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Metabolismus und Bioverfügbarkeit der
Lebensmittelkontaminante Acrylamid in
Ratte und Mensch
Dem Fachbereich Chemie der Technischen Universität Kaiserslautern
zur Verleihung des akademischen Grades
„Doktor der Naturwissenschaften“
genehmigte Dissertation
(D 386)
vorgelegt von
Diplom-Lebensmittelchemiker
Franz Berger
Kaiserslautern, 2010
Für Stefanie
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von April 2006 bis Juni 2009 im
Fachbereich Chemie, Fachrichtung Lebensmittelchemie und Toxikologie der
Technischen Universität Kaiserslautern.
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 29.04.2010
Prüfungskommission
Vorsitzender: Prof. Dr. S. Ernst
1. Berichterstatter: Prof. Dr. G. Eisenbrand
2. Berichterstatter: Prof. Dr. Dr. D. Schrenk
Ich danke Herrn Prof. Dr. Gerhard Eisenbrand und Herrn Dr. Matthias Baum für die
Überlassung des Themas sowie die stete Diskussionsbereitschaft und Unterstützung
während der Promotionszeit.
Inhaltsverzeichnis
- I -
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ....................................................................................................... 1
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN ...................................................................... 3
2.1 Acrylamid ................................................................................................................................... 3 2.1.1 Allgemeine Grundlagen ........................................................................................................... 3 2.1.2 Expositionsquellen................................................................................................................... 3 2.1.3 Bildung von Acrylamid in Lebensmitteln.................................................................................. 4 2.1.4 Expositionsabschätzung.......................................................................................................... 6 2.1.5 Reduzierung der Acrylamid-Gehalte in Lebensmitteln ............................................................ 6 2.1.6 Toxikokinetik von Acrylamid .................................................................................................... 8
2.1.6.1 Aufnahme ........................................................................................................................ 8 2.1.6.2 Verteilung......................................................................................................................... 9 2.1.6.3 Metabolismus................................................................................................................. 10 2.1.6.4 Ausscheidung ................................................................................................................ 14
2.1.7 Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem endständigen Valin im Hämoglobin ......... 15 2.1.8 Toxikodynamik von Acrylamid ............................................................................................... 17
2.1.8.1 Neurotoxische Wirkungen ............................................................................................. 17 2.1.8.2 Entwicklungs- und reproduktionstoxische Wirkungen................................................... 17 2.1.8.3 Genotoxische und mutagene Wirkungen ...................................................................... 18
2.1.8.3.1 Genotoxizität und Mutagenität in vitro ...................................................................... 18 2.1.8.3.2 Genotoxizität in vivo ................................................................................................. 18
2.1.8.4 Kanzerogenität............................................................................................................... 19
2.2 Acrolein .................................................................................................................................... 21 2.2.1 Allgemeine Grundlagen ......................................................................................................... 21 2.2.2 Expositionsquellen................................................................................................................. 21 2.2.3 Toxikokinetik von Acrolein ..................................................................................................... 26 2.2.4 Toxikodynamik von Acrolein.................................................................................................. 28
2.2.4.1 Akute, subchronische und chronische Toxizität ............................................................ 28 2.2.4.2 Genotoxizität und Mutagenität....................................................................................... 28
2.3 GC-MS und Prinzip der chemischen Ionisierung (CI) .......................................................... 29
2.4 HPLC-ESI-MS/MS und Prinzip der Elektrospray-Ionisierung (ESI)..................................... 30
2.5 Triple-Quadrupol-Tandemmassenspektrometer .................................................................. 31
3 PROBLEMSTELLUNG...................................................................................... 34
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION ................................................................... 37
4.1 Einfluss der Lebensmittelmatrix auf die Bioverfügbarkeit von Acrylamid in der Ratte... 37 4.1.1 Fütterung von Pommes frites (PFG: geschnitten; PFR: rekonstituiert) ................................. 39
4.1.1.1 Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobinaddukte .......................................................... 39 4.1.1.2 Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren im 24-Stunden-Sammelurin nach Fütterung von Pommes frites ........................................................................................................ 44 4.1.1.3 Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid im 24-Stunden-Sammelurin nach Verabreichung von Acrylamid über Pommes frites (PFG, PFR) bzw. Trinkwasser ...................... 48 4.1.1.4 Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid in Rattenserum nach Verabreichung von Acrylamid über Pommes frites (PFG) bzw. Trinkwasser............................................................... 50
4.1.2 Fütterung von Brotkruste (BK)............................................................................................... 54 4.1.2.1 Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin-Addukte......................................................... 54 4.1.2.2 Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren im 24-Stunden-Sammelurin nach Fütterung von Brotkruste (BK)....................................................................................................... 56
Inhaltsverzeichnis
- II -
4.1.2.3 Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid im 24-Stunden-Sammelurin nach Verabreichung von Acrylamid über Brotkruste (BK) bzw. Trinkwasser......................................... 59
4.1.3 Verabreichung von Lebkuchen (LK) ...................................................................................... 61 4.1.3.1 Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin-Addukte nach Verabreichung von Lebkuchen (LK) ....................................................................................................................................... 61 4.1.3.2 Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren im 24-Stunden-Sammelurin nach Fütterung von Lebkuchen (LK)...................................................................................................... 62 4.1.3.3 Ausscheidung von Acrylamid und Glycidamid im 24-Stunden-Sammelurin nach Verabreichung von Lebkuchen (LK).............................................................................................. 63
4.2 Verabreichung der kumulativen Dosis aus den Fütterungsversuchen (450 bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG) bzw. 10 mg Acrylamid/kg KG als Einzeldosis über Trinkwasser (Schlundsonde) ................................................................................................................................... 65
4.2.1 Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin-Addukte................................................................. 65 4.2.2 Ausscheidung von AAMA, GAMA, Acrylamid und Glycidamid im 24-Stunden-Sammelurin 67
4.3 Einfluss des Narkotisierungsmittels Isofluran auf den Metabolismus von Acrylamid .... 69
4.4 Bestimmung des Acrolein-Metaboliten HPMA im Rahmen der Rattenfütterungsstudie . 71
4.5 Bestimmung des Acrolein-Metaboliten HPMA nach Verabreichung von 0,05-10 mg Acrylamid/kg KG an Ratten..................................................................................................... 74
4.6 Zusammenfassende Diskussion der Ergebnisse aus den Tierversuchen ........................ 76
4.7 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut der Allgemeinbevölkerung mittels GC-MS .............................................................................................. 85
4.8 Bestimmung der Acrylamid-Mercaptursäuren im Urin von Probanden aus der Allgemeinbevölkerung........................................................................................................................ 87
4.9 Bestimmung des Acrolein-Metaboliten HPMA in Urinproben der Allgemeinbevölkerung . ................................................................................................................................................... 89
4.10 Etablierung einer HPLC-MS/MS Methode zur Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut der Allgemeinbevölkerung ..................................................... 91
4.11 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem N-terminalen Valin im Rahmen der humanen Verzehrsstudie „Bedeutung der CYP450 2E1-Aktivität für die Toxikokinetik von Acrylamid beim Menschen“ .................................................... 95
4.11.1 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid vor und 24 Stunden nach Acrylamid-Aufnahme mittels GC-MS........................................................................................ 96 4.11.2 Kinetik der Acrylamid-Hämoglobin-Adduktbildung in vivo ................................................. 99
5 ZUSAMMENFASSUNG....................................................................................103
6 METHODEN .....................................................................................................108
6.1 Fütterungsstudie an der Ratte ............................................................................................. 108 6.1.1 Spezifikation der Acrylamid-haltigen Lebensmittel.............................................................. 108 6.1.2 Konditionierung der Tiere .................................................................................................... 111 6.1.3 Behandlung der Tiere in der Hauptstudie............................................................................ 112 6.1.4 Kumulative Dosis (450 bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG) und 10 mg Acrylamid/kg KG......... 113 6.1.5 Fütterungsversuch zur Bestimmung der Resorptionskinetik von Acrylamid und Glycidamid ... ............................................................................................................................................. 114 6.1.6 Einfluss von Isofluran auf den Metabolismus von Acrylamid .............................................. 114
6.2 Bestimmung von Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin Addukten im Rahmen der humanen Verzehrsstudie „Bedeutung der CYP450 2E1-Aktivität für die Toxikokinetik von Acrylamid beim Menschen“ ............................................................................................................. 115
Inhaltsverzeichnis
- III -
6.3 Isolierung und Aufreinigung von Hämoglobin aus Human- und Rattenvollblut ............ 117
6.4 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid mittels GC-MS118 6.4.1 Hämoglobin-Derivatisierung und Flüssig-Flüssig-Extraktion der PFPTHs.......................... 118 6.4.2 GC-MS................................................................................................................................. 119
6.5 HPLC-MS/MS.......................................................................................................................... 120 6.5.1 Allgemeines ......................................................................................................................... 120
6.5.1.1 Tuning und Kalibrierung .............................................................................................. 120 6.5.1.2 Optimierung der substanz- und quellenspezifischen Parameter................................. 120 6.5.1.3 Quantifizierung der Analyte mittels isotopenmarkierter interner Standards................ 122 6.5.1.4 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen......................................................................... 122
6.5.2 Bestimmung der Hämoglobinaddukte von Acrylamid und Glycidamid mittels HPLC-ESI-MS/MS ............................................................................................................................................. 123
6.5.2.1 Massenspektrometrische Untersuchungen (MS/MS).................................................. 123 6.5.2.2 Chromatographie der PFPTHs.................................................................................... 126 6.5.2.3 Hämoglobin-Derivatisierung und Festphasenextraktion (SPE)................................... 127 6.5.2.4 Linearität/Kalibriergerade PFPTHs.............................................................................. 127 6.5.2.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen......................................................................... 127 6.5.2.6 Wiederfindung und Identifizierung von Matrixeffekten ................................................ 128
6.5.3 Bestimmung der Mercaptursäuren von Acrylamid und Glycidamid .................................... 129 6.5.3.1 Massenspektrometrische Untersuchungen (MS/MS).................................................. 129 6.5.3.2 Chromatographie der Mercaptursäuren ...................................................................... 133 6.5.3.3 Aufreinigung und Aufkonzentrierung der Mercaptursäuren mittels Festphasenextraktion ..................................................................................................................................... 133 6.5.3.4 Linearität/Kalibriergeraden .......................................................................................... 134 6.5.3.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen API 3200 ......................................................... 134 6.5.3.6 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen API 2000 ......................................................... 134 6.5.3.7 Wiederfindung der SPE-Methode................................................................................ 135 6.5.3.8 Lauf-zu-Lauf- und Tag-zu-Tag-Variabilität .................................................................. 135
6.5.4 Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid ....................................................................... 136 6.5.4.1 Massenspektrometrische Untersuchungen (MS/MS).................................................. 136 6.5.4.2 Chromatographie von Acrylamid und Glycidamid ....................................................... 139 6.5.4.3 Isolierung von Acrylamid und Glycidamid aus Rattenurin........................................... 140 6.5.4.4 Wiederfindung von Acrylamid und Glycidamid............................................................ 140 6.5.4.5 Isolierung von Acrylamid und Glycidamid aus Rattenserum....................................... 140 6.5.4.6 Wiederfindung von Acrylamid und Glycidamid in Serumproben ................................. 141 6.5.4.7 Nachweisgrenze von Glycidamid in Rattenserum....................................................... 141 6.5.4.8 Bestimmung von Acrylamid in der Standarddiät und im Lebkuchen........................... 141 6.5.4.9 Linearität/ Kalibriergeraden ......................................................................................... 142 6.5.4.10 Nachweis- und Bestimmungsgrenze....................................................................... 142
6.5.5 Bestimmung von HPMA (Hydroxypropyl-Mercaptursäure) ................................................. 143 6.5.5.1 Massenspektrometrische Untersuchungen (MS/MS).................................................. 143 6.5.5.2 Chromatographische Bedingungen............................................................................. 146 6.5.5.3 Isolierung von HPMA aus Urin .................................................................................... 147 6.5.5.4 Linearität/ Kalibriergerade ........................................................................................... 147 6.5.5.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenze HPMA ............................................................... 147 6.5.5.6 Wiederfindung der Festphasenextraktion sowie Tag-zu-Tag- und Lauf-zu-Lauf-Variabilität .................................................................................................................................... 147
6.6 Geräte ..................................................................................................................................... 148
6.7 Chemikalien............................................................................................................................ 149
6.8 Verbrauchsmaterialien.......................................................................................................... 151
7 LITERATUR......................................................................................................152
Inhaltsverzeichnis
- IV -
8 ANHANG ..........................................................................................................164
8.1 Regressionsgeraden der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen ..................................... 164 8.1.1 AAValPFPTH....................................................................................................................... 164 8.1.2 GAValPFPTH....................................................................................................................... 164 8.1.3 AAMA (API 2000) ................................................................................................................ 165 8.1.4 GAMA (API 2000)................................................................................................................ 165 8.1.5 AAMA (API 3200) ................................................................................................................ 166 8.1.6 GAMA (API 3200)................................................................................................................ 166 8.1.7 Acrylamid ............................................................................................................................. 167 8.1.8 Glycidamid ........................................................................................................................... 167 8.1.9 HPMA .................................................................................................................................. 168
8.2 Kalibriergeraden/Linearität................................................................................................... 169 8.2.1 AAValPFPTH....................................................................................................................... 169 8.2.2 GAValPFPTH....................................................................................................................... 169 8.2.3 AAMA................................................................................................................................... 170 8.2.4 GAMA .................................................................................................................................. 170 8.2.5 Acrylamid ............................................................................................................................. 171 8.2.6 Glycidamid ........................................................................................................................... 171 8.2.7 HPMA .................................................................................................................................. 172
8.3 Verwendete Formeln ............................................................................................................. 173
Abkürzungen
- V -
Abkürzungen
a Jahr
AA Acrylamid
AAD7ValPFPTH 1-(2-Carbamoylethyl)-(S)-5-isopropyl-D7-3-pentafluorophenyl-2-
thiohydantoin
AAMA N-Acetyl-S-(2-carbamoylethyl)cystein
AAMA-SO N-Acetyl-S-(2-carbamoylethyl)cystein-S-oxid
AUC Area Under Curve
AAVal N-(2-carbamoylethyl)valin
AAValPFPTH 1-(2-Carbamoylethyl)-(S)-5-isopropyl-3-pentafluorophenyl-2-
thiohydantoin
Abb. Abbildung
acGAD7ValPFPTH N-(2,2-Dimethyl-4-oxazolidinonylmethyl)-(S)-5-isopropyl-D7-3-
pentafluorophenyl-2-thiohydantoin
acGAValPFPTH N-(2,2-Dimethyl-4-oxazolidinonylmethyl)-(S)-5-isopropyl-3-
pentafluorophenyl-2-thiohydantoin
API Atmospheric Pressure Ionisation
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung
bidest. bidestilliert
cps counts per second
CYP Cytochrom-P450 abhängige Monooxygenase
d Tag
D3-AAMA N-Acetyl-S-(2-carbamoylethyl-D3)cystein
D3-GAMA N-Acetyl-S-(R,S)-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl-D3)cystein
D3-HPMA N-Acetyl-D3-S-(3-hydroxypropyl)cystein
DNA Desoxyribonucleic Acid
EH Epoxidhydrolase
ESI Electron Spray Ionisation
FPG Formamidopyrimidin-DNA-Glycosylase
GA Glycidamid
GAD7ValPFPTH 1-(R,S)-(2-Carbamoyl-2-hydroxyethyl)-(S)-5-isopropyl-D7-3-
pentafluorophenyl-2-thiohydantoin
GAMA-2 N-Acetyl-S-(R,S)-(1-carbamoyl-2-hydroxyethyl)cystein
GAMA-3 N-Acetyl-S-(R,S)-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)cystein
GAVal N-(R,S)-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)valin
Abkürzungen
- VI -
GAValPFPTH 1-(R,S)-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)-(S)-5-isopropyl-3-
pentafluorophenyl-2-thiohydantoin
GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie
GSH Glutathion
GST Glutathion-S-Transferase
Hb Hämoglobin
HPLC High Performance Liquid Chromatographie
HPMA N-Acetyl-S-(3-hydroxypropyl)cystein
HPRT Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase
IARC International Agency for Research on Cancer
IS interner Standard
kDa kilo-Dalton
KG Körpergewicht
MRM Multiple Reaction Monitoring
MS Massenspektrometrie, Massenspektrometer
n Anzahl unabhängiger Versuche
N3-GA-Ade N3-(R,S)-(2-Carbamoyl-2-hydroxyethyl)adenin
N7-GA-Gua N7-(R,S)-(2-Carbamoyl-2-hydroxyethyl)guanin
ND nicht detektierbar
NG nicht gemessen
NOAEL No Observed Adverse Effect Level
NQ nicht quantifizierbar
p Irrtumswahrscheinlichkeit
PFPITC Pentafluorphenylisothiocyanat
PFPTH Pentafluorphenylthiohydantoin
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
Q Quadrupol
SIM Selected Ion Monitoring
SPE Solid Phase Extraction
v/v Volumenverhältnis
WHO World Health Organisation
z. B. zum Beispiel
α-OH-Acrolein-dG α-Hydroxy-1,N2-propanodeoxyguanosin
γ-OH-Acrolein-dG γ-Hydroxy-1,N2-propanodeoxyguanosin
Einleitung
- 1 -
1 Einleitung
Acrylamid, eine als Industriechemikalie bekannte α,β-ungesättigte Carbonylverbindung,
entsteht bei der Zubereitung und Herstellung von kohlenhydratreichen Lebensmitteln [Tareke
et al., 2002]. Als Vorläufersubstanzen konnten Aminosäuren (vorwiegend Asparagin)
identifiziert werden, welche in Anwesenheit von reduzierenden Kohlenhydraten im Verlauf
der Maillard-Reaktion Acrylamid freisetzen [Stadler et al., 2002; Mottram et al., 2002]. In
Deutschland wird die mittlere Acrylamidaufnahme mit der Nahrung auf 0,6 µg/kg KG/Tag
geschätzt [Madle et al., 2003]. Acrylamid zeigt sowohl neurotoxische als auch
reproduktionstoxische Wirkungen, für die ein NOAEL von 0,5 mg/kg KG/Tag bzw. 2 mg/kg
KG/Tag festgelegt wurde [WHO, 2002]. In Langzeitstudien an Ratten und Mäusen wurden
erhöhte Tumorinzidenzen an verschiedenen Organen festgestellt, daher wurde Acrylamid
von der International Agency for Research on Cancer als „wahrscheinlich kanzerogen am
Menschen“ eingestuft [IARC, 1994].
Acrylamid wird im Organismus durch oxidierende Cytochrom P450-Enzyme zu Glycidamid
umgewandelt [Sumner et al., 1999]. Dieses metabolisch gebildete Glycidamid ist ein
genotoxischer Stoff, der im Wesentlichen für die kanzerogene Wirkung von Acrylamid
verantwortlich gemacht wird [Carere, 2006]. Glycidamid bildet Addukte mit der DNA,
insbesondere mit dem N7 des Guanins [Segerbäck et al., 1995].
Sowohl Acrylamid als auch Glycidamid reagieren mit nucleophilen Zentren in
Makromolekülen wie z. B. dem endständigen Valin im Hämoglobin [Friedman, 2003]. Diese
Hämoglobin-Addukte können als Langzeit-Biomarker einer chronischen Exposition mit
Acrylamid herangezogen werden [Törnqvist et al., 2002]. Sowohl in Tier- als auch in
Humanstudien konnte ein dosisabhängiger Anstieg der Acrylamid-Hämoglobinaddukte
gezeigt werden [Vikström et al., 2008; Fennell et al., 2005]. Einen Hauptentgiftungsweg für
Acrylamid und metabolisch gebildetes Glycidamid stellt die Konjugation mit Glutathion dar.
Im weiteren Verlauf führt die Umwandlung dieser Glutathion-Addukte zur Bildung der
entsprechenden Mercaptursäuren AAMA und GAMA, welche über den Urin ausgeschieden
werden [Fuhr et al., 2006; Sumner et al., 1992].
Die kanzerogene Wirkung von Acrylamid wurde in Tierversuchen beobachtet, bei denen die
Verabreichung über Trinkwasser erfolgte [Johnson et al., 1986; Friedman et al., 1995]. Dabei
war die toxikologische Untersuchung mit isoliert verabreichtem Acrylamid grundsätzlich
erforderlich, um stoffbezogene Aussagen zu dessen Schädigungspotential treffen zu können.
Dadurch können Erkenntnisse zur Toxikokinetik und Toxikodynamik sowie zur Dosis-
Wirkungsbeziehung gewonnen werden. Toxische Wirkungen, die in Tierexperimenten mit
isoliert verabreichten Lebensmittel-Inhaltsstoffen beobachtet werden, müssen nicht
Einleitung
- 2 -
unbedingt in Art und Umfang bei Aufnahme im Lebensmittel in gleicher Weise auftreten.
Lebensmittel sind in der Regel sehr komplex zusammengesetzt, so dass ein in Frage
stehender Inhaltsstoff jeweils den Einflussmöglichkeiten zahlreicher anderer Stoffe
ausgesetzt ist. Diese können in der Beeinflussung der Freisetzung und Resorption eines
Stoffes sowie in Wechselwirkungen mit Lebensmittelinhaltsstoffen bestehen. Dadurch kann
sich insbesondere die Bioverfügbarkeit bzw. die Wirkung des Inhaltsstoffes verändern.
Darüber hinaus können Lebensmittelinhaltsstoffe die Metabolisierung und Ausscheidung
eines Stoffes z. B. durch Aktivierung oder Inaktivierung von körpereigenen Enzymen oder
Enzymen der Darmflora beeinflussen. Für eine differenziertere Risikobeurteilung muss daher
untersucht werden, ob und in welcher Weise der natürliche Verbund im betreffenden
Lebensmittel die Toxikokinetik bzw. Toxikodynamik des zu beurteilenden Inhaltsstoffes
beeinflusst. [SKLM, 2006]
Theoretische Grundlagen
- 3 -
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Acrylamid
2.1.1 Allgemeine Grundlagen
Bei Acrylamid (2-Propenamid) handelt es sich bei Raumtemperatur um
eine farblose kristalline Substanz mit einem Molekulargewicht von
71,08 g/mol, welche in Wasser, Alkoholen und Aceton leicht löslich ist.
Aufgrund seiner α,β-ungesättigten Carbonylstruktur neigt Acrylamid
zur Polymerisation und zu Michael-artigen 1,4-Additionen mit
Nucleophilen [Eisenbrand et al., 2006; Roempp online]. Die industrielle
Produktion von Acrylamid liegt in der EU bei ca. 100000 t/a und wird nahezu vollständig zur
Herstellung von Polyacrylamiden verwendet. Polyacrylamide werden vor allem in der
Abwasser- und Mineralöl-Aufbereitung sowie in der Papier- und Zellstoffverarbeitung
eingesetzt [BfR, 2003].
Acrylamid zeigt sowohl neurotoxische als auch reproduktionstoxische Eigenschaften und
wurde von der International Agency for Research on Cancer (IARC) als „wahrscheinlich
kanzerogen beim Menschen“ (Gruppe 2A) eingestuft [IARC, 1994].
2.1.2 Expositionsquellen
1997 wurde während eines Tunnelbaus in Schweden ein Dichtungsmittel auf Acrylamid-
Basis zur Verhinderung von Wassereinbrüchen eingesetzt. Durch unvollständige
Polymerisation gelangten damals große Mengen Acrylamid in die Umwelt. Im Rahmen der
Untersuchung von exponierten Arbeitern konnte auch bei der nicht exponierten
Kontrollgruppe eine unerwartet hohe Acrylamidbelastung nachgewiesen werden. Später
konnte gezeigt werden, dass kohlenhydratreiche, hocherhitzte Lebensmittel eine
Expositionsquelle für Acrylamid darstellen [Tareke et al., 2000; 2002].
Eine weitere wichtige Expositionsquelle für Acrylamid ist Tabakrauch. Im Hauptstromrauch
einer Zigarette können 1-2 µg Acrylamid enthalten sein [Smith et al., 2000]. Die Gehalte an
Acrylamid-Metaboliten sind im Urin von Rauchern um den Faktor 4 höher als bei
Nichtrauchern [Boettcher et al., 2005 a+b].
Die weiteren bekannten Expositionsquellen für Acrylamid resultieren vor allem aus der
industriellen Verwendung von Polyacrylamiden, in denen monomeres Acrylamid enthalten
sein kann. Nach der Trinkwasserverordnung muss der Acrylamidgehalt in Trinkwasser unter
der Nachweisgrenze von 0,1 µg/l liegen. Die tägliche Aufnahme von Acrylamid über
O
NH2
Abb. 2.1: Acrylamid
Theoretische Grundlagen
- 4 -
Trinkwasser wird auf 0,0036 µg/kg KG geschätzt und ist damit als vernachlässigbar gering
zu bewerten [Smith et al., 2000]. Nach der Kosmetikverordnung dürfen kosmetische Mittel,
die auf der Haut verbleiben, maximal 100 µg/kg monomeres Acrylamid enthalten. Bei
sonstigen kosmetischen Mitteln liegt der Grenzwert bei 500 µg Acrylamid/kg. Da die tägliche
Aufnahme von Acrylamid über kosmetische Mittel auf weniger als 1 ng/kg KG geschätzt wird,
ist diese Expositionsquelle ebenfalls als vernachlässigbar zu betrachten [Van Landingham et
al., 2004].
Der Beitrag einer endogenen Bildung von Acrylamid zur Gesamtexposition des Menschen ist
ebenfalls als gering zu betrachten, da nach 48-stündigem Fasten eine Verringerung der
Mercaptursäureausscheidung um ca. 90 % beobachtet wurde [Boettcher et al., 2006a]. Unter
Berücksichtigung der relativ langen Halbwertszeiten (17-25 Stunden) der Acrylamid-
Mercaptursäuren kann davon ausgegangen werden, dass der überwiegende Teil der
Acrylamid-Exposition bei nicht beruflich exponierten auf die Nahrung zurückzuführen ist.
2.1.3 Bildung von Acrylamid in Lebensmitteln
Acrylamid wird vor allem in kohlenhydratreichen, stark erhitzten Lebensmitteln gebildet
[Tareke et al., 2002]. Zu den besonders belasteten Lebensmitteln gehören Lebkuchen,
Pommes frites, Kartoffelchips und Kaffee (Tab. 2.1).
Tab. 2.1: Acrylamidgehalte in verschiedenen Lebensmitteln [Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, 2008]
Warengruppe Probenanzahl Acrylamid
[µg/kg] Minimum
Acrylamid [µg/kg] Median
Acrylamid [µg/kg]
Maximum Lebkuchen und
Lebkuchenhaltiges Gebäck
96 < 20 121 1232
Spekulatius 27 < 20 118 361 Feine Backwaren,
sonstige 5 < 20 73 992
Knäckebrot 4 140 283 388 Kartoffelchips 96 46 287 2365
Pommes frites, zubereitet 69 < 20 358 1276
Kaffee, geröstet 47 19 192 556 Kaffeeextrakt 34 181 709 1373 Kaffeeersatz 22 77 520 920
Getreidebeikost für Säuglinge und
Kleinkinder 6 < 20 19 94
Kinderkeks 22 < 20 27 169 Säuglings- und
Kleinkindernahrungen 4 9 12 30
Theoretische Grundlagen
- 5 -
Es wurden verschiedene Mechanismen zur Bildung von Acrylamid diskutiert. So können
Triacylglyceride bei höheren Temperaturen Glycerin freisetzen. Durch Dehydratisierung kann
aus Glycerin Acrolein entstehen, welches durch weitere Oxidation über die Zwischenstufe
Acrylsäure in Gegenwart einer Stickstoffquelle wie z. B. Asparagin in Acrylamid überführt
werden kann. Acrylsäure als Precursor für Acrylamid kann darüber hinaus aus Aminosäuren
sowie durch Pyrolyse von Glucose entstehen [Gertz, 2002; Grivas et al., 2002; Ehling et al.,
2005].
Der quantitativ bedeutendste Mechanismus für die Bildung von Acrylamid in Lebensmitteln
ist die Reaktion von reduzierenden Kohlenhydraten mit Aminosäuren im Verlauf der Maillard-
Reaktion. Dabei entstehen besonders in Anwesenheit von Asparagin hohe Acrylamidgehalte,
wobei auch Glutamin und Methionin größere Mengen Acrylamid generieren können [Mottram
et al., 2002; Stadler et al., 2002]. Bei der Reaktion von Asparagin mit reduzierenden
Kohlenhydraten (Abb. 2.2) kommt es durch Dehydratisierung zur Bildung einer Schiff’ schen
Base, welche durch Decarboxylierung in die entsprechenden Azomethinylide umgesetzt
wird.
NH2
NH2O
COOH NH2
O
COOH
NH
R
OHHO
R
H
NH2
O
COOH
NCHR
NH2
O HNCHR
NH2
O HNCHR
NH2
O
NHR
HNH2
O NH2
NH2
O
RO
H
H2O
CO2
++
NH3
Asparagin
red. Zucker
Schiff'sche BaseAzomethinylid
Acrylamid Acrylamid3-Aminopropionamid Abb. 2.2: Mechanismus der Acrylamid Bildung aus Asparagin und reduzierenden Kohlenhydraten; modifiziert nach [Zyzak et al., 2003]
Aus Azomethinyliden kann Acrylamid entweder direkt oder über die Zwischenstufe 3-
Aminopropionamid freigesetzt werden [Zyzak et al., 2003]. 3-Aminopropionamid wird auch in
Theoretische Grundlagen
- 6 -
unverarbeiteten Lebensmitteln durch enzymatische Decarboxylierung von Asparagin gebildet
und stellt einen wichtigen Precursor für die Bildung von Acrylamid dar [Granvogl und
Schieberle, 2006].
2.1.4 Expositionsabschätzung
Durch die unterschiedlichen Gehalte der einzelnen Lebensmittelgruppen und individuellen
Verzehrsgewohnheiten kann die Exposition gegenüber Acrylamid in der
Allgemeinbevölkerung stark variieren. Das Bundesinstitut für Risikobewertung schätzt die
mittlere tägliche Acrylamidaufnahme in Deutschland auf 0,6 µg/kg KG. Bei
Bevölkerungsgruppen, die besonders hoch belastete Lebensmittel in großen Mengen
konsumieren, kann die mittlere tägliche Exposition bis zu 3,4 µg/kg KG betragen [Madle et
al., 2003]. Nach der Weltgesundheitsorganisation WHO liegt die durchschnittliche tägliche
lebensmittelbedingte Acrylamid-Exposition bei 0,3-0,8 µg/kg KG [WHO, 2002]. Die U.S. Food
and Drug Administration (FDA) beziffert die tägliche Acrylamidaufnahme auf 0,4 µg/kg KG
(95. Perzentil: 0,9 µg/kg KG), wobei die Bevölkerungsgruppe der 2-5 Jährigen mit
durchschnittlich 1,1 µg/kg KG (90. Perzentil: 2,3 µg/kg KG) höher belastet ist [FDA, 2006].
In den USA sind 35 % und in den Niederlanden 46 % der Acrylamid-Gesamtaufnahme auf
den Konsum von Pommes frites und Kartoffelchips zurückzuführen [Wilson et al., 2006]. Die
Acrylamid-Aufnahme wird auf 0,019 µg/kg KG/d über Brot und 0,058 µg/kg KG/d über
Pommes frites geschätzt [FDA, 2003].
2.1.5 Reduzierung der Acrylamid-Gehalte in Lebensmitteln
Die Bildung von Acrylamid in Lebensmitteln erfolgt im Wesentlichen aus Asparagin und
reduzierenden Kohlenhydraten im Verlauf der Maillard-Reaktion (Kap. 2.1.3). Daher wird die
Acrylamidkonzentration im Lebensmittel neben den Herstellungsbedingungen vor allem
durch die vorhandene Menge an freiem Asparagin und reduzierenden Kohlenhydraten
beeinflusst. Amrein et al. zeigten, dass die Acrylamid-Bildung in verschiedenen
Kartoffelsorten mit der Konzentration an reduzierenden Kohlenhydraten korreliert, wobei
relativ große Unterschiede zwischen den getesteten Genotypen beobachtet wurden [Amrein
et al., 2003]. Dabei lagen die mittleren Asparagin-Gehalte der untersuchten Kartoffeln um
den Faktor 6 bzw. 4 höher als die entsprechenden Glucose- bzw. Fructose-Gehalte, so dass
die Konzentration an reduzierenden Kohlenhydraten der limitierende Faktor für die
Entstehung von Acrylamid in Kartoffelprodukten darstellt. Darüber hinaus haben die
Lagerungsbedingungen nach der Ernte einen wesentlichen Einfluss auf die Gehalte an
reduzierenden Zuckern. So führte die Lagerung von Kartoffeln bei 4 °C zu einer Erhöhung
der Gehalte an reduzierenden Kohlenhydraten, wohingegen die Lagerung bei höheren
Theoretische Grundlagen
- 7 -
Temperaturen (> 8 °C) zu einer Verringerung der entsprechenden Konzentrationen führte
[Hertog et al., 1997; Amrein et al., 2004]. Nach Erhöhung der Lagerungstemperatur von 4 °C
auf 15 °C wurde innerhalb von 3 Wochen eine Verringerung der Gehalte an reduzierenden
Kohlenhydraten von 0,75 % auf 0,18 % der Trockenmasse beobachtet [De Wilde et al.,
2005].
Da Kartoffelprodukte wesentlich zur täglichen Acrylamid-Aufnahme beitragen, wurde eine
Reihe von verfahrenstechnologischen Ansätzen zur Reduzierung der Acrylamid-Gehalte
entwickelt. So konnte durch Behandlung von Pommes frites mit Asparaginase eine
Reduzierung der Acrylamid-Gehalte um 80 % erreicht werden [Heldt-Hansen et al., 2004].
Durch die Absenkung des pH-Wertes mit 1 %-iger Citronensäure wurde eine Erniedrigung
der Acrylamid-Gehalte in Pommes frites um 53–80 % beobachtet [Pedreschi et al., 2006;
Jung et al., 2003]. Durch Vorbehandlung mit Natriumchlorid-Lösung konnte die Acrylamid-
Konzentration in Pommes frites um bis zu 40 % vermindert werden [Reimerdes und Franke,
2006; Kolek et al., 2006]. Generell können die Acrylamid-Gehalte von Pommes frites durch
das Blanchieren und die Vortrocknung der Rohware und der damit verbundenen kürzeren
Frittier-Zeit vermindert werden [Seal et al., 2008].
Im Gegensatz zu Kartoffelprodukten wurde bei Getreideprodukten keine Korrelation
zwischen dem Acrylamid-Gehalt und der Konzentration an reduzierenden Kohlenhydraten
beobachtet [Taeymans et al., 2004]. In Getreide scheint der Gehalt an freiem Asparagin der
limitierende Faktor der Acrylamid-Bildung zu sein, da die Konzentration an Asparagin
lediglich bei 3-8 % der entsprechenden Konzentration an reduzierenden Zuckern liegt. Bei
Verwendung von Roggenmehl (634 mg Asparagin/kg) wurden im Vergleich zu Weizenmehl
(172 mg Asparagin/kg) etwa um den Faktor 3 höhere Acrylamid-Gehalte in Backwaren
beobachtet [Elmore et al., 2005]. Die Verwendung von Asparaginase bei der Teigherstellung
führt zu einer Verringerung der Acrylamid-Gehalte um 36-75 % in der Brotkruste und mehr
als 80 % in feinen Backwaren [FDA, 2007]. Durch Verwendung von Natriumbicarbonat
anstelle von Ammoniumbicarbonat und Einsatz von Citronensäure wurde in feinen
Backwaren, Lebkuchen und Knäckebrot eine Verringerung der Acrylamid-Gehalte um bis zu
70 % beobachtet [Graf et al., 2006]. Generell kann durch Erniedrigung der Backtemperatur
und Verkürzung der Backzeit die Acrylamid-Bildung wesentlich reduziert werden [Seal et al.,
2008].
