Metabo Test INFAI

INFAI TR Necatibey Caddesi

Balıkçıoğluİşanı No:4/171 Sıhhiye Çankaya/ANKARA

Phone: 0312 230 49 74 Fax: 0312 230 49 75

e-mail: nmr@infai.com.tr

INFAI GmbH

Gottfried-Hagen-Str. 60-62 D-51105 Köln, Germany Phone: +49 221 880 44-3 Fax: +49 221 880 44-55 e-mail: mail@infai.com

1

Yenidoğanlarda metabolik hastalıklara yönelik NMR tabanlı idrar taraması

Tahminen, Türkiye’deki her 400 yenidoğandan biri konjenital metabolik hastalıklardan etkilenmektedir. Bu teşhis ve tedavi edilmemiş vakalar irreverzibl organ yetmezlikleri, sakatlık ya da ölüme varan sonuçlar doğurabilmektedir. Günümüzde, yenidoğanlar rutin olarak sadece 12 metabolik hastalık yönünden taramaktadırlar. Ancak, bilmekte olduğumuz metabolik hastalıkların sayısı çok daha fazladır. Şu an itibariyle, Tandem-MS (kütle spektrometrisi) ve GC (gaz kromatografisi)/MS metabolik hastalıkların teşhisinde en çok başvurulan diyagnostik metotlardır. Ancak, Tandem-MS tek seferde yalnızca bir ya da bir grup metabolitin araştırılmasına olanak tanımaktadır. Büyük moleküllerin analizi ek teknik problemler yaratmakta, durum maliyetlerin yükselmesiyle sonuçlanmaktadır. Örneklerin hazırlanması için harcanan süre de göz önüne alındığında bu metotlar tarama için uygun görülmemektedir; araştırma yalnızca şüpheli hastalığın bulunması durumunda uygulanabilirdir. GC-MS aynı zamanda, örnek değiştirme riskiyle türevlendirmeye (derivazitasyon) ihtiyaç durmaktadır.

Vücut sıvılarının manyetik rezonans spektroskopisi (NMR)

NMR metodu, 1952’de bu çalışmalarıyla Nobel Ödülü almış Felix Bloch ve Edward Purcell tarafından bulunmuştur. Müteakiben metot geliştirilmiş ve çeşitli alanlarda sıklıkla kullanılmıştır. Temel uygulama alanları, organik kimyada bilinmeyen moleküllerin yapısal analizleri, karakterizasyonları ve miktarlarının belirlenmesidir. Özellikle görüntüleme yönünden tıbbi uygulamaları 1991 yılında Nobel Ödülü’ne layık görülen Richard Ernst tarafından geliştirilmiştir. Geçtiğimiz on yılda, NMR spektroskopinin diğer medikal uygulamaları araştırılmış, vücut sıvıları (idrar, serum, serebrospinal sıvı) üzerine yapılan çalışmalarda potansiyel hastalıkların saptanabileceği görülmüştür. Konjenital metabolik hastalıkların teşhisinde, NMR spektroskopisi diğer metotların çok üzerinde avantajlara sahiptir. Vücut sıvılarının NMR spektroskopisi, noninvazif olması yönünden, bilinen ve bilinmeyen hastalıklarda metabolitlerin hedefe yönelik olan ya da

2

olmayan analizleri için gelecek vadeden alternatif bir yaklaşımdır. Vücut sıvılarının 1H-NMR spektroskopisi proton içeren bileşiklerin büyük çoğunluğunu gösterir ve bu nedenle metabolizma hakkında genel bir görünüm sunar. Kalıtsal metabolik hastalıkların teşhisinde, diğer tekniklerle karşılaştırıldığında bu büyük bir avantajdır. Vücut sıvılarının NMR spektroskopisi gerek bilinen gerekse henüz bilinmeyen doğumsal metabolizma bozukluklarının teşhisinde alternatif analitik bir yaklaşım olarak değerlendirilebilir.

