Aus der Medizinischen Klinik I mit Poliklinik der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. M. F. Neurath

Medikamentöse Kombinationstherapie bei kolorektalem Karzinom

im Metastasenmodell der Ratte

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Stefanie Gilsbach

aus

Warendorf

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler Referent: Prof. Dr. Ch. Herold Korreferent: Prof. Dr. M. F. Neurath Tag der mündlichen Prüfung: 06.04.2011

3

Meiner lieben Familie

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung 01

1 Einleitung 05

2 Theoretische Grundlagen 07

2.1 Das kolorektale Karzinom 07

2.2 Aktuelle Therapieoptionen des kolorektalen Karzinoms 12

2.2.1 Therapie des Kolonkarzinoms 12

2.2.2 Therapie des Rektumkarzinoms 15

2.3 Einblicke in Zellzyklus, Apoptose und Angiogenese im 18

Tumor

2.3.1 Zellzyklus 18

2.3.2 Apoptose 21

2.3.3 Angiogenese im Tumor 24

3 Versuchsaufbau (Zelllinie: CC531) 26

3.1 Medikamente (Biomodulatoren) 26

3.1.1 Tamoxifen (TAM) 26

3.1.2 9-cis Retinsäure (CRA) 27

3.1.3 VEGF-Rezeptor-Antagonist ZK222 584 28

(ZK, Vatalanib )

3.1.4 Histondeacetylasehemmer MS-275 (MS) 30

3.2 Tiermodell 32

3.3 Makroskopische Beurteilung 34

3.4 Immunhistologie 34

3.4.1 PCNA und CD8 35

3.4.2 TUNEL 38

3.5 Mikroskopische Auswertung 39

4 Ergebnisse 40

4.1 Makroskopische Ergebnisse 40

4.2 Mikroskopische Ergebnisse 43

5 Diskussion 46

6 Literaturverzeichnis 50

7 Abkürzungsverzeichnis 67

8 Anhang 69

9 Danksagung 73

10 Lebenslauf 74

1

Zusammenfassung

1) Hintergrund und Ziele

Das kolorektale Karzinom ist in Deutschland die zweithäufigste tumorbedingte

Todesursache. Durch geeignete Screeningmethoden, wie der fäkalen okkulten

Bluttestung und der Koloskopie ist eine Prävention und damit Senkung der Mor-

talität nachgewiesen [127].

Insgesamt haben sich die Therapiemöglichkeiten für kolorektale Karzinome in

den letzten Jahren deutlich verbessert. Im Falle primär inoperabler Tumore feh-

len allerdings immer noch Behandlungsoptionen. Biomodulatoren, die Apoptose

und Proliferation in den Tumorzellen beeinflussen, geraten immer mehr in den

Fokus der Forschung.

In dieser Arbeit wurden Ergebnisse einer Monotherapie mit der Kombination

verschiedener Biomodulatoren verglichen.

2) Methoden

Dazu wurden männlichen WAG Ratten Kolonkarzinom-Zellen (Zelllinie CC531)

unter die Leberkapsel injiziert. Ab dem 7. postoperativen Tag wurden die Tiere

mit den zu prüfenden Biomodulatoren, dem Antiöstrogen Tamoxifen, 9-cis Re-

tinsäure, dem HDAC-Hemmer MS-275 und dem VEGF-Rezeptor-Antagonisten

ZK222 584, täglich intraperitoneal behandelt.

Nach 21 Tagen Behandlung wurden die Ratten in Ethernarkose getötet, erneut

gewogen und das Tumorvolumen und die Metastasierung beurteilt.

Anschließend wurde das Gewebe immunhistologisch mit PCNA-, CD8- und Tu-

nel-Färbung untersucht.

3) Ergebnisse und Beobachtungen

Die Monotherapie mit Tam als auch mit CRA führte zu einer deutlichen Reduk-

tion des Tumorvolumens. Die Kombination der beiden Biomodulatoren erreichte

eine 75%ige Tumorsuppression im Vergleich zu den Placebo-Tieren, führte al-

lerdings auch zu einer starken Gewichtsreduktion.

Die Kombination von MS und ZK führte zu einer deutlichen Tumorelimination,

dagegen zeigte die Monotherapie mit ZK nur eine geringe Reduktion des Tu-

morvolumens.

2

Die Dreifach- und Vierfachkombination der einzelnen Medikamente führte zwar

makroskopisch zu keiner weiteren Veränderung des Tumorvolumens, zeigte

aber histologisch eine deutliche Steigerung der Nekroseareale zuungunsten

des vitalen Tumorgewebes, so dass das gemessene Tumorvolumen nicht un-

bedingt die eigentliche Effektivität widerspiegelt.

4) Praktische Schlussfolgerungen

Insgesamt zeigten die Kombinationsbehandlungen eine deutliche Veränderung

des Tumorvolumens und sollten daher in weiteren, größeren Studien über einen

längeren Behandlungszeitraum und mit einer größeren Anzahl an Versuchstie-

ren untersucht werden.

3

Summary

1) Background and objectives

In Germany, colorectal carcinoma is a frequent cause for cancer related deaths.

Appropriate screening methods like fecal occult blood tests or coloscopy have

proven to reduce mortality. Overall, the therapeutic options for colorectal

carcinoma have significantly improved in the last years. However, for primary

inoperable tumors therapeutic options are still limited. Therefore, biomodulators

influencing apoptotic and proliferative activity of tumor cells increasingly

influence research.

The present study compares monotherapy and combined of biomodulators.

2) Methods

An experimental colon carcinoma was induced in male WAG rats by injection of

CC531 cells beneath the liver capsule. Following the seventh postoperative day

the animals were daily injected the following biomodulators intraperitoneally: the

antiestrogen tamoxifen, 9-cis retinoic acid, the Histone Deacetylase Inhibitor

MS-275 and the Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) receptor

antagonist ZK222 584.

After 21 days of treatment rats were sacrificed by ether and weight, tumor

volume and occurrence of metastases were assessed. Immunohistochemical

staining of the tumor tissue for PCNA, CD8 and TUNEL staining were

performed.

3) Results and observations

Monotherapy with Tam and CRA significantly reduced tumor volume, their

combination led to a 75% suppression of tumor growth as compared to the

control group. However, the body weight was markedly reduced.

The combination of MS and ZK nearly eliminated the tumor volume whereas the

monotherapy with ZK was not effective. The triple or quadruple therapy did not

further improve the macroscopic reduction of the tumor volume. However,

histologically the relative amount of necrotic tissue as compared to vital tumor

tissue increased raising doubts about the significance of the tumor volume as

(single) measure of effectiveness.

4

4) Conclusion

In conclusion the combined therapies had pronounced effects on the tumor

growth. Further studies with increased animal number and prolonged treatment

duration are required.

5

1 Einleitung

Kolorektale Karzinome gehören in der Bundesrepublik Deutschland zu den häu-

figsten malignen Erkrankungen. Jedes Jahr erkranken in Deutschland nach

Schätzung des Robert Koch Instituts mehr als 73000 Menschen an kolorekta-

lem Karzinom. Weltweit liegt die Inzidenz jährlich bei 30 pro 100.000 Einwoh-

ner. Darmkrebs ist sowohl für Frauen als auch für Männer die zweithäufigste

Todesursache. Allerdings liegen die relativen 5-Jahres-Überlebensraten inzwi-

schen bei 60 % [8, 75].

In den letzten Jahren wurden die Therapiemöglichkeiten für Patienten mit kolo-

rektalem Karzinom deutlich verbessert. Maßgeblich dafür war die klinische Ent-

wicklung zweier neuer zytostatischer Substanzen, Oxaliplatin und Irinotecan,

sowie von zwei Wirkstoffen der sogenannten „molecular targeted therapy“, Ce-

tuximab und Bevacizumab. Beide Substanzen sind Vertreter einer neuartigen

Medikamentenklasse, da sie direkt gegen tumorexpremierende Zytokine gerich-

tet sind (VEGF; CTGF) und nicht als klassische Zytostatika klassifiziert werden

können.

Trotz der Verfügbarkeit dieser Arzneimittel ist das fortgeschrittene, inoperable

kolorektale Karzinom immer noch unheilbar.

Die vorliegende Arbeit soll überprüfen, ob durch eine geeignete Kombination

von Medikamenten schon bei niedriger Dosierung die Tumorentwicklung ver-

langsamt werden kann. Dazu wurden vier Substanzen herangezogen, die als

Biomodulatoren in verschiedene Prozesse der Zellentwicklung eingreifen.

Es handelt sich um das antiöstrogen wirksame Tamoxifen (TAM), das Retinoid

9-cis Retinsäure (CRA), den Angiogenesehemmer ZK222 584 (ZK) und den

Histondeacetylasehemmer MS-275 (MS).

Mit diesen Medikamenten soll möglichst tumorzellspezifisch die Apoptosefähig-

keit rekonstituiert und gleichzeitig mit dem Angiogenesehemmer die Nährstoff-

zufuhr zum Tumor verschlechtert werden.

Die Wirksamkeit wurde in einer tierexperimentellen Arbeit an Kolorektalkarzi-

nom-Zelllinien in vivo an Ratten getestet.

6

Dazu wurden Tumorwachstum und Metastasierung behandelter und unbehan-

delter Tiere verglichen und die Therapieverträglichkeit kontrolliert.

In der folgenden Arbeit werden zunächst theoretische Grundlagen zum Charak-

ter des kolorektalen Karzinoms und zur Regulation von Zellzyklus, Apoptose

und der Angiogenese im Tumor beschrieben. Daran schließt sich eine kurze

Zusammenfassung über den aktuellen Wissensstand zu den einzelnen Medi-

kamenten an. Im experimentellen Teil werden die verwendeten Materialen und

Methoden vorgestellt und die Ergebnisse diskutiert und bewertet.

7

2 Theoretische Grundlagen

2.1 Das kolorektale Karzinom

Das kolorektale Karzinom ist das zweithäufigste Karzinom, insbesondere bei

Männern und Frauen über 50 Jahren [8, 13]. Jüngere Patienten sind meist ge-

netisch vorbelastet. Deshalb ist bei kolorektalen Karzinomen in der Familien-

anamnese ein erhöhtes Malignom-Risiko für Nachkommen zu beachten. Gene-

tische Faktoren spielen bei etwa 10 % eine Rolle. Zu nennen sind die familiäre

adenomatöse Polyposis (FAP), eine obligate Präkanzerose und das hereditäre

nichtpolypöse Kolonkarzinom-Syndrom (HNPCC, Lynch-Syndrom).

Bei der FAP werden aufgrund von Mutationen des APC-Tumorsuppressorgens

in charakteristischer Weise eine Vielzahl (in der Regel >100) kolorektaler Ade-

nome gebildet [50, 126]. Diese Polypenbildung manifestiert sich meist im zwei-

ten bis dritten Lebensjahrzehnt [50]. Hierbei entwickeln sich die Karzinome wie

in der von Vogelstein definierten Sequenz (s. Abb. 1).

Histologisch gesehen gibt es unterschiedliche Typen des kolorektalen Karzi-

noms. In der Regel gehören sie jedoch zur Gruppe der Adenokarzinome.

Aus einem Normalepithel entwickelt sich durch Mutation bzw. Verlust von Tu-

morsuppressorgenen wie APC, DCC oder p53 und/oder durch Aktivierung von

Onkogenen wie K-ras ein Adenom mit Dysplasien, das dann bei Überschreitung

einer kritischen Anzahl an genetischen Veränderungen in ein Karzinom überge-

hen kann (maligne Transformation) [142] (s. Abb. 1).

8

Abb. 1: Karzinogenese des sporadischen kolorektalen Karzinoms. Modifiziertes Modell nach Fearon und Vogelstein (1990), aktualisiert von Toribara und Sleisenger (1995). Dargestellt sind die einzelnen molekulargenetischen Ereignisse, die zur Entstehung eines Karzinoms führen. Die abgebildete Reihenfolge ist dabei weniger wichtig als die Akkumulation der einzelnen Ereignisse [77]. Bei Anlageträgern für ein Lynch Syndrom beträgt die Wahrscheinlichkeit ein

kolorektales Karzinom zu entwickeln 70 bis 80 % [127]. Das Syndrom HNPCC

wird nach amnestischen Kriterien definiert (Amsterdam-I- und II Kriterien, S.

Anlage 1, [75]). Zur Identifizierung weiterer Risikopersonen werden auch die

Bethesda-Kriterien herangezogen (Bethesda-Kriterien, s. Anlage 2 und 3 [117,

139]). Bei diesem Syndrom kommt es zur Punktmutation der Respondergene,

weswegen die Entartungstendenz in allen Gewebearten steigt.

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen, vor allem die Colitis ulcerosa, aber

auch die kolorektalen Adenome fördern die Entstehung des Dickdarmkrebses

ebenso wie Karzinome von Mamma, Ovar und Corpus uteri, Schistosomiasis

oder Uretersigmoideostomie.

