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Journée nationale du DES d’Hématologie clinique
Mesurer la maladie résiduelledans les LAL
JMML s*mposium_San Diego 2011
Pr Hélène Cavé
CHU Robert Debré – Département de GénétiqueINSERM UMR-S1131, Institut Universitaire d’Hématologie,Paris, France
QU’EST-CE QUE LA MALADIE RESIDUELLE ?
Cytology
detection threshold
Flow cytometry
detection threshold
PCR detection l!mit
Cytologie
sensibilité 5%
Maladie
résiduelle
ou
Maladie non détectable
par l’examen cyto-
morphologique
Comment évaluer l’efficacité du traitement d’une LAL ?
MRD : Minimal residual disease
Rechute tardiveRechute précoce
Ans
Ia Ib II Entretien
Pro
port
ion r
ela
tive d
e c
ellule
s le
ucém
iques
Guérison
1012
1010
Cellules
leucémiques
[CR
≤ 1
010
bla
stes]
Rémission
cytologique
(<5% blastes MO)
JAMA Oncology, 2017
20 pediatric studies(11 249 patients)
16 adult studies (2076 patients)
Coustan Smith et al., Blood 2002
ET LE SANG ?
Distribution de la MRD dans moelle et sang
selon l’immunophénotype de la LAL.
➢ Le sang périphérique peut éventuellement être utilisé pour suivre la
MRD dans les LAL-T
➢ Dans les LAL de lignée B, les valeurs de MRD mesurées dans le sang
sont souvent inférieures à celles mesurées dans la moelle
MRD AS A SURROGATE MARKER FOR OUTCOME ?
MRD at the end of induction ▪ shows a considerable prognostic
association with EFS at the individual level▪ is a poor surrogate for treatment effect on
EFS (Valsecchi et al., Blood 2016)
Still a matter of debate
Molecular response can beused as an endpoint to evaluate the efficacy of a drug
Hematologic Malignancies: Regulatory Considerations for Use of Minimal Residual Disease in Development of Drug and Biological Products for Treatment
U.S. Department of Health and Human Services - Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Biologics Evaluation and Research (CBER)
For new drugs that have a demonstrated durable CR in patients with relapsed or refractory ALL, FDA has accepted MRD of less than 0.01% as supporting evidence of efficacy. As technologies improve and new clinical findings emerge, the level of MRD needed to support an efficacy claim may change.
First FDA approval of a leukemia drug— Blinatumomab (Blincyto; Amgen)— to include patients who are technically in remission but still have measurable residual disease.
October 2018
MRD AS A SURROGATE MARKER FOR OUTCOME ?
HOW ?
Cellules leucémiques
résiduelles
*
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*
Traitement
MALADIE RESIDUELLE (MRD)
Une aiguille dans une botte de foin…
Population l*mphoïde normale
(pol*clonale)
Cellules leucémiques l*mphoïdes
(population monoclonale)
COMMENT DETECTER LES BLASTES RESIDUELS ?
MARQUEUR TECHNIQUE
Réarrangements des gènes des
immunoglobulines (Ig) et du récepteur T
(TCR) spécifique du clone leucémique
▪ PCR quantitative
▪ NGS
▪ PCR digitale
Immunophénotype aberrant ▪ Cytométrie en flux
Anomalies génétiques liées au processus
oncogénique (translocation, délétion,
mutation)
▪ PCR ou RT-PCR
quantitative
▪ NGS
▪ PCR digitale
Locus TCRGFamille VGI
VG1 VG2 VG 4VG3 VG8VG7VG6VG5 VGA VGBVG9 VG10 VG11 VG12 JP1 JP J1 C 1 C 2JP2 J2
VG3 J1
Région N
(excision/addition aléatoire de nucléotides)
ADN
//
VGI consensus
……..GCCTTGTGGGAggccccctATTATTATAAG……..
………ACTGTGCCACCTccccgcTTGGTTCAAG………
……..ACTGTGCCACCTGGGacaggcaccctATACCCACTGGTT........
Recombinaison V(D)J
MARQUEUR DE CLONALITE SPECIFIQUE DE CHAQUE CLONE TUMORAL
ASO spécifique
ASO: allele-specific oligonucleotide
MARQUEURS DE CLONALITE IG/TCR
V9J1J2
2 allèles 187 pb et 201 pb
Van Dongen, Blood 2015
IG/TCR REARRANGEMENT CARACTERISATION USING NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS)
TARGET DETECTION AND SEQUENCING IN ONE GO
MRD targets selected amongrearrangements accounting for >5% reads per locus (>1% total reads)
Amplicon size
IGHIGHIGK
TCRA/DTCRB
TCRDTCRG
CLONAL EVOLUTION AT RELAPSE
Amplicon size
IGHIGHIGK
TCRA/DTCRB
TCRDTCRG
2 clonal markers per patients are required to prevent false negativity
1) Identification et séquençage des réarrangements Ig/TCR présents dans les cellules leucémiques de chaque patient
2) Design d’une ASO pour Q-PCR
3) Courbe de calibration (dilutions en série des blastes du patient dans des cellules mononucléées polyclonales)
4) Dosage d’une séquence de référence (ALB)
5) Calcul du rapport cible/ref
DV J
ASO probe J primer J
or
PCR ALLELE-SPECIFIQUE EN TEMPS REEL
ASO: allele-specific oligonucleotide
V J
ASO probe J primer J
Multiplex PCR and NGS
PCR
PRESENTATION
Blasts > 85%
Genomic DNA
Sequencing of N region
Clono-specific primer
V J
ASO probe J primer J
MRD ASSESSEMENT – GENERAL STRATEGY
V JV D J NN N
6331-
VG
IJ1J2
6148-
VD
2D
D3
4720-
VG
IJ1J2
1
2
4
Design of an
allele specific
primer (ASO)
REMISSION
Blasts < 1-5%
PCR
Genomic DNA
Allele-specific real-time quantitative PCR
Relative quantitation b* comparison to a
standard curve (serial dilutions of initial blasts)
sensitivities of 10-4 to 10-5
TCRG, TCRD, TCRB, IGH, IGK
Reproductibilité des duplicatsbonne (ΔCt<1.5) mauvaise (ΔCt≥1.5)
Ven der Velden et al., Leukemia 2003
DOMAINES DE DETECTION ET DE QUANTIFICATION
Sensibilité (domaine de détection)
Linéarité (domaine de quantification)
•Domaine de sensibilité (SR) jusque 10-5
(1 blaste dans 100.000 cellules)
• Domaine de quantification (QR) jusque 10-4
10-5
10-4
Faux positifs ou faux négatifs ?
STRATIFICATION SWITCHES BASED ON IKZF1 AND MRD IN B-LINEAGE ALL
CAALL-F01 (ongoinfg frontline childhood ALL trial)
SR and intermediate-risk patients with MRD 10-4
at day 29 of induction (n=533) were randomly assigned to standard therapy or augmented post-remission therapy
▪ improvement in event-free survival with augmented therapy compared with standard treatment
▪ Decreased risk of relapse (mainly BM relapses) in the augmented therapy group
▪ Patients given augmented therapy had a trend but no significantly improved overall survival
DOES MRD-BASED TREATMENT INTENSIFICATION IMPROVE OUTCOME ?
(p=0·04)
Vora et al., Lancet Oncol 2014
Outcome of 3184 patients of the AIEOP-BFM ALL 2000 study according to PCR-MRD classification (Conter et al., Blood, 2010)
CLINICAL SIGNIFICANCE OF MRD IN CHILDHOOD ALL
EFS cumulative incidence of relapse
➢Molecular response to treatment still redefines all prognostic factorsin children and adolescents with B-cell precursor ALL
25% -> 40%
Therapeutic intensification based on MRD at completion of consolidation
PCR
PRESENTATION
Blasts > 85%
Genomic DNA
Sequencing of N region
Clono-specific primer
MRD ASSESSEMENT – GENERAL STRATEGY
V JV D J NN N
6331-
VG
IJ1J2
6148-
VD
2D
D3
4720-
VG
IJ1J2
1
2
4
REMISSION
Blasts < 1-5%
PCR
Genomic DNA
Multiplex PCR and NGS
TCRG, TCRD, TCRB, IGH, IGK
Ladetto et al., Leukemia 2014
IG-TCR NGS FOR MRD FOLLOW UP
Sequenta lymphoSIGHT methodGood corelation with the gold sandard method (Q-PCR)
Spike-in (knownIGH sequence)
▪ Added sensitivity (10µg DNA tested)▪ Broad availability of a standardized molecular MRD
ClonoSEQ® (Adaptive Biotechnologies) Sequenta/Adaptive platform
Not a kit but a serviceExpensive (not affordable for investigator initiated trials)
Europe: Patent pending - work on an workflow for automated library preparation Standardisation and kit development with a commercial partner (IVD regulation)
Marketing authorization to the first-ever next-generation sequencing assay for detecting MRD in patients with ALL
Wood, Blood 2018
COG studies AALL0331 (standard risk [SR] and AALL0232 (high risk; with day 29 MRD <0.1% by FC)
SR SR
• NGS identifies MRD at the clinical cutoff in more patients than FC, and these patients have worse outcomes.• A subset of B-ALL patients essentially cured using current chemotherapy is identified at end of induction by NGS.
