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MMeemmoorriiaa ddee pprrááccttiiccaass::
EEnnssaayyoo ddee aalleellooppaattííaass..
PPaattrriicciiaa MMaarrttíínn RRooddrríígguueezz..
UUnniivveerrssiiddaadd ddee SSaallaammaannccaa..
DATOS DE LAS DE LAS PRÁCTICAS:
Empresa : Consejo Superior de Investigaciones Científicas. (CSIC).
Instituto de Recursos Naturales y Agrobiológicos.( IRNASA). Salamanca
Tutor: Beatriz Rodríguez Vázquez de Aldana.
Duración de las prácticas: 25 de Junio - 14 de agosto del 2007. 296 horas.
OBJETIVOS DE LAS PRÁCTICAS:
Adquirir conocimientos científicos y experiencia en :
- Métodos de ensayo para el estudio de interacciones alelopáticas.
- Métodos de análisis e interpretación de datos. (SPSS, Statistica y
Excel).
POTENCIAL ALELOPÁTICO DE Festuca rubra EN
Plantago lanceolata Y Festuca ovina .
RESUMEN:
Festuca rubra es una gramínea frecuente en los pastos de dehesa, que se
caracterizan por una elevada diversidad florística. En estos pastos se encontró
que un 70% de las plantas estaban infectadas por el hongo endofítico Epichloë
festucae. Mediante diferentes estudios se ha podido comprobar que las plantas
infectadas por hongos endofíticos son más resistentes a herbívoros,
nematodos o a la sequía, resistencia que ha sido asociada a la producción de
alcaloides fúngicos en la planta huésped.
El objetivo de este trabajo es determinar el potencial alelopático de diferentes
ecotipos de Festuca rubra sobre las especies, Plantago lanceolata y Festuca
ovina (especies frecuentes en los pastos de dehesa), y analizar si la presencia
del hongo endofitico Epicholöe festucae que infecta a Festuca rubra produce
algún tipo de efecto sobre dichas interacciones; es decir, si el efecto es
diferente entre las plantas infectadas y no infectadas.
Tanto en los ecosistemas naturales como en los agroecosistemas, las plantas
liberan en el suelo una cantidad apreciable de compuestos biológicamente
activos y algunos de ellos actúan como inhibidores o estimuladores de la
germinación de las semillas y afectan o benefician el crecimiento de las
plantas. Estas sustancias se denominan alelopáticas y su acción se conoce
como alelopatía o efectos alelopáticos.
Se realizaron dos ensayos diferentes con el objetivo de determinar el efecto de
los diferentes extractos líquidos de Festuca rubra sobre la germinación y el
crecimiento de radícula de Plantago lanceolata y Festuca ovina. Estas dos
especies son frecuentes en los pastos de dehesa, pero Plantago es
considerada como mala hierba en céspedes, donde el uso de Festuca rubra (y
F. ovina) es muy apreciado.
OBJETIVOS GENERALES:
Determinar si existe algún efecto de Festuca rubra sobre la germinación y el
crecimiento de las especies de Plantago lanceolata y Festuca ovina.
Realizaremos ensayos con ambas especies con el objetivo de averiguar:
- Velocidad de germinación:
o Curva de germinación
o Ver si hay un retraso o adelanto en la germinación.
- Porcentaje de germinación a las 96 h:
o Es decir el porcentaje de germinación al finalizar el
experimento, cuando ya no germinan más semillas.
- Crecimiento de radícula:
o Es decir cuánto crece una radícula de una semilla
pregerminada cuando la sembramos con los diferentes
extractos de plantas potencialmente alelopáticas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Determinar si hay algún efecto del hongo endofítico en el potencial alelopático
de Festuca rubra (especie donadora) sobre Plantago lanceolata y Festuca
ovina (especies receptoras). Es decir, ver si hay diferencias significativas entre
los diferentes tratamientos de Festuca rubra sobre las dos especies receptoras,
ver si hay diferencias significativas entre los diferentes ecotipos, infectados o
no por el hongo endofítico, y ver diferencias en el comportamiento entre las
diferentes especies.
CARACTERÍSTICAS DE LAS ESPECIES:
CARACTERÍSTICAS DE Festuca rubra:
Su nombre común es festuca roja o
cañuela roja, entre otros. Es una gramínea
perenne, de talla media, con inflorescencias
erguidas y espiguillas de 5 a 10 flores,
violáceas, verde pálido o glaucas.