Neben diesen nicht unmittelbar beeinflussbaren Risikofaktoren können die Er-

nährung und der Lebensstil die Entwicklung eines kolorektalen Karzinoms be-

günstigen. Vor allem ein großer Anteil roten Fleisches, tierischen Fettes, Süßig-

keiten, Cholesterin und eine hohe Gesamtkalorienzahl gekoppelt mit Bewe-

gungsarmut erhöhen das Risiko ebenso wie langjähriger Nikotin- und Alkohol-

konsum [56, 60, 61, 75].

Auf der anderen Seite lässt sich mit fett- und fleischarmer Kost sowie reichli-

chem Verzehr an Gemüse und Salat das Dickdarmkrebsrisiko senken [12, 59].

9

Zum Einfluss von Medikamenten für eine wirksame Prävention des kolorektalen

Karzinoms gibt es derzeit keine gesicherten Daten [25, 88].

Kolorektale Karzinome sind zu etwa 60 % im Rektum und zu etwa 20 % im Sig-

ma lokalisiert, jeweils etwa 10 % finden sich im Caecum/Colon ascendens und

im übrigen Kolon.

Die klinische Diagnose eines kolorektalen Karzinoms ist aufgrund der oft feh-

lenden Symptome in der Frühphase schwierig. Insofern bedürfen jegliche Ver-

änderungen der Stuhlgewohnheiten einer genauen Beachtung. Insbesondere

Blutspuren im Stuhl sind ein besonderes Warnzeichen, des Weiteren Schmerz

oder Tenesmen. Im fortgeschrittenen Stadium hängen die Symptome von der

Lokalisation des Tumors ab. Während bei proximalen Tumoren erst spät Steno-

sesymptome auftreten und die Patienten eher durch Gewichtsverlust, Leis-

tungsknick und Eisenmangelanämie auffallen, kommt es bei distalen Karzino-

men schon früher zur Obstipation bzw. einer paradoxen Diarrhoe.

Zu der wichtigsten Komplikation des kolorektalen Karzinoms zählt die Stenose

oder Obstruktion des Darmlumens mit Ausbildung eines Ileus. Dieser ist bei 6-

16 % der Fälle die Erstmanifestation des Karzinoms. Bei 2-12 % der Patienten

kommt es zu einer Darmperforation, seltener sind Penetrationen mit Fistelbil-

dungen zu Blase, Uterus oder Vagina [75].

Mit verbesserten Screening Methoden können Tumore wesentlich früher diag-

nostiziert und die Mortalität erheblich gesenkt werden. Deshalb wird für jede

Person über dem 50. Lebensjahr jährlich eine Messung von occultem Blut im

Stuhl empfohlen (FOBT, Guajak-Test) [95] und ergänzend dazu eine erste Ko-

loskopie. Sie erlaubt nicht nur die genaue Ortung des Tumors, sondern durch

bioptische Entnahme von Material auch eine nachfolgende Differenzierung. Die

Häufigkeit von Folgeuntersuchungen hängt vom klinischen Befund ab. Bei feh-

lenden Polypen reicht es aus, die Koloskopie nach zehn Jahren zu wiederholen

[19], dagegen sind bei Adenomen mit Dysplasien solche Untersuchungen be-

reits nach drei Jahren angezeigt, siehe Anlage 4 [76].

10

Mit der Röntgen-Doppelkontrast-Untersuchung oder einem Abdomen-CT lässt

sich die Ursache eines Dickdarmileus klären [75]. Eine rektale Austastung ist

nur bei größeren Tumoren bis 10 cm ab ano Erfolg versprechend.

Für Prognose und Therapie ist das Tumorstadium von großer Bedeutung. Die

Stadieneinteilung erfolgt nach dem TNM-System der Union Internationale

Contre le Cancer (UICC) oder nach Dukes. Es beschreibt das Ausmaß der Tu-

morinfiltration und den Lymphknoten- und Metastasenstatus, die maßgeblich

Einfluss auf Therapieoption und Prognose haben [124].

UICC Definition TNM-System Dukes 0 Carcinoma in situ Tis N0 M0 I Ia Beschränkung auf Mukosa und Submu-

kosa T1 N0 M0

Ib Infiltration Muscularis propria T2 N0 M0 A

IIA Tumor infiltriert durch die Muskularis propria in die Subserosa oder in nicht peritonealisier-tes perikolisches oder perirektales Gewebe

T3 N0 M0

IIB Tumor perforiert das viszerale Peritoneum T4a N0 M0 IIC Tumor infiltriert direkt in andere Organe oder

Strukturen T4b N0 M0

B

IIIA

Metastasen in 1 regionärem Lymphknoten Metastase in 4 bis 6 regionären Lymphkno-ten

T1,T2 N1a M0 T1 N2a M0

IIIB Metastase(n) in 1-3 regionären Lymphknoten Metastasen in 4-6 regionären Lymphknoten Metastasen in 7 oder mehr regionären Lymphknoten

T3, T4a N1 M0 T2, T3 N2a M0 T1, T2 N2b M0

IIIC

T4a N2a M0 T3, T4b N2b M0 T4b N1,N2 M0

C

IVA Metastase(n) auf ein Organ beschränkt (Le-ber, Lunge, Ovar, nichtregionäre Lymphkno-ten)

Jedes T Jedes N M1a

IVB Metastasen in mehr als einem Organ oder im Peritoneum

Jedes T Jedes N M1b D

Tabelle 1: Einteilung von Tumorstadien nach dem TMM-System der Union internatio-nale Contre le Cancer [145].

11

Metastasen können sich auf verschiedenen Wegen bilden und sich per continui-

tatem in das perikolische bzw. perirektale Fettgewebe sowie lymphogen oder

hämatogen über unipolare Metastasenstraßen ausbreiten.

Lymphknotenmetastasen breiten sich dabei entlang des Gefäßversorgungsge-

bietes, welches zu dem betroffenen Kolonabschnitt gehört, aus.

Hämatogen breiten sich kolorektale Karzinome über die Vena mesenterica infe-

rior bzw. superior und die Vena porta in die Leber aus und können von dort

über die Vena cava inferior in die Lunge metastasieren.

Tiefsitzende Rektumkarzinome führen aufgrund der Gefäßversorgung über die

Venae rectales mediae und inferiores eher zu pulmonalen Metastasen [75].

Für die Prognose des Kolonkarzinoms ist die vollständige Tumorresektion ent-

scheidend. Die medianen Überlebenszeiten betragen nach unvollständiger Tu-

morresektion, je nach dem Vorhandensein von Fernmetastasen 10-20 Monate.

Stärkster prognostischer Faktor bei R0 reserzierten Patienten ist das Stadium

der Erkrankung. Die Prognose des Rektumkarzinoms ist per se schlechter.

Stadium I Stadium II Stadium III Stadium IV

Kolonkarzinom 70-100 60-91 44-60 3-7

Rektumkarzinom 72-98 54-85 39-60 3-7

Tabelle 2: Fünfjahresüberlebensrate von Rektum- und Kolonkarzinom in Abhängigkeit des Entwicklungsstadiums in Prozent [75]

12

2.2 Aktuelle Therapieoptionen des kolorektalen Karzinoms

Aufgrund unterschiedlicher Therapieoptionen des Kolon- und Rektumkarzinoms

werden zunächst aktuelle Therapiemöglichkeiten des Kolonkarzinoms darge-

stellt. Spezielle therapeutische Aspekte des Rektumkarzinoms werden im An-

schluss gesondert aufgeführt.

2.2.1 Therapie des Kolonkarzinoms

Chirurgische Therapie mit kurativem Ziel

Zur Therapie des Kolonkarzinoms ist eine Operation zur vollständigen Entfer-

nung des Tumors unerlässlich. Dabei wird der tumortragende Darmabschnitt

entfernt, wobei die versorgenden Gefäße stammnah durchtrennt und Lymph-

knoten systematisch entfernt werden.

Da Kolonkarzinome vorwiegend zirkulär wachsen, wird ein Sicherheitsabstand

von 2 cm für ausreichend erachtet [125]. Aufgrund der Lymphknotenmetasta-

sierung entlang der versorgenden Gefäße, bis zu 10 cm vom makroskopischen

Tumorrand entfernt, wird das Ausmaß der Darmresektion nach dem nach zent-

raler Gefäßligatur zu entfernenden Lymphabflussgebiet bestimmt [83]. Liegt der

Tumor zwischen zwei zentralen Gefäßen werden beide Versorgungsgebiete

entfernt.

Um die intraoperative Verschleppung von Tumorzellen zu verhindern, wird der

Tumor inklusive des zugehörigen Lymphabflussgebietes mit der „no touch“

Technik in ausreichendem Sicherheitsabstand entfernt. Dazu wird der Tumor

durch Gefäßligaturen isoliert, so dass ein direktes Anschneiden vermieden wird.

Je nach Lokalisation des Tumors werden unterschiedliche Operationstechniken

durchgeführt.

Dem Tumor adhärente Nachbarorgane sollten nach Möglichkeit en-bloc rese-

ziert werden (multiviscerale Resektion). Gleichzeitig vorhandene Adenome, die

endoskopisch nicht abtragbar sind, können eine Erweiterung der Darmresektion

notwendig machen, wobei auf eine Erweiterung des Lymphabflussgebietes ver-

zichtet werden kann.

13

Adjuvante Therapie des Kolonkarzinoms

Wichtig für eine adjuvante Therapie ist die R0-Resektion des Primärtumors. Die

Indikationsstellung erfolgt je nach pathohistologischer Stadienklassifizierung.

Hier spielt insbesondere der pN-Status eine Rolle. pN0 ist gegeben, wenn min-

destens 12 regionäre Lymphknoten untersucht und metastasenfrei sind [145].

Patienten mit einem kurativ reserziertem Karzinom im UICC Stadium I sollten

nicht adjuvant therapiert werden.

Bei Patienten im Stadium II ist eine adjuvante Chemotherapie möglich. Aller-

dings fand sich in verschiedenen Studien kein signifikanter Überlebensvorteil

[10, 46, 94]. Da im Stadium II der Nutzen einer adjuvanten Therapie jedoch

nicht völlig ausgeschlossen werden kann, sollte unter einer entsprechenden

Risikoabwägung eine Therapie in Betracht gezogen werden [115, 126].

Bei Patienten im UICC Stadium III und einem R0 reserziertem Karzinom ist eine

adjuvante Chemotherapie indiziert [35, 51].

Empfohlen wird eine Chemotherapie mit Oxaliplatin in Kombination mit 5-FU/

Folinsäure (FS), z.B. FOLFOX – Regime: Oxaliplatin (85 mg/m²), Folinsäure

(200 mg/m² als 2-h-Infusion, Tag 1 und 2) und 5-FU (400 mg/ m² als Bolus, da-

nach 600 mg/ m² als 22-h-Infusion; Tag 1 und 2), wiederholt alle 2 Wochen,

insgesamt 12 Zyklen [126]. Es konnte in mehreren Studien gezeigt werden,

dass die Zugabe von Oxaliplatin zur adjuvanten Standardtherapie mit 5-

Fluorouracil und Folinsäure das krankheitsfreie Überleben von Patienten mit

kurativ operiertem Kolonkarzinom im Stadium III verbessert [4].

Eine spezifische Nebenwirkung von Oxaliplatin ist seine Neurotoxität. Sie tritt in

unterschiedlicher Ausprägung bei allen behandelten Patienten auf und muss

streng kontrolliert werden. In der Regel bildet sie sich aber nach Therapieende

wieder zurück [4].

Bei Kontraindikationen gegen Oxaliplatin ist eine Monotherapie mit Fluoropyri-

midinen indiziert. Dabei werden die oralen Fluoropyrimidine (z.B. Capecitabin

2x 1250 mg/ m² KÖF p.o. Tag 1-14, alle 3 Wochen für 8 Zyklen) infusionalen

Schemata (z.B. Folinsäure (200 mg/ m² als 2-h-Infusion, Tag 1 und 2) plus 5-FU

(400 mg/ m² als Bolus, danach 600 mg/ m² als 22-h-Infusion; Tag 1 und 2), ins-

gesamt 12 Zyklen), vorgezogen [126].

14

Therapie bei Metastasierung und in palliativer Situation

Die palliativen Behandlungsregime mit systemischen Therapien gelten sowohl

für das fortgeschrittene Kolon- als auch für das Rektumkarzinom.

Fernmetastasen sollten bei R0-Resektion wenn möglich entfernt werden, kön-

nen jedoch auch zweitzeitig nach entsprechender interventioneller oder medi-

kamentöser Therapie entfernt werden.

Nach R0-Resektion synchroner oder metachroner Lebermetastasen kann eine

adjuvante Chemotherapie erwogen werden, hierzu gibt es aktuell allerdings nur

eine limitierte Datenlage.

Bei primär nicht kurativen Metastasen ist eine Chemotherapie unabhängig vom

Vorliegen metastasenbezogener Symptome indiziert, denn nach medikamentö-

ser Vorbehandlung kann sich ein kurativer Ansatz ergeben [39, 57]. Die Wahl

des Chemotherapeutikums muss individuell entschieden werden und richtet

sich nach der therapeutischen Zielsetzung.