Pourquoi ?
1) Parce que c’est la première technique a avoir été
corrélée avec les données cliniques (en Europe).
1) Grace à l’initiative Européenne de standardisation
(EuroMRD consortium).
haut niveau de concordance entre les
laboratoires Européen comme en témoingnent des
contrôles de qualité réguliers.
La quantification par Q-PCR des réarrangements
clonaux des IG/TCR reste le “gold standard” pour le
suivi de la MRD dans les LAL
Although 100 reads are generated, sensitivity cannot exceed 1:10 as only 10 DNA copies were analyzed
Langerak et al. J Immunol 2017
▪ The known amount of reference DNA copies (spike in) is added to the sequenced sample and used for calculation of coverage (reads) per molecule. This information is then used for calculation of MRD.
▪ The sensitivity is influenced by the total coverage and by the number of analyzed DNA copies.
Sensitivity of NGS MRD detectionand quantification of MRD
MRD DANS LES LAL CIBLER LES ANOMALIES ONCOGENIQUES
▪ Points de cassure génomiques des translocations
▪ Délétions récurrentes
▪ Mutations ponctuelles
identification et suivi de sous-clones résistants au traitement
Suivi de cibles thérapeutiques
Oncogenic markers
Point mutations
✓Technical issues✓ Subclonal
Undiluted to 10-4 standard dilutionsSample to quantify
ONCOGENIC TRANSCRIPTS AS MRD MARKERS
cDNABCR ABL
Reference transcript(quantity/quality of RNA)Ex: GUS, ABL, …
ETV6-RUNX1
H*perdiploid* (25%)
MLL (10%)
iAMP21 (2%)BCR-ABL (3%)
E2A-PBX1 (5%)M*C (2%)
CRLF2 (6%)
B-lineage ALL
sensitivity 10-4 to 10-5
DNA
▪ No patient-specific assays necessary▪ Largely used in CML
WHAT IS THE RIGHT TARGET TO FOLLOW?
Cazzaniga et al., Haematologica 2018
Predictive value of MRD in Philadelphia-chromosome-positive ALL treated with imatinib based on immunoglobulin/T-cell receptor and BCR/ABL1 methodologies.
▪ No prognostic implication so far ▪ International guidelines : follow IG-TCR rearrangements
The EsPhALL study
≥ 10-4 pos
MRD IG/TCR MRD BCR/ABL
MRD IG/TCR MRD BCR/ABL
Horvokova, Blood 2017
WHAT IS THE RIGHT TARGET TO FOLLOW?
Cazzaniga et al., Haematologica 2018
Predictive value of MRD in Philadelphia-chromosome-positive ALL treated with imatinib based on immunoglobulin/T-cell receptor and BCR/ABL1 methodologies.
▪ No prognostic implication so far ▪ International guidelines : follow IG-TCR rearrangements
The EsPhALL study
≥ 10-4 pos
MRD IG/TCR MRD BCR/ABL
MRD IG/TCR MRD BCR/ABLIn patients with discordant MRD BCR-ABL1 fusion was found also in non-ALL B cells, T cells, and myeloid cells
Horvokova, Blood 2017
IG-TCR rearrangements and BCR-ABL transcript do not mark the same cell populations
NGS IG-TCR AU DIAGNOSTIC DE LAL
LAL B : 46,XY,t(4;11)(q21;q23)[19]/46,XY[1]
Transcrit de fusion MLL-AF4
Locus IgH
1 marqueurs Locus TCR D
Problème des LAL peu différentiées : Oligoclonalité / absence de réarrangements IG/TCR
NGS DATA Analysis (MLL pipeline)
Nextera® DNA Library
Preparation
Coverage of the whole MLL gene
Identification of direct and reciprocal
fusions breakpoint sequences
Workflow at DCAL
MLL-AFF1
MLL rearrangementFISH, RT-PCR etc
MLL genomic breakpoint
TTATGCTTTTCATCCTTATTTTCCATCCAAAGTTGTGTAA•TT•CTATATTAAATTACACATAAATTAGAACCAAGA
TaqMan probe
Der(11)MLL fusion partner
MRD monitoring
Breakpoint specific Q-PCR✓ Robustness (DNA)✓ Specificity (SR ≤10-4; QR 10-4)
FOLLOW THE INITIATING ONCOGENIC LESION!
Lana O. – 6 monthsALL pro-B (EGIL I) –46XX, t(4;11)(q21;q13) – MLL-AF4Interfant MRCombined relapse at 20 monthsA103_20120215 trial - Blinatumomab
ALL pro-B (EGIL I)CD19+/CD22+, CD10-, CD20-, CD34+, CD15/65-NG2+CD13+ partialNo other myeloid marker (MP0-)
Monoblastic clone (25%)CD33+++/CD13+, CD64+/CD11c+, CD36+/CD14+, CD15/65+, CD4+Weak CD19 et CD22
ALL pro-B (EGIL I)
MRD IG/TCR (Berlin)
A103_20120215 trial
day 0 day 15 day 29
MRD CHALLENGED BY TARGETED THERAPIES
MRD
Lana O. – 6 monthsALL pro-B (EGIL I) –46XX, t(4;11)(q21;q13) – MLL-AF4Interfant MRCombined relapse at 20 monthsA103_20120215 trial - Blinatumomab
ALL pro-B (EGIL I)CD19+/CD22+, CD10-, CD20-, CD34+, CD15/65-NG2+CD13+ partialNo other myeloid marker (MP0-)
Monoblastic clone (25%)CD33+++/CD13+, CD64+/CD11c+, CD36+/CD14+, CD15/65+, CD4+Weak CD19 et CD22
ALL pro-B (EGIL I)
MRD IG/TCR (Berlin)
MRD MLL-AF4 breakpoint
A103_20120215 trial
day 0 day 15 day 29
MRD CHALLENGED BY TARGETED THERAPIES
MRD
Ex: NRAS c.35G>A ; p.Gly12Asp (VAF 44%)
MUTATION SCREENING AT DIAGNOSIS USING NGS
NGS IS POORLY ADAPTED TO MRD MONITORING
In routine conditions, sensitivity limited to 1-2% (VAF) corresponding to 2-4% residual cells (background)
high substitution error rates
PCR-induced transitions (mainly G > A and C > T) are the major source of error, which canbe significantly reduced by the application of proofreading enzymes
Digital signals have a finite/limited set of possible values (binar format)
Continuous signal (continuous range of values to represent information)
Analog signal Digital signal
DROPLET DIGITAL PCR (ddPCR) – What’s in a name?
A G
double positive droplets (VIC+FAM)
fAM droplets →WT
VIC droplets →mut
Empty droplets
▪ Analysis using QuantaSoft software▪ Calcul du nombre de copies correspondant à chaque fluorochrome (loi de Poisson)▪ Possibilité de calculer un ratio FAM (muté)/VIC+FAM (total allèles)
DESIGN ddPCRNRAS c.35G>A
T C
DESIGN ddPCRNRAS c.35G>A
T C
Ratio (FAM/VIC) = 0.27
Dilution 1/2 (VAF ≈25%)
Dilution 1/10 (VAF ≈ 5%)
Dilution 1/100 (VAF ≈ 0.5%)
DNA WT (VAF = 0%) = background
Ratio (FAM/VIC) = 0.04
Ratio (FAM/VIC) = 0.004
Ratio (FAM/VIC) = 5.10-5
Expected sensitivity = 1/ 1000 (or more adding replicates)
DESIGN ddPCRNRAS c.35G>A
T C
Ratio (FAM/VIC) = 0.27
Dilution 1/2 (VAF ≈25%)
Dilution 1/10 (VAF ≈ 5%)
Dilution 1/100 (VAF ≈ 0.5%)
DNA WT (VAF = 0%) = background
Ratio (FAM/VIC) = 0.04
Ratio (FAM/VIC) = 0.004
Ratio (FAM/VIC) = 5.10-5
Expected sensitivity = 1/ 1000 (or more adding replicates)
Initiating oncogenic event
BCR-ABL
BCR-ABL
BCR-ABLBCR-ABL
Initiating cell
Pre-leukemic cell
BCR-ABLdel(C)
IG/TCR; MFC
BCR-ABLXmut
BCR-ABLXmut
BCR-ABLXmut
Additional alterations
MRD TARGETS ARE NOT CREATED EQUAL
Leukemia cells
BCR-ABLXmutBCR-ABL
Xmut
Cooperative genetic lesions
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
▪ WHAT IS THE RIGHT TARGET TO FOLLOW?