Theoretische Grundlagen
- 8 -
2.1.6 Toxikokinetik von Acrylamid
2.1.6.1 Aufnahme
Die Aufnahme von Acrylamid kann sowohl dermal als auch inhalativ und oral erfolgen
[Sumner et al. 2003]. Da im Rahmen der vorliegenden Arbeit im Wesentlichen die orale
Aufnahme von Bedeutung ist, wird diese nachfolgend näher beschrieben.
Miller et al. zeigten, dass nach oraler Verabreichung von 1, 10 und 100 mg 14C-
Acrylamid/kg KG an F344-Ratten über Trinkwasser 53-64 % der gegebenen Dosis innerhalb
von 24 Stunden ausgeschieden werden. Nach 7 Tagen lagen die Dosisanteile der
Urinmetabolite bei 65-82 %, wobei ca. 10 % der Gesamtradioaktivität in Muskeln und Haut
gefunden wurden. Die Ausscheidungsmenge nach intravenöser Gabe von 10 mg 14C-
Acrylamid/kg KG war mit derjenigen nach oraler Gabe vergleichbar. Diese Ergebnisse
deuten darauf hin, dass Acrylamid nach oraler Verabreichung über Trinkwasser nahezu
vollständig absorbiert wird [Miller et al., 1982].
Auch bei oraler Verabreichung über Lebensmittel scheint der größte Teil des gegebenen
Acrylamids aufgenommen zu werden. Bjellaas et al. untersuchten die Gehalte an AAMA,
GAMA und Glycidamid im 24-Stunden-Urin von Mäusen, denen 24-290 µg Acrylamid/kg KG
über Knäckebrot verabreicht wurde, im Vergleich zur Ausscheidung nach subkutaner
Injektion von 50, 500 und 5000 µg Acrylamid/kg KG. Dabei zeigte sich, dass bei Acrylamid-
Aufnahme über Knäckebrot bzw. subkutane Injektion die Wiederfindung der gegebenen
Dosis im Urin bei 55 % bzw. 54 % lag, woraus eine vergleichbare Bioverfügbarkeit abgeleitet
werden kann [Bjellaas et al., 2007]. Aureli et al. bestimmten die Acrylamid-
Hämoglobinaddukte im Blut von Schweinen, denen 0,8 und 8 µg Acrylamid/kg KG/d über
Trinkwasser sowie Schweinefutter (mit definiertem Acrylamid-Gehalt) verabreicht wurde.
Dabei wurden keine signifikanten Unterschiede in den AAVal-Gehalten der beiden
Behandlungsgruppen festgestellt, was auf eine vergleichbare Bioverfügbarkeit hindeutet
[Aureli et al., 2007]. Im Gegensatz dazu berichteten Doerge et al. nach Verabreichung von
100 µg Acrylamid/kg KG über Acrylamid-dotierte Standarddiät eine im Vergleich zur
intravenösen Gabe ca. 60 % verminderte Bioverfügbarkeit [Doerge et al. 2005, 2007]. Bei
dieser Studie ist zu beachten, dass bei Dotierung der Standarddiät mit Acrylamid-haltigem
Trinkwasser Reaktionen mit nukleophilen Bestandteilen der Futtermatrix nicht
ausgeschlossen werden können, wodurch sich der Anteil des resorbierbaren Acrylamids
reduzieren würde.
Fuhr et al. bestimmten die Gehalte von Acrylamid, Glycidamid, AAMA und GAMA im Urin
von Probanden nach Aufnahme von 0,94 mg Acrylamid über Kartoffelchips. Dabei wurden
nach 72 Stunden ca. 60 % der Acrylamid-Dosis im Urin gefunden [Fuhr et al., 2006]. Nach
Aufnahme von 1 mg D3-Acrylamid über Trinkwasser lagen die Dosisanteile von AAMA und
Theoretische Grundlagen
- 9 -
GAMA bei 57 % [Boettcher et al., 2006]. Dies deutet darauf hin, dass der größte Teil des
aufgenommenen Acrylamids resorbiert wird und dass die Lebensmittelmatrix keinen
signifikanten Einfluss auf die Bioverfügbarkeit von Acrylamid hat. In einer weiteren
Humanstudie untersuchten Fennel et al. die Gehalte an Acrylamid und dessen Metaboliten
im Urin nach Verabreichung von 0,5, 1 und 3 mg Acrylamid/kg KG in Trinkwasser. Dabei
wurden innerhalb von 24 Stunden ca. 34 % der aufgenommenen Dosis über den Urin
ausgeschieden. Da beim Menschen nach Gabe von Acrylamid auch über den Zeitraum von
24 Stunden hinaus eine Ausscheidung von Mercaptursäuren zu erwarten ist und ein Teil des
aufgenommenen Acrylamids an Hämoglobin oder auch andere Proteine bindet, liegt der
aufgenommene Anteil vermutlich höher als 34 % [Fennel et al., 2005].
2.1.6.2 Verteilung
Die Verteilung von Acrylamid im Organismus wurde von Miller et al. nach intravenöser
Verabreichung von 10 mg 14C-Acrylamid/kg KG an männlichen F344-Ratten untersucht. Eine
Stunde nach Gabe der 14C-Acrylamid Dosis wurde der größte Teil der Gesamtradioaktivität in
Muskeln (48 %), Haut (15 %) sowie Leber (7 %) und Blut (12 %) gemessen. Eine
Akkumulation der Radioaktivität wurde lediglich in den Erythrocyten beobachtet, was
vermutlich auf die Bildung von Hb-Addukten zurückzuführen ist. Weniger als 1 % der
Gesamtradioaktivität wurden im Gehirn bzw. Zentralnervensystem nachgewiesen [Miller et
al., 1982].
Nach oraler Gabe von 1 mg 14C-Acrylamid/kg KG an Beagle-Hunde wurden 6 Stunden nach
der Applikation die höchsten Anteile an der verabreichten Gesamtradioaktivität in Muskeln
(ca. 35 %) und Leber (ca. 14 %) gemessen. Im Gehirn wurden weniger als 1 % der Gesamt-
radioaktivität nachgewiesen [Ikeda et al., 1987].
In Studien mit trächtigen Hunden, Schweinen und Ratten wurde gezeigt, dass Acrylamid die
Placenta-Schranke überwinden kann [Marlowe et al., 1986; Ikeda et al., 1983; 1985]. Von
Sörgel et al. wurden in Frauenmilch Acrylamid-Gehalte von bis zu 19 µg/l nachgewiesen
[Sörgel et al., 2002].
In einer Reihe weiterer Tierstudien wurde gezeigt, dass sich Acrylamid schnell und
unabhängig vom Expositionsweg auf alle Gewebe verteilt [Barber et al., 2001; Kadry et al.,
1999; Sumner et al., 2003; Hashimoto und Aldridge, 1970].
Theoretische Grundlagen
- 10 -
2.1.6.3 Metabolismus
Der Metabolismus von Acrylamid umfasst sowohl Reaktionswege der Giftung als auch der
Entgiftung (Abb. 2.3).
Hb-Cys
S
O
NH2
Hb-Cys
S
O
NH2
OH
Val-Hb
NH
O
NH2
Val-Hb
NH
O
NH2
OH
NH2
O
NH2 O
O
GS O
NH2
GS O
NH2OH
OH O
NH2GS
NH
OH
O
O S O
NH2OH
NH
OH
O
O S O
NH2 NH
OH
O
O S O
NH2
OH
N
N
N
N
NH2
NH2 O
OH
NH
N
N
NNH2
OOH
NH2
O
NH2
O
OH
OH
NH
OH
O
O S O
NH2
O
Acrylamid-Hämoglobin-Addukte Glycidamid-Hämoglobin-Addukte
Acrylamid Glycidamid
Reaktion mit Amino-und Thiolgruppen
CYP4502E1
Konjugation mit Glutathion
Abbau zu Mercaptursäuren
AAMAGAMA-3
DNA-Alkylierung
GAMA-2
N3-GA-Ade
N7-GA-Gua
Glyceramid
AAMA-SO Abb. 2.3: Metabolismus von Acrylamid; modifiziert nach [Sumner et al., 1992; Friedman 2003; Fennell et al., 2005]; N3-GA-Ade: N3-Glycidamid-Adenin, N7-GA-Gua: N7-Glycidamid-Guanin, AAMA: Acrylamid-Mercaptursäure, GAMA: Glycidamid-Mercaptursäure, AAMA-SO: Acrylamid-Mercaptursäure-Sulfoxid
Theoretische Grundlagen
- 11 -
Ein Teil des aufgenommenen Acrylamids wird durch Cytochrom P450 2E1 (CYP450 2E1)
zum Glycidamid epoxidiert. Die Tatsache, dass primär CYP450 2E1 für diese Reaktion
verantwortlich ist, wurde in Tierstudien mit CYP450 2E1-Knockout Mäusen gezeigt, in deren
Urin keine Glycidamid-Metabolite nachweisbar waren [Sumner et al., 1999]. Aktuelle
Humanstudien belegen die wesentliche, jedoch nicht ausschließliche Beteiligung von
CYP450 2E1, da die Hemmung des Enzyms mit Disulfiram lediglich zu einer Verringerung
der Glycidamid-Metabolite im Urin um 50-60 % führte [Doroshyenko et al., 2009]. Glycidamid
scheint einen wesentlichen Beitrag zur kanzerogenen Wirkung von Acrylamid zu leisten, da
es durch Bildung von DNA-Addukten direkt genotoxisch wirkt [Gamboa da Costa et al., 2003;
Besaratinia und Pfeifer, 2005]. Für Acrylamid konnten lediglich unter drastischen in vitro
Bedingungen DNA-Addukte mit dem N1 des Adenins und N7 des Guanins nachgewiesen
werden [Solomon et al., 1985]. Bei N7-(2-Carbamoyl-2-hydroxyethyl)guanin (N7-GA-Gua)
handelt es sich um das Glycidamid-DNA-Addukt mit der quantitativ größten Bedeutung
[Segerbäck et al., 1995]. Daneben konnte nach Verabreichung von 50 mg Acrylamid/kg KG
an Mäuse auch N3-(2-Carbamoyl-2-hydroxyethyl)adenin (N3-GA-Ade) nachgewiesen
werden, wobei die Gehalte um den Faktor 50-100 unter denen des N7-GA-Gua lagen
[Gamboa da Costa et al., 2003]. N7-GA-Gua und N3-GA-Ade verfügen über promutagene
Eigenschaften, da sie einer spontanen Depurinierung unterliegen können [Besaratinia und
Pfeifer, 2005].
Sowohl Acrylamid als auch Glycidamid neigen aufgrund ihrer elektrophilen Eigenschaften zur
Reaktion mit nukleophilen Zentren in Makromolekülen wie z. B. den Sulfhydryl- und
Aminogruppen im Hämoglobin und Serumalbumin [Friedman, 2003]. Die irreversible Bindung
an die Blutproteine Albumin und Hämoglobin spielt neben der Reaktion mit Glutathion eine
wichtige Rolle bei der Detoxifizierung von Acrylamid und Glycidamid, da daraus eine
geringere systemische Verfügbarkeit resultiert [Ramsey et al., 1984; Barber et al., 2001].
Im Rahmen des Phase-II Fremdstoffmetabolismus werden Acrylamid und Glycidamid an
Glutathion gebunden und im weiteren Verlauf als Mercaptursäuren ausgeschieden (Abb.
2.4).
Theoretische Grundlagen
- 12 -
NH
NH
NH2
HOOC
OSH
O
COOH
NH2
O
NH
NH
NH2
HOOC
OS
O
COOH
NH2
O
NH2
NH
S
O
COOH
NH2
O
NH2
S
NH2
O
COOHNH
S
NH2
O
COOH
O
Glutathion Acrylamid-Glutathion-Addukt
Glutathion-S-Transferase
Glutamin-säure
γ−Glutamyl-transpeptidase
Glycin
Amino-peptidase
Acetyl-transferase
Acrylamid-Mercaptursäure(AAMA)
Acetylierung
Abb. 2.4: Mechanismus der Mercaptursäure-Bildung am Beispiel Acrylamid, modifiziert nach [Forth et al., 1996]
Dieser Metabolisierungsweg ist für die Detoxifizierung von Acrylamid und Glycidamid in
Maus, Ratte und Mensch von wesentlicher Bedeutung, da bis zu 60 % einer verabreichten
Acrylamid-Dosis in Form der Mercaptursäuren ausgeschieden werden [Fennell et al., 2005;
Fuhr et al., 2006; Bjellaas et al., 2007].
Unterschiede in der Toxikokinetik zwischen Maus, Ratte und Mensch wurden sowohl beim
oxidativen Metabolismus von Acrylamid zu Glycidamid als auch bei der Konjugation von
Acrylamid und Glycidamid mit GSH und der Epoxidhydrolase vermittelten Hydrolyse von
Glycidamid beobachtet. Nach oraler Applikation von 50 mg bzw. 100 µg Acrylamid/kg KG an
B6C3F1-Mäuse waren 55 % bzw. 81 % der Gesamtmetabolite im Urin auf Glycidamid
zurückzuführen [Sumner et al., 1992; Doerge et al., 2007]. Nach Verabreichung von
3 mg 13C3-Acrylamid/kg KG an männliche F344-Ratten stammten 41 % der Metabolite im
Urin von Glycidamid [Fennell und Friedman, 2005]. Im Vergleich dazu waren nach Gabe von
3 mg 13C3-Acrylamid/kg KG an freiwillige männliche Probanden lediglich 14 % der
Urinmetabolite Glycidamid zuzuordnen [Fennell et al., 2005]. Diese Ergebnisse deuten
darauf hin, dass die Effektivität der oxidativen Umwandlung von Acrylamid zu Glycidamid in
der Reihenfolge Maus > Ratte > Mensch abnimmt. Nach Applikation von 50 mg 13C3-
Acrylamid/kg KG an männliche F344-Ratten lagen die Anteile der Glycidamid-Metabolite an
den ausgeschiedenen Urinmetaboliten bei 28 %, was im Vergleich zur Dosis von 3 mg 13C3-
Acrylamid/kg KG erniedrigt ist und auf eine Sättigung des oxidativen Metabolismus hindeutet
[Sumner et al., 1992]. Nach Gabe von 0,5, 1 und 3 mg 13C3-Acrylamid/kg KG an freiwillige
männliche Probanden wurden hingegen keine dosisabhängigen Unterschiede in der
Theoretische Grundlagen
- 13 -
Metabolitenverteilung festgestellt [Fennell et al., 2006]. Da bisher keine höheren Dosen an
Menschen verabreicht wurden, kann zur Belastbarkeit des oxidativen Metabolismus beim
Menschen keine endgültige Aussage getroffen werden.
Nach oraler Gabe von 50 mg bzw. 100 µg 13C3-Acrylamid /kg KG an B6C3F1-Mäuse lag der
Anteil der Acrylamid-Mercaptursäure an den Gesamtmetaboliten im Urin bei 41 % bzw. 18 %
[Sumner et al., 1992; Doerge et al., 2007]. Fennell und Friedman konnten nach
Verabreichung von 3 mg 13C3-Acrylamid/kg KG an männliche F344-Ratten 59 % der
Urinmetabolite auf die Konjugation von Acrylamid mit Glutathion zurückführen [Fennell und
Friedman, 2005]. Im Vergleich dazu stammten nach Gabe der gleichen Dosis an männliche
Probanden 86 % der Urinmetabolite aus der Konjugation von Acrylamid mit Glutathion
[Fennell et al., 2005]. Darüber hinaus wurden 13 % der Urinmetabolite als das Sulfoxid der
Acrylamid-Mercaptursäure (AAMA-SO) identifiziert, wobei dieser Metabolit bei Nagern nicht
nachgewiesen wurde [Fennell und Friedman, 2005]. Die beim Menschen anhand der
Mercaptursäure-Bildung beobachtete effektivere Entgiftung von Acrylamid (durch Kopplung
mit GSH) könnte eine Erklärung für die im Vergleich zu Maus und Ratte verminderte Bildung
von Glycidamid sein [Gargas et al., 2009].
Beim Menschen erfolgt die Entgiftung von Glycidamid neben der Bindung an Glutathion
durch die vermutlich Epoxidhydrolase vermittelte Hydrolyse unter Bildung von 2,3-
Dihydroxypropionamid (Glyceramid). So wurden nach Gabe einer Dosis von 3 mg 13C3-
Acrylamid/kg KG 11 % der Urinmetabolite als Glyceramid identifiziert, wohingegen nach
Verabreichung der entsprechenden Dosis an Ratten kein Glyceramid nachweisbar war. Im
Gegensatz dazu lag beim Menschen der Anteil an GAMA mit weniger als 1 % der
Gesamtmetabolite wesentlich geringer als der entsprechende Anteil bei der Ratte (ca. 41 %)
[Fennell et al., 2005; 2006]. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit in vitro
Untersuchungen zum Metabolismus vergleichbarer Epoxide. Kedderis et al. untersuchten die
Geschwindigkeit der Reaktion von 2-Cyanoethylenoxid, wobei es sich um den oxidativen
Metaboliten von Acrylnitril handelt, mit Glutathion. Dabei zeigte sich, dass die Kopplung mit
Glutathion in Rattenleber-Cytosol etwa 9 mal schneller verläuft als in humanem Leber-
Cytosol [Kedderis et al., 1995]. Darüber hinaus war eine mikrosomale Epoxidhydrolase-
Aktivität in Rattenleber nicht nachweisbar, wohingegen in der menschlichen Leber eine
Aktivität von Vmax = 3,34 nmol/g min-1 bestimmt werden konnte [Kedderis und Batra, 1993].
Nach oraler Verabreichung von 50 mg 13C3-Acrylamid/kg KG an F344-Ratten und B6C3F1-
Mäusen lagen die Anteile von Glyceramid an den Gesamtmetaboliten im Urin bei
2 bzw. 5 %, was auf eine quantitativ geringe Bedeutung dieses Metaboliten in den
untersuchten Spezies hindeutet [Sumner et al., 1992].
Theoretische Grundlagen
- 14 -
2.1.6.4 Ausscheidung
Die Ausscheidung von Acrylamid und seiner Metaboliten erfolgt überwiegend über den Harn
[Miller et al., 1982; Sumner et al., 1992; Fennell et al., 2006; Boettcher et al., 2006a; Fuhr et
al., 2006]. Miller et al. beobachteten in F344-Ratten eine biphasische Eliminationskinetik,
wobei in der ersten Eliminationsphase die Halbwertszeit < 5 Stunden betrug, während die
Halbwertszeit der zweiten Eliminationsphase bei < 8 Tagen lag. Nach 24 Stunden waren
bereits 62 % der verabreichten Acrylamid-Dosis (10 mg 2,3-14C-Acrylamid/kg KG) über den
Urin ausgeschieden. Nach 7 Tagen stiegen die Anteile der Urinmetabolite auf 71 %, wobei
über diesen Zeitraum lediglich 6 % der Gesamtradioaktivität in den Fäces nachgewiesen
wurde [Miller et al., 1982].
Nach Verabreichung von 13 µg D3-Acrylamid/kg KG an einen freiwilligen Probanden wurden
innerhalb von 46 Stunden 57 % der Dosis in Form der Mercaptursäuren AAMA und GAMA
ausgeschieden. Die Eliminationskinetik zeigte einen biphasischen Verlauf mit Eliminations-
Halbwertszeiten von 3,5 Stunden für AAMA und GAMA in der ersten Phase und mehr als 10
Stunden in der zweiten Phase [Boettcher et al., 2006a]. Fuhr et al. bestimmten die Gehalte
an Acrylamid und Glycidamid sowie der entsprechenden Mercaptursäuren bei freiwilligen
Probanden nach Aufnahme von 12,4 µg Acrylamid/kg KG über Kartoffelchips. Nach 72
Stunden lagen die mittleren Anteile der Urinmetabolite an der aufgenommenen Dosis bei
4 % für Acrylamid, 50 % für AAMA und 6 % für GAMA, wobei kein freies Glycidamid
detektierbar war. Dabei wurden für Acrylamid, AAMA und GAMA mittlere
Eliminationshalbwertszeiten von 2, 17 und 25 Stunden ermittelt [Fuhr et al., 2006].
Tab. 2.2: Ausscheidung von Acrylamid und dessen Metabolite im Urin von Maus, Ratte und Mensch nach oraler Verabreichung von Acrylamid über Trinkwasser (Angaben als prozentuale Dosisanteile); a: Sumner et al. 1992, b: Doerge et al. 2007, c: Sumner et al. 2003, d: Fennell et al. 2005, e: Fennell et al. 2006, f: Boettcher et al. 2006a; NQ: detektierbar, nicht quantifiziert; NG: nicht gemessen; ND: nicht detektierbar; GAMA: GAMA-3 + GAMA-2
Spezies Dosis mg/kg KG AA AAMA AAMA-SO GA GAMA Glyceramid
50a NQ 21 ND 9 17 3 Maus 0,1b 0,7 7 NG 16 16 NG 50a NQ 34 ND 3 12 1 50c NQ 42 ND 4 12 0,7 3d NQ 29 ND ND 21 ND
Ratte
0,1b 2 31 NG 6 28 NG 3e 3 28 7 0,7 0,7 NG 3d NG 22 4 0,8 ND 3 1e 5 34 9 0,6 0,8 NG
0,5e 5 31 8 0,4 0,8 NG Mensch
0,013f NG 52 NG NG 5 NG
Theoretische Grundlagen
- 15 -
2.1.7 Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem endständigen Valin im Hämoglobin
Aufgrund ihrer elektrophilen Eigenschaften reagieren sowohl Acrylamid als auch Glycidamid
mit nukleophilen Zentren in Makromolekülen wie z. B. dem Hämoglobin [LoPachin et al.,
2004]. Humanes Hämoglobin hat ein Molekulargewicht von ca. 64 kDa und besteht aus 4
Polypeptidketten, von denen jeweils 2 identisch sind. Das beim Erwachsenen
vorherrschende Hämoglobin A besteht aus zwei α-Ketten mit je 141 Aminosäuren und zwei
β-Ketten mit je 146 Aminosäuren [Stryer, 1991]. Jede dieser Polypeptidketten trägt am N-
terminalen Ende die Aminosäure Valin, deren freie Aminogruppe ein nukleophiles Zentrum
darstellt und leicht mit Elektrophilen wie Acrylamid oder Glycidamid reagiert. Neben dem N-
terminalen Valin sind beim Menschen darüber hinaus Addukte mit His77,97 und Cys93 der α-
Peptidkette sowie His45 der β-Peptidkette möglich [Badghisi und Liebler, 2002]. Humanes
Hämoglobin verfügt lediglich über einen reaktiven Cysteinyl-Rest (Cys93), dessen Reaktivität
im Vergleich zur Thiolgruppe des Glutathions geringer ist. Im Gegensatz dazu beinhaltet das
Hämoglobin-Molekül von Ratten drei reaktive Cysteinyl-Reste (Cys13,93,125), wobei für Cys125
im Erythrocyten eine im Vergleich zu Glutathion 30-fach höhere Reaktivität gezeigt wurde [Di
Simplicio et al., 1998; Rossi et al., 2001].
Dem N-terminalen Valin kommt für das in vivo-Monitoring von Expositionen gegenüber
elektrophilen Substanzen aus analytischer Sicht eine besondere Bedeutung zu. Mit Hilfe des
modifizierten Edman-Abbaus lässt sich spezifisch die N-terminale, alkylierte Aminosäure
abspalten [Mowrer et al., 1986]. Als Derivatisierungsreagenz wird häufig Pentafluorphenyl-
isothiocyanat (PFPITC) verwendet, das mit der N-alkylierten endständigen Aminosäure zu
einem Pentafluorphenylthiohydantoin reagiert. Abb. 2.5 zeigt die Umsetzung am Beispiel der
Acrylamid- und Glycidamid-Valin-Addukte. Zur Verbesserung der gaschromatographischen
Eigenschaften kann das entstehende GAValPFPTH mit Aceton umgesetzt werden, wodurch
aus dem von Glycidamid stammenden Alkylrest ein Oxazolidinon-Derivat entsteht [Paulsson
et al., 2003].
Theoretische Grundlagen
- 16 -
FF
F
F
F
N
SC
NH
NH2
O
O
NH
Globin FF
F
F
F
N
N
OS
NH2
O
FF
F
F
F
N
SC
NH
NH2
O
O
NH
Globin
OH
FF
F
F
F
N
N
OS
O
NH
OO
FF
F
F
F
N
N
OS
O
NH2
OH
FF
F
F
F
N
N
OS
O
NH2
OH
+45°C;90min
AAVal-Addukt PFPITC
AAValPFPTH
+45°C; 90min
GAVal-Addukt PFPITC
acGAValPFPTH
-H2O
GAValPFPTH
GAValPFPTH Abb. 2.5: Derivatisierung der Acrylamid- und Glycidamid-Valin-Addukte des Hämoglobins (AA/GAVal-Addukt) mit Pentafluorphenylisothiocyanat (PFPITC) zu den entsprechenden Pentafluorphenyl-thiohydantoinen (PFPTH) sowie Umsetzung von GAValPFPTH mit Aceton; modifiziert nach [Rydberg et al. 2002; Paulsson et al., 2003]
Theoretische Grundlagen
- 17 -
2.1.8 Toxikodynamik von Acrylamid
2.1.8.1 Neurotoxische Wirkungen
Neurotoxische Wirkungen von Acrylamid wurden sowohl im Tierversuch als auch beim
Menschen beobachtet. Im Bereich höherer Dosierungen (20-50 mg Acrylamid/kg KG/d)
wurde im Tierversuch vor allem das zentrale Nervensystem beeinträchtigt, was zu Ataxien
bei Ratten, Hunden und Primaten führte [IPCS, 1999; Mc Collister et al., 1964; Thomann et
al., 1974; Hopkins, 1970]. Im Bereich niedrigerer Dosierung scheint hingegen das periphere
Nervensystem betroffen zu sein. Die Verabreichung von 5 bzw. 20 mg Acrylamid/kg KG/d an
F344-Ratten führte zu peripheren Nervendegenerationen, die sich jedoch als voll reversibel
erwiesen [Burek et al., 1980]. Nach Gabe von 2 mg Acrylamid/kg KG/d über 18 Monate an
F344-Ratten wurden Degenerationen des Nervus tibialis beobachtet [Johnson et al., 1986].
In einer weiteren Langzeitstudie mit F344-Ratten wurden bei einer Dosis von
2 mg Acrylamid/kg KG/d über 18 Monate vermehrt Degenerationen des Nervus ischiadicus
festgestellt [Friedman et al., 1995].
Beim Menschen wurden unter akuter Acrylamid-Einwirkung Ataxie, Tremor, Reflexstörungen,
verwaschene Sprache und Verwirrtheitszustände beobachtet [Auld und Bedwell, 1967]. Bei
schwedischen Tunnelarbeitern, die einem acrylamidhaltigen Gemisch ausgesetzt waren,
zeigten sich ebenfalls periphere Nervenstörungen, die jedoch größtenteils reversibel waren.
Dabei korrelierten die AAVal-Hb-Adduktgehalte mit dem Auftreten der neurotoxischen
Symptome, wobei ein NOAEL von 510 pmol/g Hämoglobin abgeleitet wurde [Hagmar et al.,
2001]. In der Literatur werden verschiedene Mechanismen der neurotoxischen Wirkung von
Acrylamid diskutiert, insbesondere die Inhibition des schnellen axonalen Transports auf der
Basis von Kinesin-Motorproteinen sowie die direkte Hemmung der Neurotransmission
[Sickles et al., 2002; LoPachin, 2002]. Als Ursache der neurotoxischen Wirkung kommt die
Reaktion von Acrylamid und Glycidamid mit nukleophilen Zentren in den relevanten
Makromolekülen in Betracht [Friedman, 2003]. Für die Neurotoxizität von Acrylamid wurde
ein NOAEL von 0,5 mg/kg KG/Tag festgelegt [WHO, 2002].
2.1.8.2 Entwicklungs- und reproduktionstoxische Wirkungen
Bei Ratten führten 50-200 ppm Acrylamid im Trinkwasser über den Zeitraum von 70 Tagen
zu einer Verringerung der Spermienbeweglichkeit, des Geburtsgewichts und der
Gewichtszunahme während der Lactationsperiode sowie zu Störungen des
Paarungsverhaltens [Zenick et al., 1986]. In einer weiteren Studie wurde nach Verabreichung
von 5-20 mg Acrylamid/kg KG ebenfalls eine Verringerung des Geburtsgewichts und der
Anzahl der Nachkommen sowie Anomalien in der Spermienanatomie und Beweglichkeit
Theoretische Grundlagen
- 18 -
beobachtet [Wise et al., 1995]. Auch in einer Studie mit Mäusen wurde nach Gabe von
45 mg Acrylamid/kg KG/d während der Trächtigkeit eine Verringerung der Geburtsgewichte
festgestellt [Field et al., 1990]. Darüber hinaus führte die dermale Exposition mit Acrylamid
bei Mäusen zu Chromosomenschäden in Keimzellen [Gutierrez-Espeleta et al., 1992]. Der
molekulare Mechanismus der reproduktions- und entwicklungstoxischen Wirkungen bei den
männlichen Tieren liegt vermutlich in der Alkylierung von Protaminen und Motorproteinen der
Spermien, außerdem wird eine GSH-Depletion und DNA-Schädigung in den Hoden diskutiert
[Tyl und Friedman, 2003; Dearfield et al., 1995].
Für die Reproduktionstoxizität von Acrylamid wurde ein NOAEL von 2 mg/kg KG/d festgelegt
[WHO, 2002].
2.1.8.3 Genotoxische und mutagene Wirkungen
2.1.8.3.1 Genotoxizität und Mutagenität in vitro
Acrylamid induziert im Ames-Test mit den Salmonella typhimurium Stämmen TA 1535,
TA 1537, TA 98, TA 100 und Escherichia Coli WP2uvrA- sowohl mit als auch ohne
metabolische Aktivierung keine Genmutationen. Im Gegensatz dazu zeigt Glycidamid im
Ames-Test mit Salmonella typhimurium TA 100 und TA 1535 mit und ohne metabolische
Aktivierung positive Ergebnisse [Hashimoto und Tanii, 1985; Tsuda et al., 1993]. Tsuda et al.
untersuchten darüber hinaus das mutagene Potential von Acrylamid im HPRT-Test mit V79-
Zellen, wobei bis zur höchsten getesteten Konzentration von 7 mM kein Anstieg in der
Mutationsrate beobachtet wurde [Tsuda et al., 1993]. In früheren Arbeiten im Arbeitskreis
wurde gezeigt, dass Acrylamid im HPRT-Test mit V79-Zellen bis zu einer Konzentration von
10 mM negative Ergebnisse zeigt. Dagegen führte Glycidamid bereits ab einer Konzentration
von 0,8 mM zu Mutationen. Im Comet Assay (Einzelzellgelelektrophorese) mit humanen
Lymphocyten zeigte Acrylamid nach vierstündiger Inkubationszeit mit bis zu 6 mM keine
Effekte, wohingegen Glycidamid bereits ab Konzentrationen von 0,3 mM zu einem Anstieg
der DNA-Strangbrüche führte [Baum et al., 2005]. Bei Erhöhung der Sensitivität des Comet
Assays durch das bakterielle DNA-Reparatur-Enzym Formamidopyrimidin-DNA-glykosylase
(FPG) induziert Glycidamid in humanen Lymphocyten bei ebenfalls vierstündiger Inkubation
bereits ab 10 µM DNA-Strangbrüche [Thielen et al., 2006].
2.1.8.3.2 Genotoxizität in vivo
Nach wiederholter Verabreichung von 1-30 mg Acrylamid/kg KG/d über 7 Tage an CBA-
Mäuse wurde bereits bei der niedrigsten Dosis ein Anstieg der Mikrokern-Bildung in
Knochenmarkszellen beobachtet. Die niedrigen DNA-Gehalte der Mikrokerne deuteten nicht
auf die Anwesenheit vollständiger Chromosomen hin, so dass für die genotoxische Wirkung
von Acrylamid vermutlich ein klastogener Mechanismus in Frage kommt [Abramsson-
Theoretische Grundlagen
- 19 -
Zetterberg, 2003]. In einer weiteren Studie wurde nach Gabe von 1,5-
6 mg Glycidamid/kg KG an CBA-Mäuse eine dosisabhängige Zunahme von Mikrokernen in
Knochenmarkszellen beobachtet. Dabei wurde eine ähnliche Mikrokernfrequenz pro Einheit
der in vivo Dosis gefunden wie bei einer vorausgegangenen Studie, bei der die Tiere mit
Acrylamid behandelt wurden und Glycidamid als Metabolit entstand. Diese Ergebnisse
deuten darauf hin, dass Glycidamid einen wesentlichen Beitrag zur Genotoxizität von
Acrylamid leistet [Paulsson et al., 2003b; Paulsson et al., 2002].
Acrylamid zeigte im dominanten Letaltest an Mäusen und Ratten positive Ergebnisse
[Chapin et al., 1995; Tyl et al., 2000]. Bei der Prüfung auf außerplanmäßige DNA-Synthese
(UDS-Assay) waren die Ergebnisse in Spermatocyten von Mäusen und Ratten positiv und in
Ratten-Hepatocyten negativ [Sega et al., 1990; Butterworth et al., 1992].
2.1.8.4 Kanzerogenität
Die kanzerogene Wirkung von Acrylamid wurde in Studien mit Mäusen und Ratten
untersucht. Nach oraler bzw. intraperitonealer Gabe von 1–30 mg Acrylamid/kg KG/d an A/J-
Mäuse wurde ein dosisabhängiger Anstieg von Lungenadenomen festgestellt [Bull et al.,
1984]. Nach Verabreichung von 0,01–2 mg Acrylamid/kg KG/d über Trinkwasser an F344-
Ratten wurden nach einer maximalen Behandlungszeit von 24 Monaten bei den männlichen
Tieren ab einer Dosis von 2 mg Acrylamid/kg KG/d eine signifikante Erhöhung der
Schilddrüsentumore sowie ab 0,5 mg Acrylamid/kg KG/d peritoneale Mesotheliome in der
Hodenregion beobachtet. Bei den weiblichen Tieren wurden in der höchsten Dosisgruppe
Tumore der Schilddrüse, Brustdrüse, Zentralnervensystem, Mundhöhle und Uterus
festgestellt [Johnson et al., 1986]. In einer weiteren Studie mit Fischer 344 Ratten mit Dosen
von bis zu 3 mg Acrylamid/kg KG/d wurden nach 2-jähriger Behandlungszeit ebenfalls
Tumore der Schilddrüse (ab 1 mg Acrylamid/kg KG/d) in beiden Geschlechtern sowie
peritestikuläre Mesotheliome in den männlichen Tieren (ab 2 mg Acrylamid/kg KG/d),
Tumore der Brustdrüse und Fibroadenome in den weiblichen Tieren (ab
1 mg Acrylamid/kg KG/d) festgestellt [Friedman et al., 1995].
Zur Untersuchung der kanzerogenen Wirkung von Acrylamid am Menschen wurden eine
Reihe von epidemiologischen Studien durchgeführt. In Kohortenstudien mit exponierten
Arbeitern wurde im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung keine signifikante Erhöhung der
Tumorinzidenz beobachtet [Collins et al., 1989; Marsh et al., 1999; Sobel et al., 1986].
Darüber hinaus konnte in Studien mit der Allgemeinbevölkerung keine statistisch signifikante
Korrelation zwischen erhöhten Acrylamid-Gehalten in der Nahrung und dem Auftreten von
Tumorerkrankungen gezeigt werden [Mucci et al., 2003, 2004, 2005, 2006; Pelucchi et al.,
2006]. Allerdings ist die statistische Aussagekraft dieser Studien aufgrund der geringen
Theoretische Grundlagen
- 20 -
Größe der Kohorten sowie Defiziten bei der Erhebung der Exposition und Berücksichtigung
von Störfaktoren als kritisch zu bewerten [Carere, 2006].