Dafür stehen systemische Chemotherapeutika für die intravenöse oder orale

Applikation zur Verfügung sowie mittlerweile auch zwei monoklonale Antikörper.

In Deutschland sind 5-Fluorouracil (5-FU; evtl. in Kombination mit Folinsäure),

Capecitabin (orales 5-FU Prodrug), Oxaliplatin und Irinotecan sowie die mo-

noklonalen Antikörper Cetuximab und Bevacizumab zugelassen.

Cetuximab bindet an den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGF-R) und

ist in Kombination mit Irinotecan gegen das kolorektale Karzinom wirksam. Bei

Progredienz unter laufender irinotecanhaltiger Therapie ist die Kombination mit

Cetuximab effektiver und für diese Indikation in Deutschland zugelassen [29,

125].

Dagegen ist Bevacizumab ein monoklonaler Antikörper gegen den Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF) und wirkt somit antiangiogenetisch. Er ist in

Kombination mit 5-FU/FS mit oder ohne Irinotecan für die Erstlinientherapie zu-

gelassen [78] und mit einer oxaliplatinhaltigen Substanz für die Zweitlinienbe-

handlung. Als Monotherapie ist Bevacizumab wirkungslos.

15

2.2.3 Therapie des Rektumkarzinoms

Als Rektumkarzinome gelten dem internationalen Dokumentationssystem zufol-

ge Tumore, deren aboraler Rand bei der Messung mit dem starren Rektoskop

16 cm oder weniger von der Anokutanlinie entfernt sind [45, 129]. Sie werden

entsprechend ihres Abstandes in Karzinome des oberen Rektumdrittels (12-16

cm), des mittleren Rektumdrittels (6 - < 12 cm) und des unteren Rektumdrittels

(< 6 cm) eingeteilt [145].

Chirurgische Therapie

Die operative Behandlung der Rektumkarzinome sieht die Entfernung des Tu-

mors mit partieller oder totaler Mesorektumresektion vor, wobei das regionäre

Lymphabflussgebiet eingebunden wird [45, 129].

Man unterscheidet die (tiefe) anteriore Rektumresektion, die abdomino-perinea-

le Rektumextirpation sowie die intersphinktere Rektumresektion.

Generell sollte das regionäre Lymphabflussgebiet mit Absetzung der A. mesen-

terica inferior enfernt werden, ebenso das komplette Mesorektum beim mittleren

und unteren Rektumkarzinom sowie das partielle Mesorektum beim oberen

Rektumkarzinom.

In allen Fällen sind gewisse Sicherheitsabstände in situ einzuhalten. Sie betra-

gen bei Karzinomen des oberen Drittels 5 cm von aboral, bei Karzinomen des

mittleren und unteren Drittels bei gutem bis mäßigem Differenzierungsgrad 2

cm und bei „High-grade-Karzinomen“ 5 cm.

Zur Vermeidung einer örtlichen Tumorzelldissemination ist die en-bloc Resek-

tion von tumoradhärenten Organen (multiviszerale Resektion) erforderlich. Dar-

über hinaus müssen die autonomen Beckennerven geschont werden [38, 91,

126].

Neoadjuvante Therapie des Rektumkarzinoms

Bei Rektumkarzinomen im UICC Stadium I ist keine perioperative Therapie in-

diziert, dagegen zeigen verschiedene Studien, dass im UICC Stadium II und III

eine signifikante Reduzierung der Lokalrezidivrate nach neoadjuvanter Radio-

oder Radiochemotherapie erzielt werden kann und deshalb sinnvoll ist [52,

123]. Die präoperative Strahlentherapie bietet zwei mögliche Fraktionsschema-

16

ta. Bei der Kurzzeitbestrahlung beträgt die tägliche Einzeldosis (ED) 5,0 Gy.

Die Bestrahlung erfolgt an fünf aufeinander folgenden Tagen bis zu einer Ge-

samtdosis von 25,0 Gy, unmittelbar gefolgt von der Operation. Bei der konven-

tionell fraktionierten Radiotherapie wird in 25-28 Fraktionen bis zu einer Ge-

samtreferenzdosis von 45-50,4 Gy bestrahlt und nach vier bis sechs Wochen

operiert.

Bei der neoadjuvanten Radiochemotherapie wird parallel zur Bestrahlung eine

kontinuierliche Chemotherapie mit 5-FU mit oder ohne Folinsäure verabreicht.

In Studien konnte gezeigt werden, dass bei dieser Therapieform die Lokalrezi-

divrate im Vergleich zur alleinigen Radiotherapie signifikant reduziert wird [17,

55].

Bei Tumoren im UICC Stadium IV gibt es keine therapeutische leitliniengerech-

te Standardempfehlung. Bei irresektablen Fernmetastasen sollte, soweit mög-

lich, zunächst eine systemische Kombinationschemotherapie erfolgen. Im Falle

einer primären Radiochemotherapie ist bei systemischer Metastasierung eine

intensivierte Kombinationschemotherapie angezeigt.

Adjuvante Therapie beim Rektumkarzinom

Bei Patienten mit Rektumkarzinomen im Stadium UICC I ist keine adjuvante

Therapie indiziert, bei Tumoren im Stadium II und III ist die kombinierte Radio-

chemotherapie als Standard anzusehen. Bei Kontraindikationen gegen eine der

beiden Therapieformen ist eine alleinige Chemo- oder Radiotherapie angezeigt

[116].

Wird bei Patienten das Stadium erst postoperativ als II oder III klassifiziert, wird

eine adjuvante Radiochemotherapie empfohlen, ebenso nach einer R1-Resek-

tion oder einer intraoperativen Tumorruptur [87]. Die adjuvante Therapie be-

ginnt in der Regel 4-8 Wochen nach der Operation.

Nach neoadjuvanter Radiochemotherapie ist unabhängig vom postoperativen

Tumorstadium eine adjuvante Chemotherapie indiziert, entweder als 5-FU-Mo-

notherapie oder als Kombination aus 5-FU und Folinsäure [126].

17

Wie sich aus Statistiken ablesen lässt, ist es durch moderne Chemotherapeuti-

ka insgesamt zu einer deutlichen Lebensverlängerung gekommen.

Auch die palliative Behandlung des metastasierten Kolonkarzinoms hat sich

durch die Einführung neuer Medikamente wie Irinotecan und Oxaliplatin, der

oralen 5-FU Prodrugs und der monoklonalen Antikörper, Cetuximab und Beva-

cizumab, deutlich verbessert. Die Letzteren stellen eine komplett neue Medika-

mentenklasse dar, da sie nicht zytostatisch wirken, sondern gegen tumorzel-

lexprimierende Zytokine gerichtet sind und damit indirekt das Wachstum und

die Metastasierung hemmen. Eine Monotherapie ist ausgeschlossen.

Trotz der Therapieerfolge der letzten Jahre besteht immer noch Bedarf an Opti-

onen für primär inoperable Tumoren. Aufgrund der Erfolge monoklonaler Anti-

körper besteht großes Interesse an der Forschung weiterer Biomodulatoren, die

durch sinnvolle Kombination synergistisch wirken und den Tumor multifaktoriell

behandeln [28].

18

2.3 Einblicke in Zellzyklus, Apoptose und Angiogenese im Tumor

2.3.1 Zellzyklus

Der Zellzyklus (s. Abb. 2) ist ein hoch organisierter komplexer Prozess, der eine

vollständige und fehlerfreie Replikation der Zelle sicherstellt, bevor sie sich in

der Mitose teilt und ihr genetisches Material weitergibt [58].

Er dauert etwa 24 h und findet in vier Phasen statt, zwischen denen verschie-

dene Kontrollpunkte (engl.: „Checkpoints“) die ordnungsgemäße Übertragung

der genetischen Information von einer Zelle auf die beiden Tochterzellen garan-

tieren [74, 143].

Nach der Mitose tritt die proliferierende Zelle in die G1-Phase (G=engl. gap:

Lücke). Hier wächst die Zelle und synthetisiert ihre Bestandteile.

Fehlen wichtige Substrate oder Wachstumsfaktoren können die Zellen von der

G1-Phase in die reversible G0-Ruhephase übergehen [93], aus der sie durch

bestimmte Mitose auslösende Signale (z.B. Wachstumsfaktoren, Tumorviren)

wieder in die G1-Phase zurückkehren und dann am Zellzyklus teilnehmen

[112].

Nach dem ersten Kontrollpunkt am Ende der G1-Phase tritt die Zelle in die S-

Phase ein, in der die DNA-Replikation stattfindet. In einer zweiten Wachstums-

phase (G2) wird die DNA-Replikation kontrolliert. In diesem Stadium werden

Fehler durch DNA-Reparaturmechanismen behoben oder die Zelle wird durch

Apoptose eliminiert [143].

Daran schließt sich die eigentliche Zellteilung in der Mitose- oder M-Phase an

[74].

19

Abb. 2: Der Zellzyklus [138]

Durch die G0- und G2-Phase werden DNA-Reparaturen möglich, die die gene-

tische Integrität sicherstellen. Die Zelle wird vor unkontrollierter Proliferation

geschützt [74]. Proteine wie RB (Retinoblastom) und p53 ermöglichen den Ü-

bergang in diese Ruhephase. Ihre Mutation führt zur unkontrollierten tumorösen

Zellproliferation und klassifiziert sie als Proonkogene.

Cyklinabhängige Kinasen (CDK 1 - 8) und ihre Inhibitoren (CDKIs) sind direkt

für jeweilige Phasenübertritte maßgebend, indem sie Komplexe mit jeweils spe-

zifischen Cyclinen bilden [103].

Inhibitorisch wirken zwei unterschiedliche Proteinfamilien. Mitglieder der p16

INK4-Familie hemmen CyklinD/CDK4/CDK6-Komplexe in der frühen S-Phase,

Moleküle der P21cip/ waf - Familie wirken in der späten G1-Phase. Sie fungieren

als Gegenregulatoren des oben genannten Systems und bremsen die zelluläre

Proliferation. Fallen diese negativen Regulatoren durch Mutation oder Deletion

der Gene oder die gestörte Genexpression aus, wird eine maligne Entartung

von Zellen hervorgerufen [7].

Hauptvertreter der p21-Familie sind das sogenannte CDK-2 interagierende Pro-

tein1 (P21cip/ waf) und das Kinase inhibierende Protein (P27), das auch als direk-

ter Tumorsuppressor wirkt [58]. Die Aktivität von P21cip/ waf ist direkt abhängig

vom Tumorsuppressorgen p53. P21 inhibiert nach seiner Bindung an Cyklin-

Kinase-Komplexe die Progression von der G1-Phase in die S-Phase. So ist der

p53 vermittelte G1-Arrest in kolorektalen Karzinomzellen von p21 abhängig

[144]. Die Zelle wird in G1 arretiert und DNA-Schäden können repariert werden

20

[74]. Als Folge genotoxischen Stresses, z.B. durch Bestrahlung oder Chemo-

therapie, akkumuliert das p53-Protein in der Zelle und führt über transkriptionel-

le Aktivierung von p21 zum vorübergehenden Zellzyklusarrest, der die DNA-

Reparatur ermöglicht oder zur Einleitung der Apoptose und Elimination der Zel-

le führt [37].

Wie in der Vogelstein-Sequenz für das kolorektale Karzinom beschrieben, über-

winden viele maligne Zellen diese spezifischen Kontrollpunkte durch Mutation

von Tumorsupressorgenen aus den Familien der Zellzyklusinhibitoren. Dabei ist

p53 das in Tumoren am häufigsten mutierte Gen und findet sich besonders

häufig in gastrointestinalen Tumoren.

21

2.3.2 Apoptose

Tumore wurden lange Zeit nur als Erkrankung des Zellzyklus angesehen, näm-

lich als Folge einer unkontrollierten Zellproliferation. Inzwischen weiß man, dass

Tumore sich auch oder sogar in erster Linie durch Immortalisierung und Resis-

tenz gegenüber Apoptosestimuli auszeichnen [137].

Von den rund 1014 Zellen des erwachsenen Organismus sterben täglich etwa

1012 ab [74, 82]. Die Eliminierung der Zellen ist sehr genau geregelt, damit die

Integrität des Gesamtorganismus nicht gefährdet wird. Dieser geregelte physio-

logische Zelluntergang wird als Apoptose bezeichnet [82, 85].

Der selbstinduzierte Zelltod kennzeichnet sich durch charakteristische morpho-

logische Veränderungen. Dazu gehören eine Ausstülpung der Zellmembran

(Zeiose) mit Vesikelabschnürung (Blebbing), das Schrumpfen des Zellkerns, die

Kondensation des Chromatins und die Fragmentierung des Zellkerns sowie in

vielen Zellen die Fragmentierung der DNA [82, 148]. Makrophagen und andere

phagozytierende Zellen können apoptotische Zellen erkennen und sie durch

Phagozytose entfernen [82, 130].

