no increase in eosinophil
counts, and no parasites, microbial or viral inclusions. Confirming previous findings21,
patients showed a marked increased in MCs (CD117+) counts (IBS-D: 25.8 (SD 8.8;
95% CI 22.1-29.4); H: 18.1 (SD 10.3; 95% CI 13.7-22.5) MCs/hpf; P=0.008). No
significant differences were found in the number of CD3+ cells between both groups
(IBS-D: 24.8 (SD 16.9; 95% CI 17.9-31.8); H: 17.8 (SD 5.4; 95% CI 15.6-20.3); P=0.06)
(supplementary table 2).
6.3.3. The jejunal mucosa of IBS-D shows a distinctive transcriptional profile
linked to alterations in intestinal permeability, MC function and TJ signaling
Analysis of microarray data revealed 286 genes as differentially expressed in IBS-D
compared to H (FDR-adjusted P-value<0.05) (supplementary table 3). Not surprisingly,
the analysis disclosed predominant low to moderate expression fold-changes (range:
0.3-2.8; figure 1A). Hierarchical clustering of the individual signal intensities uncovered
a high similarity of transcript expression patterns among IBS-D (figure 1A). Validity of
our microarray analysis is supported by significant and consistent expression
CAPÍTULO I - 55 -
differences (in the same direction, up or down) between groups as shown by Q-RT-
PCR analysis (supplementary figure 1) of a selection of 14 randomly selected genes.
To define how individual genes interact to have a coordinated role in specific
biological functions and signaling pathways we identified the potential networks of the
IBS-D transcriptomic profile. Seventeen significant biological networks were identified
by IPA (supplementary table 4). Further analysis of the highest scored network (score
44, 26 focus genes) identified intestinal permeability (P<0.01), the apoptosis of
leukocytes and MCs (P<0.01) and immunological disorder (P<0.05), as the most
significant biological functions, and phosphatase and tensin homologue deleted on
chromosome ten (PTEN) (P<0.001) and TJ signaling (P<0.001), as the main canonical
signaling pathways linked to this network (figure 1B).
In order to confirm the altered expression of genes related to the functions and
pathways identified in this network, Q-RT-PCR analysis was performed in a larger IBS-
D population (figure 1C). Assessment of genes related to MCs-dependent alterations in
intestinal permeability, disclosed consistent up-regulation of tryptase (TPSAB1/TPSB2)
in IBS-D patients (P<0.001), yet no change in proteinase activated receptor 2 (PAR-2)
expression. In addition, genes related to apoptosis and survival of MCs, including
forkhead box O3 transcription factor (FOXO3), myeloid cell leukemia-1 (MCL-1), and
stem cell factor (SCF) were down-regulated in IBS-D tissue samples (P<0.001 for all).
Although we failed to confirm up-regulation of the pro-apoptotic factor CASP10, we
indeed found over-expression of TRAIL (P<0.01) and TRAIL-R1 (P<0.05), known target
molecules in CASP10-mediated apoptosis signaling cascade. Moreover, we validated
the significant reduction in PTEN expression in IBS-D, which may also link FOXO3 to
MCs survival.
- 56 - CAPÍTULO I
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CAPÍTULO I - 57 -
- 58 - CAPÍTULO I
Figure 1. Transcriptional signature of IBS-D patients and IPA functional analysis (cont).
B. Relationships between differentially expressed genes in the highest scored network and related Canonical
Pathways (CP) and Biological Functions (Fx). The list of differentially expressed genes in IBS-D, compared to
healthy, linked to their approved nomenclature (http://www.genenames.org), and fold-change was uploaded into the IPA
application. Node (gene) and edge (gene relationship) symbols are described in the figure. The intensity of the node
color indicates the degree of up-(red) or down-(green) regulation. Genes in uncolored nodes were not identified as
differentially expressed in our study and were integrated into the computationally generated networks on the basis of the
evidence stored in the IPA knowledge memory indicating relevance for this network. The network score is based on the
hypergeometric distribution and is calculated with the right-tailed Fisher’s Exact Test. The score is the negative Log of
this P-value (P-score=-log10 (P-value)). C. Q-RT-PCR validation of microarray data of genes related to functions
and pathways from Network 1. Expression of genes involved in apoptosis of leukocytes and mucosal mast cells
(MCL1, FOXO3 and SCF), intestinal permeability (PAR-2 and tryptase) and PTEN signaling. Level of expression of
selected genes was measured in 12 H volunteers and 17 IBS-D patients. To obtain the fold-change value for each
sample the target gene/18S mRNA ratio was calculated for each sample and then normalized to the average of the H
group. Groups were compared using the parametric unpaired t-test and P-values are indicated.
Note: F2RL1, coagulation factor II (thrombin) receptor-like 1, also known as PAR2, protease-activated receptor 2.
CAPÍTULO I - 59 -
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- 60 - CAPÍTULO I
IPA analysis also identified a number of new canonical signaling pathways key for
intestinal homeostasis as playing an important role in IBS-D (supplementary table 5).
Interestingly, caveolar-mediated endocytosis, TJ signaling, and PTEN signaling,
appeared as the most significant in IBS-D (table 2).
6.3.4. The altered expression of TJ-related proteins correlates with mucosal MC
activation and bowel dysfunction in IBS-D
As TJ signaling is one of the most significant pathways highlighted by IPA analysis,
we next studied TJ protein expression. IBS-D samples showed differential mRNA
expression of several proteins belonging to the TJ (figure 2A), including tight junction
protein (TJP)-1 and 2 (also known as zonula occludens (ZO)-1 and 2) which, together
with ZO-3, are responsible for connecting the integral transmembrane proteins of the
intercellular junctions to the cytoskeleton31.
In order to further assess TJ dysregulation, we measured the expression and
protein distribution of ZO proteins in a larger set of participants. Q-RT-PCR analysis
demonstrated a significant down-regulation of ZO-1 and ZO-3 mRNA in IBS-D patients
(P<0.01 for both), while ZO-2 remained unchanged (figure 2B).
At the protein level, IBS-D showed reduced staining for both, ZO-1 (H: 128 ± 28 vs.
IBS-D: 45 ± 20 arbitrary units; P<0.0001) and ZO-2 (H: 423 ± 156 vs. IBS-D: 281 ± 149
arbitrary units; P<0.05), and no change in ZO-3 staining (figure 2C). Moreover, we
observed a marked labeling of the intracellular compartment in IBS-D samples,
suggesting intensive internalization of this protein, as opposed to H where ZO-1 was
restricted to the surface of epithelial cells (figure 2C).
CAPÍTULO I - 61 -
- 62 - CAPÍTULO I
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Healthy IBS-D
ZO3 Fluorescence Intensity
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Healthy IBS-D
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Healthy IBS-D
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Healthy IBS-D
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Healthy IBS-D
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ZO2 Fluorescence Intensity
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Healthy IBS-D
P = 0.015 *
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IBS-D
Healthy
ZO-2
IBS-D
Healthy
ZO-3
IBS-D
Healthy
ZO-3
IBS-D
Healthy
Figure 2. Assessment of TJ signaling pathway in the jejunal mucosa of IBS-D patients.
A. Microarray analysis of TJ signaling-related genes in the jejunal mucosa of IBS-D and H
subjects. Affymetrix accession number of genes and their fold change expression in IBS-D with respect to H are
indicated. P-values were adjusted to obtain strong control over the “false discovery rate” (FDR) using the Benjamini and
Hochberg method. B. qRT-PCR validation of genes related to TJ signaling pathway. Expression of genes involved
in connecting the integral transmembrane proteins of the TJ to the cytoskeleton (ZO-1, ZO-2 and ZO-3). Level of
expression of selected genes was measured in 12 H volunteers and 17 IBS-D patients. To obtain the fold-change value
for each sample the target gene/18S mRNA ratio was calculated for each sample and then normalized to the average of
the H group. Groups were compared using the parametric unpaired t-test and P-values are indicated. C. Detection of
ZO proteins in the jejunal epithelium by laser scanning confocal microscopy. Representative micrographs of the
jejunal epithelium of 16 IBS-D and 16 H samples where zonula occludens (ZO)-1 (green), ZO-2 (green) and ZO-3 (red)
are identified (high-power field, x400). Nuclear labeling of 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blue) is also shown for
reference. Inserts show magnified localization of ZO proteins.
CAPÍTULO I - 63 -
The expression of ZO proteins significantly correlated with tryptase and SCF, which
are indicative of mast cell activation and proliferation, respectively (table 3). Bowel
frequency and stool consistency correlated with both numbers (CD117+) and activation
of MCs (tryptase mRNA expression), and with the expression of ZO proteins (table 4).
Table 3. Correlation between MC-related variables and ZO expression in the jejunal mucosa of IBS-D
patients (n=17) and H volunteers (n=12).
Note: A FDR <15% was accepted as significant.
Table 4. Correlation between clinical parameters and MC-related variables and ZO expression in the jejunal
mucosa of IBS-D patients (n=17) and H volunteers (n=12).
Note: For correlations of abdominal pain intensity and frequency, only IBS-D participants were evaluated, as H
subjects do not have pain by definition. A FDR <15% was accepted as significant.
- 64 - CAPÍTULO I
6.3.5. Integrative multivariate analysis of clinical and biological data
differentiates between IBS-D and healthy populations
To get insights on the biological relevance of our findings and to discover
association between different groups of variables, MFA was performed using all
differentially expressed probe sets plus ECH variables. In this analysis, each graph
was built with the two first components of the PCA, showing that the first component
explains an extraordinary high proportion, 74.14%, of the total variability of the data.
For the correlation circle, only genes with a correlation value >0.8 over the first
component were plotted (supplementary table 6) revealing two well-identified gene
patterns (figure 3A). Over-expressed genes in IBS-D (left side) linked to the vast
majority of quantitative ECH parameters, being the intensity of abdominal pain the most
relevant variable (the longest arrow, meaning the higher correlation), whereas under-
expressed genes (right side) did not correlate with any of the ECH variables studied.
Furthermore, individual factor maps for frequency of abdominal pain, bowel movements
and Bristol stool scale showed two distinctive clusters over the first dimension: H (4
individuals) and IBS-D (5 individuals) (figure 3B).
Overall, in the MFA, the ECH variables together with the differentially expressed
genes completely discriminates the H and IBS-D groups, confirming that there is a
consistent pathophysiological process related to the transcriptomic profile underlying
the IBS-D entity.
CAPÍTULO I - 65 -
Figure 3. Integrative multivariate analysis and clustering of participants based on gene expression and ECH
variables.
A. PCA for variables in Healthy vs. IBS-D. Quantitative ECH variables are represented by colored arrows and gene
expression are represented by black arrows. Proximity of arrow-heads to 1.0 indicates better projection. Only genes with
a correlation value ≥0.8 are represented. On the left side, genes over-expressed in IBS-D are linked to most of the
quantitative ECH variables. On the contrary, only one variable (Holmes-Rahe) appear on the right side where under-
expressed genes are plotted.
- 66 - CAPÍTULO I
B.
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CAPÍTULO I - 67 -
6.4. DISCUSSION
We provide the first evidence of the alteration of TJ signaling in the jejunal mucosa
of IBS-D patients and its relation to mast cell activation and to the clinical outcome of
these patients. Conjointly, these findings come to challenge the classical view of IBS as
a model functional disorder while reinforce its organic parentage, which extends
beyond the colon to affect also the small bowel.
The integrative analysis of our data illustrates relevant issues related to the nature
and the mechanistic understanding of IBS-D: 1) The jejunum of IBS-D patients displays
a distinctive gene transcriptional profile; 2) Intestinal permeability, MC biology and TJ
signaling emerge as distinctive biological functions in IBS-D; and 3) There is a
consistent pathophysiological process linking clinical outcome and transcriptomic
signature in IBS-D.
Altered intestinal permeability has been described as a key feature of IBS5,6,7,8,
being more pronounced in IBS-D patients than in other subgroups of IBS5. Importantly,
our study identified the TJ signaling as one of the most significant pathways. Of
particular clinical interest to IBS-D is the down-regulation of ZO-1, given its ability to
modulate paracelular permeability, and its correlation with enhanced intestinal
permeability and abdominal pain severity in the colon of IBS6,9. In our study, both Q-
RT-PCR and confocal microscopy confirmed the down-regulation of ZO-1 in the
jejunum of IBS-D. In addition, we found ZO-1 redistribution from the apical membrane
of the enterocytes to the cytoplasm only in IBS-D samples. The same effect on ZO-1
localization has been found in mouse colonocytes added with fecal supernatants from
IBS-D32. Besides protein down-regulation, structural and functional modulation of
barrier function can be also achieved by endocytosis of TJ proteins by a mechanism
that depends on the stimulus involved33. Pro-inflammatory factors such as tumor
necrosis factor (TNF) and bacterial products have been shown to induce the
- 68 - CAPÍTULO I
internalization of ZO-1 and occludin by caveolar-mediated endocytosis34,35 together
with a concomitant loss of barrier function. Notably, caveolar-mediated endocytosis is
identified in our study as the most significant signaling pathway associated with the
transcriptional signature of IBS-D. Taken together, these results suggest that ZO-1
down-regulation and redistribution may help to explain the increased intestinal
permeability observed in IBS-D, although further studies are needed to define the
mechanism and functional consequences of this alteration.
Interestingly, the down-regulation of ZO proteins negatively correlated with
activation of mast cells and bowel dysfunction in these patients. Given that tryptase has
been shown to trigger redistribution of ZO-1 increasing paracelular permeability in
colonocytes36, it can be speculated that the clinical outcome of IBS-D may rely on
distinctive mast cell-related impairment of jejunal TJ biology. This mechanism may be
of critical importance in the control of inflammation in the intestine. However, additional
studies are needed in order to define its role in the pathophysiology of IBS-D.
Remarkably, regulation of intestinal permeability through PAR-2 is highlighted in
the main network of our study. Activation of PAR by endogenous or microbial-derived
proteases has been implicated in the modulation of gastrointestinal physiology,
including epithelial permeability, enteric neurotransmission, secretion, motility,
inflammation and visceral sensitivity37. Interestingly, fecal samples, colonic explants
and supernatants from IBS patients show higher proteolytic activity than healthy
controls16,32. Moreover, colonic supernatants from IBS activate human submucosal
neurons23, increase the paracelular permeability in mice16,32 and Caco-2 cells9 and
evoke visceral hyperalgesia and allodynia in mice, through PAR-2-mediated
mechanisms16. A good candidate to mediate these PAR-2-linked responses is the mast
cell tryptase, since it is increased in IBS16,21,23, and has been shown to enhance
paracelular permeability36,38 and to induce hyperalgesia23. Our study demonstrated
CAPÍTULO I - 69 -
increased jejunal tryptase expression in IBS-D, as previously shown in the colon16.
Notably, the positive correlation between tryptase and bowel dysfunction deserves
special attention in upcoming investigations.
Cell death, particularly by apoptosis, is also a relevant function highlighted in our
study. The jejunal mucosa of IBS-D showed several alterations in genes belonging to
the apoptotic pathway of leukocytes and MCs. Interestingly, we found that three key
intertwined anti-apoptotic molecules, SCF, FOXO3, and MCL1, were significantly
down-regulated in these patients. Of note, SCF is a central modulator of the biology of
human MCs in peripheral tissues acting via multiple mechanisms39, including the
induction of MCL140 and the prevention of growth factor withdrawal-mediated apoptosis
via the inactivation of FOXO341. Conversely, we also observed the differential over-
expression of several promoters of human MCs apoptosis in IBS-D, namely TRAIL,
and TRAIL-R142. Moreover, PTEN expression was decreased in IBS-D. PTEN
signaling is also involved in MCs homeostasis and function, acting at crucial steps on
phosphoinositide 3-kinase-mediated pathways43. Overall, our data support that IBS-D
pathophysiology is partially determined by the mucosal imbalance of factors controlling
survival, proliferation, and activation of human MCs. MCs deregulation may possibly
dampen the natural resolution of mucosal inflammation, hence acting as a critical
driving factor for persisting inflammation. Furthermore, based on the specific inverse
correlation observed between SCF expression and bowel dysfunction, it is tempting to
speculate that the above alterations may also relate to clinical manifestations of IBS-D,
though additional studies are needed to clarify this issue.
Interpreting the functional consequences in microarray screening is one of the
major goals of this exploratory technique. In order to achieve this, IBS-D gene profile
was further analyzed with the IPA software, which integrates all biological knowledge
extracted from the recent scientific literature. Our microarray gene analysis yielded a
- 70 - CAPÍTULO I
list of 286 differentially expressed genes in IBS-D. Other gene expression studies
performed in the colon yielded a list of 20 to 33 genes25,26, disparities that may respond
to heterogeneous IBS populations, to variations between gut segments (i.e. the
different antigenic load to which jejunal and colonic mucosa are exposed), and to the
larger size and deeper penetration of suction vs. endoscopic biopsies. Despite this
difference, we obtained consistent and discrete differences in gene expression (<2-fold
in 86.5% of the genes), similar to previous studies25,26. This apparently subtle change in
gene expression is indeed concordant with the low-grade inflammatory nature of IBS-
D19,22,44-46, only reflected in our study by the increase in MC counts.
Finally, the integrative multivariate analysis separates the H group and IBS-D
patients into two well-defined clusters according to both gene expression profiles and
clinical variables. It would be not surprising to note that patients and H volunteers are
clustered depending on the clinical variables, as IBS is currently diagnosed only by
clinical criteria, but the relevance of this study is that this clustering is supported by the
differential transcriptomic profile of both groups of participants.
We acknowledge that the relatively small size of participants and the reduced
number of samples examined for microarray profiling is a potential weakness of the
study. However, this limitation is well compensated by the highly homogeneous group
population studied and by the consistency of reported differences. Moreover, the
validation of the data by Q-RT-PCR and further assessment of alterations in TJ
signaling at both mRNA and protein level in a higher number of patients also reinforce
the reported results. Anyhow, some caution is advised when interpreting the
translational relevance of our results to the clinical practice, waiting for own and
independent reassessment in a larger population of patients.
In conclusion, this study adds a few glimpses of the complex network of
interactions regulating the inflammatory response in the intestine of IBS-D and allows
CAPÍTULO I - 71 -
us to generate some new intriguing hypothesis to be tested in future research in the
fields of mast cell biology and regulation of paracelular permeability. Although much
remains to be learned, the integration of computational and high-throughput genomic
resources may help to develop strategies aimed at providing disease biomarkers and
uncover additional targets for therapeutic intervention in those affected by IBS.
- 72 - CAPÍTULO I
6.5. REFERENCES
1. Faresjo A, Grodzinsky E, Johansson S, et al.
Psychosocial factors at work and in every day life are
associated with irritable bowel syndrome. Eur J
Epidemiol 2007;22:473-80.
2. Bennet EJ, Tennant CC, Piesse C, et al. Level
of chronic life stress predicts clinical outcome in
irritable bowel syndrome. Gut 1998;43:256-61.
3. Nicholl BI, Halder SL, Macfarlane GJ, et al.
Psychosocial risk markers for new onset irritable bowel
syndrome-results of a large prospective population-
based study. Pain 2008;137:147-55.
4. Spiller R, Garsed K. Postinfectious irritable
bowel syndrome. Gastroenterology 2009;136:1979-88.
5. Dunlop SP, Hebden J, Campbell E, et al.
Abnormal intestinal permeability in subgroups of
diarrhea-predominant irritable bowel syndromes. Am J
Gastroenterol 2006;101:1288-94.
6. Zhou Q, Zhang B, Verne GN. Intestinal
membrane permeability and hypersensitivity in the
irritable bowel syndrome. Pain 2009;146:41-6.
7. Spiller RC, Jenkins D, Thornley JP, et al.
Increased rectal mucosal enteroendocrine cells, T
lymphocytes, and increased gut permeability following
acute campylobacter enteritis and in post-dysenteric
irritable bowel syndrome. Gut 2000;47:804-11.
8. Marshall JK, Thabane M, Garg AX, et al.
Intestinal permeability in patients with irritable bowel
syndrome after a waterborne outbreak of acute
gastroenteritis in Walkerton, Ontario. Aliment
Pharmacol Ther 2004;20:1317-22.
9. Piche T, Barbara G, Aubert P, et al. Impaired
intestinal integrity in the colon of irritable bowel
syndrome patients: involvement of soluble mediators.
Gut 2009;58:196-201.
10. Coeffier M, Gloro R, Boukhettala N, et al.
Increased proteasome-mediated degradation of
occludin in irritable bowel syndrome. Am J
Gastroenterol 2010;105:1181-8.
11. Turner JR. Intestinal mucosal barrier function
in health and disease. Nat Rev Immunol 2009;9:799-
809.
12. Garrett WS, Gordon JI, Glimcher LH.
Homeostasis and inflammation in the intestine. Cell
2010;140:859-70.
13. Alonso C, Guilarte M, Vicario M, et al.
Maladaptive intestinal epithelial responses to life stress
may predispose healthy women to gut mucosal
inflammation. Gastroenterology 2008;135:163-72.
14. Soderholm JD, Yang PC, Ceponis P, et al.
Chronic stress induces mast cell dependent bacterial
adherence and initiates mucosal inflammation in rat
intestine. Gastroenterology 2002;123:1099-108.
15. Qiu BS, Vallance BA, Blennerhassett PA, et
al. The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility
of mice to stress-induced reactivation of experimental
colitis. Nat Med 1999;5:1178-82.
16. Cenac N, Andrews CN, Holzhausen M, et al.
Role for protease activity in visceral pain in irritable
bowel syndrome. J Clin Invest 2007;117:636-47.
17. Klooker TK, Braak B, Koopman KE, et al. The
mast cell stabiliser ketotifen decreases visceral
hypersensitivity and improves intestinal symptoms in
patients with irritable bowel syndrome. Gut
2010;59(9):1213-21.
18. Gwee KA, Collins SM, Read NW, et al.
Increased rectal mucosal expression of interleukin
1beta in recently acquired post-infectious irritable
bowel syndrome. Gut 2003;52:523-6.
19. Chadwick VS, Chen W, Shu D, et al.
Activation of the mucosal immune system in irritable
bowel syndrome. Gastroenterology 2002;122:1778-83.
20. Barbara G, Stanghellini V, De Giorgio R, et al.
Activated mast cells in proximity to colonic nerves
correlate with abdominal pain in irritable bowel
syndrome. Gastroenterology 2004;126:693-702.
21. Guilarte M, Santos J, de Torres I, et al.
Diarrhoea-predominant IBS patients show mast cell
CAPÍTULO I - 73 -
activation and hyperplasia in the jejunum. Gut
2007;56:203-9.
22. Ohman L, Simren M. Pathogenesis of IBS:
role of inflammation, immunity and neuroimmune
interactions. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2010;
7:163-73.
23. Barbara G, Wang B, Stanghellini V, et al.
Mast cell-dependent excitation of visceral-nociceptive
sensory neurons in irritable bowel syndrome.
Gastroenterology 2007;132:26-37.
24. Buhner S, Li Q, Vignali S, et al. Activation of
human enteric neurons by supernatants of colonic
biopsy specimens from patients with irritable bowel
syndrome. Gastroenterology 2009;137:1425-34.
25. Aerssens J, Camilleri M, Talloen W, et al.
Alterations in mucosal immunity identified in the colon
of patients with irritable bowel syndrome. Clin
Gastroenterol Hepato. 2008;6:194-205.
26. Macsharry J, O'Mahony L, Fanning A, et al.
Mucosal cytokine imbalance in irritable bowel
syndrome. Scand J Gastroenterol 2008;43:1467-76.
27. Talley NJ, Stanghellini V, Heading RC, et al.
Functional gastroduodenal disorders. Gut 1999;
45:1137-42.
28. Holmes TH, Rahe RH. The social
readjustment rating scale. J Psychosom Med. 1967;
11:213-8.
29. Lewis SJ, Heaton KW. Stool form scale as a
useful guide to intestinal transit time. Scand J
Gastroenterol 1997;32:920-4.
30. Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time
PCR data by the comparative CT method. Nat Protoc
2008;3:1101-08.
31. Guillemot L, Paschoud S, Pulimeno P, et al.
The cytoplasmic plaque of tight junctions: a scaffolding
and signalling center. Biochim Biophys Acta 2008;
1778(3):601-13.
32. Gecse K, Róka R, Ferrier L, et al. Increased
faecal serine protease activity in diarrhoeic IBS
patients: a colonic lumenal factor impairing colonic
permeability and sensitivity. Gut 2008;57:591-9.
33. Utech M, Mennigen R, Bruewer M.
Endocytosis and recycling of tight junction proteins in
inflammation. J Biomed Biotechnol 2010;2010:484987.
34. Hopkins AM, Walsh SV, Verkade P, et al.
Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1
influences tight junction structure and epithelial barrier
function. J Cell Sci 2003;116:725-42.
35. Marchiando AM, Shen L, Graham WV, et al.
Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required
for TNF-induced tight junction regulation in vivo. J Cell
Biol 2010 Apr 5;189:111-26.
36. Jacob C, Yang PC, Darmoul D, et al. Mast
cell tryptase controls paracellular permeability of the
intestine. Role of protease-activated receptor 2 and
beta-arrestins. J Biol Chem 2005;280:31936-48.