Für die im Tierversuch kanzerogene Wirkung von Acrylamid werden verschiedene
Mechanismen diskutiert. Aufgrund der DNA-alkylierenden Wirkung von Glycidamid gilt ein
genotoxischer Mechanismus als sehr wahrscheinlich. Darüber hinaus könnten die häufig in
hormonabhängigen Organen aufgetretenen Tumore auf Störungen des endokrinen Systems
zurückgeführt werden. Da sowohl Acrylamid als auch Glycidamid eine hohe Reaktivität
gegenüber nukleophilen Zentren in Makromolekülen zeigen, könnten durch Beeinflussung
von z. B. Enzymen oder Rezeptoren zelluläre Funktionen beeinträchtigt werden [Carere,
2006].
Theoretische Grundlagen
- 21 -
2.2 Acrolein
2.2.1 Allgemeine Grundlagen
Bei Acrolein (2-Propenal; MR=56,06 g/mol) handelt es sich um eine
farblose bis gelbliche, bei Raumtemperatur leichtbewegliche und
brennbare Flüssigkeit von stechendem Geruch. Als α,β-ungesättigte
Carbonylverbindung neigt Acrolein sehr leicht zu Polymerisations-
bzw. Additionsreaktionen und ist daher in reinem Zustand wenig stabil.
Acrolein ist ein wichtiges Zwischenprodukt bei der Herstellung von Acrylsäure und
Polymeren. [Eisenbrand et al., 2006; Roempp online]
2.2.2 Expositionsquellen
Eine Hauptexpositionsquelle für Acrolein stellt die Atmosphäre dar. Durch unvollständige
Verbrennungsprozesse enthält Luft durchschnittlich 14,3 µg Acrolein/m3 [EPA, 2003]. Bei
einem mittleren Atemvolumen des Menschen von ca. 20 m3/24 h entspricht dies einer
Acrolein-Exposition von 286 µg/d [ECHA, 2008].
Im Hauptstromrauch von Zigaretten konnten 56-118 µg Acrolein nachgewiesen werden.
Dabei wurde gezeigt, dass sich die Acrolein-Bildung mit steigendem Glycerin- und
Zuckergehalt des Tabaks erhöht [Carmines und Gaworski, 2005; Talhout et al., 2006].
Auch Lebensmittel sind eine Expositionsquelle für Acrolein. Himbeeren, Trauben, Erdbeeren
und Brombeeren enthalten 10-50 µg Acrolein/kg. Höhere Konzentrationen sind in Käse (290-
1300 µg Acrolein/kg) sowie Rotwein (bis zu 3800 µg Acrolein/kg) enthalten [Eisenbrand et
al., 2006].
O
HAbb. 2.6: Acrolein
Theoretische Grundlagen
- 22 -
In überhitzten Speisefetten kann Acrolein durch Dehydratisierung von Glycerin sowie
Lipidperoxidation entstehen [Esterbauer et al., 1991]. Dabei kann durch β-Spaltung von
Fettsäurehydroperoxiden Acrolein freigesetzt werden (Abb. 2.7).
COOH
COOH
OOH
O
H
OOH O
H
O
H
O
H
+
Acrolein
Bildung von Hydroperoxiden
Bildung von Hydroperoxiden
β-Spaltung
β-Spaltung
Abb. 2.7: Postulierter Mechanismus der Bildung von Acrolein aus Arachidonsäure; modifiziert nach [Esterbauer et al., 1991]
Theoretische Grundlagen
- 23 -
In erhitzten Lebensmitteln kann die thermische Zersetzung von Aminosäuren wie Methionin
und Threonin zur Bildung von Acrolein führen. Dabei wird Methionin durch Strecker-Abbau in
Methional überführt. Aus Methional kann durch Retro-Michael-Addition Methanthiol und
Acrolein entstehen. Des Weiteren führt die Oxidation von Methional zum Methionalsulfoxid,
welches in Methylsulfensäure und Acrolein gespalten werden kann [Ballance, 1961; Mottram
et al., 2002; Stevens und Maier, 2008]. Threonin bildet über den Strecker-Abbau 2-
Hydroxypropanal, dessen Dehydratisierung wie in Abb. 2.8 gezeigt zum Acrolein führt [Li und
Ho, 2005].
S
NH2O
OH
R1O
O R2
S
NO
O
R2
O
R1
H
S
N
R2
OH
R1
S
O
S
OH
O
S
O
OS+
OH
OS CH3
OH
O
SH CH3
-H2O -CO2
[O], H2ONH3, R1-(CO)2-R2Methionin Schiff´sche Base
Methional
Retro-MichaelAddition
Acrolein
[O]
AcroleinMethionalsulfoxid
Abb. 2.8: Mechanismus zur Bildung von Acrolein aus Methionin; modifiziert nach [Stevens und Maier, 2008]
Theoretische Grundlagen
- 24 -
Bei der Zubereitung von kohlenhydrathaltigen Lebensmitteln kann Acrolein im Verlauf der
Maillard-Reaktion entstehen [Yaylayan et al., 1999; Yaylayan und Keyhani, 2000]. Dabei
führt die Enolisierung von Hydroxypropanon, welches z. B. durch 3,4-Retro-Aldol-Spaltung
(3,4-RAS) aus 1-Desoxyglucoson entsteht, zu 2-Hydroxypropanal. Die Dehydratisierung von
2-Hydroxypropanal hat die Bildung von Acrolein zur Folge (Abb. 2.9).
CH
CH
CH
CH
CH2 OH
OH
OH
OH
OH
O H
CH
CH
CH
CH
CH2 OH
OH
OH
OH
OH
RN H
CH
CH
CH
C
CH2 OH
OH
OH
OH
O H
CH
CH
CH2
C
CH2 OH
O
OH
OH
O H
CH
C
OH
O H
O H
CH2
C
CH2 OH
OH
CH3
C
CH2 OH
O
C
CH
CH
CH
CH2 OH
OH
OH
OH
O
N H
H
R
C
CH
CH2
C
CH2 OH
O
OH
O
N H
H
R
C
C
O
N H
HO
H
R
CH3
C
CH2 OH
O
C
C
CH
CH
CH2 OH
OH
OH
O
O
CH3
C
CH
CH
C
CH2 OH
O
OH
OH
O
CH3
C
CH2OH
O
CH3
C
C
CH2 OH
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
O O
RNH2
H2O
RNH2
Amadori-Verbindung
-H2O
-H2O
3,4-RAS
3,4-RAS
3,4-RAS
1-Desoxyglucoson
-H2O
AcroleinHydroxypropanon
a)
b)
2-Hydroxypropanal Abb. 2.9: Mechanismen zur Entstehung von a) Hydroxypropanon im Verlauf der Maillard-Reaktion und b) Acrolein aus Hydroxypropanon; RAS: Retro-Aldol-Spaltung; modifiziert nach [Yaylayan et al., 1999; Yaylayan und Keyhani, 2000; Stevens und Maier, 2008]
Theoretische Grundlagen
- 25 -
Eine wichtige endogene Expositionsquelle für Acrolein ist die Myeloperoxidase (MPO)-
vermittelte Oxidation von Threonin. Dabei entsteht der Acrolein-Precursor 2-
Hydroxypropanal (Abb. 2.10), welcher durch Dehydratisierung in Acrolein umgewandelt wird
[Anderson et al., 1997]. Darüber hinaus führt der Aminooxidase (AO)-vermittelte Abbau von
Spermin (Abb. 2.11) zur Bildung von Acrolein [Lee und Sayre, 1998; O`Brien et al., 2005].
OH
NH2
O
OH
OH
N
O
O
H
Cl
H
OH
NH
OH
OO
Threonin
H2O2 Cl-
MPO
H2OOH-
CO2Cl-
H2O
-H2O
NH3
Acrolein Abb. 2.10: Endogene Bildung von Acrolein durch Myeloperoxidase (MPO)-vermittelte Oxidation von Threonin [modifiziert nach Anderson et al., 1997; Stevens und Maier, 2008]
NH2 NH
NH
NH2
NH2 NH
NH
O
O
NH2 NH
NH2
O
NH2
NH2
Spermin
NH3
[O]AO
Retro-Michael- Addition
Acrolein
Spermidin
NH3
[O]AO
+
Putrescin
Acrolein
Abb. 2.11: Endogene Bildung von Acrolein durch Aminooxidase (AO)-vermittelten Abbau von Spermin; modifiziert nach [Stevens und Maier, 2008]
Theoretische Grundlagen
- 26 -
2.2.3 Toxikokinetik von Acrolein
Bei Acrolein handelt es sich um das stärkste Elektrophil unter den α,β-ungesättigten
Aldehyden [Witz et al., 1987]. Absorbiertes Acrolein reagiert daher unmittelbar mit Thiol-
sowie primären und sekundären Amino-Gruppen [Ghilarducci und Tjeerdema, 1995;
Esterbauer et al., 1991], weswegen die systemische Verteilung von Acrolein als gering
einzuschätzen ist [EPA, 2003]. Parent et al. zeigten, dass nach oraler Gabe von 2,5 mg 14C-
Acrolein/kg KG/d an Sprague Dawley Ratten 7 Tage nach der Dosierung weniger als 0,7 %
der Gesamtradioaktivität im Gewebe gefunden wird [Parent et al., 1996].
Der Metabolismus von Acrolein ist in Abb. 2.12 gezeigt. Die wichtigste
Metabolisierungsreaktion von Acrolein stellt die Konjugation mit GSH und der anschließende
Abbau zur Mercaptursäure N-Acetyl-S-(3-oxopropyl)cystein (OPMA) dar. Durch Reduktion
der Aldehydgruppe entsteht N-Acetyl-S-(3-hydroxypropyl)cystein (HPMA), wobei es sich um
den Hauptmetaboliten von Acrolein im Urin von Ratten handelt [Sanduja et al., 1989],
während die Oxidation zur Bildung von N-Acetyl-S-(2-carboxyethyl)cystein (CEMA) führt.
Durch die Michael-Addition von Wasser an Acrolein entsteht 3-Hydroxypropanal, das durch
Oxidation in 3-Hydroxypropionsäure und anschließend in Malon- und Oxalsäure überführt
wird. Die Bildung von Malon- und Oxalsäure ist vermutlich auf die Darmflora zurückzuführen,
da diese Metabolite bei intravenöser Verabreichung nicht detektiert wurden [Parent et al.,
1998]. Die enzymatische Epoxidierung von Acrolein führt zur Bildung von Glycidaldehyd,
welcher überwiegend mit GSH konjugiert und als N-Acetyl-S-(2-carboxy-2-
hydroxyethyl)cystein ausgeschieden wird [Parent et al., 1998]. Darüber hinaus kann
Glycidaldehyd über Epoxidhydrolase zum Glyceraldehyd hydrolisiert werden [Patel et al.,
1980]. Durch Retro-Michael-Addition kann Acrolein aus OPMA bzw. OPMA-Sulfoxid erneut
freigesetzt werden [Hashmi et al., 1992].
Parent et al. untersuchten den Metabolismus von Acrolein nach oraler Verabreichung von
2,5 mg 2,3-14C-Acrolein/kg KG an Sprague-Dawley Ratten. Dabei wurden durchschnittlich
57 % der verabreichten Gesamtradioaktivität nach 7 Tagen im Urin gefunden und die
ausgeschiedenen Anteile von Oxalsäure, N-Acetyl-S-(2-carboxy-2-hydroxyethyl)cystein,
CEMA, HPMA und 3-Hydroxypropionsäure lagen bei 17-35 %, 8-18 %, 3-12 %, 23-41 % und
6-31 % der gemessenen Gesamtradioaktivität im Urin [Parent et al., 1996; 1998]. Nach
oraler Gabe von 13 mg Acrolein/kg KG an männliche Sprague-Dawley Ratten wurden nach
24 Stunden mehr als 78 % der verabreichten Dosis als HPMA über den Urin ausgeschieden
[Sanduja et al., 1989].
Acrolein kann als α,β-ungesättigte Carbonylverbindung leicht mit nucleophilen Stellen in
Proteinen und der DNA reagieren, was zu genotoxischen Wirkungen führen kann. Wang et
Theoretische Grundlagen
- 27 -
al. zeigten, dass Acrolein DNA-Addukte mit Desoxyguanosin bildet, wobei das γ-OH-
Acrolein-dG-Addukt überwiegt [Wang et al., 2008].
O
NH
NH
COOH
NH2
HOOC
O
OS
O
NH
S
O
O
CH3 COOH
NH
S+
OH
O
CH3 COOH
O
O
NH
SO
CH3 COOH
OH
COOHHOOC
NH
S
OH
O
CH3 COOHNH
SO
CH3 COOH
COOH
O
OH
OH
COOH
COOHHOOC
OO
O
OH
OHNH
SO
CH3 COOH
COOH
OH
N
N
N
N
N
dR
O
H
OH
N
N
N
N
N
dR
O
H
OHAcrolein
Acrolein-GSH-Addukt
γ-GlutamyltranspeptidaseCysteinylglycinase
N-Acetyltransferase
N-Acetyl-S-(3-oxopropyl)cysteinOPMA
OPMA-Sulfoxid
+
Sulfensäure
FMO?
ADH
AKR
DNA-Alkylierung
ADH
Malonsäure
H2O
[O]
N-Acetyl-S-(3-hydroxypropyl)cysteinHPMA
N-Acetyl-S-(2-carboxyethyl)cysteinCEMA
Oxalsäure
3-Hydroxypropionsäure
Glycidaldehyd
Glyceraldehyd
EHH2O
GSH
N-Acetyl-S-(2-carboxy-2-hydroxyethyl)cystein
Acrolein
[O]
α-OH-Acrolein-dG
γ-OH-Acrolein-dG
Abb. 2.12: Metabolismus von Acrolein; ADH: Aldehyd-Dehydrogenase, AKR: Aldo-Keto-Reduktase, FMO: Flavin-Monooxigenase, EH: Epoxid-Hydrolase, GSH: Glutathion
Theoretische Grundlagen
- 28 -
2.2.4 Toxikodynamik von Acrolein
2.2.4.1 Akute, subchronische und chronische Toxizität
Bei Ratten wurde für Acrolein eine orale LD50 in einem Bereich von 39-56 mg/kg KG
bestimmt [Smyth et al., 1951]. Bei Beagle-Hunden, die Acrolein über einen Dosisbereich von
0,1-2 mg/kg KG/d in Gelatinekapseln über 53 Wochen erhielten, trat dosisabhängig
vermehrtes Erbrechen auf [Parent et al., 1992a]. Bei Ratten bewirkte die Verabreichung von
Acrolein (0,05, 0,5 und 2,5 mg/kg KG/d) mittels Schlundsonde über 102 Wochen eine
Abnahme der Kreatininphosphokinase im Serum aller Dosisgruppen und einen Anstieg der
Mortalität in den beiden höheren Dosisgruppen. Andere Wirkungen, insbesondere eine
erhöhte Tumorinzidenz, wurden nicht beobachtet [Parent et al., 1992b]. Mäuse, denen
Acrolein (0,5, 2 und 4,5 mg/kg KG/d) mit der Schlundsonde über 18 Monate verabreicht
wurde, zeigten verminderte Körpergewichtszunahme und erhöhte Mortalität bei männlichen
Tieren in der höchsten Dosisgruppe, aber ebenfalls keine erhöhte Tumorhäufigkeit [Parent et
al., 1991]. In einer weiteren Langzeitstudie an Ratten (100, 250 und 625 mg Acrolein/l
Trinkwasser über maximal 124 Wochen) wurde keine dosisbezogene signifikant erhöhte
Tumorinzidenz im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet [Lijinski und Reuber, 1987].
2.2.4.2 Genotoxizität und Mutagenität
Acrolein zeigte im Ames-Test mit Salmonella typhimurium TA 104 ohne externe
metabolische Aktivierung mutagenes Potential [Marnett et al., 1985], ebenso mit Salmonella
typhimurium TA 1535 nach metabolischer Aktivierung [Hales, 1982]. Mit Escherichia coli
WP2 uvrA wurde ohne metabolische Aktivierung schwache Mutagenität beobachtet
[Hemminki et al., 1980]. Bei Verwendung der Salmonella typhimurium-Stämme TA 98 und
TA 100 wurde sowohl über positive als auch negative Ergebnisse berichtet [Haworth et al.,
1983]. Acrolein induzierte in vitro in humanen Bronchialepithelzellen Schwester-Chromatid-
Austausch-Ereignisse (SCEs) [Au et al., 1980] und DNA-Einzelstrangbrüche [Grafström et
al., 1986, 1988]. Acrolein ist stark mutagen gegenüber isolierten Fibroblasten von Xeroderma
pigmentosum-Patienten (mit defektem Nukleotid-Exzisions-Reparatursystem), während in
normalen humanen Fibroblasten keine Mutagenität beobachtet wurde [Curren et al., 1988].
Theoretische Grundlagen
- 29 -
2.3 GC-MS und Prinzip der chemischen Ionisierung (CI)
Das Prinzip der GC-MS eignet sich für die qualitative und quantitative Bestimmung von
mittel- bis unpolaren Substanzen, welche über eine ausreichende thermische Stabilität und
Flüchtigkeit verfügen. Bei der direkten Kopplung eines Gaschromatographen mit einem
Massenspektrometer wird das Trägergas der GC-Säule über ein beheiztes Interface in die
Ionenquelle des Massenspektrometers überführt. Dabei gehören die
Elektronenstoßionisation und die chemische Ionisation zu den am häufigsten verwendeten
Ionisationstechniken.
Bei der Elektronenstoßionisation (EI) wird senkrecht zum Molekülstrom der Probe ein
Elektronenstrahl von einer Glühkathode zu einer Anode hin beschleunigt. Bei der
Wechselwirkung der Elektronen mit den Molekülen der Probe kann entweder die zur
Abspaltung eines Elektrons notwendige Energie aufgenommen werden (Bildung von
positiven Ionen) oder ein Elektron in ein unbesetztes Orbital gelangen (Bildung von
negativen Ionen). Die entstehenden Molekülionen sind nur stabil, wenn die Wechselwirkung
mit energiearmen (thermischen) Elektronen erfolgt. Bei höheren Elektronenenergien, wie sie
jedoch für die EI-Ionenquelle typisch sind, kommt es zur Fragmentierung der Molekülionen,
was zu komplexen Massenspektren sowie verminderter Sensitivität und Selektivität führt. Der
Vorteil der chemischen Ionisation liegt in der praktisch ausschließlichen Bildung von
Molekülionen durch die gezielte Unterdrückung der Fragmentierung. Dabei wird in eine
modifizierte EI-Ionenquelle zusammen mit der zu analysierenden Substanz ein großer
Überschuss eines Reaktantgases (z.B. Methan) eingebracht, das durch Elektronenbeschuss
ionisiert wird:
CH4 + e-(230eV) → CH4
+ + 2e-(thermal)
Bei dieser Stoßionisation des Reaktantgases entstehen sekundäre Elektronen mit niedriger
(thermischer) Energie, die auf Probenmoleküle mit ausreichend hoher Elektronenaffinität
übertragen werden können. Durch Umsetzung der Analytmoleküle mit
Derivatisierungsreagenzien, die eine hohe Elektronenaffinität besitzen, kann die Effektivität
der Ionisierung gesteigert werden. [Budzikiewicz und Schäfer, 2005; Harrison, 1992]
Theoretische Grundlagen
- 30 -
2.4 HPLC-ESI-MS/MS und Prinzip der Elektrospray-Ionisierung
(ESI)
Die Kopplung von Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)-Systemen mit der
Massenspektrometrie (MS) eignet sich für die qualitative und quantitative Bestimmung von
polaren, schwer flüchtigen oder auch thermisch labilen Verbindungen. Im Gegensatz zur GC-
MS müssen für die HPLC-MS Kopplung die Analyten aus der mobilen, flüssigen Phase in die
Gasphase unter Hochvakuum (10-5 torr) überführt werden, was hohe Anforderungen an die
HPLC-MS Kopplungssysteme (Interfaces) stellt. Aufgund des breiten Anwendungs-
spektrums, der Robustheit und hohen Empfindlichkeit für eine Vielzahl von polaren und
mittelpolaren Analyten sind die Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) und die
Elektrospray Ionisation (ESI) die am häufigsten eingesetzten Kopplungstechniken für HPLC-
MS [Niessen, 1998].
Bei der Elektrosprayionisation (ESI) handelt es sich um eine sehr schonende
Ionisierungsmethode. Dabei werden die aus der HPLC-Säule austretenden Probenmoleküle
durch eine geladene Sprühkapillare geleitet. Bei Flussraten > 50 µl/min wird zum Versprühen
und Verdampfen des Fließmittels ein Hilfsgas („Vernebelungsgas“, z. B. Stickstoff)
eingesetzt. Senkrecht zum Spray kann ein aufgeheizter Stickstoffstrom („Turbogas“)
zugeführt werden, um die Verdampfung des Lösungsmittels und damit die Effizienz der
Ionenbildung zu erhöhen. Durch Anlegen hoher Spannungen wird am Ende der
Sprühkapillare ein Flüssigkeitskonus („Taylor-Cone“) gebildet, in welchem sich entsprechend
der Feldrichtung positive oder negative Ionen ansammeln und aus dem schließlich geladene
Tröpfchen entstehen (Abb. 2.13). Das Prinzip der „Ionenverdampfung“ besteht darin, dass
Nebeltröpfchen erzeugt werden, die einen Überschuss an positiven oder negativen
Ladungsträgern enthalten. Durch Verdampfung kommt es zu einem Verlust von neutralen
Lösungsmittelmolekülen, wodurch die Oberflächenladung/cm2 wegen des kleiner werdenden
Tröpfchenradius bis zu einem Grenzwert zunimmt, dem sogenannten „Raleigh limit“, bei dem
die Coulomb-Abstoßung der gleichsinnigen Ladungen die Oberflächenspannung übersteigt.
Es kommt zum Zerfall in kleinere Tröpfchen, wobei sich dieser Prozess mehrfach
wiederholen kann. Zuletzt bleiben nach dem „charged residue model“ entweder nur noch
geladene Ionen zurück oder es kommt zum Austritt von Ionen aus dem Tropfen in die
Gasphase („ion evaporation model“). Die Ionen treten bei Atmosphärendruck in die
Gasphase über und werden durch ein elektrisch geladenes Linsensystem in das unter
Hochvakuum stehende Massenspektrometer überführt, wobei Luft- und
Lösungsmitteldämpfe abgesaugt werden. [Gaskell, 1997; Budzikiewicz und Schäfer, 2005]
Theoretische Grundlagen
- 31 -
Vernebelungs-gas
HPLC
Turbogas
Hochspannung
AbgasBildung von
geladenen Tröpfchen
Verdampfungdes Lösungsmittels
Coulomb-Explosion
Curtain gas
Curtain gas
Orifice
Massen-analysator
Vernebelungs-gas
HPLC
Turbogas
Hochspannung
AbgasBildung von
geladenen Tröpfchen
Verdampfungdes Lösungsmittels
Coulomb-Explosion
Curtain gas
Curtain gas
Orifice
Massen-analysator
Abb. 2.13: Schematische Darstellung der Elektrosprayionisierung; modifiziert nach [Applied Biosystems, 2008]
2.5 Triple-Quadrupol-Tandemmassenspektrometer
Ein Quadrupol besteht aus vier parallel im Quadrat angeordneten Metallstäben, von denen
kreuzweise jeweils zwei miteinander leitend verbunden sind. Die Ionentrennung erfolgt durch
Ablenkung mit Hilfe elektrischer Felder. Dabei wird an jeweils zwei gegenüberliegende Stäbe
eine Wechselspannung angelegt, so dass sich im Wechsel positive und negative Felder
relativ zur Mittelachse aufbauen. Positive Ionen, die sich zwischen den Stäben befinden,
werden während der positiven Phase zur Mittelachse und bei negativer Polarisierung zu den
Stäben hin beschleunigt. Die seitliche Ablenkung der Ionen hängt von der angelegten
Spannung, der Frequenz (Dauer der Einwirkung der alternierenden Felder) und der Masse
der Ionen ab. Die Überlagerung der Wechselspannung von zwei gegenüberliegenden
Stäben (A und C, Abb. 2.14) mit einer positiven Gleichspannung bewirkt eine generelle
Ablenkung zur Mittelachse. Bei schweren Ionen überwiegt der Einfluss der Gleichspannung,
während leichte Ionen bis zu einer bestimmten Masse so stark ausschwingen, dass sie die
entgegengesetzt geladenen Stäbe treffen und entladen werden. An die Stäbe B und D wird
eine im Vergleich zu A und C versetzte Wechselspannung und eine negative
Gleichspannung angelegt; letztere bewirkt, dass Ionen über einer bestimmten Masse zu den
Stäben hin abgelenkt werden, während bei niedrigen Massen das positive Feld der
Wechselspannung ausreicht, die Ionen zur Mitte des Stabsystems zu beschleunigen.
Theoretische Grundlagen
- 32 -
I II
A C
D
B
I II
A C
D
B
Abb. 2.14: Schematische Darstellung der Ionenbewegung im Quadrupol; I) Seitenansicht , II) Vorderansicht; modifiziert nach [Applied Biosystems, 2008]
Durch geeignete Abstimmung der Gleich- und Wechselspannungen wird erreicht, dass
jeweils nur Ionen einer bestimmten Masse den Quadrupol passieren können. [Miller und
Denton, 1986]
Triple-Quadrupol-Tandemmassenspektrometer zeichnen sich durch eine hohe
Empfindlichkeit und Spezifität aus, wobei mehrere Massenanalysatoren (Quadrupole)
hintereinander angeordnet sind. Für die Spurenanalytik in komplexen Matrices wird häufig im
Multiple Reaction Monitoring (MRM)-Modus gearbeitet (Abb. 2.15).
Quadrupol 1 Quadrupol 3Kollisionszelle(Quadrupol 2)
Quadrupol 1 Quadrupol 3Kollisionszelle(Quadrupol 2)
Abb. 2.15: Schematische Darstellung des Multiple Reaction Monitoring (MRM) [Applied Biosystems, 2008]
Theoretische Grundlagen
- 33 -
Dabei dient der erste Quadrupol zur Auswahl des zu untersuchenden Analytions, während
der zweite Quadrupol nur mit einer Wechselspannung versorgt und als Kollisionszelle
verwendet wird. Diese dient zur Erzeugung von spezifischen Fragmentionen aus dem
Analyten und Fokussierung des Ionenstrahls, um insbesondere Streuverluste durch
Coulomb-Abstoßung zu minimieren. Die erzeugten Fragmentionen werden anschließend im
dritten Quadrupol selektiv analysiert. [Budzikiewicz und Schäfer, 2005]
Problemstellung
- 34 -
3 Problemstellung
Die Bioverfügbarkeit von Acrylamid aus Lebensmitteln und die Frage nach einer niedrigsten
genotoxisch wirksamen Dosis im lebenden Organismus, sind derzeit zentrale offene Fragen
für die Risikobewertung von Acrylamid. Für die Risikobewertung entscheidend ist der
Abstand zwischen dieser niedrigsten biologisch aktiven Konzentration und jenen
Konzentrationen, die unter ungünstigen Umständen im Organismus maximal erreicht werden
können. Die Höhe der Glycidamid-Konzentration im Blut wird durch eine Reihe von Faktoren
determiniert, insbesondere durch das Ausmaß der
• Freisetzung von Acrylamid aus Lebensmitteln im Verdauungstrakt,
• Aufnahme von Acrylamid durch die Darmwand,
• Acrylamid-Metabolisierung zu Glycidamid (vor allem in der Leber),
• Bindung von Acrylamid/Glycidamid an „unkritische“ Moleküle wie Blutproteine
oder Glutathion.
Tierstudien zur Bioverfügbarkeit und zu biologischen Wirkungen (einschließlich
Kanzerogenität) von Acrylamid wurden bisher fast ausschließlich durch orale Applikation von
Acrylamid über Trinkwasser durchgeführt [Sumner et al., 1992; Fennell et al., 2005;
Friedman et al., 1995; Johnson et al., 1986]. Es existieren nur wenige Studien zum Einfluss
der Lebensmittelmatrix auf die Bioverfügbarkeit und daraus resultierende biologische
Wirkungen, wobei stark unterschiedliche Matrixeffekte beobachtet wurden [Doerge et al.,
2007; Bjellaas et al., 2007]. Zudem wurden Tierstudien in der Regel mit Dosierungen im
Bereich von 1 mg/kg KG/d und darüber durchgeführt. In diesem Dosisbereich, der erheblich
über jenem liegt, der bei Exposition über Lebensmittel zu erwarten ist, wurden genotoxische
bzw. kanzerogene Wirkungen festgestellt.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, im Tierversuch an der Ratte zu untersuchen, inwieweit
spezifische Lebensmittelmatrices die Bioverfügbarkeit von Acrylamid beeinflussen.
Lebkuchen als zuckerhaltiges, fettarmes und trockenes Lebensmittel auf Getreidebasis und
Pommes frites (fett- und wasserreich; Kartoffelbasis) die entweder direkt aus der Kartoffel
geschnitten (mit intakter Gewebestruktur) oder aus Kartoffelerzeugnissen „rekombiniert“
wurden, sowie Brotkruste sollen vergleichend getestet werden. Hierzu wurden durch
geeignete Verfahren im Lebensmittel Acrylamidgehalte erzeugt, wie sie unter ungünstigen
Herstellungsbedingungen zu erwarten sind. Die Lebensmittel werden an männliche Sprague-
Dawley-Ratten verfüttert, wobei die tägliche Acrylamid-Dosis auf 100 µg/kg KG für Pommes
frites und Lebkuchen bzw. 50 µg/kg KG für Brotkruste eingestellt werden soll. Änderungen in
der Bioverfügbarkeit und biologischen Wirkung von Acrylamid sollen mit Biomarkern erfasst
werden, die eine Bilanzierung der Acrylamid-Aufnahme und Ausscheidung über 24 Stunden
sowie über den gesamten Expositionszeitraum ermöglichen. Weiterhin soll eine Abschätzung
Problemstellung
- 35 -
des Ausmaßes der Biotransformation von Acrylamid zu Glycidamid ermöglicht werden. Als
Bezugsgröße dient jeweils die Aufnahme von Acrylamid über Trinkwasser
(Schlundsondierung).
Als kumulativer Langzeit-Expositionsbiomarker sollen Addukte von Acrylamid und
Glycidamid mit dem endständigen Valin am Hämoglobin mit Hilfe einer im Arbeitskreis
bereits etablierten GC-MS Methode bestimmt werden.
Einen Hauptentgiftungsweg für Acrylamid und Glycidamid stellt die Konjugation mit dem
Tripeptid Glutathion dar. Als Kurzzeit-Expositionsbiomarker für Aufnahme, Entgiftung und
Ausscheidung von Acrylamid, sowie dessen Biotransformation zu Glycidamid im Organismus
über einen Zeitraum von 24 Stunden sollen Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren
(AAMA und GAMA) als Abbauprodukte der Glutathionaddukte im Urin der Tiere bestimmt
werden. Für die Ermittlung der Gesamtbilanz an Acrylamid-Ausscheidung aus dem
Organismus soll zusätzlich die Acrylamid- und Glycidamid-Ausscheidung über den Urin
erfasst werden. Dazu war die Entwicklung und Etablierung geeigneter HPLC-MS/MS- und
Festphasenextraktions-Methoden notwendig.
Darüber hinaus sollen zur Untersuchung der Resorptionskinetik von Acrylamid bei
Verabreichung über Lebensmittel über einen Zeitraum von 4 Stunden die Acrylamid- und
Glycidamid-Gehalte in Rattenserum bestimmt werden.
Um die Acrylamid-Exposition aus der Bioverfügbarkeitsstudie mit der Belastung durch
andere α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen zu vergleichen, soll durch eine geeignete
HPLC-MS/MS- bzw. SPE-Methode zusätzlich die Exposition mit Acrolein über den Gehalt an
N-Acetyl-S-(3-hydroxypropyl)cystein (HPMA) bestimmt werden.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit liegt in der Untersuchung des Einflusses der CYP450 2E1-
Aktivität auf die Bildung der Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobinaddukte in vivo. Dies
geschieht im Rahmen einer humanen Verzehrsstudie, welche zum Ziel hat, die Rolle der
CYP450 2E1-Aktivität bei der Toxikokinetik von Acrylamid beim Menschen zu
charakterisieren. Dadurch soll die Basis für eine Risikoabschätzung nach Aufnahme von
Acrylamid-haltigen Lebensmitteln verbessert werden. Dazu wird in einer klinischen Studie
der Konzentrations-Zeit-Verlauf von Acrylamid und seinen Metaboliten Glycidamid, AAMA
und GAMA in Plasma und Urin sowie von den Hb-Addukten nach Gabe Acrylamid-reicher
Nahrung jeweils bei unbeeinflusster, gehemmter und induzierter CYP450 2E1-Aktivität
bestimmt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden die Acrylamid- und Glycidamid-Hb-
Addukte im Blut der Probanden in 3 Studienabschnitten jeweils vor und 24 Stunden nach
Aufnahme von Acrylamid über Lebensmittel mit Hilfe der im Arbeitskreis etablierten GC-MS
Methode bestimmt. Dabei soll zunächst untersucht werden, ob eine einmalige Dosis von
15 µg Acrylamid/kg KG (1 mg Acrylamid absolut) mit den Biomarkern AAVal und GAVal zu
Problemstellung
- 36 -
erfassen ist. Des Weiteren sollen mögliche Einflüsse der Hemmung von CYP450 2E1 durch
Disulfiram bzw. der Induktion von CYP450 2E1 durch Vorbehandlung mit Ethanol auf die Hb-
Addukt-Bildung identifiziert werden. Darüber hinaus soll gegebenenfalls durch die
Entwicklung und Etablierung einer empfindlicheren HPLC-MS/MS- sowie einer effizienten
Festphasenextraktions-Methode der zeitliche Verlauf der AAVal- und GAVal-Bildung
untersucht werden.
Um die Anwendbarkeit der etablierten Methoden zu überprüfen und die Ergebnisse mit
denen anderer Arbeitsgruppen zu vergleichen, werden die Hintergrundbelastungen an
AAVal, GAVal, AAMA, GAMA und HPMA in Blut und Urinproben von Rauchern und
Nichtrauchern aus der Allgemeinbevölkerung bestimmt.
Die wesentlichen Ziele der vorliegenden Arbeit liegen in der Untersuchung
• der Bioverfügbarkeit von Acrylamid in Abhängigkeit von der Lebensmittelmatrix,
• der Resorptionskinetik von Acrylamid bei Verabreichung über Lebensmittel,
• des Ausmaßes der Biotransformation von Acrylamid zu Glycidamid in Ratte und
Mensch,
• des Einflusses der CYP450 2E1-Aktivität auf die Bildung der Acrylamid- und
Glycidamid-Hämoglobinaddukte in vivo.
Ergebnisse und Diskussion
- 37 -
4 Ergebnisse und Diskussion
4.1 Einfluss der Lebensmittelmatrix auf die Bioverfügbarkeit von
Acrylamid in der Ratte
Im Rahmen dieser Arbeit wurde als Bestandteil des FEI (Forschungskreis der
Ernährungsindustrie)-Projektes „Entwicklung und Anwendung neuer Verfahrensabläufe in
Produktionsanlagen für Kartoffel- und Getreideerzeugnisse mit reduzierten Gehalten an
Acrylamid und dessen Folgeprodukten“ (AiF 209 ZBG) im Tierversuch an der Ratte
untersucht, inwieweit spezifische Lebensmittelmatrices die Bioverfügbarkeit und den
Metabolismus von Acrylamid beeinflussen. Lebkuchen als zuckerhaltiges, fettarmes und
trockenes Lebensmittel auf Getreidebasis und Pommes frites (fett- und wasserreich;
Kartoffelbasis) die entweder direkt aus der Kartoffel geschnitten (mit intakter
Gewebestruktur) oder aus Kartoffelerzeugnissen „rekombiniert“ wurden, sowie Brotkruste
wurden an männliche Sprague Dawley-Ratten über 1, 3, 5, 7 und 9 Tage verfüttert und mit
der Aufnahme von Acrylamid über Trinkwasser (Schlundsondierung) verglichen (Abb. 4.1).