İdrar NMR spektrumu

Vücut sıvısının 1H-NMR spektrumu, belirli bir metabolitteki hemen hemen tüm hidrojen atom çekirdeklerinin birer karakteristik “parmak izini” elde etmemizi sağlar. İdrarın NMR spektrumunda 1000’in üzerinde metabolit gözlenebilmektedir. Gözlenen rezonansın yoğunluğu örnekteki hidrojen atomunun sayısıyla orantılıdır. Bu şekilde, her metabolitin konsantrasyonu belirlenebilir. NMR spektroskopisi, hızlı ve uygun maliyetli tanı tarama yöntemi olarak, idrardaki tüm metabolitleri dakikalar içerisinde gerçekleştirilebilen tek bir ölçümle saptayabilir ve analiz edebilir. Tampon hazırlığının dışında, ölçüm için idrar örneklerinin ön işlemesine gerek bulunmamaktadır.

Şekil 1: İdrarın NMR spektrumu

3

Türkiye’de gerçekleştirilen klinik çalışma

INFAI ve Bruker BioSpin Türkiye'deki on klinik merkezle işbirliği içinde yürütülen geniş ve çok merkezli bir klinik çalışmada, sağlıklı yenidoğanlarda patolojik metabolitlerin gözlenip gözlenmediğinin anlaşılması ve bunların konsantrasyon aralıklarının belirlenmesi için 950 yenidoğan bebekten alınan idrar örnekleri toplanmış, Bruker ADVANCE III 500 MHz ve 600 MHz spektroskopi kullanılarak incelenmiştir. Burada, aynı zamanda standart model olarak adlandırılan yenidoğan taraması geliştirilmiştir. Şu anda, bu NMR metodu ile 600’ün üzerinde metabolit saptanabilmekte ve ölçülebilmektedir. Bir istatistik analiz yöntemi (PCA) normal ve anormal örneklerin otomatik ayrımının sağlanması için kullanılmaktadır. Göze çarpan örnekler, 2D NMR gibi daha kompleks NMR teknikleri ile ilave araştırmaya tabi tutulacaktır. Bu şekilde, sağlıklı ve hastalıklı yenidoğanların örnekleri ayrılacaktır.

İstatistik analiz

Metabolit konsantrasyonlarının istatistik analizi ve ölçümü bir 1D- ve hızlı 2D-J-çözümlü spektrum kombinasyonunu temel alacaktır. Burada, 2D spektrum, J-çözümlü 2D spektrumdan elde edilen dizi pozisyonu ve multiplet yapı gösteren metabolitlerin güvenli identifikasyonu ve dekonvolüsyon tabanlı ölçümünü destekler. İdrar örneklerinin spektrumlarının karşılaştırılması için, şüpheli idrar örneklerinin identifikasyonu, temel bileşen analizi (PCA) kullanılarak yapılmaktadır.

Şekil 2: PCA kullanılarak gerçekleştirilmiş, hedefe yönelik olmayan analiz örneği Şüpheli örneklerin identifikasyonunda Türkiye’de gerçekleştirilen klinik çalışmada toplanan 950 spektrumun istatistik analizleri kullanılmıştır. Şekil 2’de bu tür analizlere bir örnek verilmiştir. Temel bileşen analizi (PCA) her bir örneğin bireysel bir nokta olarak gösterildiği bir reprezantasyon üretmektedir. Şüpheli örnekler aykırı değerliklerdeki noktalar olarak belirgin hale gelmektedir. Şekilde, farklı renklerde gösterilen üç tip aykırı örnek görülmektedir. Spektral analiz farklı parmak izi metabolitlerin yüksek konsantrasyonlarını göstermektedir. Deneklerin ikisinin sarılık problemleri