Se caracteriza por tener lemas con arista
Se puede apreciar con lupa una ligera pilosidad en las vainas, las cuales son
Es una especie de base en las mezclas de los céspedes ornamentales. Forma
Tiene unas hojas muy finas, por lo que aporta calidad decorativa. Se
recomienda su uso en combinaciones con otras especies como Poa pratense y
corta, hojas suaves, lisas, generalmente plegadas o revueltas.
rojizas en su parte baja, de ahí la denominación de Festuca roja.
un césped apto para ser pisado, es persistente y eficaz aunque algo
discontinuo por lo que es conveniente mezclarlo con otras especies.
Lolium perenne, para incrementar la calidad de la mezcla y la plasticidad, y
para funcionar en sombra o condiciones poco fértiles.
Muy buena resistencia al frío y moderada a la sequía. Se desarrolla bien en
climas secos y templados fríos, presenta tolerancia a la sombra, gran
Se utilizan como cespitosas las 3 subespecies botánicas siguientes:
- Festuca rubra rubra (Reptante).
- Festuca rubra commutata (Encespedante).
reptante).
CARACTERÍSTICAS DE Epichloë festucae.
Epichlöe festucae es un hongo endofítico filamentoso que infecta
tipos sexuales: sexual (Epichlöe) y
tualista y se
E
adaptabilidad a suelos pobres y salinos. Poco exigente en fertilización. La
mejor época de siembra es otoño o principios de primavera.
- Festuca rubra trichophylla (Semi
particularmente al género Festuca.
El género se caracteriza por tener dos
Epichlöe festucae en placa
asexual (Neotyphodium)
Perteneciente a los ascomicetos, son
simbiontes de tipo mu
transmiten por las semillas, verticalmente,
los tipos sexuales como en el caso de
pichlöe festucae.
Confieren a las plantas que
infectan características
Ciclo biológico de Epichlöe
festucae
positivas, mejorando su
crecimiento y confiriéndoles
resistencia a la sequía, a
insectos, nematodos,
algunos hongos patógenos.
Estas características, según
diferentes estudios
realizados, se deben a la producción de metabolitos, de tipo alcaloide que
produce el hongo.
CARACTERÍSTICAS DE Plantago lanceolata
Su nombre vulgar es llantén menor
Es una planta perenne, de 10-40 cm,
escaposa. Tiene hojas en roseta,
lanceoladas, más de 5 veces más largas
que anchas, con pilosidad variable y
atenuadas en el peciolo. Flores en
espigas pequeñas (menores de 3 cm) sobre un escapo canaliculado, con 5
surcos bien marcados. Es acaulescente, de tallos no ramificados, es decir que
salen sus hojas desde la misma base.
La inflorescencia terminal es una densa espiga cilíndrica en la especie mediana
y mayor, ovoide o globulosa en la lanceolata. Florece entre mayo y octubre
según sea el tipo de llantén. Las flores son blancas o purpúreas, pequeñas,
imbricadas y numerosas. Tienen una corola campanulada con cuatro lóbulos.
La podemos encontrar en pastizales, herbazales, en cultivos de regadío donde
la humedad del suelo es abundante.
Se encuentra en casi toda Europa, América del Norte, África del norte y Asia
occidental. Es planta fácil de hallar en bordes de caminos, terrenos no
cultivados, etc. Es considerada como una mala hierba en céspedes.
CARACTERÍSTICAS DE Festuca ovina.
Nombre común o vulgar: Cañuela de
oveja.
Es una gramínea caracterizada por
tener hojas de color verde grisáceo
de textura fina. Se emplean más en
obras de revegetación paisajísticas
que en céspedes de jardín.
Tiene un sistema radicular extenso que la hace más tolerante a la sequía que
la Festuca rubra. Se considera una especie interesante para terrenos pobres y
zonas de escaso mantenimiento.
Crece lentamente, por lo que tarda tiempo en implantarse. Se desarrolla menos
que la Festuca rubra y es más resistente a las zonas sombrías.
Requiere poco mantenimiento, presenta una excelente tolerancia al frío,
resistente a la sequía, mala resistencia al pisoteo y se adapta mal a la mayoría
de los climas de España, pero resiste bien a los suelos pobres.