Die Apoptose kann durch zwei Signalwege induziert werden [150]. Beide Fälle

führen zur Aktivierung proteolytischer Enzyme, sogenannte Caspasen. Sie spal-

ten die zellulären Substrate und induzieren die oben beschriebene apoptotische

Morphologie und DNA-Fragmentierung. Caspasen lassen sich nach ihrer Funk-

tion in zwei Klassen einteilen. Initiator-Caspasen wirken an der Induktion der

Apoptose mit (z.B. Caspase 8 und 9) und Effektorcaspasen leiten die Termina-

tion ein (z.B. Caspase 3, 6 und 7). Caspasen können entweder durch spezifi-

sche Liganden membranständiger Todesrezeptoren (death receptor pathway

oder extrinsic pathway) aktiviert werden oder durch mitochondrienabhängige

Molekülinteraktionen (mitochondrial pathway oder intrinsic pathway) [86, 100]

(s. Abb. 3).

Der Todesrezeptorsignalweg ist der am Besten erforschte Apoptoseinduktions-

mechanismus. Aktivierte transmembranöse Rezeptoren (=Todesrezeptoren)

aus der Nerve-Growth-Factor-Receptor/Tumor-Necrosis-Factor-Receptor Su-

perfamilie (NGF-/TNF-Rezeptorfamilie) [85] binden an spezifische Liganden

und trimerisieren und aktivieren durch ihre zytoplasmatische Domäne (death

domains) intrazelluläre Adapterproteine [85, 147]. Diese aktivieren Caspase 8,

22

die wichtigste Initiator Caspase. Die aktive Caspase 8 setzt die Kaskade der

Effektormechanismen in Gang. Das bekannteste Beispiel für diesen Mechanis-

mus ist die Bindung von Fas-Ligand (FasL) an den Fas Rezeptor (CD95) [85].

Allerdings kann die Apoptose auch durch Vermittlung über die Mitochondrien

erfolgen. Hierbei spielt der Verlust des transmembranösen mitochondrialen Po-

tentials durch Permeabilisierung der inneren Mitochondrienmembran eine zent-

rale Rolle, so dass Proteine aus dem Intermembranraum in das Zytoplasma

gelangen [85, 100]. Die Caspase-Kaskade wird hier vor allem über das in das

Zytoplasma freigesetzte Cytochrom C der Mitochondrien aktiviert [9]. Cytoch-

rom C bindet an Apaf-1 (Apoptotic Protease Activating Factor 1), das unter

ATP-Verbrauch Caspase 9 aktiviert. Diese aktiviert ihrerseits die Effektor-

Caspasen 3 und 7, womit die gemeinsame Endstrecke beider Apoptosewege

erreicht ist [9, 30]. Die Regulation erfolgt über Mitglieder der Bcl-Familie (z.B.

Bax, Bcl-2).

Zur Apoptosehemmung gibt es verschiedene Möglichkeiten. Die Proteinfamilie

IAP (inhibitor of apoptosis proteins) hemmt durch die Blockade der Effektor-

Caspasen 3 und 7 beide Apoptosewege gleichermaßen [66]. Zusätzlich hat

jeder der beiden Apoptosewege noch eigene Regulatoren. Der mitochondrial

pathway wird hauptsächlich durch die Proteine der Bcl-2-Familie kontrolliert, der

death receptor pathway z.B. durch cFLIP (cellular FLICE like inhibiting protein)

[3, 69, 81].

Weiterhin gibt es auch caspaseunabhängige Wege der Apoptoseinduktion. Eine

Expression von Zellzyklusinhibitoren führt neben dem Zellzyklusstop auch zur

apoptosespezifischen DNA-Spaltung. p53 hat nicht nur Einfluss als negativer

Wachstumsregulator auf den Zellzyklus, sondern spielt auch eine entscheiden-

de Rolle bei der Initiation der Apoptose [108]. Der genaue Mechanismus p53

vermittelter Apoptose ist im Detail noch nicht aufgeklärt.

23

Abb. 3: Aktivierung des mitochondrialen und des Death-Rezeptor-vermittelten Apopto-se- Signalwegs [74]

Die Apoptose ist somit ein wesentliches Element für die Erhaltung der Gewebe-

homöostase. Die Massenzunahme von Tumoren beruht bekanntlich auf einem

ungesteuerten Wachstum und einer reduzierten Apoptoserate. Tumorzellen

gewinnen einen Selektionsvorteil, wenn sie durch Mutation eine größere Apop-

toseresistenz entwickeln [137]. Die genaue Kenntnis der apotoseinduzierenden

Mechanismen und der einer Krebserkrankung zugrunde liegenden genetischen

Abweichung ermöglicht es, gezielt Chemotherapeutika zu entwickeln, die die

Apoptosesensitivität wieder herstellen [40, 79].

24

2.3.3 Angiogenese im Tumor

Neoangiogenese ist ein lebenswichtiger Bestandteil der embryonalen Entwick-

lung, ist aber auch im erwachsenen Organismus z.B. am Menstruationszyklus

der Frau oder dem Haarwachstum beteiligt. Angiogenese findet sich aber auch

in pathophysiologischen Vorgängen z.B. bei der diabetischen Retinopathie,

dem Herzinfarkt, der altersbedingten Makuladegeneration, der Psoriasis vulga-

ris und bei der rheumatoiden Arthritis [24, 42, 47] und sie spielt eine Schlüssel-

rolle bei Tumorwachstum, Progression und Metastasierung.

Bereits vor 40 Jahren erkannte Folkman, dass bei malignen Erkrankungen die

Neubildung von Blutgefäßen Voraussetzung für das Wachstum solider Tumore

und der Metastasierung ist [49]. Tumorzellen benötigen ab einer Größe von 3

mm3 eine eigene Gefäßversorgung [44]. Aus diesem Grund sezernieren die

Tumorzellen spezifische proangiogenetische Mediatoren, z.B. bFGF (basic

fibroblast growth factor) und VEGF (vascular endothelial growth factor). Diese

binden dann an Rezeptoren bereits vorhandener Endothelzellen, die daraufhin

proliferieren und proteolytische Enzyme (Matrixmetalloproteinasen, MMP) pro-

duzieren. Diese können die umgebene Matrix lysieren und bieten damit die

Voraussetzung für die Migration der Endothelzellen in die Umgebung [43, 49].

Der antitumoralen Therapie dienen Angiogeneseinhibitoren, die die Endothel-

zellen und proangiogenetische Faktoren hemmen. Physiologisch werden zur

Regulation der Gefäßbildung die proangiogenetischen Faktoren im Gleichge-

wicht mit natürlichen Angiogenesehemmstoffen gehalten. Dazu zählen bei-

spielsweise Endostatin (Spaltprodukt des Kollagen XVII, Hemmung der Endo-

thelzell-Proliferation und -Migration), Angiostatin (Spaltprodukt des Plasmino-

gens, Hemmung der Proliferation), Hemmer der MMPs und auch die Vitamin A-

Säure, welche die Endothelzell-Proliferation, die gerichtete Migration und die

Bildung eines Gefäßlumens reduziert [18, 70]. Demnach könnte eine antitumo-

rale Therapie mit Retinoiden eventuell auch die Neoangiogenese des Tumors

einschränken.

Die natürlichen Hemmstoffe sind jedoch nur schwer in einer ausreichenden

Menge zu synthetisieren und müssen zudem teilweise parenteral verabreicht

werden, so dass andere Methoden zur Angiogeneseinhibition erforderlich sind

[23, 32].

25

Der endothelspezifische Wachstumsfaktor VEGF ist ein potenter angiogener

Faktor. Es konnte gezeigt werden, dass VEGF der wichtigste Regulator von

normalem und abnormalem Blutgefäßwachstum ist und seine Expression in

soliden Tumoren prognostisch relevant ist [31, 140].

VEGF wird in Tumorzellen und Makrophagen gebildet und sezerniert. Das an-

giogene Signal wird über zellmembranständige Rezeptoren VEGF-R1 (flt-1),

VEGF-R2 (KDR) und VEGF-R3 der Blutgefäßendothelien vermittelt [6, 16] und

erhöht so die mikrovaskuläre Permeabilität, stimuliert Endothelzellwachstum

und fördert Angiogenese und Lymphangiogenese [80].

Spezifische Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitoren können die Phosphorylierung

der Kinasedomäne verhindern und so die Zellantwort auf VEGF unterbinden.

Diese Substanzen inhibieren daher selektiv die VEGF-induzierte Tumorangio-

genese.

26

3 Versuchsaufbau (Zelllinie: CC531)

3.1 Medikamente (Biomodulatoren)

3.1.1 Tamoxifen (TAM)

Tamoxifen gehört zur Gruppe der Antiöstrogene. Es blockiert die peripheren

Wirkungen der Östrogene durch Bindung an Östrogenrezeptoren [106]. Es wird

gastrointestinal nur langsam, aber vollständig resorbiert und hat somit eine Bio-

verfügbarkeit von 100% [62]. Tamoxifen hat eine Halbwertszeit von über sieben

Tagen und wird unter anderem als 4-Hydroxytamoxifen vorwiegend biliär aus-

geschieden [106].

Aufgrund seiner Wirkungsweise wird Tamoxifen derzeit in der adjuvanten und

palliativen Therapie des östrogenrezeptorpositiven Mammakarzinoms einge-

setzt [64]. Seine Wirkung beruht dort darauf, dass die Bindung von Tamoxifen

eine Dimerisierung des Rezeptors auslöst, der dann durch Bindung an ver-

schiedene DNA-Sequenzen (z.B. die Transaktivationsdomänen AF-1 und AF-2)

Genexpression und Wachstumsverhalten der Zellen beeinflusst [20].

Als seltene Nebenwirkungen wurden vor allem Kopfschmerzen, gastrointestina-

le Beschwerden, allergische Reaktionen und Flushs, Venenentzündungen, De-

pressionen sowie Thrombo- und Leukozytopenien beschrieben [62]. Weiterhin

wurden genomtoxische Effekte und die Entwicklung endometrialer Karzinosen

unter Tamoxifentherapie beobachtet [106].

Ergänzend zu der Wirkung der östrogenpositiven Zelllinien wurde auch ein pro-

apoptotischer und zytostatischer Effekt von Tamoxifen bei östrogennegativen

Zellinien, wie Prostata, cholangiozellulären oder hepatozellulären Karzinomen

(HCC), nachgewiesen [72, 121].

Sowohl in vitro als auch am Rattenmodell gewonnene Daten bestätigten den

positiven Effekt einer Monotherapie mit Tamoxifen für kolorektale Karzinome

[151, 152]. Auch die Kombination von Tamoxifen mit anderen Medikamenten

zeigte in vitro schon positive Wirkung auf das kolorektale Karzinom [71, 128].

Die Wirkungsweise von Antiöstrogenen auf östrogennegative Tumore ist noch

unklar. In der Literatur werden unter anderem eine TGFß- oder bcl2-vermittelte

Induktion der Apoptose [11, 113, 149], eine Aktivierung der Caspasen-Kaskade

27

durch oxidativen Stress [96] und eine Hemmung der Neoangiogenese [14] dis-

kutiert.

Beim HCC wurde TAM als Monotherapie in verschiedenen Studien [27, 98] ein-

gesetzt, erreichte aber keine positiven Effekte. Im Rahmen einer Kombinations-

therapie mit TAM/CRA war es jedoch erfolgreich [53].

3.1.2 9-cis-Retinsäure (CRA)

Retinoide, wie z.B. 9-cis-Retinsäure (CRA), all-trans-Retinsäure (ATRA, Treti-

noin) und auch die 13-cis-Retinsäure (Isoretinoin), sind essentiell für die Diffe-

renzierung epithelialer Gewebe und spielen eine Rolle in verschiedenen Pro-

zessen wie Zellwachstum und Apoptose [65].

Retinol (Vitamin A) kann über Retinal weiter zu Retinsäure oxidiert werden. Re-

tinsäuren werden oral vollständig resorbiert und sind zu mindestens 30 % bio-

verfügbar [62].

Im Plasma liegen die Retinoide gebunden an das retinol binding protein (RBS),

intrazellulär an CRBS (cellular retinoid binding protein) bzw. CRABS (cellular

retinoid acis binding protein) vor [65, 107]. Die Wirkung der Retinoide wird

durch ligandenbesetzte Rezeptoren vermittelt [92]. Nach einer Translokation

dieser Komplexe in den Zellkern erfolgt eine Interaktion mit zwei Gruppen

nukleärer Retinoidrezeptoren (RAR = retinoid acid receptor und RXR = retinoid

X receptor), mit ihren Subtypen alpha, beta und gamma. Diese haben als

Transkriptionsfaktoren direkten Einfluss auf die Genexpression von Regulator-

proteinen des Zellzyklus, z.B. Wachstumsfaktoren und Differenzierungsfaktoren

[92]. Aktivierte RAR und RXR bilden dann Heterodimere, sogenannte RARE

(retinoic acid response elements) oder RXRE (retinoic X response elements).

Diese können mit den Promotoren der Zielgene interagieren und so deren

Transkription modulieren [65, 92].