37. Vergnolle N. Clinical relevance of proteinase
activated receptors (PARs) in the gut. Gut 2005;
54:867-74.
38. Lee JW, Park JH, Park DI, et al. Subjects with
diarrhea-predominant IBS have increased rectal
permeability responsive to tryptase. Dig Dis Sci 2010;
55:2922-8.
39. Galli SJ, Grimbaldeston M, Tsai M.
Immunomodulatory mast cells: negative, as well as
positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol
2008;8:478-86.
40. Aichberger KJ, Mayerhofer M, Gleixner KV, et
al. Identification of MCL1 as a novel target in
neoplastic mast cells in systemic mastocytosis:
inhibition of mast cell survival by MCL1 antisense
oligonucleotides and synergism with PKC412. Blood
2007;109:3031-41.
41. Möller C, Alfredsson J, Engström M, et al.
Stem cell factor promotes mast cell survival via
inactivation of FOXO3a-mediated transcriptional
induction and MEK-regulated phosphorylation of the
proapoptotic protein Bim. Blood 2005;106:1330-6.
42. Berent-Maoz B, Piliponsky AM, Daigle I, et al.
Human mast cells undergo TRAIL-induced apoptosis.
J Immunol 2006;176:2272-8.
43. Kim MS, Radinger M, Gilfillan AM. The
multiple roles of phosphoinositide 3-kinase in mast cell
biology. Trends Immunol 2008;29:493-501.
- 74 - CAPÍTULO I
44. Cremon C, Gargano L, Morselli-Labate AM, et
al. Mucosal immune activation in irritable bowel
syndrome: gender-dependence and association with
digestive symptoms. Am J Gastroenterol 2009;
104:392-400.
45. Bercik P, Verdu EF, Collins SM. Is irritable
bowel syndrome a low-grade inflammatory bowel
disease? Gastroenterol Clin North Am 2005;34:235-
45.
46. Kirsch R, Riddell RH. Histopathological
alterations in irritable bowel syndrome. Mod Pathol
2006;19:1638-45.
CCAAPPÍÍTTUULLOO IIII
CAPÍTULO II - 77 -
CAPÍTULO II
7. TRANSCRIPTIONAL AND PROTEOMIC PROFILING OF THE INTESTINAL MUCOSA OF DIARRHEA-IBS PATIENTS REVEALS SIMILAR BIOLOGICAL PATHWAYS AS DIFFERENTIALLY ACTIVE COMPARED TO HEALTHY SUBJECTS
Authors: Cristina Martínez1, María Vicario1,3, Laura Ramos1, Beatriz Lobo1, Carmen
Alonso1, Ana M. González-Castro1, Marc Pigrau1, Mar Guilarte1,2, María Antolín1,
Fernando Azpiroz1,3, Javier Santos1,3.
1Digestive System Research Unit, Institut de Recerca Vall d’Hebron; Department of
1Gastroenterology, 2Allergy Section, Hospital Universitari Vall d’Hebron, Universitat
Autònoma de Barcelona, Barcelona, Spain. 3Centro de Investigación Biomédica en
Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (Ciberehd).
Grant Support: Supported in part by the Fondo de Investigación Sanitaria and
Ciberehd, Instituto Carlos III, Subdirección General de Investigación Sanitaria, Ministerio
de Ciencia e Innovación; and the International Foundation for Functional
Gastrointestinal Disorders (IFFGD). C. Alonso (CM04/00019), L Ramos (CM05/00055),
M. Vicario (CP10/00502), and J. Santos (PI05/1423; PI/080940; EC07/90148, 2008
IFFGD Research Grant Award) were the recipients of these grants.
- 78 - CAPÍTULO II
7.1. INTRODUCTION
Irritable bowel syndrome (IBS) is the most common functional disorder diagnosed
by gastroenterologists, affecting 10-25% of people worldwide1,2. Its heterogeneous
clinical manifestations, coupled with our incomplete understanding on their
etiopathogenesis, explains the current lack of effective therapeutic tools and the
progressive burden on healthcare systems1,2. Such limitations have promoted research
initiatives aimed at deciphering the mechanisms involved in IBS origin. As a
consequence, recent findings reveal that a prominent feature in the intestine of certain
IBS subgroups, the presence of mucosal inflammation and immune activation, may be
linked to IBS symptoms3,5, challenging the traditional assumption of its strict non-
organic nature.
A consistent approach to improve our current knowledge on the molecular
mechanisms underlying IBS pathogenesis is the comprehensive analysis of the real
endpoints of physiological regulatory processes, the proteins, and by extension gene
expression. Therefore, transcriptomics stands as an innovative tool in the field of
gastroenterology offering a valuable aid to identify disease and prognostic biomarkers
which could be implemented in the clinical strategies of stress-related digestive
disorders. In this sense, recent data from our laboratory showed differential changes in
the gene expression profile of the jejunal mucosa of IBS-D patients linked to increased
mucosal tryptase mRNA expression and alterations in the expression and distribution
of proteins belonging to the TJ signaling pathway6. Accordingly, recent reports have
shown that barrier dysfunction in the colonic mucosa of IBS is linked to the down-
regulation of the TJ scaffolding protein zonula occludens 1 (ZO-1)7 and to the
degradation of the TJ structural protein occludin (OCLN) by the proteasome8.
Proteomics approaches are widely used in biomarker research to discover
molecular signatures useful for disease diagnosis or prognosis9-11. Therefore, in the
CAPÍTULO II - 79 -
present study we have applied two-dimensional (2D) difference gel electrophoresis
(DIGE) analysis to identify proteins as potential candidate molecules involved in the
pathogenesis of IBS-D. As an extension of our previous investigation6, we now
describe the alterations in the proteomic profile and associated biological functions and
signaling pathways of the jejunal mucosa of IBS-D patients comparing the results
obtained with this approach to those previously obtained with microarray analysis.
7.2. METHODS
7.2.1. Participants
Newly diagnosed, diarrhea-predominant IBS (IBS-D) patients meeting the Rome II
criteria for IBS12 and healthy (H) volunteers were prospectively recruited from the
outpatient gastroenterology clinic and by public advertising, respectively. Prior to
inclusion, a complete medical history and physical examination were carried out in all
participants. Food allergy was ruled out using a battery of skin prick tests (Leti) for 32
common allergens with histamine and saline as positive and negative controls,
respectively. Other exclusion criteria included age <18 or >60 years, active smoking,
major psychiatric and organic diseases, previous history of acute gastroenteritis and
gastrointestinal co-morbidities, those having taken any drug or pharmaceutical
compound in the last 2 weeks, those having taken steroids, anti-allergic or
immunosuppressive and related drugs in the last 3 months, and those having received
radiotherapy or chemotherapy in the last 6 months. Written informed consent was
obtained from each participant and data was stored in an anonymous fashion
according to the approval from the ethics committee of the Institut de Recerca Hospital
Universitari Vall d´Hebron (PR(AG)76/2006).
7.2.2. Clinical assessment
The following parameters were recorded in all participants for the last 10 days prior
to the biopsy: a) the severity of abdominal pain by a 100-point visual analogue scale;
- 80 - CAPÍTULO II
b) the frequency of abdominal pain (number of days with pain); c) the stool frequency
(maximum number of bowel movements); d) the stool consistency by the Bristol
scale13.
7.2.3. Biological evaluation of participants
Jejunal biopsy
A single mucosal biopsy per participant was obtained from the proximal jejunum, 5-
10 cm distal to the Treitz’s angle, using a Watson’s capsule. Tissue samples were
obtained by suction with a 50 mL syringe and immediately split into two similar pieces
with a sterile scalpel. One fragment was fixed in formalin and embedded in paraffin for
further microscopic examination. The remaining fragment was placed in RNAse free
tubes containing 500 μL of RNA Later Solution (Ambion) and stored at -80ºC until
processed for RNA isolation or snap frozen in liquid nitrogen for protein isolation and
2D DIGE analysis, as follows.
RNA isolation and microarray analysis
Biopsies were homogenized in the FastPrep mixer (Bio101) in RLT cell lysis buffer
(Qiagen, Madrid, Spain) followed by RNA isolation (RNeasy Mini Kit, Qiagen) and on-
column DNAse treatment (Qiagen). Prior to gene array analysis, RNA quantity and
quality were confirmed by capillary electrophoresis (Agilent 2100 Bioanalyzer; Agilent
Technologies, Palo Alto, CA, USA).
Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133 Plus 2.0 arrays were used for
expression profiling. Labeling, hybridization and washing were performed according to
manufacturer’s instructions. Data was analyzed using R packages (http://www.r-
project.org) and submitted to Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software 7.0 as
described in Chapter 1 (page 52 and 149).
CAPÍTULO II - 81 -
Protein isolation and DIGE analysis
Samples were homogenized in the FastPrep mixer (Bio101) in T-PER buffer and
protease and phosphatase inhibitor cocktail (Invitrogen), following manufacturer
recommendations. Insoluble material was removed by centrifugation (350 g, 5 min,
4°C) and the supernatant was sonicated four times for 10 seconds at 4°C.
Isolated protein samples were then subjected to a modified acetone-trichloroacetic
acid precipitation (2D-CleanUp kit; GE Healthcare). The protein pellets were
resuspended in the DIGE labeling buffer {8 M urea, 4% [wt/vol] 3-[(3-cholamidopropyl)-
dimethylammonio]-1-propanesulfonate [CHAPS], 30 mM Tris [pH 8.0]}, and the protein
concentration was determined using the Bio-Rad RCDC protein assay as described by
the manufacturer (Bio-Rad, United Kingdom). The protein concentration in the samples
was then adjusted to 2 mg/mL by addition of DIGE labeling buffer. Fifty micrograms of
each sample was labeled with either Cy3 or Cy5 cyanine dye (GE Healthcare),
following general procedures.
Two-dimension electrophoresis was performed using GE Healthcare reagents and
equipment. First-dimension isoelectric focusing was performed on immobilized pH
gradient strips (24 cm; pH 3 to 10 or 4 to 7) using an Ettan IPGphor system. Samples
were applied via cup loading near the basic ends of the strips, which were previously
rehydrated overnight in 450 μL of rehydration buffer (8 M urea, 4% [wt/]vol CHAPS,
1% Pharmalytes [pH 3 to 10], 100 mM DeStreak). After focusing for a total of 67 kV-h,
the strips were equilibrated first for 15 min in 6 ml of reducing solution (6 M urea, 100
mM Tris-HCl [pH 8], 30% [vol/vol] glycerol, 2% [wt/vol] SDS, 5 mg/mL DTT) and then
for a further 15 min in 6 mL of alkylating solution (6 M urea, 100mM Tris-HCl [pH 8],
30% [vol/vol] glycerol, 2% [wt/vol] SDS, 22.5 mg/mL iodoacetamide) on a rocking
platform. Second-dimension SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was run by
overlaying the strips on 12.5% isocratic Laemmli gels (24 by 20 cm), cast in low-
- 82 - CAPÍTULO II
fluorescence glass plates, on an Ettan DALT VI system. Gels were run at 20°C and at
a constant power of 2.5 W per gel for 30 min, followed by 17 W per gel until the
bromophenol blue tracking front had run off the bottoms of the gels (about 5 h).
Fluorescence images of the gels were acquired on a Typhoon 9400 scanner (GE
Healthcare). Cy3 and Cy5 images were scanned at 532 nm excitation/580 nm
emission and 633 nm excitation/670 nm emission, respectively, at a 100-μm
resolution. Image analysis and determination of significant alterations in protein
abundances were performed automatically with the DeCyder V. 5.0 software (GE
Healthcare).
Protein identification and data analysis
Protein spots of interest were excised from the gel by using an automated Spot
Picker (GE Healthcare). In-gel trypsin digestion was performed essentially as
previously described14, using autolysis-stabilized trypsin (Promega, Madison, WI).
Tryptic digests were purified using ZipTip microtiter plates (Millipore, Carrigtwohill,
Ireland).
Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometric analysis of tryptic
peptides was performed on an Ultraflex time-of-flight/time-of-flight (TOF-TOF)
instrument (Bruker, Germany). Samples were prepared using α-cyano-4-hydroxy-
cinnamic acid as a matrix on anchor chip targets (Bruker, Germany). Identification of
the proteins was carried out by peptide mass fingerprint data and/or by TOF-TOF
PSD. Database searches were performed using the Mascot algorithm (Matrix
Science). Identified proteins where then submitted to Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
Software 7.0 as previously described6.
CAPÍTULO II - 83 -
7.2.4. Statistical analysis
Two-tailed parametric or nonparametric tests were used when appropriate
(unpaired Student’s t-test, Mann-Whitney U test) using GraphPad Prism 5.0 software.
Data are expressed as mean ± standard deviation (SD), unless otherwise stated; P-
values of 0.05 or lower were considered significant.
7.3. RESULTS
7.3.1. Study population
Five H volunteers and 8 IBS-D patients were included in the study. Groups were
similar in age (table 1). All patients reported daily watery or mushy stools that varied in
number (3 to 9/day) associated with abdominal pain or discomfort that was relieved
with defecation. Moreover, H volunteers had low stress levels while IBS-D patients
showed higher, yet moderate, stress levels in the last year (table 1).
Table 1. Clinical and demographic characteristics of participants.
Note: IBS-D, diarrhea-predominant irritable bowel syndrome; H, healthy; F, female; M, male; NA, non-applicable.
Stool consistency: 1 (hard) to 7 (entirely liquid).
Holmes-Rahe scale: 0-150, low stress; 151-300, moderate stress; >300 severe stress.
Groups were compared using the non parametric Mann Whitney U-test and P-values are indicated.
- 84 - CAPÍTULO II
7.3.2. The jejunum of IBS-D shows a distinctive transcriptomic profile
We previously reported that the jejunal mucosa of IBS-D patients display a
distinctive gene expression profile compared to H and that this profile reflects
alterations in canonical pathways and biological networks associated with mast cell
function, intestinal permeability and tight junction (TJ) signaling6.
As a second approach to unravel the molecular underpinnings of IBS pathogenesis,
we applied DIGE analysis to identify differentially expressed proteins in IBS-D patients.
Analysis of proteomic data revealed approximately 1,200 protein spots. By selecting an
abundance ratio of 1.3-fold as the threshold for the study, at least 139 spots were
differentially produced (P < 0.05) between the two groups studied. From those, we
were able to identify 95 proteins (figure 1; supplementary table 1).
IPA analysis revealed a number of new canonical signaling pathways key for
intestinal homeostasis as playing an important role in IBS-D. Interestingly, LPS/IL1
mediated alterations of nuclear RXR receptors, mitochondrial dysfunction and
regulation of actin-based motility by rho, appeared as the most significant in IBS-D
(table 2).
Interestingly, among the proteins identified, we found several subunits of those
involved in the degradation of proteins through the proteasome pathway as significantly
down-regulated (table 3).
CAPÍTULO II - 85 -
Table 2. Canonical signaling pathways most significantly associated with IBS-D protein expression profile.
* Ratio: number of genes in the analysis that are associated with the canonical pathway divided by the total
number of genes that map to the canonical pathway.
Table 3. Proteins belonging to the proteasome pathway are differentially expressed in the jejunal mucosa
of IBS-D patients. Uniprot accession number of proteins and their fold change expression in IBS-D with respect to H
are shown.
- 86 - CAPÍTULO II
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CAPÍTULO II - 87 -
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- 88 - CAPÍTULO II
7.3.3. Gene and protein expression profiles in the jejunal mucosa of IBS-D are
associated with similar canonical pathways, biological functions and disease
mechanisms
While there was no apparent concordance between the exact genes and proteins
identified as differentially expressed in IBS-D patients, IPA comparative analysis of
gene and protein expression data revealed that the same canonical pathways,
biological functions and disease/disease mechanisms were associated with both
expression profiles (figure 2).
Interestingly, both microarray and proteomic approaches identified cellular
assembly and cell-to-cell signaling as two of the most significant biological functions
associated with IBS-D. Moreover, immunological, gastrointestinal and inflammatory
diseases were among the most relevant disease mechanism associated with both IBS-
D transcriptional profiles.
7.4. DISCUSSION
In the present study, we demonstrate that the jejunum of IBS-D patients has a
distinctive proteomic profile compared to H, extending our previous reports by showing
that gene and protein alterations are associated to the same signaling pathways. The
classification of the RNA and protein transcripts in the same canonical pathways
demonstrates that many different biological processes are identified by both
approaches as differentially active in the jejunal mucosa of IBS-D patients. This
underlines the difficulty in unraveling the cellular networks involved in the pathogenesis
of this complex and multifactorial disease.
Increased intestinal permeability has been described by several clinical studies as
a key feature of IBS15-18, being more pronounced in IBS-D patients than in other
subgroups of IBS15. In the present study, we identified bile acid metabolism as one of
CAPÍTULO II - 89 -
the most relevant pathways associated with the IBS-D proteomic profile. Bile acids can
stimulate secretion in the colon and in many animal studies chenodeoxycholic acid
(CDCA) and deoxycholic acid (DCA) in concentrations between 1 and 8 mmol/L have
produced a dose-related increase in paracellular mucosal permeability and also
damaged the mucosa, as verified by light and electron microscopy19. Moreover, it has
been demonstrated that bile acids can modulate tight junction structures and barrier
function in Caco-2 monolayers by activating the epithelial growth factor receptor20 or
generating reactive oxygen species21. Increased colonic exposure to bile acids as a
consequence of bile acid malabsorption has been associated with IBS-D22, however,
the potential relationship of increased bile acid exposure and increased intestinal
permeability has not been addressed. Interestingly, time-course studies in hepatic
epithelial cells demonstrated that mitochondrial injury preceded impairments in Na+-
dependent glucose transport and TJ permeability in response to bile acids
exposure23. Moreover, exposure to bile acids exacerbates mucosal barrier dysfunction
in colonic biopsies of patients with collagenous colitis in remission allowing a
substantially increased bacterial uptake, which may contribute to recurrence of
inflammation24. In line with this observation, we identified LPS-mediated inhibition of
RXR function as the most significant pathway associated with the proteomic profile of
IBS-D patients. The RXR pathway, acting synergistically with PPARγ, negatively
regulates intestinal inflammation through inactivation of NFκB and MAPK pathways25 In
view of these findings, we may speculate that bile acids may influence epithelial barrier
function in IBS-D allowing access of bacterial antigens to the intestinal mucosa which
may lead to the inactivation of RXR function and, therefore, contributing to chronic
inflammation.
Another remarkable finding of the present study is that several proteins involved in
the proteasome pathway are differentially expressed in the jejunal mucosa of IBS-D
- 90 - CAPÍTULO II
patients, as proteasome-mediated protein degradation contribute to the regulation of
several cellular pathways related to cell proliferation, apoptosis, inflammatory response
and antigen presentation26. Moreover, it has been shown that proteasomes can
strongly influence the production of pro-inflammatory cytokines through the
regulation of the NFκB pathway27,28, and several studies have shown that
administration of proteasome inhibitors can suppress systemic cytokine storm in
sepsis and related inflammatory conditions29,30. Interestingly, recent data have
suggested that proteasome could have an important function during experimental
intestinal inflammation21-33, as well as in inflammatory bowel diseases32,34,35. Mucosal
intestinal proteins have a high turnover rate, ~50% per day, in humans36,37. Thus,
proteasome-mediated proteolysis, which degrades proteins in a specific manner, may
have important functions in intestinal cell metabolism. In this sense, it has been
recently suggested that proteasome alterations may contribute to the pathophysiology
of IBS by increasing occludin degradation in the colonic mucosa of IBS patients8. Our
results reinforce this hypothesis by showing an impaired expression of ubiquitin-
proteasome related proteins in IBS-D samples, although further studies will be needed
to further identify the implications for epithelial barrier dysfunction and intestinal
inflammation in these patients.
These observations, together with our recent findings on altered TJ signaling6,
support the assessment of intestinal barrier dysfunction in future studies. The
application of powerful platforms like proteomics can help to unravel the underlying
molecular mechanisms, and contribute to the diagnosis, prevention, and monitoring of
IBS.
CAPÍTULO II - 91 -
7.5. REFERENCES
1. American College of Gastroenterology IBS
Task Force. An evidence based position statement on
the management of irritable bowel syndrome. Am J
Gastroenterol 2009;104:S1-S35.
2. Williams JG, Roberts SE, Ali MF, et al.
Gastroenterology services in the UK. The burden of
disease, and the organisation and delivery of services
for gastrointestinal and liver disorders: a review of the
evidence. Gut 2007;56(Suppl 1):1-113.
3. Chadwick VS, Chen W, Shu D, et al. Activation
of the mucosal immune system in irritable bowel
syndrome. Gastroenterology 2002;122:1778-83.
4. Cremon C, Gargano L, Morselli-Labate AM, et
al. Mucosal immune activation in irritable bowel
syndrome: gender-dependence and association with
digestive symptoms. Am J Gastroenterol 2009;
104:392-400.
5. Guilarte M, Santos J, de Torres I, et al.
Diarrhoea-predominant IBS patients show mast cell
activation and hyperplasia in the jejunum. Gut
2007;56:203-9.
6. Martinez C, Vicario M, Ramos L, et al. The
jejunum of diarrhea-predominant irritable bowel
syndrome shows molecular alterations in the tight
junction signaling pathway that are associated with
mucosal pathobiology and clinical manifestations. Am
J Gastroenterol 2011; under review.
7. Piche T, Barbara G, Aubert P, et al. Impaired
intestinal integrity in the colon of irritable bowel
syndrome patients: involvement of soluble mediators.
Gut 2009;58:196-201.
8. Coeffier M, Gloro R, Boukhettala N, et al.
Increased proteasome-mediated degradation of
occludin in irritable bowel syndrome. Am J
Gastroenterol 2010;105:1181-8.
9. Draisma G, Etzioni R, Tsodikov A, et al. Lead
time and overdiagnosis in prostate-specific antigen
screening: importance of methods and context. J Natl
Cancer Inst 2009;101:374-83.
10. Ross JS, Hatzis C, Symmans WF, et al.
Commercialized multigene predictors of clinical
outcome for breast cancer. Oncologist 2008;13:477-
93.
11. Solassol J, Boulle N, Maudelonde T, et al.
Clinical proteomics: towards early detection of
cancers. Med Sci (Paris) 2005;21:722-9.
12. Talley NJ, Stanghellini V, Heading RC, et al.
Functional gastroduodenal disorders. Gut 1999;
45:1137-42.
13. Lewis SJ, Heaton KW. Stool form scale as a
useful guide to intestinal transit time. Scand J
Gastroenterol 1997;32:920-4.
14. Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, et al. Mass
spectrometric sequencing of proteins on silver-stained
polyacrylamide gels. Anal Chem 1996;68:850-8.
15. Dunlop SP, Hebden J, Campbell E, et al.
Abnormal intestinal permeability in subgroups of
diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Am J
Gastroenterol 2006;101:1288-94.
16. Zhou Q, Zhang B, Verne GN. Intestinal
membrane permeability and hypersensitivity in the
irritable bowel syndrome. Pain 2009;146:41-6.
17. Spiller RC, Jenkins D, Thornley JP, et al.
Increased rectal mucosal enteroendocrine cells, T
lymphocytes, and increased gut permeability following
acute campylobacter enteritis and in post-dysenteric
irritable bowel syndrome. Gut 2000;47:804-11.
18. Marshall JK, Thabane M, Garg AX, et al.
Intestinal permeability in patients with irritable bowel
syndrome after a waterborne outbreak of acute
gastroenteritis in Walkerton, Ontario. Aliment
Pharmacol Ther 2004;20:1317-22.
19. Chadwick VS, Gainella TS, Carlson GL, et al.
Effects of molecular structure on bile acid-induced
alterations in absorptive function, permeability and
morphology in the perfused rabbit colon. J Lab Clin
Med 1979;94:661-74.
20. Raimondi FR, Santoro P, Barone MV, et al.
Bile acids modulate tight junction structure and barrier
function of Caco-2 monolayer via EGFR activation. Am
J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008;294:906-13.
- 92 - CAPÍTULO II
21. Araki Y, Katoh T, Ogawa A, et al. Bile acids
modulate transepithelial permeability via the
generation of reactive oxygen species in the Caco-2
cell line. Free Radic Biol Med 2005;39:769-80.
22. Wedlake L, A’Hern R, Russell D, et al.
Systematic review: the prevalence of idiopathic bile
acid malabsorption as diagnosed by SeHCAT
scanning in patients with diarrhoea-predominant
irritable bowel syndrome. Aliment Pharmacol Ther
2009;30:707-17.
23. Santa Cruz V, Dugas TR, Kanz MF.
Mitochondrial dysfunction occurs before transport or
tight junction deficits in biliary epithelial cells exposed
to bile from methylenedianiline-treated rats. Toxicol Sci
2005;84:129-38.
24. Münch A, Söderholm JD, Ost A, et al. Low
levels of bile acids increase bacterial uptake in colonic
biopsies from patients with collagenous colitis in
remission. Aliment Pharmacol Ther 2011;33:954-60.
25. Desreumaux P, Dubuquoy L, Nutten S, et al.
Attenuation of colon inflammation through activators of
the retinoid X receptor (RXR) / peroxisome proliferator-
activated receptor gamma (PPARgamma)
heterodimer. A basis for new therapeutic strategies. J
Exp Med 2001;193:827-38.