MATERIAL Y MÉTODOS:
Material vegetal:
Partimos de dos líneas de Festuca rubra medio hermanas, procedentes de
pastos naturales, de dos zonas de la provincia de Salamanca, el Cabaco (Ca) y
Peña (Pe). Dentro de estos dos ecotipos contábamos con plantas que estaban
infectadas con Epichlöe festucae (E+) y otras plantas libes de él (E-).
Las semillas de diferentes ecotipos fueron sembradas en maceta con una
mezcla de turba, perlita y arena durante 4 ó 5 meses, a 25ºC día y 12ºC noche.
A partir de estas plantas se prepararon los diferentes extractos, según se indica
a continuación.
Preparación de extractos acuosos:
De planta:
Se tomó la parte aérea de la planta, fueron troceadas y secadas en un
liofilizador. Posteriormente fueron molidas en molino.
1Se realiza una extracción (50g de planta / L de agua destilada) y se mantiene
mezclándose con el agua durante dos horas en nevera, seguidamente lo
agitamos una hora a 150 rpm (a temperatura ambiente) y después se
centrífuga 15 minutos a 1500 gs. Una vez hecho todos estos pasos se filtró a
vacío obteniendo el extracto de concentración al 100% (extracto 50P), a partir
del cual se hace una dilución 1:5 para obtener concentración del 20% (extracto
10P).
De raíz:
Se toma la raíz, eliminamos en todo lo posible los restos de sustrato, y
proceder a congelarlas a –80ºC para secarlas en un liofilizador, seguidamente
fueron molidas para ser disueltos 30g/l de agua destilada y se siguió el mismo
protocolo antes mencionado, obteniendo el extracto de raíz 30R.
Desarrollo de los ensayos:
Ensayo de germinación:
En placas petri de 90mm de diámetro pusimos papel de filtro especial para
germinación (filter-lab). Dichos filtros fueron impregnados con 4ml de los
diferentes extractos de planta y de raíz (50P, 10P, 30R), de cada uno de los
ecotipos (CaE+, CaE-, PeE+, PeE-) y con agua destilada para establecer un
control. De cada extracto se hicieron 5 replicas.
Posteriormente fueron sembradas las semillas de P. lancelata o de F. ovina
que previamente fueron esterilizadas con una solución de lejía comercial al
20% durante dos minutos y posteriormente aclaradas varias veces con agua
destilada. En cada placa se colocan 30 semillas.
Mediante ensayos anteriores de pregerminación en placa utilizando como
extracto agua destilada sabíamos que P. lanceolata empezaba a germinar a
las 24h y que terminaban con prácticamente un 98% de porcentaje de
germinación a las 96h, mientras que en el caso de F.ovina empezaban a
germinar prácticamente a las 72h y no terminaban hasta las 168h después.
Teniendo en cuenta esta información procedimos a plantar 30 semillas por
placa, teniendo un total de 80 placas por cada especie (Plantago lanceolada y
Festuca ovina) y se mantuvieron durante todo el ensayo en cámara a 25ºC en
oscuridad. Se realizó un ensayo independiente para cada especie.
Posteriormente se contaron las semillas germinadas a las 24, 48, 72 y 96 horas
en el caso de P. lanceolata, mientras que en el caso de F. ovina el conteo se
llevó hasta las 168h después de la puesta en placa de las semillas.
Ensayo de crecimiento de radícula:
Para llevar a cabo este experimento, para cada una de las especies por
separado tuvimos que hacer un ensayo de pregerminación, ya que en este
caso las semillas que pongamos en placa tienen que estar germinadas y con
una radícula de 1-2 mm.
Para llevar a cabo este ensayo de pregerminación pusimos 25 placas por
especie. Las semillas fueron esterilizadas con el método anteriormente citado.
En el caso de P. lanceolata se pusieron en placa sobre los filtros de
germinación, Filter-lab, en los que se había inoculado 8ml de agua destilada y
estas placas fueron guardadas en cámara a 25ºC, en oscuridad. A las 24 horas
ya habían germinado y teníamos plántulas con radícula de longitud entre 1-2
mm que se colocaron en placas con 4ml de cada extracto, en este caso
también 5 replicas por extracto, y 25 semillas por placa. Estas placas fueron
llevadas a un fitotrón donde se tuvieron 48 horas con un fotoperiodo de 16 h de
luz a 25ºC y 8h oscuridad a 20ºC, después se escanearon (HP Scanjet 5530)
para llevar a cabo después la medida de la radícula a partir de las imágenes
obtenidas por el programa Soft Imagin System.