4

bulunduğu teyit edilmiştir; bunlardan biri yoğun bakım ünitesinde tedavi edilmek durumunda kalmıştır. On denekte, alifatik bölgede makromoleküllerin yüksek konsantrasyonu gözlenmiştir. Harici bir laboratuvar, belirgin nefropati durumunu gösteren albümini tespit etmiştir. Çeşitli deneklerde 4-hidroksifenilasetik asit yüksek konsantrasyonlarda gözlenmiş ancak klinik veride hiçbir anormal bulgu rapor edilmemiştir. Ancak, veritabanındaki hastalık spesifik metabolitlerin tüm geçerli NMR belirteçleri metabolik hastalığı olan bireylerden elde edilmektedir. Bir tarama testi hizmeti için normal yenidoğanlarla gerçekleştirilecek karşılaştırma metodun doğru kalibrasyonu için oldukça önemlidir. Bu, özellikle metabolizmanın immatür yapı ve yaşlı hastalardakinden daha yüksek değişkenlik gösterdiği yenidoğanlarda uygulamayı etkiler. Bazı hastalık spesifik metabolitler yenidoğanlarda bir ölçüde halen fizyolojik olarak bulunabilirler. Kapsamlı istatistik analiz ve klasifikasyon gerek sağlıklı kontrol gruplarından gerekse metabolik hastalıklı değişik hasta popülasyonlarından idrar örneklerinin toplanmasını gerektirir. İstatistik modellemenin hedefi, probleme ilişkin klinik bulgu göstermeyen yenidoğanların idrarlarında spesifik metabolitlerin varyasyon (konsantrasyon ve kimyasal değişim) aralığının araştırılmasıdır. Bu, sağlıklı yenidoğanlarla karşılaştırılarak, spesifik metabolitlerin patolojik eşik değerlerinin identifikasyonu ve Türk bebeklerine yönelik bir normal model oluşturmak için gereklidir. INFAI ve Bruker BioSpin Ltd.'de geliştirilen ileri istatistik modüller, hedefe yönelik olmayan taramalar için normal bir model kullanmaktadırlar ve Türkiye'deki bebeklerin bilinmeyen hastalıklarının tespitine olarak sağlamaktadırlar.

5

Miktar tayini

Uygun eksperimental koşullar kullanıldığında, 1H-NMR spektrumundaki bir rezonansın pik bölgesi ya da sinyal yoğunluğu, sinyale katkıda bulunan protonların sayısıyla doğru orantılıdır. Bu nedenle, dupletin pik alanı kuartetin pik alanından üç kat daha büyüktür. Pik alan, sinyale katkıda bulunan protonların sayısıyla doğru orantılı olduğu gibi ilgili molekülün konsantrasyonuyla da doğru orantılıdır. Bu nedenle, NMR spektroskopinin metabolit ölçümü için kullanımı mümkündür. Tekniğin duyarlılığı çoğu metabolit için düşük mikromolar aralıktadır. Metabolitlerin NMR spektrumundaki identifikasyonundan sonra, ilgilenilen metabolitlerden seçilen bazı sinyallerin basit entegrasyonu, konsantrasyonunun kantitatif bilgilerini tamamen açığa çıkarır. Aşağıda Şekil 3'te bir örnek verilmektedir. İki katının patolojik olarak tanımlandığı (631 mmol/mol), 4-hidroksifenilasetik asit (246 mmol/mol kreatinin) ve D-galaktozun (1274 mmol/mol) konsantrasyonları.

Şekil 3: 4-OH-fenilasetik asit ve D-galaktozun her ikisinin patolojik konsantrasyonlarda bulunduğu bir denekte gösterilen ölçüm miktarları

6

Hastalıklar ve idrar spektrumundaki metabolitler

INFAI, vücut sıvılarının NMR tabanlı araştırılmasında 20 yıllık deneyime sahiptir. Yıllar boyunca, birçok hastalık ve izole edilmiş metabolitin bilgisini içeren kapsamlı bir kütüphane oluşmuştur. Aşağıda, teşhis edilmiş hastalıkları bulunan çocukların bazı idrar spektrum örnekleri sunulmaktadır. Daha fazla bilgi için, insan genleri ve genetik hastalıklarının online katalogu niteliğindeki Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) hastalık numaraları verilmektedir (omim.org). OMIM insan genleri, genetik bozukluklar ve özelliklerini içeren sürekli güncellenmekte olan bir katalogdur. Özel olarak genetik varyasyon ve fenotipik ekspresyon arasındaki moleküler ilişki üzerinde odaklanmaktadır. Bu özellikleriyle İnsan Genom Projesi'ne eşlik eden fenotipik karşılığı olarak kabul edilmektedir. INFAI kendi web sitesinde (www.infai.com) hastalıklarla ilişkili metabolit aramaları için yardımcı bir araştırma aracı sunmaktadır.