Die Herstellung der Lebensmittel erfolgte durch Projektpartner, die durch geeignete
Verfahren Acrylamidgehalte erzeugten, wie sie unter ungünstigen Herstellungsbedingungen
zu erwarten sind. Die Acrylamid-Gehalte lagen in der Brotkruste (BK) bei ca. 1400 µg/kg. In
den geschnittenen (PFG) und rekonstituierten Pommes frites (PFR) wurden Acrylamid-
Gehalte von ca. 2800 µg/kg generiert.
15 Tiere pro GruppeAA-arme Standarddiät (< 30 µg/kg Futter;
Bestimmungsgrenze eurofins, interne Methode)
Exposition über 1-9 TageKontrollgruppe (TW)
Trinkwasser, AA-armes Futter
Gruppe 5 (BK)Brotkruste
50 µg/kg KG/dAA-Gehalt: 1400 µg/kg
Gruppe 4 (LK)Lebkuchen
100 µg/kg KG/d4150 ± 800 µg/kg
Gruppe 3 (PFR)Pommes fritesrekonstituiert
100 µg/kg KG/dAA-Gehalt:2800 µg/kg
Gruppe 2 (PFG)Pommes frites
geschnitten100 µg/kg KG/d
AA-Gehalt: 2800 µg/kg
Gruppe 1 (AA-TW)AA-haltigesTrinkwasser
50/100 µg/kg KG/d
Abb. 4.1: Schematische Darstellung der Behandlungsgruppen
Ergebnisse und Diskussion
- 38 -
Im Falle der untersuchten Lebkuchen (LK) wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten mehrere
Kontrollanalysen vorgenommen, wobei stark unterschiedliche Acrylamid-Gehalte (3180-
6320 µg/kg; MW ± SD: 4150 ± 800 µg/kg; Kap. 6.1.1) gemessen wurden. Die Lebensmittel
wurden an männliche Sprague-Dawley-Ratten verfüttert, wobei die tägliche Acrylamid-Dosis
auf 100 µg/kg KG für Pommes frites (PFG; PFR) und Lebkuchen bzw. 50 µg/kg KG für
Brotkruste eingestellt werden sollte. Änderungen in der Bioverfügbarkeit von Acrylamid
sollten mit Biomarkern erfasst werden, die eine Bilanzierung der Acrylamid-Aufnahme und
Ausscheidung über 24 Stunden sowie über den gesamten Expositionszeitraum ermöglichen.
Als Langzeit-Expositionsbiomarker wurden Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem
endständigen Valin am Hämoglobin bestimmt.
Als Kurzzeitmarker für Aufnahme, Entgiftung und Ausscheidung von Acrylamid sowie dessen
Biotransformation zu Glycidamid im Organismus über einen Zeitraum von 24 Stunden
wurden Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren (AAMA und GAMA) als Abbauprodukte
der Glutathion-Addukte im 24-Stunden-Urin der Tiere bestimmt.
Für die Ermittlung der Gesamtbilanz an Acrylamid-Ausscheidung aus dem Organismus
wurde zusätzlich die Acrylamid- und Glycidamid-Ausscheidung über den Urin und im
Rahmen der Diplomarbeit von Natalie Gerhard über Fäces erfasst [Gerhardt, 2008].
Da Lebensmittelmatrices die Kinetik der Acrylamid-Aufnahme durch den Darm beeinflussen
können, wurde in einem weiteren Experiment die Aufnahme von Acrylamid über Pommes
frites (aus der Kartoffel geschnitten; PFG) und Bildung von Glycidamid vergleichend zur
Acrylamid-Aufnahme über Trinkwasser (Schlundsondierung) untersucht. Dazu wurden die
Acrylamid- und Glycidamid-Serumspiegel zum Zeitpunt T = 0 bis zu 4 Stunden nach der
jeweiligen Acrylamid-Gabe bestimmt.
Ergebnisse und Diskussion
- 39 -
4.1.1 Fütterung von Pommes frites (PFG: geschnitten; PFR: rekon-stituiert)
Im Folgenden sind die Ergebnisse nach Fütterung über 1, 3, 5, 7 und 9 Tage dargestellt. Die
tägliche Dosis lag bei 100 µg Acrylamid/kg KG über Pommes frites (PFG/PFR) bzw.
Trinkwasser (AA-TW; Schlundsondierung). Die Blutentnahme erfolgte 24 Stunden nach der
letzten Fütterung und die Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid sowie der
entsprechenden Mercaptursäuren wurde im 24-Stunden-Sammelurin durchgeführt.
4.1.1.1 Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobinaddukte
In Abb. 4.2 und 4.3 sind repräsentative GC-MS-Chromatogramme zur Bestimmung der
Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobinaddukte gezeigt. Dabei wurden die Addukte von
Acrylamid und Glycidamid mit dem endständigen Valin im Hämoglobin durch den
modifizierten Edman-Abbau mittels PFPITC in die entsprechenden AAVal- bzw.
GAValPFPTHs überführt, wobei in einem weiteren Derivatisierungsschritt GAValPFPTH mit
Aceton zum acGAValPFPTH umgesetzt wurde. Die Quantifizierung erfolgte mit den
entsprechenden 7-fach deuterierten internen Standards.
16.6016.8017.0017.2017.4017.6017.8018.0018.2018.4018.6018.8019.0019.200
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000
120000
130000
140000
150000
160000
170000
180000
190000
200000
Time-->
Abundance
Ion 375.00 (374.70 to 375.70): AA Tier 1 M1.D
17.61
AAValPFPTH
FF
FF
F
N
N
OS
NH2
O
Abb. 4.2: GC-MS Chromatogramm zur Bestimmung von AAValPFPTH (100 µg Acrylamid/kg KG über Trinkwasser (AA-TW); einmalige Verabreichung)
Wie Abb. 4.2 verdeutlicht, ergibt die gaschromatographische Auftrennung bereits nach
einmaliger Verabreichung von 100 µg Acrylamid/kg KG im Fall von AAValPFPTH ein
basisliniengetrenntes, gut integrierbares Signal mit einer Retentionszeit von 17,6 Minuten. Im
Gegensatz dazu zeigt das Chromatogramm von acGAValPFPTH (Abb. 4.3) eine höhere
Ergebnisse und Diskussion
- 40 -
Matrixbelastung bei gleichzeitig geringerer Signalintensität des Analyten. Darüber hinaus
kommt es durch das Vorliegen von zwei Stereozentren im Molekül zur Bildung von
Diastereomerenpeaks (Retentionszeiten: 18,5 bzw. 18,6 Minuten), was zusätzlich zu einer
Verringerung der Signalintensität führt [Paulsson et al., 2003; Schettgen et al., 2004]. Das
Vorkommen von Diastereomeren-Paaren ist auch für andere Epoxide wie z. B. Ethylenoxid
oder Propylenoxid beschrieben [Törnqvist, 1994]. Da der zuerst eluierende Peak von
acGAValPFPTH häufig mit Matrixbestandteilen interferierte, wurde lediglich der später
eluierende größere Diastereomerenpeak zur Quantifizierung von GAVal-Addukten
herangezogen. Da gleichermaßen nur der entsprechende Peak des internen Standards
acGAD7ValPFPTH berücksichtigt wurde und sich das Verhältnis des Diastereomerenpaares
von acGAValPFPTH als konstant erwiesen hat ist durch diese Vorgehensweise keine
Beeinflussung der Ergebnisse zu erwarten [Bertow, 2008]. Die Nachweis- und
Bestimmungsgrenzen wurden nach DIN-Vorschrift 32645 bestimmt und betrugen 0,4 bzw.
3,1 fmol für AAValPFPTH sowie 1,6 bzw. 8,0 fmol für acGAValPFPTH (absolute Angaben)
[Bertow, 2008].
18.00 18.20 18.40 18.60 18.80 19.00 19.20 19.40 19.60 19.80 20.00
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
16000
17000
18000
19000
20000
21000
22000
23000
24000
25000
26000
27000
28000
29000
30000
31000
32000
Time-->
Abundance
Ion 431.00 (430.70 to 431.70): GA Tier 1 M1.D
18.51
18.58
acGAValPFPTH
FF
FF
F
N
N
OS
O
NH
O
Abb. 4.3: GC-MS Chromatogramm zur Bestimmung von acGAValPFPTH (100 µg Acrylamid/kg KG über Trinkwasser (AA-TW); einmalige Verabreichung)
In Abb. 4.4 sind die Ergebnisse nach Gabe von 100 µg Acrylamid/kg KG über Pommes frites
(PFG/PFR) bzw. Trinkwasser (AA-TW) dargestellt. Bei den behandelten Tieren sind sowohl
bei den Trinkwasser- als auch bei den Lebensmittel-Gruppen deutliche, nahezu lineare
Anstiege der AAVal-Konzentrationen in Abhängigkeit von der Behandlungszeit und damit der
kumulativen Acrylamid-Dosis zu erkennen. Bei einmaliger Exposition mit Acrylamid steigt die
AAVal-Konzentration von 12 ± 1 pmol/g Hb bei den Kontrolltieren auf 35-40 pmol/g Hb bei
den behandelten Tieren an. Nach 7-tägiger Exposition mit Acrylamid erhöht sich die AAVal-
Konzentration auf 246 ± 22 bzw. 255 ± 7 pmol/g Hb bei den AA-TW- und Lebensmittel-
Ergebnisse und Diskussion
- 41 -
Gruppen. Dieser Gehalt ist im Vergleich zur 3-tägigen Fütterung (120 ± 13 bzw.
119 ± 9 pmol/g Hb) etwa um den Faktor 2 erhöht, was auf Kumulation der Acrylamid-Hb-
Addukte zurückgeführt werden kann. Nach 9 Tagen ist die AAVal-Bildung mit 286-
290 pmol/g Hb bei den Acrylamid-Trinkwasser- und Lebensmittelgruppen etwa um den
Faktor 3 größer als nach 3 Tagen (100-120 pmol/g Hb).
TW AA-TW PFG PFR0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
325
350
*****
Häm
oglo
bin-
Add
ukte
[pm
ol/g
Hb]
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage AAVal GAVal
Abb. 4.4: Hämoglobin-Addukte im Blut von Ratten nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition mit 100 µg Acrylamid/kg KG/d über Pommes frites (PFG: aus der Kartoffel geschnitten; PFR: aus Kartoffelerzeugnissen rekonstituiert) bzw. Trinkwasser (AA-TW), TW: Negativkontrolle, Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe; *: signifikant unterschiedlich zu AA-TW (**p<0,01; ***p<0,001)
Bei den Negativ-Kontrolltieren (TW) liegen die AAVal-Konzentrationen bei 8–23 pmol/g Hb,
während die GAVal-Konzentrationen mit 27-33 pmol/g Hb etwa 1,4-3,5-fach höher liegen.
Vergleichbare Hintergrundgehalte in Ratten wurden von Tareke et al. (GAVal/AAVal: 2-3)
sowie von Paulsson et al. (GAVal/AAVal = 1,8) beobachtet [Tareke et al. 2006; Paulsson et
al. 2002]. Vermutlich sind die Hintergrundgehalte an AAVal und GAVal auf die Acrylamid-
Belastung der Standarddiät (ca. 11 µg Acrylamid/kg) zurückzuführen. Darüber hinaus könnte
eine endogene Bildung von Acrylamid einen geringen Beitrag zur Hintergrundexposition
leisten. Bei geringen Acrylamid-Konzentrationen könnte die Bindung von Acrylamid an SH-
Gruppen überwiegen, da nach dem Hard-Soft-Acid-Base-Konzept nach Pearson die Thiol-
Reaktivität von Acrylamid im Vergleich zu Glycidamid größer ist [Ayers et al., 2006]. Dies
wäre eine mögliche Erklärung für die im Vergleich zu AAVal höheren GAVal-Gehalte.
Hamdan et al. zeigten, dass nach den SH-Gruppen des Cysteins nicht die freie α-
Aminogruppe sondern die ε-Aminogruppe des Lysins die nachgeordnet wichtigste Rolle bei
Ergebnisse und Diskussion
- 42 -
der Adduktbildung von Acrylamid mit Proteinen spielt, wodurch die resultierenden Addukt-
Gehalte ebenfalls beeinflusst werden könnten [Hamdan et al., 2001].
Die behandelten Tiere zeigen nach den durchgeführten Expositionsperioden keine
signifikante Änderung der GAVal-Konzentration im Vergleich zur Kontrolle. Dies deutet auf
eine geringe Glycidamid-Blutkonzentration bzw. systemische Verfügbarkeit von Glycidamid
hin, wobei der daraus resultierende GAVal-Anstieg mit der verwendeten analytischen
Methode vermutlich nicht erfasst werden kann. Diese Vermutung wird durch die in Kap.
4.1.1.4 diskutierten Glycidamid-Serumkonzentrationen (< 0,06 µM) nach Aufnahme von
100 µg Acrylamid/kg KG über Pommes frites (PFG) bzw. Acrylamid-haltiges Trinkwasser
gestützt. In einem weiteren Experiment, bei dem eine etwa 11-fach höhere einmalige
Acrylamid-Dosis als die über 9 Tage applizierte Gesamtdosis verabreicht wurde (Kap. 4.2.1),
wurde eine etwa 10-fach höhere GAVal-Bildung gefunden. Das heißt, bei höheren Dosen
wird das in der Leber metabolisch aus Acrylamid gebildete Glycidamid als Hb-Addukt in
entsprechender Konzentration nachgewiesen. In der niedrigen Dosierung von 9 Tagesdosen
(à 100 µg Acrylamid/kg KG), also einer Gesamtdosis von 900 µg Acrylamid/kg KG, bleibt das
Glycidamid-Hb-Addukt im Bereich der unbehandelten Kontrolle, während das Acrylamid-Hb-
Addukt dosisabhängig ansteigt. Tareke et al. fanden nach oraler Verabreichung
(Schlundsondierung) von 100 µg Acrylamid/kg KG an männliche und weibliche F344-Ratten
Anstiege der AAVal- und GAVal-Gehalte von 10-20 bzw. 30-90 pmol/g Hb [Tareke et al.
2006]. Ebenfalls höhere GAVal- als AAVal-Anstiege wurden von Törnqvist et al. nach
Verabreichung von 100 bzw. 500 µg Acrylamid/kg KG/d über 7 Tage bestimmt [Törnqvist et
al., 2008]. Dabei lagen die AAVal- und GAVal-Gehalte der weiblichen F344-Ratten bei
160 pmol/g Hb und 320 pmol/g Hb (100 µg/kg KG/d; Gesamtdosis 700 µg/kg KG) sowie
680 pmol/g Hb und 1710 pmol/g Hb (500 µg/kg KG/d; Gesamtdosis 3500 µg/kg KG).
Allerdings wurde bei dieser Studie die Acrylamid-Dosis nicht mittels Schlundsondierung,
sondern über das Trinkwasser verabreicht, was vermutlich eine veränderte Toxikokinetik zur
Folge hat. Insbesondere könnte durch die kontinuierliche Aufnahme von Acrylamid im
Trinkwasser der Metabolismus zum Glycidamid effektiver verlaufen, woraus höhere GAVal-
Addukt-Gehalte resultieren könnten. Im Vergleich dazu bestimmten Fennell et al. bei einer
vergleichbaren oralen Gabe (Schlundsondierung) von 3000 µg/kg KG an F344-Ratten
höhere AAVal- als GAVal-Anstiege (890 bzw. 750 pmol/g Hb) [Fennell et al., 2005].
Lediglich nach einer Expositionsdauer von 5 Tagen erscheint die AAVal-Bildung bei den
Lebensmittel-Gruppen (153-169 pmol/g Hb) im Vergleich zur Acrylamid-Gabe über
Trinkwasser (218 ± 3 pmol/g Hb) signifikant erniedrigt bzw. die AA-TW-Gruppe erhöht. Bei
Gabe über Pommes frites ergibt sich eine um ca. 25 % erniedrigte Hb-Addukt-Bildung.
Dieser Messwert ist allerdings gekennzeichnet durch eine auffallend niedrige Streuung
zwischen den 3 Individuen (siehe Abb. 4.4). Da dies der einzige Zeitpunkt ist, bei dem eine
Ergebnisse und Diskussion
- 43 -
im Vergleich zu Trinkwasser etwa um 25 % verminderte Acrylamid-Hb-Addukt- und
Mercaptursäure-Bildung (siehe Kap. 4.1.1.2) nach Gabe über Pommes frites erkennbar ist,
kann eine am Verhalten der Biomarker zu Tage tretende akzidentielle Überdosierung von
Acrylamid im Trinkwasser um etwa 25 % vermutet werden. Die vier übrigen untersuchten
Expositionsperioden liefern keinerlei Hinweis auf eine Beeinflussung der Acrylamid-
Aufnahme über Pommes frites im Vergleich zu Trinkwasser.
Die beobachteten Anstiege der AAVal-Addukte deuten daraufhin, dass sich die Verfügbarkeit
von Acrylamid aus den geprüften Pommes frites (PFG und PFR) nicht signifikant von der
Verfügbarkeit aus Trinkwasser (AA-TW) unterscheidet. Bei einer Acrylamid-
Resorptionsstudie in Schweinen wurde die Acrylamid-Aufnahme aus kommerziellem
Schweinefutter, welches Beimengungen von Kartoffelchips mit definiertem Acrylamid-Gehalt
enthielt, mit der Aufnahme aus Trinkwasser verglichen. Dabei wurden ebenfalls keine
signifikanten Unterschiede in der Bildung von AAVal-Addukten festgestellt [Aureli et al.,
2007]. Vikström et al. untersuchten die Acrylamid-Aufnahme über Futter unterschiedlicher
Zusammensetzung unter subchronischen Bedingungen im Niedrig-Dosis-Bereich (3-50 µg/kg
KG/d) an Mäusen. Dabei wurden anhand der Gehalte an AAVal- und GAVal-Addukten
ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen den unterschiedlich
zusammengesetzten Futtermitteln festgestellt [Vikström et al., 2008].
Ergebnisse und Diskussion
- 44 -
4.1.1.2 Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren im 24-Stunden-
Sammelurin nach Fütterung von Pommes frites
In Abb. 4.5 ist ein repräsentatives HPLC-MS/MS Chromatogramm zur Bestimmung der
Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren sowie der entsprechenden 3-fach deuterierten
internen Standards gezeigt. Die Analyten AAMA und GAMA sind basisliniengetrennt und
weisen Retentionszeiten von 11,3 bzw. 8,7 Minuten auf, welche mit den Retentionszeiten der
internen Standards D3-AAMA und D3-GAMA nahezu identisch sind.
AAMA
D3-AAMA
GAMA
D3-GAMA
AAMA
D3-AAMA
GAMA
D3-GAMA
Abb. 4.5: HPLC-MS/MS Chromatogramm zur Bestimmung von AAMA und GAMA im 24-Stunden-Sammelurin (100 µg Acrylamid/kg KG über Trinkwasser; einmalige Verabreichung)
Bei den Mercaptursäuren handelt es sich im Gegensatz zu den Hämoglobin-Addukten um
Biomarker, welche Acrylamid-Expositionen der vergangenen 24 Stunden widerspiegeln. Bei
allen Behandlungsgruppen wurde eine vergleichbare Mercaptursäure-Gesamtausscheidung
beobachtet, wobei keine signifikanten Unterschiede in Abhängigkeit von der
Expositionsdauer erkennbar waren. Nach Behandlung mit identischen Tagesdosen von
100 µg Acrylamid/kg KG lag der Anteil der Mercaptursäuren (AAMA + GAMA; Abb. 4.6) an
Ergebnisse und Diskussion
- 45 -
der gegebenen Tagesdosis im 24-Stunden-Urin für AA-TW-Gruppen bei 51,1 ± 11,7 %
(Range: 38,1-73,5 %; Median: 49,2 %) sowie für PFG- und PFR-Behandlungsgruppen bei
50,6 ± 8,7 % (Range: 26,0-67,5 %; Median: 49,9 %) bzw. 48,1 ± 9,7 % (Range: 23,9-60,2 %;
Median: 51,6 %). Vergleichbare prozentuale Anteile der Mercaptursäuren AAMA und GAMA
nach oraler Verabreichung von 0,1-50 mg/kg KG an Ratten über Trinkwasser wurden von
Doerge et al. (59 %), Fennell et al. (50 %) und Sumner et al. (46 %, 54 %) beobachtet
[Doerge et al., 2007; Fennell et al., 2005; Sumner et al., 1992; 2003]. Auch bei den Tieren
der Negativkontrolle konnte AAMA mit Absolutmengen von 4-6 nmol nachgewiesen werden,
wobei GAMA nicht detektierbar war. Diese Hintergrundbelastung ist, wie bereits bei den Hb-
Addukten (Kap. 4.1.1.1) diskutiert, vermutlich auf die Acrylamid-Aufnahme über die
Standarddiät zurückzuführen.
AA-TW PFG PFR0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Dos
isan
teile
[%]
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage
Abb. 4.6: Prozentualer Anteil der Mercaptursäureausscheidung an der verabreichten Einzeldosis von 100 µg Acrylamid/kg KG/d nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition über Pommes frites (PFG: aus der Kartoffel geschnitten; PFR: aus Kartoffelerzeugnissen rekonstituiert) bzw. Trinkwasser (AA-TW), Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe
Insgesamt weisen die AAMA- und GAMA-Gehalte (Abb. 4.7) eine größere Variabilität als die
Hämoglobinaddukte (siehe Kap. 4.1.1.1) auf. Bei den AA-TW-Gruppen liegen die Anteile an
der gegebenen täglichen Dosis (100 µg Acrylamid/kg KG) über alle Expositionsperioden
gemittelt bei 35,7 ± 9,5 % (Range: 21,4-53,9 %; Median: 30,5 %) für AAMA und 15,4 ± 4,6 %
(Range: 8,7-22,7 %; Median: 14,9 %) für GAMA. Die entsprechenden Dosisanteile liegen bei
den PFG- bzw. PFR-Gruppen bei 30,0 ± 6,7 % (15,2-39,7 %; Median: 30,3 %) für AAMA und
20,6 ± 4,5 % (10,8-29,0 %; Median: 19,6 %) für GAMA bzw. 30,0 ± 9,0 % (15,5-43,9 %;
Ergebnisse und Diskussion
- 46 -
Median: 30,2 %) für AAMA und 18,1 ± 4,3 % (8,4-27,9 %; Median: 17,1 %) für GAMA. Auch
bei den Mercaptursäuren sind die Dosisanteile nach Verabreichung von Acrylamid über
Trinkwasser (AA-TW) an Tag 5 wie bei den Hb-Addukten erhöht, was die Vermutung einer
akzidentiellen Überdosierung unterstützt. Für die Behandlungsgruppen PFG und PFR zeigte
sich eine Tendenz hin zu einer stärkeren Bildung von GAMA-Mercaptursäuren im Vergleich
zur AA-TW-Gruppe (signifikant: PFG: 3, 9 Tage; PFR: 9 Tage), während die AAMA-Gehalte
im Urin entsprechend abnahmen (signifikant: PFG: 9 Tage; PFR: 3, 9 Tage).
AA-TW PFG PFR0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
*
*** ****
*
**
*
**
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage AAMA GAMA
Dos
isan
teile
[%]
Abb. 4.7: Dosisanteile berechnet auf Grundlage der Gesamtausscheidung an Mercaptursäuren nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition mit 100 µg Acrylamid/kg KG/d über Pommes frites (PFG: aus der Kartoffel geschnitten; PFR: aus Kartoffelerzeugnissen rekonstituiert) bzw. Trinkwasser (AA-TW); AAMA: Acrylamid-Mercaptursäure; GAMA: Glycidamid-Mercaptursäure; Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe; *: signifikant unterschiedlich zur AA-Trinkwassergruppe (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001)
Das Verhältnis GAMA/AAMA beträgt bei den AA-TW-, PFG- und PFR-Gruppen über alle
Expositionsperioden gemittelt 0,46 ± 0,17, 0,72 ± 0,21 und 0,66 ± 0,25. Damit ist das
GAMA/AAMA-Verhältnis bei Acrylamid-Aufnahme über Pommes frites höher (signifikant:
PFG und PFR: 1, 3, 9 Tage) als bei Gabe von Acrylamid über Trinkwasser, wobei bei
erstmaliger Gabe der Acrylamid-Dosis die höchsten GAMA/AAMA-Verhältnisse beobachtet
wurden (GAMA/AAMA: 0,8-1,1; Abb. 4.8). Da sich die Gesamtausscheidung an
Mercaptursäuren nach einmaliger Verabreichung von Acrylamid sich nicht signifikant von
derjenigen nach wiederholter Gabe unterscheidet (Abb. 4.6), deuten die niedrigeren
GAMA/AAMA-Verhältnisse nach wiederholter Verabreichung von Acrylamid auf einen
adaptiven Effekt hin.
Ergebnisse und Diskussion
- 47 -
AA-TW PFG PFR0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
**
*
**
*****
***
GA
MA
/ A
AM
A
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage
Abb. 4.8: Verhältnis GAMA/AAMA nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition mit 100 µg Acrylamid/kg KG/d über Pommes frites (PFG: aus der Kartoffel geschnitten; PFR: aus Kartoffelerzeugnissen rekonstituiert) bzw. Trinkwasser (AA-TW), Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe; *: signifikant unterschiedlich zur Acrylamid-Trinkwassergruppe (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001)
Die höheren GAMA/AAMA-Verhältnisse bei Acrylamid-Aufnahme über Pommes frites
könnten wie in Kap. 4.1.1.4 diskutiert auf eine verzögerte Freisetzung von Acrylamid aus der
Lebensmittelmatrix bzw. Resorption im Gastrointestinaltrakt zurückgeführt werden. Dadurch
könnte einerseits die maximal erreichbare Konzentration von Acrylamid im Blut im Vergleich
zur Acrylamid-Aufnahme über Trinkwasser (Schlundsonde) geringer werden, andererseits
könnte diese Acrylamid-Konzentrationen über einen längeren Zeitraum konstant gehalten
werden, wodurch die metabolische Umwandlung von Acrylamid zu Glycidamid effektiver sein
könnte.
Insgesamt deuten die Gesamtgehalte an Mercaptursäuren darauf hin, dass sich die
Bioverfügbarkeit von Acrylamid aus den untersuchten Pommes frites (PFG und PFR) nicht
signifikant von derjenigen aus Trinkwasser (AA-TW) unterscheidet.
Ergebnisse und Diskussion
- 48 -
4.1.1.3 Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid im 24-Stunden-
Sammelurin nach Verabreichung von Acrylamid über Pommes frites (PFG, PFR) bzw. Trinkwasser
In Abb. 4.9 ist ein repräsentatives HPLC-MS/MS-Chromatogramm einer mit Pommes frites
(PFG; 1 Tag) gefütterten Ratte gezeigt. Die Analyten Acrylamid und Glycidamid sind
basisliniengetrennt und weisen Retentionszeiten von 8,8 bzw. 12,4 Minuten auf, welche mit
den Retentionszeiten der internen Standards D5-Acrylamid und 13C3-Glycidamid nahezu
identisch sind.
GA
13C3-GA
AA
D5-AA
GA
13C3-GA
AA
D5-AA
Abb. 4.9: HPLC-MS/MS-Chromatogramm zur Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid in Urin (100 µg Acrylamid/kg KG über Pommes frites (aus Kartoffel geschnitten, PFG); einmalige Verabreichung)
Ergebnisse und Diskussion
- 49 -
AA-TW PFG PFR0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5 1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage AA GA
Dos
isan
teile
[%]
Abb. 4.10: Prozentualer Anteil der Ausscheidung von Acrylamid und Glycidamid an der verabreichten Einzeldosis von 100 µg Acrylamid/kg KG/d nach 1, 3, 5, 7 und 9 -tägiger Exposition über Pommes frites (PFG: aus der Kartoffel geschnitten; PFR: aus Kartoffelerzeugnissen rekonstituiert) bzw. Trinkwasser (AA-TW); Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe
Der prozentuale Anteil der über den Urin ausgeschiedenen Acrylamid- bzw. Glycidamid-
Stoffmenge an der gegebenen täglichen Dosis von 100 µg Acrylamid/kg KG liegt über die
Expositionsperioden gemittelt bei 5,6 ± 3,0 % bzw. 2,3 ± 0,7 % (AA-TW), 2,0 ± 0,6 % bzw.
2,0 ± 0,7 % (PFG) und 1,5 ± 0,4 % bzw. 1,7 ± 0,6 % (PFR). In den Urinproben der
Negativkontrollen war sowohl Acrylamid als auch Glycidamid nicht nachweisbar.
Vergleichbare Ergebnisse wurden von Doerge et al. nach oraler Gabe von
100 µg Acrylamid/kg KG an F344-Ratten gefunden [Doerge et al., 2007]. Dabei lagen die
über den Urin ausgeschiedenen mittleren Anteile von Acrylamid und Glycidamid bei
2 bzw. 6 % der verabreichten Dosis.
Bei Acrylamid-Aufnahme über Trinkwasser (AA-TW) wird mit Ausnahme der einmaligen
Verabreichung (1 Tag) im Vergleich zu PFG- und PFR-Gruppen tendenziell mehr Acrylamid
über den Urin ausgeschieden (Abb. 4.10), wobei die behandelten Tiere relativ große
individuelle Unterschiede zeigen. Diese Beobachtung könnte auf die in Kap. 4.1.1.4
diskutierten höheren Acrylamid-Serumkonzentrationen bei Verabreichung von Acrylamid
über Trinkwasser zurückgeführt werden. Allerdings führt die tendenziell höhere
Ausscheidung von Acrylamid zu keiner signifikant veränderten Gesamtausscheidung der
Mercaptursäuren, da die mittleren Anteile an freiem Acrylamid und Glycidamid im Urin meist
unter 10 % der verabreichten Dosis liegen und damit einen geringen Anteil zur
Gesamtausscheidung von Acrylamid leisten. Darüber hinaus wurden nach einmaliger
Ergebnisse und Diskussion
- 50 -
Verabreichung von Acrylamid tendenziell höhere Glycidamid-Gehalte im Urin festgestellt,
wobei die beobachteten Unterschiede weniger als 1 % der verabreichten Dosis betragen.
Insgesamt sind unter Berücksichtigung der geringen Anzahl behandelter Tiere die Gehalte
an Acrylamid und Glycidamid in den untersuchten Gruppen und Expositionsperioden auf
vergleichbarem Niveau. Zwischen den Behandlungsgruppen PFG und PFR sowie den
einzelnen Expositionsperioden können keine signifikanten Unterschiede in der Acrylamid-
bzw. Glycidamid-Ausscheidung festgestellt werden.
4.1.1.4 Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid in Rattenserum
nach Verabreichung von Acrylamid über Pommes frites (PFG)
bzw. Trinkwasser
Zur Untersuchung der Acrylamid-Resorptionskinetik wurden an jeweils 4 Versuchstiere
Einzeldosen von 100 µg Acrylamid/kg KG über Pommes frites (PFG) bzw. Trinkwasser
(Schlundsondierung) verabreicht. Die Gewinnung von Blutproben erfolgte bei jeweils 3
Versuchstieren (randomisiert) zu den Zeitpunkten 30, 60, 120 und 240 Minuten nach der
Acrylamid-Aufnahme mittels retrobulbärer Punktion. Die Bestimmung der
Hintergrundbelastung an Acrylamid und Glycidamid wurde bei drei weiteren Versuchstieren
durchgeführt.
0 1 2 3 4
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Zeit [h]
AA
-Ser
umko
nzen
trat
ion
[µM
]
PFG AA-TW
Abb. 4.11: Acrylamid-Serumkonzentration nach Aufnahme von 100 µg AA/kg KG/d über Pommes frites (PFG) bzw. Trinkwasser (AA-TW), Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Blutentnahmezeitpunkt
Ergebnisse und Diskussion
- 51 -
Die maximale Acrylamid-Serumkonzentration wurde sowohl bei den PFG- als auch bei den
AA-TW-Gruppen bereits zwischen 30 und 60 Minuten nach der Acrylamid-Aufnahme erreicht
(Abb. 4.11). Dabei stiegen die Gehalte im Serum von 0,05 ± 0,01 µM zum Zeitpunkt T = 0 auf
0,52 ± 0,03 µM (nach 60 Minuten) bei der PFG- bzw. 1,84 ± 0,17 µM (nach 30 Minuten) bei
der AA-TW-Gruppe an, d. h. die maximale Acrylamid-Serumkonzentration liegt bei
Acrylamid-Aufnahme über Trinkwasser (Schlundsonde) etwa um den Faktor 3-4 höher als
bei Acrylamid-Gabe über Pommes frites (PFG). Die nachweisbaren Acrylamid-
Serumkonzentrationen zum Zeitpunkt T = 0 (Negativ-Kontrollen) sind vermutlich auf den
Acrylamid-Gehalt (ca. 11 µg/kg) der Standarddiät zurückzuführen. Bei Verabreichung von
Acrylamid über Trinkwasser ist bereits nach 60 Minuten eine tendenzielle Verringerung der
Acrylamid-Serumkonzentration zu beobachten (1,77 ± 0,14 µM), welche nach 120 Minuten
weiter abnimmt (1,53 ± 0,04 µM). Nach 240 Minuten liegt die Acrylamid-Konzentration mit
0,75 ± 0,08 µM nur noch bei ca. 40 % des maximal erreichten Wertes. Für die AA-TW-
Gruppen liegt die Halbwertszeit von Acrylamid im Serum bei ca. 3 Stunden. Im Gegensatz
dazu bleiben die Acrylamid-Serumkonzentrationen der PFG-Gruppe bei den entsprechenden
Blutentnahmezeitpunkten mit 0,44-0,54 µM relativ konstant, wobei auch 240 Minuten nach
der Acrylamid-Aufnahme noch keine Tendenz zu einer Verringerung der Acrylamid-
Konzentration im Serum zu erkennen ist. Die nach Aufnahme von Acrylamid über Pommes
frites gemessenen geringeren Acrylamid-Serumgehalte deuten auf eine verzögerte
Freisetzung von Acrylamid aus Lebensmitteln bzw. verlangsamte Resorption im
Gastrointestinaltrakt im Vergleich zur Acrylamid-Aufnahme über Trinkwasser hin. Unterstützt
wird diese Annahme durch eine Verschiebung des Mercaptursäure-Verhältnisses
GAMA/AAMA zu Gunsten von GAMA (Kap. 4.1.1.2) bei Acrylamid-Aufnahme über Pommes
frites, da bei einer verzögerten Resorption der Metabolismus von Acrylamid zu Glycidamid
effektiver sein könnte.
Glycidamid konnte sowohl bei den Versuchstieren der PFG- als auch in einer Probe der AA-
TW-Gruppe lediglich 240 Minuten nach der Acrylamid-Aufnahme nachgewiesen werden,
wobei die gemessenen Konzentrationen mit 0,056-0,059 µM bereits unter der
Bestimmungsgrenze (0,07 µM) der verwendeten Methode zur Bestimmung von Glycidamid
in Rattenserum lagen. Die bei Acrylamid-Aufnahme über Pommes frites im Vergleich zur
Acrylamid-Trinkwasser-Gruppe anhand des Biomarkers GAMA beobachtete tendenziell
erhöhte Bildung von Glycidamid wird durch die Glycidamid-Serumgehalte nicht
widergespiegelt, da der überwiegende Teil des in der Leber gebildeten Glycidamids
vermutlich unmittelbar mit GSH gekoppelt wird. Darüber hinaus lag auch die in Kap. 4.1.1.3
beschriebene Glycidamid-Ausscheidung über den Urin bei einmaliger Verabreichung von
100 µg Acrylamid/kg KG über Trinkwasser (AA-TW) bzw. Pommes frites (PFG) mit einem
Anteil von ca. 3 % der gegebenen Dosis auf vergleichbarem Niveau. Für eine effiziente
Ergebnisse und Diskussion
- 52 -
Entgiftung des metabolisch gebildeten Glycidamid spricht auch die Tatsache, dass mit Hilfe
des Comet Assay nach FPG-Behandlung keine signifikanten DNA-Schäden im Blut und in
der Leber der behandelten Tiere detektiert wurden [Feld, persönliche Mitteilung]. Frühere
Arbeiten zeigten, dass nach 4-stündiger Inkubation von humanem Vollblut mit 10 µM
Glycidamid DNA-Schäden mittels Comet assay nach FPG-Behandlung detektierbar waren
[Thielen et al., 2006].