En el caso de F. ovina, la pregerminación se llevó a cabo colocando los filtros,
Filter-lab, sobre perlita estéril y sobre este se inocularon con 16ml agua estéril,
después se colocaron las semillas. Estas placas se dejaron en una cámara a
25ºC en oscuridad.
A las 72h fueron puestas 25 semillas germinadas (con radículas entre 1-2 mm)
en las diferentes placas con 4ml de los diferentes extractos. Después siguió el
mismo procedimiento que la especie anterior.
Análisis estadístico:
Los datos del porcentaje de germinación al final del ensayo y de la longitud de
radícula se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA), donde los factores
de variación considerados fueron los diferentes ecotipos de F.ruba (CaE+,
CaE-, PeE+, PeE-) los diferentes tratamientos de extractos (Planta50,
Planta10, Raiz30, Control) y la interacción entre ellos. Se utilizó el contraste de
Levene para comprobar la homogeneidad de las muestras, y el test de Duncan
para la comparación de las medias, cuando el ANOVA fue significativo.
Los análisis se llevaron a cabo con el programa SPSS 15.0 y el Statistica.
Índice de germinación: -
Con los datos del porcentaje de la germinación al final del ensayo y de la
longitud radicular se calculó el índice de germinación de Zucconi et al (1981)
mediante la siguiente fórmula:
Gm = % de germinación de la muestra.
Gm x Lrm
IG = Gc x Lrc
Lrm = longitud radicular de la muestra.
Gc = % de germinación del control.
Lrc = Longitud radicular control.
El índice de germinación de Zuconni (Zuconni et al.,1981), permite evaluar el
efecto de las especies productora del factor alelopático sobre la especie
receptora considerando los datos de germinación y crecimiento de radícula.
Se considera que para valores < 0,5 existe influencia de la especie productora
del factor alelopático, pudiendo ser esto un indicio de dicho efecto.
RESULTADOS:
1. Plantago lanceolata
1.1 Ensayo de germinación:
En la figura 1 se muestra el porcentaje de germinación para P. lanceolata
frente a cada uno de los diferentes extractos de cada ecotipo de F. rubra,
donde se observa que las diferencias se deben a los ecotipos y a los
tratamientos con los diferentes extractos.
% germinación Plantago lanceolata
0
20
40
60
80
100
Fr Ca E+ Fr Ca E- Fr Pe E+ Fr Pe E-
ecotipos de F. rubra
% d
e ge
rmin
ació
n
50 P10P30 Rcontrol
Figura 1: Porcentaje de germinación de la especie receptora (P. lanceolata) frente a distintos ecotipos de Festuca rubra y tipos de extracto.
Mediante los análisis estadísticos se ha podido ver que no podemos hablar de
la existencia de diferencias significativas en la interacción de extracto – ecotipo.
Los resultados muestran un efecto significativo del extracto 50P mientras que
de los extractos 10P y 30R no producen diferencias significativas respecto al
control.
1.2 Ensayo crecimiento de radícula:
En la figura 2 se presentan los resultados de la longitud de radícula; en este
caso se aprecian diferencias significativas en la interacción de los factores
tratamiento y el ecotipo. En todos los ecotipos de F. rubra, los distintos tipos de
extractos producen un efecto significativo disminuyendo la longitud de radícula.
Los extractos de 50P son lo que producen una mayor inhibición de la radícula,
seguido de 10P y 30R. En el caso de CaE+ las diferencias entre 10P y 30R no
son significativas.
longitud de radicula de Plantago lanceolata
0
2
4
6
8
10
FrCAE+ FrCAE- FrPeE+ FrPeE-
ecotipo de Festuca rubra
long
itud
de ra
dicu
la (m
m)
50P10P30RC
ab b
c
bb
b
a aa
c c
c
d d d
Figura 2: Longitud de radícula de la especie receptora (P. lanceolata) frente a distintos ecotipos de Festuca rubra y tipos de extractos. Se indica que con las letras la existencia de diferencias significativas entre los diferentes extractos de los ecotipos de F. rubra.