Nicht alle Retinoide sind gleichermaßen in der Lage, an RAR und RXR-Re-

zeptoren zu binden. So vermittelt ATRA, das in vivo in CRA umgewandelt wer-

den kann [62], seine Wirkung lediglich über RAR [92]. CRA bindet zwar an bei-

de Rezeptorklassen, die höchste Affinität besteht jedoch zu RXR alpha, das die

Apoptoseinduktion vermittelt [92]. Neuere synthetische Retinoide wie Adapale-

ne binden ebenfalls mit sehr hoher Affinität an beide Rezeptorklassen [109].

28

Retinoidrezeptoren sind mit den Steroid- und den Thyroidhormonrezeptoren

verwandt. Daher ist eine Wechselwirkung zwischen den Bindungspartnern die-

ser Rezeptorgruppen möglich, z.B. zwischen Tamoxifen (Steroidrezeptor) und

9-cis-Retinsäure (RAR-Rezeptor) [53, 71, 153].

Klinisch werden Retinoide derzeit für zwei Indikationen eingesetzt. Zum einen

wird Isoretinoin (13-cis-Retinsäure) in der Dermatologie zur topischen Behand-

lung der Psoriasis und Acne vulgaris eingesetzt, welche durch Entdifferenzie-

rung der epidermalen Zellen charakterisiert ist [122, 134]. Zum anderen kann

ATRA bei der Therapie der akuten promyeloischen Leukämie [110] zeitweise

eine Remission erzeugen, falls durch die chromosomale Translokation t(15; 17)

eine Fusion zwischen dem RAR-Rezeptor und dem PML (promyelocytic leuke-

mia protein) entstanden ist [5, 62, 65].

In vitro Versuche haben gezeigt, dass Retinoide das Wachstum und die Diffe-

renzierung von kolorektalen Karzinomen, abhängig von deren Zelltyp und Reti-

noid-Rezeptor-Status beeinflussen [2, 71, 90, 131]. Am hepatozellulären Karzi-

nom wird in mehreren Studien von einem apoptosefördernden Effekt berichtet

[72, 99, 111].

Die Nachteile von ATRA und CRA gegenüber neueren synthetischen Analoga

sind die hohe Lichtsensitivität und das hohe teratogene Potential dieser Sub-

stanzen [62].

3.1.3 VEGF-Rezeptor-Antagonist ZK222 584: (ZK, Vatalanib )

Wie bereits in Kapitel 2.3.3 beschrieben, ist die antiangiogenetische Therapie

eine Möglichkeit Tumorwachstum und Metastasierung zu hemmen [34, 43]. Der

spezifische orale Tyrosinkinase-Inhibitor ZK222 584 (ZK) wurde in der Klinik für

Tumorbiologie in Zusammenarbeit mit den Firmen Novartis und Shering entwi-

ckelt und gehört in die chemische Klasse der Aminophthalazine. Er inhibiert die

Kinaseaktivität aller VEGF-Rezeptoren (VEGFR-1, -2, -3), mit größerer Potenz

gegen VEGFR-1 und VEGFR-2 sowie mit geringerer Potenz gegen PGDF-ß

und c-kit, c-Fms [34, 80, 135]. ZK wirkt gegen Zellen, die keine VEGF-Rezep-

toren auf ihrer Oberfläche haben, weder cytotoxisch noch antiproliferativ [146].

29

Der Effekt von ZK auf eine tumorzell-induzierte Angiogenese wurde in vivo im

subcutanen Nacktmausmodell für verschiedene Tumorentitäten getestet. Es

kam zu einer dosisabhängigen Inhibierung des Tumorwachstums und der Angi-

ogeneserate, welche beim humanen Prostatakarzinom am stärksten ausfiel [73,

146]. Histologische Untersuchungen zeigten eine Inhibition der Formierung von

Mikrogefäßen im Tumor [146].

Verschiedene Studien zeigten, dass VEGF in der Angiogenese, Metastasierung

und Proliferation von kolorektalen Karzinomen eine bedeutende Rolle spielt [34,

89, 102, 132].

Wie bereits in Kapitel 2.2 beschrieben, ist Bevacizumab (Avastin R), ein mo-

noklonaler Antikörper gegen VEGF Rezeptoren, bereits für den Einsatz bei ko-

lorektalen Karzinomen zugelassen [133, 136].

Thomas konnte 2007 in einer klinischen Studie zeigen, dass die maximal tole-

rierte Dosis von ZK in Kombination mit einem FOLFOX Chemotherapie Regime

1250 mg/Tag ist und dies in einem Dosisbereich liegt, in dem nachweislich bio-

logische Aktivität im Tumor gezeigt werden kann. Die Behandlung wurde von

den Patienten gut vertragen und zeigte keine pharmakologischen Interaktionen.

[67, 102, 136].

Vatalanib (ZK) ist die orale Form von ZK222 584, das alle bekannten VEGF

Rezeptoren inhibiert. Er wird bereits in klinischen Studien für die Behandlung

verschiedenster solider Tumore, wie Mamma-, Gehirn-, Prostata-, Lungen-, Nie-

renzell-, Leberkarzinomen und dem kolorektalen Karzinom getestet [80].

ZK wird im Allgemeinen gut vertragen. Zu den häufigen Nebenwirkungen zäh-

len Übelkeit, Müdigkeit, Erbrechen und Schwindelgefühle. Weiterhin kann es zu

erhöhtem Blutdruck und thrombembolischen Ereignissen kommen [146].

30

3.1.4 Histondeacetylasehemmer MS-275 (MS)

Das Medikament MS-275 (MS) ist ein Histon-Deacetylase-Hemmer. Histone

sind basische Proteine. Sie bilden Komplexe mit DNA und stellen den Protein-

anteil des Chromatins dar [101]. Das Ablesen der Gene an der DNS wird unter

anderem durch die epigenetische Acetylierung und Deacetylierung der Histone

reguliert und durch zwei gegensätzliche Enzyme, den Histon-Acetyl-Trans-

ferasen (HAT) und den Histon-Deacetylasen (HDAC, auch HDA oder HD) aus-

geführt [73].

Durch Acetylierung der Histone kommt es zu einer Konformationsänderung der

DNA und dadurch zu einer höheren Zugänglichkeit für Endonukleasen, so dass

Transkriptionsfaktoren vermehrt an entsprechende Promotor-Regionen binden

können, wie den Zellzyklus-Regulator-Genen, die dann vermehrt transkribiert

werden.

Durch eine Deacetylierung werden die Genpromotoren ensprechend inhibiert.

Betroffen sind vor allem Apoptoseindukoren und Zellzyklusregulatoren.

Histon-Deacetylase-Inhibitoren führen durch Hemmung von Histon-Deacetyl-

asen zur Hyperacetylierung und „Lockerung“ der Chromatinstruktur. Dadurch

können sie Apoptose, Zellzyklusarrest und Differenzierung auch in malignen

Zellen rekonstituieren [97]. Weiterhin ermöglichen sie die Wiederaufnahme der

Transkription von Tumorsuppressorgenen sowie die verstärkte Expression pro-

apoptotischer Proteine [63, 110].

In verschiedenen Arbeiten wird außerdem eine Erhöhung der Zytotoxizität an-

derer am Chromatin angreifender Zytostatika sowie eine Steigerung der Radio-

sensitivität von malignen Zellen durch HDAC-I beschrieben [21, 22, 68, 141].

MS ist ein synthetisches Benzamid-Derivat und aktuell der potenteste HDAC-

Hemmer seiner Klasse. MS inhibiert Histon-Deacetylasen und verursacht eine

Hyperacetylierung der nukleären Histone in verschiedenen Tumorzelllinien

[120].

Er wurde bereits in mehreren in vitro- und in vivo- Modellen für solide Tumore

(Mammakarzinom, kolorektales Karzinom, Leukämie und Lungenkrebs) erfolg-

reich getestet [1, 118, 119].

31

Die Nebenwirkungen sind relativ gering. Am häufigsten zeigten sich gastroin-

testinale Beschwerden und Übelkeit, Kopfschmerzen, Blutbildveränderungen

und Depressionen [119].

Ein in Amerika bereits zugelassener Inhibitor der Histon-Deacetylase für die

Behandlung des kutanen T-Zell Lymphoms ist Varinostat [36]. In Studien konn-

te bereits gezeigt werden, dass Varinostat potente antiproliferative Wirkung in

Kolorektalkarzinom-Zelllinien hat [33, 114].

Die Grundlage dieser Arbeit besteht darin, den Tumor durch Kombination ver-

schiedener Biomodulatoren, die parallel möglichst viele Ebenen der Tumorent-

wicklung beeinflussen (Apoptose, Proliferation und Angiogenese), anzugreifen.

Zielparameter war dabei das makroskopische Tumorwachstum. Daneben wur-

den immunhistochemisch die Zellproliferation, die Apoptoseinduktion und die

Chemotaxis überprüft (s. Abb. 4).

Abb. 4: Wirkungsweise der eingesetzten Biomodulatoren

Zelle

Neoangio-

genese

Tumor und

Metastasie-

rung

Modifikation

Extrazellulä-

re Matrix

Entdiffe-

renzierung,

Wachs-

tumskon-

trolle

Apoptose

ZK

Retinoide

TAM

MS

32

3.2 Tiermodell

Die Versuchsreihe bestand aus 48 männlichen WAG Ratten.

Die Tierhaltung und das experimentelle Vorgehen wurden von der Regierung

Mittelfranken bewilligt und gemäß den in ILAR veröffentlichten Empfehlungen/

Richtlinien von „The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“

durchgeführt [26].

Zunächst wurden Kolonkarzinom-Zellen (Zelllinie CC531) in vitro in DMEM

(Dulbecco´s Modified Eagle Medium) mit 10 % fetalem Kalbsserum, 100 U/l

Penicillin, 10 mg/l Streptomycin, 10 nM Dexamethason und 0,2 nM Insulin bei

37 °C unter 5 % CO2 kultiviert. Diese Zellen wurden trypsinisiert und in einer

Konzentration von 10.000 Zellen/µl in Phosphat-Puffer-Lösung (PBS) (s. Anlage

5) resuspendiert. 100 µl dieser Zellsuspension mit 1x106 Zellen wurden sub-

kapsulär in die Leber der Versuchsratten implantiert.

Vor der Operation wurden die Tiere in Diethylether narkotisiert und ihr Gewicht

dokumentiert. Das Bauchfell der Tiere wurde rasiert und desinfiziert. Nach ei-

nem ca. 2 cm langen Paramedianschnitt wurde die Leber luxiert und in Koch-

salz getränkte Tupfer gebettet. Mit einer 24G-Kanüle wurde die Zellsuspension

subkapsulär injiziert. Blutungen aus der Injektionsstelle wurden durch Kompres-

sion und mit resorbierbarem fibringetränkten Gewebe (Tabotamp) gestillt.

Die Leber wurde zurückverlagert und das Abdomen schichtweise mit resorbier-

barem Nahtmaterial (Dexon II, 3,0 Ethikon) verschlossen. Zum Abschluss wur-

de das Operationsgebiet nochmals desinfiziert. Die Ratten erhielten postopera-

tiv zur Schmerztherapie fünf Tage lang 2,5 mg/kg KG Novalgin ins Trinkwasser.

Ab dem siebten postoperativen Tag wurden die zu prüfenden Medikamente täg-

lich intraperitoneal injiziert. Dabei bekamen die Versuchstiere die in der Tabelle

3 aufgeführten Mono- bzw. Kombinationsbehandlungen. Sechs Tiere wurden

nicht behandelt und dienten als Kontrollgruppe. Fünf Versuchstiere verstarben

bzw. wurden euthanisiert und konnten in die Auswertung nicht mit einbezogen

werden.

33

Tierzahl Beginn Tierzahl Ende Gestorben

Placebo 6 6 0

TAM 6 5 1

CRA 6 6 0

TAM/CRA 6 5 1

ZK 6 6 0

ZK/MS 6 5 1

ZK/MS/TAM 8 7 1

ZK/MS/TAM/CRA 4 3 1

Tabelle 3: Anzahl der Versuchstiere und ihre Behandlungsform.

Die Dosierung der Medikamente berechnete sich aus früheren Untersuchungen

bzw. den Empfehlungen des Herstellers.

Tamoxifen 10 mg/kg KG i.p. täglich

9-Cis Retinsäure 6 mg/kg KG i.p. täglich

PTK787/ ZK222 584 50 mg/kg KG i.p. täglich

MS-275 3 mg/kg KG i.p. täglich

Nach 21 Tagen Behandlung wurden die Ratten unter Ethernarkose getötet.

34

3.3 Makroskopische Beurteilung

Post mortem wurden die Ratten erneut gewogen. Nach Öffnung des Situs wur-

de Blut aus der rechten Herzkammer abgezogen und die Leber herausgenom-

men. Der Tumor wurde ausgemessen und der Grad der Metastasierung und

der Organzustand dokumentiert. Jeder Ratte wurden Tumoranteile, Material

aus dem Tumorrandgebiet, Lungengewebe, Sternumgewebe und bei sichtbaren

Metastasen auch Nieren, Milz und Teile des Peritoneums entfernt.

Die Gewebe wurden asserviert und innerhalb von fünf Minuten in flüssigem

Stickstoff bzw. 5%-gepuffertem Formalin für die immunhistologischen Untersu-

chungen fixiert.