Da die Entnahme von Serumproben nur bis zu einem Zeitraum von 4 Stunden nach
Acrylamid-Aufnahme erfolgte und Glycidamid lediglich nach 4 Stunden detektiert werden
konnte, wäre in Anbetracht der vorhandenen Acrylamid-Serumkonzentration ein weiterer
Anstieg der Glycidamid-Serumkonzentration denkbar. Doerge et al. untersuchten die
Resorptionskinetik von Acrylamid an F344-Ratten über einen Zeitraum von 10-12 Stunden
nach Verabreichung von 100 µg/kg KG i.v. bzw. mittels Schlundsondierung sowie Gabe von
Acrylamid-dotierter Standarddiät [Doerge et al., 2005]. Dabei wurde in den untersuchten
Behandlungsgruppen die maximale Glycidamid-Serumkonzentration bereits 2-4 Stunden
nach der Acrylamid-Verabreichung beobachtet, so dass die Wahrscheinlichkeit für einen
wesentlichen Anstieg der in der vorliegenden Arbeit gemessenen Glycidamid-
Serumkonzentrationen über den Zeitraum von 4 Stunden hinaus als gering einzuschätzen
ist.
In der Studie von Doerge et al. wurden nach oraler Verabreichung von
100 µg Acrylamid/kg KG an männliche F344-Ratten die maximalen Acrylamid-
Serumkonzentrationen nach 1-2 Stunden erreicht und lagen bei ca. 0,4 bzw. 0,3 µM für die
Gabe mittels Schlundsonde bzw. Acrylamid-dotierter Standarddiät [Doerge et al., 2005].
Diese maximalen Acrylamid-Serumgehalte liegen insbesondere bei Verabreichung mittels
Schlundsonde (Faktor: ~ 4) unter den in der vorliegenden Arbeit ermittelten Konzentrationen.
Allerdings liegen die maximalen Glycidamid-Serumkonzentrationen (ca. 0,2 µM) über den im
Rahmen der vorliegenden Arbeit gemessenen Konzentrationen (< 0,06 µM). Weiterhin
wurden von Doerge et al. nach oraler Verabreichung von 100 µg Acrylamid/kg KG an
männliche F344-Ratten höhere GAMA- (27-29 % der verabreichten Dosis) sowie höhere
Glycidamid-Gehalte (6 % der verabreichten Dosis) im Urin beobachtet [Doerge et al., 2007].
Tareke et al. Untersuchten die Acrylamid- und Glycidamid-Hb-Adduktbildung nach
Verabreichung von 100 µg Acrylamid/kg KG per Schlundsonde an männlichen F344-Ratten
[Tareke et al., 2006]. Dabei wurde ein Anstieg von GAVal um 20-30 pmol/g Hb beobachtet,
während sich die AAVal-Gehalte lediglich um ca. 10 pmol/g Hb erhöhten. Darüber hinaus
beobachteten die Autoren bei der Inkubation von Rattenlebermikrosomen mit Acrylamid
Unterschiede in der Geschwindigkeit der Glycidamid-Bildung, wobei die
Geschwindigkeitskonstante bei F344-Ratten mit 12 pmol/min/mg Protein um mehr als 80 %
höher lag als diejenige von Sprague-Dawley-Ratten (7 pmol/min/mg Protein).
Ergebnisse und Diskussion
- 53 -
In der vorliegenden Arbeit stiegen die AAVal-Gehalte nach einmaliger Verabreichung von
100 µg Acrylamid/kg KG an männliche Sprague Dawley Ratten mittels Schlundsonde um ca.
30 pmol/g Hb an, während sich die GAVal-Adduktgehalte nicht signifikant veränderten.
Die zitierten Studien deuten auf Unterschiede in der Toxikokinetik von Acrylamid in F344-
Ratten im Vergleich zu den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Sprague Dawley Ratten
hin. Darüber hinaus muss berücksichtigt werden, dass die Körpergewichte der F344-Ratten
(ca. 150 g) in diesen Studien weit unter den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Sprague
Dawley Ratten (ca. 280 g) lagen, was ebenfalls die Toxikokinetik von Acrylamid beeinflussen
könnte.
Ergebnisse und Diskussion
- 54 -
4.1.2 Fütterung von Brotkruste (BK)
Im Folgenden sind die Ergebnisse nach Verabreichung von Brotkruste über 1-9 Tage
dargestellt. Da in der Brotkruste der maximal generierbare Acrylamid-Gehalt bei 1400 µg/kg
lag, wurde die tägliche Dosis auf 50 µg Acrylamid/kg KG über Brotkruste bzw. Trinkwasser
reduziert. Das Versuchsprotokoll entsprach den Untersuchungen mit Pommes frites.
4.1.2.1 Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin-Addukte
TW AA-TW BK0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
275
300
**
* *
Häm
oglo
bin-
Add
ukte
[pm
ol/g
Hb]
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage AAVal GAVal
Abb. 4.12: Hämoglobin-Addukt-Bestimmung nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition mit 50 µg Acrylamid/kg KG/d über Brotkruste (BK) bzw. Trinkwasser (AA-TW), TW: Negativkontrolle, Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe, *: signifikant unterschiedlich zu AA-TW (*p<0,05; **p<0,01)
Wie bei den Fütterungsversuchen mit Pommes frites sind auch bei diesem Experiment nach
den untersuchten Expositionsperioden (50 µg Acrylamid/kg KG/d bei den behandelten
Tieren) sowohl bei den Trinkwasser- als auch bei der Lebensmittelgruppe deutliche Anstiege
der AAVal-Gehalte zu erkennen (Abb. 4.12). Der AAVal-Gehalt der nichtbehandelten
Kontrolle beträgt 12-73 pmol/g Hb, während der AAVal-Gehalt der Acrylamid-behandelten
Tiere von 24-27 (1 Tag) auf 218-255 (9 Tage) pmol/g Hb ansteigt. Wie bei der Verabreichung
von Acrylamid über Pommes frites ist auch bei der Gabe von 50 µg Acrylamid/kg KG/d über
Brotkruste bzw. Trinkwasser eine Kumulation der Acrylamid-Hb-Addukte zu beobachten.
Jedoch zeigen die unbehandelten Negativ-Kontrollen (TW) nach 5, 7 und 9 Tagen Fütterung
Ergebnisse und Diskussion
- 55 -
deutlich höhere AAVal-Hintergrundgehalte (29-73 pmol/g Hb) im Vergleich zu den übrigen
Negativkontrollen (12-17 pmol/g Hb). Nach Berücksichtigung dieser höheren AAVal-
Hintergrundgehalte durch Auftragung der Hb-Addukt-Zunahme (Δ pmol/g Hb) gegen die
Expositionsdauer ergibt sich eine nahezu lineare Zunahme der Acrylamid-Hb-Addukte in
Abhängigkeit von der Gesamtdosis (Abb. 4.13), was auch bei den Fütterungsversuchen mit
Pommes frites beobachtet wurde.
1 3 5 7 9
0
50
100
150
200
250
Expositionsdauer [d]
AA-TW BK
AAValGAVal
Hb-
Add
ukt-Z
unah
me
[Δ p
mol
/g H
b]
Abb. 4.13: Hämoglobin-Addukt-Zunahme in Abhängigkeit von der Expositionsdauer 50 µg Acrylamid/kg KG/d über Brotkruste (BK) bzw. Trinkwasser (AA-TW), Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe
In den BK-Gruppen deutet sich eine geringfügige, um etwa 15-20 % verminderte AAVal-
Bildung im Vergleich zur AA-TW-Gruppe an (signifikant nach 5, 7 und 9 Tagen). Bei den
behandelten Tieren ist nach den durchgeführten Expositionsperioden keine signifikante
Änderung der GAVal-Konzentration im Vergleich zu den Negativ-Kontrollen zu erkennen,
was bereits bei den Fütterungsversuchen mit Pommes frites beobachtet und diskutiert wurde
(Kap. 4.1.1.1).
Ergebnisse und Diskussion
- 56 -
4.1.2.2 Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren im 24-Stunden-
Sammelurin nach Fütterung von Brotkruste (BK)
Die Anteile der Mercaptursäuren (AAMA + GAMA; Abb. 4.14) an der gegebenen Tagesdosis
liegen gemittelt über alle durchgeführten Expositionsperioden für AA-TW-Gruppen bei
58,5 ± 11,2 % (32,6-74,8 %; Median: 62,0 %) und für die Brotkruste (BK)-Gruppen bei
48,9 ± 6,5 % (33,6-60,3 %; Median: 50,5 %). Auf der Basis der AAVal-Addukt-Gehalte
wurden bei den Negativkontrollen der Fütterungsversuche über 5, 7 und 9 Tage erhöhte
Hintergrundbelastungen beobachtet. Der Gehalt an AAMA im 24-Stunden-Urin der
Negativkontrollen beträgt 4-8 nmol absolut, wobei GAMA nicht detektierbar war. Ähnliche
Hintergrundgehalte an Mercaptursäuren wurden bei den Negativkontrollen der Fütterungs-
versuche mit Pommes frites ermittelt. Daraus folgt, dass die Gesamtausscheidung an
Mercaptursäuren nicht auf eine erhöhte Hintergrundbelastung mit Acrylamid hindeutet.
AA-TW BK0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
*
Dos
isan
teile
[%]
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage
Abb. 4.14: Dosisanteile berechnet auf Grundlage der Gesamtausscheidung an AAMA und GAMA nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition mit 50 µg Acrylamid/kg KG/d über Brotkruste bzw. Trinkwasser (AA-TW); Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe, *: signifikant unterschiedlich zur Acrylamid-Trinkwassergruppe (*p<0,05)
Ergebnisse und Diskussion
- 57 -
AA-TW BK0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
*
Dos
isan
teile
[%]
*
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage AAMA GAMA
Abb. 4.15: Mercaptursäuren-Bestimmung nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition mit 50 µg Acrylamid/kg KG/d über Brotkruste (BK) bzw. Trinkwasser (AA-TW), AAMA: Acrylamid-Mercaptursäure; GAMA: Glycidamid-Mercaptursäure, Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe *: signifikant unterschiedlich zur Acrylamid-Trinkwassergruppe (p<0,05)
Die AAMA- und GAMA-Anteile an der verabreichten Tagesdosis von 50 µg Acrylamid/kg KG
nach 3-, 5-, 7- und 9- tägiger Exposition mit Acrylamid zeigen innerhalb der Acrylamid-
Trinkwasser- und Brotkrustegruppen keine signifikanten Unterschiede. Lediglich die AAMA-
Ausscheidung nach einmaliger Gabe von Acrylamid ist sowohl bei der AA-TW- als auch bei
der BK-Gruppe im Vergleich zur Exposition über 3, 5, 7 und 9 Tage erniedrigt, was bereits
bei den Fütterungsversuchen mit Pommes frites beobachtet wurde. Der Vergleich der
Gehalte an AAMA in den AA-TW- und BK-Gruppen zeigt eine leichte Erniedrigung der
ausgeschiedenen Dosisanteile bei Exposition über BK (signifikant: 3, 7 Tage). Dies korreliert
mit den Daten zur Acrylamid-Hb-Adduktbildung und deutet auf eine geringfügig verminderte
Bioverfügbarkeit von Acrylamid über Brotkruste im Vergleich zu Trinkwasser hin.
Doerge et al. untersuchten die Aufnahme von 100 µg Acrylamid/kg KG an F344-Ratten nach
intravenöser im Vergleich zu oraler Verabreichung. Dabei zeigte sich, dass Acrylamid nach
Verabreichung in Trinkwasser mittels Schlundsondierung schnell und nahezu vollständig
aufgenommen wird. Bei Acrylamid-Aufnahme über die Nahrung betrug die Bioverfügbarkeit
im Vergleich zur intravenösen Verabreichung jedoch nur 32-44 %, was auf einen
ausgeprägten Einfluss durch die Lebensmittelmatrix schließen lässt [Doerge et al., 2005].
Allerdings ist bei dieser Studie zu beachten, dass die Acrylamid-Gehalte im Futter durch
Zusatz von Acrylamid-Lösungen generiert wurden. Dabei könnte die Reaktion von
Futterinhaltsstoffen mit dem zugesetzten Acrylamid zu einer Verminderung der freien
Acrylamid-Gehalte führen, wodurch sich die resorbierbare Gesamtmenge bei Einstellung
Ergebnisse und Diskussion
- 58 -
einer bestimmten Dosis verringern würde. In der vorliegenden Arbeit wurden Lebensmittel
verwendet, in denen der Acrylamid-Gehalt bei der Herstellung generiert wurde, so dass es
sich bei den Analysenergebnissen um den tatsächlich vorhandenen Gehalt an freiem,
resorbierbarem Acrylamid handelt.
AA-TW BK0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
*
GA
MA
/ A
AM
A
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage
Abb. 4.16: Verhältnis GAMA/AAMA nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition mit 50 µg Acrylamid/kg KG/d über Brotkruste bzw. Trinkwasser (AA-TW), Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe, *: signifikant unterschiedlich zur Acrylamid-Trinkwassergruppe (*p<0,05)
Die GAMA-Konzentrationen zeigen beim Vergleich der beiden Expositionsgruppen keine
signifikanten Unterschiede. Wie bei den Fütterungsversuchen mit Pommes frites deutet sich
auch bei den BK-Gruppen (GAMA/AAMA: 0,58 ± 0,22) im Vergleich zur Acrylamid-Aufnahme
über Trinkwasser (GAMA/AAMA: 0,43 ± 0,18) eine Verschiebung des GAMA/AAMA-
Verhältnisses zu Gunsten von GAMA an (Abb. 4.16), was vermutlich auf die verzögerte
Resorption von Acrylamid bei Aufnahme über Lebensmittel zurückzuführen ist. Dadurch
könnte der oxidative Metabolismus von Acrylamid zu Glycidamid effektiver verlaufen, was zu
einer höheren GAMA-Ausscheidung führen würde. Bei erstmaliger Gabe der Acrylamid-
Dosis wurden die höchsten GAMA/AAMA-Verhältnisse beobachtet, was ebenfalls bei den
Fütterungsversuchen mit Pommes frites beobachtet wurde.
Ergebnisse und Diskussion
- 59 -
4.1.2.3 Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid im 24-Stunden-
Sammelurin nach Verabreichung von Acrylamid über Brotkruste (BK) bzw. Trinkwasser
Der prozentuale Anteil der über den Urin ausgeschiedenen Acrylamid- bzw. Glycidamid-
Stoffmenge an der gegebenen täglichen Dosis von 50 µg Acrylamid/kg KG liegt über die
Expositionsperioden gemittelt bei 5,0 ± 2,9 % bzw. 3,5 ± 2,3 % für die AA-TW-Gruppen und
2,8 ± 0,5 % bzw. 2,9 ± 0,7 % für die Brotkruste (BK)-Gruppen. Bei Acrylamid-Aufnahme über
Trinkwasser (AA-TW) wird trotz relativ großer individueller Unterschiede mit Ausnahme der
einmaligen Verabreichung (1 Tag) im Vergleich zu BK-Gruppen tendenziell mehr Acrylamid
über den Urin ausgeschieden (Abb. 4.17), was auch bei den Fütterungsversuchen mit
Pommes frites (Kap. 4.1.1.3) beobachtet und diskutiert wurde. Innerhalb der
Behandlungsgruppen konnten zwischen den einzelnen Expositionsperioden keine
signifikanten Unterschiede in der Acrylamid-Ausscheidung beobachtet werden. Die Gehalte
an Glycidamid sind in den untersuchten Gruppen und Expositionsperioden auf
vergleichbarem Niveau. In den Urinproben der Negativkontrollen war sowohl Acrylamid als
auch Glycidamid nicht nachweisbar.
AA-TW BK0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
Dos
isan
teile
[%]
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage AA GA
Abb. 4.17: Prozentualer Anteil der Ausscheidung von Acrylamid und Glycidamid an der verabreichten Einzeldosis von 50 µg Acrylamid/kg KG/d nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition über Brotkruste (BK) bzw. Trinkwasser (AA-TW), Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe
Ergebnisse und Diskussion
- 60 -
Insgesamt sind die Dosisanteile von Acrylamid und Glycidamid im Urin nach Verabreichung
von Acrylamid über Brotkruste mit denjenigen der Pommes frites vergleichbar. Die bei den
Brotkruste-Gruppen beobachteten reduzierten AAVal- und AAMA-Gehalte korrelieren daher
nicht mit der Ausscheidung von Acrylamid oder Glycidamid über den Urin.
Im Rahmen früherer Arbeiten im Arbeitskreis wurden die Gehalte an freiem Acrylamid und
Glycidamid in den Fäces der behandelten Tiere bestimmt [Gerhardt, 2008]. Dabei konnte in
keiner der untersuchten Proben Glycidamid nachgewiesen werden. Bei den
Fütterungsversuchen mit Pommes frites und Lebkuchen lagen die Acrylamid-Gehalte bei
53 % der Proben unter der Nachweisgrenze. Bei den übrigen Tieren lagen die mittleren
Dosis-Anteile von freiem Acrylamid bei 1,1 % (Pommes frites) und 1,2 % (Lebkuchen). Bei
Verabreichung von Brotkruste konnte in nahezu allen Fäces-Proben Acrylamid
nachgewiesen werden, wobei die mittleren Anteile an der verabreichten Dosis mit 3,4 %
tendenziell höher als bei Aufnahme von Acrylamid über Pommes frites bzw. Lebkuchen
lagen. Allerdings wurden auch in den Fäces-Proben von Negativkontrollen relativ hohe
Acrylamid-Gehalte gemessen, so dass keine exakte Aussage über die tatsächlich über
Fäces ausgeschiedene Menge an Acrylamid bei Aufnahme über die Lebensmittel getroffen
werden kann.
Ergebnisse und Diskussion
- 61 -
4.1.3 Verabreichung von Lebkuchen (LK)
Im Folgenden sind die Ergebnisse nach Fütterung von Lebkuchen über 1, 3, 5, 7 und 9 Tage
dargestellt. Die tägliche Dosis sollte auf 100 µg Acrylamid/kg KG über Lebkuchen (LK) bzw.
Trinkwasser (AA-TW, Schlundsondierung) eingestellt werden. Für den Acrylamid-Gehalt des
Lebkuchens wurden im Rahmen mehrmals durchgeführter Kontrollmessungen stark
unterschiedliche Werte ermittelt (4150 ± 800 µg Acrylamid/kg; Kap. 6.1.1), obwohl die in den
jeweiligen Messungen untersuchten Lebkuchen jeweils aus der gleichen Probe stammten
und gleich behandelt wurden. Die Vermutung, dass der Acrylamid-Gehalt möglicherweise
nicht exakt bestimmt wurde, ergab sich an dem zunächst unklaren Befund, dass sowohl die
AAVal-Addukte als auch die Mercaptursäure-Bildung in den LK-Gruppen höher war als in
den AA-TW-Gruppen. Insofern musste sich die jeweilige Einwaage für die exakte Dosierung
über den nach der Gesamtheit der zum jeweiligen Zeitpunkt vorliegenden Analysedaten
richten. Daher wurden in Abhängigkeit von den jeweiligen Analysenergebnissen für die
Durchführung der Fütterungsversuche zu den jeweiligen Versuchsabschnitten
unterschiedliche Acrylamid-Gehalte des Lebkuchens zu Grunde gelegt.
4.1.3.1 Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin-Addukte nach Verab-reichung von Lebkuchen (LK)
Auch bei Fütterung von Lebkuchen sind vergleichbar zur Gabe von Pommes frites und
Brotkruste nach den untersuchten Expositionsperioden bei den behandelten Tieren sowohl
bei der Trinkwasser- als auch bei der Lebensmittelgruppe Gesamtdosis-abhängige Anstiege
der AAVal-Gehalte zu erkennen (Abb. 4.18).
Die AAVal-Gehalte der Kontrollen betragen 8-23 pmol/g Hb, während diejenige der
behandelten Tiere von 33-40 pmol/g Hb nach einmaliger Gabe auf 290-383 pmol/g Hb nach
9 Tagen ansteigt. Wie bei der Verabreichung von Acrylamid über Pommes frites und
Brotkruste ist auch bei der Gabe von 100 µg Acrylamid/kg KG/d über Trinkwasser eine
Kumulation der Acrylamid-Hb-Addukte zu beobachten. Auch bei der Fütterung von
Lebkuchen wurde bei den behandelten Tieren keine signifikante Änderung der GAVal-
Gehalte im Vergleich zur Negativkontrolle (TW) beobachtet. Jedoch zeigt die Lebkuchen-
Gruppe nach allen Expositionszeiträumen signifikant unterschiedliche AAVal-Gehalte im
Vergleich zu den AA-TW-Gruppen. Nach 1- und 5-tägiger Fütterung sind die AAVal-Gehalte
signifikant erniedrigt (angenommener Acrylamid-Gehalt des Lebkuchens: 5400 µg/kg),
während nach 3-, 7- und 9-tägiger Fütterung die entsprechenden Gehalte signifikant erhöht
sind (angenommene Acrylamid-Gehalte des Lebkuchens: 3 Tage: 3200 µg/kg; 7 Tage:
3400 µg/kg; 9 Tage: 4060 µg/kg). Vermutlich reflektieren die AAVal-Messwerte die ungenaue
Ergebnisse und Diskussion
- 62 -
Charakterisierung des Gehaltes an Acrylamid im Lebkuchen. Wahrscheinlich wurde in
Abhängigkeit der Analysenergebnisse sowohl von zu hohen (Zeitpunkte 1 und 5 Tage) als
auch von zu niedrigen (Zeitpunkte 3, 7 und 9 Tage) Acrylamid-Gehalten des Lebkuchens
ausgegangen.
TW AA-TW LK0
255075
100125150175200225250275300325350375400
5)4)
3)
2)
1)
****
*
***
*
Häm
oglo
bin-
Addu
kte
[pm
ol/g
Hb]
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage AAVal GAVal
Abb. 4.18: Hämoglobin-Addukte im Blut von Ratten nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition mit 100 µg Acrylamid/kg KG/d über Lebkuchen bzw. Trinkwasser (AA-TW), Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe, *: signifikant unterschiedlich zu AA-TW (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001), zu Grunde gelegte Acrylamid-Gehalte des LK: 1) 5400 µg/kg; 2) 3200 µg/kg; 3) 5400 µg/kg; 4) 3400 µg/kg; 5) 4060 µg/kg
4.1.3.2 Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren im 24-Stunden-
Sammelurin nach Fütterung von Lebkuchen (LK)
Die Anteile der Mercaptursäuren an der verabreichten Dosis spiegeln die Ergebnisse bei den
Acrylamid-Hb-Addukten wider. Nach allen Expositionsperioden (Ausnahme: einmalige
Verabreichung) wurden signifikante Unterschiede in der Ausscheidung von AAMA bei den
LK-Gruppen im Vergleich zu AA-TW-Gruppen beobachtet (Abb. 4.19).
Wie bereits bei den Acrylamid-Hb-Addukten festgestellt wurde, liegen die gemessenen
AAMA-Dosisanteile nach einmaliger sowie 5-tägiger Behandlung niedriger (signifikant: 5
Tage) und nach 3-, 7- und 9-tägiger Fütterung mit Lebkuchen höher (signifikant: 3, 7 und 9
Tage) als in den entsprechenden AA-TW-Gruppen. Auch die GAMA-Dosisanteile zeigen
sowohl bei 3-, als auch nach 7- und 9-tägiger Fütterung (signifikant: 3 und 9 Tage) mit
Lebkuchen erhöhte Werte im Vergleich zu den AA-TW-Gruppen. Wie bereits bei den Hb-
Ergebnisse und Diskussion
- 63 -
Addukten erwähnt können die beobachteten Unterschiede vermutlich auf die
unterschiedlichen, bei der Versuchsdurchführung zugrunde gelegten Acrylamid-Gehalte des
Lebkuchens zurückgeführt werden.
AA-TW LK0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
5)
4)
3)
2)
1)
**
**
***
***
**
**
***
Dos
isan
teile
[%]
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage AAMA GAMA
Abb. 4.19: Dosisanteile berechnet auf Grundlage der Gesamtausscheidung an Mercaptursäuren nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition mit 100 µg Acrylamid/kg KG/d über Lebkuchen (LK): bzw. Trinkwasser (AA-TW), AAMA: Acrylamid-Mercaptursäure, GAMA: Glycidamid-Mercaptursäure; Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe, *: signifikant unterschiedlich zur Acrylamid-Trinkwassergruppe (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001), zu Grunde gelegte Acrylamid-Gehalte des LK: 1) 5400 µg/kg, 2) 3200 µg/kg, 3) 5400 µg/kg, 4) 3400 µg/kg, 5) 4060 µg/kg
4.1.3.3 Ausscheidung von Acrylamid und Glycidamid im 24-Stunden-
Sammelurin nach Verabreichung von Lebkuchen (LK)
Bei den Fütterungsversuchen mit Lebkuchen (LK) wurden aufgrund der stark
unterschiedlichen Analysenergebnisse zum Acrylamid-Gehalt (4150 ± 800 µg Acrylamid/kg)
vermutlich sowohl zu hohe als auch zu niedrige Acrylamid-Gehalte des Lebkuchens für die
exakte Einstellung der Dosis von 100 µg Acrylamid/kg KG zugrunde gelegt. Jedoch werden
die daraus resultierenden Unterschiede in der tatsächlich verabreichten Acrylamid-Dosis
durch die über den Urin ausgeschiedene Stoffmenge an Acrylamid und Glycidamid nicht
wiedergegeben. Der prozentuale Anteil der über den Urin ausgeschiedenen Acrylamid- bzw.
Glycidamid-Stoffmenge an der verabreichten täglichen Dosis von 100 µg Acrylamid/kg KG
liegt über die Expositionsperioden gemittelt bei 5,6 ± 3,0 % bzw. 2,3 ± 0,7 % für die AA-TW-
Gruppen und 1,8 ± 0,5 % bzw. 1,8 ± 0,6 % für die Lebkuchen (LK)-Gruppen und ist mit den
Ergebnissen aus den Fütterungsversuchen mit Pommes frites bzw. Brotkruste vergleichbar.
Ergebnisse und Diskussion
- 64 -
Auch bei der Verabreichung von Lebkuchen wird mit Ausnahme der einmaligen
Verabreichung (1 Tag) im Vergleich zur Acrylamid-Aufnahme über Trinkwasser (AA-TW)
tendenziell weniger Acrylamid über den Urin ausgeschieden (Abb. 4.20). Innerhalb der
Behandlungsgruppen konnten zwischen den einzelnen Expositionsperioden keine
signifikanten Unterschiede in der Acrylamid-Ausscheidung beobachtet werden, obwohl in
den Lebkuchen-Gruppen unterschiedliche Acrylamid-Dosen verabreicht wurden. Die
Glycidamid-Dosisanteile sind in den untersuchten Gruppen und Expositionsperioden
ebenfalls auf vergleichbarem Niveau.
AA-TW LK0
2
4
6
8
10
12
Dos
isan
teile
[%]
1 Tag 3 Tage 5 Tage 7 Tage 9 Tage AA GA
Abb. 4.20: Prozentualer Anteil der Ausscheidung von Acrylamid und Glycidamid an der verabreichten Einzeldosis von 100 µg Acrylamid/kg KG/d nach 1-, 3-, 5-, 7- und 9-tägiger Exposition über Lebkuchen (LK) bzw. Trinkwasser (AA-TW), Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe
Ergebnisse und Diskussion
- 65 -
4.2 Verabreichung der kumulativen Dosis aus den
Fütterungsversuchen (450 bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG)
bzw. 10 mg Acrylamid/kg KG als Einzeldosis über
Trinkwasser (Schlundsonde)
Zum Vergleich der Toxikokinetik von Acrylamid bei wiederholter Verabreichung im Rahmen
des Fütterungsversuchs (50 bzw. 100 µg Acrylamid/kg KG/d für maximal 9 Tage) mit
derjenigen nach Gabe der entsprechenden kumulativen Einzeldosis wurden jeweils 3 Tiere
mit 450 bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG über Trinkwasser mittels Schlundsondierung
behandelt. Darüber hinaus wurde zur Untersuchung der Acrylamid-Toxikokinetik im
Hochdosisbereich an zwei Versuchstiere eine Dosis von 10 mg Acrylamid/kg KG verabreicht.
4.2.1 Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin-Addukte
Bei den behandelten Tieren sind nahezu lineare Anstiege der AAVal-Gehalte in Abhängigkeit
von der verabreichten Acrylamid-Dosis zu erkennen (Abb. 4.21). Bei einmaliger Exposition
mit 0,45 mg Acrylamid/kg KG über Acrylamid-haltiges Trinkwasser (Schlundsondierung)
steigt der AAVal-Gehalt von 12 ± 1 pmol/g Hb bei den Kontrolltieren auf 186 ± 9 pmol/g Hb
bei den behandelten Tieren an. Im Rahmen der Fütterungsstudie wurde bei 9-tägiger
Behandlung mit 50 µg Acrylamid/kg KG/d (entsprechend einer kumulativen Dosis von
0,45 mg Acrylamid/kg KG) ein vergleichbarer AAVal-Anstieg um ca. 180-190 pmol/g Hb
beobachtet. Bei Verabreichung einer Einzeldosis von 0,9 mg Acrylamid/kg KG liegen die
AAVal-Gehalte bei 366 ± 21 pmol/g Hb. Dieser Gehalt ist im Vergleich zur Einzeldosis von
0,45 mg Acrylamid/kg KG etwa um den Faktor 2 erhöht. Nach 9-tägiger Exposition mit
100 µg Acrylamid/kg KG/d steigen die AAVal-Gehalte auf 290 ± 14 pmol/g Hb, welche im
Vergleich zur Einzeldosis von 0,9 mg Acrylamid/kg KG niedriger liegen. Nach Verabreichung
einer Einzeldosis von 10 mg Acrylamid/kg KG wurde ein etwa 10-fach höherer Anstieg der
AAVal-Addukte (3834 ± 488 pmol/g Hb) im Vergleich zur einmaligen Dosis von
0,9 mg Acrylamid/kg KG beobachtet. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass das Ausmaß
der AAVal-Bildung lediglich von der resultierenden Gesamtdosis abhängig ist, was auf eine
Kumulation der Hb-Addukte als Langzeitbiomarker der inneren Exposition zurückzuführen
ist. Aufgrund der im Vergleich zur Lebensdauer der Erythrocyten (ca. 60-90 Tage bei der
Ratte) relativ kurzen Expositionszeit von maximal 9 Tagen sind die ermittelten AAVal-
Gehalte nach wiederholter Exposition mit 50 bzw. 100 µg Acrylamid/kg KG/d mit der
Verabreichung der kumulativen Dosis von 450 bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG vergleichbar.
Ergebnisse und Diskussion
- 66 -
TW 0,45 mg/kg KG 0,9 mg/kg KG 10 mg/kg KG0
100
200
300
400
10002000300040005000
AAVal GAVal
Häm
oglo
bin-
Addu
kte
[pm
ol/g
Hb]
Abb. 4.21: Hämoglobin-Addukt-Bestimmung nach Exposition mit 0,45 mg Acrylamid/kg KG, 0,9 mg Acrylamid/kg KG und 10 mg/kg KG über Trinkwasser (Schlundsondierung), TW: Negativkontrolle, Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe (10 mg Acrylamid/kg KG: 2 Tiere)
Die behandelten Tiere zeigen nach Gabe einer Einzeldosis von 0,45 bzw.
0,9 mg Acrylamid/kg KG keine signifikante Änderung der GAVal-Gehalte im Vergleich zur
Kontrolle. Bei den Kontrolltieren liegt der GAVal-Gehalt mit 16 ± 3 pmol/g Hb höher als
derjenige von AAVal (12 ± 1 pmol/g Hb), was bereits bei den Kontrolltieren der
Fütterungsstudie beobachtet und diskutiert wurde (Kap. 4.1.1.1). Auch bei 9-tägiger
Behandlung mit 50 bzw. 100 µg Acrylamid/kg KG (Fütterungsstudie) wurde kein signifikanter
Anstieg der GAVal-Addukte festgestellt. Dies deutet zusammen mit den in Kap. 4.1.1.4
diskutierten relativ niedrigen Glycidamid-Serumkonzentrationen (< 0,06 µM) nach Aufnahme
von 100 µg Acrylamid/kg KG über Pommes frites (PFG) bzw. Acrylamid-haltiges Trinkwasser
auf im Vergleich zu Acrylamid relativ geringe Glycidamid-Blutkonzentrationen hin. Die
Gehalte an Glycidamid-Mercaptursäure (Kap. 4.2.2) nach Verabreichung der Einzeldosen
deuten darauf hin, dass die Glycidamid-Bildung im Dosisbereich von 50-
10000 µg Acrylamid/kg KG nahezu linear verläuft. Lediglich nach Gabe einer Einzeldosis von
10 mg Acrylamid/kg KG wurde ein signifikanter Anstieg der GAVal-Addukte auf
251 ± 47 pmol/g Hb beobachtet. Darüber hinaus wurde nach Verabreichung einer
Einzeldosis von 10 mg Acrylamid/kg KG ein signifikanter Anstieg der DNA-Schäden in Blut
und Leber beobachtet, wohingegen bei niedrigeren Konzentrationen bis 0,9 mg Acrylamid/kg
mittels Comet Assay kein signifikanter Anstieg der DNA-Schäden bei den behandelten
Tieren im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolltieren gemessen wurde [Feld, persönliche
Mitteilung].
Ergebnisse und Diskussion
- 67 -
4.2.2 Ausscheidung von AAMA, GAMA, Acrylamid und Glycidamid im 24-Stunden-Sammelurin
Nach Verabreichung einer Einzeldosis von 0,45 mg Acrylamid/kg KG lagen die prozentualen
Anteile von AAMA, GAMA, Acrylamid und Glycidamid bei 43,1 ± 2,2 %, 17,6 ± 1,7 %,
3,5 ± 1,5 % und 2,7 ± 0,1 % (Abb. 4.22). Nach 9-tägiger Behandlung mit
50 µg Acrylamid/kg KG/d wurden im 24-Stunden-Urin nach dem letzten Behandlungstag
vergleichbare Werte ermittelt (36,8 ± 4,0 %, 18,1 ± 0,1 %, 3,0 ± 0,2 % und 2,4 ± 0,2 %). Die
nach Gabe einer Einzeldosis von 50 µg Acrylamid/kg KG (Fütterungsstudie, Tag 1)
festgestellte niedrigere Ausscheidung von AAMA (20,9 ± 4,4 % der Dosis) sowie erhöhte
Ausscheidung von GAMA (20,0 ± 3,2 % der Dosis) wurde nach einmaliger Verabreichung
von 0,45 mg Acrylamid/kg KG nicht beobachtet.