Índice de germinación de Zucconi: En la tabla 1 se puede ver que en el caso de los extractos 50P de todos los
ecotipos, F. rubra tiene un posible efecto alelopático sobre P. lanceolata.
Mientras que con el resto de concentraciones de extractos, no podemos
asegurarlo.
En el caso de 50P, el extracto CaE- tiene un índice menor (mayor potencial)
que el CaE+. En cuanto al ecotipo de Peña no hay grandes diferencias entre
los extractos E+ y E-.
Tabla 1: Índice de Zuconni para la especie P. lanceolata (como especie receptora) frente a los extracto de diferentes concentraciones y ecotipos de F. rubra (productora) CaE+ CaE- PeE+ PeE-
50P 0,42 0,28 0,27 0,22
10P 0,82 0,43 0,50 0,48
30R 0,90 0,74 0,66 0,66
2. Festuca ovina
2.1.Ensayo de germinación:
En este ensayo sí se pudo observar que se daban diferencias significativas en
la interacción de tratamiento – ecotipo, y mediante los estudios estadísticos se
pudo ver que cada ecotipo se comporta de una manera diferente lo mismo
paso con los diferentes tratamientos.
En el caso de F. ovina (figura 3) se pudo observar que el extracto con mayores
efectos alelopáticos era el del 50P, seguido del extracto al 10P y por último el
extracto 30R.
También se puede observar que el efecto alelopático negativo>la disminución
del porcentaje de germinación del extracto 50P es mayor en el caso de CaE+ y
de PeE+ (en relación a E-), mientras que el efecto del extracto 10P es bastante
regular en todos los ecotipos de F. rubra para F. ovina. En el caso del extracto
30R sólo hay diferencias significativas en el caso de PeE-
% germinación F. ovina
0
20
40
60
80
100
Fr Ca E+ Fr Ca E- Fr Pe E+ Fr Pe E-
ecotipos de F. rubra
50 P10P30 Rcontrola
bb
bc
a
b
c c
a
bb b
a
bb
ac
Figura 3: Porcentaje de germinación de la especie receptora (F. ovina) frente a distintos ecotipos de Festuca rubra y tipos de extractos. Se indica que con las letras la existencia de diferencias significativas entre los diferentes extractos de los ecotipos de F. rubra.
2.2 Ensayo de radícula:
En la figura 4 se presenta la longitud de radícula de F. ovina en presencia de
los diferentes extractos de Festuca rubra. En este ensayo también hay que
resaltar que se dan diferencias significativas en la interacción de ecotipo –
tratamiento.
En el caso de 30R, cada ecotipo de F. rubra tiene una respuesta diferente,
CaE+ y CaE- no tienen un efecto significativo, PeE+ tiene un efecto positivo
(incrementa la longitud radicular) y PeE- un efecto negativo. En el caso de 10P
todos los ecotipos de F. rubra, excepto CaE+, tienen un efecto significativo
disminuyendo la longitud de la radícula. Los extractos 50P de todos los
ecotipos de Festuca rubra disminuyen la longitud de radícula, no existiendo
diferencias significativas entre E+ y E-.
longitud de radícula F.ovina
012345678
CaE+ CaE- PeE+ PeE-
ecotipos de F. rubra
50P10P30RC
bb b
aa
b
cc
a
b
cd
a
b
c
d
Figura 4: Longitud de radícula de la especie receptora (F. ovina) frente a distintos ecotipos de F. rubra y tipos de extractos Se indica que con las diferentes letras la existencia de diferencias significativas entre los diferentes extractos de los ecotipos de F. rubra.
2.3 Índice de germinación de Zucconi:
En la tabla 2 se puede ver que en el caso de los extractos 50P de todos los
ecotipos, F. rubra tiene un posible efecto alelopático sobre F. ovina. Mientras
que con el resto de concentraciones de extractos, no se da ese efecto
alelopático.
En el caso de 50P, tanto en el caso de de el extracto CaE+ y PeE+ se puede
ver que el índice es menor que en los otros dos extractos pero las diferencias
no llegan a ser significativas.