26. Glickman MH, Ciechanover A. The ubiquitin-
proteasome proteolytic pathway: destruction for the
sake of construction. Physiol Rev 2002;82:373-428.
27. Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, et al.
The ubiquitin-proteasome pathway is required for
processing the NF-kappa B1 precursor protein and the
activation of NF-kappa B. Cell 1994;78:773-85.
28. Yamamoto Y, and Gaynor RB. Therapeutic
potential of inhibition of the NF-kappaB pathway in the
treatment of inflammation and cancer. J Clin Invest
2001;107:135-42.
29. Palombella VJ, Conner EM, Fuseler JW, et al.
Role of the proteasome and NF-kappaB in
streptococcal cell wall-induced polyarthritis. Proc Natl
Acad Sci USA 1998;95:15671-6.
30. Leblond J, Hubert-Buron A, Bole-Feysot C, et
al. Regulation of proteolysis by cytokines in the human
intestinal epithelial cell line HCT-8: role of IFNgamma.
Biochimie 2006;88:759-65.
31. Visekruna A, Joeris T, Seidel D, et al.
Proteasome-mediated degradation of IkappaBalpha
and processing of p105 in Crohn disease and
ulcerative colitis. J Clin Invest 2006;116:3195-203.
32. Fitzpatrick LR, Khare V, Small JS, et al.
Dextran sulfate sodium-induced colitis is associated
with enhanced low molecular mass polypeptide 2
(LMP2) expression and is attenuated in LMP2
knockout mice. Dig Dis Sci 2006;51:1269-76.
33. Visekruna A, Joeris T, Schmidt N, et al.
Comparative expression analysis and characterization
of 20S proteasomes in human intestinal tissues: the
proteasome pattern as diagnostic tool for IBD patients.
Inflamm Bowel Dis 2009;15:526-33.
34. Fitzpatrick LR, Small JS, Poritz LS, et al.
Enhanced intestinal expression of the proteasome
subunit low molecular mass polypeptide 2 in patients
with inflammatory bowel disease. Dis Colon Rectum
2007;50:337-50.
35. Weerasooriya V, Rennie MJ, Anant S, et al.
Dietary fiber decreases colonic epithelial cell
proliferation and protein synthetic rates in human
subjects. Am J Physiol Endocrinol Metab 2006;
290:E1104-8.
36. Coeffier M, Claeyssens S, Lecleire S, et al.
Combined enteral infusion of glutamine,
carbohydrates, and antioxidants modulates gut protein
metabolism in humans. Am J Clin Nutr 2008;88:1284-
90.
37. Nakshabendi IM, Downie S, Russell RI, et al.
Increased rates of duodenal mucosal protein synthesis
in vivo in patients with untreated celiac disease. Gut
1996;39:176-9.
CCAAPPÍÍTTUULLOO IIIIII
CAPÍTULO III - 95 -
CAPÍTULO III
8. ALTERED JEJUNAL TIGHT JUNCTION SIGNALING CORRELATES WITH MUCOSAL MAST CELL ACTIVATION AND SYMPTOM SEVERITY IN DIARRHEA-PRONE IRRITABLE BOWEL SYNDROME PATIENTS.
Authors: Cristina Martínez1, María Vicario1,5, Beatriz Lobo1, Guilá M1, Laura
Ramos1, Carmen Alonso1, Jose Luis Mosquera2, Alex Sánchez2,6, Ana M. González-
Castro1, Marc Pigrau1, Mar Guilarte1,3, María Antolín1, Inés de Torres4, Esteban
Saperas1, Fernando Azpiroz1,5, Javier Santos1,5.
1Digestive System Research Unit and 2Statistics and Bioinformatics Unit, Institut de
Recerca Vall d’Hebron; Departments of 1Gastroenterology, 3Allergy, and 4Pathology,
Hospital Universitari Vall d’Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona,
Spain. 5Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y
Digestivas (Ciberehd). 6Statistics Department, Faculty of Biology, University of
Barcelona, Barcelona, Spain.
Grant Support: Supported in part by the Fondo de Investigación Sanitaria and
Ciberehd, Instituto Carlos III, Subdirección General de Investigación Sanitaria, Ministerio
de Ciencia e Innovación; and the International Foundation for Functional
Gastrointestinal Disorders (IFFGD). A. Sánchez (MTM2008-00642), C. Alonso
(CM04/00019), L. Ramos (CM05/00055), M. Vicario (CP10/00502), and J. Santos
(PI05/1423; PI/080940; EC07/90148, 2008 IFFGD Research Grant Award) were the
recipients of these grants.
- 96 - CAPÍTULO III
8.1. INTRODUCTION
The molecular and functional integrity of the intestinal epithelial barrier is pivotal to
preserve energy supply and to restrict the internal contact with luminal content. Barrier
dysfunction might allow the passage of bacterial antigens through the mucosal layer of
the gut leading to activation of mucosal immune responses1,2 and contributing,
therefore, to IBS manifestations3. Interestingly, increased intestinal permeability has
been described by several clinical studies as a key feature of IBS4-7, being more
pronounced in IBS-D patients than in other subgroups of IBS3. A plausible contributor
to this phenomenon is the low-grade inflammation that has been identified as a
frequent, yet not universal8,9, pathological hallmark in the intestinal mucosa of some
IBS patients10,11. In these patients, the inflammatory infiltrate is dominated by increased
populations of mast cells (MCs)12-14 which have been largely implicated in the
regulation of stress and infectious related intestinal barrier dysfunction and in the
generation of gastrointestinal motor abnormalities and visceral pain8,15,16. Upon
activation, MCs release a wide range of neurotransmitters and other inflammatory
mediators. Among all these mediators, tryptase seems particularly relevant as it can
activate protease-activated receptor 2 (PAR-2) on epithelial cells, resulting in
modulation of tight junction (TJ) proteins and increases in permeability through
paracellular pathways in the intestinal epithelium17. Noteworthy, increased tryptase
mucosal expression18,19 and release to the intestinal lumen13 has been recently
described in IBS patients. In line with all these observations, recent data from our
laboratory showed differential changes in the transcriptomic profile of the jejunal
mucosa of IBS-D patients linked to increased mucosal tryptase mRNA expression and
alterations in the expression and distribution of proteins belonging to the TJ signaling
pathway19. Accordingly, recent reports have shown that barrier dysfunction in the
colonic mucosa of IBS is linked to the down-regulation of the TJ scaffolding protein
CAPÍTULO III - 97 -
zonula occludens 1 (ZO-1)20 and to the degradation of the TJ structural protein occludin
(OCLN) by the proteasome21.
The barrier function in epithelial cells is regulated by the apical intercellular
junctional complex in which TJ are the major constituents22. TJ act as both a gate that
prevents the paracellular transport of ions and solutes; and a fence that separates the
plasma membrane into the apical and basolateral domains23. The TJ transmembrane
proteins, claudins (CLDN) and occludin, are structurally associated to the cytoskeleton,
composed of actin, myosin II and other proteins, through the scaffolding proteins ZO.
This association to the perijunctional actomyosin ring, which encircles the cell at the
apical surface, is crucial for the dynamic regulation of paracellular permeability2.
In this study, we aimed (i) to evaluate the expression of structural TJ proteins and
the mechanisms of TJ disassembly through modulation of cytoskeleton proteins in the
jejunal mucosa of IBS-D patients, (ii) to assess the relationship of TJ alterations to
MCs numbers and activation, and (iii) to investigate the clinical impact of TJ alterations
in these patients.
8.2. METHODS
8.2.1. Participants
Newly diagnosed, diarrhea-predominant IBS (IBS-D) patients meeting the Rome II
criteria for IBS24 and healthy volunteers (H) were prospectively recruited from the
outpatient gastroenterology clinic and by public advertising, respectively. Prior to
inclusion, a complete medical history and physical examination were carried out in all
participants. Food allergy was ruled out using a battery of skin prick tests (Leti) for 32
common allergens with histamine and saline as positive and negative controls,
respectively. Other exclusion criteria included age <18 or >60 years, active smoking,
major psychiatric and organic diseases, previous history of acute gastroenteritis and
gastrointestinal co-morbidities, those having taken any drug, pharmaceutical
- 98 - CAPÍTULO III
compound, or herb in the last 2 weeks, those having taken steroids, anti-allergic or
immunosuppressive and related drugs in the last 3 months, and those having received
radiotherapy or chemotherapy in the last 6 months. Written informed consent was
obtained from each participant and data was stored in an anonymous fashion
according to the approval from the ethics committee of the Institut de Recerca Hospital
Universitari Vall d´Hebron (PR(AG)76/2006).
8.2.2. Clinical assessment
The following parameters were recorded in all participants for the last 10 days prior
to the biopsy: a) the severity of abdominal pain by a 100-point visual analogue scale;
b) the frequency of abdominal pain (number of days with pain); c) the stool frequency
(maximum number of bowel movements); d) the stool consistency by the Bristol
scale25.
8.2.3. Biological evaluation of participants
Jejunal biopsy and fluid content aspirate
A single mucosal biopsy per participant was obtained from the proximal jejunum, 5-
10 cm distal to the Treitz’s angle, using a Watson’s capsule with an attached 3 mm
diameter aspiration tube. Jejunal fluid (5 mL) was obtained by gentle aspiration with a
10 mL syringe, snap frozen and stored at -80º C until analyzed. Then, tissue samples
were obtained by suction with a 50 mL syringe and immediately split into two similar
pieces with a sterile scalpel. One fragment was fixed in formalin and embedded in
paraffin for further microscopic examination. The remaining fragment was placed in
RNAse free tubes containing 500 μL of RNA Later Solution (Ambion) and stored at
-80ºC until processed for RNA isolation, snap frozen in liquid nitrogen for protein
isolation or processed for ultrastructure assessment of TJ by transmission electron
microscopy, as follows.
CAPÍTULO III - 99 -
Histology and Immunohistochemistry
Tissue sections were processed for routine hematoxylin & eosin following general
procedures to assess epithelial morphology and eosinophilic infiltration. In addition, the
number of MCs and IELs was determined at x 400 magnification using anti-human c-
kit (CD117) (Dako), as previously described13,19. Specimens were blindly examined by
one experienced pathologist.
Immunofluorescence.
Tissue sections were deparaffinated and hydrated following general procedures,
and blocked with Dako Blocking Solution (Dako) for 10 minutes followed by 60 minutes
room temperature incubation in primary antibodies (Supplementary Table 1).
Secondary antibodies were Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG and 488 goat anti-
mouse IgG (Molecular Probes). Nuclei were counterstained with 4',6-diamidino-2-
phenylindole (DAPI) before mounting in Prolong antifade reagent (Molecular Probes).
Negative control slides were set by exposing the serial sections under similar
conditions but without the primary antibody. Images were acquired with a laser
scanning confocal microscope (FV-10) and quantification of TJ protein expression was
performed in a blinded manner measuring the average of fluorescence intensity in 10
non-overlapping fields per subject using the FV-10-ASW Olympus software.
Microarray analysis
Biopsies were homogenized in the FastPrep mixer (Bio101) in RLT cell lysis buffer
(Qiagen, Madrid, Spain) followed by RNA isolation (RNeasy Mini Kit, Qiagen) and on-
column DNAse treatment (Qiagen). Prior to gene array analysis, RNA quantity and
quality were confirmed by capillary electrophoresis (Agilent 2100 Bioanalyzer; Agilent
Technologies, Palo Alto, CA, USA).
Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133 Plus 2.0 arrays were used for
expression profiling. Labeling, hybridization and washing were performed according to
- 100 - CAPÍTULO III
manufacturer’s instructions. Data was analyzed using R packages (http://www.r-
project.org) and submitted to Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software 7.0 as
described in Chapter 1 (page 52 and 149).
Quantitative Real-Time PCR (Q-RT-PCR)
cDNA synthesis was performed using 1 μg of total RNA with the High Capacity
Reverse Transcription Reagents Kit (Applied Biosystems). Q-RT-PCR was performed
on an ABI PRISM® 7500 FAST Sequence Detection System (Applied Biosystems)
using validated TaqMan Gene Expression Assays (GEA), and the human 18S subunit
ribosomal RNA gene as an endogenous control (Supplementary Table 2) (Applied
Biosystems), as previously described19.
Protein isolation and western blotting
Samples were homogenized in the FastPrep mixer (Bio101) in T-PER buffer and
protease and phosphatase inhibitor cocktail (Invitrogen), following manufacturer
recommendations. Insoluble material was removed by centrifugation (350 g, 5 min,
4°C) and the supernatant was sonicated four times for 10 seconds at 4°C. Protein
concentrations were determined by Pierce bicinchoninic acid assay (Pierce). Equal
amounts of protein were separated by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gel electrophoresis) and transferred to a poly(vinylidene difluoride)
membrane. Primary antibodies and dilutions used are listed in supplementary table 1.
Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG or goat anti-mouse IgG (Pierce) and the
chemiluminescence detection system SuperSignal West Femto (Thermo Scientific)
were used to detect bound antibodies. All blots were probed with mouse anti-human β-
actin (Sigma-Aldrich) as a protein loading control. Densitometric comparison was
carried out on the same immunoblot using the ImageJ software (National Institutes of
Health; http://rsb.info.nih.gov/ij/).
CAPÍTULO III - 101 -
Transmission electron microscopy (TEM)
Samples were fixed with 2.5% (v/v) glutaraldehyde and 2% (v/v) paraformaldehyde
(EM grade, TAAB) in 100 mM phosphate buffer (PB, pH 7.4) for 2 h and rinsed with
100 mM PB. Tissues were then post-fixed in 1% (w/v) osmium tetroxide (TAAB)
containing 0.8% (w/v) of potassium hexacyanoferrate (III) (Sigma) 2 h and washed
with 100 mM PB. Samples were dehydrated through a graded acetone series,
infiltrated in Epon’s resin and polymerized for 48h at 60ºC. Ultra thin sections were
mounted in copper grids, contrasted with standard uranyle acetate and lead citrate
double-staining, and observed in a transmission electron microscope Hitachi H-7000 at
75Kv equipped with a camera MegaView III (Soft Imaging System). To evaluate
changes in TJ ultrastructure only well-oriented sections with longitudinally sectioned
microvilli were examined in each sample. Examinations were performed in a blinded
manner on a minimum of 50 junctions per sample in non-overlapping fields. The
architecture of the apical junctional complex was considered altered when the
maximum length of the intercellular dilatation measured was bigger than 20 nm26,27.
Other features observed were aberrant microvilli structure28 and increased
perijunctional cytoskeleton condensation29.
8.2.5 Statistical analysis
Two-tailed parametric or nonparametric tests were used when appropriate
(unpaired Student’s t-test, Mann-Whitney U test) using GraphPad Prism 5.0 software.
Relationships between clinical variables and gene or protein expression were
assessed by Spearman’s rho correlation. Data are expressed as mean ± standard
deviation (SD), unless otherwise stated; P-values of < 0.05 were considered
significant.
- 102 - CAPÍTULO III
8.3. RESULTS
8.3.1. The jejunum of IBS-D shows hyperplasia of activated mucosal MCs
Twenty-seven healthy volunteers (H) and forty-five diarrhea-IBS (IBS-D) patients
were included in the study (table 1). Confirming our previous findings13,19, IBS-D
patients showed a marked increased in MCs (CD117+) counts and tryptase mRNA
over-expression (figure 1a). Western blot analysis confirmed this increase in tryptase in
the jejunal mucosa (figure 1a). Noteworthy, tryptase expression positively correlated
with the number of bowel movements and stool consistency (table 2).
Table 1. Clinical and demographic characteristics of participants.
Note: IBS-D, diarrhea-predominant irritable bowel syndrome; H, healthy; F, female; M, male; NA, non-applicable.
Stool consistency: 1 (hard) to 7 (entirely liquid).
Other exclusion criteria: active smoking, major psychiatric and organic diseases, those having taken any drug,
pharmaceutical compound, or herb in the last 2 weeks, those having taken steroids, anti-allergic or immunosuppressive
and related drugs in the last 3 months, and those having received radiotherapy or chemotherapy in the last 6 months.
CAPÍTULO III - 103 -
Figure 1. Assessment of MC numbers and activation in the jejunal mucosa of IBS-D patients.
a. Mast cell counts. Mast cells were counted in 8 contiguous, non-overlapping, histological fields, at 400x, and
expressed as CD117+ cells per high power field (hpf) after immunohistochemistry for CD117. IBS-D patients (n=45)
showed a significant increase of mast cell numbers compared to H (n=27). Groups were compared using the parametric
unpaired t-test and P-values are indicated. b. Tryptase gene expression. Tryptase mRNA expression was measured
by Q-RT-PCR in 12 H volunteers and 17 IBS-D patients. To obtain the fold-change value for each sample the
tryptase/18S mRNA ratio was calculated for each sample and then normalized to the average of the H group. Groups
were compared using the parametric unpaired t-test and P-values are indicated. c. Tryptase protein expression.
Tryptase protein expression was measured by western-blot in 7 H and 7 IBS-D patients. To obtain the fold-change value
for each sample the tryptase/β-actin ratio was calculated for each sample and then normalized to the average of the H
group. Groups were compared using the parametric unpaired t-test and P-values are indicated.
Table 2. Correlation between MC-related variables and clinical symptoms in the jejunal mucosa of IBS-D
patients (n=7-45) and H volunteers (n=7-27).
Note: For correlations of abdominal pain intensity, only IBS-D participants were evaluated, as H subjects
experiencing abdominal pain would not meet inclusion criteria.
- 104 - CAPÍTULO III
8.3.2. Altered expression and distribution of structural TJ proteins correlates
with bowel dysfunction in IBS-D patients
IPA analysis revealed that several genes belonging to TJ-related biological
functions and the TJ signaling pathway are differentially expressed in IBS-D
(supplementary figure 1).
In order to further assess TJ dysregulation, we analyzed the expression of
structural TJ proteins at both mRNA and protein levels. Q-RT-PCR analysis showed
the mRNA down-regulation of claudins (CLDN) 1, 2 and 4 (P<0.01 for all) in IBS-D
(figure 2a); while at the protein level CLDN2 protein expression was significantly up-
regulated in IBS-D (P<0.05) (figure 2b).
Furthermore, gene and protein expression of occludin (OCLN) was similar in both
groups (figure 3a-b), but OCLN phosphorylation (p-OCLN) was reduced in IBS-D
(P<0.05) (figure 3b). As the phosphorylation status of OCLN has been linked to its
distribution in epithelial cells, we assessed OCLN staining by confocal
immunofluorescence. IBS-D samples showed increased staining of OCLN in the
cytoplasm of epithelial cells suggesting intensive internalization of this protein, as
opposed to H where OCLN was predominantly located in the TJ (figure 3c).
CAPÍTULO III - 105 -
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- 106 - CAPÍTULO III
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d.
CAPÍTULO III - 107 -
Interestingly, we found a significant direct correlation between both, CLDN2 protein
over-expression and increased OCLN cytoplasmic staining and MC activation (table 3).
Moreover, stool frequency and consistency also correlated with the increased
expression of CLDN2 and OCLN redistribution (table 4). Noteworthy, samples showing
less expression of CLDN3 and CLDN4 also showed reduced p-OCLN (r=0.84,
P=0.0001 for CLDN3; r=0.73, P=0.003 for CLDN4).
Table 3. Correlation between MC-related variables and expression of TJ transmembrane proteins in the
jejunal mucosa of IBS-D patients (n=7-11) and H volunteers (n=7-8).
8.3.3. Phosphorylation of myosin light chain (MLC) is increased in IBS-D
To define the mechanisms that regulate TJ function we evaluated MLC
phosphorylation at Ser19 (pMLC), which leads to contraction of the acto-myosin belt
and disassembly of TJs; and phosphorylation at Thr18+Ser19, which has been related
to the de novo TJ assembly. IBS-D patients showed a significant increase in pMLC
compared to H (P<0.01), while ppMLC remained unchanged (figure 4a). In
concordance, IBS-D showed increased expression of MLC kinase (MLCK) (1.6 fold,
P=0.02), while the catalytic subunit of myosin phosphatase (PP1cδ) was decreased
(0.7 fold, P<0.05) (figure 4b). Remarkably, pMLC level significantly correlated with
bowel frequency and consistency (table 4).
- 108 - CAPÍTULO III
Figure 4. Assessment of the MLCK-dependent pathway in the jejunal mucosa of H volunteers and IBS-D
patients.
a. Detection of MLC phosphorylation in the jejunal epithelium by laser scanning confocal microscopy.
Representative micrographs of the jejunal epithelium of 14 IBS-D and 14 H samples where Ser19-phosphorylated MLC
(pMLC) (green) and Ser19/Thr18-phosphorylated MLC (ppMLC) (red) are identified (high-power field, x400). Nuclear
labeling of 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blue) is also shown for reference. Quantitative analysis of fluorescence
intensity was performed in a blinded manner on stained sections using the FV-10-ASW Olympus software. The average
of fluorescence intensity in 10 non-overlapping fields per subject is represented. Groups were compared using the
parametric unpaired t-test and P-values are indicated. b. MLC kinase (MLCK) and MLC phosphatase (PP1cδ) protein
expression analysis. Protein expression was measured by western-blot in 7 H and 7 IBS-D patients. To obtain the
fold-change value for each sample the target protein/β-actin ratio was calculated for each sample and then normalized
to the average of the H group. Groups were compared using the non parametric Mann Whitney U-test and P-values are
indicated.
CAPÍTULO III - 109 -
8.3.4. TJ architecture is altered in IBS-D
Routine processing of jejunal samples for hematoxilin and eosin staining disclosed
no differences in epithelial architecture or the presence of inflammatory cells in the
lamina propria between IBS-D patients and H (data not shown). However, widening of
intercellular spaces, peri-junctional cytoskeleton condensation at the TJ and aberrant
apical junction structures were frequently observed by TEM in enterocytes from IBS-D
patients (figure 5a). Measurement of the maximum paracellular space length revealed
that IBS-D patients showed a larger proportion of samples showing dilated intercellular
spaces (>20 nm) (P<0.01) and a significant increase of the apical intercellular distance
(P<0.0001) (figure 5b). Moreover, IBS-D samples showed a higher percentage of
junctions with peri-junctional cytoskeleton condensation (P<0.001) (figure 5b).
Interestingly, we found a significant correlation between both, the proportion of dilated
intercellular junctions and the intercellular distance and IBS-D symptoms (table 4).
Cytoskeleton condensation also correlated with bowel dysfunction (table 4).
Table 4. Correlation between expression of TJ-related proteins, ultraestructural TJ alterations and clinical
parameters in the jejunal mucosa of IBS-D patients (n=7-15) and H volunteers (n=7-14).
Note: For correlations of abdominal pain intensity, only IBS-D participants were evaluated, as H subjects
experiencing abdominal pain would not meet inclusion criteria.
- 110 - CAPÍTULO III
Figure 5. Assessment of apical junctional complex ultrastructure in the jejunal mucosa of H volunteers and
IBS-D patients.
a. Ultrastructural TJ alterations. Representative micrographs of the jejunal epithelium of 15 IBS-D and 12 H
samples showing widening of the paracellular space (indicated by white arrow) and peri-junctional cytoskeleton
condensation. Original magnification x60.000. b. Quantification of ultrastructural alterations. The percentage of
subjects showing paracellular spaces measuring more than 20 nm and electron-dense material around the apical
junctional complex was calculated within each group of participants. The maximum length of intercellular dilatation was
measured in a minimum of 50 junctions per sample in non-overlapping fields. Groups were compared using the
parametric unpaired t-test and P-values are indicated.
CAPÍTULO III - 111 -
8.4. DISCUSSION
In the present study, we demonstrate both structural and functional alterations in TJ
proteins in the jejunal mucosa of IBS-D patients and its association to mast cell
activation and to the clinical outcome of these patients. We have recently showed that
the jejunal mucosa of IBS-D patients displays a distinctive transcriptomic signature
linked to alterations in the expression and distribution of proteins belonging to the TJ
signaling pathway19. The results reported in this study extend our previous findings by
showing that these patients show alterations in structural and regulatory TJ proteins
paralleled by disrupted architecture of the apical junctional complex.
Increased intestinal permeability has been previously described in IBS3-6, being
higher in IBS-D patients than in other subgroups3. A major determinant to the rate of
intestinal permeability is the ‘‘tightness’’ of the TJ between enterocytes, which vary
considerably in different intestinal segments, i.e. the proximal gut is leakier than distal
segments30. Claudins play a central role in the coordination of barrier function and
signaling activity at the TJ and its differential expression and properties appear to
determine the tissue-specific variations in electrical resistance and paracellular ionic
selectivity31. The pathophysiological relevance of claudins in the intestine has recently
been highlighted by the finding of alterations in several members of this family of
transmembrane proteins in the colonic epithelia of inflammatory bowel disease (IBD)
patients, which have been demonstrated to contribute to barrier dysfunction32,33. In our
study, we have shown that mRNA expression of sealing claudins (CLDN1 and CLDN4)
and the pore-forming CLDN2 were decreased in IBS-D. On the contrary, at the protein
level CLDN2 was found to be up-regulated. This protein has been described to
contribute prominently to the paracellular permeability to Na+ and K+ in the rodent small
intestinal epithelium34 and to mediate water permeability in renal epithelial cells35. Thus,
alterations in the claudin profile would be expected to enhance paracellular
- 112 - CAPÍTULO III
permeability to cations providing the molecular basis for the so-called leak-flux
diarrhea, as suggested in IBD32,33, even though the contribution of other mechanisms
including the transcellular route can not be excluded. On the other hand, the opposite
effect on CLDN2 mRNA and protein expression is intriguing and deserves further
exploration, but we may speculate that it could be due to counteracting mechanisms
aimed at controlling intestinal barrier dysfunction and, therefore, intestinal inflammation
in IBS.