▪ WHAT IS THE QUESTION?
▪ MRD CHALLENGED B* TARGETED THERAPIES (anti CD19, …)
Initiating oncogenic event
BCR-ABL
BCR-ABL
BCR-ABLBCR-ABL
Initiating
cell
Pre-leukemic cell
BCR-ABL
del(C)
IG/TCR; MFC
BCR-ABL
Xmut
BCR-ABL
Xmut
BCR-ABL
Xmut
Cooperative genetic lesions
Additional
alterations
Leukemia cells
BCR-ABL
XmutBCR-ABL
Xmut
Evolution of a
pre-leukemic clone
BCR-ABL
CDKN2A
Pmut
BCR-ABL
CDKN2A
Pmut
BCR-ABL
CDKN2A
Pmut
BCR-ABL
CDKN2A
PmutBCR-ABL
CDKN2A
Pmut
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
Selection of a minor
resistant subclone (52%)
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
BCR-ABL
Xmut
IKZF1BCR-ABL
Xmut
IKZF1
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
MRD TARGETS ARE NOT CREATED EQUAL
Les seuils de MRD ainsi que les
points de prélèvement d’un
protocole thérapeutique doivent être
définis précisément pour chaque
cible avant d’entreprendre une
stratification du risque basée sur la
maladie résiduelle.
Au-delà de la technique et du marqueur utilisé …
des bonnes pratiques médicales :
Merci à
Aurélie Caye
“If the Why is big enough, the How doesn’t matter”
MRD ET LAL PEDIATRIQUES
Fin d’induction (J35)
RR=16
RR=5,7(47%)
(11%)
EORTC-CLG 58 881 BFM-90
Cavé et al., NEJM 1998 Van Dongen et al., Lancet 1998
➢ La MRD aux stades précoces du traitement est un facteur pronostic de
rechute puissant et indépendant
➢ « Effet-dose »: Une mesure quantitative est plus informative
➢ Utilisation clinique de la MRD pour la stratification selon le risque : Définition
des seuils de MRD et temps de prélèvements optimaux pour chaque
protocole de traitement
Cellules leucémiques
résiduelles
*
*
* *
**
Traitement
MARQUEUR DE MALIGNITE (ex: anomalie initiatrice de la leucémie : mBCR-ABL)
Population lymphoïde normale
(polyclonale)
Cellules leucémiques lymphoïdes
(population monoclonale)
*
*
***
*
*
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
**
**
*
*
*
*
*
**
** *
*
***
***
*
• Quality-control program twice per year• Development and evaluation of new MRD strategies and techniques• Guidelines for the interpretation of RQ-PCR-based MRD data.
http://www.euromrd.org
ESG
MRD
ALL
BFM-
AIEOP
ALL-2000
DCLSG
ALL9
Interfant
99
MRC-
ALL 97/99
UKALL-R3
COALL-
06-97
FRALLE
2000
EORTC-
CLG 58951
NOPHO
ALL-2000
(pre-)BMT
ALL
adult
ALL
GMALL
06/99
adult ALL
LALA 2000
adult ALL
UKALL XII
adult ALL
PETHEMA/
GETH
THE EURO MRD CONSORTIUM (2001)
Q1 (réponse choix multiples)
L’intérêt du suivi de la maladie résiduelle dans les LAL a été démontré
pour :
1. Déterminer la réponse précoce au traitement de première ou
seconde ligne, prédictive du risque de rechute ?
2. Détecter précocement une résurgence des celles leucémiques afin
d’anticiper la rechute cytologique ?
3. Évaluer les chances de réussite d’une greffe de moelle osseuse (et le
cas échéant prévoir un traitement permettant de réduire la charge
tumorale avant greffe) ?
4. Vérifier que l’on peut arrêter sans risque le traitement d’entretien ?
5. Evaluer l’efficacité d’une drogue dans le cadre d’un essai de phase III
(« surrogate marker ») ?
Q1 (réponse choix multiples)
L’intérêt du suivi de la maladie résiduelle dans les LAL a été démontré
pour :
1. Déterminer la réponse précoce au traitement de première ou
seconde ligne, prédictive du risque de rechute ?
2. Détecter précocement une résurgence des celles leucémiques afin
d’anticiper la rechute cytologique ?
3. Évaluer les chances de réussite d’une greffe de moelle osseuse (et le
cas échéant prévoir un traitement permettant de réduire la charge
tumorale avant greffe) ?
4. Vérifier que l’on peut arrêter sans risque le traitement d’entretien ?
5. Evaluer l’efficacité d’une drogue dans le cadre d’un essai de phase III
(« surrogate marker ») ?
QUIZZ (choix multiple) – les écueils liés au prélèvement
1. Dans une LAL de lignée B, la proportion de cellules leucémiques est
identiques dans le sang et la moelle.
2. Si le prélèvement de moelle de suivi a été oublié, il peut être
remplacé par un prélèvement de sang.
3. L’hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de
maladie résiduelle faussement négatif
4. Une hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de
maladie résiduel faussement positif
5. Prélever la moelle sur plusieurs territoires permet d’éviter un
résultat faussement négatif
QIZZ (choix simple) – Chez un nouveau-né avec t(4;11), la
décision de greffe dépend du résultat de la maladie
résiduelle, avec un seuil à 10-4. Quel va être votre choix de
première intention pour le suivi de la maladie résiduelle?
1. Suivi par Q-PCR du réarrangement IG/TCR
2. Suivi par RT-QPCR du transcrit de fusion MLL-AF4
3. Suivi par cytométrie de flux
4. Suivi par le point de cassure génomique de la translocation
CLONAL ARCHITECTURE CAN BE COMPLEX
Does treatment affect clonal architecture?- HSCT- Pre-HSCT (6-MP, AZA, …)
DiagnosisHSCT
Relapse
Q1 (réponse choix multiples)
L’intérêt du suivi de la maladie résiduelle dans les LAL a été démontré
pour :
1. Déterminer la réponse précoce au traitement de première ou
seconde ligne, prédictive du risque de rechute ?
2. Détecter précocement une résurgence des celles leucémiques afin
d’anticiper la rechute c*tologique ?
3. Évaluer les chances de réussite d’une greffe de moelle osseuse (et le
cas échéant prévoir un traitement permettant de réduire la charge
tumorale avant greffe) ?
4. Vérifier que l’on peut arrêter sans risque le traitement d’entretien ?
5. Evaluer l’efficacité d’une drogue dans le cadre d’un essai de phase III
(« surrogate marker ») ?
Q1 (réponse choix multiples)
L’intérêt du suivi de la maladie résiduelle dans les LAL a été démontré
pour :
1. Déterminer la réponse précoce au traitement de première ou
seconde ligne, prédictive du risque de rechute ?
2. Détecter précocement une résurgence des celles leucémiques afin
d’anticiper la rechute c*tologique ?
3. Évaluer les chances de réussite d’une greffe de moelle osseuse (et le
cas échéant prévoir un traitement permettant de réduire la charge
tumorale avant greffe) ?
4. Vérifier que l’on peut arrêter sans risque le traitement d’entretien ?
5. Evaluer l’efficacité d’une drogue dans le cadre d’un essai de phase III
(« surrogate marker ») ?