3.4 Immunhistologie

Das in Formalin fixierte Gewebe wurde in Paraffin eingebettet und mit dem

Mikrotom in 6 µm dünne Schichten geschnitten und auf Objektträger aufge-

bracht.

Bevor die Schnitte mit verschiedenen Antikörpern behandelt werden konnten,

mussten sie mit der nachfolgenden Xylol-Alkoholreihe entparaffiniert werden.

30 min Xylol (Tissue clear)

2 x 5 min Isopropanol

2 x 5 min Ethanol 96 %

2 x 5 min Ethanol 70 %

2 x 5 min Aqua dest.

2 x 5 min Tris-Puffer pH 7,4 (s. Anlage 5)

Im Anschluss wurden die Schnitte zur Hitzedemaskierung einmal 8 min bei 600

Watt und einmal 8 min bei 800 Watt erhitzt und anschließend 20 min in Citrat-

Puffer (s. Anlage 5) abgekühlt.

Sie wurden dann dreimal 2 Minuten lang mit Aqua dest. auf der Rüttelbank ge-

spült und für die PCNA und CD8 Färbung 1,5 min bei Raumtemperatur mit Pro-

teinkinase K 0,03 % (Firma: GlaxoSmithKline) inkubiert und anschließend wie-

der mit Aqua dest. gespült.

35

Zur Blockade des endogenen Biotins wurden die Schnitte für 15 min in Hühner-

eiweiß (2 EW mit 200 ml Aqua dest.) inkubiert, erneut mit Aqua dest. gespült

und wiederum 15 min in fettarmer H-Milch (1,5 % Fett) inkubiert. Nach weiterem

gründlichem Spülen in Aqua dest. wurden die immunhistologischen Färbungen

durchgeführt.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei verschiedene Antikörper verwendet:

PCNA (Proliferating cell nuclear antigen), CD8 und TUNEL-Assay (terminal de-

oxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated deoxyuridinetriphosphatase (dUTP)

nick endlabeling).

3.4.1 PCNA und CD8

PCNA ist ein Hilfsprotein der DNA-Polymerase Delta, das sich überwiegend in

der späten S-Phase nachweisen lässt. Die PCNA-Expression ist in der G1-

Phase leicht erhöht und erhöht sich weiter in der DNA-Synthesephase. In der

G2-Phase sinkt der PCNA-Gehalt auf Werte, die zwischen denen der G1- und

S-Phase liegen. Das zeitabhängige Auftreten von PCNA im Zellzyklus macht es

zu einem geeigneten Marker für die Zellproliferation. Unter Bedingungen, in de-

nen die Zellproliferation abnimmt, wird auch dieses Polypeptid vermindert nach-

gewiesen [104].

Bei den CD-Molekülen handelt es sich meistens um membrangebundene Gly-

koproteine, die teilweise zellspezifisch exprimiert werden und verschiedenste

Funktionen haben können.

Der CD8-Rezeptor oder einfach nur CD8 ist ein Erkennungsmolekül, das eine

wesentliche Rolle im Immunsystem eines höheren Organismus spielt. Es han-

delt sich dabei um ein Protein, welches in die Zellmembran von cytotoxischen

T-Killerzellen eingebaut ist.

Dabei erkennt der T-Zellen-Rezeptor mit Hilfe des CD8 den MHC-I-Komplex

(Major Histocompatibility Complex) auf körpereigenen Zellen. Alle Zellen des

Körpers produzieren diesen MHC-I-Komplex und präsentieren dort die zelleige-

nen Proteine. Cytotoxische T-Zellen erkennen, aufgrund der embryonalen Prä-

gung im Thymus, ob es sich um körpereigene Proteine oder um körperfremde

36

Proteine handelt (z.B. virale Proteine, Tumorzellen). Erkennen sie fremde Pro-

teine wird die Zielzelle zerstört [105].

In dieser Arbeit wird eine mögliche Chemotaxis der CD8-Zellen vor und nach

einer Behandlung überprüft.

Da beide Färbungen nach der Biotin/Streptavidin-Methode erfolgen, werden sie

hier zusammen behandelt.

Diese Färbemethode wird heute bevorzugt eingesetzt. Das Prinzip nutzt die

hohe Affinität von Streptavidin (Streptomyces avidinii) und Avidin (Hühnerei-

weiß) für Biotin. An den Primärantikörper wird ein Brückenantikörper gekoppelt,

der mit Biotin markiert ist. An diesen biotinylierten sekundären Brückenantikör-

per bindet der mit alkalischer Phosphatase konjugierte Streptavidin-Komplex.

Durch eine enzymatische Reaktion mit dem Farbsubstrat FastRed, das eine

Bindung mit der alkalischen Phosphatase eingeht, wird dieser Komplex sichtbar

gemacht [15].

Nach der oben beschriebenen Vorbehandlung wurden die Schnitte in das Co-

ver-Plate-System eingestellt und mit Tris-Puffer pH 7,4 gespült.

Der Primärantikörper wurde entsprechend verdünnt, jeweils 200 µl der Lösung

wurden auf die Schnitte aufgetragen und bei 4°C über Nacht inkubiert. Die

Schnitte wurden im Anschluss mit Tris-Puffer-Brij und Tris-Puffer gespült und

danach mit je 200 µl des verdünnten biotinylierten Sekundärantikörpers bei

Raumtemperatur für 60 min inkubiert.

Primärantikörper Sekundär-/Brückenantikörper

PCNA Maus anti Ratte (Novocastra),

1:100

22 µl AK + 2178 µl Tris Puffer

Kaninchen anti Maus (DAKO),

1:50

44 µl AK + 2156 µl Tris Puffer

CD 8 Maus monoklonal (Pharmin-

gen), 1:200

11 µl + 2189 µl BSA

Kaninchen anti Maus (DAKO),

1:50

44 µl AK + 2156 µl Tris Puffer

37

Die Schnitte wurden erneut mit Tris-Puffer gespült, mit je 200 µl des Streptavi-

din-AB-Komplexes (5 ml Tris-Puffer pH 7,4; 1 Tropfen Lösung A, 1 Tropfen Lö-

sung B) behandelt und für 30 min bei Raumtemperatur belassen.

Nach wiederum zweimaligem Spülen mit Tris-Puffer wurden die Schnitte bei

Raumtemperatur mit Fast Red (s. Anlage 5) über 20 min eingefärbt, 10 min un-

ter fließendem Leitungswasser gespült und für 20 sec in Hämalaun (1:2 mit

destilliertem Wasser) gegengefärbt. Zum Schluss wurden die eingefärbten

Schnitte noch einmal mit Aqua dest. gespült, bevor sie mit dem wasserlöslichen

Eindeckmittel Aquadex eindeckt wurden.

Abb. 5: PCNA-Färbung bei Therapie mit Abb. 6: CD8-Färbung bei Therapie mit TAM/ CRA ZK/MS Rot: Zellen in der Proliferation Rot: T-Killerzellen (Maßstab: 25:1) (Maßstab: 25:1)

38

3.4.2 TUNEL

TUNEL ist ein enzymatisches Assay, um an fixierten Zellen DNA-Fragmen-

tierungen in situ nachzuweisen. Diese DNA-Fragmente sind das Endprodukt

der Caspase-Kaskade und der Apoptose. Sie wurden mit einem „in-situ Cell

Death detection POD“ (Roche 1 684 817) nach Herstellerempfehlung darge-

stellt.

Es kommt durch Degradierung der DNA zu Fragmenten mit freien 3´-OH-

Enden, die man mit dem Enzym TdT (Terminal desoxynukleotid Transferase),

eine DNA-Polymerase, markieren kann.

In der TUNEL-Färbung wird mit Biotin konjugiertes UTP (Uridin) mit den 3´-OH-

Enden der durch Apoptose fragmentierten DNA durch TdT verknüpft. Dies wird

nach Zugabe eines Entwicklers und Gegenfärbung der Zelle sichtbar.

Nach der Vorbehandlung wurden die Schnitte mit 200 µl Proteinkinase K über

30 min bei 37 °C im Brutschrank inkubiert und anschließend zweimal mit PBS

gewaschen. Zur Blockade der endogenen Peroxidase wurde für 10 min in 100

µl 3%iger H2O2-Methanol-Lösung bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneu-

tem zweimaligem Spülen mit PBS wurden 50 µl der Reaktionslösung, ein Ge-

misch aus fluoreszierenden Nukleotiden und TdT (Roche Kit, Flasche 1 und 2),

auf die Schnitte aufgetragen. Die Objektträger wurden mit Parafilm abgedeckt

und bei 37°C für 60 min in einer feuchten Kammer inkubiert. Daraufhin wurde

erneut dreimal in PBS gespült bevor 50 µl des POD-Konverters (Peroxidase

konjugierte anti-Fluoreszein-Antikörper) für 30 min bei 37°C auf die Schnitte

aufgetragen wurden. Nach erneutem Spülschritt mit PBS wurden die Objektträ-

ger mit dem Farbsubstrat DAB für weitere 10 min inkubiert. Anschließend wurde

nochmals gespült und die Schnitte für 7 min mit 2,5%igem Methylengrün ge-

gengefärbt. Zum Abschluss wurde für je 15 sec in 75%igem und 96%igem Al-

kohol gespült und mit Entellan eingedeckt.

Abb. 7: TUNEL-Färbung bei Therapie mit CRA

Braun: Zellen mit DNA-Fragmentierungen

(Maßstab: 25:1)

39

3.5 Mikroskopische Auswertung

Nach immunhistologischer Bearbeitung der Schnitte mit den verschiedenen An-

tikörpern wurden die Schnitte lichtmikroskopisch (Axiophot, Nikon coolpix 995,

Zeiss) untersucht und abfotografiert. Anschließend wurden die angefärbten Zel-

len mit dem Programm Cell Explorer 2001 von BioScitec gezählt und die Er-

gebnisse ausgewertet. Zur Quantifizierung der PCNA und TUNEL positiven Zel-

len wurden unter dem Mikroskop zufällig sieben „high power fields“ pro Ge-

sichtsfeld in 250 facher Vergrößerung ausgewählt und abfotografiert (s. Abb. 5-

7). Es wurden je Kontroll-/Behandlungsgruppe drei bis sieben Tiere ausgewer-

tet.

40

4 Ergebnisse

4.1 Makroskopische Ergebnisse

Bei den unbehandelten Tieren zeigte sich erwartungsgemäß nach 28 Tagen

das größte Tumorvolumen (s. Abb. 8). Es lag im Durchschnitt bei 11,6 cm3,

streute aber bedingt durch die individuelle Entwicklung der Versuchstiere im

Bereich von 0,2 bis 38 cm3 erheblich. Die Einzelmedikamente zeigten eine un-

terschiedliche Tumorreduktion. Während die Behandlung mit ZK nur eine gerin-

ge Abnahme des Tumorvolumens von etwa 20 % bewirkte, reduzierte die Ein-

zelbehandlung mit TAM das Volumen um 40 % auf 7,1 cm3. CRA zeigte hier die

beste Wirkung und reduzierte das Tumorvolumen auf etwa 40 % der Kontroll-

gruppe.

11,6

7,1

4,4

10,2

2,9

1,5

2,4 2,4

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

cm3

Placebo TAM CRA ZK TAM/CRA ZK/MS ZK/MS/TAM ZK/MS/TAM/CRA

Abb. 8: Einfluss ausgewählter Biomodulatoren auf das Tumorvolumen

Kombinationspräparate zeigten eine deutlich bessere Wirksamkeit. Das Tumor-

volumen nahm um mehr als drei Viertel ab, wobei mit Ausnahme der Kombina-

tion ZK/MS die Unterschiede nicht signifikant waren. Sowohl die Dreier- als

auch die Viererkombination erbrachten keine höhere Reduktion als die Kombi-

nation TAM/CRA. Obwohl in der Einzeldosierung ZK die geringste Effektivität

hatte, zeigte es in der Kombination mit MS eine Reduktion des Volumens auf

durchschnittlich 11 % und damit gegenüber den Placebotieren die beste Wir-

kung. Auch hier ergab eine weitere Kombination mit TAM/CRA keine weitere

Effektivität.

41

Metastasierung und Gewichtsdifferenzen:

Ausgehend von Ausgangsgewichten zwischen 240 und 301 g haben mit einer

Ausnahme alle Placebotiere während der Versuchsphase um 3 bis 40 g zuge-

nommen, einerseits bedingt durch das Wachstum des induzierten Tumors,

dann aber auch durch sekundäre Einflüsse, wie Aszites.

Alle behandelten Tiere haben in Folge der Applikation an Gewicht verloren. Und

zwar bei den Kombinationspräparaten deutlich stärker als bei der Einzeldosie-

rung (s. Abb. 9).

20,5

-18,2

-13,0 -13,0

-30,8

-17,4

-35,4

-21,0

-40,0

-30,0

-20,0

-10,0

0,0

10,0

20,0

30,0

g

Placebo TAM CRA ZK TAM/CRA ZK/MS ZK/MS/TAM ZK/MS/TAM/CRA

Abb. 9: Einfluss ausgewählter Biomodulatoren auf das Gewicht

Zudem entwickelten die Tiere Metastasen in Lunge, Milz, Nieren, Peritoneum

und Bauchwand. Hier zeigten sich vor allem bei den Dreier- und Viererkombina-

tionen deutlich weniger Metastasen (s. Tabelle 4).