- Metabolik hastalıklardan örnek NMR spektrumlar

Herediter üre döngüsü bozukluğu atıkların vücuttan idrar yoluyla atımında problemlerle kendini gösteren kalıtsal bir durumdur. Üre siklusu vücuttan atık maddelerin (amonyak) uzaklaştırıldığı bir prosestir. Protein aldığınızda, vücut bunları aminoasitlerine parçalayacaktır. Amonyak artık aminoasitlerden üretilmektedir ve vücuttan uzaklaştırılması gerekmektedir. Karaciğer, amonyağı idrarla vücuttan uzaklaştırılan üreye dönüştürecek çeşitli kimyasallar (enzimler) üretir. Eğer bu işlem bozulursa, amonyak düzeyleri artmaya başlar. Bazı kalıtsal durumlar bu atık boşaltım prosesinde görülen problemlere neden olabilir. Üre döngüsü bozukluğu olanların, vücutlarındaki amonyağın yıkımı için gereken enzimin sentezlenmesini sağlayan bir genleri eksiktir. Bu hastalıklar şunlardır:

- Arjininosüksinik asidüri - Arjinaz eksikliği - Karbamoil fosfat sentetaz (CPS) eksikliği - Sitrülinemi - N-Asetil glutamat sentetaz eksikliği (NAGS) - Ornitin transkarbamilaz eksikliği (OTC)

Bir grup olarak, bu bozukluklar yenidoğanlarda 30 binde bir meydana gelir. Ornitin transkarbamilaz eksikliği bu bozuklular arasında en yaygın olanıdır.

7

- Sitrülinemi

OMIM #215700 Sitrülinemi amonyak ve diğer toksik maddelerin kanda birikimine neden olan kalıtsal bir bozukluktur. Sitrülineminin iki formu tanımlanmıştır; bu formlar farklı belirtiler ve semptomlar göstermekle beraber farklı genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanmaktadırlar. Tip I sitrülinemi bu bozukluğun en yaygın formudur, genellikle yaşamın ilk birkaç günü içerisinde belli olur. Tip II sitrülinemi esas olarak sinir sistemini etkiler; bu etkilenim konfüzyon, huzursuzluk, hafıza kaybı, anormal davranışlar, nöbet ve komaya varabilen sonuçlar doğurur. Bazı durumlarda, hastalığın semptomları erişkinlikte görülebilir (yetişkin başlangıçlı). Yüksek düzeyde sitrülin ve N-asetil sitrülin idrar spektrumunda gözlenebilmektedir.

8

- Ornitin transkarbamilaz eksikliği

OMIM #311250 Ornitin transkarbamilaz eksikliği kanda amonyak birikimine neden olan kalıtsal bir bozukluktur. Proteinlerin vücuttaki yıkımı sırasında oluşan amonyak, düzeyi çok arttığı takdirde, zehirleyicidir. Özellikle sinir sistemi yüksek miktarlardaki amonyağın etkilerine oldukça duyarlıdır. Ornitin transkarbamilaz eksikliği genellikle yaşamın ilk birkaç günü içerisinde belli olur. Bu bozukluğa sahip kimi bebekler nöbet ya da anormal vücut hareketleri gösterebilir ya da komaya gidebilirler. Ornitin transkarbamilaz eksikliğinin yaklaşık 80 binde bir kişide meydana geldiğine inanılmaktadır. İdrarda yüksek orotik asit ve urasil atılımı gözlenmektedir.