Acr*lamide
separation
Multiplex PCR / Capillar* electrophoresis
PCR
PRESENTATION
Blasts > 85%
Genomic DNA
Sequencing of N region
Clono-specific primer
TCRG, TCRD, TCRB (T), IGH, IGK (B)
V J
ASO probe J primer J
MRD ASSESSEMENT – GENERAL STRATEG*
V JV D J NN N
6331-
VG
IJ1J2
6148-
VD
2D
D3
4720-
VG
IJ1J2
1
2
4
Design of an
allele specific
primer (ASO)
N-region sequencing
REMISSION
Blasts < 1-5%
PCR
Genomic DNA
Allele-specific real-time quantitative PCR
Relative quantitation b* comparison to a
standard curve (serial dilutions of initial blasts)
sensitivities of 10-4 to 10-5
TCRA+D
TCRG
IGH
germline
IGH
germline
▪ Suivi de l’ensemble des clones tumoraux
▪ Tableau du répertoire B des cellules normales (niveau de diversité, …)
NGS IG-TCR POUR LE SUIVI DE LA MALADIE RÉSIDUELLE
CD19-NEGATIVE RELAPSE OF PEDIATRIC BCP-ALLFOLLOWING BLINATUMOMAB TREATMENT
Patient achieved hematologic remission during c*cle 1 of blinatumomab and complete MRD response b* flow c*tometr* but was MRD-positive b* PCR.
MRD detected b* PCR provides reliable results independentl* from CD19 expression. However, it does not identif* this important change of CD19-negative relapse, which ma* have therapeutic implications. Loss of the CD19 antigen is also an important cause of discrepanc* between flow c*tometr* and PCR. The abilit* to accuratel* monitor ALL progression during treatment and after CD19-negative relapse b* flow c*tometr* requires identif*ing additional B-lineage or other specific markers consistentl* expressed on B cells. CD22 or CD24 in combination with markers
Mejstríková et al. Blood Cancer Journal (2017)
MRD DANS LES LAL
NOUVELLES APPROCHES MOLECULAIRES
La PCR digitale en gouttelettes
▪ Amplification d’une cible unique par compartiment (dilution)
▪ Discrimination allélique (sondes allèle-spécifiques marquées par un
fluorochrome)
▪ Remplace le signal exponentiel (analogue) de la PCR conventionnelle)
en signal digital (linéaire)
▪ Sensibilité dépend du nombre de compartiments (puits/gouttelettes)
et de la quantité d’ADN
Détection de mutations rares parmi des allèles sauvages
PCR digitale : Principe
1/ Génération des gouttelettes
❑Compartimentation de l’ADN dans
des millions de gouttelettes
❑Conditions de dilution limite
PCR digitale : Principe
1/ Génération des gouttelettes
2/ PCR spécifique et indépendante
Amplification (1) ou non (0)
PCR digitale : Principe
1/ Génération des gouttelettes
2/ PCR spécifique et indépendante
3/ H*bridation des sondes « mut » et « sauvage » et lecture de fluorescence
❑ Détection du signal fluorescent
▪ Sondes fluorescentes
▪ Décompte binaire : événement (1) ou non (0)
▪ Événement : allèle sauvage ou muté
❑ Quantification absolue
DROPLET DIGITAL PCR (ddPCR)
▪ Compartimentation de l’ADN dans des millions de gouttelettes
▪ Amplification d’une cible unique par compartiment (dilution)
▪ Discrimination allélique (sondes allèle-spécifiques marquées par un fluorochrome)
▪ Sensibilité dépend du nombre de compartiments (puits/gouttelettes) et de la quantité d’ADN
*
Merci à…Aurélie Ca*eVincent CathalotL*dia Suarez
La maladie résiduelle a encore bien des cordes à son arc !
Rapport transcrit cible / transcrit de référence
ARN
cDNA
Transcrit
de fusion
Transcrit
de référence
endogène
Prélèvement
Extraction
Transcription
inverse
PCR
quantitative
Conservation
UTILISATION LIMITEE DES TRANSCRITS DE FUSION
POUR SUIVRE LA MALADIE RESIDUELLE DANS LES LAL
MLL-t
CALM-AF10
TCR-HOXA
TLX1/HOX11
TLX3/HOX11L2
SIL-TAL1, L*L1, TAL2, +/- LMO1, LMO2
TCR-M*B
ETV6-RUNX1
H*perdiploid* (25%)
MLL (10%)
iAMP21 (2%)BCR-ABL (3%)
E2A-PBX1 (5%)M*C (2%)
CRLF2 (6%)
Childhood B-lineage ALL
T-ALL
NB: utilisé pour LMC (BCR-ABL), LAM3 (PML-RARA)
Protocoles EORTC
INTEGRATION DE LA MRD POUR DEFINIR LE RISQUE
• Intensité du traitement basée sur la MRD
(Intensification si MRD élevée +/- désescalade si bas niveau de MRD)
• Indication d’allogreffe de moelle
Prephase Ia
MRD 10-2
VANDAIb’
Ib IIa+bInterval Maintenance
Interval
(3 courses)MaintenanceBlocks R1 R2 R3 (x2)
MRD
(D35)
Risque
Standard
et bas risque
Haut risque
VHRBMT-MSD
MINIMAL RESIDUAL DISEASE MONITORING IN ADULT ALLTO DETERMINE THERAP*
Bassan, Curr Hematol Malig Rep, 2015
NEXT GENERATION SEQUENCING
OF IG/TCR REARRANGEMENTS
▪ PCR Multiplex
▪ (s*stèmes identiques à ceux utilisés en
PCR/anal*se de fragment),
▪ Incorporation des code-barres et
adaptateurs pour NGS
▪ séquençage sur les plateformes PGM-Ion
Torrent ou Miseq-Illumina)
#2 jours de technique, #2,5 jours de run
V J P7IdIdP5
Index
Amorces d’amplification
Adaptateurs Illumina
(attachement à la flow cell)
Amplicon
Au diagnostic : Identification des réarrangements clonaux
▪ Séquence simultanée des réarrangements, (#1 semaine)
▪ Anal*se bioinformatique permettant l’identification des régions V-D-J
Rd1
Adaptateurs Illumina
(pour PCR universelle – si technique PCR en 2 étapes) et site de fixation des amorces de séquençage)
Mise en évidence des Réarrangements IgTCR par NGS
Laboratoire de Génétique moléculaire de Robert Debré
Secteur Onco-Hématologie-Greffe
Identification des réarrangements IgTCR du patient au Diagnostic par séquençage sur Miseq.
Locus IgH, IgK, TCRD, TCRG, TCRB.(primers Biomed II)
Délétions intragéniques ERG et IKZF1 (primers maison)
Identito-Vigilance (set de 9 SNPs)
Principe
PCR Multiplex Non Fluo
Ligation des adaptateurs(Kit ClaSeek, Thermofisher)
Quantification des produits de Ligation(Kit KAPA, Roche)
Pool des Echantillons + Quantification du Pool
Chargement du Pool (Cartouche V2 500 c*cles, Flow cell Nano 1M de reads)
Les Différentes Etapes du Protocole
V(D)J
Vidjil : alignement des réarrangements IgTCR à partir des reads présents dans les fichiers FASTQ.gz (compressés)
EmEditor : anal*ses des données brutes à partir des fichiers FASTQ (décompressés)
Anal*ses d’ERG, IKZF1, Identito-Vigilance.
Anal*se des données
Pulsipher et al., Blood 2015
QUIZZ (réponse choix multiples) – Pourquoi suivre la maladie
résiduelle chez l’enfant?
L’intérêt du suivi de la maladie résiduelle dans les LAL de
l’enfant a été démontré pour :
1. Déterminer la réponse précoce au traitement, prédictive du
risque de rechute
2. Détecter précocement une rechute afin de la traiter avant la
rechute c*tologique
3. Évaluer les chances de réussite d’une greffe de moelle osseuse
4. Vérifier qu’on peut arrêter sans risque le traitement
d’entretien
QUIZZ (choix multiple) – les écueils liés au prélèvement
1. Dans une LAL de lignée B, la proportion de cellules leucémiques est
identiques dans le sang et la moelle.
2. Si le prélèvement de moelle de suivi a été oublié, il peut être
remplacé par un prélèvement de sang.
3. L’hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de
maladie résiduelle faussement négatif
4. Une hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de
maladie résiduel faussement positif
5. Prélever la moelle sur plusieurs territoires permet d’éviter un
résultat faussement négatif
QIZZ (choix simple) – Chez un nouveau-né avec t(4;11), la
décision de greffe dépend du résultat de la maladie
résiduelle, avec un seuil à 10-4. Quel va être votre choix de
première intention pour le suivi de la maladie résiduelle?