In addition to claudins, other proteins have been described to play a role in the
modulation of TJ integrity, including the transmembrane protein OCLN and the
scaffolding protein ZO1. We have recently reported jejunal ZO1 down-regulation and
redistribution linked to mast cell activation and bowel dysfunction in IBS-D patients19. In
the present study we show similar mRNA expression of OCLN than healthy subjects, in
agreement with other studies in the colon of IBS20,21. Of note, OCLN protein expression
has been reported to be decreased in the colon of IBS as a result of an increased
proteasome activity in these patients21. However, our study did not confirm this result
probably due to differences in the IBS population studied and to variations between gut
segments. Besides gene and protein expression regulation, OCLN-mediated
modulation of TJ integrity can be also achieved by phosphorylation36. When separated
by SDS-PAGE, OCLN resolves as two bands of 65 and 85 KDa, where the higher
molecular weight band represents ser/thr-phosphorylated OCLN37,38 that selectively
concentrate at the TJ, while the lower molecular weight band represent non- or less
phosphorylated OCLN and is localized in the cytoplasm38. Our study identified a
reduction in the 85 KDa band corresponding to pOCLN in the jejunum of IBS-D patients
and a consequent redistribution of OCLN from the TJ to the cytoplasm. In addition,
specific phosphorylation of cytoskeleton proteins is also crucial for the assembly and
maintenance of TJ integrity. Our study identified increased MLCK expression and
CAPÍTULO III - 113 -
reduced PP1cδ (the catalytic subunit of MLCP) and, consequently, enhanced
phosphorylation of MLC. This is in coincidence with studies showing the ability of
colonic supernatants of IBS patients to induce an increase of intestinal permeability
involving enhanced pMLC when infused in the colon of mice39. Taken together, these
results suggest that TJ phosphorylation/dephosphorylation events may be of critical
importance in the control of inflammation in the intestine of IBS-D patients modulating
the passage of luminal antigens through the paracellular pathway. Indeed, the reduced
pOCLN and increased pMLC levels suggest structural changes of TJ in the jejunum of
IBS-D, which may be, at least in part, responsible for the increased small bowel
permeability observed in this disease. Further support for these results comes from the
electron microscopy data which demonstrates a significant increase in the paracellular
space between adjacent enterocytes in the jejunum of IBS-D patients that may be the
result of alterations in the expression and distribution of structural TJ proteins.
Moreover, the observed electron-dense material around the TJ in IBS-D samples may
be the consequence of the MLCK-mediated contraction of the perijunctional
actomyosin ring, a phenomenon that has been previously linked to T-cell activation40.
This study provides evidence of gut epithelial barrier dysfunction in IBS-D patients,
but does not elucidate the precise mechanism. Noteworthy, the relationship between
regulatory and structural TJ alterations and clinical parameters leads us to speculate
that TJ integrity dysregulation may be a critical step for the development and
exacerbation of IBS symptoms. A possible explanation for our findings is a mast cell-
induced disruption of TJ proteins through diverse mechanisms given the ability of mast
cell mediators, including cytokines and specific proteases, to modulate paracellular
permeability27,41,42. We have previously demonstrated an increase in mast cell numbers
and activation in the jejunum of IBS-D patients13,19 which is further confirmed in this
study by showing that tryptase expression is increased in IBS-D, not only at mRNA but
- 114 - CAPÍTULO III
also at the protein level, and its association with mast cell numbers and bowel
dysfunction. Noteworthy, both increased CLDN2 protein expression and increased
cytoplasmic pool of OCLN correlated with tryptase expression and bowel dysfunction
suggesting a pivotal role of MC in the disruption of gut mucosal integrity which may
explain the symptoms in these patients. On the other hand, several studies have
reported differences in serum and colonic cytokine levels, which may also be
responsible for the alteration of TJ proteins in the intestinal mucosa, although to date
the results obtained in this area have been inconsistent10,11,43-46. However, there are no
studies addressing this point in the small bowel epithelium.
In summary, these results suggest that changes in structural and regulatory TJ
proteins may help to explain the increased intestinal permeability previously observed
in IBS-D patients, although further studies are needed to precisely define the
mechanism and functional consequences of these alterations.
CAPÍTULO III - 115 -
8.5. REFERENCES
1. Shen L, Turner JR. Role of epithelial cells in
initiation and propagation of intestinal inflammation.
Eliminating the static: tight junction dynamics exposed.
Am J Physiol: Gastrointest Liver Physiol 2006;
290:G577-82.
2. Turner JR. Intestinal mucosal barrier function
in health and disease. Nat Rev Immunol 2009;9:799-
809.
3. Spiller R. Clinical update: irritable bowel
syndrome. Lancet 2007;369:1586-8.
4. Dunlop SP, Hebden J, Campbell E, et al.
Abnormal intestinal permeability in subgroups of
diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Am J
Gastroenterol 2006;101:1288-94.
5. Zhou Q, Zhang B, Verne GN. Intestinal
membrane permeability and hypersensitivity in the
irritable bowel syndrome. Pain 2009;146:41-6.
6. Spiller RC, Jenkins D, Thornley JP, et al.
Increased rectal mucosal enteroendocrine cells, T
lymphocytes, and increased gut permeability following
acute campylobacter enteritis and in post-dysenteric
irritable bowel syndrome. Gut 2000;47:804-11.
7. Marshall JK, Thabane M, Garg AX, et al.
Intestinal permeability in patients with irritable bowel
syndrome after a waterborne outbreak of acute
gastroenteritis in Walkerton, Ontario. Aliment
Pharmacol Ther 2004;20:1317-22.
8. Cenac N, Andrews CN, Holzhausen M, et al.
Role for protease activity in visceral pain in irritable
bowel syndrome. J Clin Invest 2007;117:636-47.
9. Klooker TK, Braak B, Koopman KE, et al. The
mast cell stabiliser ketotifen decreases visceral
hypersensitivity and improves intestinal symptoms in
patients with irritable bowel syndrome. Gut
2010;59:1213-21.
10. Gwee KA, Collins SM, Read NW, et al.
Increased rectal mucosal expression of interleukin
1beta in recently acquired post-infectious irritable
bowel syndrome. Gut 2003;52:523-6.
11. Dinan TG, Quigley EM, Ahmed SM, et al.
Hypothalamic-pituitary-gut axis dysregulation in
irritable bowel syndrome: plasma cytokines as a
potential biomarker? Gastroenterology 2006,130:304-
11.
12. Barbara G, Stanghellini V, De Giorgio R, et al.
Activated mast cells in proximity to colonic nerves
correlate with abdominal pain in irritable bowel
syndrome. Gastroenterology 2004;126:693-702.
13. Guilarte M, Santos J, de Torres I, et al.
Diarrhoea-predominant IBS patients show mast cell
activation and hyperplasia in the jejunum. Gut
2007;56:203-9.
14. Chadwick VS, Chen W, Shu D, et al.
Activation of the mucosal immune system in irritable
bowel syndrome. Gastroenterology 2002;122:1778-83.
15. Barbara G, Wang B, Stanghellini V, et al.
Mast cell-dependent excitation of visceral-nociceptive
sensory neurons in irritable bowel syndrome.
Gastroenterology 2007;132:26-37.
16. Buhner S, Li Q, Vignali S, et al. Activation of
human enteric neurons by supernatants of colonic
biopsy specimens from patients with irritable bowel
syndrome. Gastroenterology 2009;137(4):1425-34.
17. Bueno L, Fioramonti J. Protease-activated
receptor 2 and gut permeability: a review.
Neurogastroenterol Motil 2008;20:580-7.
18. Bian ZX, Li Z, Huang ZX, et al. Unbalanced
expression of protease-activated receptors-1 and -2 in
the colon of diarrhea-predominant irritable bowel
syndrome patients. J Gastroenterol 2009;44:666-74.
19. Martinez C, Vicario M, Ramos L, et al. The
jejunum of diarrhea-predominant irritable bowel
syndrome shows molecular alterations in the tight
junction signaling pathway that are associated with
mucosal pathobiology and clinical manifestations. Am
J Gastroenterol 2011; under review.
20. Piche T, Barbara G, Aubert P, et al. Impaired
intestinal integrity in the colon of irritable bowel
- 116 - CAPÍTULO III
syndrome patients: involvement of soluble mediators.
Gut 2009;58:196-201.
21. Coeffier M, Gloro R, Boukhettala N, et al.
Increased proteasome-mediated degradation of
occludin in irritable bowel syndrome. Am J
Gastroenterol 2010;105:1181-8.
22. Balda MS, Matter K. Tight junctions at a
glance. J Cell Sci 2008;121:3677-82.
23. Schulzke JD, Fromm M. Tight junctions
molecular structure meets function. Ann NY Acad Sci
2009;1165:1-6.
24. Talley NJ, Stanghellini V, Heading RC, et al.
Functional gastroduodenal disorders. Gut 1999;45:
1137-42.
25. Lewis SJ, Heaton KW. Stool form scale as a
useful guide to intestinal transit time. Scand J
Gastroenterol 1997;32:920-4.
26. Demaude J, Salvador-Cartier C, Fioramonti J,
et al. Phenotypic changes in colonocytes following
acute stress or activation of mast cells in mice:
implications for delayed barrier dysfunction. Gut
2006;55:655-61.
27. Söderholm JD, Olaison G, Peterson KH, et al.
Augmented increase in tight junction permeability by
luminal stimuli in the non-inflamed ileum of Crohn's
disease Gut 2002;50:307-13.
28. Clayburgh DR, Barrett TA, Tang Y, et al.
Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier
dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea
in vivo. J Clin Invest 2005;115:2702-15.
29. Secondulfo M, Iafusco D, Carratu R, et al.
Ultrastructural mucosal alterations and increased
intestinal permeability in non-celiac, type I diabetic
patients. Dig Liver Dis 2004;36:35-45.
30. Sleisenger and Fordtran's Gastrointestinal
and Liver Disease, 9th Edition. Ed Saunders. 2010.
31. Van Itallie CM, Anderson JM. Claudins and
epithelial paracellular transport. Annu Rev Physiol
2006;68:403-29.
32. Prasad S, Mingrino R, Kaukinen K, et al.
Inflammatory processes have differential effects on
claudins 2, 3 and 4 in colonic epithelial cells. Lab
Invest 2005;85:1139-62.
33. Zeisig S, Bürgel N, Günzel D, et al. Changes
in expression and distribution of claudin 2, 5 and 8
lead to discontinous tight junctions and barrier
dysfunction in active Crohn’s disease. Gut 2007;56:61-
72.
34. Tamura A, Hayashi H, Imasato M, et al. Loss
of claudin-15 but not claudin-2, causes Na+ deficiency
and glucose malabsorption in mouse small intestine.
Gastroenterology 2011;140:913-23.
35. Rosenthal R, Milatz S, Krug SM, et al.
Claudin-2, a component of the tight junction, forms a
paracellular water channel. J Cell Sci 2010;123:1913-
21.
36. Rao R. Occludin phosphorylation in regulation
of epithelial tight junctions. Ann N Y Acad Sci
2009;1165:62-8.
37. Sakakibara A, Furuse M, Saitou M, et al.
Possible involvement of phosphorylation of occludin in
tight junction formation. J Cell Biol 1997;137:1393-401.
38. Simonovic I, Rosenberg J, Koutsouris A, et al.
Enteropathogenic Escherichia coli dephosphorylates
and dissociates occludin from intestinal epithelial tight
junctions. Cell Microbiol 2000;2:305-15.
39. Gecse K, Roka R, Ferrier L, et al. Increased
faecal serine protease activity in diarrhoeic IBS
patients: a colonic lumenal factor impairing colonic
permeability and sensitivity. Gut 2008;57:591-9.
40. Clayburgh DR, Barrett TA, Tang Y, et al.
Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier
dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea
in vivo. J Clin Invest 2005;115:2702-15.
41. Jacob C, Yang PC, Darmoul D, et al. Mast
cell tryptase controls paracellular permeability of the
intestine. Role of protease-activated receptor 2 and
beta-arrestins. J Biol Chem 2005;280:31936-48.
42. Lee JW, Park JH, Park DI, et al. Subjects with
diarrhea-predominant IBS have increased rectal
permeability responsive to tryptase. Dig Dis Sci
2010;55:2922-8.
CAPÍTULO III - 117 -
43. Ohman L, Isaksson S, Lindmark AC, et al. T-
cell activation in patients with irritable bowel syndrome.
Am J Gastroenterol 2009;104:1205-12.
44. Liebregts T, Adam B, Bredack C, et al.
Immune activation in patients with irritable bowel
syndrome. Gastroenterology 2007;132:913-20.
45. Macsharry J, O'Mahony L, Fanning A, et al.
Mucosal cytokine imbalance in irritable bowel
syndrome. Scand J Gastroenterol 2008;43:1467-76.
46. Chang L, Sundaresh S, Elliott J, et al.
Dysregulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal
(HPA) axis in irritable bowel syndrome.
Neurogastroenterol Motil 2009;21:149-59.
DDIISSCCUUSSIIÓÓNN GGEENNEERRAALL
DISCUSIÓN GENERAL - 121 -
DISCUSIÓN GENERAL
El síndrome del intestino irritable (SII) es una enfermedad digestiva de curso
crónico, con una alta prevalencia en los países industrializados (10-20% de la
población; Mayer, 2008). El desconocimiento de su etiopatogenia, junto a la
inexistencia de marcadores biológicos que ayuden en su diagnóstico, determina que el
manejo terapéutico de esta enfermedad sea deficiente. El deterioro en la calidad de
vida de los pacientes y el creciente coste socio-económico que se genera convierten al
SII en un problema importante de salud pública. En consecuencia, es de vital
importancia que la investigación en este campo se oriente hacia la identificación del
sustrato biológico subyacente a la sintomatología de esta enfermedad, que pueda ser
utilizado tanto como marcador diagnóstico como para el desarrollo de dianas
terapéuticas.
Afortunadamente, y en estrecha vinculación con la irrupción progresiva de
tecnologías innovadoras y ultrasensibles, así como de su rápida incorporación a los
protocolos de investigación, nuestra comprensión mecanística del origen del SII puede
estar experimentando en la actualidad un gran salto hacia adelante. Un avance
notable es la reciente identificación de la existencia de un aumento de la
permeabilidad epitelial en el intestino delgado de los pacientes con SII, más acusado
en aquellos pacientes con diarrea de origen no post-infeccioso (Dunlop et al, 2006), y
un aumento del número y de la activación de los mastocitos en la mucosa del yeyuno
de pacientes con SII-D (Guilarte et al, 2007). Estos hallazgos cuestionan la naturaleza
funcional del SII y proporcionan los primeros cimientos sobre los que estudiar este
síndrome como una enfermedad orgánica, lo que podría ser cierto para algunos
subgrupos de pacientes. Bajo este nuevo enfoque, la trayectoria a seguir conlleva la
identificación de alteraciones en la mucosa intestinal que constituyan el sustrato
biológico subyacente a la etiopatogenia del SII. Como punto de partida en la búsqueda
- 122 - DISCUSIÓN GENERAL
de dicho sustrato, la hipótesis de trabajo que plantea la presente tesis es que la
barrera mucosa intestinal de los pacientes con SII-D presenta alteraciones
moleculares y estructurales distintivas asociadas con un sustrato inmuno-inflamatorio
patobiológico subyacente y con las manifestaciones clínicas predominantes.
Como primera aproximación para evaluar nuestra hipótesis, hemos analizado el
perfil de expresión génica y proteica en muestras de mucosa yeyunal de pacientes con
SII-D y voluntarios sanos mediante microarrays y electroforesis diferencial en gel
(DIGE), respectivamente. Este tipo de tecnologías están ampliamente aceptadas por la
comunidad científica y han contribuido significativamente a la comprensión de los
mecanismos moleculares subyacentes a varias enfermedades complejas. Sin
embargo, la interpretación de los resultados de este tipo de análisis y su traslación a
la práctica clínica diaria conlleva una serie de limitaciones, que pueden ser
parcialmente superadas mediante la combinación de diferentes métodos
bioinformáticos que nos permiten profundizar en el significado biológico de los cambios
de expresión génica. Así pues, hemos utilizado el análisis de microarrays y de DIGE
como técnicas exploratorias iniciales seguidas del análisis del significado biológico
asociado al perfil transcriptómico diferencial obtenido. Para ello hemos proyectado la
lista de genes y proteínas diferencialmente expresadas en SII-D en el programa de
análisis IPA, el cual cuenta con una base de datos propia que integra todo el
conocimiento biológico extraído en la literatura científica reciente. Este análisis nos ha
permitido clasificar los genes y proteínas diferencialmente expresados según su
participación en funciones biológicas y en redes de señalización.
Por otro lado, hemos realizado un análisis multivariante con el objetivo de obtener
una mayor comprensión de la importancia biológica de nuestros resultados y descubrir
las posibles asociaciones entre los diferentes grupos de variables biológicas, clínicas y
epidemiológicas, recogidas en todos los participantes del estudio.
DISCUSIÓN GENERAL - 123 -
Nuestros resultados demuestran que la mucosa del yeyuno de los pacientes con
SII-D tiene un perfil transcriptómico característico que, además, es distinto al de los
voluntarios sanos. Dicho perfil se compone de 286 genes, un número elevado si lo
comparamos con estudios recientes realizados en biopsias de colon donde el listado
de genes diferencialmente expresados comprende un número de 20 a 33 genes
(Aerssens et al, 2008; Macsharry et al, 2008). Las diferencias entre nuestros
resultados y los obtenidos por otros grupos de investigación podrían ser debidas a
diferentes factores: la heterogeneidad de la población de SII estudiada, el segmento
intestinal objeto de estudio, ya que las mucosas del colon y del yeyuno presentan
diferente estructura y función, por lo tanto, sus poblaciones celulares varían, y,
además, están expuestas a diferente carga antigénica; y también por los diferentes
métodos utilizados para la obtención de la biopsia. A pesar de estas diferencias, es
interesante comprobar que también existen ciertas similitudes con estos estudios en la
mucosa colónica. Fundamentalmente, las funciones más relevantes identificadas en
estos estudios previos están asociadas a la respuesta inmunológica frente a bacterias
intestinales. Es interesante destacar que, en nuestro análisis también identificamos
genes implicados en los mecanismos de respuesta inmunológica frente a la microbiota
intestinal en el yeyuno de los pacientes con SII-D, con mayor relevancia aquellos que
participan en la señalización de las vías de ERK/MAPK y NFκB.
Por otro lado, es de gran importancia destacar que las redes moleculares y las vías
de señalización asociadas al perfil transcriptómico del SII-D que emergen como las
más relevantes, son aquellas relacionadas con la regulación de la permeabilidad
intestinal a través de la modulación de las uniones estrechas (TJ). En vista de este
resultado inicial, nos planteamos evaluar de manera exhaustiva las proteínas
pertenecientes a la vía de señalización de las TJ y su posible relación con el estado de
activación de los mastocitos en la mucosa del yeyuno de estos pacientes. En concreto,
- 124 - DISCUSIÓN GENERAL
analizamos las alteraciones en la expresión de las proteínas ZO, identificadas en el
análisis de microarrays, pero también de las proteínas estructurales de las TJ
claudinas y ocludina, y otras proteínas implicadas en la regulación del ensamblaje y
desensamblaje de las TJ en estos pacientes.
El principal factor que determina la tasa de permeabilidad del epitelio intestinal es
la “fuerza” de las TJ que se establecen entre los enterocitos adyacentes. Este factor
varía considerablemente en función de las propiedades fisiológicas de cada segmento
intestinal, de manera que el intestino más proximal, en el cual se produce la absorción
de nutrientes e iones, es más permeable que el intestino distal, el cual está sometido a
una mayor carga antigénica (Sleisenger & Fordtran, 2010). Esta “fuerza” de las TJ
viene determinada por las proteínas transmembrana que las componen. Entre ellas,
las claudinas desempeñan un papel esencial en la coordinación de la función de
barrera y en la señalización de las TJ, de manera que su expresión diferencial y sus
propiedades parecen determinar las variaciones específicas de cada epitelio en la
resistencia eléctrica y en la selectividad iónica paracelular (Van Itallie & Anderson,
2006). En el epitelio intestinal, la relevancia fisiopatológica de las claudinas ha sido
puesta de manifiesto recientemente gracias al hallazgo de alteraciones en la expresión
de varios miembros de esta familia de proteínas en el epitelio del colon de pacientes
con enfermedad inflamatoria intestinal (EII) demostrándose, además, la contribución
de estas alteraciones a la disfunción de la barrera epitelial (Prasad et al, 2005; Zeisig
et al, 2007). Nuestros resultados demuestran que la mucosa del yeyuno de los
pacientes con SII-D presenta alteraciones en la expresión del perfil de claudinas.
Concretamente, se observó una disminución de la expresión de mRNA de CLDN1 y
CLDN4, que forman parte del grupo de claudinas denominado “selladoras”, y de la
CLDN2, que forma parte del grupo de claudinas denominado “formadoras de canales”.
Por el contrario, la expresión proteica de CLDN2 estaba aumentada. Recientemente
DISCUSIÓN GENERAL - 125 -
se ha descrito la contribución de esta proteína a la permeabilidad paracelular a iones
de Na+ y de K+ en el intestino delgado de roedores (Tamura et al, 2011) y con su
implicación en la permeabilidad al agua descrita en células epiteliales de riñón
(Rosenthal et al, 2010). Todos estos resultados sugieren que las alteraciones en el
perfil de expresión de las claudinas podrían tener como consecuencia el aumento de la
permeabilidad a cationes proporcionando un soporte molecular potencialmente
involucrado en el origen de la diarrea crónica que caracteriza a estos pacientes, al
igual que se ha sugerido en los pacientes con EII (Prasad et al, 2005; Zeisig et al,
2007). Sin embargo, no podemos excluir la contribución de otros mecanismos, como
deficiencias en la absorción de agua o alteraciones en la función secretora, tal y como
se ha descrito previamente en respuesta a un estímulo de estrés, tanto agudo como
crónico (Santos et al, 1998; Santos et al, 2000; Alonso et al, 2008).
Además de las claudinas, existen otras proteínas que tienen un papel esencial en
la modulación de la integridad de las TJ. Estas proteínas incluyen la proteína integral
transmembrana ocludina y la familia de proteínas adaptadoras ZO, responsables de
conectar las proteínas transmembrana estructurales de las uniones intercelulares al
citoesqueleto de actina y miosina (Guillemot et al, 2008). Nuestro estudio no mostró
diferencias en la expresión de mRNA de ocludina, en consonancia con otros estudios
en la mucosa colónica de pacientes con SII (Piche et al, 2009; Coëffier et al, 2010).
Cabe destacar que, en el colon de pacientes con SII, se ha descrito una reducción de
la expresión proteica de ocludina como resultado del aumento en la actividad del
proteasoma (Coëffier et al, 2010). Sin embargo, nuestro estudio no ha confirmado este
resultado en la mucosa del intestino delgado, posiblemente debido a que los
mecanismos de regulación de la función de barrera difieren según el segmento
intestinal estudiado. Por otro lado, nuestros resultados confirmaron la disminución de
la expresión de ZO-1 identificada por microarrays, tanto en mRNA como en proteína.
- 126 - DISCUSIÓN GENERAL
Esta proteína tiene una especial relevancia para el SII, debido a que se ha demostrado
previamente que los cambios de expresión de ZO-1 se asocian con el aumento de la
permeabilidad intestinal y con la intensidad del dolor abdominal en el colon de
pacientes con SII (Zhou et al, 2009; Piche et al, 2009).
La modulación estructural y funcional de la barrera intestinal también puede
producirse a través de la endocitosis de las proteínas específicas de las TJ mediante
un mecanismo que depende del estímulo implicado (Utech et al, 2010). Se ha
demostrado que diversos estímulos pro-inflamatorios como el TNF-α y productos
bacterianos son capaces de inducir la internalización de ZO-1 y de ocludina a través
de un mecanismo de endocitosis mediado por la proteína caveolina junto con la
consiguiente pérdida de la función de barrera (Hopkins et al, 2003; Marchiando et al,
2010). Es importante destacar que, en nuestro estudio, la endocitosis mediada por
caveolina se identifica como la vía de señalización más significativa asociada al perfil
transcriptómico del SII-D. Por tanto, analizamos la localización subcelular de las
proteínas ZO-1 y ocludina mediante microscopía confocal. En el caso de ZO-1,
observamos su redistribución desde la membrana apical hacia el citoplasma
únicamente en las muestras de los pacientes con SII-D. Este efecto ha sido descrito
con anterioridad en células epiteliales del colon de ratones en respuesta a la
exposición al sobrenadante fecal de pacientes con SII-D (Gecse et al, 2008). En lo que
respecta a la ocludina, también observamos una redistribución de esta proteína hacia
el citoplasma en las muestras de los pacientes. Este resultado concuerda con la
disminución de la fosforilación específica de la ocludina en residuos de Ser y Thr
observada en los pacientes analizados en el presente trabajo, tal y como se ha
descrito en estudios previos (Sakakibara et al, 1997; Simonovic et al, 2000).