0,45 mg/kg KG 0,9 mg/kg KG 10 mg/kg KG0
10
20
30
40
50
Dos
isan
teile
[%]
AAMA GAMA AA GA
Abb. 4.22: Urinmetabolite (AAMA: Acrylamid-Mercaptursäure; GAMA: Glycidamid-Mercaptursäure; AA: Acrylamid; GA: Glycidamid) nach Exposition mit 0,45; 0,9 und 10 mg Acrylamid/kg KG über Trinkwasser (Schlundsondierung), Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe (10 mg Acrylamid/kg KG: 2 Tiere)
Ähnliche Ergebnisse zeigte die Verabreichung einer Einzeldosis von
0,9 mg Acrylamid/kg KG, wobei die prozentualen Anteile von AAMA, Acrylamid und
Glycidamid (39,4 ± 3,3 %, 5,2 ± 1,6 % und 2,6 ± 0,2 %) an der gegebenen Dosis ebenfalls
mit denen nach 9-tägiger Behandlung mit 100 µg Acrylamid/kg KG/d (38,6 ± 2,0 %,
5,7 ± 3,7 %, und 1,9 ± 0,3 %; Fütterungsstudie) vergleichbar waren. Lediglich die GAMA-
Ausscheidung nach 9-tägiger Behandlung mit 100 µg Acrylamid/kg KG/d (12,3 ± 0,2 %) war
Ergebnisse und Diskussion
- 68 -
im Vergleich zur Einzeldosis von 0,9 mg Acrylamid/kg KG (17,1 ± 0,5 %) erniedrigt. Diese
anhand der GAMA-Ausscheidung zu Tage tretende verminderte Bildung von Glycidamid
nach wiederholter Verabreichung würde in Verbindung mit der im Vergleich zur kumulativen
Dosis geringeren AAVal-Bildung (Kap. 4.2.1) auf eine verstärkte Detoxifizierung von
Acrylamid deuten (z. B. durch Induktion von Glutathion-S-Transferasen (GSTs)). Allerdings
wäre im Falle einer GST-Induktion auch eine vermehrte Bildung von Acrylamid-GSH-
Addukten und im weiteren Verlauf eine erhöhte Ausscheidung von AAMA zu erwarten, was
jedoch bei dem durchgeführten Experiment nicht beobachtet wurde. Aufgrund der relativ
niedrigen Anzahl behandelter Tiere zeigen die beobachteten Unterschiede in der
Ausscheidung von GAMA nur eine Tendenz und bedürfen weiterer Abklärung.
Nach Verabreichung einer Einzeldosis von 10 mg Acrylamid/kg KG lagen die prozentualen
Anteile von AAMA, GAMA, Acrylamid und Glycidamid bei 35,1 ± 0,6 %, 22,6 ± 1,5 %,
1,1 ± 0,5 % und 0,6 ± 0,2 %. Im Vergleich zur Dosis von 0,45 bzw. 0,9 mg Acrylamid/kg KG
(GAMA/AAMA: 0,41 ± 0,06 bzw. 0,43 ± 0,03) war eine Verschiebung des GAMA/AAMA-
Verhältnisses (0,65 ± 0,03) zu Gunsten von GAMA zu beobachten. Eine mögliche Erklärung
könnte die Sättigung der Detoxifizierung von Acrylamid durch Kopplung an Glutathion in der
Leber im Dosisbereich von 1-10 mg Acrylamid/kg KG sein, wodurch das verbleibende
Acrylamid vermehrt zu Glycidamid umgewandelt werden könnte. Im Einklang mit der
verminderten AAMA-Ausscheidung war auch der Dosisanteil von Acrylamid im Urin
erniedrigt, wobei die erhöhte GAMA-Ausscheidung durch die Glycidamid-Gehalte im Urin
nicht widergespiegelt wurde. Allerdings ist zu beachten, dass die statistische Aussagekraft
dieser Dosisgruppe (n = 2) begrenzt ist.
Doerge et al. ermittelten nach oraler Verabreichung von 100 µg Acrylamid/kg KG an F344-
Ratten Dosisanteile von 31 % für AAMA und 28 % für GAMA [Doerge et al., 2007]. In der
Veröffentlichung von Fennell et al. lagen die Dosisanteile von AAMA und GAMA nach Gabe
von 3 mg Acrylamid/kg KG an F344-Ratten bei 29 bzw. 21 % [Fennell et al., 2005]. Sumner
et al. beobachteten nach oraler Gabe von 50 mg Acrylamid/kg KG an F344-Ratten
Dosisanteile von 42 % für AAMA und 12 % für GAMA [Sumner et al., 2003]. Diese Daten
lassen vermuten, dass der oxidative Metabolismus von Acrylamid zu Glycidamid in der Ratte
sättigbar ist, da mit zunehmender Dosis die Ausscheidung an GAMA als Biomarker für die
Bildung von Glycidamid abnimmt, wobei die Gesamtausscheidung an Mercaptursäuren auf
vergleichbarem Niveau liegt [Doerge et al., 2007]. In der vorliegenden Arbeit wurde ein
derartiger Effekt im Dosisbereich von 0,05 – 10 mg Acrylamid/kg KG nicht beobachtet.
Ergebnisse und Diskussion
- 69 -
4.3 Einfluss des Narkotisierungsmittels Isofluran auf den
Metabolismus von Acrylamid
Der oxidative Metabolismus von Acrylamid zu Glycidamid erfolgt im Wesentlichen durch
CYP450 2E1 [Sumner et al., 1999; Ghanayem et al., 2005]. Im Rahmen der vorliegenden
Arbeit wurde zur Durchführung der Tierversuche das Narkotisierungsmittel Isofluran
eingesetzt, dessen Metabolismus ebenfalls durch CYP450 2E1 vermittelt wird [Kharasch und
Thummel, 1993; Bradshaw und Ivanetich, 1984]. Da beide Substanzen von dem gleichen
Enzym umgesetzt werden, ist eine gegenseitige Beeinflussung des Metabolismus nicht
auszuschließen. Um den Einfluss des Narkotisierungsmittels Isofluran auf die im Rahmen
der vorliegenden Arbeit verwendeten Acrylamid-Biomarker (Hb-Addukte und
Mercaptursäuren) zu untersuchen wurden an 4 Versuchstiere an zwei aufeinanderfolgenden
Tagen 100 µg Acrylamid/kg KG/d mittels Schlundsonde verabreicht. Bei zwei Versuchstieren
wurden die jeweiligen Schlundsondierungen nach leichter Isofluran-Narkose durchgeführt,
die beiden anderen Tiere wurden ohne Narkotisierung behandelt. Die Mercaptursäuren
wurden nach der letzten Applikation (Tag 2) im 24-Stunden-Sammelurin bestimmt. Die
Entnahme von Blut erfolgte 24 Stunden nach der letzten Applikation.
Wie Tab. 4.1 verdeutlicht steigt der AAVal-Gehalt von 19 ± 4 pmol/g Hb bei den
Kontrolltieren (TW) auf 93 ± 11 pmol/g Hb bei den narkotisierten bzw. 92 ± 2 pmol/g Hb bei
den nicht narkotisierten Tieren an, wobei das Ausmaß der AAVal-Bildung keine signifikanten
Unterschiede zwischen den beiden Behandlungsgruppen erkennen lässt. Die behandelten
Tiere zeigen nach Exposition mit 100 µg Acrylamid/kg KG/d über den Zeitraum von zwei
Tagen sowohl mit als auch ohne Isofluran-Behandlung keine signifikante Änderung der
GAVal-Gehalte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.
Bei den narkotisierten Tieren liegen die Anteile der Mercaptursäuren an der gegebenen
täglichen Dosis (100 µg Acrylamid/kg KG) bei 28,6 ± 0,5 % für AAMA und 14,4 ± 1,3 % für
GAMA. Die entsprechenden Dosisanteile liegen für die nicht narkotisierte
Behandlungsgruppe bei 26,1 ± 2,5 % für AAMA und 15,2 ± 0,4 % für GAMA. Die
Mercaptursäure-Ausscheidung spiegelt die Ergebnisse bei den Hb-Addukten wieder, da
keine signifikanten Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Behandlungsgruppen
beobachtet wurden.
Ergebnisse und Diskussion
- 70 -
Tab. 4.1: Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid sowie Dosisanteile der Mercaptursäuren nach Verabreichung von 100 µg Acrylamid/kg KG/d an zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit (AA-TW (narkotisiert)) und ohne (AA-TW) Isofluran-Narkose. TW: Negativkontrolle; Mittelwert ± SD, 2 Tiere pro Gruppe
AAVal [pmol/g Hb]
GAVal [pmol/g Hb]
AAMA [%]
GAMA [%]
TW 19 ± 4 35 ± 3 - - AA-TW (narkotisiert) 93 ± 11 36 ± 7 28,6 ± 0,5 14,4 ± 1,3
AA-TW 92 ± 2 42 ± 10 26,1 ± 2,5 15,2 ± 0,4
Insgesamt verdeutlichen die Ergebnisse bei den Hb-Addukten und Mercaptursäuren, dass
die unter den Versuchsbedingungen der Fütterungsstudie durchgeführte moderate Isofluran-
Narkose die Hb-Addukt-Bildung bzw. Mercaptursäureausscheidung nicht signifikant
beeinflusst. Insbesondere deutet die GAMA-Ausscheidung der narkotisierten Gruppe auf
eine unveränderte Enzymaktivität von CYP450 2E1 im Hinblick auf den Metabolismus von
Acrylamid zu Glycidamid hin, da es sich bei GAMA um den Hauptmetaboliten von
Glycidamid handelt. Plate et al. untersuchten den Einfluss von Isofluran auf die Aktivität von
CYP450 2E1 in Rattenleber. Dabei wurde bei Wistar-Ratten nach einer Isofluran-
Behandlungsdauer von 75 Sekunden ebenfalls keine signifikante Veränderung der
CYP450 2E1 Enzymaktivität beobachtet [Plate et al., 2005].
Ergebnisse und Diskussion
- 71 -
4.4 Bestimmung des Acrolein-Metaboliten HPMA im Rahmen der
Rattenfütterungsstudie
Bei Acrolein handelt es sich um eine α,β-ungesättigte Carbonylverbindung, welche in
erhitzten Lebensmitteln durch Dehydratisierung von Glycerin, durch Lipidperoxidation sowie
bei der thermischen Zersetzung von Aminosäuren und im Verlauf der Maillard-Reaktion
gebildet werden kann. Darüber hinaus kann Acrolein endogen durch Myeloperoxidase-
vermittelte Oxidation von Threonin und Abbau von Spermin unter Beteiligung von
Aminooxidase entstehen. [Stevens und Maier, 2008]
Um die Acrylamid-Exposition der Rattenfütterungsstudie mit der Belastung durch Acrolein zu
vergleichen, wurde der Gehalt an N-Acetyl-S-(3-hydroxypropyl)cystein (HPMA) im 24-
Stunden-Sammelurin bestimmt, wobei es sich bei HPMA um den Hauptmetaboliten von
Acrolein in der Ratte handelt [Parent et al., 1998; Sanduja et al., 1989]. Darüber hinaus
wurde HPMA im Urin von Ratten nach Aufnahme von Allylalkohol (2-Propen-1-ol),
Allylchlorid (3-Chlorpropen), Allylbromid (3-Brompropen), Allylcyanid (3-Butennitril) und
Cyclophosphamid gefunden.
D3-HPMA
HPMA
D3-HPMA
HPMA
Abb. 4.23: HPLC-MS/MS Chromatogramm zur Bestimmung von HPMA im 24-Stunden-Sammelurin (100 µg Acrylamid/kg KG über geschnittene Pommes frites (PFG); einmalige Verabreichung)
Abb. 4.23 zeigt ein repräsentatives HPLC-MS/MS-Chromatogramm einer mit Pommes frites
(PFG; 1 Tag) gefütterten Ratte. Der Analyt HPMA weist eine Retentionszeit von 12,5
Minuten auf, welche mit der Retentionszeit des internen Standards D3-HPMA übereinstimmt.
Die Gesamtausscheidung von HPMA (Abb. 4.24) lag bei den mit Acrylamid behandelten
Ergebnisse und Diskussion
- 72 -
Tieren (50 bzw. 100 µg Acrylamid/kg KG/d) und Negativkontrollen bei 229 ± 74 nmol
(Median: 229; Range: 39-421). Insgesamt wurden bei allen untersuchten Tieren starke
individuelle Unterschiede sowohl innerhalb als auch zwischen den einzelnen
Behandlungsgruppen beobachtet. Dadurch sind zwischen den Gruppen der getesteten
Lebensmittel und Negativkontrollen bzw. Expositionsperioden keine signifikanten
Unterschiede zu erkennen.
TW AA-TW (a) BK AA-TW (b) PFG PFR LK0
50
100
150
200
250
300
350
400
*
Ges
amta
ussc
heid
ung
[nm
ol]
HPMA AAMA+GAMA
Abb. 4.24: Gesamtausscheidung der Mercaptursäuren von Acrolein (HPMA) sowie Acrylamid (AAMA+GAMA) nach Verabreichung acrylamidreicher Lebensmittel gemittelt über die Expositionsperioden 1, 3, 5, 7 und 9 Tage, TW: Negativkontrolle, AA-TW (a): 50 µg Acrylamid/kg KG/d über Trinkwasser (Schlundsonde), BK: Brotkruste (50 µg Acrylamid/kg KG/d), AA-TW (b): 100 µg Acrylamid/kg KG/d über Trinkwasser (Schlundsonde), PFG: Pommes frites aus der Kartoffel geschnitten; PFR: Pommes frites aus Kartoffelerzeugnissen rekonstituiert, LK: Lebkuchen (jeweils 100 µg Acrylamid/kg KG/d); Mittelwert ± SD, 15 Tiere pro Gruppe, *: signifikant unterschiedlich zur Negativkontrolle (*p<0,05)
Lediglich bei Aufnahme von Pommes frites (PFR) wurde unter Berücksichtigung aller
Expositionsperioden (1, 3, 5, 7 und 9 Tage) eine signifikant erhöhte Ausscheidung von
HPMA im Vergleich zu den Negativkontrollen festgestellt (p < 0,05). Da weder die Acrolein-
Gehalte der Lebensmittel noch die der Standarddiät bekannt waren und auch Unterschiede
in der endogenen Bildung von Acrolein bei den jeweiligen Tieren nicht ausgeschlossen
werden können, kann keine endgültige Aussage zu den Ergebnissen getroffen werden.
Allerdings deuten die HPMA-Gehalte auf einen geringen Beitrag der verabreichten
Lebensmittel zur Acrolein-Gesamtexposition unter den Versuchsbedingungen der
Fütterungsstudie hin. Bei Verabreichung von 100 µg Acrylamid/kg KG war die
ausgeschiedene Stoffmenge von Acrylamid-Mercaptursäuren (AAMA+GAMA) mit derjenigen
Ergebnisse und Diskussion
- 73 -
von HPMA vergleichbar, wobei bei den Negativkontrollen um Faktor 20-30 höhere HPMA-
Gehalte im Vergleich zu den Acrylamid-Mercaptursäuregehalten bestimmt wurden. Diese
Hintergrundbelastung könnte aus Acrolein belasteter Standarddiät sowie der endogenen
Bildung von Acrolein resultieren. Darüber hinaus ist eine Exposition über die Atemluft
möglich. Aus den Gehalten an HPMA ergibt sich ohne Berücksichtigung sonstiger Acrolein-
Metabolite eine mittlere Belastung von 46 ± 16 µg Acrolein/kg KG (Median: 46; Range: 9-
147). Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die im Rahmen der Tierstudie verwendeten
Sprague Dawley-Ratten neben der verabreichten Acrylamid-Dosis auch einer relativ hohen
Acrolein-Exposition ausgesetzt sind.
Ergebnisse und Diskussion
- 74 -
4.5 Bestimmung des Acrolein-Metaboliten HPMA nach
Verabreichung von 0,05-10 mg Acrylamid/kg KG an Ratten
Um den Einfluss relativ hoher Acrylamid-Dosen auf die Konjugation von Acrolein mit
Glutathion zu untersuchen, wurden die Gehalte an HPMA nach Verabreichung einer
Einzeldosis von bis zu 10 mg Acrylamid/kg KG bestimmt (Abb. 4.25).
TW
50µg
AA/kgKG
100µ
gAA/kg
KG
450µ
gAA/kg
KG
900µ
gAA/kg
KG
10mgAA/kg
KG
0
50
100
150
200
250
300
350
400
HPM
A [n
mol
]
Abb. 4.25: HPMA-Ausscheidung nach einmaliger Verabreichung von Acrylamid-haltigem Trinkwasser mittels Schlundsonde; TW: Negativkontrolle; Mittelwert ± SD, 3 Tiere pro Gruppe (10 mg Acrylamid/kg KG: 2 Tiere)
Die Gesamtausscheidung von HPMA (Abb. 4.25) lag bei den mit Acrylamid behandelten
Tieren und Negativkontrollen bei 188 ± 64 nmol (Median: 193; Range: 40-259). Diese
Stoffmenge entspricht unter Ausschluss weiterer Acrolein-Metabolite einer Dosis von
41 ± 14 µg Acrolein/kg KG (Median: 46 µg/kg KG; Range: 9-58 µg/kg KG). Auch in diesem
Experiment wurden starke individuelle Unterschiede sowohl innerhalb als auch zwischen den
einzelnen Behandlungsgruppen beobachtet, was bereits bei den Versuchstieren der
Fütterungsstudie diskutiert wurde und möglicherweise auf Unterschiede in der endogenen
Bildung von Acrolein sowie unterschiedliche Aufnahmemengen der vermutlich Acrolein-
haltigen Standarddiät zurückzuführen ist. Zwischen den Versuchstieren der verschiedenen
Ergebnisse und Diskussion
- 75 -
Behandlungsgruppen waren keine signifikanten Unterschiede in der Gesamtausscheidung
von HPMA zu erkennen. Selbst bei der höchsten Acrylamid-Dosis von
10 mg Acrylamid/kg KG lagen die Gehalte an HPMA im Bereich der unbehandelten
Kontrollen (TW), d. h. die mit hohen Acrylamid-Dosen einhergehende GSH-Depletion führt
zu keiner verminderten Ausscheidung von HPMA im 24-Stunden-Urin. Diese Ergebnisse
stehen im Einklang mit den bei hohen Acrylamid-Dosen beobachteten unveränderten
Anteilen der Acrylamid-Mercaptursäuren AAMA und GAMA (Kap. 4.2.2) und verdeutlichen
die hohe Effektivität und Kapazität des durch Kopplung mit Glutathion vermittelten Phase II-
Metabolismus.
Ergebnisse und Diskussion
- 76 -
4.6 Zusammenfassende Diskussion der Ergebnisse aus den
Tierversuchen
Um zu untersuchen, inwieweit spezifische Lebensmittelmatrices die Bioverfügbarkeit und
den Metabolismus von Acrylamid beeinflussen, wurden Pommes frites (PFG: aus der
Kartoffel geschnitten (mit intakter Gewebestruktur); PFR: aus Kartoffelerzeugnissen
rekombiniert) sowie Brotkruste (BK) und Lebkuchen (LK) an männliche Sprague Dawley-
Ratten über 1-9 Tage verfüttert und mit der Aufnahme von Acrylamid über Trinkwasser
(Schlundsondierung, AA-TW) verglichen. Die tägliche Acrylamid-Dosis wurde auf
100 µg/kg KG für Pommes frites und Lebkuchen bzw. 50 µg/kg KG für Brotkruste eingestellt.
Bei allen Behandlungsgruppen waren deutliche, nahezu lineare Anstiege der AAVal-Hb-
Addukt-Gehalte in Abhängigkeit von der Behandlungszeit und damit der kumulativen
Acrylamid-Dosis zu erkennen. Das Ausmaß der AAVal-Bildung in den Tieren, denen
Acrylamid über Pommes frites (PFG, PFR) verabreicht wurde, entsprach weitgehend jener
nach Gabe einer entsprechenden Dosis Acrylamid in Trinkwasser mittels Schlundsondierung
(AA-TW-Gruppen), was auf eine vergleichbare Bioverfügbarkeit von Acrylamid hindeutet. Bei
einer Acrylamid-Resorptionsstudie in Schweinen wurde die Acrylamid-Aufnahme aus
kommerziellem Schweinefutter, welches Beimengungen von Kartoffelchips mit definiertem
Acrylamid-Gehalt enthielt, mit der Aufnahme aus Trinkwasser verglichen. Dabei wurden
ebenfalls keine signifikanten Unterschiede in der Bildung von AAVal-Addukten festgestellt
[Aureli et al., 2007]. Vikström et al. untersuchten die Acrylamid-Aufnahme über Futter
unterschiedlicher Zusammensetzung unter subchronischen Bedingungen im Niedrig-Dosis-
Bereich (3-50 µg/kg KG/d) an Mäusen. Dabei wurden anhand der Gehalte an AAVal- und
GAVal-Addukten ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen den unterschiedlich
zusammengesetzten Futtermitteln festgestellt [Vikström et al., 2008].
Lediglich in den Gruppen, die Acrylamid über Brotkruste erhielten, wurde eine geringfügige,
um ca. 15-20 % verminderte Bildung von AAVal-Hb-Addukten im Vergleich zu den AA-TW-
Gruppen beobachtet. Diejenigen Behandlungsgruppen, welche Acrylamid über Lebkuchen
erhielten, zeigten nach allen Expositionszeiträumen eine signifikant unterschiedliche AAVal-
Hb-Adduktbildung im Vergleich zu den AA-TW-Gruppen. Für den Acrylamid-Gehalt des
Lebkuchens wurden im Rahmen mehrmals durchgeführter Kontrollmessungen stark
unterschiedliche Werte ermittelt (4150 ± 800 µg Acrylamid/kg; Kap. 6.1.1), obwohl die in den
jeweiligen Messungen untersuchten Lebkuchen jeweils aus der gleichen Probe stammten
und gleich behandelt wurden. Daher wurden in Abhängigkeit von den jeweiligen
Analysenergebnissen für die Durchführung der Fütterungsversuche zu den jeweiligen
Versuchsabschnitten unterschiedliche Acrylamid-Gehalte des Lebkuchens zu Grunde gelegt.
Ergebnisse und Diskussion
- 77 -
Vermutlich reflektieren die AAVal-Messwerte die ungenaue Charakterisierung des Gehaltes
an Acrylamid im Lebkuchen, geben aber keinen Anhaltspunkt für Unterschiede in der
Bioverfügbarkeit.
Bei den Negativkontrollen (TW-Gruppen) liegen die GAVal-Gehalte 1,4-3,5-fach höher als
die entsprechenden AAVal-Gehalte. Vergleichbare Hintergrundgehalte in Ratten wurden von
Tareke et al. (GAVal/AAVal: 2-3) sowie von Paulsson et al. (GAVal/AAVal = 1,8) beobachtet
[Tareke et al. 2006; Paulsson et al. 2002]. Vermutlich sind die Hintergrundgehalte an AAVal
und GAVal auf die Acrylamid-Belastung der Standarddiät (ca. 11 µg Acrylamid/kg)
zurückzuführen. Darüber hinaus könnte eine endogene Bildung von Acrylamid einen
geringen Beitrag zur Hintergrundexposition leisten. Bei geringen Acrylamid-Konzentrationen
könnte die Bindung von Acrylamid an SH-Gruppen überwiegen, da nach dem Hard-Soft-
Acid-Base-Konzept nach Pearson die Thiol-Reaktivität von Acrylamid im Vergleich zu
Glycidamid größer ist [Ayers et al., 2006]. Dies wäre eine mögliche Erklärung für die im
Vergleich zu AAVal höheren GAVal-Gehalte. Hamdan et al. zeigten, dass nach den SH-
Gruppen des Cysteins nicht die freie α-Aminogruppe sondern die ε-Aminogruppe des Lysins
die nachgeordnet wichtigste Rolle bei der Adduktbildung von Acrylamid mit Proteinen spielt,
wodurch die resultierenden Addukt-Gehalte ebenfalls beeinflusst werden könnten [Hamdan
et al., 2001].
Die behandelten Tiere zeigen nach den durchgeführten Expositionsperioden keine
signifikante Änderung der GAVal-Konzentration im Vergleich zur Kontrolle. Dies deutet auf
eine geringe Glycidamid-Blutkonzentration bzw. systemische Verfügbarkeit von Glycidamid
hin, wobei der daraus resultierende GAVal-Anstieg mit der verwendeten analytischen
Methode vermutlich nicht erfasst werden kann. Diese Vermutung wird durch die im Vergleich
zu den entsprechenden Acrylamid-Serumkonzentrationen um den Faktor 10-30 niedrigeren
Glycidamid-Serumkonzentrationen (< 0,06 µM) nach Aufnahme von 100 µg Acrylamid/kg KG
über Pommes frites (PFG) bzw. Acrylamid-haltiges Trinkwasser gestützt (Kap. 4.1.1.4).
Lediglich nach Verabreichung von 10 mg Acrylamid/kg KG (Kap. 4.2.1) wurde ein
signifikanter Anstieg der GAVal-Bildung beobachtet. Das heißt, bei höheren Dosen wird das
in der Leber metabolisch aus Acrylamid gebildete Glycidamid als Hb-Addukt in
entsprechender Konzentration nachgewiesen. In der niedrigen Dosierung von 9 Tagesdosen
(à 100 µg bzw.50 µg Acrylamid/kg KG), also einer Gesamtdosis von 900 µg Acrylamid/kg
KG, bleibt das Glycidamid-Hb-Addukt im Bereich der unbehandelten Kontrolle, während das
Acrylamid-Hb-Addukt dosisabhängig ansteigt. Tareke et al. fanden nach oraler
Verabreichung (Schlundsondierung) von 100 µg Acrylamid/kg KG an männliche und
weibliche F344-Ratten Anstiege der AAVal- und GAVal-Gehalte von 10-20 bzw. 30-90
pmol/g Hb [Tareke et al. 2006]. Ebenfalls höhere GAVal- als AAVal-Anstiege wurden von
Törnqvist et al. nach Verabreichung von 100 bzw. 500 µg Acrylamid/kg KG/d über 7 Tage
Ergebnisse und Diskussion
- 78 -
bestimmt [Törnqvist et al., 2008]. Dabei lagen die AAVal- und GAVal-Gehalte der weiblichen
F344-Ratten bei 160 pmol/g Hb und 320 pmol/g Hb (100 µg/kg KG/d; Gesamtdosis
700 µg/kg KG) sowie 680 pmol/g Hb und 1710 pmol/g Hb (500 µg/kg KG/d; Gesamtdosis
3500 µg/kg KG). Allerdings wurde bei dieser Studie die Acrylamid-Dosis nicht mittels
Schlundsondierung, sondern über das Trinkwasser verabreicht, was vermutlich eine
veränderte Toxikokinetik zur Folge hat. Insbesondere könnte durch die kontinuierliche
Aufnahme von Acrylamid im Trinkwasser der Metabolismus zum Glycidamid effektiver
verlaufen, woraus höhere GAVal-Addukt-Gehalte resultieren könnten. Im Vergleich dazu
bestimmten Fennell et al. bei einer vergleichbaren oralen Gabe (Schlundsondierung) von
3000 µg/kg KG an F344-Ratten höhere AAVal- als GAVal-Anstiege (890 bzw. 750 pmol/g
Hb) [Fennell et al., 2005].
Die Anteile der Mercaptursäuren an der verabreichten täglichen Dosis lagen über alle
Behandlungsgruppen und Expositionsperioden gemittelt bei 36 ± 10 % für AAMA und
18 ± 4 % für GAMA, wobei im Hinblick auf die Gesamtausscheidung keine signifikanten
Unterschiede in Abhängigkeit von der Expositionsdauer erkennbar waren. Vergleichbare
prozentuale Anteile der Mercaptursäuren (AAMA + GAMA) nach oraler Verabreichung von
0,1-50 mg/kg KG an Ratten über Trinkwasser wurden von Doerge et al. (59 %), Fennell et al.
(50 %) und Sumner et al. (46 %, 54 %) beobachtet [Doerge et al., 2007; Fennell et al., 2005;
Sumner et al., 1992; 2003].
Nach Aufnahme von Acrylamid über Pommes frites wurde kein signifikanter Unterschied in
der Gesamtausscheidung an Mercaptursäuren im Vergleich zur Gabe in Trinkwasser mittels
Schlundsondierung (AA-TW-Gruppen) beobachtet, was auf eine vergleichbare
Bioverfügbarkeit von Acrylamid hindeutet.
Bei den mit Brotkruste behandelten Tieren wurde eine im Vergleich zu AA-TW-Gruppen
geringfügig erniedrigte Ausscheidung an AAMA beobachtet, was im Einklang mit der
erniedrigten AA-Val-Bildung steht. Doerge et al. untersuchten die Aufnahme von
100 µg Acrylamid/kg KG an F344-Ratten nach intravenöser im Vergleich zu oraler
Verabreichung. Bei Acrylamid-Aufnahme über die Nahrung betrug die Bioverfügbarkeit im
Vergleich zur intravenösen Verabreichung 32-44 %, was auf einen ausgeprägten Einfluss
durch die Lebensmittelmatrix schließen lässt [Doerge et al., 2005]. Allerdings ist bei dieser
Studie zu beachten, dass die Acrylamid-Gehalte im Futter durch Zusatz von Acrylamid-
Lösungen generiert wurden. Dabei könnte die Reaktion von Futterinhaltsstoffen mit dem
zugesetzten Acrylamid zu einer Verminderung der freien Acrylamid-Gehalte führen, wodurch
sich die resorbierbare Gesamtmenge bei Einstellung einer bestimmten Dosis verringern
würde. In der vorliegenden Arbeit wurden Lebensmittel verwendet, in denen der Acrylamid-
Gehalt bei der Herstellung generiert wurde, so dass es sich bei den Analysenergebnissen
um den tatsächlich vorhandenen Gehalt an freiem, resorbierbarem Acrylamid handelt.
Ergebnisse und Diskussion
- 79 -
Nach Aufnahme von Acrylamid über Lebkuchen wurden nach allen Expositionsperioden
Unterschiede in der Mercaptursäure-Ausscheidung im Vergleich zu den AA-TW-Gruppen
festgestellt, was vermutlich die ungenaue Charakterisierung des Acrylamid-Gehalts im
Lebkuchen reflektiert und die Ergebnisse bei den AAVal-Hb-Addukten widerspiegelt.
Nach Exposition mit Acrylamid über Pommes frites und Brotkruste konnte eine Veränderung
des Mercaptursäure-Verhältnisses GAMA/AAMA hin zu einer verstärkten Bildung von GAMA
im Vergleich zu den AA-TW-Gruppen gezeigt werden. Die höheren GAMA/AAMA-
Verhältnisse bei Acrylamid-Aufnahme über Pommes frites und Brotkruste könnten auf eine
verzögerte Freisetzung von Acrylamid aus der Lebensmittelmatrix bzw. Resorption im
Gastrointestinaltrakt zurückgeführt werden. Dadurch könnte einerseits die maximal
erreichbare Konzentration von Acrylamid im Blut im Vergleich zur Acrylamid-Aufnahme über
Trinkwasser (Schlundsonde) geringer werden, andererseits könnte diese Acrylamid-
Konzentration über einen längeren Zeitraum konstant gehalten werden, wodurch die
metabolische Umwandlung von Acrylamid zu Glycidamid effektiver sein könnte. Bei der
erstmaligen Gabe der Acrylamid-Dosis wurden im Vergleich zur wiederholten Verabreichung
die höchsten GAMA/AAMA-Verhältnisse beobachtet, was auf adaptive Effekte hindeuten
könnte.
Für die Ermittlung der Gesamtbilanz an Acrylamid-Ausscheidung aus dem Organismus
wurde die Acrylamid- und Glycidamid-Ausscheidung im 24-Stunden-Sammelurin bestimmt.
Die ausgeschiedenen Anteile an der verabreichten Tagesdosis lagen über die
Behandlungsgruppen und Expositionsperioden gemittelt bei 3,1 ± 2,4 % für Acrylamid und
2,4 ± 1,3 % für Glycidamid. Zwischen den unterschiedlichen Behandlungsgruppen wurden
keine signifikanten Unterschiede in der Acrylamid- bzw. Glycidamid-Ausscheidung
beobachtet, wobei innerhalb der AA-TW-Gruppen tendenziell mehr Acrylamid über den Urin
ausgeschieden wurde. Diese Beobachtung könnte auf die in Kap. 4.1.1.4 diskutierten
höheren Acrylamid-Serumkonzentrationen bei Verabreichung von Acrylamid über
Trinkwasser zurückgeführt werden. Allerdings führt die tendenziell höhere Ausscheidung von
Acrylamid zu keiner signifikant veränderten Gesamtausscheidung der Mercaptursäuren
AAMA und GAMA, da die mittleren Anteile an freiem Acrylamid und Glycidamid im Urin meist
unter 10 % der verabreichten Dosis liegen und damit einen geringen Anteil zur
Gesamtausscheidung von Acrylamid leisten. Darüber hinaus wurden nach einmaliger
Verabreichung von Acrylamid tendenziell höhere Glycidamid-Gehalte im Urin festgestellt,
wobei die beobachteten Unterschiede weniger als 1 % der verabreichten Dosis betragen.
Die bei den Brotkruste-Gruppen beobachteten reduzierten AAVal- und AAMA-Gehalte
korrelieren nicht mit der Ausscheidung von Acrylamid oder Glycidamid über den Urin. Im
Rahmen früherer Arbeiten im Arbeitskreis wurden die Gehalte an freiem Acrylamid und
Glycidamid in den Fäces der behandelten Tiere bestimmt [Gerhardt, 2008]. Dabei konnte in
Ergebnisse und Diskussion
- 80 -
keiner der untersuchten Proben Glycidamid nachgewiesen werden. Bei den
Fütterungsversuchen mit Pommes frites und Lebkuchen lagen die Acrylamid-Gehalte bei
53 % der Proben unter der Nachweisgrenze. Bei den übrigen Tieren lagen die mittleren
Dosis-Anteile von freiem Acrylamid bei 1,1 % (Pommes frites) und 1,2 % (Lebkuchen). Bei
Verabreichung von Brotkruste konnte in nahezu allen Fäces-Proben Acrylamid
nachgewiesen werden, wobei die mittleren Anteile an der verabreichten Dosis mit 3,4 %
tendenziell höher als bei Aufnahme von Acrylamid über Pommes frites bzw. Lebkuchen
lagen. Allerdings wurden auch in den Fäces-Proben von Negativkontrollen relativ hohe
Acrylamid-Gehalte gemessen, so dass keine endgültige Aussage über die tatsächlich über
Fäces ausgeschiedene Menge an Acrylamid bei Aufnahme über die Lebensmittel getroffen
werden kann.
Zum Vergleich der Toxikokinetik von Acrylamid bei wiederholter Verabreichung (50 bzw.
100 µg Acrylamid/kg KG/d für maximal 9 Tage) mit derjenigen nach Gabe der
entsprechenden kumulativen Einzeldosis wurden 450 bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG über
Trinkwasser mittels Schlundsondierung an Sprague Dawley-Ratten verabreicht. Darüber
hinaus wurde zur Untersuchung der Acrylamid-Toxikokinetik im Hochdosisbereich eine Dosis
von 10 mg Acrylamid/kg KG verabreicht. Dabei konnten bei den behandelten Tieren nahezu
lineare Anstiege der AAVal-Hb-Addukte in Abhängigkeit von der verabreichten Acrylamid-
Dosis beobachtet werden. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass das Ausmaß der AAVal-
Bildung lediglich von der resultierenden Gesamtdosis abhängig ist, was auf eine Kumulation
der Hb-Addukte als Langzeitbiomarker der inneren Exposition zurückzuführen ist. Aufgrund
der im Vergleich zur Lebensdauer der Erythrocyten (ca. 60-90 Tage bei der Ratte) relativ
kurzen Expositionszeit von maximal 9 Tagen sind die ermittelten AAVal-Gehalte nach
wiederholter Exposition mit 50 bzw. 100 µg Acrylamid/kg KG/d mit der Verabreichung der
kumulativen Dosis von 450 bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG vergleichbar. Die behandelten
Tiere zeigen nach Gabe einer Einzeldosis von 0,45 bzw. 0,9 mg Acrylamid/kg KG keine
signifikante Änderung der GAVal-Gehalte im Vergleich zur Kontrolle. Lediglich nach
Verabreichung von 10 mg Acrylamid/kg KG wurde ein signifikanter Anstieg der GAVal-
Addukte im Vergleich zu den Negativkontrollen beobachtet.