1. Suivi par Q-PCR du réarrangement IG/TCR
2. Suivi par RT-QPCR du transcrit de fusion MLL-AF4
3. Suivi par c*tométrie de flux
4. Suivi par le point de cassure génomique de la translocation
DELETIONS INTRAGENIQUES D’IKAROS (IKZF1)
UNE NOUVELLE CIBLE POUR SUIVRE LA MRD
Gamme SENI – 50µL ; 500ng ;
duplicat - Dilutions
10-2 10-35.10-
4 10-4
RECHERCHE DE MARQUEURS CLONO-SPECIFIQUES
LAL DU NOURRISSON
INTERFANT 06
Cible MRD :
point de cassure
génomique de MLL
Cible MRD :
réarangements des
gènes IG/TCR
LAL du nourrisson
MLL+ MLL-
80% 20%
• LAL souvent immature / biphénot*pique
• Réarrangements IG/TCR absents ou restreints à des sous-clones (risque de
faux négatifs)
• Suivi du transcrit de fusion : diversité des transcrits. Pas de standardisation,
interprétation délicate
• Suivi en CMF : possible mais pas de standardisation internationale
CATTGTGATGTCACACTAATTTTATGCTTTTCATCCTTATTTTCCATCCAAAGTTGTGTAA•TT•CTATATTAAATTACACATAAATTAGAACCAAGAACAGGAAAGAACCCCTTGCCATCTGTTCTCTAGCTGCG
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
MLL Séquence chromosomique inconnue
der 11
AFF1 (AF4)46%
Autre7%
MLLT1 (ENL)21%
MLLT3 (AF9)16%
EPS15 (AF1P)3%
MLLT10 (AF10)5%
MLLT4 (AF6)2%
POINT DE CASSURE GENOMIQUE DE MLL (11q23)
1) Séquençage du point de cassure
génomique de la translocation MLL
(11q23) par long-distance inverse
PCR (LDI-PCR) (R Marshalek, D)
CATTGTGATGTCACACTAATTTTATGCTTTTCATCCTTATTTTCCATCCAAAGTTGTGTAA•TT•CTATATTAAATTACACATAAATTAGAACCAAGAACAGGAAAGAACCCCTTGCCATCTGTTCTCTAGCTGCG
Amorce MLL Amorce X
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
MLL Séquence chromosomique inconnue
der 11
AFF1 (AF4)46%
Autre7%
MLLT1 (ENL)21%
MLLT3 (AF9)16%
EPS15 (AF1P)3%
MLLT10 (AF10)5%
MLLT4 (AF6)2%
Sonde TaqMan
S*stème Q-PCR patient spécifique
Spécificité
Robustesse (ADN)
Domaine de quantification : 10-4
Applicabilité : >70% des patients MLL+
POINT DE CASSURE GENOMIQUE DE MLL (11q23)
1) Séquençage du point de cassure
génomique de la translocation MLL
(11q23) par long-distance inverse
PCR (LDI-PCR) (R Marshalek, D)
2) Choix d’amorces encadrant le
point de cassure +/- sonde TaqMan
3) PCR quantitative en temps réel
Positif non quantifiable :
Expression / QR
Négatif
Expression / SR
Pas d’indication
de greffe
Rechute méningée isolée
À J1 du traitement
d’entretien
(ponction s*stématique)
Indication de greffe
BIBLIOGRAPHY
MRD Reviews
Campana D. Should Minimal Residual Disease Monitoring in Acute Lymphoblastic Leukemia be Standard of Care? Curr
Hematol Malig Rep. 2012 Feb 29.
McGregor S, McNeer J, Gurbuxani S. Beyond the 2008 World Health Organization classification: the role of the
hematopathology laboratory in the diagnosis and management of acute lymphoblastic leukemia. Semin Diagn Pathol. 2012
Feb;29(1):2-11. Review.
Brüggemann M, Gökbuget N, Kneba M. Acute lymphoblastic leukemia: monitoring minimal residual disease as a therapeutic
principle. Semin Oncol. 2012 Feb;39(1):47-57. Review.
Oliansky DM, Camitta B, Gaynon P, Nieder ML, Parsons SK, Pulsipher MA, Dillon H, Ratko TA, Wall D, McCarthy PL Jr, Hahn T.
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leukemia: update of the 2005 evidence-based review. Biol Blood Marrow Transplant. 2012 Apr;18(4):505-22.
Hunger SP, Raetz EA, Loh ML, Mullighan CG. Improving outcomes for high-risk ALL: translating new discoveries into clinical
care. Pediatr Blood Cancer. 2011 Jun;56(6):984-93.
Cazzaniga G, Valsecchi MG, Gaipa G, Conter V, Biondi A. Defining the correct role of minimal residual disease tests in the
management of acute l*mphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 2011 Oct;155(1):45-52
Coustan-Smith E, Campana D. Immunologic minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia: a
comparative approach to molecular testing. Best Pract Res Clin Haematol. 2010 Sep;23(3):347-58.
Campana D. Progress of minimal residual disease studies in childhood acute leukemia. Curr Hematol Malig Rep. 2010
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S*mposium on MRD assessment in Kiel, German*, 18-20 September 2008. Leukemia. 2010 Mar;24(3):521-35.
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Minimal Residual Disease on Relapse and Survival. Biol Blood Marrow Transplant. 2012 Mar 16.
Lankester AC, et al. Preemptive alloimmune intervention in high-risk pediatric acute l*mphoblastic leukemia patients
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Giebel S, et al. Stud* Group for Adult ALL of the European Leukemia Net. Status of minimal residual disease determines
outcome of autologous hematopoietic SCT in adult ALL. Bone Marrow Transplant. 2010 Jun;45(6):1095-101.
Pulsipher MA, Bader P, Klingebiel T, Cooper LJ. Allogeneic transplantation for pediatric acute l*mphoblastic leukemia: the
emerging role of peritransplantation minimal residual disease/chimerism monitoring and novel chemotherapeutic,
molecular, and immune approaches aimed at preventing relapse. Biol Blood Marrow Transplant. 2009 Jan;15(1 Suppl):62-71
Bader P, et al., ALL-REZ BFM Stud* Group. Prognostic value of minimal residual disease quantification before allogeneic
stem-cell transplantation in relapsed childhood acute l*mphoblastic leukemia: the ALL-REZ BFM Stud* Group. J Clin Oncol.
2009 Jan 20;27(3):377-84. Epub 2008 Dec 8.
Bader P, Willasch A, Klingebiel T. Monitoring of post-transplant remission of childhood malignancies: is there a standard?
Bone Marrow Transplant. 2008 Oct;42 Suppl 2:S31-4. Review.
Q1 (réponse choix multiples) – Pourquoi suivre la maladie
résiduelle chez l’enfant? L’intérêt du suivi de la maladie
résiduelle dans les LAL de l’enfant a été démontré pour :
1. Déterminer la réponse précoce au traitement, prédictive du
risque de rechute
2. Détecter précocement une rechute afin de la traiter avant la
rechute c*tologique
3. Évaluer les chances de réussite d’une greffe de moelle osseuse
4. Vérifier qu’on peut arrêter sans risque le traitement
d’entretien
High-resolution profiling of genetic alterations has
transformed the genomic landscape of BCP-ALL
High hyperdiploidy
ETV6-RUNX1
TCF3-PBX1
ERGdel
iAMP21
Low hypo/near-haploidy
MLLt
B-Other
BCR-ABL1
High h*perdiploid*30-35%
« B-other »25-30%
TCF3-PBX1
BCR-ABL1< 5%
MLLtH*po/haploid*
≤ 5% each
ERGdeliAMP21
Classif*ing/primar* abnormalities
ETV6-RUNX120-25%
CAS CLINIQUE
Gabriel, 3 mois
NFS
• Hyperleucocytose à 160 G/L
• Frottis : cellules immatures
SNC+
Moelle
Broncho-pneumopathie avec hépato-spénomégalie
LAL pro-B (EGIL B-I)
Immunophénotype
Sensible à la préphase de corticoides (J8)
INTERFANT – Bras Medium RiskO Fenneteau
Q2 (choix multiples) - Chez un nourrisson atteint de LAL
1. On identifie un réarrangement MLL dans plus de 80% des cas
2. Le réarrangement le plus fréquent est MLL-AF9
3. la stratification du risque va reposer sur le statut de MLL
(réarrangé ou non)
4. la stratification du risque va reposer sur le partenaire de MLL
5. La meilleure technique pour identifier les réarrangements de
MLL est la FISH
6. La meilleure technique pour identifier les réarrangements de
MLL est la RT-PCR multiplex
FISH MLL (dual clor break apart)
AFF1 (AF4)
46%
Autre7%
MLLT1 (ENL)21%
MLLT3 (AF9)16%
EPS15 (AF1P)3%
MLLT10 (AF10)5%
MLLT4 (AF6)2%
LAL DU NOURRISSON : 80% MLL+
Van der Velden et al., Leukemia 2009
TP3 10-4
INTERFANT 99MLL-AF4
LAL DU NOURRISSON : 80% MLL+
LAL DU NOURRISSON : INTERFANT 06
Risque faible - MLL-
Haut Risque - MLL+
- âge <6 mois - GB >300 G/L ou mauvaise réponse aux corticoïdes
Risque intermédiaire : - autres MLL+
RECHERCHE DE MARQUEURS CLONO-SPECIFIQUES
Q3 (choix simple) - La décision de greffe dépend du résultat de
la maladie résiduelle, avec un seuil à 10-4. Quel va être
votre choix de première intention pour le suivi de la
maladie résiduelle?