Por otro lado, el citoesqueleto de actina y miosina también juega un papel
fundamental en el mantenimiento de la integridad de la función de las TJ a través de la
DISCUSIÓN GENERAL - 127 -
fosforilación específica de la cadena ligera de la miosina (MLC). Nuestro estudio
identificó un aumento en la expresión de la kinasa de miosina (MLCK) y una reducción
en la expresión de la subunidad catalítica de la fosfatasa de miosina (PP1cδ) junto con
el consiguiente aumento de fosforilación de MLC. Estudios previos en ratones han
demostrado que la exposición al sobrenadante obtenido de biopsias de colon de
pacientes con SII provoca un aumento de la permeabilidad intestinal dependiente de la
fosforilación de MLC (Gecse et al, 2008). Por lo tanto, nuestros resultados podrían
ayudar a explicar el aumento de permeabilidad intestinal observada previamente en
estos pacientes.
A la luz de todos estos resultados nos planteamos evaluar si las alteraciones en
las diferentes proteínas analizadas podrían tener como consecuencia final una
alteración de la ultraestructura de las TJ y, consecuentemente, contribuir al aumento
de la permeabilidad intestinal observada en los pacientes de SII. Nuestros resultados
mostraron un incremento en la distancia paracelular de los enterocitos del epitelio
yeyunal en los pacientes con SII-D, presumiblemente, como consecuencia de la
alteración en la expresión y en la distribución de las proteínas estructurales de las TJ.
Además, la mayor proporción de uniones intercelulares con condensación del
citoesqueleto alrededor de las TJ observada en las muestras de SII-D, podría reflejar
la contracción del citoesqueleto de acto-miosina como consecuencia del aumento en la
fosforilación de MLC.
Los resultados presentados en esta tesis demuestran que la mucosa del yeyuno
de los pacientes con SII-D presenta alteraciones moleculares y estructurales de la
barrera epitelial que podrían tener implicaciones clínicas importantes para esta
enfermedad. De hecho, es importante destacar que las alteraciones en las proteínas
estructurales y reguladoras de las TJ descritas en este trabajo están asociadas a los
parámetros clínicos que definen al SII, de manera que podríamos especular que la
- 128 - DISCUSIÓN GENERAL
presencia de una disfunción epitelial persistente en estos pacientes podría aumentar el
paso de sustancias antigénicas a través de la barrera constituyendo un factor crítico en
el inicio y la exacerbación de los síntomas. Sin embargo, todavía no estamos en
posición de determinar si estas alteraciones de la barrera son causa o consecuencia
de la micro-inflamación mucosa observada en estos pacientes. Existen evidencias que
indican que el estrés puede alterar la barrera física y la vigilancia inmunológica del
epitelio intestinal, pudiendo iniciar, facilitar y perpetuar respuestas inmunológicas
defectuosas. En este sentido, resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio en
un modelo animal de estrés por aglomeración (Vicario et al, 2010; Vicario et al 2011)
nos permiten especular que el estrés podría ejercer como inductor primario de la
inflamación de la mucosa y, posteriormente, de la disfunción de la barrera intestinal.
Varios estudios han demostrado la habilidad de los mastocitos para modular la
barrera epitelial intestinal, a través de mediadores, principalmente citoquinas y
proteasas, liberados tras su activación (Jacob et al, 2005; Groschwitz et al, 2009; Lee
et al, 2010). Resultados previos en nuestro laboratorio han demostrado un aumento en
el número y en la activación de los mastocitos en el yeyuno de pacientes con SII-D
(Guilarte et al, 2007), lo cual se confirmó en la presente tesis mostrando, además, que
el aumento en la expresión de la proteasa específica del mastocito triptasa se asocia a
las manifestaciones clínicas del SII, concretamente a la frecuencia y a la consistencia
de las deposiciones. Pese a que no conocemos el mecanismo de activación de los
mastocitos en estos pacientes, los datos existentes en la literatura nos permiten
especular que el eje estrés-mastocito podría ser un factor esencial en la generación y
perpetuación de las alteraciones fisiopatológicas del SII-D (Santos et al, 1998; Santos
et al, 1999; Santos et al, 2001; Guilarte et al, 2004; Barreau et al, 2007; Vicario et al,
2010). Además, tanto el aumento de expresión de CLDN2 como la redistribución de
ocludina están asociados a la activación de los mastocitos y a la disfunción intestinal,
DISCUSIÓN GENERAL - 129 -
lo que sugiere que el mastocito desempeña un papel esencial en la alteración de la
integridad de la función de barrera intestinal que podría explicar los síntomas de los
pacientes con SII-D.
En resumen, esta tesis contribuye a implementar el conocimiento sobre la
patogénesis del SII-D demostrando que existen alteraciones en el perfil de expresión
génica en la mucosa del yeyuno de pacientes con SII-D. En particular, los resultados
de esta tesis ponen de manifiesto la importancia del mastocito como célula clave en la
iniciación y perpetuación de esta enfermedad a través de su implicación en la compleja
red de interacciones moleculares destinadas a regular la función de barrera del epitelio
intestinal y de su relación con las manifestaciones clínicas de esta enfermedad.
Conjuntamente, estos resultados cuestionan la visión clásica de esta enfermedad
como un modelo de trastorno funcional a la vez que refuerzan su filiación orgánica,
que se extiende más allá del colon para afectar también al intestino delgado.
CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS
CONCLUSIONES - 133 -
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral han dado lugar a las siguientes
conclusiones:
1. La mucosa del yeyuno de los pacientes con SII-D posee un perfil transcripcional
característico diferente al de individuos sanos. Este perfil está asociado a alteraciones
en vías de señalización y en funciones biológicas relacionadas con la modulación de la
permeabilidad intestinal a través de las uniones estrechas.
2. La mucosa del yeyuno de los pacientes con SII-D presenta alteraciones en la
expresión y en la distribución de proteínas estructurales y reguladoras de la función de
barrera del epitelio intestinal. Estas alteraciones moleculares comprometen la
integridad ultraestructural de las uniones estrechas.
3. La mucosa del yeyuno de los pacientes con SII-D presenta una hiperplasia y
activación mastocitaria que se correlaciona con la sintomatología de estos pacientes y
con alteraciones de las proteínas estructurales de las TJ.
4. Las manifestaciones clínicas del SII-D se asocian a la pérdida de la integridad
molecular de la barrera intestinal.
BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA
BIBLIOGRAFÍA - 137 -
BIBLIOGRAFÍA
- Aerssens J, Hillsley K, Peeters PJ, et al.
Alteration in the brain–gut axis underlying
visceral hypersensitivity in Nippostrongylus
brasilinensis-infected mice. Gastroenterology
2007;132:1375–87.
- Aerssens J, Camilleri M, Talloen W, et al.
Alterations in mucosal immunity identified in the
colon of patients with irritable bowel syndrome.
Clin Gastroenterol Hepatol 2008;6:194-205.
- Akiho H, Deng Y, Blennerhassett P, et al.
Mechanisms underlying the maintenance of
muscle hypercontractility in a model of
postinfective gut dysfunction. Gastroenterology
2005;129:131-41.
- Alonso C, Guilarte M, Vicario M, et al.
Maladaptive intestinal epithelial responses to life
stress may predispose healthy women to gut
mucosal inflammation. Gastroenterology 2008;
135:163-172.
- Amano M, Ito M, Kimura K, et al. Phosphorylation
and activation of myosin by Rho-associated
kinase. J Biol Chem 1996;271:20246-9.
- Anderson JM, Van Itallie CM. Physiology and
function of the tight junction. Cold Spring Harb
Perspect Biol 2009;1:a002584.
- Arrieta MC, Bistritz L, Meddings JB. Alterations in
intestinal permeability. Gut 2006;55:1512-20.
- Atkinson W, Lockhart S, Whorwell PJ, et al.
Altered 5-hydroxytryptamine signaling in patients
with constipation- and diarrhea-predominant
irritable bowel syndrome. Gastroenterology
2006;130:34-43.
- Azpiroz F, Bouin M, Camilleri M, et al.
Mechanisms of hypersenitivity in IBS and
functional disorders. Neurogastroenterol Motil
2007;19(Suppl 1):62-88.
- Balda MS, Whitney JA, Flores C, et al. Functional
dissociation of paracellular permeability and
transepithelial electrical resistance and disruption
of the apical-basolateral intramembrane diffusion
barrier by expression of a mutant tight junction
membrane protein. J Cell Biol 1996;134:1031-49.
- Balda MS, Matter K. Tight junctions at a glance.
J Cell Sci 2008;121:3677-82.
- Barbara G, Stanghellini V, De Giorgio R, et al.
Activated mast cells in proximity to colonic nerves
correlate with abdominal pain in irritable bowel
syndrome. Gastroenterology 2004;126:693-702.
- Barbara G, Wang B, Stanghellini V, et al. Mast
Cell-Dependent Excitation of Visceral-Nociceptive
Sensory Neurons in Irritable Bowel Syndrome.
Gastroenterology 2007;132:26.
- Barbara G, Cremon C, De Giorgio R, et al.
Mechanisms underlying visceral hypersensitivity
in irritable bowel syndrome. Curr Gastroenterol
Rep 2011 May 3 [Epub ahead of print].
- Barreau F, Cartier C, Leveque M, et al. Pathways
involved in gut mucosal barrier dysfunction
induced in adult rats by maternal deprivation:
CRF and NGF interplay. J Physiol 2007;580:347-
56.
- Bhatia V, Tandon RK. Stress and the
gastrointestinal tract. J Gastroenterol Hepatol
2005;20:332-9.
- Bauer H, Stelzhammer W, Fuchs R, et al.
Astrocytes and neurons express the tight
junction-specific protein occludin in vitro. Exp Cell
Res 1999;250:434-8.
- Bennet EJ, Tennant CC, Piesse C, et al. Level of
chronic life stress predicts clinical outcome in
irritable bowel syndrome. Gut 1998;43:256-61.
- Bercik P, Wang L, Verdu EF, et al. Visceral
hyperalgesia and intestinal dysmotility in a mouse
model of postinfective gut dysfunction.
Gastroenterology 2004;127:179-87.
- Bercik P, Verdu EF, Collins SM. Is irritable bowel
syndrome a low-grade inflammatory bowel
disease? Gastroenterol Clin North Am 2005;
34:235-45.
- 138 - BIBLIOGRAFÍA
- Bernard O. Lim kinases, regulators of actin
dynamics. Int J Biochem Cell Biol 2007;39:1071-
76.
- Bischoff SC, Wedemeyer J, Herrmann A, et al.
Quantitative assessment of intestinal eosinophils
and mast cells in inflammatory bowel disease.
Histopathology 1996;28:1-13.
- Blair SA, Kane SV, Clayburgh DR, Turner JR.
Epithelial myosin light chain kinase expression
and activity are upregulated in inflammatory
bowel disease. Lab Invest 2006;86:191-201.
- Blank F, Wehrli M, Lehmann A, et al.
Macrophages and dendritic cells express tight
junction proteins and exchange particles in an in
vitro model of the human airway wall.
Immunobiology 2011;216:86-95.
- Bruewer M, Utech M, Ivanov AI, et al. Interferon-
gamma induces internalization of epithelial tight
junction proteins via a macropinocytosis-like
process. FASEB J 2005;19:923-33.
- Camilleri M. Genetics and irritable bowel
syndrome: from genomics to intermediate
phenotype and pharmacogenetics. Dig Dis Sci
2009;54:2318-24.
- Chadwick VS, Chen W, Shu D, et al. Activation of
the mucosal immune system in irritable bowel
syndrome. Gastroenterology 2002;122:1778-83.
- Chang L, Heitkemper MM. Gender differences in
irritable bowel syndrome. Gastroenterology
2002;123:1686-701.
- Chang L. The role of stress on physiological
responses and clinical symptoms in irritable
bowel syndrome. Curr Mol Med 2008;8:299-312.
- Chen Y, Merzdorf C, Paul DL, et al. COOH
terminus of occludin is required for tight junction
barrier function in early Xenopus embryos. J Cell
Biol 1997;138:891-9.
- Chiba H, Osanai M, Murata M, et al.
Transmembrane proteins of tight junctions.
Biochim Biophys Acta 2008;1778:588-600.
- Chow J, Lee SM, Shen Y, et al. Host-bacterial
symbiosis in health and disease. Adv Immunol
2010;107:243-74.
- Clarke G, Quigley EM, Cryan JF, Dinan TG.
Irritable bowel syndrome: towards biomarker
identification. Trends Mol Med 2009;15:478-89.
- Clayburgh DR, Barrett TA, Tang Y, et al.
Epithelial myosin light chain kinase-dependent
barrier dysfunction mediates T cell activation-
induced diarrhea in vivo. J Clin Invest 2005;
115:2702-15.
- Coëffier M, Gloro R, Boukhettala N, et al.
Increased proteasome-mediated degradation of
occludin in irritable bowel syndrome. Am J
Gastroenterol 2010;105:1181-8.
- Cremon C, Gargano L, Morselli-Labate AM, et al.
Mucosal immune activation in irritable bowel
syndrome: gender-dependence and association
with digestive symptoms. Am J Gastroenterol
2009;104:392-400.
- Curran PF. Solute-solving interactions and water
transport. En: Zolisl G ed. Role of the membrane
in secretory processes, Amsterdan: North Hollald
Publish, 1972:408-19.
- Desjeaux JF. Effects of sugar and aminoacids on
sodium movement across small intestine. Review
article. Am J Dis Child 1977;131:331-40.
- Dinan TG, Quigley EM, Ahmed SM, et al.
Hypothalamic-pituitary-gut axis dysregulation in
irritable bowel syndrome: plasma cytokines as a
potential biomarker? Gastroenterology 2006;
130:304-11.
- Docena G, Rovedatti L, Kruidenier L, et al. Down-
regulation of p38 mitogen-activated protein kinase
activation and proinflammatory cytokine
production by mitogen-activated protein kinase
inhibitors in inflammatory bowel disease. Clin Exp
Immunol 2010;162:108-15.
- Drossman DA, Thompson WG, Talley NJ.
Identification of subgroups of functional
gastrointestinal disorders. Gastroenterol Int 1990;
3:159-72.
BIBLIOGRAFÍA - 139 -
- Drossman DA, Morris CB, Hu Y, et al. A
prospective assessment of bowel habit in irritable
bowel syndrome in women: defining an
alternator. Gastroenterology 2005;128:580-9.
- Drossman DA. The functional gastrointestinal
disorders and the ROME III process.
Gastroenterology 2006;130:1377.
- Dunlop SP, Jenkins D, Neal KR, et al. Relative
importance of enterochromaffin cell hyperplasia,
anxiety and depression in postinfectious IBS.
Gastroenterology 2003;125:1651-9.
- Dunlop SP, Coleman NS, Blackshaw E, et al.
Abnormalities of 5-hydroxytryptamine metabolism
in irritable bowel syndrome. Clin Gastroenterol
Hepatol 2005;3:349-57.
- Dunlop SP, Hebden J, Campbell E, et al.
Abnormal intestinal permeability in subgroups of
diarrhea-predominant irritable bowel syndromes.
Am J Gastroenterol 2006;101:1288-94.
- Elias BC, Suzuki T, Seth A, et al.
Phosphorylation of Tyr-398 and Tyr-402 in
occludin prevents its interaction with ZO-1 and
destabilizes its assembly at the tight junctions. J
Biol Chem 2009;284:1559-69.
- El-Serag HB, Olden K, Bjorkaman D. Health-
related quality of life among persons with irritable
bowel syndrome: a systematic review. Aliment
Pharmacol Ther 2002;16:1171-85.
- Essler M, Hermann K, Amano M, et al.
Pasteurella multocida toxin increases endothelial
permeability via Rho kinase and myosin light
chain phosphatase. J Immunol 1998;161:5640-6.
- Faresjo A, Grodzinsky E, Johansson S, et al.
Psychosocial factors at work and in every day life
are associated with irritable bowel syndrome. Eur
J Epidemiol 2007;22:473-80.
- Farhadi A, Keshavarzian A, Ranjbaran Z, et al.
The role of protein kinase C isoforms in
modulating injury and repair of the intestinal
barrier. J Pharmacol Exp Ther 2006;316:1-7.
- Fihn BM, Sjoqvist A, Jodal M. Permeability of the
rat small intestinal epithelium along the villus-
crypt axis: effects of glucose transport.
Gastroenterology 2000;119:1029-36.
- Ford AC, Spiegel BM, Talley NJ, et al. Small
intestinal bacterial overgrowth in irritable bowel
syndrome: systematic review and meta-analysis.
Clin Gastroenterol Hepatol 2009;7:1279-86.
- Fukudo S, Nomura T, Hongo M. Impact of
corticotropin-releasing hormone on
gastrointestinal motility and adrenocorticotropic
hormone in normal controls and patients with
irritable bowel syndrome. Gut 1999:42:845-9.
- Garrod D, Chidgey M. Desmosome: structure,
composition and function. Biochim Biophys Acta
2008;1778:572–87.
- Gecse K, Róka R, Ferrier L, et al. Increased
faecal serine protease activity in diarrhoeic IBS
patients: a colonic lumenal factor impairing
colonic permeability and sensitivity. Gut 2008;
57:591-9.
- Gill SR, Pop M, Deboy RT, et al. Metagenomic
analysis of the human distal gut microbiome.
Science 2006;312:1355-9.
- González-Mariscal L, Tapia R, Chamorro D.
Crosstalk of tight junction components with
signaling pathways. Biochim Biophys Acta
2008;1778:729-56.
- Graham WV, Marchiando AM, Shen L, Turner JR.
No static at all. Ann N Y Acad Sci 2009;1165:314-
22.
- Groschwitz KR, Ahrens R, Osterfeld H, et al. Mast
cells regulate homeostatic intestinal epithelial
migration and barrier function by a
chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc Natl
Acad Sci USA 2009;106:22381-6.
- Groschwitz KR, Hogan SP. Intestinal barrier
function: molecular regulation and disease
pathogenesis. J Allergy Clin Immunol 2009;124:3
-20.
- Guilarte M, Santos J, Alonso C, et al.
Corticotropin releasing hormone (CRH) triggers
jejunal mast cell and eosinophil activation in IBS
patients. Gastroenterology 2004;126(suppl 2):A4.
- 140 - BIBLIOGRAFÍA
- Guilarte M, Santos J, de Torres I, et al.
Diarrhoea-predominant IBS patients show mast
cell activation and hyperplasia in the jejunum.
Gut 2007;56:203-9.
- Guillemot L, Paschoud S, Pulimeno P, et al. The
cytoplasmic plaque of tight junctions: a
scaffolding and signalling center. Biochim
Biophys Acta 2008;1778:601-13.
- Gwee KA, Leong YL, Graham C, et al. The role
of psychological and biological factors in post-
infective gut dysfunction. Gut. 1999;44:400-6.
- Gwee KA, Collins SM, Read NW, et al. Increased
rectal mucosal expression of interleukin 1beta in
recently acquired post-infectious irritable bowel
syndrome. Gut 2003;52:523-6.
- Halpert A, Drossman DA. Biopsychosocial issues
in irritable bowel syndrome. J Clin Gastroenterol
2005;39:665-9.
- Hartsock A, Nelson WJ. Adherens and tight
junctions: structure, function and connections to
the actin cytoskeleton. Biochim Biophys Acta
2008;1778:660-9.
- Hawkins PT, Anderson KE, Davidson K, et al.
Signalling through Class I PI3Ks in mammalian
cells. Biochem Soc Trans 2006;34:647-62.
- Hommes D, van den Blink B, Plasse T, et al.
Inhibition of stress activated MAP kinases
induces clinical improvement in moderate to
severe Crohn’s disease. Gastroenterology
2002;122:7–14.
- Hopkins AM, Walsh SV, Verkade P, et al.
Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1
influences tight junction structure and epithelial
barrier function. J Cell Sci 2003;116:725-42.
- Hotoleanu C, Popp R, Trifa AP, et al. Genetic
determination of irritable bowel syndrome. World
J Gastroenterol 2008;14:6636-40.
- Jacob C, Yang P.C, Darmoul D, et al. Mast cell
tryptase controls paracellular permeability of the
intestine. Role of protease-activated receptor 2
and beta-arrestins. J Biol Chem 2005;280:31936-
48.
- Kalantar JS, Locke GR 3rd, Talley NJ, et al. Is
irritable bowel syndrome more likely to be
persistent in those with relatives who suffer from
gastrointestinal symptoms? A population-based
study at three time points. Aliment Pharmacol
Ther 2003;17:1389-97.
- Karaki S, Kaji I, Otomo Y, et al. The tight junction
component protein, claudin-4, is expressed by
enteric neurons in the rat distal colon. Neurosci
Lett 2007;428:88-92.
- Kato T, Owen RL. Structure and function of
intestinal mucosal epithelium. En: Ogra PL,
Mestecky J, Lamm ME, Strober W, Bienenstock
J, McGhee J. Eds. Mucosal Immunology. 2ª ed.
San Diego: Academic Press 1999;115-132.
- Keita AV, Söderholm JD. The intestinal barrier
and its regulation by neuroimmune factors.
Neurogastroenterol Motil 2010;22:718-33.
- Kellow JE, Eckersley CM, Jones MP. Enhanced
perception of physiological intestinal motility in the
irritable bowel syndrome. Gastroenterology
1991;101:1621-7.
- Kellow JE, Langeluddecke PM, Eckersley GM, et
al. Effects of acute psychologic stress on small-
intestinal motility in health and the irritable bowel
syndrome. Scand J Gastroenterol 1992;27:53-8.
- Kellow JE, Azpiroz F, Delvaux M, et al. Applied
principles of neurogastroenterology: physiology
/motility sensation. Gastroenterology 2006;
130:1412-20.
- Kempuraj D, Papadopoulou NG, Lytinas M, et al.
Corticotropin-releasing hormone and its
structurally related urocortin are synthesized and
secreted by human mast cells. Endocrinology
2004;145:43-8.
- Kirsch R, Riddell RH. Histopathological
alterations in irritable bowel syndrome. Mod
Pathol 2006;19:1638-45.
- Lee JW, Park JH, Park DI, et al. Subjects with
diarrhea-predominant IBS have increased rectal
permeability responsive to tryptase. Dig Dis Sci
2010;55:2922-8.
BIBLIOGRAFÍA - 141 -
- Lee KJ, Tack J. Altered intestinal microbiota in
irritable bowel syndrome. Neurogastroenterol
Motil 2010;22:493-8.
- Levy RL, Jones KR, Whitehead WE, et al.
Irritable bowel syndrome in twins: heredity and
social learning both contribute to etiology.
Gastroenterology 2001;121:799-804.
- Lewis SJ, Heaton KW. Stool form scale as a
useful guide to intestinal transit time. Scand J
Gastroenterol 1997;32:920–4.
- Locke GR 3rd, Zinsmeister AR, Talley NJ, et al.
Familial association in adults with functional
gastrointestinal disorders. Mayo Clin Proc
2000;75:907-12.
- Longstreth GF, Thompson WG, Chey WD, et al.
Functional bowel disorders. Gastroenterology
2006;130:1480-91.
- Lum H, Podolski JL, Gurnack ME, et al. Protein
phosphatase 2B inhibitor potentiates endothelial
PKC activity and barrier dysfunction. Am J
Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001;281:546-55.
- Lydiard RB. Irritable bowe syndrome, anxiety and
depression: what are the links? J Clin Psychiatry
2001;62(Suppl 8):38-45.
- Macsharry J, O'Mahony L, Fanning A, et al.
Mucosal cytokine imbalance in irritable bowel
syndrome. Scand J Gastroenterol 2008;43:1467-
76.
- Madara JL, Pappenheimer JR. Structural basis
for physiological regulation of paracellular
pathways in intestinal epithelia. J Membr
Biol 1987;100:149-64.
- Malamut G, Cabane C, Dubuquoy L, et al. No
evidence for an involvement of the p38 and JNK
mitogen-activated protein in inflammatory bowel
diseases. Dig Dis Sci 2006;51:1443-53.
- Mankertz J, Waller JS, Hillenbrand B, et al. Gene
expression of the tight junction protein occludin
includes differential splicing and alternative
promoter usage. Biochem Biophys Res
Commun 2002;298:657-66.
- Manning AP, Thompson WG, Heaton KW, et al.
Towards positive diagnosis of the irritable bowel.
Br Med J 1978;2:653-4.
- Marchiando AM, Graham WV, Turner JR.
Epithelial barriers in homeostasis and disease.
Annu Rev Pathol Mech Dis 2010;5:119-44.
- Marchiando AM, Shen L, Graham WV, et al.
Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is
required for TNF-induced tight junction regulation
in vivo. J Cell Biol 2010;189:111-26.
- Marshall JK, Thabane M, Garg AX, et al.
Intestinal permeability in patients with irritable
bowel syndrome after a waterborne outbreak of
acute gastroenteritis in Walkerton, Ontario.