42

Placebo

(n=6)

TAM

(n=5)

CRA

(n=6)

ZK

(n=6)

TAM/

CRA

(n=5)

ZK/MS

(n=5)

ZK/MS/

TAM

(n=7)

ZK/MS/

TAM/CRA

(n=3)

Lungen-

metastasen

Grad

6

3

5

2-3

6

3

6

2-3

5

3

5

1-2

3

3

1

1

Abdominal-

metastasen

Grad

6

3

5

2

6

2-3

6

2

5

2

5

2

5

1-2

2

1

Aszites

Grad

6

3

3

1

0 1-2

1

0 0 1-2

1

1

1

Tabelle 4: Quantifizierung der Metastasen

Abdominalmetastasen=Peritoneum, intrahepatisch, Niere, Milz, Colon

Der Schweregrad der Metastasierung wurde von 1 bis 3 eingeteilt, dabei bedeutet Grad 1: geringe, Grad 2: mäßige, Grad 3: schwere Metastasierung

43

4.2 Mikroskopische Ergebnisse

Die Zellproliferation, angezeigt durch PCNA positive Zellen, war in allen Be-

handlungsgruppen durch eine sehr hohe Streuung charakterisiert und lieferte

mit den verschiedenen Medikamenten unterschiedliche Ergebnisse.

Die makroskopisch beobachtete Wirkung der Einzelmedikamente TAM und

CRA war bei diesem Marker nicht zu erkennen. Die Zellproliferation lag sogar

um 14-19 % höher als bei der Kontrollgruppe.

Dagegen zeigte die Kombination beider Präparate einen deutlich positiven Ef-

fekt, denn die Proliferationsrate war hier am geringsten. Sie verminderte sich

gegenüber den Placebotieren um durchschnittlich 21 %.

ZK zeigte einzeln verabreicht mit einer Verminderung um 16 % einen positiven

Einfluss. Dieser wurde in Kombination mit MS wieder relativiert, diese Verände-

rung ist jedoch nicht signifikant. Die Kombination zeigte annähernd die gleiche

Proliferationsrate wie die Kontrollgruppe. Auch bei der Kombination von drei

oder vier Präparaten war eine Wirkung der Medikamente mit diesem Marker

nicht erkennbar.

Die Abb. 10 zeigt die Proliferationsrate nach Applikation des Medikaments ver-

sus die Kontrollgruppe.

5866

69

4946

61

52 52

0

10

20

30

40

50

60

70

80

% pos Zellen

Placebo TAM CRA ZK TAM/CRA ZK/MS ZK/MS/TAM ZK/MS/TAM/CRA

PCNA

Abb.10: Einfluss der Biomodulatoren auf die Zellproliferation.

44

Die CD8-Färbung zeigte bei der Einzelmedikation und den Zweierkombinatio-

nen keine erhöhte Zahl an zytotoxischen T-Killerzellen, während bei den Dreier-

bzw. Viererkombinationen eine merkliche Einwanderung erkennbar war.

In Tabelle 5 ist noch einmal zusammengestellt, wie hoch die Anteile an gefärb-

ten Zellen mit den drei geprüften Markern nach Applikation der Biomodulatoren

sind.

% PCNA

pos Zellen

% CD8

pos Zellen

% TUNEL

Pos Zellen

Placebo 58 ± 18 6,4 ± 2,6 2,5 ± 1,5

Tam 66 ± 19 6,6 ± 2,3 6,0 ± 3,4

CRA 69 ± 18 7,8 ± 3,3 9,0 ± 4,5

ZK 49 ± 15 7,5 ± 4,1 6,5 ± 4,6

TAM/ CRA 46 ± 18 7,4 ± 3,4 6,5 ± 3,6

ZK/ MS 61 ± 14 9,2 ± 6,2 8,7 ± 5,0

ZK/ MS/ TAM 52 ± 16 13,3 ± 8,4 10,9 ± 5,9

ZK/ MS/ TAM/ CRA 52 ± 18 15,4 ± 11,6 7,8 ± 4,1

Tab. 5: Immunhistologische Gewebeanalyse, Anteil an gefärbten Zellen mit den drei geprüften Markern nach Applikation der Biomodulatoren.

Wie erwartet liegen die TUNEL-positiven-Zellen, als Marker für stattfindende

Apoptose, bei der Kontrollgruppe (2,5 ± 1,5 %) am niedrigsten (s. Abb. 11). Die

Zunahme der Apoptoserate ist bei den verschiedenen Medikamenten unter-

schiedlich stark ausgeprägt. Bei der Monobehandlung sind die Mittelwerte für

TAM (6,0 ± 3,4 %) und ZK (6,5 ± 4,6 %) etwa gleich hoch. Die Wirkung von

CRA scheint tendenziell höhere Apoptoseraten zu induzieren, denn der Mittel-

wert (9,0 ± 4,5 %) liegt um 50 % über den anderen. Allerdings sind diese Unter-

schiede aufgrund der relativen Streuung der Daten und der niedrigen Tierzahl

nicht signifikant.

45

Die Kombination von TAM und CRA (6,5 ± 3,6 %) und die Kombination von ZK

und MS (8,7 ± 5,0 %) lieferten keine besseren Ergebnisse. Sowohl bei der

Dreierkombination von ZK/MS/TAM als auch bei der Kombination aller vier Me-

dikamente zeigte sich im histologischen Bild eine deutliche Zunahme nekroti-

scher Bereiche. Diese waren durch das Auswertprogramm nicht zuverlässig zu

berechnen, denn damit lassen sich nur vital abgrenzbare Zellen erfassen.

Dementsprechend ist von einer Unterschätzung der Effektivität auszugehen.

2,5

6,0

9,0

6,5 6,5

8,7

10,9

7,8

0

2

4

6

8

10

12

% pos Zellen

Placebo TAM CRA ZK TAM/CRA ZK/MS ZK/MS/TAM ZK/MS/TAM/CRA

TUNEL

Abb. 11: Einfluss der Biomodulatoren auf die Apoptose

46

5 Diskussion

Die Therapiemöglichkeiten des kolorektalen Karzinoms haben sich in den letz-

ten Jahren deutlich verbessert. Ein Grund ist darin zu suchen, dass neben den

bereits seit vielen Jahren auf dem Markt befindlichen klassischen Chemothera-

peutika Biomodulatoren entwickelt wurden, die neuerdings in den wissenschaft-

lichen Fokus gerückt sind. Trotz der Vielzahl der Untersuchungen fehlen aber

immer noch Optionen für primär inoperable Tumore.

In der vorliegenden Arbeit wurde an mit Tumorzellen beimpften Ratten, die

Wirksamkeit ausgewählter biomodulatorischer Substanzen geprüft, die in den

Zellzyklus, das Apoptoseverhalten der Zellen und in die Tumorangiogenese

eingreifen.

Hierbei wurde eine syngene Lebermetastase in der Ratte induziert, um die Um-

gebungsreaktion und etwaige Einflüsse auf das Immunsystem beurteilen zu

können.

Tamoxifen blockiert durch Bindung an Östrogenrezeptoren die periphere Wir-

kung von Östrogenen. Durch diese Wirkungsweise hat sich Tamoxifen in der

adjuvanten und palliativen Therapie des östrogenpositiven Mammakarzinoms

etabliert. In verschiedenen Studien wurde allerdings auch ein proapoptotischer

und antiproliferativer Effekt von Tamoxifen bei östrogennegativen Tumoren,

unter anderem auch beim kolorektalen Karzinom beschrieben [71, 128, 152].

Auch in dieser Studie wurde bei der Monotherapie mit Tamoxifen ein moderater

proapoptotischer und antiproliferativer Effekt nachgewiesen. Das Tumorvolu-

men reduzierte sich durchschnittlich um 39 %.

In vitro konnte gezeigt werden, dass die Kombination von TAM mit CRA die

Wirksamkeit deutlich steigerte [72]. Dieser Effekt wurde bei den „in vivo“ Versu-

chen dieser Arbeit bestätigt. Das Tumorvolumen reduzierte sich deutlich, um

insgesamt 75 %, allerdings war auch der Gewichtsverlust der Tiere durch-

schnittlich sehr hoch.

Retinoide, wie das in dieser Arbeit verwendete 9-cis-Retinsäure (CRA) hat

durch seine Bindung an Retinoidrezeptoren direkten Einfluss auf die Genex-

pression von Regulatorproteinen des Zellzyklus. Auch hier konnten die Ergeb-

47

nisse von „in vitro“ Studien, nach denen Retinoide das Wachstum und die Diffe-

renzierung von kolorektalen Karzinomen beeinflussen können [2, 71, 90, 131],

bestätigt werden.

Es ist bekannt, dass in kolorektalen Karzinomen die VEGF-Expression hochre-

guliert ist [41]. Bevacizumab, ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF-Rezep-

toren, ist bereits für den Einsatz bei kolorektalen Karzinomen zugelassen. Für

diese Studie wurde der VEGF-Rezeptor-Antagonist ZK222 584, der die Kina-

seaktivität aller VEGF-Rezeptoren hemmt, gewählt.

Dieser wird bereits in klinischen Studien für die Behandlung verschiedenster

solider Tumoren, unter anderem auch des kolorektalen Karzinoms, getestet

[80]. Zu diesen Studien gehören auch die Confirm I und II Studien. Hier konnte

keine Verbesserung des primären Endpunktes oder der Gesamtüberlebenszeit

unter der Behandlung mit ZK beobachtet werden [67, 84].

Die Zweifel an der Wirksamkeit werden mit dieser Arbeit gestützt. Die Monothe-

rapie mit ZK zeigte die schlechtesten Ergebnisse. Das Tumorvolumen reduzier-

te sich lediglich um 12 %.

Dies ist verständlich, denn kleinere Tumore können auch ohne eigene Gefäß-

versorgung bestehen, indem sie über Diffusion versorgt werden [48]. Daher

kann die Behandlung eines Tumors mit einem Angiogenesehemmer nur als

zusätzliche Behandlungsoption angesehen werden.

Deshalb wurde ZK mit MS-275, einem Histon-Deacetylase-Hemmer, kombi-

niert. Er verursacht eine Hyperacetylierung der nukleären Histone und kann

somit Apoptose und Zellzyklusarrest auslösen.

HDAC-Inhibitoren wurden bereits in vitro und in vivo in der Therapie von kolo-

rektalen Karzinomen erfolgreich getestet [119].

Die Kombination von ZK mit MS führte in der vorliegenden Arbeit zu einer signi-

fikanten Reduktion des Tumorvolumens um insgesamt 89 % bei moderatem

Gewichtsverlust. Histologisch zeigte sich ein deutlicher Anstieg der apoptoti-

schen Zellen und der nekrotischen Areale, was die makroskopischen Ergebnis-

se bestätigte.

„ In vitro“ Studien haben ergeben, dass HDAC-Hemmer Wechselwirkungen mit

Retinoid-und Östrogenrezeptoren aufweisen. Beim hepatocellulärem Karzinom

48

konnte gezeigt werden, dass eine Vierfachkombination von Biomodulatoren das

Tumorwachstum signifikant hemmt [54].

In der hier durchgeführten Studie zeigten sowohl die Dreifachkombination von

ZK, MS und TAM als auch die Vierfachkombination von ZK, MS, TAM und CRA

keine zusätzliche Wirksamkeit im Vergleich zur Zweifachkombination. Bei bei-

den Behandlungsgruppen wurde das Tumorvolumen zwar um 79 % reduziert,

jedoch war dies der Zweifachkombination von ZK und MS statistisch nicht über-

legen.

Eine deutliche Reduktion der Metastasierungsrate könnte allerdings auf eine

höhere Effektivität hinweisen, die aus Gründen der niedrigen Tierzahl und des

Versuchsaufbaus nicht evident wird.

So zeigte sich in den histologischen Schnitten gerade bei den Drei- und Vier-

fachkombinationen ein deutlicher Anstieg der nekrotischen Areale. Vitales Tu-

morgewebe war histologisch kaum noch zu erkennen, so dass das Tumorvolu-

men im Falle der Dreifach- und Vierfachkombination womöglich nicht den richti-

gen Effekt dieser Behandlungskombination widerspiegelt. Ähnliche Effekte wer-

den bereits in der Klinik beim Einsatz antiangiogenetischer Substanzen gese-

hen, wo inzwischen Techniken untersucht werden, um das avitale Gewebe trotz

gleichen Tumorvolumens abschätzen zu können. Dies gilt es bei künftigen Ver-

suchsreihen zu berücksichtigen.

Zusammenfassend war festzustellen, dass die Kombinationsbehandlung der

Monotherapie weit überlegen war. Besonders die Kombination von MS und ZK

zeigte eine fast vollständige Reduktion des Tumorvolumens und histologisch

einen deutlichen Anstieg der Apoptose.