1. Suivi par Q-PCR du réarrangement IG/TCR
2. Suivi par RT-QPCR du transcrit de fusion MLL-AF4
3. Suivi par cytométrie de flux
4. Suivi par le point de cassure génomique de la translocation
LAL DU NOURRISSON
INTERFANT 06
Cible MRD :
point de cassure
génomique de MLL
Cible MRD :
réarangements des
gènes IG/TCR
LAL du nourrisson
MLL+ MLL-
80% 20%
• LAL souvent immature / biphénot*pique
• Réarrangements IG/TCR absents ou restreints à des sous-clones (risque de
faux négatifs)
• Suivi du transcrit de fusion : diversité des transcrits. Pas de standardisation,
interprétation délicate
• Suivi en CMF : possible mais pas de standardisation internationale
CATTGTGATGTCACACTAATTTTATGCTTTTCATCCTTATTTTCCATCCAAAGTTGTGTAA•TT•CTATATTAAATTACACATAAATTAGAACCAAGAACAGGAAAGAACCCCTTGCCATCTGTTCTCTAGCTGCG
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
MLL Séquence chromosomique inconnue
der 11
AFF1 (AF4)46%
Autre7%
MLLT1 (ENL)21%
MLLT3 (AF9)16%
EPS15 (AF1P)3%
MLLT10 (AF10)5%
MLLT4 (AF6)2%
POINT DE CASSURE GENOMIQUE DE MLL (11q23)
1) Séquençage du point de cassure
génomique de la translocation MLL
(11q23) par long-distance inverse PCR
(LDI-PCR) (R Marshalek, D)
CATTGTGATGTCACACTAATTTTATGCTTTTCATCCTTATTTTCCATCCAAAGTTGTGTAA•TT•CTATATTAAATTACACATAAATTAGAACCAAGAACAGGAAAGAACCCCTTGCCATCTGTTCTCTAGCTGCG
Amorce MLL Amorce X
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
MLL Séquence chromosomique inconnue
der 11
AFF1 (AF4)46%
Autre7%
MLLT1 (ENL)21%
MLLT3 (AF9)16%
EPS15 (AF1P)3%
MLLT10 (AF10)5%
MLLT4 (AF6)2%
Sonde TaqMan
S*stème Q-PCR patient spécifique
Spécificité
Robustesse (ADN)
Domaine de quantification : 10-4
Applicabilité : >70% des patients MLL+
POINT DE CASSURE GENOMIQUE DE MLL (11q23)
1) Séquençage du point de cassure
génomique de la translocation MLL
(11q23) par long-distance inverse PCR
(LDI-PCR) (R Marshalek, D)
2) Choix d’amorces encadrant le point de
cassure +/- sonde TaqMan
3) PCR quantitative en temps réel
Positif non quantifiable :
Expression / QR
Négatif
Expression / SR
Pas d’indication
de greffe
Rechute méningée isolée
À J1 du traitement
d’entretien
(ponction s*stématique)
Indication de greffe
The target
Jak2
STAT5
STAT5
PP
P
1
22
33
1 Gab2
P
P STAT5
*1002
*694
TKI
Drug targeted pathwa*s
CD20, …
Phosphoproteins (phospho-FCM)
Oncogenic markers
Breakpoint specific Q-PCR
✓ Robustness (DNA)
✓ Specificit* (SR ≤10-4; QR 10-4)
MLL genomic breakpoint
(initiating lesion)
TTATGCTTTTCATCCTTATTTTCCATCCAAAGTTGTGTAA•TT•CTATATTAAATTACACATAAATTAGAACCAAGA
TaqMan probe
Der(11) MLL fusion partner
IKZF1 intragenic deletions
(drug-resistant cell subset)
1 2 3 4 5 6 7
1 2 7IKZF4-7
TaqMan® probe
Be*ond the technique used…
MRD DANS LES LAL
NOUVELLES APPROCHES MOLECULAIRES
Nouvelles méthodes
• “PCR universelle”: Séquençage
haut débit des réarrangements
IG/TCR (NGS) (>1 million lectures
avec des amorces consensus)
Nouvelles cibles
• Marqueurs oncogéniques
identification et suivi de sous-
clones résistants au traitement
Suivi de cibles thérapeutiques
Autre
93%
IKZF1 (Δ4-7)
7%
3
Oncogenic markers
Breakpoint specific Q-PCR
✓ Robustness (DNA)
✓ Specificit* (SR ≤10-4; QR 10-4)
IKZF1 intragenic deletions
(drug-resistant cell subset)
1 3 4 5 6 8
1 2 8IKZF4-7
TaqMan® probe
QUALIT* CONTROL WITHIN EURO-MRD
Positive
1.00E-05
1.00E-04
1.00E-03
1.00E-02
Mean
QR: 5x10-4
RQ-PCR anal*sis of a follow-up sample using provided primers/probe set
→ MRD level differs less than 2-fold between various laboratories
MRD-PCR laboratories
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Results 7th ESG-MRD-ALL Qualit* Control Round; Spring 2005
ESGMRDALL
BFM-AIEOP
ALL-2000
DCLSGALL9
Interfant99
MRC-ALL 97/99UKALL-R3
COALL-06-97
FRALLE2000
EORTC-CLG 58951
NOPHOALL-2000
(pre-)BMTALL
adultALL
GMALL06/99
adult ALLLALA 2000
adult ALLUKALL XII
adult ALLPETHEMA/
GETH
RQ-PCR anal*sis of Ig/TCR
gene rearrangements
RQ-PCR anal*sis of fusion
gene transcripts
(BCR-ABL, etc…)
Flow c*tometr*
Applicabilit* Wide
B-lineage and T-ALL
(90-95%)
<30%
Depends on the marker
Wide
B-lineage and T-ALL
(80-95%)
Sensitivit* 10-4 to 10-5 10-3 to 10-5
Depends on RNA input
(qualit*/quantit*)
3- to 4-color: 10-3 to 10-4
6- to 9- color: 10-4 to 10-5
Depends on cell input
Quantitative
range
10-3 to 10-4 To be defined To be defined
Biological
material
DNA (stabilit* +++) possibilit* of centralised and
retrospective anal*ses
RNA (unstable) Fresh cells
1st step cannot be easil*
centralised or tested
retrospctivel*
Marker stabilit* Oligoclonalit*
Clonal evolution
+
Leukemia specific
Immunophenot*pic shifts
Standardization High level In process In process
Cost +++ + +++
METHODS FOR MRD QUANTITATION IN ALL
RQ-PCR anal*sis of Ig/TCR
gene rearrangemnts
RQ-PCR anal*sis of fusion
transcripts (BCR-ABL, etc…)
Flow c*tometr*
Pros • Most published data for
evidence based treatment
decisions
• Well established
stratification tool
• Universal markers
• Follow-up of a treatment
target (BCR-ABL, …)
• Quantitative
• Additional infos on
benign cells or malignant
cells
• Follow-up of a treatment
target (CD20, …)
Cons • Patient-specific markers:
• Time-consuming (cannot
be used for ver* earl* time-
points)
• Variations in expression
levels (relationship with cell
number)
• Risk of false positivit*
(contaminations)
• Changes in precursor B-
compartment during
regeneration
• Extensive expertise
necessar* for ≥6-color flow
c*tometers
Conclusion Remains the gold standard
for multicenter protocols
Challenged b* DNA oncogenic
markers (genomic
breakpoint, …)
Still in learning process
(room for improvement)
METHODS FOR MRD QUANTITATION IN ALL
MRD term Proposed definition Remarks
Remission assessement
Complete MRD response Minimal technical requirements
fulfilled and MRD negativit*
Treatment modifications depending on
these measurements are recommended to
be based on anal*sis of at least 2 samples
MRD persistence Minimal technical requirements
fulfilled and quantifiable MRD
positivit* for at least 2 time-points
Time-point should be specified in the
protocol. At least one relevant treatment
element should be administered in-
between
Post-remision monitoring
MRD reapparance Minimal technical requirements
fulfilled and conversion after MRD
negativit* to quantifiable positivit*
Treatment modifications depending on
these measurements are recommended to
be based on anal*sis of at least 2 samples
Relapse Usuall* c*tologicall* defined Can be equated with « MRD
reapparance » onl* in protocol that
evidenced invariable association between
both
DEFINITIONS OF MRD TERMS IN ALL
Workshop on MRD assessment in ALL – Kiel, German*
(Brüggerman et al., 2010)
Study group I-BFM-SG BFM-AUSTRIA NOPHO EORTC ST-JUDE
Treatment protocol ALL-BFM 90/ AEIOP ALL91/ DCLSG – ALL8
ALL-BFM 95 NOPHO ALL MRD 95 EORTC protocol 58881 Total Therapy Study XIIIAand XIIIB
Induction intensitybefore MRD sampling
Standard (PRED + Mtx i.th.+ VCR + DAUNO + L-ASP)
Standard (PRED + Mtx i.th.VCR + DAUNO + L-ASP)
Standard (PRED + Mtx i.th.VCR +DOXO + L-ASP)
Standard (PRED + Mtx i.th.VCR +DOXO + L-ASP)
Intensive (Mtx + PRED +VCR + Dauno + L-ASP +VP-16 + Ara-C + triple i.th.)