Aliment Pharmacol Ther 2004;20:1317-22.
- Matter K, Balda MS. Epithelial tight junctions,
gene expression and nucleo-junctional interplay.
J Cell Sci 2007;120:1505-11.
- Mayer EA, Gebhart G. Basic and clinical aspects
of visceral hyperalgesia. Gastroenterology 1994;
107:271-93.
- Mayer EA, Naliboff BD, Chang L, et al. Stress and
irritable bowel syndrome. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol 2001;280:G519-24.
- Mayer EA. Clinical practice. Irritable bowel
syndrome. N Engl J Med 2008;358:1692-9.
- Mayer L. Mucosal immunity and gastrointestinal
antigen processing. J Pediatr Gastroenterol Nutr
2000;30:S4-S12.
- Mearin F, Pérez-Oliveras M, Perelló A, et al.
Dyspepsia and irritable bowel syndrome after a
Salmonella gastroenteritis outbreak: one-year
follow-up cohort study. Gastroenterology.
2005;129(1):98-104.
- Miyosi J, Takai Y. Structural and functional
associations of apical junctions with cytoskeleton.
Biochim Biophys Acta 2008;1778:670–91.
- Nicholl BL, Halder SL, Macfarlane GJ, et al.
Psychosocial risk markers for new onset irritable
bowel syndrome-results of a large prospective
population-based study. Pain 2008;137:147-55.
- 142 - BIBLIOGRAFÍA
- Niessen CM, Gottardi CJ. Molecular components
of the adherens junction. Biochim Biophys Acta
2008;1778:562–71.
- Nunbhakdi-Craig V, Machleidt T, Ogris E, et al.
Protein phosphatise 2A associates with and
regulates atypical PKC and the epithelial tight
junction complex. J Cell Biol 2002;158:967-78.
- Nusrat A, Turner JR, Madara JL. Molecular
physiology and pathophysiology of tight junctions.
IV. Regulation of tight junctions by extracellular
stimuli: nutrients, cytokines and immune cells.
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2000;
279:G851-7.
- Öhman L, Simrén M. Pathogenesis of IBS: role of
inflammation, immunity and neuroimmune
interactions. Nat Rev Gastroenterol Hepatol
2010;7:163-73.
- O'Malley D, Quigley EM, Dinan TG, et al. Do
interactions between stress and immune
responses lead to symptom exacerbations in
irritable bowel syndrome? Brain Behav Immun
2011 Apr 23. [Epub ahead of print]
- Park CH, Joo YE, Choi SK, et al. Activated mast
cells infiltrate in close proximity to enteric nerves
in diarrhea-predominant irritable bowel
syndrome. J Korean Med Sci 2003;18(2):204-10.
- Park KS, Ahn SH, Hwang JS, et al. A survey
about irritable bowel syndrome in South Korea:
prevalence and observable organic abnormalities
in IBS patients. Dig Dis Sci 2008;53:704-11.
- Piche T, Barbara G, Aubert P, et al. Impaired
intestinal barrier integrity in the colon of patients
with irritable bowel syndrome: involvement of
soluble mediators. Gut 2009;58(2):196-201.
- Powel N, Walker MM, Talley NJ. Gastrointestinal
eosinophils in health, disease and functional
disorders. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2010;
7(3):146-56.
- Prasad S, Mingrino R, Kaukinen K, et al.
Inflammatory processes have differential effects
on claudins 2, 3 and 4 in colonic epithelial cells.
Lab Invest 2005;85(9):1139-62.
- Qiu BS, Vallance BA, Blennerhassett PA, et al.
The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility
of mice to stress-induced reactivation of
experimental colitis. Nat Med 1999;5(10):1178-
82.
- Quigley EM. Disturbances of motility and visceral
hypersensitivity in irritable bowel syndrome:
biological markers or epiphenomenon.
Gastroenterol Clin North Am 2005;34(2):221-33.
- Rao R. Occludin phosphorylation in regulation of
epithelial tight junctions. Ann NY Acad Sci
2009;1165:62-8.
- Renes IB, Boshuizen JA, Van Nispen DJ, et al.
Alterations in Muc2 biosynthesis and secretion
during dextran sulfate sodium-induced colitis. Am
J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2002;
282(2):G382-9.
- Reya T, Clevers H. Wnt signalling in stem cells
and cancer. Nature 2005;434:843-50.
- Rosenthal R, Milatz S, Krug SM, et al. Claudin-2,
a component of the tight junction, forms a
paracellular water channel. J Cell Sci 2010;
123(Pt 11):1913-21.
- Saito YA. The role of genetics in IBS.
Gastroenterol Clin North Am. 2011;40(1):45-67.
- Sakakibara A, Furuse M, Saitou M, et al. Possible
involvement of phosphorylation of occludin in tight
junction formation. J Cell Biol 1997;137:1393-401.
- Santos J, Saperas E, Nogueiras C, et al. Release
of mast cell mediators into the jejunum by cold
pain stress in humans. Gastroenterology
1998;114:640-48.
- Santos J, Saunders PR, Hanssen NP, et al.
Corticotropin-releasing hormone mimics stress-
induced colonic epithelial pathophysiology in the
rat. Am J Physiol 1999;277(2 Pt 1):G391-9.
- Santos J, Benjamin M, Yang PC, et al. Chronic
stress impairs rat growth and jejunal epithelial
barrier function: role of mast cells. Am J Physiol
Gastrointest Liver Physiol 2000;278(6):G847-54.
- Santos J, Yang PC, Soderholm JD, et al. Role of
mast cells in chronic stress induced colonic
BIBLIOGRAFÍA - 143 -
epithelial barrier dysfunction in the rat. Gut
2001;48:630-6.
- Santos J, Bienenstock J, Perdue MH. Innervation
of lymphoid tissue and functional consequences
of neurotransmitter and neuropeptide release.
Food Allergy and Intolerance. J Brostoff & SJ
Challacombe, eds, London: WB Saunders. pp51-
67.
- Schulzke JD, Gitter AH, Mankertz J, et al.
Epithelial transport and barrier function in
occludin-deficient mice. Biochim Biophys Acta
2005;1669(1):34-42.
- Schulzke JD, Bojarski C, Zeissig S, et al.
Disrupted barrier function through epithelial cell
apoptosis. Ann NY Acad Sci 2006;1072:288-99.
- Seminowicz DA, Labus JS, Bueller JA, et al.
Regional gray matter density changes in brains of
patients with irritable bowel syndrome.
Gastroenterology. 2010;139(1):48-57.
- Serra J, Azpiroz F, Malagelada JR. Impaired
transit and tolerance of intestinal gas in the
irritable bowel syndrome. Gut. 2001;48(1):14-9.
- Seth A, Sheth P, Elias BC, et al. Protein
phosphatases 2A and 1 interact with occludin
and negatively regulate the assembly of tight
junctions in the CACO-2 cell monolayer. J Biol
Chem 2007;282(15):11487-98.
- Shen L, Black ED, Witkowski ED, et al. Myosin
light chain phosphorylation regulates barrier
function by remodeling tight junction structure. J
Cell Sci 2006;119:2095-106.
- Shen L, Turner JR. Role of epithelial cells in
initiation and propagation of intestinal
inflammation. Eliminating the static: tight junction
dynamics exposed. Am J Physiol Gastrointest
Liver Physiol 2006;290(4):G577-82.
- Simonovic I, Rosenberg J, Koutsouris A, et al.
Enteropathogenic E. coli dephosphorylates and
dissociates occludin from intestinal epithelial tight
junctions. Cell Microbiol 2000;2(4):305-15.
- Simrén M, Abrahamsson H, Björnsson ES. An
exaggerated sensory component of the
gastrocolonic response in patients with irritable
bowel syndrome. Gut 2001;48:20-7.
- Simrén M, Abrahamsson H, Björnsson ES. Lipid-
induced colonic hypersensitivity in the irritable
bowel syndrome: the role of bowel habit, sex and
psychologic factors. Clin Gastroenterol Hepatol
2007a;5:201-8.
- Simrén M, Agerforz P, Björnsson ES, et al.
Nutrient dependent enhancement of rectal
sensitivity in irritable bowel syndrome.
2007b;19:20-9.
- Sleisenger and Fordtran's Gastrointestinal and
Liver Disease, 9th Edition. Ed Saunders. 2010.
- Spiller RC, Jenkins D, Thornley JP, et al.
Increased rectal mucosal enteroendocrine cells, T
lymphocytes, and increased gut permeability
following acute Campylobacter enteritis and in
post-dysenteric irritable bowel syndrome. Gut
2000;47(6):804-11.
- Spiller R. Serotonin and GI clinical disorders.
Neuropharmacology 2008;55(6):1072-80.
- Spiller R, Garsed K. Postinfectious irritable bowel
syndrome. Gastroenterology 2009;136:1979-88.
- Steck N, Hoffmann M, Hew Ferstl CM, et al.
Bacterial proteases contribute to the development
of chronic intestinal inflammation by impairing
epithelial barrier function. Gastroenterology
2009;136(5),Suppl 1:A22.
- Stevenson BR, Anderson JM, Braun ID, et al.
Phosphorylation of the tight-junction protein ZO-1
in two strains of Madin-Darby canine kidney cells
which differ in transepithelial resistance. Biochem
J 1989;263(2):597-9.
- Su L, Shen L, Clayburgh DR, et al. Targeted
epithelial tight junction dysfunction causes
immune activation and contributes to
development of experimental colitis.
Gastroenterology 2009;136(2):551-63.
- Surawicz CM. Mechanisms of diarrhea. Curr
Gastroenterol Rep 2010;12(4):236-41.
- Taché Y, Martínez V, Wang L, et al. CRF1
signalling pathways are involved in stress-related
- 144 - BIBLIOGRAFÍA
alterations of colonic function and
viscerosensitivity: implications for irritable bowel
syndrome. Br J Pharmacol 2004;141:1321-30.
- Tamura A, Hayashi H, Imasato M, et al. Loss of
claudin-15 but not claudin-2, causes Na+
deficiency and glucose malabsorption in mouse
small intestine. Gastroenterology 2011;140:913-
23.
- Tana C, Umesaki Y, Imaoka A, et al. Altered
profiles of intestinal microbiota and organic acids
may be the origin of symptoms in irritable bowel
syndrome. J Neurogastroenterol Motil 2010;22(5)
512-9.
- Tanaka Y, Kanazawa M, Fukudo S et al.
Biopsychosocial model of irritable bowel
syndrome. J Neurogastroenterol Motil 2011;
17(2):131-9.
- Terry S, Nie M, Matter K, et al. Rho signaling and
tight junction functions. Physiology 2010;25(1):16
-26.
- Thabane M, Marshall JK. Post-infectious irritable
bowel syndrome. World J Gastroenterol 2009;
15(29):3591-6.
- Thompson WG, Creed FH, Drossman DA, et al.
Functional bowel disorders and functional
abdominal pain. Gastroenterol International
1992;5:75-91.
- Thompson WG, Longstreth GF, Drossman DA, et
al. Functional bowel disorders and functional
abdominal pain. Gut 1999;45(suppl 2):1143-47.
- Turner JR. Intestinal mucosal barrier function in
health and disease. Nat Rev Immunol 2009;9:799
-809.
- Umeda K, Ikenouchi J, Katahira-Tayama S, et al.
ZO-1 and ZO-2 independently determine where
claudins are polymerized in tight-junction strand
formation. Cell 2006;126(4):741-54.
- Utech M, Mennigen R, Bruewer M. Endocytosis
and recycling of tight junction proteins in
inflammation. J Biomed Biotechnol 2010;2010:
484987.
- Van Itallie CM, Anderson JM. Claudins and
epithelial paracellular transport. Annu Rev Physiol
2006;68:403-29.
- Vicario M, Guilarte M, Alonso C, et al.
Chronological assessment of mast cell-mediated
gut dysfunction and mucosal inflammation in a rat
model of chronic psychosocial stress. Brain
Behav Immun 2010;24(7):1166-75.
- Vicario M, Alonso C, Guilarte M, et al. Chronic
psychosocial stress induces reversible
mitochondrial damage and corticotropin-releasing
factor receptor type-1 upregulation in the rat
intestine and IBS-like gut dysfunction.
Psychoneuroendocrinology. 2011 Jun 3. [Epub
ahead of print]
- Wallon C, Yang PC, Keita AV, et al. Corticotropin
releasing hormone (CRH) regulates
macromolecular permeability via mast cells in
normal human colonic biopsies in vitro. Gut
2008;57:50-8.
- Wang F, Graham WV, Wang Y, et al. Interferon-
gamma and tumor necrosis factor-alpha
synergize to induce intestinal epithelial barrier
dysfunction by up-regulating myosin light chain
kinase expression. Am J Pathol 2005;166(2):409-
19.
- Weber CR, Raleigh DR, Su L, et al. Epithelial
myosin light chain kinase activation induces
mucosal interleukin-13 expression to alter tight
junction ion selectivity. J Biol Chem 2010;
285(16):12037-45.
- Whitehead WE, Crowell MD, Robinson JC, et al.
Effects of stressful life events on bowel
symptoms: subjects with irritable bowel syndrome
compared with subjects without bowel dysfunction
Gut 1992;3:825-30.
- Whitehead WE, Palsson O, Jones KR.
Systematic review of the comorbidity of irritable
bowel syndrome with other disorders: what are
the causes and implications? Gastroenterology
2002;122(4):1140-56.
- Williams JG, Roberts SE, Ali MF, et al.
Gastroenterology services in the UK. The burden
of disease, and the organisation and delivery of
BIBLIOGRAFÍA - 145 -
services for gastrointestinal and liver disorders: a
review of the evidence. Gut 2007;56(Suppl 1):1-
113.
- Wisner DM, Harris LR 3rd, Green CL, et al.
Opposing regulation of the tight junction protein
claudin-2 by interferon-gamma and interleukin-4.
J Surg Res 2008;144(1):1-7.
- Wood JD. Neuropathophysiology of functional
gastrointestinal disorders. World J Gastroenterol
2007;13(9):1313-32.
- Zeisig S, Bürgel N, Günzel D, et al. Changes in
expression and distribution of claudin 2, 5 and 8
lead to discontinous tight junctions and barrier
dysfunction in active Crohn’s disease. Gut
2007;56:61-72.
- Zhou Q, Zhang B, Verne GN. Intestinal
membrane permeability and hypersensitivity in
the irritable bowel syndrome. Pain 2009;146:41-
6.
AANNEEXXOO
ANEXO - 149 -
ANEXO
9. SUPPLEMENTARY MATERIAL FROM CHAPTER 1
9.1. SUPPLEMENTARY METHODS
9.1.1. Microarray analysis
Biopsies were homogenized in the FastPrep mixer (Bio101) in RLT cell lysis buffer
(Qiagen) followed by RNA isolation (RNeasy Mini Kit, Qiagen) and on-column DNase
treatment (Qiagen). Prior to gene array analysis, RNA quantity and quality were
confirmed by capillary electrophoresis (Agilent 2100 Bioanalyzer; Agilent
Technologies). Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133 Plus 2.0 arrays
(Affymetrix) were used for expression profiling, following general procedures. The
images were captured using Affymetrix Genechip Scanner 3000. The resulting images
were processed with Microarray Analysis Suite 5.0 (Affymetrix). Raw expression values
obtained directly from CEL files were pre-processed using the RMA (Robust Multi-chip
Average) method1. The complete dataset is available at the NCBI Gene Expression
Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; accession number GSE14841).
9.1.2. Statistical analysis of microarray data
For microarray data, we used the open source R statistical software package
(http://www.r-project.org) and the libraries developed by the Bioconductor Project
(www.bioconductor.org). Main methods and tools have been described by Gentleman
et al2. The selection of differentially expressed genes between conditions was based
on a linear model analysis with empirical Bayes moderation of the variance estimates3.
To control errors derived from multiple simultaneous testing (one per gene), P-values
were adjusted to obtain strong control over the “false discovery rate” (FDR) using the
Benjamini and Hochberg method4.
- 150 - ANEXO
To get further insight of the biological relevance of our findings and to discover
associations between different groups of variables, we performed an integrative
multivariate analysis based on a Multiple Factor Analysis (MFA)5,6 combining
microarray expression data and epidemiological, clinical and histological (ECH)
variables. The core of these methods is a principal component analysis (PCA) with
supplementary quantitative and qualitative variables, which reduces the dimensionality
of a dataset with a large number of interrelated variables into a smaller number of
independent variables called principal components. First principal component retains
as much as possible of the variability present in the data, and each succeeding
component retains as much of the remaining variability, but always less variability than
the previous component7. The integrative multivariate analysis disclosed two types of
PCA plots, the correlation circle, which includes the quantitative ECH variables; and
individual factor maps, with the categorical ECH variables. Both types of graphics show
the distribution of the data according to the same two axes representing the first and
second components obtained after PCA analysis.
9.1.3. Ingenuity pathway analysis (IPA)
For network analysis, IPA computed a score (p-score=-log10(p-value)) according to
the fit of the set of supplied focus genes and a list of biological functions stored in the
IPKB. The score takes into account the number of focus genes in the network and the
size of the network to approximate how relevant this network is to the original list of
focus genes and allows the networks to be prioritized for further studies. A score >3
(p<0.001) indicates a >99.9% confidence that a focus gene network was not generated
by chance alone. The network identified is presented as a graph indicating the
molecular relationships between genes/gene products.
ANEXO - 151 -
The functional analysis identified biological functions and canonical signaling
pathways most significant to the data set. The significance of the association between
the data set and functions/pathways was determined based on two parameters: (1)
ratio of the number of genes from the data set that map to the function/pathway divided
by the total number of genes that map to the function/pathway and (2) a P-value
calculated using Fischer’s exact test determining the probability that the association
between the dataset and the function/pathway is explained by chance alone.
9.2. Supplementary References
1. Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, et al. Exploration,
normalization, and summaries of high density
oligonucleotide array probe level data. Biostatistics
2003;4:249-264.
2. Gentleman R, Carey V, Huber W, et al.
Bioinformatics and Computational Biology Solutions
using R and Bioconductor. Springer, New York, 2005.
3. Smyth GK. Linear models and empirical bayes
methods for assessing differential expression in
microarray experiments. Stat. Appl. Genet. Mol. Biol.
2004;3:article 3.
4. Benjamini Y and Hochberg Y. Controlling the
false discovery rate: A practical and powerful approach
to multiple testing. J. Roy. Statist. Soc. B. 1995;85:289-
300.
5. Escofier B and Pagès J. Analyses factorielles
simples et multiples. Objetifs, methodes et interpretation.
3rd ed. Dunod; Paris, 1998.
6. Lê S, Josse J and Husson F. FactoMineR: An R
package for multivariate analysis. J. Stat. Softw.
2008;25:1-18.
7. Jolliffe IT. Principal Component Analysis. Second
Edition. Springer Series in Statistics. Springer-Verlag,
2002.
- 152 - ANEXO
9.2. SUPPLEMENTARY FIGURES AND TABLES
9.2.1. Supplementary table 1. Gene expression assays (GEA) used for Q-RT-PCR.
ANEXO - 153 -
9.
2.2.
Sup
plem
enta
ry ta
ble
2.In
divi
dual
cou
nts
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Hpf
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fiel
d.
- 154 - ANEXO
9.2.3. Supplementary table 3. Differentially expressed transcripts in IBS-D patients
compared with the healthy volunteer (H) group. Entrez and Affymetrix accession number of
genes and their fold change expression in IBS-D with respect to H are indicated. P-values were
adjusted to obtain strong control over the “false discovery rate” (FDR) using the Benjamini and
Hochberg method.