9

- Canavan hastalığı

OMIM #271900 Canavan hastalığı beyindeki sinir hücrelerinde ilerleyici hasara neden olan kalıtsal bir hastalıktır. Aspartik asidin yıkımı ve kullanımını (metabolizması) etkiler. Aspartoasilaz enziminin eksikliği beyinde N-asetilaspartik asit dediğimiz maddenin birikimine neden olur. Şiddetli canavan hastalığının insidansının yaklaşık 100 bin doğumda bir olduğu tahmin edilmektedir. N-asetilaspartik asitin yüksek konsantrasyonları idrar, serum ve BOS'da gözlenmektedir.

10

- D-Gliserik asidüri

OMIM #220120 D-gliserik asidüri, D-gliserik asit atılımı ile karakterize bir metabolizma bozukluğudur. Birçok hastada tanımlanmıştır. Klinik bulgular ilerleyici nörolojik bozukluk, hipotoni, nöbetler, gelişim yetmezliği ve metabolik asidozu içerir. Bazı hastalarda organik asidemiye ikincil olarak hiperglisinemi vardır. Ancak, bildirilen hastaların bazıları asemptomatik olmaktadır. D-gliserik asidüriye D-gliserat kinaz eksikliği neden olur. GLYCTK geni 3 p 21 bölgesinde haritalanmıştır. İdrar ve serumda gliserik asidin yüksek konsantrasyonları gözlenmiştir.

11

- Glutarik asidüri tip I

OMIM #231670 Glutarik asidüri tip I vücudun belli proteinleri düzgün olarak işleyemediği kalıtsal bir hastalıktır. Bu hastalığa sahip bireylerde, proteinlerin yapı taşları olan lizin, hidroksi lizin ve triptofan aminoasitlerinin yıkımına yardımcı enzim düzeylerinde yetersizlik mevcuttur. Tip I glutarik asideminin şiddeti büyük farklılıklar gösterir; bazı bireyler sadece hafif miktarda etkilenirken diğerleri şiddetli problemlerden muzdarip olabilmektedirler. Çoğu vakada, tip I glutarik asidüri belirtileri bebeklik ya da erken çocukluk döneminde ortaya çıkar. Tip I glutarik asidüri yaklaşık 30 bin ila 40 bin kişide bir görülmektedir. Yüksek konsantrasyonlarda glutarik asit tüm vücut sıvılarında gözlenmiştir.

12

- İzovalerik asidüri

OMIM #243500 İzovalerik asidemi, vücudun belli proteinleri düzgün olarak işleyemediği nadir bir hastalıktır. Organik asit adıyla bilinen belirli asitlerin anormal birikimine neden olan bir durum tanımı altında, bir organik asit bozukluğu olarak sınıflandırılır. Kanda (organik asidemi), idrarda (organik asidüri) ve dokularda bulunan anormal düzeydeki organik asit, toksik olabilmekte ve ciddi sağlık problemlerine sebebiyet verebilmektedir. Avrupa'nın genel popülasyonunda izovalerik asideminin 100 binde bir kişiyi etkilediği tahmin edilmektedir. İdrarda yüksek konsantrasyonlarda izovaleril glisin ve 3-hidroksi izovalerik asit gözlenebilir.

13

- Metilmalonik asidüri

OMIM #251000 Metilmalonik asidemi vücudun belirli protein ve yağları (lipidler) doğru biçimde işleyemediği kalıtsal bir hastalıktır. Genellikle erken bebeklik döneminde görülen metilmalonik asideminin etkileri hafiften, yaşamı tehdit edecek düzeylere kadar değişir. Etkilenen bebeklerde kusma, dehidrasyon, zayıf kas tonusu (hipotoni), gelişimsel gecikme, aşırı yorgunluk (letarji), genişlemiş karaciğer (hepatomegali), kilo almada başarısızlık ve beklenen oranlarda büyümenin sağlanamaması (gelişim geriliği) ortaya çıkabilir. Uzun vadeli komplikasyonlar beslenme sorunları, entelektüel engellilik hali, kronik böbrek hastalığı ve pankreas enflamasyonunu (pankreatit) içerebilir. Bu hastalık için tahmini görülme sıklığı 50 bin ila 100 binde birdir.