Tabla 2: Índice de Zuconni para F. ovina (como especie receptora) frente a los extractos de diferentes concentraciones y ecotipos de F. rubra (productora). CaE+ CaE- PeE+ PeE-
50P 0,16 0,25 0,19 0,32
10P 0,83 0,66 0,83 0,75
30R 0,96 1,06 1,34 0,51
Discusión:
Los resultados de este estudio muestran que el efecto alelopático de F. rubra,
dependen tanto del ecotipo como de la especie receptora.
Los extractos acuosos de Festuca rubra para los diferentes ecotipos y a las
diferentes concentraciones se ha visto que tienen un efecto alelopático sobre
F. ovina y P. lanceolata, pero los efectos cambian dependiendo de si se trata
de la germinación o del crecimiento de radícula. En ambas especies se puede
observar que la mayoría de extractos de los ecotipos de F. rubra producen
efectos alelopáticos negativos en ambas especies.
En el caso de P. lanceolata, en los ensayos de germinación no se puede hablar
de la existencia de diferencias significativas entre la interacción de ecotipo –
extracto. Los resultados muestran un efecto significativo de los extractos 50P
mientras que los extractos 10P y 30R no producen diferencias significativas
respecto al control.
En el ensayo de crecimiento de radícula, para la misma especie, si se dan
diferencias significas entre la interacción de los factores ecotipo – extracto.
Los extractos de 50P son lo que producen una mayor inhibición del crecimiento
de radícula, seguido de 10P y 30R. En el caso de CaE+ las diferencias entre
10P y 30R no son significativas.
En F. ovina tanto para el ensayo de germinación, como para el ensayo de
radícula se dan diferencias significativas entre la interacción de los factores
ecotipo – extracto, a diferencia de lo que pasaba en el caso de P. lanceolata.
En el ensayo de germinación, se pudo observar que los extractos con mayores
efectos alelopáticos eran los 50P, seguido de los extracto 10P y por último de
los extracto 30R.
También se puede observar que el efecto alelopático negativo del extracto 50P
es mayor en el caso de CaE+ y de PeE+ (en relación a E-), lo que nos podría
llevar a pensar que puede tener algún efecto la presencia del hongo endofítico
sobre estos dos ecotipos, que les hacer ser más eficientes en su interacción
con F. ovina.
Mientras que el efecto del extracto 10P es bastante regular en todos los
ecotipos de F. rubra para F. ovina. En el caso del extracto de raíz (30R) sólo
hay diferencias significativas en el caso de PeE-.
En el ensayo de crecimiento de radícula el mayor efecto alelopático también lo
producen los extractos 50P disminuyen la longitud de radícula, no existiendo
diferencias significativas entre E+ y E-.
En el caso de 30R, cada ecotipo de F. rubra tiene una respuesta diferente,
CaE+ y CaE- no tienen un efecto significativo, PeE+ tiene un efecto positivo
(incrementa la longitud radicular) y PeE- un efecto negativo.
En el caso de 10P todos los ecotipos de F. rubra, excepto CaE+, tienen un
efecto significativo disminuyendo la longitud de la radícula.
Tendríamos que llevar a cabo ensayos más extensos para poder aseguran
efectos alelopáticos de F. rubra efectivos sobre estas dos especies. Estos
ensayos muestran que no hay un efecto generalizado de la infección endofítica
sobre las especies consideradas como receptoras. En algún caso, como en
Festuca ovina, los extractos 50P de plantas infectadas disminuyen el
porcentaje de germinación en relación a los extractos de plantas no infectadas,
pero en el ensayo de radícula no hay diferencias.
APLICACIONES:
La aplicación primordial de las interacciones alelopáticas es poder llegar a
sintetizar herbicidas naturales. Evitando así la adicción de productos químicos
utilizando plantas capaces de sintetizan compuestos específicos que inhiban el
crecimiento de malas hierbas o especies competidos de la especie de interés.
Para que haya una mayor eficacia es conveniente saber cual es el compuesto
que produce la planta para inhibir el crecimiento de plantas vecinas que pueden
disminuir su rendimiento.
Si se pudiese incluso caracterizar la ruta de síntesis de dicho compuesto se
podría aumentar la síntesis de este por parte de la planta o incluso hacer
plantas transgénicas superproductoras.
Bibliografía:
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