EntrezID affyIDs Gene Symbol Fold Change P-Value FDR-adjusted P-Value
55269 226574_at PSPC1 1,87 0,000004 0,005 78993 229741_at MGC3260 1,89 0,000004 0,005 238918_at 0,54 0,000005 0,005 8125 201043_s_at ANP32A 0,28 0,000006 0,005 7531 210317_s_at YWHAE 0,34 0,000007 0,005 9877 243648_at ZC3H11A 2,81 0,00001 0,01 9685 230609_at CLINT1 0,51 0,00001 0,01 3191 35201_at HNRNPL 2,06 0,00002 0,01 1314 214336_s_at COPA 0,28 0,00002 0,01 85455 229579_s_at DISP2 2,22 0,00002 0,01 830 201237_at CAPZA2 1,68 0,00003 0,01 64787 222546_s_at EPS8L2 0,38 0,00003 0,01 1553575_at 2,19 0,00003 0,01 51582 213747_at AZIN1 0,42 0,00003 0,01 5878 201156_s_at RAB5C 0,52 0,00005 0,01 10611 211681_s_at PDLIM5 0,43 0,0001 0,01 3177 1560062_at SLC29A2 2,01 0,0001 0,01 659 231873_at BMPR2 0,57 0,0001 0,01 91304 213986_s_at C19orf6 0,42 0,0001 0,01 6564 207254_at SLC15A1 1,83 0,0001 0,01 23428 216604_s_at SLC7A8 0,47 0,0001 0,01 23516 1555434_a_at SLC39A14 0,35 0,0001 0,01 8289 210649_s_at ARID1A 0,57 0,0001 0,01 51322 219679_s_at WAC 0,53 0,0001 0,01 23060 1559401_a_at ZNF609 0,60 0,0001 0,01 229713_at 0,55 0,0001 0,01 1200 214196_s_at TPP1 0,56 0,0001 0,02 6734 200917_s_at SRPR 0,48 0,0001 0,02 212103_at 1,73 0,0001 0,02 228919_at 2,30 0,0001 0,02 57447 214279_s_at NDRG2 0,40 0,0001 0,02 5284 226147_s_at PIGR 1,65 0,0001 0,02 1636 209749_s_at ACE 0,47 0,0002 0,02 2017 227473_at CTTN 0,53 0,0002 0,02
ANEXO - 155 -
145376 237654_at C14orf50 1,66 0,0002 0,02 5911 225585_at RAP2A 1,49 0,0002 0,02 56993 222474_s_at TOMM22 1,65 0,0002 0,02 972 1567628_at CD74 0,46 0,0002 0,02 5343 238875_at PLGLB1 0,59 0,0002 0,02 221037 224933_s_at JMJD1C 0,54 0,0002 0,02 678 201367_s_at ZFP36L2 0,51 0,0002 0,02 29927 222385_x_at SEC61A1 0,49 0,0002 0,02 9039 1556338_at UBA3 0,60 0,0002 0,02 236219_at 1,74 0,0002 0,02 81688 213872_at C6orf62 0,49 0,0002 0,02 23117 211996_s_at LOC23117 1,89 0,0002 0,02 6654 229261_at SOS1 0,56 0,0002 0,02 84189 232176_at SLITRK6 1,66 0,0002 0,02 114876 208158_s_at OSBPL1A 1,58 0,0002 0,02 79064 220934_s_at MGC3196 1,82 0,0003 0,02 23196 1555945_s_at FAM120A 1,61 0,0003 0,02 10611 203242_s_at PDLIM5 0,55 0,0003 0,02 23389 216109_at MED13L 0,60 0,0003 0,02 4289 235067_at MKLN1 0,63 0,0003 0,02 9749 242277_at PHACTR2 0,57 0,0003 0,02 5725 212016_s_at PTBP1 0,58 0,0003 0,02 25791 243556_at NGEF 0,47 0,0003 0,02 5530 202425_x_at PPP3CA 1,52 0,0003 0,02 93010 1555963_x_at B3GNT7 1,74 0,0003 0,02 4094 209347_s_at MAF 0,45 0,0003 0,02 22906 226013_at TRAK1 1,59 0,0003 0,02 2130 229966_at EWSR1 1,88 0,0003 0,02 6687 230885_at SPG7 1,85 0,0003 0,02 8550 1561937_x_at MAPKAPK5 0,31 0,0003 0,02 240180_at 0,57 0,0004 0,02 4154 1556657_at MBNL1 0,61 0,0004 0,02 57224 231034_s_at NHSL1 0,57 0,0004 0,02 10611 216804_s_at PDLIM5 0,61 0,0004 0,02 10180 228030_at RBM6 0,57 0,0004 0,02 3191 202072_at HNRNPL 2,03 0,0004 0,02 2052 202017_at EPHX1 0,49 0,0004 0,02 9948 210935_s_at WDR1 0,39 0,0004 0,02 23185 228196_s_at LARP5 0,49 0,0004 0,02 23428 216603_at SLC7A8 0,53 0,0004 0,02 26027 1554938_a_at ACOT11 0,61 0,0004 0,02 3685 236251_at ITGAV 0,58 0,0004 0,02 811 214315_x_at CALR 0,66 0,0005 0,02 481 201243_s_at ATP1B1 1,60 0,0005 0,02
- 156 - ANEXO
93010 1555962_at B3GNT7 1,69 0,0005 0,02 2618 230097_at GART 0,63 0,0005 0,02 2150 206429_at F2RL1 0,53 0,0005 0,02 56995 218184_at TULP4 1,53 0,001 0,02 79683 219247_s_at ZDHHC14 1,54 0,001 0,02 682 208677_s_at BSG 0,51 0,001 0,02 2746 200947_s_at GLUD1 1,66 0,001 0,02 7422 211527_x_at VEGFA 0,63 0,001 0,02 85315 227626_at PAQR8 2,04 0,001 0,02 216908_x_at 0,63 0,001 0,02 7644 206059_at ZNF91 0,66 0,001 0,02 338 223579_s_at APOB 0,41 0,001 0,02 2065 1563253_s_at ERBB3 0,56 0,001 0,02 57234 227383_at FAM91A2 0,63 0,001 0,02 9112 211783_s_at MTA1 1,66 0,001 0,02 2934 214040_s_at GSN 0,55 0,001 0,02 3291 204130_at HSD11B2 1,83 0,001 0,02 244354_at 0,66 0,001 0,02 29881 224305_s_at NPC1L1 0,50 0,001 0,02 4170 200796_s_at MCL1 0,40 0,001 0,02 51133 241903_at KCTD3 0,64 0,001 0,02 1495 1558214_s_at CTNNA1 0,43 0,001 0,02 55258 219044_at THNSL2 2,30 0,001 0,02 243386_at 1,56 0,001 0,02 7086 208699_x_at TKT 0,62 0,001 0,02 89866 1564423_a_at SEC16B 0,51 0,001 0,02 92482 228993_s_at LOC92482 0,57 0,001 0,03 7798 1558173_a_at LUZP1 1,92 0,001 0,03 5284 229659_s_at PIGR 0,51 0,001 0,03 6428 232392_at SFRS3 0,64 0,001 0,03 236685_at 0,66 0,001 0,03 90187 228307_at EMILIN3 0,57 0,001 0,03 220494_s_at 0,62 0,001 0,03 6822 206292_s_at SULT2A1 0,53 0,001 0,03 55684 225377_at C9orf86 1,80 0,001 0,03 10944 235526_at C11orf58 0,63 0,001 0,03 158405 235112_at KIAA1958 0,64 0,001 0,03 231174_s_at 0,53 0,001 0,03 26137 237803_x_at ZBTB20 0,57 0,001 0,03 55500 231576_at ETNK1 0,45 0,001 0,03 5870 239445_at RAB6A 0,60 0,001 0,03 55122 223144_s_at C6orf166 1,51 0,001 0,03 57466 243759_at SFRS15 0,59 0,001 0,03 153222 225956_at C5orf41 0,65 0,001 0,03
ANEXO - 157 -
57019 208424_s_at CIAPIN1 1,53 0,001 0,03 8566 218019_s_at PDXK 1,55 0,001 0,03 5527 1557718_at PPP2R5C 0,63 0,001 0,03 283991 224785_at FAM100B 0,63 0,001 0,03 51090 204519_s_at PLLP 1,52 0,001 0,03 283131 238320_at TncRNA 0,30 0,001 0,03 645166 228158_at LOC645166 1,82 0,001 0,03 10370 207980_s_at CITED2 0,59 0,001 0,03 7039 205016_at TGFA 1,55 0,001 0,03 166647 1569542_at GPR125 0,59 0,001 0,03 92 244332_at ACVR2A 0,64 0,001 0,03 5074 204004_at PAWR 0,70 0,001 0,03 148867 243524_at SLC30A7 0,66 0,001 0,03 916 205456_at CD3E 0,61 0,001 0,03 7072 1558922_at TIA1 0,65 0,001 0,03 6431 206108_s_at SFRS6 2,83 0,001 0,03 9520 201454_s_at NPEPPS 1,49 0,001 0,03 64163 214801_at IFRG15 1,44 0,001 0,03 5734 204896_s_at PTGER4 0,54 0,001 0,03 243495_s_at 0,37 0,001 0,03 4008 242722_at LMO7 1,67 0,001 0,03 5286 1553694_a_at PIK3C2A 0,55 0,001 0,03 7082 243184_at TJP1 0,64 0,001 0,03 800 201616_s_at CALD1 0,65 0,001 0,03 29035 225197_at C16orf72 1,47 0,001 0,03 51312 226179_at SLC25A37 2,22 0,001 0,03 238956_at 1,60 0,001 0,03 167153 238706_at PAPD4 0,63 0,001 0,03 164091 242123_at PAQR7 1,82 0,001 0,03 2055 223912_s_at CLN8 0,63 0,001 0,03 5286 226094_at PIK3C2A 0,67 0,001 0,03 84364 238161_at ARFGAP2 0,61 0,001 0,03 10682 202735_at EBP 1,53 0,001 0,03 6238 201206_s_at RRBP1 1,66 0,001 0,03 54897 232699_at CASZ1 1,74 0,001 0,03 56894 224282_s_at AGPAT3 0,56 0,001 0,03 6446 201739_at SGK1 2,01 0,001 0,03 79148 239272_at MMP28 1,84 0,001 0,03 10055 1555618_s_at SAE1 0,63 0,001 0,03 57599 222157_s_at WDR48 0,63 0,001 0,03 10613 202444_s_at ERLIN1 0,59 0,001 0,03 23543 213901_x_at RBM9 0,59 0,001 0,03 54896 1555781_at PQLC2 1,67 0,001 0,03 1778 229115_at DYNC1H1 1,88 0,001 0,03
- 158 - ANEXO
55970 222834_s_at GNG12 1,82 0,001 0,03 9927 216205_s_at MFN2 0,49 0,001 0,03 26118 227501_at WSB1 0,59 0,001 0,03 6314 209964_s_at ATXN7 0,65 0,001 0,03 80736 1555203_s_at SLC44A4 0,43 0,001 0,03 143098 238778_at MPP7 1,49 0,001 0,03 7586 214670_at ZKSCAN1 0,68 0,001 0,03 378938 224567_x_at MALAT1 1,83 0,001 0,03 54584 226204_at GNB1L 1,55 0,001 0,03 10097 1558015_s_at ACTR2 0,45 0,001 0,03 440556 242269_at FLJ42875 1,61 0,001 0,03 567 232311_at B2M 1,57 0,001 0,03 54904 242968_at WHSC1L1 0,63 0,001 0,03 3954 222006_at LETM1 1,53 0,001 0,03 85315 226423_at PAQR8 1,65 0,001 0,03 647305 1566472_s_at LOC647305 0,63 0,002 0,03 64398 219321_at MPP5 0,68 0,002 0,03 1455 202573_at CSNK1G2 1,51 0,002 0,03 93589 228083_at CACNA2D4 1,59 0,002 0,03 3172 236652_at HNF4A 2,39 0,002 0,03 25945 241970_at PVRL3 0,59 0,002 0,03 4149 210734_x_at MAX 0,64 0,002 0,03 4076 200722_s_at CAPRIN1 0,59 0,002 0,03 116138 214383_x_at KLHDC3 0,65 0,002 0,03 8490 1555725_a_at RGS5 0,54 0,002 0,03 23043 213109_at TNIK 1,55 0,002 0,03 9589 227621_at WTAP 0,67 0,002 0,03 9223 225465_at MAGI1 1,71 0,002 0,03 988 209055_s_at CDC5L 0,66 0,002 0,03 22978 243158_at NT5C2 0,63 0,002 0,03 23554 230626_at TSPAN12 1,65 0,002 0,03 54665 222791_at RSBN1 0,65 0,002 0,03 232527_at 0,68 0,002 0,03 10207 223681_s_at INADL 1,43 0,002 0,03 2113 241435_at ETS1 0,65 0,002 0,03 253260 237330_at RICTOR 0,65 0,002 0,03 55502 226446_at HES6 1,46 0,002 0,03 3998 203294_s_at LMAN1 0,50 0,002 0,03 2528 211885_x_at FUT6 0,62 0,002 0,03 6934 232522_at TCF7L2 0,68 0,002 0,03 122970 229534_at ACOT4 1,79 0,002 0,03 535 205095_s_at ATP6V0A1 0,64 0,002 0,03 1942 202023_at EFNA1 0,65 0,002 0,03 9522 212417_at SCAMP1 1,66 0,002 0,03
ANEXO - 159 -
80704 220736_at SLC19A3 0,56 0,002 0,03 230795_at 0,59 0,002 0,03 124975 236225_at GGT6 1,71 0,002 0,03 60313 1569320_at GPBP1L1 0,66 0,002 0,03 9414 232017_at TJP2 0,64 0,002 0,03 3183 200751_s_at HNRNPC 0,66 0,002 0,03 11252 1554691_a_at PACSIN2 0,61 0,002 0,03 10963 212009_s_at STIP1 0,57 0,002 0,03 7422 210513_s_at VEGFA 0,66 0,002 0,03 665 221479_s_at BNIP3L 1,49 0,002 0,03 2063 209261_s_at NR2F6 0,65 0,002 0,03 57466 222311_s_at SFRS15 0,69 0,002 0,03 4077 201383_s_at NBR1 0,64 0,002 0,03 4901 242993_at NRL 1,74 0,002 0,03 54700 216902_s_at RRN3 0,57 0,002 0,03 11309 211557_x_at SLCO2B1 0,69 0,002 0,03 1499 1554411_at CTNNB1 2,20 0,002 0,03 401466 1555241_at C8orf59 1,51 0,002 0,03 10204 202397_at NUTF2 1,46 0,002 0,03 401261 1559964_at FLJ38717 0,67 0,002 0,04 55608 227260_at ANKRD10 0,51 0,002 0,04 10299 201737_s_at MARCH6 0,67 0,002 0,04 57556 215028_at SEMA6A 0,50 0,002 0,04 360 39249_at AQP3 0,66 0,002 0,04 4012 231866_at LNPEP 0,65 0,002 0,04 9058 239805_at SLC13A2 1,65 0,002 0,04 56994 1559739_at CHPT1 0,66 0,002 0,04 116540 225523_at MRPL53 1,43 0,002 0,04 4116 210092_at MAGOH 0,65 0,002 0,04 284443 1558486_at ZNF493 0,64 0,002 0,04 1499 201533_at CTNNB1 1,46 0,002 0,04 84934 44065_at C12orf52 1,57 0,002 0,04 202915 1558281_a_at TMEM184A 1,91 0,002 0,04 84062 223446_s_at DTNBP1 0,68 0,003 0,04 232325_at 1,53 0,003 0,04 84134 226059_at TOMM40L 1,52 0,003 0,04 6934 233689_at TCF7L2 0,65 0,003 0,04 3958 1557197_a_at LGALS3 2,22 0,003 0,04 7559 1559881_s_at ZNF12 0,71 0,003 0,04 79085 226010_at SLC25A23 1,55 0,003 0,04 2530 203988_s_at FUT8 1,58 0,003 0,04 8675 1558249_s_at STX16 0,68 0,003 0,04 4486 205455_at MST1R 1,59 0,003 0,04 213549_at 1,55 0,003 0,04
- 160 - ANEXO
9121 206600_s_at SLC16A5 1,61 0,003 0,04 9245 219508_at GCNT3 1,54 0,003 0,04 643854 215549_x_at hCG_2030429 0,66 0,003 0,04 9910 232702_at RABGAP1L 0,64 0,003 0,04 5878 201140_s_at RAB5C 0,63 0,003 0,04 230958_s_at 0,64 0,003 0,04 4299 237006_at AFF1 0,67 0,003 0,04 51099 213805_at ABHD5 0,52 0,003 0,04 9554 214257_s_at SEC22B 0,66 0,003 0,04 3557 212657_s_at IL1RN 1,91 0,003 0,04 8792 238846_at TNFRSF11A 1,55 0,003 0,04 5887 201222_s_at RAD23B 0,60 0,003 0,04 1398 202226_s_at CRK 0,67 0,003 0,04 6668 235282_at SP2 1,48 0,003 0,04 9099 229337_at USP2 1,54 0,003 0,04 8773 229773_at SNAP23 0,59 0,003 0,04 8543 209205_s_at LMO4 1,59 0,003 0,04 114793 226184_at FMNL2 1,61 0,003 0,04 227959_at 1,61 0,003 0,04 378938 226675_s_at MALAT1 1,72 0,003 0,04 6240 201476_s_at RRM1 0,61 0,003 0,04 55500 242059_at ETNK1 0,55 0,003 0,04 10097 1554390_s_at ACTR2 0,56 0,003 0,04 10746 221695_s_at MAP3K2 0,67 0,003 0,04 843 205467_at CASP10 1,42 0,003 0,04 1558236_at 1,53 0,003 0,04 56882 229120_s_at CDC42SE1 1,41 0,003 0,04 54530 1564164_at C1orf218 0,66 0,003 0,04 5795 227396_at PTPRJ 1,45 0,003 0,04 10390 219375_at CEPT1 1,41 0,003 0,04 51107 1554417_s_at APH1A 0,65 0,003 0,04 255743 244747_at NPNT 0,64 0,003 0,04 158158 1553986_at RASEF 0,60 0,003 0,04 80351 222562_s_at TNKS2 0,67 0,003 0,04 51554 220351_at CCRL1 1,59 0,003 0,04 228478_at 0,65 0,003 0,04 81611 229128_s_at ANP32E 0,48 0,003 0,04 27086 241993_x_at FOXP1 0,68 0,003 0,04 120 201753_s_at ADD3 0,63 0,003 0,04 55331 222689_at PHCA 1,47 0,003 0,04 55696 222527_s_at RBM22 0,69 0,003 0,04 10144 232628_at FAM13A1 0,61 0,004 0,04 116224 241948_at FAM122A 0,65 0,004 0,04 284266 215856_at SIGLEC15 1,83 0,004 0,04
ANEXO - 161 -
5030 242337_at P2RY4 1,80 0,004 0,04 232687_at 0,59 0,004 0,04 286077 226129_at FAM83H 1,55 0,004 0,04 5757 211921_x_at PTMA 1,48 0,004 0,04 2195 201579_at FAT 1,43 0,004 0,04 2355 228188_at FOSL2 1,47 0,004 0,04 8490 209071_s_at RGS5 0,67 0,004 0,04 4035 200785_s_at LRP1 1,47 0,004 0,04 8490 209070_s_at RGS5 0,64 0,004 0,04 4924 200646_s_at NUCB1 0,66 0,004 0,04 80704 239345_at SLC19A3 0,65 0,004 0,04 130399 1552519_at ACVR1C 0,65 0,004 0,04 6654 212777_at SOS1 0,59 0,004 0,04 6713 213577_at SQLE 1,45 0,004 0,04 27086 223287_s_at FOXP1 0,68 0,004 0,05 64062 218422_s_at RBM26 1,55 0,004 0,05 23288 204202_at IQCE 1,61 0,004 0,05 22820 217749_at COPG 1,41 0,004 0,05 1906 218995_s_at EDN1 0,65 0,004 0,05 7011 205727_at TEP1 1,57 0,004 0,05 378805 238619_at FLJ43663 0,71 0,004 0,05 23022 200906_s_at PALLD 1,59 0,004 0,05 10548 209149_s_at TM9SF1 0,67 0,004 0,05 6822 206293_at SULT2A1 0,61 0,004 0,05 3309 230031_at HSPA5 1,59 0,004 0,05 64771 217924_at C6orf106 0,66 0,004 0,05 51201 222731_at ZDHHC2 1,83 0,004 0,05 144871 225284_at LOC144871 1,38 0,004 0,05 6667 1553685_s_at SP1 0,55 0,004 0,05 1139 210123_s_at CHRNA7 0,66 0,004 0,05 50809 220633_s_at HP1BP3 0,71 0,004 0,05 152485 226764_at ZNF827 1,91 0,004 0,05 55893 239619_at ZNF395 0,66 0,004 0,05 3703 202223_at STT3A 1,60 0,004 0,05 10521 230180_at DDX17 1,73 0,004 0,05 375 208750_s_at ARF1 0,62 0,004 0,05 4641 32811_at MYO1C 1,43 0,004 0,05 3437 204747_at IFIT3 0,68 0,004 0,05 4967 1554152_a_at OGDH 0,49 0,004 0,05 9414 1565863_at TJP2 0,59 0,004 0,05 58480 223169_s_at RHOU 0,66 0,004 0,05 8106 201545_s_at PABPN1 1,56 0,004 0,05 5500 228222_at PPP1CB 0,64 0,004 0,05 55500 226432_at ETNK1 0,66 0,004 0,05
- 162 - ANEXO
9331 235333_at B4GALT6 1,44 0,005 0,05 84542 243539_at KIAA1841 1,39 0,005 0,05 441454 208549_x_at LOC441454 1,45 0,005 0,05 10097 200727_s_at ACTR2 0,55 0,005 0,05 4735 1554747_a_at SEPT2 0,64 0,005 0,05 84759 210023_s_at PCGF1 0,71 0,005 0,05 3326 1557910_at HSP90AB1 0,55 0,005 0,05 56894 219723_x_at AGPAT3 0,66 0,005 0,05 5692 228204_at PSMB4 0,71 0,005 0,05 1739 217208_s_at DLG1 0,57 0,005 0,05 3685 232797_at ITGAV 0,66 0,005 0,05 2309 204132_s_at FOXO3 0,70 0,005 0,05 378938 228582_x_at MALAT1 0,47 0,005 0,05 7775 219123_at ZNF232 1,49 0,005 0,05 23112 230779_at TNRC6B 0,65 0,005 0,05 23389 238883_at MED13L 0,70 0,005 0,05 1564077_at 0,64 0,005 0,05 2935 240452_at GSPT1 0,68 0,005 0,05 227576_at 0,69 0,005 0,05 79109 229846_s_at MAPKAP1 0,66 0,005 0,05 3709 216614_at ITPR2 0,66 0,005 0,05 114224 223797_at PRO2852 0,69 0,005 0,05 26578 204479_at OSTF1 1,52 0,005 0,05 29894 201639_s_at CPSF1 1,59 0,005 0,05 5880 207419_s_at RAC2 0,63 0,005 0,05 2872 223199_at MKNK2 1,51 0,005 0,05 55333 235722_at SYNJ2BP 1,46 0,01 0,05 7837 212013_at PXDN 1,72 0,01 0,05 171586 241940_at ABHD3 0,64 0,01 0,05 51274 225140_at KLF3 0,61 0,01 0,05 56882 218157_x_at CDC42SE1 1,41 0,01 0,05 5757 200772_x_at PTMA 1,49 0,01 0,05 3643 226216_at INSR 1,53 0,01 0,05 523 201971_s_at ATP6V1A 0,58 0,01 0,05 11325 1559954_s_at DDX42 0,57 0,01 0,05 51290 226422_at ERGIC2 1,40 0,01 0,05 55847 218597_s_at CISD1 1,56 0,01 0,05
ANEXO - 163 -
9.2.4. Supplementary Figure 1. Quantitative real time PCR validation of microarray data.
Level of expression for 14 randomly selected genes (7 up-regulated and 7 down-regulated) was
measured in 12 healthy volunteers and 17 IBS-D patients. Randomization was performed using
a standard random number generator (a linear congruential generator was used to generate
uniform random values, followed by a transformation to obtain integer values in a set with the
same size as the number of genes). *P<0.05.
- 164 - ANEXO
9.2.5. Supplementary table 4. All networks identified associated to the IBS-D
transcripcional profile Network IDs are assigned based on the network score. The network
score is based on the hypergeometric distribution and is calculated with the right-tailed Fisher’s
Exact Test. The number of focus genes in each network is also indicated. The three most
significant functions for each network are also listed.
ID Genes in Network Score Focus Genes
Top Functions
1 Actin, ANP32A, BNIP3L, CASP10, Caspase, CD74, Coup-Tf, DYNC1H1, EPS8L2, F2RL1, FOXO3, Glycogen synthase, GSN, GSPT1, hCG, HNRNPC, HNRNPL, HSD11B2, KLF3, LETM1, MCL1, NFkB (complex), NR2F6, PAWR, peptidase, PP2A, PPP2R5C, PTBP1, RAB6A, Rxr, SGK1, SP1, SULT2A1, TPP1, WTAP
44 26 Cell Death, Immunological Disease, Digestive System Development
2 Akt, Alpha Actinin, APOB, BSG, Calcineurin protein(s), CALD1, Calmodulin, CALR, CaMKII, CD3E, CHRNA7, CTNNA1, CTNNB1, DDX17, DLG1, F Actin, GPR125, Guk, Hsp90, HSP90AB1, IKK, INADL (includes EG:10207), LMO7, MAGI1, MPP5, MPP7, MST1R, PALLD, PPP3CA, Proteasome, STIP1, TCF7L2 (includes EG:6934), TIA1, TJP1, TJP2
40 25 Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Cellular Assembly and Organization, Cellular Function and Maintenance
3 ACVR2A, AQP3, B2M, C12ORF52, Creb, Cyclin A, E2f, ERBB3, ERK1/2, FSH, Histone h3, Histone h4, HNF4A, IFIT3, IL1RN, Insulin, LDL, LNPEP, Mapk, MRPL53, NDRG2, PDXK, Pka, Pkc(s), Pld, RAB5C, RBM6, RGS5, SAE1, SCAMP1, SLC19A3, SNAP23, TNKS2, Vegf, WDR1
32 21 Digestive System Development and Function, Inflammatory Disease, Cellular Assembly and Organization
4 BMPR2, CD3, CK1, Collagen(s), CRK, CSNK1G2, EFNA1, ERK, FOSL2, growth factor receptor, Ige, Integrin, ITGAV, Laminin, LGALS3, LMO4, MAP3K2, Mek, MFN2, MHC Class I, MKNK2, MTA1, OGDH, Pdgfr, PHACTR2, PTGER4, PTPRJ, Rap1, Ras, Ras homolog, Sos, SOS1, TCR, TGFA, TNFRSF11A
28 19 Cell Morphology, Tissue Morphology, Cellular Development
5 14-3-3, ACTR2, AMPK, ARF1, Ck2, COP I, COPA, COPG, Hsp70, IFN Beta, IL12, INSR, Interferon alpha, Jnk, LRP1, MAX, NUTF2, PI3K, PIK3C2A, PPP1CB, PSPC1, PTMA, RAD23B, RAP2A, RNA polymerase II, RRM1, Shc, STAT, STAT5a/b, SYNJ2BP, TNIK, tyrosine kinase, UBA3, Ubiquitin, YWHAE
28 19 Lipid Metabolism, Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry
ANEXO - 165 -
6 AGTR1, CAPZA2, CHPT1, EGFR, EWSR1, FUT8, G3BP2, GART, GPBP1L1, Hd-neuronal intranuclear inclusions, JMJD1C, KCTD3, MED13L, MIRN101B, MVK, NFYB, POLR1C, POU4F1, PVRL3, RRN3, SCAMP1, SFRS3, SFRS15, SNAPC1, STX16, TAF13, TAF1A, TAF1B, TAF1C, TBP, TEP1, TFAP4, TP53, TULP4, TWISTNB
23 17 Gene Expression, Cancer, Neurological Disease
7 APH1A (includes EG:51107), C6ORF62, C9ORF86, CDC5L, CISD1, ERLIN1, FASTKD2, GNB1L, HNF4A, MAGOH, MDFI (includes EG:4188), MIRN199A1, MRTO4, NAT13, NDUFA7, NPEPPS, NUDT11, PAN2 (includes EG:9924), PHPT1, PRCC, PRKAB1, REXO2, SEC61A1, SP2, SPG7, STT3A, TRAF6, UFM1, USP2, USP30, USP36, USP46, WBSCR22, WDR42A, ZNF764
20 15 RNA Damage and Repair, Cellular Development, Lipid Metabolism
8 ACVR2A, AKIRIN2, ANKRD10, ATXN1, AZIN1, BNIP3L, C5ORF41, CNBP, DDX42, DLGAP4, EMILIN3, FAM100B, FAM120A, HNRNPH1, MAT2A, MIRN339, MIRN17 (includes EG:406952), MIRN181A1, MIRN212 (includes EG:406994), MIRN291A (includes EG:100049715), MIRN298 (includes EG:723832), MIRN301A (includes EG:407027), MIRNLET7D (includes EG:406886), MNT, PABPN1, PAPOLG, PAQR8, RBM9, RICS, SLC2A1, TCOF1, TSPAN12, UBE3A, VAMP2, ZNF609
20 15 RNA Post-Transcriptional Modification, Developmental Disorder, Embryonic Development
9 ACE, ADD3, ALP, Ap1, CTTN, Dynamin, EDN1, ETS1, Fgf, GART, Hsp27, IgG, IL1, IRS, MAF, MAPKAPK5, Mmp, MMP28, Nfat, NGEF, NRL, P38 MAPK, PACSIN2, Pak, Pdgf, PDGF BB, PLA2, PLC gamma, Rac, RAC2, RHOU, Smad2/3, Tgf beta, TOMM22, VEGFA
20 16 Organismal Development, Cardiovascular System Development and Function, Skeletal and Muscular System Development and Function
10
ACVRL1, AHNAK, amino acids, ANGPTL4, BDKRB1, Ca2+, CAPRIN1, CDC42SE1, CFTR, CITED2, CLINT1, CNN3, COG7, FUT6, GLUD1, KLF16, LMAN1, MAPK6, MCFD2, P2RY4, PDLIM5, PDX1 (includes EG:3651), PHCA, PINK1, PRSS3 (includes EG:5646), PTPRK, RABGAP1L, RCN1, S100G, SLC39A14, SRPK1, STAT4, TGFB1, WHSC1L1, ZFP36L2
19 14 Amino Acid Metabolism, Post-Translational Modification, Small Molecule Biochemistry
11
ACVR1C, APOD, ATP12A, ATP1B1, BAZ1A, beta-estradiol, cholesterol, CNN1, DHX8, dihydrotestosterone, EPHX1, GNS, GPR172B, HES6, HOXA9, HSD17B2, MBNL1, MSMB, NCOA4, NPC1L1, OSTF1, PAQR7, PTPRG, PXDN, RRBP1, SLC25A37, SLC7A8, SMAD2, SRC, ST5, TGFBR3, TMF1, Type I Receptor, WSB1, ZNF91
19 14 Drug Metabolism, Endocrine System Development and Function, Lipid Metabolism
- 166 - ANEXO
12
ADIPOR1, ANGPTL4, ARPC3, ATP5G2, BPGM, CFL2, D-glucose, GAPDH (includes EG:14433), GH1, GRB2, GYS1, GYS2, INS1, LCK, LEP, LTA4H, LUZP1, MAFA, MIRN373, MYO1C, NDRG2, SEPT2, SLC13A2, SLC15A1, SLC25A11, SLC25A23, SLC29A2, SLC37A4, SLCO2B1, SRPR, steroid, THNSL2, TKT, WDR1, WDR48
19 14 Endocrine System Development and Function, Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry
13
ANP32A, ANP32E, ASGR1, ASGR2, CPSF1, DNAJ, DTNBP1 (includes EG:84062), ERN2, EVL, FOS, FOXP1, GCNT3, GTF2E1, HNF1A, HSPA5, HTT, LIPA, MIRN341, MIRN195 (includes EG:406971), MIRN300 (includes EG:723833), NBR1, NCK1, NQO1, NR1D1, PLLP, PRKCB, RBM26, RNASEN, SEL1L, SEMA6A, SNX3, SYMPK, TBCA, ZBTB20, ZNF827
17 13 Embryonic Development, Tissue Development, Gastrointestinal Disease
14
ABHD5, ACAA2, AGPAT3, ATP6, ATP5C1, ATP5D, ATP5G2, ATP5G3, ATP5O, ATP6V0A1, ATP6V0C, ATP6V0D2, ATP6V1A, ATP6V1C2, ATP6V1D, ATP6V1E1, ATP6V1F, ATP6V1G1, ATP6V1G3, ATP6V1H, C11ORF58, C16ORF72, EBP, ERBB2, FAM83H, H+-transporting two-sector ATPase, KLHDC3, LARP5, MIRN124, MIRN122 (includes EG:406906), NPNT, PGM1, SLC30A7, TCIRG1, YBX2
15 12 Molecular Transport, DNA Replication, Recombination, and Repair, Energy Production
15
ABCC2, Adaptor protein 1, B4GALT6, BDKRB2, CCL9, CCL19, CCL21, CCL25, CCL27, CCRL1, CIAPIN1, CXCL5, CXCL13, CYLD, FAT1, GNB4, GNG12, HLA-F, inosine, IRF3, LBP, LTB, MARCH6, nicotinic acid, NOS3, NT5C2, PIGR, SEC22B, SLC12A6, SLC16A5, SQLE, TFAP2C, TNF, ZDHHC2
15 12 Antigen Presentation, Hematological System Development and Function, Tissue Morphology
16
AFF1, butyric acid, CDC2L1 (includes EG:984), CEPT1, CLK1, CRKRS, EFTUD2, GAPDH (includes EG:14433), Ggt, GGT6, HADHB, HIST2H4A, HTATIP2, ITPR2, MAPKAP1, MKLN1, MYC, NUCB1, PCBP2, PNN, POLR1B, POLR2A, PRPF6, RNGTT, RNPS1, SFRS2, SFRS4, SFRS6, SFRS9, SFRS11, SRPK1, TNRC6B, TRAK1, UBQLN4, WAC
13 11 RNA Post-Transcriptional Modification, Cancer, Respiratory Disease
17
ARID1A, ARNT, ARNT2, ATXN7, BCL6, CASP7, CCND1, CD40LG, CDKN1A, EGFR, EP300, EPO, GATA2, HDAC1, HDAC2, HDAC7, IL5, IL10, JUN, NCOR1, NCOR2, NR3C1, OSBPL1A, PML, SIM1, SIN3A, SIRT1, SMAD3, SMARCD2, SP1, SP100, TGFB1, TP53, ZBTB16, ZDHHC14
4 5 Gene Expression, Cellular Development, Cellular Growth and Proliferation
ANEXO - 167 -
9.2.6. Supplementary table 5. Identified canonical pathways associated to the IBS-D
transcripcional profile. * Ratio: number of genes in the analysis that are associated with the
canonical pathway divided by the total number of genes that map to the canonical pathway. The
genes from the input data set that belong to each canonical pathway are also indicated.