Allerdings wurden auch einige Schwächen der Vorgehensweise deutlich. So

konnten viele Ergebnisse keine Signifikanz erreichen, da die Tierzahl einem

Pilotversuch angepasst war und dementsprechend für den Nachweis geringer

Unterschiede nicht geeignet war. Die Vierfachkombination ist beispielweise

nicht endgültig beurteilbar. Gegen eine Vierfachkombination sprechen die ho-

hen Raten unerwünschter Nebenwirkungen (z.B. deutlicher Gewichtsverlust).

Schwierig zu interpretieren waren zudem die Ergebnisse der PCNA Färbung,

denn gerade bei Tieren mit niedrigem Tumorrestvolumen war ein Rückgang der

49

proliferierenden Zellpopulation zu erwarten. Dies bestätigte sich jedoch in den

untersuchten Schnitten keineswegs. Eine mögliche, wenn auch nicht sichere,

Erklärung könnte eine überschießende Proliferation der noch vitalen Tumorzel-

len sein, wenn eine Großzahl der übrigen Zellen im Zellverband avital bzw.

nekrotisch werden.

Eine weitere Schwierigkeit ist sicherlich die Beurteilung der Tumorgrößen, die ja

lediglich makroskopisch vermessen wurden. Die hohen Nekroseareale lassen,

wie bereits mehrfach erwähnt, ein wesentlich geringeres vitales Tumorvolumen

vermuten – ein Problem, das sich auch in der Klinik nach Tumortherapie mit

molecular target therapy (z.B. Bevacizumab) stellt.

Hier wären für künftige Untersuchungen dringend therapiebegleitende bildge-

bende Verfahren zu etablieren.

Insgesamt ist jedoch in Zusammenschau der makroskopischen und histologi-

schen Befunde von einer deutlichen antitumoralen Wirkung der Kombinations-

therapien auszugehen. Inwieweit diese Wirkung, die der konventionellen The-

rapieoptionen bei vertretbarem Nebenwirkungsprofil übertrifft, lässt sich leider

nicht vollends beurteilen. Die hier erhobenen Ergebnisse lassen eine höhere

Nebenwirkungsrate der Kombinationen mit TAM und Retinoiden vermuten.

Um diese Frage zu klären, sollte eine größere Tierzahl mit den Zweifachkombi-

nationen, den möglichen Dreifachkombinationen und der Vierfachkombination

getestet werden. Aufgrund der schlechten Ergebnisse als Einzelmedikament

sollte hier gegebenenfalls auch eine Gruppe ohne ZK (also mit TAM/CRA und

MS) mitgeführt werden. Als Kontrollgruppe ist die Behandlung mit einem kon-

ventionellen Chemotherapeutikum und im optimalen Fall mit einem anderen

VEGF-Hemmer (also Bevacizumab) zu empfehlen, um eine Überlegenheit der

untersuchten Therapie nachzuweisen oder zu widerlegen. Hierbei sollte eine

intravitale Bildgebung zur Abschätzung der tatsächlich vitalen Zellen erfolgen!

50

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67

8 Abkürzungsverzeichnis

5-FU = 5 Fluoruracil

A. = Arterie

Apaf-1 = Apoptotic Protease Activating Factor 1

APC = adenomatous polyposis coli

ATRA = all-trans Retinsäure

bFGF = basic fibroblast growth factor

CDK = Cyklinabhängige Kinasen

CDKI = Cyklinabhängige Kinasen Inhibitor

cFlip = cellular FLICE like inhibiting protein

CRA = 9-cis Retinsäure

CRABS = cellular retinoid acis binding protein

CRBS = cellular retinoid binding protein

CTGF = Connective Tissue Growth Factor

DCC = deleted in colon carcinoma

DNA = Desoxyribonukleinsäure

ED = Einzeldosis

EGF-R = epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor

FAP = familiäre adenomatöse Polyposis

FasL = Fas-Ligand

FOBT = Fecal Occult Blood Test

FS = Folinsäure

G = engl. gap: Lücke

Gy = Gray

HAT = Histon-Acetyltransferase

HDAC = Histon-Deacetylase

HNPCC = hereditäres nicht-polypöses kolorektales Karzinom

IAP = Inhibitor of apoptosis proteins

MHC = Major Histocompatibility Complex

MMP = Matrixmetalloproteinasen

NGF-/ TNF = Nerve-Growth-Factor Receptor/Tumor-Necrosis- Rezeptor Factor-Receptor

PCNA = Proliferating cell nuclear antigen

PML = promyelocytic leukaemia protein

68

RAR = retinoid acid receptor

RARE = retinoic acid response elements

RB = Retinoblastom

RXR = retinoid X receptor

RXRE = retinoic X response elements

S-Phase = Synthese Phase

TAM = Tamoxifen

TdT = Terminal desoxynukleotid Transferase

TUNEL = Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated de-

oxyuridinetriphosphatase (dUTP) nick endlabeling

UICC = Union Internationale Contre le Cancer

UTP = Uridin

VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor

ZK = Vatalanib

69

9 Anhang

Anlage 1

Amsterdam-I-Kriterien (alle Kriterien müssen erfüllt sein) [75]

• mindestens drei Familienangehörige mit histologisch gesichertem kolo-rektalem Karzinom

• einer davon Verwandter ersten Grades der beiden anderen • Erkrankungen in mindestens zwei aufeinander folgenden Generationen • mindestens ein Patient mit der Diagnose des kolorektalen Karzinoms vor

dem 50. Lebensjahr • Ausschluss einer Familiären Adenomatösen Polyposis (FAP)

Amsterdam-II-Kriterien (alle Kriterien müssen erfüllt sein)

• mindestens drei Familienangehörige mit HNPCC-assoziiertem Karzinom (Kolon/ Rektum, Endometrium, Dünndarm, Nierenbecken/Ureter)

• einer davon Verwandter ersten Grades der beiden anderen • Erkrankungen in mindestens zwei aufeinander folgenden Generationen • mindestens ein Patient mit der Diagnose eines Karzinoms vor dem 50.

Lebensjahr • Ausschluss einer FAP

Anlage 2

Bethesda-Kriterien [Rodriguez-Bigas, [117, 139]] 1. Patienten mit Krebserkrankungen in Familien, die die Amsterdam-Kriterien erfüllen, 2. Patienten mit zwei HNPCC-assoziierten Karzinomen einschließlich synchro- ner und metachroner kolorektaler Karzinome oder assoziierter extrakolischer Karzinome (Endometrium-, Ovarial-, Magen-, Dünndarm-, Gallenwegskarzi- nom, Karzinome im Bereich des Nierenbeckens oder Ureters), 3. Patienten mit kolorektalem Karzinom und einem erstgradigen Verwandten mit kolorektalem oder assoziiertem extrakolischem Karzinom und/oder einem kolorektalen Adenom; eine der Krebserkrankungen wurde im Alter < 45 Jah- ren diagnostiziert, das Adenom < 40 Jahren, 4. Patienten mit kolorektalem Karzinom oder Endometriumkarzinom, diagnosti- ziert im Alter < 45 Jahren, 5. Patienten mit rechtsseitigem Kolonkarzinom mit einem undifferenzierten (so- lid/cribiformen) Zelltyp in der Histopathologie, diagnostiziert im Alter < 45 Jahren.

70

Anlage 3 Überarbeitete Bethesda-Kriterien [117, 139] Tumoren von Patienten, die eines der folgenden Kriterien erfüllen, sollten auf eine Mikrosatelliteninstabilität untersucht werden:

1. Diagnose eines KRKs vor dem 50. LJ., 2. Diagnose von syn- oder metachronen kolorektalen oder anderen HNPCC assoziierten Tumoren (Kolon, Rektum, Endometrium, Magen, Ovar, Pankre- as, Ureter, Nierenbecken, biliäres System, Gehirn [v.a. Glioblastom], Haut [Talgdrüsenadenome und -karzinome, Keratoakanthome, Dünndarm]) unab- hängig vom Alter bei Diagnose, 3. Diagnose eines KRKs vor dem 60. LJ mit typischer Histologie eines MSI-H- Tumors (Tumor-infiltrierende Lymphozyten, Crohn’s like Lesions, muzinöse oder siegelringzellige Differenzierung, medulläres Karzinom), 4. Diagnose eines KRKs bei mindestens einem erstgradig Verwandten mit ei- nem HNPCC-assoziierten Tumor, davon Diagnose mindestens eines Tumors vor dem 50. LJ, 5. Diagnose eines KRKs bei zwei oder mehr erstgradig Verwandten mit einem HNPCC- assoziierten Tumor, unabhängig vom Alter.

71

Anlage 4 [76]

Risikokategorie Charakterisierung des/der Polypen (Histologie, Zusatzkriterien)

Koloskopie- Intervall

Koloskopie- Intervall, sobald Befund bland

I

Tubuläres Adenom • 1-2 Polypen und • ≤ 1cm groß und • keine hochgradige Dysplasie und • Familienanamnese nega- tiv

5 Jahre

Stopp der Sur-veillance

Tubuläres Adenom • >2 Polypen oder • >1 cm Größe oder • hochgradige Dysplasie oder • Familienanamnese positiv (Erstgradige Verwandte)

II (Tubulo-)villöses Adenom oder gezahntes ("serrated") Adenom • jede Anzahl oder Größe • jeder Dysplasie-Grad

3 Jahre

5 Jahre

III

pT1-Karzinom im Polyp • Polypektomie endosko- pisch vollständig und • Resektionsrand histolo- gisch karzinomfrei und • Differenzierung G1-2 und • keine Angioinvasion

≤3 Monate zur Kontrolle der Resektionsstelle, dann 3 Jahre

5 Jahre

IV

pT1-Karzinom im Polyp • Polypektomie endosko- pisch unvollständig oder • Resektionsrand histolo- gisch nicht karzinomfrei oder • Differenzierung G3 oder • eindeutige Angioinvasion

chirurgische Resektion grundsätzlich indiziert

Hyperplastischer Polyp oberhalb des Rektosigmoids oder >1 cm oder >20 Polypen

3 Jahre

5 Jahre

im Rektosigmoid und ≤1 cm keine Surveillance

72

Anlage 5

Puffer:

PBS, pH 7,4: (Phosphat puffered saline)

80 g NaCl 2,0 g KCl 11,5 g Na2HPO4 2,0 g KH2PO4 ad 1 l Aqua dest.

Tris- Puffer pH 7,4: 30,25 g Tris 45,00 g NaCl ad 5 l Aqua dest.

Citratpuffer, pH 6,0: 2,94 g Na – Citrat ad 1 l Aqua dest. mit Zitronensäure pH – Wert einstellen

Fast – Red – Substrat: 0,002 g Naphtol As-Mx Phosphat 200 ul N-N-Dimethylformamid 9,8 ml Tris – Puffer, pH 8,6 10 ul Levamisol 0,01 g Fast Red TR Salz

Streptavidin – AB – Komplex: 4 ml Tris - Puffer, pH 7,4 1 Tr. Lösung A, 1 Tr. Lösung B

73

10 Danksagung

Ich möchte mich im Zusammenhang mit dieser Arbeit als erstes bei Herrn Prof.

Dr. E. G. Hahn bedanken, der mir die Möglichkeit gab, meine Dissertation in

seiner Klinik zu erstellen.

Weiterhin danke ich Herrn Prof. Dr. Ch. Herold für die Bereitstellung des The-

mas und die ausgezeichnete Möglichkeit, es zu bearbeiten.

Außerdem gilt mein Dank Frau Dr. med. M. Ganslmayer für die Betreuung und

Hilfsbereitschaft während der praktischen Arbeit und des späteren Nieder-

schreibens.

Ganz herzlich möchte ich auch meinen Eltern für ihre grenzenlose und unein-

geschränkte Unterstützung danken sowie meinem Freund Stefan der meiner

Arbeit viel Verständnis und Geduld entgegenbrachte.

74

11 Lebenslauf

Name: Stefanie Gilsbach

Geburtsdatum: 25.06.1979

Geburtsort: Warendorf

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Eltern: Dr. rer. nat. Willi Gilsbach, Lebensmittelche-miker

Christine Gilsbach, Grundschulrektorin

Geschwister: Johannes Gilsbach, Physiotherapeut

Schulbildung

September 1986 – Juli 1990: Grund- und Teilhauptschule Hannberg

September 1990 – Juni 1999: Gymnasium Herzogenaurach

Studienverlauf

Oktober 1999 bis Mai 2006 Studium der Humanmedizin an der Friedrich-

Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

September 2001 Physikum

August 2002 1. Staatsexamen

März 2005 2. Staatsexamen

Mai 2006 3. Staatsexamen

Juni 2006 Approbation

Praktisches Jahr

Innere Medizin: Klinikum St. Marien, Amberg

Chirurgie: Kantonsspital Bruderholz, Schweiz

Neurologie: Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg

Berufserfahrung

15.09.2006 bis 30.09.2008 Assistenzärztin in der Neurologie der Sozial-stiftung Bamberg

1.10.2008 bis heute Assistenzärztin in der Pathologie Klinikum Fürth