Die über den Urin ausgeschiedenen Anteile von AAMA, GAMA sowie freiem Acrylamid und
Glycidamid an der verabreichten Dosis von 0,45-10 mg Acrylamid/kg KG waren mit den
Ergebnissen nach einmaliger bzw. wiederholter Gabe von 50 bzw. 100 µg Acrylamid/kg KG/d
vergleichbar. Doerge et al. ermittelten nach oraler Verabreichung von
100 µg Acrylamid/kg KG an F344-Ratten Dosisanteile von 31 % für AAMA und 28 % für
GAMA [Doerge et al., 2007]. In der Veröffentlichung von Fennell et al. lagen die Dosisanteile
von AAMA und GAMA nach Gabe von 3 mg Acrylamid/kg KG an F344-Ratten bei 29 bzw.
Ergebnisse und Diskussion
- 81 -
21 % [Fennell et al., 2005]. Sumner et al. beobachteten nach oraler Gabe von
50 mg Acrylamid/kg KG an F344-Ratten Dosisanteile von 42 % für AAMA und 12 % für
GAMA [Sumner et al., 2003]. Diese Daten lassen vermuten, dass der oxidative
Metabolismus von Acrylamid zu Glycidamid in der Ratte sättigbar ist, da mit zunehmender
Dosis die Ausscheidung an GAMA als Biomarker für die Bildung von Glycidamid abnimmt,
wobei die Gesamtausscheidung an Mercaptursäuren auf vergleichbarem Niveau bleibt
[Doerge et al., 2007]. In der vorliegenden Arbeit wurde ein derartiger Effekt im Dosisbereich
von 0,05 – 10 mg Acrylamid/kg KG nicht beobachtet.
Zur Untersuchung der Resorptionskinetik von Acrylamid bei Verabreichung von 100 µg
Acrylamid/kg KG über Pommes frites im Vergleich zur Aufnahme in Trinkwasser
(Schlundsondierung) (Kap. 4.1.1.4) wurden in der vorliegenden Arbeit über einen Zeitraum
von 4 Stunden die Acrylamid- und Glycidamid-Gehalte in Rattenserum bestimmt. Dabei lag
die maximale Acrylamid-Serumkonzentration bei Acrylamid-Aufnahme über Trinkwasser
(Schlundsonde) etwa um den Faktor 3-4 höher als bei Acrylamid-Gabe über Pommes frites.
Die nach Aufnahme von Acrylamid über Pommes frites gemessenen geringeren Acrylamid-
Serumgehalte deuten auf eine verzögerte Freisetzung von Acrylamid aus Lebensmitteln bzw.
verlangsamte Resorption im Gastrointestinaltrakt im Vergleich zur Acrylamid-Aufnahme über
Trinkwasser hin. Unterstützt wird diese Annahme durch eine Verschiebung des
Mercaptursäure-Verhältnisses GAMA/AAMA zu Gunsten von GAMA (Kap. 4.1.1.2) bei
Acrylamid-Aufnahme über Pommes frites, da bei einer verzögerten Resorption der
Metabolismus von Acrylamid zu Glycidamid effektiver sein könnte. Glycidamid konnte bei
den behandelten Gruppen lediglich 4 Stunden nach der Acrylamid-Aufnahme nachgewiesen
werden, wobei die gemessenen Konzentrationen unter der Bestimmungsgrenze der
verwendeten Methode zur Bestimmung von Glycidamid in Rattenserum lagen. Die bei
Acrylamid-Aufnahme über Pommes frites im Vergleich zur AA-TW-Gruppe anhand des
Biomarkers GAMA beobachtete tendenziell erhöhte Bildung von Glycidamid wird durch die
Glycidamid-Serumgehalte nicht widergespiegelt, da der überwiegende Teil des in der Leber
gebildeten Glycidamids vermutlich unmittelbar mit GSH gekoppelt wird. Darüber hinaus lag
auch die in Kap. 4.1.1.3 beschriebene Glycidamid-Ausscheidung über den Urin bei
einmaliger Verabreichung von 100 µg Acrylamid/kg KG über Trinkwasser (AA-TW) bzw.
Pommes frites (PFG) mit einem Anteil von ca. 3 % der gegebenen Dosis auf vergleichbarem
Niveau. Für eine effiziente Entgiftung des metabolisch gebildeten Glycidamid spricht auch
die Tatsache, dass mit der im Arbeitskreis etablierten Methode des Comet Assay nach FPG-
Behandlung keine signifikanten DNA-Schäden im Blut und in der Leber der behandelten
Tiere detektiert wurden [Feld, persönliche Mitteilung].
Ergebnisse und Diskussion
- 82 -
Da die Entnahme von Serumproben nur bis zu einem Zeitraum von 4 Stunden nach
Acrylamid-Aufnahme erfolgte und Glycidamid lediglich nach 4 Stunden detektiert werden
konnte, wäre in Anbetracht der vorhandenen Acrylamid-Serumkonzentration ein weiterer
Anstieg der Glycidamid-Serumkonzentration denkbar. Doerge et al. untersuchten die
Resorptionskinetik von Acrylamid an F344-Ratten über einen Zeitraum von 10-12 Stunden
nach Verabreichung von 100 µg/kg KG i.v. bzw. mittels Schlundsondierung sowie Gabe von
Acrylamid-dotierter Standarddiät [Doerge et al., 2005]. Dabei wurde in den untersuchten
Behandlungsgruppen die maximale Glycidamid-Serumkonzentration bereits 2-4 Stunden
nach der Acrylamid-Verabreichung beobachtet, so dass die Wahrscheinlichkeit für einen
wesentlichen Anstieg der in der vorliegenden Arbeit gemessenen Glycidamid-
Serumkonzentrationen über den Zeitraum von 4 Stunden hinaus als gering einzuschätzen
ist.
In der Studie von Doerge et al. wurden nach oraler Verabreichung von
100 µg Acrylamid/kg KG an männliche F344-Ratten die maximalen Acrylamid-
Serumkonzentrationen nach 1-2 Stunden erreicht und lagen bei ca. 0,4 bzw. 0,3 µM für die
Gabe mittels Schlundsonde bzw. Acrylamid-dotierter Standarddiät [Doerge et al., 2005].
Diese maximalen Acrylamid-Serumgehalte liegen insbesondere bei Verabreichung mittels
Schlundsonde (Faktor: ~ 4) unter den in der vorliegenden Arbeit ermittelten Konzentrationen.
Allerdings liegen die maximalen Glycidamid-Serumkonzentrationen (ca. 0,2 µM) über den im
Rahmen der vorliegenden Arbeit gemessenen Konzentrationen (< 0,06 µM). Weiterhin
wurden von Doerge et al. nach oraler Verabreichung von 100 µg Acrylamid/kg KG an
männliche F344-Ratten höhere GAMA- (27-29 % der verabreichten Dosis) sowie höhere
Glycidamid-Gehalte (6 % der verabreichten Dosis) im Vergleich zur vorliegenden Arbeit
(GAMA: 18 ± 4 %; GA: 2,4 ± 1,3 %) berichtet [Doerge et al., 2007]. Tareke et al.
Untersuchten die Acrylamid- und Glycidamid-Hb-Adduktbildung nach Verabreichung von
100 µg Acrylamid/kg KG per Schlundsonde an männlichen F344-Ratten [Tareke et al., 2006].
Dabei wurde ein Anstieg von GAVal um 20-30 pmol/g Hb berichtet, während sich die AAVal-
Gehalte lediglich um ca. 10 pmol/g Hb erhöhten. Darüber hinaus beobachteten die Autoren
bei der Inkubation von Rattenlebermikrosomen mit Acrylamid Unterschiede in der
Geschwindigkeit der Glycidamid-Bildung, wobei die Geschwindigkeitskonstante bei F344-
Ratten mit 12 pmol/min/mg Protein um mehr als 80 % höher lag als diejenige von Sprague-
Dawley-Ratten (7 pmol/min/mg Protein). In der vorliegenden Arbeit stiegen die AAVal-
Gehalte nach einmaliger Verabreichung von 100 µg Acrylamid/kg KG an männliche Sprague
Dawley Ratten mittels Schlundsonde um ca. 30 pmol/g Hb an, während sich die GAVal-
Adduktgehalte nicht signifikant veränderten. Die zitierten Studien deuten auf Unterschiede in
der Toxikokinetik von Acrylamid in F344-Ratten im Vergleich zu den in der vorliegenden
Arbeit verwendeten Sprague Dawley-Ratten hin. Darüber hinaus muss berücksichtigt
Ergebnisse und Diskussion
- 83 -
werden, dass die Körpergewichte der F344-Ratten (ca. 150 g) in diesen Studien weit unter
den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Sprague Dawley Ratten (ca. 280 g) lagen, was
ebenfalls die Toxikokinetik von Acrylamid beeinflussen könnte.
Um den Einfluss des Narkotisierungsmittels Isofluran auf die im Rahmen der vorliegenden
Arbeit verwendeten Acrylamid-Biomarker (Hb-Addukte und Mercaptursäuren) in den
behandelten Tieren zu untersuchen wurden an zwei aufeinanderfolgenden Tagen
100 µg Acrylamid/kg KG/d mittels Schlundsonde verabreicht. Bei zwei Versuchstieren
wurden die jeweiligen Schlundsondierungen nach leichter Isofluran-Narkose durchgeführt,
die beiden anderen Tiere wurden ohne Narkotisierung behandelt. Insgesamt verdeutlichen
die Ergebnisse bei den Hb-Addukten und Mercaptursäuren, dass die unter den
Versuchsbedingungen der Fütterungsstudie durchgeführte moderate Isofluran-Narkose die
Hb-Addukt-Bildung bzw. Mercaptursäureausscheidung nicht signifikant beeinflusst.
Insbesondere deutet die GAMA-Ausscheidung der narkotisierten Gruppe auf eine
unveränderte Enzymaktivität von CYP450 2E1 im Hinblick auf den Metabolismus von
Acrylamid zu Glycidamid hin, da es sich bei GAMA um den Hauptmetaboliten von
Glycidamid handelt. Plate et al. untersuchten den Einfluss von Isofluran auf die Aktivität von
CYP450 2E1 in Rattenleber. Dabei wurde bei Wistar-Ratten nach einer Isofluran-
Behandlungsdauer von 75 Sekunden ebenfalls keine signifikante Veränderung der
CYP450 2E1 Enzymaktivität beobachtet [Plate et al., 2005].
Bei Acrolein handelt es sich um eine α,β-ungesättigte Carbonylverbindung, welche in
erhitzten Lebensmitteln durch Dehydratisierung von Glycerin, durch Lipidperoxidation sowie
bei der thermischen Zersetzung von Aminosäuren und im Verlauf der Maillard-Reaktion
gebildet werden kann. Darüber hinaus kann Acrolein endogen durch Myeloperoxidase-
vermittelte Oxidation von Threonin und Abbau von Spermin unter Beteiligung von
Aminooxidase entstehen. [Stevens und Maier, 2008]
Um die Acrylamid-Exposition der Versuchstiere mit derjenigen von Acrolein zu vergleichen,
wurde der Gehalt an N-Acetyl-S-(3-hydroxypropyl)cystein (HPMA) im 24-Stunden-
Sammelurin bestimmt, wobei es sich bei HPMA um den Hauptmetaboliten von Acrolein
handelt. Dabei konnte über den Gehalt an HPMA im Urin der Tiere eine theoretische mittlere
Belastung von 46 ± 16 µg Acrolein/kg KG berechnet werden. Insgesamt wurden bei den
untersuchten Tieren große individuelle Unterschiede sowohl innerhalb als auch zwischen
den einzelnen Behandlungsgruppen beobachtet. Dadurch sind zwischen den Gruppen der
getesteten Lebensmittel und Negativkontrollen bzw. Expositionsperioden keine signifikanten
Unterschiede zu erkennen. Lediglich bei Aufnahme von Pommes frites (PFR) wurde unter
Berücksichtigung aller Expositionsperioden (1, 3, 5, 7 und 9 Tage) eine signifikant erhöhte
Ergebnisse und Diskussion
- 84 -
Ausscheidung von HPMA im Vergleich zu den Negativkontrollen festgestellt (p < 0,05). Da
weder die Acrolein-Gehalte der Lebensmittel noch die der Standarddiät bekannt waren und
auch Unterschiede in der endogenen Bildung von Acrolein bei den jeweiligen Tieren nicht
ausgeschlossen werden können, kann keine endgültige Aussage zu den Ergebnissen
getroffen werden. Allerdings deuten die HPMA-Gehalte auf einen geringen Beitrag der
verabreichten Lebensmittel zur Acrolein-Gesamtexposition unter den Versuchsbedingungen
der Fütterungsstudie hin.
In den Tieren, denen die höchste Acrylamid-Dosis (10 mg Acrylamid/kg KG) verabreicht
wurde, lagen die Gehalte an HPMA im Bereich der unbehandelten Kontrollen, d. h. die mit
hohen Acrylamid-Dosen einhergehende GSH-Depletion führt zu keiner verminderten
Ausscheidung von HPMA im 24-Stunden-Urin. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den
bei hohen Acrylamid-Dosen beobachteten nahezu unveränderten Anteilen der Acrylamid-
Mercaptursäuren AAMA und GAMA (Kap. 4.2.2) und verdeutlichen die hohe Effektivität und
Kapazität des durch Kopplung an Glutathion vermittelten Phase II-Metabolismus. Insgesamt
zeigen die Ergebnisse, dass die im Rahmen der Tierstudie verwendeten Sprague Dawley-
Ratten neben der verabreichten Acrylamid-Dosis auch einer relativ hohen Acrolein-
Exposition ausgesetzt sind.
Ergebnisse und Diskussion
- 85 -
4.7 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und
Glycidamid im Blut der Allgemeinbevölkerung mittels GC-MS
Die Bestimmung der Hb-Addukte von Acrylamid und Glycidamid wurde bei 8 Probanden (6
Nichtraucher, 2 Raucher) nach modifiziertem Edman-Abbau mittels GC-MS durchgeführt. Bei
den Nicht-Rauchern lagen die AAVal- bzw. GAVal-Gehalte bei 40,1 ± 5,4 bzw.
23,8 ± 7,1 pmol/g Hb. In der Literatur sind vergleichbare AAVal- bzw. GAVal-Adduktgehalte
bei Nichtrauchern von 27 ± 6 bzw. 26 ± 6 pmol/g Hb sowie 19 ± 7 bzw. 17 ± 4 pmol/g Hb
beschrieben [Paulsson et al., 2003; Schettgen et al., 2004].
1 2 3 4 5 6 7 (R) 8 (R)0
10
20
30
40
50
200
400
600
800
pmol
/g H
b
Proband
AAVal GAVal
Abb. 4.26: Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem endständigen Valin im Blut der Allgemeinbevölkerung (GC-MS). Probanden 1-6: Nichtraucher; Probanden 7 und 8: Raucher; Mittelwert ± SD, n = 3
Bei den Rauchern wurden deutlich höhere AAVal-Gehalte gemessen, wobei Proband 8 mit
782 pmol/g Hb eine besonders hohe Belastung mit Acrylamid aufweist. Bei diesem
Probanden wurden im Einklang mit den hohen AAVal-Adduktgehalten ebenfalls stark
erhöhte Gehalte der Acrylamid-Mercaptursäuren (AAMA + GAMA) im Urin festgestellt (Kap.
4.8, Proband 6). Darüber hinaus lag auch der Gehalt des Acrolein-Metaboliten HPMA etwa
um den Faktor 5 höher als bei den restlichen Probanden (Kap. 4.9, Proband 6). In der
Literatur sind für einzelne Probanden ebenfalls hohe AAVal-Gehalte beschrieben. Vesper et
al. ermittelten bei einem Probanden einen AAVal-Gehalt von 453 pmol/g Hb [Vesper et al.,
2006]. Fennell et al. fanden Messwerte von bis zu 986 pmol/g Hb [Fennell et al., 2005].
Ergebnisse und Diskussion
- 86 -
Scherer et al. bestimmten bei Rauchern AAVal-Gehalte von 84 ± 42 pmol/g Hb [Scherer et
al., 2007]. Im Gegensatz zu den AAVal-Addukten sind die GAVal-Gehalte bei den Rauchern
(27,8-33,5 pmol/g Hb) mit den entsprechenden Gehalten bei Nichtrauchern vergleichbar. Da
mit steigender Acrylamid-Exposition auch eine höhere Glycidamid Bildung einhergeht, wäre
auch ein Anstieg der GAVal-Gehalte zu erwarten. Schettgen et al. fanden bei Rauchern
sowohl tendenziell höhere AAVal- (80 ± 48 pmol/g Hb) als auch GAVal- (53 ± 30 pmol/g Hb)
Gehalte im Vergleich zu Nichtrauchern (27 ± 6 bzw. 26 ± 6 pmol/g Hb), wobei relativ große
individuelle Schwankungen beobachtet wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden bei
lediglich 2 Rauchern die Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin-Addukte bestimmt, wodurch
die statistische Aussagekraft der ermittelten Werte begrenzt ist. Darüber hinaus könnte aus
dem sowohl inhalativen als auch oralen Expositionsweg der Raucher eine geringere
Glycidamid-Bildung resultieren, da bei ausschließlich oraler Exposition durch den First-Pass-
Effekt in der Leber möglicherweise mehr Glycidamid gebildet werden könnte. Unterstützt
wird diese Vermutung durch die in Kap. 4.8 beobachteten niedrigeren GAMA/AAMA-
Verhältnisse bei Rauchern. Die gemessenen Gehalte an AAVal sind sowohl bei den
Nichtrauchern als auch bei den Rauchern größer als die entsprechenden Gehalte von
GAVal. Das Verhältnis GAVal/AAVal beträgt 0,32-0,95 bei den Nichtrauchern sowie 0,04-
0,24 bei den Rauchern und unterliegt damit relativ großen individuellen Schwankungen.
Vesper et al. ermittelten GAVal/AAVal-Verhältnisse mit einem ebenfalls hohen
Schwankungsbereich von 0,33-3,12 [Vesper et al., 2006].
Ergebnisse und Diskussion
- 87 -
4.8 Bestimmung der Acrylamid-Mercaptursäuren im Urin von
Probanden aus der Allgemeinbevölkerung
Die Bestimmung der Acrylamid- (AAMA) und Glycidamid-Mercaptursäurekonzentration
(GAMA) im Urin erfolgte bei 10 Probanden (5 Nichtraucher; 5 Raucher; Alter: 23-54 Jahre)
mittels des API 3200 HPLC-MS/MS Systems. Die AAMA-Konzentration der Nichtraucher lag
bei 263 ± 136 nM (Range: 74-465 nM), diejenige der Raucher bei 2138 ± 2665 nM (Range:
480-7447 nM). Die GAMA-Konzentration wurde mit 56 ± 27 nM (Range: 16-101 nM) bei
Nichtrauchern und 315 ± 396 nM (Range: 85-1107 nM) bei Rauchern bestimmt.
1 2 3 4 5 6 (R) 7 (R) 8 (R) 9 (R) 10 (R)0
200
400
600
800
1000
1200
2000400060008000
nM
Probanden
AAMA GAMA
Abb. 4.27: Bestimmung der Mercaptursäuren von Acrylamid (AAMA) und Glycidamid (GAMA) im Urin der Allgemeinbevölkerung (HPLC-MS/MS). Probanden 1-5: Nichtraucher; Probanden 6-10: Raucher; Mittelwert ± SD, n = 2
Boettcher et al. ermittelten vergleichbare AAMA- bzw. GAMA-Konzentrationen von 542 nM
(Range: 73-1443 nM) bzw. 76 nM (Range: 12-180 nM) bei Rauchern und 124 nM (Range:
13-354 nM) bzw. 20 nM (Range: ND-56 nM) bei Nichtrauchern [Boettcher et al., 2005b].
Ähnliche Ergebnisse wurden von Urban et al. gezeigt , die die Mercaptursäure-Konzentration
im Urin von jeweils 60 Rauchern und Nichtrauchern bestimmten. Dabei lagen die Gehalte
von AAMA bzw. GAMA bei 793 ± 460 nM bzw. 110 ± 80 nM bei den Rauchern und
312 ± 199 nM bzw. 64 ± 52 nM bei den Nichtrauchern [Urban et al., 2006]. Schettgen et al.
Ergebnisse und Diskussion
- 88 -
fanden ebenfalls vergleichbare mittlere AAMA Konzentrationen von 1036 nM (Range: 129-
1908 nM) bei Rauchern und 225 nM (Range: 54-729 nM) bei Nichtrauchern [Schettgen et al.
2008]. Insbesondere bei Proband 6 wurden im Vergleich zu den anderen Probanden stark
erhöhte AAMA und GAMA Konzentrationen ermittelt, was auf eine hohe Acrylamid-Belastung
schließen lässt. Im Einklang mit der erhöhten Mercaptursäureausscheidung wurde bei
diesem Probanden auch ein hoher Gehalt an AAVal-Addukten und des Acrolein-Metaboliten
HPMA festgestellt. Nach eigenen Angaben handelt es sich bei Proband 6 um einen sehr
starken Raucher. Insgesamt zeigen die gemessenen Mercaptursäuregehalte relativ große
individuelle Schwankungen sowohl bei den Rauchern als auch bei den Nichtrauchern. Diese
Beobachtung könnte sowohl auf Unterschiede in der individuellen Acrylamid-Belastung als
auch der Harnproduktion zurückgeführt werden. Dennoch lässt sich bei den Rauchern unter
Ausschluss des offensichtlich überdurchschnittlich belasteten Probanden 6 eine signifikant
erhöhte Ausscheidung von AAMA (811 ± 261 nM, p<0,01) und GAMA (117 ± 25 nM, p<0,05)
im Vergleich zu den Nichtrauchern feststellen. Darüber hinaus führt die erhöhte Acrylamid-
Exposition der Raucher zu einer im Vergleich zu Nichtrauchern etwa 3-fach höheren AAMA-
Konzentration, während die GAMA-Konzentration lediglich um den Faktor 2 höher liegt. Die
GAMA/AAMA Verhältnisse liegen dadurch bei Nichtrauchern (0,23 ± 0,08) tendenziell höher
als bei Rauchern (0,15 ± 0,02). Vergleichbare GAMA/AAMA-Verhältnisse wurden von
Boettcher et al. (Nichtraucher: 0,22; Raucher: 0,15) beobachtet [Boettcher et al., 2005b]. Für
die Aufnahme von Acrylamid ist bei Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern neben dem
oralen der inhalative Expositionsweg von wesentlicher Bedeutung. Bei ausschließlich oraler
Aufnahme von Acrylamid könnte im Vergleich zur inhalativen Exposition bedingt durch den
First-Pass-Effekt in der Leber mehr Glycidamid gebildet werden, was im weiteren Verlauf zu
einer höheren GAMA- und geringeren AAMA-Ausscheidung führt. Bei oraler und gleichzeitig
inhalativer Aufnahme könnte der oxidative Metabolismus vermindert sein, was eine höhere
AAMA- und geringere GAMA-Ausscheidung zur Folge hätte. Dadurch könnten die bei
Rauchern im Vergleich zu Nichtrauchern beobachteten niedrigeren GAMA/AAMA-
Verhältnisse erklärt werden. Unterstützt wird diese Vermutung durch die bei Rauchern stark
erhöhten Gehalte an AAVal-Hb-Addukten, während bei den GAVal-Gehalten kein
signifikanter Unterschied im Vergleich zu den Nichtrauchern beobachtet wurde (Kap. 4.7).
Heudorf et al. untersuchten die Gehalte an AAMA und GAMA in Urinproben von 5-6-jährigen
Kindern (n = 110). Dabei wurde eine mittlere AAMA-Konzentration von 154 nM (95. Perzentil:
653 nM) und GAMA-Konzentration von 54 nM (95. Perzentil: 223 nM) gefunden. Daraus
wurde eine mittlere Acrylamid-Aufnahme von 0,54 µg/kg KG/d (95. Perzentil:
1,91 µg/kg KG/d) abgeleitet, welche die mittlere Aufnahme beim Erwachsenen etwa um
50 % übersteigt [Heudorf et al., 2009]. Der Vergleich dieser Ergebnisse mit den im Rahmen
dieser Arbeit gemessenen Mercaptursäurekonzentrationen bei den Nichtrauchern deutet
Ergebnisse und Diskussion
- 89 -
ebenfalls auf eine erhöhte Exposition mit Acrylamid und einen effektiveren Metabolismus von
Acrylamid zu Glycidamid bei Kindern im Vergleich zum Erwachsenen hin. Auch Hartmann et
al. beobachteten in der Altersgruppe der 5-10 Jährigen signifikant erhöhte GAMA/AAMA
Verhältnisse im Vergleich zu Erwachsenen [Hartmann et al., 2008].
4.9 Bestimmung des Acrolein-Metaboliten HPMA in Urinproben
der Allgemeinbevölkerung
Der Gehalt an HPMA wurde im Urin von 10 Probanden (5 Nichtraucher; 5 Raucher; Alter: 23-
54 Jahre) mittels des API 2000 HPLC-MS/MS Systems bestimmt. Dabei handelte es sich um
die Urinproben aus der Acrylamid-Mercaptursäurebestimmung (Kap. 4.8).
Die HPMA-Konzentration der Nichtraucher lag bei 3,12 ± 1,81 µM (Range: 0,57-5,72 µM),
diejenige der Raucher bei 16,57 ± 16,32 µM (Range: 5,25-48,75 µM).
1 2 3 4 5 6 (R) 7 (R) 8 (R) 9 (R) 10 (R)0
2
4
6
8
10
12
14
20
40
60
µM
Probanden
HPMA
Abb. 4.28: Bestimmung von HPMA im Urin der Allgemeinbevölkerung (HPLC-MS/MS). Probanden 1-5: Nichtraucher; Probanden 6-10: Raucher; Mittelwert ± SD, n=2
Schettgen et al. fanden vergleichbare mittlere HPMA Konzentrationen von 7,60 µM (Range:
0,60-24,15 µM) bei Rauchern (n=14) und 0,70 µM (Range: 0,17-3,30 µM) bei Nichtrauchern
[Schettgen et al., 2008]. Proband 6 zeigt im Vergleich zu den anderen Rauchern um Faktor
5-10 höhere HPMA-Gehalte. In Verbindung mit den ebenfalls stark erhöhten Acrylamid- und
Glycidamid-Mercaptursäuregehalten ist dies ein weiteres Indiz für den nach eigenen
Angaben hohen Zigarettenkonsum dieses Probanden. Eine Zigarette enthält durchschnittlich
Ergebnisse und Diskussion
- 90 -
1-2 µg Acrylamid und 118 µg Acrolein, wodurch das Rauchen einen wesentlichen Beitrag
sowohl zur Acrylamid- und vor allem zur Acrolein-Exposition leisten kann [Smith et al., 2000;
Stevens und Maier, 2008]. Insgesamt zeigen die gemessenen HPMA-Gehalte relativ große
individuelle Schwankungen sowohl bei den Rauchern als auch bei den Nichtrauchern, was
bereits bei den Acrylamid-Mercaptursäuren beobachtet wurde. Dies ist möglicherweise
sowohl auf Unterschiede in der individuellen Acrolein-Belastung als auch der Harnproduktion
zurückzuführen. Bei den Rauchern lässt sich unter Ausschluss von Proband 6 eine
signifikant erhöhte Ausscheidung von HPMA (p<0,05) im Vergleich zu den Nichtrauchern
feststellen, was vermutlich auf die hohen Acrolein-Gehalte im Hauptstromrauch von
Zigaretten zurückzuführen ist. Allerdings zeigen auch die Nichtraucher relativ hohe
Konzentrationen an HPMA im Urin, welche etwa um den Faktor 10 höher liegen als die
Summe der entsprechenden Acrylamid-Mercaptursäuren AAMA und GAMA. Für
Nichtraucher kommt neben der Exposition über Lebensmittel und einer endogenen Bildung
die Atmosphäre als eine weitere wichtige Expositionsquelle für Acrolein in Betracht. Der
Acrolein-Gehalt in der Atmosphäre beträgt 8-25 µg/m3 [EPA, 2003]. Beim Menschen liegt das
mittlere Atemvolumen bei 20 m3/24 h [ECHA, 2008]. Daher ergibt sich bei Annahme einer
vollständigen Resorption eine tägliche Aufnahme von mindestens 160 µg Acrolein.
Insgesamt deuten die Gehalte an HPMA darauf hin, dass die Allgemeinbevölkerung einer
relativ hohen Belastung mit Acrolein ausgesetzt ist. Die Exposition gegenüber Acrolein
scheint die Belastung mit Acrylamid bei weitem zu übertreffen. Bei Acrolein handelt es sich
um das stärkste Elektrophil unter den α,β-ungesättigten Carbonylverbindungen, welches im
Gegensatz zu Acrylamid ohne metabolische Aktivierung DNA-Addukte bildet [Witz et al.,
1987; Wang et al., 2008]. Darüber hinaus verläuft der oxidative Metabolismus von Acrolein
ähnlich wie bei Acrylamid über die Bildung hochreaktiver Epoxide [Parent et al., 1998].
Generell handelt es sich bei α,β-ungesättigten Carbonylverbindungen um besonders
reaktionsfähige Substanzen, welche einerseits leicht mit Proteinen und DNA reagieren, was
zu zytotoxischen und genotoxischen Wirkungen führen kann, andererseits jedoch schnell
und effektiv durch Bindung an Glutathion detoxifiziert werden [SKLM, 2006].
Ergebnisse und Diskussion
- 91 -
4.10 Etablierung einer HPLC-MS/MS Methode zur Bestimmung der
Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid im Blut
der Allgemeinbevölkerung
Die Chromatogramme in Kap. 4.1.1.1 zur Messung der Hb-Addukte von Acrylamid und
Glycidamid mittels GC-MS verdeutlichen, dass insbesondere die Bestimmung der
Glycidamid-Hb-Addukte Probleme bereitet, da einerseits nach Derivatisierung mit PFPITC
die entstandenen PFPTHs als Diastereomere vorliegen und daher als Doppelpeak detektiert
werden, andererseits die gemessenen Ionenspuren der Analyten und internen Standards
hohe Matrixbelastungen aufweisen. Des Weiteren muss zur Bestimmung von GAValPFPTH
mittels GC-MS eine zusätzliche Derivatisierung mit Aceton durchgeführt werden, um die
chromatographischen Eigenschaften dieses Analyten zu verbessern.
Um die Empfindlichkeit für die Quantifizierung von GAValPFPTH zu erhöhen und das relativ
zeitaufwendige Verfahren der Flüssig-Flüssig-Extraktion zur Isolierung der PFPTHs zu
vereinfachen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine HPLC-MS/MS Methode in Verbindung
mit einer Festphasenextraktion (SPE) zur Probenaufarbeitung etabliert. Frühere Arbeiten im
Arbeitskreis zeigten, dass trotz der hohen Selektivität der MS/MS-Technik die Sensitivität
eines API 2000 Massenspektrometers nicht ausreicht, um die Hintergrund-Adduktgehalte an
AAVal und GAVal in Blutproben der Allgemeinbevölkerung im Bereich von 5-100 pmol/g Hb
zu messen [Bertow, 2008]. Daher wurde die Etablierung der MS/MS-Methode mittels des
empfindlicheren API 3200 Tandemmassenspektrometers vorgenommen.
In Abb. 4.29 ist das MRM-Chromatogramm zur Messung einer AA- bzw. GAValPFPTH-
Standardlösung gezeigt. Die beiden Analyte sind basisliniengetrennt und weisen
Retentionszeiten von 12,4 Minuten für AAValPFPTH sowie 11,3 und 11,5 Minuten für
GAValPFPTH auf. Das Signal von GAValPFPTH zeigt, wie bereits bei der Bestimmung
mittels GC-MS beobachtet, einen Doppelpeak, welcher auf das Vorkommen von
Diastereomeren zurückzuführen ist. Die ermittelten absoluten Nachweisgrenzen liegen bei
12 fmol für AAValPFPTH sowie 30 fmol für GAValPFPTH und liegen im Vergleich zur
Messung mittels GC-MS (AAValPFPTH: 0,4 fmol; acGAValPFPTH: 1,6 fmol) höher.
Abb. 4.30 zeigt das MRM-Chromatogramm eines starken Rauchers mit den Ionenspuren der
Analyten AAVal- und GAValPFPTH bzw. der entsprechenden 7-fach deuterierten internen
Standards. Sowohl für AAValPFPTH (RT = 12,8 Minuten) als auch für GAValPFPTH
(RT = 11,7/ 12,1 Minuten) sind deutliche und gut integrierbare Peaks zu erkennen. Allerdings
ist bei dem zuletzt eluierenden Diastereomeren-Peak von GAVal- bzw. GAD7Val-PFPTH im
Vergleich zum Chromatogramm der methanolischen Standardlösung (Abb. 4.29) eine starke
Ergebnisse und Diskussion
- 92 -
Suppression des Signals zu beobachten, welche vermutlich auf Matrixeffekte zurückzuführen
ist.
AAValPFPTH
GAValPFPTH
AAValPFPTH
GAValPFPTH
Abb. 4.29: MRM-Chromatogramm zur Messung einer AAVal- und GAValPFPTH-Standardlösung (50 ng/ml Methanol)
AAValPFPTH
GAValPFPTH
AAD7ValPFPTH
GAD7ValPFPTH
AAValPFPTH
GAValPFPTH
AAD7ValPFPTH
GAD7ValPFPTH
Abb. 4.30: MRM-Chromatogramm eines Rauchers zur Bestimmung der AAVal- und GAVal-PFPTHs
Ergebnisse und Diskussion
- 93 -
Im Vergleich dazu zeigt Abb. 4.31 das MRM-Chromatogramm eines Nichtrauchers mit den
entsprechenden Ionenspuren. Es wird deutlich, dass die Empfindlichkeit der verwendeten
HPLC-MS/MS Methode zur Bestimmung der AAVal-Addukte bei Nichtrauchern ausreichend
ist. Allerdings zeigt sich bei der Bestimmung von GAValPFPTH, dass die Intensität der
beiden Diastereomerenpeaks bereits im Bereich der Nachweisgrenze liegt und dadurch die
Quantifizierung mit einem größeren Fehler behaftet ist. Darüber hinaus waren die geringen
GAVal-Gehalte der nichtrauchenden Allgemeinbevölkerung in der Mehrzahl der gemessenen
Hb-Proben aufgrund der offensichtlich zu geringen Empfindlichkeit der verwendeten
Methode nicht nachweisbar.
AAValPFPTH
GAValPFPTH
AAD7ValPFPTH
GAD7ValPFPTH
AAValPFPTH
GAValPFPTH
AAD7ValPFPTH
GAD7ValPFPTH
Abb. 4.31: MRM-Chromatogramm eines Nichtrauchers zur Bestimmung der AAVal- und GAVal-PFPTHs
Die erhaltenen Ergebnisse bei der Ermittlung der Wiederfindungsrate der SPE-Methode
verdeutlichen, dass die verwendete strata C18-E-Säule sowohl für AAValPFPTH
(81 ± 14 %) als auch GAValPFPTH (94 ± 13 %) mit der verwendeten SPE-Methode (Kap.
6.5.2.3) akzeptable Werte lieferte und somit für deren Extraktion geeignet ist. Allerdings
müssen bei der Aufarbeitung von derivatisierten Hb-Proben die in der Lösung enthaltenen
Matrixkomponenten berücksichtigt werden, da diese ebenfalls adsorbiert werden können und
möglicherweise die Sorbenskapazität vermindern. Zusätzlich können Matrixbestandteile bei
Koelution mit den Analyten zu einer Suppression der Analytsignale führen, was
insbesondere bei GAValPFPTH beobachtet wurde. Zur Identifizierung solcher Matrixeffekte
Ergebnisse und Diskussion
- 94 -
wurden die Peakflächen der internen Standards von derivatisierten Hb-Proben mit denen von
mittels SPE aufgearbeiteten Standardlösungen (ohne Hb; ohne PFPITC) verglichen (Kap.