Canonical Pathways P-value Ratio* Genes
Caveolar-mediated Endocytosis 0,0002 8,54E-02 B2M, RAB5C, COPA (includes EG:1314), ITGAV,
INSR, MAP3K2, COPG
Tight Junction Signaling 0,0006 5,49E-02 TJP2, PPP2R5C, MPP5, TJP1, PVRL3, CTNNA1,
CPSF1, INADL, CTNNB1
PTEN Signaling 0,0008 6,67E-02 RAC2, MAGI1, SOS1, FOXO3, BMPR2, INSR,
TNFRSF11A
Ephrin Receptor Signaling 0,002 4,62E-02 VEGFA, RAC2, ACTR2, NGEF, SOS1, CRK,
GNB1L, GNG12, EFNA1
ERK/MAPK Signaling 0,003 4,69E-02 ETS1, RAC2, PPP2R5C, PIK3C2A, SOS1,
MAPKAPK5, PPP1CB, CRK, MKNK2
Integrin Signaling 0,004 4,43E-02 RAC2, ACTR2, ARF1, PIK3C2A, SOS1, ITGAV,
RHOU, PPP1CB, RAP2A
Role of NFAT in Regulation of the Immune
Response 0,008 4,17E-02
CD3E, PIK3C2A, CSNK1G2, ITPR2, SOS1,
GNB1L, GNG12, PPP3CA
TGF-β Signaling 0,01 5,81E-02 SOS1, BMPR2, HNF4A, ACVR1C, ACVR2A
Regulation of Actin-based Motility by Rho 0,01 5,38E-02 RAC2, ACTR2, RHOU, PPP1CB, GSN
PI3K/AKT Signaling 0,01 4,38E-02 PPP2R5C, YWHAE, HSP90AB1, SOS1, FOXO3,
CTNNB1
VEGF Signaling 0,02 5,15E-02 VEGFA, YWHAE, PIK3C2A, SOS1, FOXO3
SAPK/JNK Signaling 0,02 5,21E-02 RAC2, PIK3C2A, SOS1, CRK, MAP3K2
PPAR Signaling 0,02 4,90E-02 HSP90AB1, IL1RN, SOS1, INSR, CITED2
- 168 - ANEXO
Antigen Presentation Pathway 0,02 7,69E-02 B2M, CALR, CD74
Axonal Guidance Signaling 0,02 2,97E-02
VEGFA, RAC2, ACTR2, NGEF, PIK3C2A, SOS1,
SEMA6A, CRK, GNB1L, GNG12, PPP3CA,
EFNA1
GM-CSF Signaling 0,02 5,97E-02 ETS1, PIK3C2A, SOS1, PPP3CA
Actin Cytoskeleton Signaling 0,02 3,38E-02 RAC2, ACTR2, PIK3C2A, SOS1, PPP1CB, CRK,
GSN, GNG12
Leukocyte Extravasation Signaling 0,03 3,59E-02 RAC2, MMP28, PIK3C2A, CTNNA1, CRK,
CTNNB1, CTTN
NF-κB Signaling 0,03 4,00E-02 PIK3C2A, IL1RN, TGFA, BMPR2, INSR,
TNFRSF11A
B Cell Receptor Signaling 0,04 3,87E-02 ETS1, RAC2, PIK3C2A, SOS1, PPP3CA,
MAP3K2
Clathrin-mediated Endocytosis 0,04 3,59E-02 VEGFA, ACTR2, PIK3C2A, RAB5C, CTTN,
PPP3CA
CD28 Signaling in T Helper Cells 0,04 4,00E-02 ACTR2, CD3E, PIK3C2A, ITPR2, PPP3CA
CCR3 Signaling in Eosinophils 0,04 4,13E-02 PIK3C2A, ITPR2, PPP1CB, GNB1L, GNG12
EGF Signaling 0,05 5,77E-02 PIK3C2A, ITPR2, SOS1
ANEXO - 169 -
9.2.7. Supplementary table 6. Coordinates for selected genes from the integrative
multivariate analysis. Genes that show a correlation >0.8 for component 1 in the correlations
circle and were selected for further analysis using IPA.
Gene Name Component 1 Component 2 238918_at 0.9 0.3 ANP32A 1.0 0.0 CLINT1 0.8 0.4 COPA 1.0 0.1
EPS8L2 0.8 0.4 RAB5C 0.9 0.0 C19orf6 0.9 0.3 SLC7A8 0.9 0.2 ARID1A 0.9 0.1
WAC 1.0 0.0 TPP1 0.9 0.2 SRPR 0.9 0.1
NDRG2 0.9 0.2 229261_at 0.9 0.0
MKLN1 0.9 0.1 PTBP1 0.9 0.4 NGEF 0.9 0.2
240180_at 0.9 0.2 WDR1 0.9 0.1
ACOT11 0.9 0.2 VEGFA 0.9 0.4
LOC730092 0.9 0.0 ZNF91 0.8 0.5 ERBB3 0.9 0.3
GSN 0.9 0.1 244354_at 0.9 0.1 NPC1L1 0.9 0.1
MCL1 0.9 0.1 SEC16B 0.9 0.3 SFRS3 0.9 0.0
235526_at 0.8 0.4 231174_s_at 0.8 0.4
C5orf41 0.9 0.3 FAM100B 0.9 0.1 CITED2 0.9 0.3
244332_at 0.9 0.3 204896_s_at 0.9 0.1 238161_at 0.9 0.1 AGPAT3 0.9 0.3
SAE1 0.9 0.2 WDR48 0.9 0.2 RBM9 0.9 0.2 MFN2 1.0 0.1
227501_at 0.9 0.3
- 170 - ANEXO
SLC44A4 0.9 0.0 ZKSCAN1 0.9 0.0
MPP5 0.9 0.0 232527_at 0.9 0.0
FUT6 0.9 0.4 232522_at 0.9 0.3 PACSIN2 0.9 0.3 NR2F6 0.9 0.2 NBR1 0.9 0.1
216902_s_at 0.9 0.1 SLCO2B1 0.9 0.3
AQP3 0.8 0.3 DTNBP1 0.8 0.5
CRK 0.9 0.2 RRM1 0.9 0.0 RBM22 0.9 0.4 NUCB1 0.9 0.1 FOXP1 0.9 0.2
SP1 0.9 0.2 ARF1 1.0 0.0
SEPT2 0.9 0.1 GSPT1 0.9 0.1 KLF3 0.9 0.1
DDX42 0.9 0.1 YWHAE 1.0 0.0 AZIN1 0.9 -0.1
PDLIM5 1.0 -0.1 SLC39A14 1.0 0.0
1559401_a_at 0.9 -0.2 229713_at 0.9 -0.2 227473_at 0.9 -0.3
CD74 1.0 -0.1 238875_at 0.9 -0.4 JMJD1C 1.0 0.0 ZFP36L2 1.0 -0.1 SEC61A1 0.9 0.0
1556338_at 0.9 -0.1 C6orf62 0.9 -0.3 MED13L 0.9 -0.1
1556657_at 0.9 0.0 NHSL1 0.9 0.0 RBM6 0.9 -0.3
LARP4B 0.9 -0.3 236251_at 0.9 0.0
CALR 0.9 0.0 F2RL1 0.9 0.0 APOB 0.9 -0.1
227383_at 0.9 0.0 241903_at 0.9 -0.1 CTNNA1 1.0 -0.1
TKT 0.8 -0.4
ANEXO - 171 -
236685_at 0.9 -0.1 EMILIN3 0.8 -0.5
235112_at 0.9 -0.1 237803_x_at 0.9 -0.1
SFRS15 0.9 -0.4 PPP2R5C 0.9 0.0
1569542_at 1.0 0.0 PAWR 0.9 -0.4
PIK3C2A 0.9 -0.2 CALD1 0.9 -0.2 PAPD4 0.9 -0.3 ERLIN1 1.0 0.0 ATXN7 0.8 -0.5 ACTR2 0.9 -0.3
242968_at 0.9 -0.4 241970_at 0.9 -0.4
MAX 0.9 -0.3 CAPRIN1 1.0 -0.1 KLHDC3 0.9 -0.2 WTAP 0.8 -0.6 CDC5L 0.9 -0.3 RSBN1 0.8 -0.5
237330_at 0.9 -0.3 LMAN1 0.9 -0.2
ATP6V0A1 0.9 0.0 GPBP1L1 0.9 -0.3 HNRNPC 0.9 -0.3
STIP1 0.9 -0.2 ANKRD10 0.9 -0.2 ZNF493 0.9 0.0 ZNF12 0.8 -0.5 STX16 0.9 -0.2
RABGAP1L 0.9 -0.2 214257_s_at 0.8 -0.3 242059_at 0.9 -0.2 MAP3K2 0.8 -0.5 APH1A 0.9 -0.4 TNKS2 0.8 -0.4
228478_at 0.9 -0.3 241948_at 0.9 -0.1 TM9SF1 0.9 0.0 HP1BP3 0.9 0.0
HSP90AB1 0.9 0.0 PSMB4 0.8 -0.5 DLG1 0.9 0.0
232797_at 0.9 -0.5 238883_at 0.8 -0.5 MAPKAP1 1.0 -0.1 PRO2852 0.9 -0.5
RAC2 0.9 0.0 ATP6V1A 0.9 -0.4
- 172 - ANEXO
243648_at -0.9 0.4 SLC15A1 -0.9 0.1 KPNA6 -0.9 0.3 PIGR -0.9 0.2
TMEM223 -0.9 0.4 FAM120A -0.9 0.1 B3GNT7 -0.9 0.1 EWSR1 -0.9 0.3 SPG7 -0.8 0.4 TULP4 -0.9 0.2
ZDHHC14 -0.9 0.3 GLUD1 -0.9 0.2 MTA1 -0.9 0.2 CASZ1 -0.9 0.3 LUZP1 -0.9 0.5 C9orf86 -0.9 0.1 PDXK -0.9 0.2 PLLP -0.9 0.1
NPEPPS -0.9 0.1 214801_at -0.9 0.1
LMO7 -0.9 0.3 RRBP1 -0.8 0.4
232699_at -0.8 0.5 DYNC1H1 -0.8 0.3
GNG12 -0.8 0.3 MALAT1 -0.9 0.2
B2M -0.9 0.3 CSNK1G2 -0.8 0.5
MAGI1 -0.8 0.5 HES6 -0.9 0.1 GGT6 -0.9 0.0
BNIP3L -0.9 0.4 242993_at -0.9 0.0 TMEM184A -0.9 0.4 242337_at -0.8 0.4
PTMA -0.9 0.2 SQLE -0.9 0.0
RBM26 -0.9 0.4 COPG -0.9 0.2
ZNF827 -0.8 0.6 MYO1C -0.8 0.5 PTMAP7 -0.9 0.2 MKNK2 -0.8 0.3 PSPC1 -0.9 -0.3 MAVS -0.9 -0.3
HNRNPL -0.9 -0.1 DISP2 -0.9 -0.3
CAPZA2 -1.0 -0.2 ND6 -0.9 -0.5
228919_at -0.9 0.0 C14orf50 -0.9 -0.1
ANEXO - 173 -
RAP2A -0.9 -0.4 TOMM22 -0.9 -0.3
236219_at -0.9 -0.1 OSBPL1A -0.9 -0.3 PPP3CA -0.9 -0.4 TRAK1 -0.9 -0.1 ATP1B1 -0.9 -0.3 TGFA -0.9 -0.1
225197_at -0.8 -0.5 MPP7 -0.8 -0.5 LETM1 -0.8 -0.4
SCAMP1 -0.9 -0.2 CDC42SE1 -0.8 -0.4
FAM83H -0.9 -0.3 DNAJC3 -0.8 -0.5
230180_at -0.9 -0.1
- 174 - ANEXO
10. SUPPLEMENTARY MATERIAL FROM CHAPTER 2
10.1. SUPPLEMENTARY FIGURES AND TABLES
10.1.1. Suplementary table 1. Differentially expressed spots identified in IBS-D
patients compared with the healthy volunteer group. Uniprot accession number of proteins
and their fold change expression in IBS-D with respect to H are indicated.
P-value Fold-change Identificació # acces
(Uniprot) Gene name
0,01 -1,59 Annexin A5 P08758 ANXA5 0,004 -1,61 Cytochrome b5 P00167 CYB5A 0,011 -1,71 Actin P62736 ACTA
9,33E-04 1,63 Aconitate hydratase, mitochondrial precursor Q99798 ACO2
0,012 -1,38 Peptydil-prolyli cis-trans isomerase P62937 PPIA 0,002 -1,57 14-3-3 protein zeta/delta P63104 YWHAZ 0,032 -1,35 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase P25325 MPST 0,045 -1,34 LGALS4 protein Q6FHZ4 LGALS4 0,006 -1,64 Glutathione S-transferase theta-1 P30711 GSTT1 0,015 1,45 Isoform I of Serum albumin precusor P02768 ALB
0,002 -1,78 proteasome activator subunit 1 isoform 1 (29KDa protein) Q06323 PSME1
0,001 -1,83 proteasome activator subunit 1 isoform 1 (29KDa protein) Q06323 PSME1
0,001 -1,68 Annexin A5 P08758 ANXA5 0,003 -1,52 EF-hand domain-containing protein D2 Q96C19 EFHD2 0,003 -1,70 Actin, aortic smooth muscle P62736 ACTA2 0,004 1,69 Aconitate hydratase, mitochondrial Q99798 ACO2
9,33E-04 1,63 Aconitate hydratase, mitochondrial precursor Q99798 ACO2
0,009 -1,59 Cofilin-1 P23528 CFL1 0,001 -1,52 Cathepsin D P07339 CTSD 0,038 -1,60 Bile salt sulfotransferase Q06520 SULT2A1 0,002 1,34 Elongation factor 2 P13639 EEF2
0,004 1,50 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial P31040 SDHA
0,011 1,30 Keratin, type II cytoskeletal 8 P05787 KRT8 0,008 -1,54 Annexin A1 P04083 ANXA1
3,59E-04 1,42 Heat shock 70 kDa protein 1 P08107 HSPA1A 0,013 -1,55 Alpha-soluble NSF attachment protein P54920 NAPA 0,017 -1,49 Cathepsin D P07339 CTSD
0,002 -1,59 NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 2, mitohondrial precursor P19404 NDUFV2
1,38E-04 1,58 Keratin, type I cytoskeletal 18 P05783 KRT18
0,019 -1,46 Superoxide dismutase (Mn), mitochondrial precursor P04179 SOD2
0,004 -1,33 Protein DJ-1 (Oncogene DJ1) Q99497 PARK7
ANEXO - 175 -
0,003 -1,45 14-3-3 protein zeta/delta P63104 YWHAZ 0,008 -1,69 cytidylate kinase (UMP-CMP kinase) P30085 CMPK1 0,001 -1,50 Proteasome subunit beta type 2 P49721 PSMB2
-1,50 Isoform 1 of Growth factor receptor-bound protein 2 P62993 GRB2
-1,50 Calcineurin B homologous protein 2 O43745 CHP2 8,44E-05 -1,32 Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial P30084 ECHS1
0,008 -1,45
22 kDa Protein (tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5- monooxygenase activation protein, epsilon polypeptide [synthetic construct]) (14-3-3 epsilon )
P62258 YWHAE
0,005 -1,47 Alcohol dehydrogenase [NADP+] P14550 AKR1A1
0,005 -1,43 Isoform short of 14-3-3 protein beta/alpha A4K2U9 YWHAB
0,004 1,42 Guanine deaminase Q9Y2T3 GDA
0,002 -1,35 Phosphoglycerate mutase 1 (Brain) variant Q53G35 PGAM1
0,003 1,31 Retinal dehydrogenase P00352 ALDH1A1 0,001 1,43 Protein transport protein Sec23A Q15436 SEC23A
0,03 -1,35 LIM and SH3 domain protein 1 Q14847 LASP1
0,044 -1,35 Abhydrolase domain-containing protein 14B (22 kDa protein) Q96IU4 ABHD14B
-1,35 Peroxiredoxin-2 P32119 PRDX2 0,008 1,49 Serotransferrin precursor P02787 TF
9,91E-05 1,48 Serotransferrin precursor P02787 TF 1,48 Vesicle-fusing ATPase P46459 NSF
0,002 1,33 Elongation factor 2 P13639 EEF2 2,61E-04 1,91 Isoform 1 of Adseverin Q9Y6U3 SCIN
0,002 1,30 Stress-70 protein, mitochondrial P38646 HSPA9 1,30 Xaa-Pro aminopeptidase 1 Q9NQW7 XPNPEP1
0,003 1,28 Lamin-B1 P20700 LMNB1 1,28 Serum albumin P02768 ALB
0,014 1,55 Serum albumin P02768 ALB 0,004 1,69 ALB protein P02768 ALB
6,51E-05 1,44 WD repeat-containing protein 1 O75083 WDR1
1,44 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial P31040 SDHA
0,001 1,59 WD repeat-containing protein 1 O75083 WDR1
1,59 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial P31040 SDHA
0,005 1,63 Gamma-tubulin complex component 2 (83 Kda Protein) Q9BSJ2 TUBGCP2
0,001 1,53 KRT8 protein Q969I0 KRT8 0,025 1,34 Selenium-binding protein 1 Q13228 SELENBP1
1,34 Aldehyde dehydrogenase X, mitochondrial P30837 ALDH1B1
0,003 1,25 Keratin, type I cytoskeletal 20 P35900 KRT20 1,25 Actin-related protein 3 P61158 ACTR3
7,48E-04 1,69 Actin-like protein 3 P61158 ACTR3 0,002 1,27 Eukaryotic initiation factor 4A-II Q14240 EIF4A2
- 176 - ANEXO
0,004 1,38 GDP-mannose 4,6 dehydratase O60547 GMDS 1,38 Fructose-bisphosphate aldolase B P05062 ALDOB
0,007 -1,40 Annexin A1 P04083 ANXA1
0,004 -1,30 phenol sulfotransferase 1A5/1A possible alternative splicing form P50224 SULT1A3
0,041 -1,29 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase P25325 MPST 0,007 -1,31 Inorganic pyrophosphatase Q15181 PPA1 0,017 -1,39 EF-hand domain-containing protein D2 Q96C19 EFHD2 0,017 -1,53 Prohibitin P35232 PHB 0,025 -1,31 Thiopurine S-methyltransferase P51580 TPMT
0,006 -1,86 Endoplasmic reticulum protein ERp29 precursor P30040 ERP29
0,002 -1,76 Endoplasmic reticulum protein ERp29 precursor P30040 ERP29
-1,76 6-phosphogluconolactonase O95336 PGLS 0,006 -1,43 Pyridoxine-5'-phosphate oxidase Q9NVS9 PNPO
0,007 -1,35 Thioredoxin-dependent peroxide reductase, mitochondrial P30048 PRDX3
0,013 -1,45 Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 P30086 PEBP1
0,014 -1,51 Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 P30086 PEBP1
0,003 -1,37 Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD Q9ULZ3 PYCARD
-1,37 Proteasome subunit beta type-3 P49720 PSMB3
0,013 -1,51 Myosin regulatory light chain 2, nonsarcomeric P19105 MRCL3
0,001 -1,46 Nucleoside diphosphate kinase A P15531 NME1
5,43E-04 -1,60 Eukaryotic translation initiation factor 5A-1 P63241 EIF5A
0,007 -1,46 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A P62938 PPIA 0,012 -1,60 Transthyretin P02766 TTR 0,018 -1,44 Fatty acid-binding protein, liver P07148 FABP1 0,025 -1,47 Fatty acid-binding protein, liver P07148 FABP1
ANEXO - 177 -
11. S
UPP
LEM
ENTA
RY
MA
TER
IAL
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M C
HA
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3
11.1
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used
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- 178 - ANEXO
11.1.2. Supplementary table 2. Gene expression assays (GEA) used for Q-RT-PCR.
ANEXO - 179 -
11.1.3. Supplementary figure 1. Relationships between differentially expressed genes
in the highest scored network and related Canonical Pathways (CP) and Biological
Functions (Fx). The list of differentially expressed genes in IBS-D, compared to healthy
volunteers, linked to their approved nomenclature (http://www.genenames.org), and fold-change
was uploaded into the IPA application. Node (gene) and edge (gene relationship) symbols are
described in the figure. The intensity of the node color indicates the degree of up-(red) or down-
(green) regulation. Genes in uncolored nodes were not identified as differentially expressed in
our study and were integrated into the computationally generated networks based on the
evidence stored in the IPA knowledge memory indicating relevance for this network. The
network score is based on the hypergeometric distribution and is calculated with the right-tailed
Fisher’s Exact Test. The score is the negative Log of this P-value (P-score=-log10 (P-value)).
- 180 - ANEXO