Number of patients 169 98 100 151 165
Relapse rate 27% at 5 years 12% at 3.5 years 15% at 4 years 21% at 3 years 16.3% 3.5% at 4 years
Technique Ig/TCR PCR Flow cytometry Ig/TCR PCR Ig/TCR PCR Flow cytometry
Standardization multi-center single-center single-center multi-center single-center
MRD time point at theend of inductiontreatment
5 weeks 5 weeks 4 weeks 5 weeks 6 weeks
MRD status at the endof induction treatment
Distribution% (No.)
Relapse rate% (No.)
Distribution% (No.)
Relapse rate% (No.)
Distribution% (No.)
Relapse rate% (No.)
Distribution% (No.)
Relapse rate% (No.)
Distribution% (No.)
Relapse rate% (No.)
MRD-negative 42% (71) 3% (2) 60% (59) 7% (4) 66% (88) 8% (7) 75% (123) 7% (9)
MRD 10-4 20% (33) 24% (8) 5% (5) 20% (1)
53%
(53) 2% (1)
12% (19)
MRD 10-3 22% (38) 39% (15) 32% (31) 16% (5) 32% (32) 28% (9)
23%
(30) 17% (5)
8% (14)
30%
MRD 10-2 16% (27) 74% (20) 3% (3) 100% (3) 15% (15) 33% (5) 11% (15) 73% (11) 5% (9) 72% 21%
Combined two time points Combined two time points Single time point Single time point Combined two time pointsRisk groupclassification
Distribution Relapse rate Distribution Relapse rate Distribution Relapse rate Distribution Relapse rate Distribution Relapse rate
MRD-based LRG 43% (55) 2% (1) 40% (40) 0% 79% (123) 7% (9)
MRD-based IRG 43% (55) 24% (13)
90%
(94)
3%
(3) 89%
(118) 10% (12)
9% (14) 7% (1)
MRD-based HRG 15% (19) 84% (16) 10% (10) 100% (10)
60%
(60)
25%
(15)11% (15) 73% (11) 12% (18) 56% (10)
MRD : LARGE PROSPECTIVE STUDIES IN CHILDHOOD ALL
JJM Van Dongen., personal communication
Marqueurs de maladie résiduelle
• Nécessité d’homogénéiser la présentation des résultats
• Transcrits oncogéniques : pathologies différentes
• Nécessité de corrélations cliniques pour chaque marqueur
• Les données issues de l’étude des IGH/TCR ne peuvent pas être extrapolées!
• Protocoles nationaux ou internationaux : standardisation des techniques (accréditation)
MRD AFTER INDUCTION IS THE STRONGEST PREDICTOR OF PROGNOSIS
IN INTERMEDIATE RISK RELAPSED ALL – ALL-REZ BFM P95/96 TRIAL
Eckert, Eur J Cancer 2011
Bruggerman et al., 2012
MRD AS AN INDICATOR OF IMPENDING RELAPSE
➢ Should molecular relapse be regarded as an overt ALL relapse? (Initiate salvage
therap* prior to hematologic relapse with a lower tumour burden)
➢ If *es, at which level of MRD?
Whether treatment in molecular relapse is more effective
than in overt relapse is still to be proven.
GMALL trial: conversion to quantifiable MRD positivit* during earl* post-
consolidation is highl* predictive of subsequent relapse.
Q4 (choix multiple) – les écueils liés au prélèvement
• Dans une LAL de lignée B, la proportion de cellules leucémiques est
identiques dans le sang et la moelle.
• Si le prélèvement de moelle de suivi a été oublié, il peut être
remplacé par un prélèvement de sang.
• L’hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de
maladie résiduelle faussement négatif
• Une hémodilution du prélèvement peut entraîner un résultat de
maladie résiduel faussement positif
Gamme SENI – 50µL ; 500ng ;
duplicat - Dilutions
10-2 10-3
5.10-
410-4
Maladie résiduelle et Séquençage de Nouvelle Génération (NGS)
Maladie résiduelle et Séquençage de Nouvelle Génération (NGS)
Technique : PCR Multiplexe (s*stèmes identiques à ceux utilisés en PCR/anal*se de fragment), puis incorporation des barcodes et adaptateurs pour NGS (séquençage sur les plateformes PGM-Ion Torrent ou Miseq-Illumina)
#2 jours de technique, #2,5 jours de run
Au diagnosticIdentification des réarrangements clonauxSéquence simultanée de ces mêmes réarrangements, obtenues donc en
#1 semaine (plus de séparation sur pol*acr*lamide, plus de séquence à lancer une à une)
Séquence de l’ensemble des réarrangementsAnal*se bioinformatique permettant l’identification des régions V-D-J
Application sur les prélèvements au suivi Sensibilité de 10 4 à 10 6 (fonction de la quantité initiale d’ADN)Quantification possible par rapport au diagnostic/contrôle interneAbsence de mise au point de s*stèmes patients spécifiqueSuivi de l’ensemble des marqueurs
avantage si oligoclonalitéavantage si évolution clonale
1) Identification et séquençage des
réarrangements Ig/TCR présents dans
les cellules leucémiques de chaque
patient
2) Design d’une ASO pour Q-PCR
3) Courbe de calibration (dilutions en
série des blastes du patient dans des
cellules mononucléées pol*clonales)
DV J
ASO probe J primer J
or
PCR ALLELE-SPECIFIQUE EN TEMPS REEL
ASO: allele-specific oligonucleotide
V J
ASO probe J primer J
Protocoles EORTC
INTEGRATION DE LA MRD POUR DEFINIR LE RISQUE
• Intensité du traitement basée sur la MRD
(Intensification si MRD élevée +/- désescalade si bas niveau de MRD)
• Indication d’allogreffe de moelle
Prephase Ia
MRD 10-2
VANDAIb’
Ib IIa+bInterval Maintenance
Interval
(3 courses)MaintenanceBlocks R1 R2 R3 (x2)
MRD
(D35)
Risque
Standard
et bas risque
Haut risque
VHRBMT-MSD
*AN, 3 ans
NEXT GENERATION SEQUENCING
OF IG/TCR REARRANGEMENTS
▪ PCR Multiplex
▪ (s*stèmes identiques à ceux utilisés en
PCR/anal*se de fragment),
▪ Incorporation des code-barres et
adaptateurs pour NGS
▪ séquençage sur les plateformes PGM-Ion
Torrent ou Miseq-Illumina)
#2 jours de technique, #2,5 jours de run
V J P7IdIdP5
Index
Amorces d’amplification
Adaptateurs Illumina
(attachement à la flow cell)
Amplicon
Au diagnostic : Identification des réarrangements clonaux
▪ Séquence simultanée des réarrangements, (#1 semaine)
▪ Anal*se bioinformatique permettant l’identification des régions V-D-J
ANALYSE BIOINFORMATIQUE
L*mphoTrack® Dx MiSeq Data Anal*sis (Kits IGH, TCRG) Invivoscribelogiciel d’anal*se spécifique, macro Excel, 1 échantillon par anal*se
visualisation graphique des réarrangements majoritaires