14

- Fenilketonüri

OMIM #261600 Fenilketonüri (PKU), vücudun fenilalanin (Phe) adı verilen bir protein parçasını işleyemediği genetik bir bozukluktur. Phe neredeyse tüm gıdalarda bulunmaktadır. Eğer Phe düzeyleri çok yükselirse, beyne zarar verebilmekte ve şiddetli mental retardasyon ortaya çıkabilmektedir. ABD hastanelerinde doğan tüm bebeklerin PKU'ya yönelik tarama testinden geçmesi gerekmektedir. Bu, erken teşhisi ve problemin erken tedavisini kolaylaştırır. Fenilketonüri yaklaşık 7 bin ila 10 bin kişide bir görülmektedir. İdrarda yüksek konsantrasyonlarda fenilalanin gözlenebilir.

15

- Sarkozinemi

OMIM #268900 Sarkozinemi plazmada artmış konsantrasyonda sarkozin (N-metil glisin) varlığı ve idrarda artan sarkozin atılımı ile karakterize bir fenotiptir. Sarkozinemi, sarkozin dehidrojenaz tarafından katalizlenen sarkozin-glisin dönüşümündeki bir defekt nedeniyle ortaya çıkar. Sarkozin dehidrojenaz eksikliği, apoenzimde oluşan bir genetik değişiklik, gerekli elektron transfer flavoproteininin disfonksiyonu ya da ciddi bir folik asit eksikliği neticesinde meydana gelebilir. Sarkozineminin prevalansının 1:28.000 ila 1:350.000 dolaylarında olduğu tahmin edilmektedir.

16

- Tip I tirozinemi

OMIM #276700 Tirozinemi, bir protein yapıtaşı aminoasit olan tirozinin kandaki seviyesinin yüksekliğiyle karakterize genetik bir bozukluktur. Tirozinemi, tirozinin çok aşamalı yıkım prosesi için gerekli olan enzimlerden birinin eksikliği nedeniyle ortaya çıkar. Bozukluğun en şiddetli formu olan tip I tirozinemi fumarilasetoasetat hidrolaz enziminin eksikliği nedeniyle oluşur. Tip I tirozinemi, dünya çapında her 100 bin insandan birini etkilemektedir. İdrar ve serumda yüksek konsantrasyonlarda tirozin gözlenebilmektedir. Ayrıca, betain ve metionin konsantrasyonları da yükselmiştir.

17

2-OH-hidroksiglutarik asidürinin D ve L varyantı

D ve L-2-hidroksiglutarik asidüriler, idrar (Şekil 4), plazma ve serebrospinal sıvıda 2-hidroksi glutarik asit seviyesindeki artışla karakterize 2-hidroksiglutarik asidürinin nadir, klinik değişkenlik gösteren nörolojik formlarıdır. 2-hidroksiglutarik asidin farklı enantiyomerik formları farklı hastalıklarla ilişkilidir. Daha az yaygın olan D-2-hidroksiglutarik asidüri (D-2-HGA) D-enantiyomeri ile bağlantılı iken, L-2-hidroksiglutarik asidüri (L-2-HGA), 2-hidroksiglutarik asidin L-enantiyomeri ile ilişkilidir. Bu bozukluğun prevalansı bilinmemektedir; dünya genelinde bugüne kadar yalnızca 80 vaka rapor edilmiştir.

Şekil 4: 2-hidroksiglutarik asidürili idrar NMR spektrumu L ve D varyantları arasındaki ayrımın, sıradan analitik yöntemler (Tandem-MS, GC-MS) kullanılarak yapılması mümkün değildir. Kesin tanı için, genellikle etkilenen genlerin birer genetik analizi gerekmektedir. Etkilenen genler L2HGDH (L-2-HGA'da) ya da D2HGDH veya IDH2 genleridir (D-2-HGA'da). Bir lantanit değişim reaktifi (Şekil 5) idrarın NMR spektrumunda L ve D-2-hidroglutarik asitin arasındaki ayrımın yapılmasına olanak sağlar. Kimyasal değişim reaktifi olarak bu samaryum kompleksinin eklenmesiyle, L ve D-2-

18

hidroksiglutarik asidin NMR rezonansları farklı yönlere (Şekil 6'de gösterilen) kaydırılmış olur.

Bu şekilde, L ve D formları açıkça ayırt edilebilir.

Şekil 5: Lantanit değişim reaktifi

Bu metoda, Hacettepe Üniversitesi, Ankara, Türkiye öğretim üyelerinden Prof. Dr. Turgay Coşkun ve Prof. Dr. Ali Dursun’un 1, 5 ve 28 yaşlarındaki üç hastadan aldıkları idrar örnekleri üzerinde başvurulmuştur. Her üç vakada da, L-2-HGA teşhisini doğrulayan L-enantiyomer bulunmuştur.

Şekil 6: L ve D-hidroksiglutarik asidin farklı kimyasal değişimlerde ayrımı

19

Yenidoğan tarama sorunları

Yenidoğan taramalarında hatalı pozitif ve hatalı negatif sonuçlardan kaçınılmalıdır. Tespit edilemeyen bilinmeyen metabolitlerde ek araştırmalara ve gen dizi analizi ya da enzim analizleri gibi farklı tekniklere ihtiyaç duyulmaktadır. Örneğin, tip 2 tirozinemide, idrarda 4-OH-fenilasetik asit, 4-OH-fenillaktik asit, 4-OH-fenilpürivik asit ve 5-aminolevülinik asit görülür ve plazmada tirozin aminoasidine rastlanır. İlk üç aminoasit idrarda saptanabilirken 5-aminolevülinik asit saptanamaz. Hawkinsinüride, yine ilk üç metabolit görülmektedir. Ek olarak, 5 okzoprolin ve daha sonra 4-hidroksisikloheksil asetat varlığı gözlenebilir. Sonuç olarak bu iki hastalığı ayırt etmek zordur. Bu gibi durumlarda, daha ileri tetkikler gereklidir. Şekil 7'de 600'ün üzerinde metabolitin spektrum bilgisine sahip Bruker'in BBIOREFCODE veritabanı ile idrar spektrumunun manüel olarak nasıl eşleştirildiği gösterilmektedir.

Şekil 7: İdrardaki tanısal metabolitlerin veritabanı spektrumuyla eşleştirilmesi

20

Laboratuvarlar arası tekrarlanabilirlik

Tüm örnekler Köln'deki INFAI laboratuvarı ve Karlshure'deki Bruker laboratuvarlarında iki kez ölçüme tabi tutulmuştur. Şekil 8'da, başvurulan PCA analizinin sonuçları birleştirilmiş veri kümesinde gösterilmiştir (her iki laboratuvar; Lab-1: Sarı, Lab-2: Mavi). Her iki örnek de mavi bir çizgi ile bağlanmış iki belirteç ile temsil edilmektedir. Eklenen küçük çerçeve, siyah dikdörtgen alanın içinin yakınlaşmış görüntüsünü vermektedir. Her iki laboratuvarda bağımsız olarak ölçülen her iki ilk örneğin alikotları sürekli birbirine çok yakın noktalarla temsil edilmektedir. Bu, mükemmel tekrarlanabilirliğin kanıtı niteliğindedir.

Şekil 8: İki farklı laboratuvarda ölçülen ve incelenen NMR spektrumlarının PCA analizi

21

Kaynaklar

1. Aksu F, Aygen S, Vigabatrintherapie bei einem 7jährigen Jungen mit Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Mangel, Monatsschrift Kinder-heilkunde 144 (1996) 797.

2. Aygen S et al., Hochauflösende 1H NMR Spektroskopie von Körper-flüssigkeiten (Serum, Urin, Liquor) zur Diagnose und Therapiekontrolle bestimmter angeborener Stoffwechselerkrankungen im Kindesalter, Aktuelle Neuropäd. (1994) 273.

3. Yamaguchi S, Koda N, Eto Y, Aoki K, Quick screening and diagnosis of organic acidemia by NMR urinalysis, J.Pediatr. 106 (1985) 620.