séquence des réarrangements majoritaires, avec anal*se des segments V et J
Logiciel Vidjil (développé à Lille, accès en ligne, tous réarrangements)
BMC Genomics, 15:409, doi:10.1186/1471-2164-15-409
interface web (compte utilisateur)
visualisation graphique des réarrangements majoritaires
accès à la séquence du réarrangement sélectionné
identification des régions V,D,J
liens pour anal*se de la séquence sur IMGT/V-QUEST, IgBlast, Blast
possibilité de lier plusieurs échantillons à un patient : cinétique
NGS IG-TCR AU DIAGNOSTIC DE LAL
18900, LAL pré pré B, h*perleucoc*taire, B-other45, XX, der(7) t(7;11) (q2?2;q1?3), der(9) t(9;11)(p13;p?11), -11, ?der(12)del12)(p13) [11]Bon répondeur à la préphase (J8)
Recherche de réarrangements Ig/TCR classique : 1 VH1-DH4-JH4 / 1 VH6-DH3-JH2
Visualisation L*mphoTrack VisualisationVidjil
16536, LAL pré B, absence de transcrits46,XX,del(9)(p10)[5]/46,XX[10]Seul le locus IGH présente des réarrangements, mais oligoclonalité marquée (VH3, VH4, VH6)4 des réarrangements ont une région DJ commune et sont suivis simultanément
Visualisation L*mphoTrack
SANGERRéarrangement VH3 : échec de séquence des allèles à 323, 324 pb (double séquence)Région DJ (DH3JH6) commune aux réarrangements VH4 et VH6
VisualisationVidjil
NGS IG-TCR AU DIAGNOSTIC
Echantillon pol*clonal
Visualisation L*mphoTrack VisualisationVidjil
NGS IG-TCR AU DIAGNOSTIC
▪ Suivi de l’ensemble des clones tumoraux
▪ Tableau du répertoire B des cellules normales (niveau de diversité, …)
NGS IG-TCR POUR LE SUIVI DE LA MALADIE RÉSIDUELLE
MRD DANS LES LAL
NOUVELLES APPROCHES MOLECULAIRES
Nouvelles cibles
• Marqueurs oncogéniques
identification et suivi de sous-
clones résistants au traitement
Suivi de cibles thérapeutiques
▪ Points de cassure génomiques
des translocations
▪ Délétions récurrentes
▪ Mutations ponctuelles
Oncogenic markers
Breakpoint specific Q-PCR
✓ Robustness (DNA)
✓ Specificit* (SR ≤10-4; QR 10-4)
MLL genomic breakpoint
(initiating lesion)
TTATGCTTTTCATCCTTATTTTCCATCCAAAGTTGTGTAA•TT•CTATATTAAATTACACATAAATTAGAACCAAGA
TaqMan probe
Der(11) MLL fusion partner
80% des LAL du nourrisson
MRD DANS LES LAL
NOUVELLES APPROCHES MOLECULAIRES
Nouvelles cibles
• Marqueurs oncogéniques
identification et suivi de sous-
clones résistants au traitement
Suivi de cibles thérapeutiques
▪ Points de cassure génomiques
des translocations
▪ Délétions récurrentes
▪ Mutations ponctuelles
Autre
93%
IKZF1 (Δ4-7)
7%
3
Oncogenic markers
Breakpoint specific Q-PCR
✓ Robustness (DNA)
✓ Specificit* (SR ≤10-4; QR 10-4)
IKZF1 intragenic deletions
(drug-resistant cell subset)
1 3 4 5 6 8
1 2 8IKZF4-7
TaqMan® probe
MRD DANS LES LAL
NOUVELLES APPROCHES MOLECULAIRES
La PCR digitale en gouttelettes
▪ Amplification d’une cible unique par compartiment (dilution)
▪ Discrimination allélique (sondes allèle-spécifiques marquées par un
fluorochrome)
▪ Remplace le signal exponentiel (analogue) de la PCR conventionnelle)
en signal digital (linéaire)
▪ Sensibilité dépend du nombre de compartiments (puits/gouttelettes)
et de la quantité d’ADN
Détection de mutations rares parmi des allèles sauvages
10-2 10-3 5.10-4 10-4
PCR DIGITALE EN GOUTTELETTES
Raindrop® s*stem (Raindance technologies)
Exemple d’une mutation ponctuelle d’IKZF1
t(A;B)
t(A;B)
t(A;B)t(A;B) Mutation
sélection
Cellule
progénitrice
Cellule
pre-leucémique
Cellules leucémiques
t(A;B)
del(C)
Xmut
t(A;B)
del(C)
Xmutt(A;B)
del(C)
Xmutt(A;B)
del(C)
Xmut
t(A;B)
del(C)
Xmut
t(A;B)
del(C)t(A;B)
del(C)
t(A;B)
del(C)
t(A;B)
del(C)
t(A;B)
del(C)
Xmut
ou
Rechute
Chimioresistance +
MRD+
t(A;B)
del(C)
Xmut
t(A;B)
del(C)
Xmut
t(A;B)
del(C)
Xmut
t(A;B)
del(C)
Xmut
t(A;B)
del(C)
Xmut
t(A;B)
del(C)
Xmutt(A;B)
del(C)
Xmut
t(A;B)
del(C)
Xmut
MRD+TRAITEMENT
t(A;B)
del(C)
Xmut
t(A;B)
del(C)
Xmut
t(A;B)
del(C)
Xmut
MRD(-)
t(A;B)
del(C)
Xmut
MARQUEUR, MRD ET HISTOIRE NATURELLE DES RECHUTES
MARQUEUR, MRD ET HISTOIRE NATURELLE DES RECHUTES
t(A;B)
t(A;B)
t(A;B)t(A;B)
Mutation
sélection
Cellule
progénitrice
Cellule
pre-leucémique
Cellules leucémiques
t(A;B)
del(C)t(A;B)
del(C)
t(A;B)
del(C)
t(A;B)
del(C)
t(A;B)
del(C)
Xmut
TRAITEMENT
MRD(-)
t(A;B)
Add(F)
Pmut
t(A;B)
Add(F)
Pmut
t(A;B)
Add(F)
Pmut
t(A;B)
Add(F)
Pmutt(A;B)
Add(F)
Pmut
Rechute
Chimiorésistance +/-
Dup(V)
Kmut
Dup(V)
Kmut
Dup(V)
KmutDup(V)
Kmut
2nde LAL
[0,5-1,5%]Protocoles
t*pe BFM
Initiating oncogenic event
BCR-ABL
BCR-ABL
BCR-ABLBCR-ABL
Initiating
cell
Pre-leukemic cell
BCR-ABL
del(C)
IG/TCR; MFC
BCR-ABL
Xmut
BCR-ABL
Xmut
BCR-ABL
Xmut
Additional
alterations
Leukemia cells
BCR-ABL
XmutBCR-ABL
Xmut
Cooperative genetic lesions
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
MARQUEUR, MRD ET HISTOIRE NATURELLE DES RECHUTES
Toutes les cibles ne sont pas ph*sio-pathologiquement équivalentes
Initiating oncogenic event
BCR-ABL
BCR-ABL
BCR-ABLBCR-ABL
Initiating
cell
Pre-leukemic cell
BCR-ABL
del(C)
IG/TCR; MFC
BCR-ABL
Xmut
BCR-ABL
Xmut
BCR-ABL
Xmut
Cooperative genetic lesions
Additional
alterations
Leukemia cells
BCR-ABL
XmutBCR-ABL
Xmut
Evolution of a
pre-leukemic clone
BCR-ABL
CDKN2A
Pmut
BCR-ABL
CDKN2A
Pmut
BCR-ABL
CDKN2A
Pmut
BCR-ABL
CDKN2A
PmutBCR-ABL
CDKN2A
Pmut
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
Selection of a minor
resistant subclone
(52%)
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
BCR-ABL
Xmut
IKZF1BCR-ABL
Xmut
IKZF1
BCR-ABL
Xmut
IKZF1
MARQUEUR, MRD ET HISTOIRE NATURELLE DES RECHUTES
Thank you for your attention
UTILISATION LIMITEE DES TRANSCRITS DE FUSION
POUR SUIVRE LA MALADIE RESIDUELLE DANS LES LAL
MLL-t
CALM-AF10
TCR-HOXA
TLX1/HOX11
TLX3/HOX11L2
SIL-TAL1, L*L1, TAL2, +/- LMO1, LMO2
TCR-M*B
ETV6-RUNX1
Hyperdiploidy (25%)
MLL (10%)
iAMP21 (2%)BCR-ABL (3%)
E2A-PBX1 (5%)MYC (2%)
CRLF2 (6%)
Childhood B-lineage ALL
T-ALL
NB: utilisé pour LMC (BCR-ABL), LAM3 (PML-RARA)