4. Lindon JC, Nicholson JK, Everett JR, NMR spectroscopy of biofluids, Ann. Rep. NMR Spectr. 38 (1999) 1.

5. Wevers RA, Engelke UF, Moolenaar SH, Bräutigam C, de Jong JG, Duran R, de Abreu RA, van Gennip AH, 1H-NMR spectroscopy of body fluids: inborn errors of purine and pyrimidine metabolism, Clin. Chem. 45 (1999) 539.

6. Moolenaar SH, Engelke UF, Hoenderop SM, Sewell AC, Wagner L, Wevers RA, Handbook of 1H NMR spectroscopy in inborn errors of metabolism, SPS 2002.

7. Holmes E, Foxall PJD, Spraul M, Farrant RD, Nicholson JK, Lindon JC, 750 MHz 1H NMR spectroscopy characterisation of the complex metablic pattern of urine..., J. Pharm. Biomed. Analy. 15 (1997) 1647.

8. Engelke UF, Sass JO, Van Coster RN, Gerlo E, Olbrich H, Krywawych S, Calvin J, Hart C, Omran H, Wevers RA, NMR spectroscopy of amino-acylase 1 deficiency, a novel inborn error of metabolism, NMR Biomed. 21 (2008) 138.

9. Assfalg M, Bertini I, Colangiuli D, Luchinat C, Schäfer H, Schütz B and Spraul M., Evidence of different metabolic phenotypes in humans, PNAS 105 (2008) 1420.

10. Blau N, Duran M, Blaskovics ME, Gibson KM, Laboratory diagnosis of metabolic diseases, Springer (2005) 363.

11. Aygen S. et al., Urine based newborn screening study applying high-resolution NMR spectroscopy in Turkey, JIMD 34 (Suppl. 3) (2011) S256.

12. Gryff-Keller A, Kraska-Dziadecka A, Kubica D, Detection of acylglycines in urine by 1H and 13C NMR for the diagnosis of inborn metabolic diseases, Acta Biochim. Pol. 59 (2012) 613.

13.Topcu M, Coskun T, et al., L-2-Hydroxyglutaric aciduria: a report of 29 patients, Turkish J. Pediatr. 47 (2005) 1.

22

Sizlere sunduklarımız:

- Ortak metabolitler için "normal aralıklar" ve miktar saptaması - Hastalık belirteci olarak kullanılabilecek patolojik metabolitlerin tayini - Yenidoğan sağlığı için kapsamlı bir tarama testi entegrasyonu - Tek seferde hedefe yönelik ve hedefe yönelik olmayan tarama - Farklı pH değerlerinde, bir ve iki boyutlu NMR spektrumlarında karakterize

600’ün üzerinde metabolitten oluşan ve giderek büyüyen bir veritabanı idamesi

- Bu metabolitlerin istatistiksel analizi ve miktarlarının belirlenmesi, özel bir popülasyonda normal bir model gelişimine ve aynı zamanda, yenidoğan sağlığında genel değerlendirme yapılmasına olanak tanımaktadır.

- Birlikte çalışılan laboratuvarlar ile ek analizler (gen dizi ve enzim analizleri, Tandem-MS, GC-MS, LC-MS) sunulacaktır.

Kalite yönetimi

INFAI, ulusal ve uluslararası regülasyonlara uygun olarak, ISO 9001 temelli bir entegre kalite yönetim sistemi oluşturmuştur. Bu çerçevede tanımlanan yüksek kalite standartları, güvenilir ve yüksek kalitede farmasötik ürünlerin üretimini garanti altına almaktadır. Müşteri memnuniyeti tüm faaliyetlerimizin merkezindedir. Kalite yönetim sistemimizin sürekli iyileştirilmesi bizlere değişen pazar koşullarına hızla uyum sağlama şansı kazandırmaktadır. INFAI Biyomedikal Analiz ve NMR Görüntüleme Enstitüsü Ltd. www.infai.com, nmr@infai.com.tr