6.5.2.6). Als Referenz dienten die Standardlösungen aus der Bestimmung der
Wiederfindung. Dabei führte die Anwesenheit von Matrixbestandteilen in Form von Hb und
PFPITC zu einer mittleren Abnahme der Wiederfindungsrate um 24 % für AAD7ValPFPTH
und 72 % für GAD7ValPFPTH. Da weder in der Probenflüssigkeit nach Passage der SPE-
Säule noch im Waschwasser die Analyten nachweisbar waren und auch die Erhöhung des
Elutionsvolumens zu keiner Erhöhung der Wiederfindungsrate führte, kann davon
ausgegangen werden, dass die beobachtete Suppression der Analytsignale auf eine
Koelution von Matrixbestandteilen zurückzuführen ist, wobei dieser Effekt bei
GAD7ValPFPTH offensichtlich stärker ausgeprägt ist. Die beobachtete Signalsuppression
führt bei GAValPFPTH in Verbindung mit der ohnehin durch die Ausbildung von
Diastereomerenpeaks geringeren Signalintensität zu einer im Vergleich zu AAValPFPTH
wesentlich geringeren Empfindlichkeit der HPLC-MS/MS Methode.
Ergebnisse und Diskussion
- 95 -
4.11 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und
Glycidamid mit dem N-terminalen Valin im Rahmen der
humanen Verzehrsstudie „Bedeutung der CYP450 2E1-
Aktivität für die Toxikokinetik von Acrylamid beim
Menschen“
In Kooperation mit Prof. Dr. Uwe Fuhr vom Institut für Pharmakologie der Universität Köln
wurden im Rahmen der humanen Verzehrsstudie „Bedeutung der CYP450 2E1-Aktivität für
die Toxikokinetik von Acrylamid beim Menschen“ (Studien-Nr. KPUK-03-ACR/PIL-01)
Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem endständigen Valin des Hämoglobin
bestimmt. Dabei sollte die Kinetik der Addukt-Bildung nach Gabe Acrylamid-reicher Nahrung
(Kartoffel-Chips) jeweils bei unbeeinflusster (R-Phase), gehemmter (T1-Phase) und
induzierter (T2-Phase) CYP450 2E1-Aktivität untersucht werden. Die jeweiligen
Studienphasen wurden in randomisierter Abfolge durchgeführt.
Tab. 4.2: Studienperioden
Phänotypisierung (P-Phase)
orale Gabe von 250 mg Chlorzoxazon (Parafon Forte® DSC 500 mg; ½ Tablette) Bestimmung von Chlorzoxazon und des Metaboliten 6-OH-Chlorzoxazon pre-dose und 2 h
danach mittels HPLC
Referenzperiode (R-Phase)
Gabe von 150 g Kartoffelchips mit einem Gehalt von 957-1000 µg Acrylamid (14,8 µg/kg KG) ohne Komedikation
Testperiode 1 (T1-Phase)
Gabe von 150 g Kartoffelchips mit einem Gehalt von 957-1000 µg Acrylamid (14,8 µg/kg KG) 10 h nach oraler Applikation von 500 mg Disulfiram (Antabus® 0,5 Dispergetten)
Testperiode 2 (T2-Phase)
Gabe von 150 g Kartoffelchips mit einem Gehalt von 957-1000 µg Acrylamid (14,8 µg/kg KG)
nach täglicher Aufnahme von 48 ml Ethanol über 7 Tage in Form von Bier (jeweils 1 Liter Reissdorf Kölsch®)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und
Glycidamid bei 13 Probanden in Blutproben der Referenzperiode sowie den Testperioden 1
und 2 jeweils zu den Zeitpunkten pre-dose und 24 Stunden nach Acrylamid-Aufnahme
mittels GC-MS bestimmt. Weiterhin wurde bei 3 Probanden die Acrylamid-Hb-Adduktbildung
Ergebnisse und Diskussion
- 96 -
zu den Zeitpunkten pre-dose, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16 und 24 Stunden in den jeweiligen
Studienperioden mittels HPLC-MS/MS untersucht.
4.11.1 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid vor und 24 Stunden nach Acrylamid-Aufnahme mittels GC-MS
Die Hintergrundbelastung an AAVal- und GAVal-Hb-Addukten lag vor Aufnahme der
Acrylamid-haltigen Kartoffelchips (gemessen als pre dose-Wert vor Beginn der
randomisierten 1. Studienperiode) bei 38 ± 10 pmol/g Hb für AAVal und 29 ± 9 pmol/g Hb für
GAVal. Vergleichbare Hintergrundbelastungen wurden von Paulsson et al. (AAVal:
27 ± 6 pmol/g Hb; GAVal: 26 ± 6 pmol/g Hb) sowie von Schettgen et al. (AAVal:
19 ± 7 pmol/g Hb; GAVal: 17 ± 4 pmol/g Hb) ermittelt [Paulsson et al., 2003; Schettgen et al.,
2004]. 24 Stunden nach Aufnahme der Acrylamid-haltigen Kartoffelchips stiegen die AAVal-
Gehalte um 7,7 ± 4,8 pmol/g Hb in der R-Phase sowie 11,9 ± 4,9 pmol/g Hb in der T1-Phase
und 9,2 ± 5,1 pmol/g Hb in der T2-Phase. Die entsprechenden GAVal-Gehalte stiegen um
2,7 ± 6,9 pmol/g Hb in der R-Phase sowie 0,6 ± 8,1 pmol/g Hb in der T1-Phase und
3,9 ± 9,5 pmol/g Hb in der T2-Phase.
R-Phase T1-Phase T2-Phase0
2
4
6
8
10
12
14
16
18*
Hb-
Add
ukt-A
nstie
g [Δ
pm
ol/g
Hb]
AAVal GAVal
Abb. 4.32: Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem endständigen Valin bei 13 Probanden 24 h nach Aufnahme von Acrylamid über Kartoffelchips. Studienphasen: R-Phase: (Referenzphase ohne Komedikation); T1-Phase (Vorbehandlung mit Disulfiram); T2-Phase (Vorbehandlung mit Ethanol), *: signifikant unterschiedlich zur R-Phase (p < 0,05)
Ergebnisse und Diskussion
- 97 -
Insgesamt zeigen die Anstiege der AAVal- und GAVal-Addukt-Gehalte relativ große
individuelle Schwankungen. Vesper et al. untersuchten in einer vergleichbaren Studie die
Acrylamid- und Glycidamid-Hb-Adduktbildung bei 6 Probanden, welche über den Zeitraum
von einer Woche täglich 115 µg Acrylamid (1,9 µg Acrylamid/kg KG/d) über Kartoffelchips
aufnahmen, was einer Gesamtdosis von ca. 0,8 mg Acrylamid entspricht. Dabei zeigte sich
ein mittlerer Anstieg von AAVal um 7 pmol/g Hb und GAVal um 6 pmol/g Hb, wobei sowohl
für AAVal (-6 bis +19 pmol/g Hb) als auch für GAVal (-5 bis +18 pmol/g Hb) ebenfalls relativ
große Schwankungen beobachtet wurden [Vesper et al., 2005].
Die festgestellten Unterschiede in den Anstiegen der AAVal- und GAVal-Gehalte könnten auf
Polymorphismen in Genen zurückgeführt werden, welche metabolisierende Enzyme
kodieren. Duale et al. untersuchten bei 49 Probanden die Beziehung zwischen den GAVal-
und AAVal-Hb-Hintergrundbelastungen und Polymorphismen in kodierenden Genen von
CYP450 2E1 sowie Glutathion-S-Transferasen (GSTM1, GSTT1, GSTP1). Dabei wurden
signifikant höhere GAVal/AAVal-Verhältnisse bei Probanden mit GSTM1- und GSTT1-null
Varianten im Vergleich zu den entsprechenden Wild-Typen festgestellt, wohingegen für die
CYP450 2E1-Genotypen kein signifikanter Zusammenhang zu den GAVal/AAVal-
Verhältnissen gezeigt werden konnte [Duale et al., 2009]. Im Rahmen der in der
vorliegenden Arbeit beschriebenen Studie wurde eine Phänotypisierung der Probanden unter
Einschluss von CYP450 2E1*5A, CYP450 2E1*5B, CYP450 2E1*6, GSTM1-null, GSTT1-null
sowie GSTP1-Einzelnukleotid Polymorphismen vorgenommen. Im Gegensatz zu den
Beobachtungen von Duale et al. konnte dabei kein signifikanter Einfluss bestimmter
Phänotypen der untersuchten Gene auf den Metabolismus des aufgenommenen Acrylamids
gezeigt werden [Doroshyenko et al., 2009]. Dennoch kann in Anbetracht der relativ geringen
einmaligen Aufnahmemenge von ca. 15 µg/kg KG in den jeweiligen Studienperioden und der
damit verbundenen größeren Schwankungsbreite der Messergebnisse eine Beeinflussung
der Toxikokinetik von Acrylamid durch Polymorphismen metabolisierender Enzyme nicht
ausgeschlossen werden.
Bei Disulfiram handelt es sich um einen selektiven Inhibitor, der sowohl nach akuter als auch
chronischer Gabe eine vergleichbare Verminderung der CYP450 2E1-Aktivität bewirkt [Frye
und Branch, 2002; Emery et al., 1999; Kharasch et al., 1993]. Da der oxidative Metabolismus
von Acrylamid zu Glycidamid im Wesentlichen durch CYP450 2E1 vermittelt wird, kann die in
der T1-Phase bei CYP450 2E1-Hemmung im Vergleich zur Referenzphase signifikant
erhöhte AAVal-Bildung vermutlich auf höhere Acrylamid-Blutkonzentrationen zurückgeführt
werden. Diese Vermutung wird durch eine bei den Probanden der durchgeführten Studie
signifikant erhöhte Ausscheidung von Acrylamid (Faktor: 1,34) und AAMA (Faktor: 1,18)
sowie signifikant erniedrigte GAMA-Ausscheidung (Faktor: 0,44) im Vergleich zur
Referenzphase gestützt. Darüber hinaus deutet die beobachtete Erniedrigung der GAMA
Ergebnisse und Diskussion
- 98 -
Ausscheidung um lediglich 50-60 % darauf hin, das neben dem hauptsächlich CYP450 2E1
vermittelten Metabolismus noch weitere Bildungswege für Glycidamid im menschlichen
Organismus existieren [Doroshyenko et al., 2009].
Die Exposition gegenüber Ethanol führt selbst bei moderatem Alkoholkonsum zu einer
Induktion von hepatischem und extrahepatischem CYP450 2E1 [McCarver et al., 1998;
Roberts et al., 1995; Tsutsumi et al., 1993]. Die Aufnahme von täglich 40 g Ethanol über eine
Woche führt zu einer Erhöhung der CYP450 2E1-Aktivität um ca. 30 % [Oneta et al., 2002].
Daher wäre im Rahmen der Studienphase T2 nach einwöchiger Vorbehandlung mit Ethanol
eine stärkere Glycidamid-Bildung zu erwarten. Daraus würde eine verminderte Zunahme von
AAVal sowie erhöhte Zunahme von GAVal resultieren. Allerdings zeigte sowohl die
Erhöhung der AAVal- als auch die der GAVal-Addukt-Gehalte keine signifikanten
Unterschiede im Vergleich zur Referenzphase. Weiterhin wurden bei den Probanden der
Studie keine signifikanten Unterschiede in der Ausscheidung von Acrylamid bzw. der
Mercaptursäuren zwischen T2- und Referenz-Phase beobachtet. Daraus folgt, dass die
moderate Induktion von CYP450 2E1 keinen eindeutigen Effekt auf die Toxikokinetik von
Acrylamid hat [Doroshyenko et al., 2009]. Allerdings ist angesichts der relativ geringen
aufgenommenen Dosis von ca. 15 µg Acrylamid/kg KG und der beobachteten individuellen
Schwankungen fraglich, ob die Ethanol vermittelte CYP450 2E1 Induktion zu einer mit den
verwendeten analytischen Methoden erfassbaren relativen Veränderung des Biomarker-
Status führt.
Ergebnisse und Diskussion
- 99 -
4.11.2 Kinetik der Acrylamid-Hämoglobin-Adduktbildung in vivo
Zur Untersuchung der Kinetik der in vivo Adduktbildung von Acrylamid mit dem endständigen
Valin im Hämoglobin wurde bei den Probanden 8, 13 und 16 der humanen Verzehrsstudie
die Acrylamid-Hämoglobin-Adduktbildung zu den Zeitpunkten pre-dose, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16
und 24 Stunden in den Studienperioden R- (Acrylamid-Aufnahme ohne Komedikation), T1-
(Acrylamid-Aufnahme nach CYP450 2E1-Hemmung durch Disulfiram) und T2- (Acrylamid-
Aufnahme nach CYP450 2E1-Induktion durch Vorbehandlung mit Ethanol) Phase mittels
HPLC-MS/MS bestimmt.
In Abb. 4.33 ist der zeitliche Verlauf der AAVal-Bildung bei Proband 8 nach Aufnahme von
jeweils 1 mg Acrylamid (ca. 15 µg/kg KG) über Kartoffelchips in den untersuchten Studien-
phasen gezeigt. In der R-Phase liegt der AAVal-Gehalt bei 44,7 ± 0,6 pmol/g Hb vor (T = 0)
bzw. 43,4 ± 1,3 pmol/g Hb 24 Stunden nach der Acrylamid-Aufnahme. In der T1-Phase liegt
der AAVal-Gehalt vor Aufnahme der Acrylamid-haltigen Kartoffelchips bei
43,8 ± 0,4 pmol/g Hb und steigt bis auf 48,2 ± 0,9 pmol/g Hb nach 24 Stunden an. Ein
ähnlicher Anstieg wurde in der T2-Phase beobachtet, wobei die entsprechenden AAVal-
Gehalte bei 45,7 ± 0,4 pmol/g Hb und 48,9 ± 0,1 pmol/g Hb liegen.
0 4 8 12 16 20 2440
45
50
55Proband 8
AA
Val [
pmol
/g H
b]
Zeit [h]
R-Phase T1-Phase T2-Phase
Abb. 4.33: Zeitlicher Verlauf der AAVal-Bildung bei Proband 8 nach Aufnahme von jeweils 1 mg Acrylamid über Kartoffelchips in den untersuchten Studienphasen; R-Phase (Referenzphase ohne Komedikation), T1-Phase (Vorbehandlung mit Disulfiram), T2-Phase (Vorbehandlung mit Ethanol), n = 1-2
Ergebnisse und Diskussion
- 100 -
Bei der Bestimmung mittels GC-MS wurden ähnliche AAVal-Gehalte ermittelt (R-Phase:
48,1 ± 2,7 pmol/g Hb (T = 0) und 49,4 ± 3,0 pmol/g Hb (T = 24 h), T1-Phase:
46,7 ± 2,2 pmol/g Hb (T = 0) und 59,9 ± 2,9 pmol/g Hb (T = 24 h), T2-Phase:
52,4 ± 2,0 pmol/g Hb (T = 0) und 67,5 ± 2,7 pmol/g Hb (T = 24 h)), wobei die Anstiege in der
T1- und T2-Phase mit ca. 13 bzw. 15 pmol/g Hb im Vergleich zur Messung mittels HPLC-
MS/MS (T1-Phase: 4,4 pmol/g Hb; T2-Phase: 3,2 pmol/g Hb) größer sind. Der zeitliche
Verlauf der AAVal-Bildung zeigt in der R-Phase keinen signifikanten Anstieg der Gehalte im
Zeitraum von 24 Stunden nach der Acrylamid-Aufnahme.
Abb. 4.34 zeigt die Kinetik der AAVal-Bildung bei Proband 13. Nach Aufnahme der
Kartoffelchips steigt der AAVal-Gehalt in der R-Phase von 45,2 ± 0,8 pmol/g Hb (T = 0) auf
47,6 ± 0,9 pmol/g Hb (T = 16 h). In der T1-Phase liegen die AAVal-Gehalte bei
41,8 ± 0,3 pmol/g Hb (T = 0) bzw. 44,9 ± 0,4 pmol/g Hb 24 Stunden nach der Acrylamid-
Aufnahme. In der T2-Phase steigt der AAVal-Gehalt nach Aufnahme der Acrylamid-haltigen
Kartoffelchips von 47,3 ± 0,6 pmol/g Hb (T = 0) auf 52,2 ± 1,0 pmol/g Hb (T = 24 h) an.
0 4 8 12 16 20 2440
45
50
55Proband 13
R-Phase T1-Phase T2-Phase
AA
Val [
pmol
/g H
b]
Zeit [h] Abb. 4.34: Zeitlicher Verlauf der AAVal-Bildung bei Proband 13 nach Aufnahme von jeweils 1 mg Acrylamid über Kartoffelchips in den untersuchten Studienphasen; R-Phase (Referenzphase ohne Komedikation), T1-Phase (Vorbehandlung mit Disulfiram), T2-Phase (Vorbehandlung mit Ethanol), n = 2
Wie bereits bei den Ergebnissen von Proband 8 diskutiert, wurden auch bei Proband 13
nach Bestimmung mittels GC-MS ähnliche AAVal-Gehalte ermittelt (R-Phase:
43,7 ± 3,5 pmol/g Hb (T = 0) und 54,3 ± 2,8 pmol/g Hb (T = 24 h), T1-Phase:
Ergebnisse und Diskussion
- 101 -
34,7 ± 1,1 pmol/g Hb (T = 0) und 49,8 ± 1,4 pmol/g Hb (T = 24 h), T2-Phase:
51,0 ± 2,4 pmol/g Hb (T = 0) und 65,5 ± 1,4 pmol/g Hb (T = 24 h)), wobei die beobachteten
Anstiege im Vergleich zur Messung mittels HPLC-MS/MS ebenfalls höher liegen.
Abb. 4.35 zeigt den zeitlichen Verlauf der AA-Val-Bildung bei Proband 16. Nach Exposition
mit Acrylamid ohne Komedikation (R-Phase) steigt der AAVal-Gehalt von
42,5 ± 0,6 pmol/g Hb zum Zeitpunkt T = 0 auf 47,5 ± 0,8 pmol/g Hb (T = 24 h) an. In der T1-
Phase liegen die entsprechenden Gehalte bei 46,5 ± 0,7 pmol/g Hb (T = 0) bzw.
51,5 ± 0,6 pmol/g Hb (T = 24 h). Im Vergleich dazu lassen die AAVal-Gehalte in der
Studienphase T2 (40,7 ± 0,8 pmol/g Hb (T = 0) bzw. 42,8 ± 0,4 pmol/g Hb (T = 24 h))
lediglich auf einen geringen Anstieg der AAVal-Gehalte schließen.
0 4 8 12 16 20 24
40
45
50
55
Proband 16 R-Phase T1-Phase T2-Phase
AA
Val [
pmol
/g H
b]
Zeit [h]
Abb. 4.35: Zeitlicher Verlauf der AAVal-Bildung bei Proband 16 nach Aufnahme von jeweils 1 mg Acrylamid über Kartoffelchips in den untersuchten Studienphasen; R-Phase (Referenzphase ohne Komedikation), T1-Phase (Vorbehandlung mit Disulfiram), T2-Phase (Vorbehandlung mit Ethanol), n = 1-2
Wie bereits bei den Probanden 8 und 13 diskutiert, sind die mittels HPLC-MS/MS zu den
Zeitpunkten pre dose (T = 0) und T = 24 h ermittelten AAVal-Gehalte von Proband 16 mit
denjenigen nach der Bestimmung mittels GC-MS vergleichbar (R-Phase:
40,9 ± 1,7 pmol/g Hb (T = 0) und 59,2 ± 2,3 pmol/g Hb (T = 24 h), T1-Phase:
58,7 ± 1,4 pmol/g Hb (T = 0) und 73,3 ± 2,6 pmol/g Hb (T = 24 h), T2-Phase:
36,6 ± 0,3 pmol/g Hb (T = 0) und 49,7 ± 1,7 pmol/g Hb (T = 24 h)). Auch die Ergebnisse von
Ergebnisse und Diskussion
- 102 -
Proband 16 zeigen bei Messung mittels GC-MS im Vergleich zu HPLC-MS/MS größere
Anstiege der AAVal-Gehalte.
Insgesamt verdeutlichen die Ergebnisse bei den untersuchten Probanden, dass die
Aufnahme von ca. 15 µg Acrylamid/kg KG über Kartoffelchips in allen Studienperioden (mit
Ausnahme der R-Studienphase von Proband 8) zu einem signifikanten Anstieg der AAVal-
Gehalte führt. Die beobachteten Anstiege lagen bei den Messungen mittels HPLC-MS/MS
über die jeweiligen Studienperioden gemittelt bei 2,1 ± 2,5 pmol/g Hb (R-Phase),
4,2 ± 0,8 pmol/g Hb (T1-Phase) und 3,4 ± 1,2 pmol/g Hb (T2-Phase), wohingegen bei der
Messung mittels GC-MS bei diesen Probanden größere Anstiege der AAVal-Gehalte
beobachtet wurden (10,1 ± 7,0 pmol/g Hb (R-Phase), 14,3 ± 0,8 pmol/g Hb (T1-Phase),
14,2 ± 0,8 pmol/g Hb (T2-Phase)). Da sich sowohl die GC-MS- als auch HPLC-MS/MS-
Methode als ausreichend empfindlich zur Bestimmung der AAVal-Addukte erwiesen hat und
mit der gleichen internen Standardisierung (AAD7ValPFPTH) und Derivatisierungstechnik
gearbeitet wurde, können die beobachteten Unterschiede dadurch nicht erklärt werden. Die
Bestimmung der Hb-Addukte in den isolierten Hb-Proben mittels HPLC-MS/MS wurde ca. 18
Monate nach den entsprechenden GC-MS-Messungen durchgeführt, wobei die Lagerung der
isolierten Hämoglobin-Proben bei -30°C in Kunststoffvials erfolgte. Unter diesen
Lagerungsbedingungen ist eine Beeinflussung der AAVal-Addukt-Gehalte nicht zu erwarten.
Die maximalen AAVal-Konzentrationen wurden bei den untersuchten Probanden im Zeitraum
von 8-10 Stunden erreicht, wobei 10 Stunden nach der Acrylamid-Aufnahme meist ein
Plateau-förmiger Verlauf der Bildungskurven zu erkennen ist. Die Aufnahme von ca. 15 µg
Acrylamid/kg KG bewirkt in den jeweiligen Studienperioden, wie bereits diskutiert, lediglich
einen geringen Anstieg der AAVal-Gehalte (2–4 pmol/g Hb). Dadurch ist in Verbindung mit
der geringen Anzahl an Messungen (n = 1-2) und der beobachteten Schwankungsbreite der
Messergebnisse die Interpretation der AAVal-Bildung in den einzelnen Studienphasen nur
eingeschränkt möglich. Dennoch deuten die AAVal-Anstiege in der T1-Phase (Acrylamid-
Aufnahme nach CYP450 2E1-Hemmung durch Disulfiram) auch bei der Bestimmung mittels
HPLC-MS/MS auf eine erhöhte Bildung von AAVal im Vergleich zur R- (Acrylamid-Aufnahme
ohne Komedikation) und T2- (Acrylamid-Aufnahme nach CYP450 2E1-Induktion durch
Vorbehandlung mit Ethanol) Phase hin, wodurch die bei Messung mittels GC-MS
beobachteten Ergebnisse bestätigt werden (Kap. 4.11.1).
Im Rahmen von früheren Arbeiten im Arbeitskreis wurde die Kinetik der Acrylamid-Hb-
Addukt-Bildung bei den Probanden 4, 7 und 10 mittels GC-MS bestimmt [Bertow, 2008].
Dabei lag die maximale AAVal-Konzentration ebenfalls in einem Bereich von 8-12 Stunden.
Die beobachteten mittleren Anstiege der AAVal-Gehalte lagen bei 6 pmol/g Hb (R-Phase),
15 pmol/g Hb (T1-Phase) sowie 8 pmol/g Hb (T2-Phase), was ebenfalls auf eine verstärkte
AAVal-Bildung in der T1-Phase hindeutet.
Zusammenfassung
- 103 -
5 Zusammenfassung
Bei Acrylamid handelt es sich um ein genotoxisches Kanzerogen, welches beim Erhitzen von
Lebensmitteln gebildet wird. Die Bioverfügbarkeit von Acrylamid aus Lebensmitteln und die
niedrigste genotoxisch wirksame Dosis im lebenden Organismus sind derzeit die zentralen
offenen Fragen für die Risikobewertung von Acrylamid.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit spezifische Lebensmittelmatrices die
Bioverfügbarkeit und den Metabolismus von Acrylamid beeinflussen. Lebkuchen als
zuckerhaltiges, fettarmes und trockenes Lebensmittel auf Getreidebasis und Pommes frites
(fett- und wasserreich; Kartoffelbasis) die entweder direkt aus der Kartoffel geschnitten (mit
intakter Gewebestruktur) oder aus Kartoffelerzeugnissen „rekombiniert“ wurden sowie
Brotkruste wurden an männliche Sprague Dawley-Ratten über 1, 3, 5, 7 und 9 Tage
verfüttert und mit der Aufnahme von Acrylamid über Trinkwasser (Schlundsondierung)
verglichen. Die täglich verabreichte Acrylamid-Dosis lag bei 100 µg/kg KG für Pommes frites
und Lebkuchen bzw. 50 µg/kg KG für Brotkruste.
Als Langzeit-Expositionsbiomarker wurden Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem
endständigen Valin (Val) am Hämoglobin (Hb) herangezogen. Bei allen
Behandlungsgruppen waren deutliche, nahezu lineare Anstiege der AAVal-Hb-Addukt-
Gehalte in Abhängigkeit von der Behandlungszeit und damit der kumulativen Acrylamid-
Dosis zu erkennen. Im Gegensatz zu den AAVal-Hb-Addukten blieb die Glycidamid-Hb-
Adduktbildung bei allen Behandlungsgruppen im Bereich der unbehandelten Kontrolle. Das
Ausmaß der AAVal-Bildung in den Tieren, denen Acrylamid über Pommes frites verabreicht
wurde, entsprach jener nach Gabe einer entsprechenden Dosis Acrylamid in Trinkwasser
mittels Schlundsondierung (AA-TW-Gruppen), was auf eine vergleichbare Bioverfügbarkeit
von Acrylamid hindeutet. Lediglich in den Gruppen, die Acrylamid über Brotkruste erhielten,
wurde eine geringfügig verminderte Bildung von AAVal-Hb-Addukten im Vergleich zu den
AA-TW-Gruppen beobachtet.
Bei den Behandlungsgruppen, welche Acrylamid über Lebkuchen erhielten, wurde nach allen
Expositionszeiträumen eine signifikant unterschiedliche AAVal-Hb-Adduktbildung im
Vergleich zu den AA-TW-Gruppen beobachtet. Vermutlich reflektieren die AAVal-Messwerte
die ungenaue Charakterisierung des Gehaltes an Acrylamid im Lebkuchen, wodurch im
Rahmen der Messungenauigkeiten keine endgültige Aussage zur Bioverfügbarkeit von
Acrylamid aus Lebkuchen gemacht werden kann.
Als Kurzzeit-Expositionsbiomarker für Aufnahme, Entgiftung und Ausscheidung von
Acrylamid, sowie dessen Biotransformation zu Glycidamid im Organismus über einen
Zeitraum von 24 Stunden wurden Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren (AAMA und
Zusammenfassung
- 104 -
GAMA) als Abbauprodukte der Glutathion-Addukte herangezogen. Die Anteile der
Mercaptursäuren an der verabreichten täglichen Dosis lagen über alle Behandlungsgruppen
und Expositionsperioden gemittelt bei 36 ± 10 % für AAMA und 18 ± 4 % für GAMA, wobei
im Hinblick auf die Gesamtausscheidung keine signifikanten Unterschiede in Abhängigkeit
von der Expositionsdauer erkennbar waren. Nach Aufnahme von Acrylamid über Pommes
frites wurde kein signifikanter Unterschied in der Gesamtausscheidung an Mercaptursäuren
im Vergleich zur Gabe in Trinkwasser mittels Schlundsondierung (AA-TW-Gruppen)
beobachtet, was auf eine vergleichbare Bioverfügbarkeit von Acrylamid hindeutet. Bei den
mit Brotkruste gefütterten Tieren wurde eine im Vergleich zu AA-TW-Gruppen geringfügig
erniedrigte Ausscheidung an AAMA beobachtet, was im Einklang mit der erniedrigten AA-
Val-Bildung steht. Nach Aufnahme von Acrylamid über Lebkuchen wurden nach allen
Expositionsperioden Unterschiede in der Mercaptursäure-Ausscheidung im Vergleich zu den
AA-TW-Gruppen festgestellt, was die Ergebnisse bei den AAVal-Hb-Addukten widerspiegelt.
Nach Exposition mit Acrylamid über Pommes frites und Brotkruste konnte eine Veränderung
des Mercaptursäure-Verhältnisses GAMA/AAMA hin zu einer verstärkten Bildung von GAMA
im Vergleich zur Acrylamid-Aufnahme über Trinkwasser (Schlundsondierung) gezeigt
werden.
Insgesamt lassen die Biomarker Hämoglobin-Addukte und Mercaptursäuren erkennen, dass
die Bioverfügbarkeit von Acrylamid aus den untersuchten Lebensmitteln mit derjenigen nach
Aufnahme über Trinkwasser (Schlundsondierung) vergleichbar ist.
Für die Ermittlung der Gesamtbilanz an Acrylamid-Ausscheidung aus dem Organismus
wurde auch die Acrylamid- und Glycidamid-Ausscheidung im 24-Stunden-Sammelurin
bestimmt. Die ausgeschiedenen Anteile an der verabreichten Tagesdosis lagen über die
Behandlungsgruppen und Expositionsperioden gemittelt bei 3,1 ± 2,4 % für Acrylamid und
2,4 ± 1,3 % für Glycidamid und leisten damit im Vergleich zu den Mercaptursäuren einen
verhältnismäßig geringen Beitrag zur Gesamtausscheidung einer verabreichten Acrylamid-
Dosis. Zwischen den unterschiedlichen Behandlungsgruppen wurden keine signifikanten
Unterschiede in der Acrylamid- bzw. Glycidamid-Ausscheidung beobachtet, wobei innerhalb
der AA-TW-Gruppen tendenziell mehr Acrylamid über den Urin ausgeschieden wurde.
Zur Untersuchung der Resorptionskinetik von Acrylamid bei Verabreichung über Pommes
frites im Vergleich zur Aufnahme in Trinkwasser (Schlundsondierung) wurden über einen
Zeitraum von 4 Stunden die Acrylamid- und Glycidamid-Gehalte in Rattenserum bestimmt.
Dabei lag die maximale Acrylamid-Serumkonzentration bei Acrylamid-Aufnahme über
Trinkwasser (Schlundsonde) etwa um den Faktor 4 höher als bei Acrylamid-Gabe über
Pommes frites. Insgesamt deutet der zeitliche Verlauf der Acrylamid-Serumkonzentration in
der mit Pommes frites gefütterten Gruppe auf eine im Vergleich zur AA-TW-Gruppe
verzögerte Freisetzung bzw. verlangsamte Resorption von Acrylamid im Gastrointestinaltrakt
Zusammenfassung
- 105 -
hin. Glycidamid konnte bei den behandelten Gruppen lediglich 4 Stunden nach der
Acrylamid-Aufnahme nachgewiesen werden, wobei die gemessenen Konzentrationen unter
der Bestimmungsgrenze der verwendeten Methode zur Bestimmung von Glycidamid in
Rattenserum lagen.
Zum Vergleich der Toxikokinetik von Acrylamid bei wiederholter Verabreichung (50 bzw.
100 µg Acrylamid/kg KG/d für maximal 9 Tage) mit derjenigen nach Gabe der
entsprechenden kumulativen Einzeldosis wurden 450 bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG über
Trinkwasser mittels Schlundsondierung an männliche Sprague Dawley-Ratten verabreicht.
Darüber hinaus wurde zur Untersuchung der Acrylamid-Toxikokinetik im Hochdosisbereich
eine Einzeldosis von 10 mg Acrylamid/kg KG gegeben. Dabei wurden bei den behandelten
Tieren nahezu lineare Anstiege der AAVal-Hb-Addukte in Abhängigkeit von der
verabreichten Acrylamid-Dosis beobachtet. Die Glycidamid-Hämoglobin-Addukte (GAVal)
zeigten lediglich nach Verabreichung von 10 mg Acrylamid/kg KG einen signifikanten Anstieg
im Vergleich zu den Negativkontrollen. Die über den Urin ausgeschiedenen Anteile von
AAMA, GAMA sowie freiem Acrylamid und Glycidamid an der verabreichten Dosis waren im
Dosisbereich von 0,45-10 mg Acrylamid/kg KG mit den Ergebnissen nach einmaliger bzw.
wiederholter Gabe von 50 bzw. 100 µg Acrylamid/kg KG/d vergleichbar. Diese Ergebnisse
deuten darauf hin, dass im untersuchten Dosisbereich von 0,05-10 mg Acrylamid/kg KG
keine Sättigung des oxidativen Metabolismus unter Bildung von Glycidamid zu erwarten ist.
Zur Abschätzung der Hintergrundbelastung mit Acrylamid wurden in 8 humanen Blutproben
die Gehalte an Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin-Addukten (AAVal, GAVal) sowie in
10 humanen Urinproben die Gehalte an Acrylamid- und Glycidamid-Mercaptursäuren
(AAMA, GAMA) bestimmt. Bei den Rauchern wurden deutlich höhere AAVal-Gehalte im
Vergleich zu Nichtrauchern gemessen, wohingegen die Gehalte an GAVal auf
vergleichbarem Niveau lagen. Darüber hinaus wurde bei den Rauchern eine im Vergleich zu
Nichtrauchern signifikant höhere Ausscheidung von AAMA und GAMA beobachtet, wobei die
entsprechenden GAMA/AAMA-Verhältnisse bei Rauchern erniedrigt waren. Die Ergebnisse
verdeutlichen, dass das Rauchen einen wesentlichen Beitrag zur Acrylamid-Exposition
leisten kann.
Um die Empfindlichkeit für die Quantifizierung der Hämoglobin-Addukte zu erhöhen und das
relativ zeitaufwendige Verfahren der Flüssig-Flüssig-Extraktion zur Isolierung der
Hämoglobin-Addukt-Derivate (PFPTHs) zu vereinfachen, wurde im Rahmen dieser Arbeit
eine HPLC-MS/MS Methode in Verbindung mit einer Festphasenextraktion (SPE) zur
Probenaufarbeitung etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass die Empfindlichkeit der
verwendeten Methode zur Bestimmung der AAVal-Addukte bei Nichtrauchern ausreichend
Zusammenfassung
- 106 -
ist. Allerdings lagen bei der Bestimmung der GAVal-Addukte die Intensitäten der beiden
Diastereomeren-Peaks bereits im Bereich der Nachweisgrenze.
In Kooperation mit Prof. Dr. Uwe Fuhr vom Institut für Pharmakologie der Universität Köln
wurden im Rahmen der humanen Verzehrsstudie „Bedeutung der CYP450 2E1-Aktivität für
die Toxikokinetik von Acrylamid beim Menschen“ Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit
dem endständigen Valin des Hämoglobin bestimmt. Dabei wurde das Ausmaß der Addukt-
Bildung bei 13 Probanden nach Aufnahme von ca. 1 mg Acrylamid über Kartoffel-Chips
jeweils bei unbeeinflusster (R-Phase), gehemmter (T1-Phase) und induzierter (T2-Phase)
CYP450 2E1-Aktivität untersucht. In der Referenzperiode (R-Phase) ohne Komedikation
wurde bei diesen Probanden ein Anstieg der AAVal-Gehalte um 8 ± 5 pmol/g Hb beobachtet.
Ein im Vergleich zur R-Phase signifikant erhöhter AAVal-Anstieg (12 ± 5 pmol/g Hb) zeigte
sich in der Testperiode T1, in der CYP450 2E1 durch Disulfiram gehemmt wurde. In der
Testperiode T2, in der CYP450 2E1 durch eine Vorbehandlung mit Ethanol induziert wurde,
wiesen die AAVal-Gehalte einen mit der R-Phase vergleichbaren Anstieg um
9 ± 5 pmol/g Hb auf. Für GAVal hingegen konnten aufgrund der größeren
Messwertschwankungen keine signifikanten Veränderungen in der Testperiode T1 bzw. T2
im Vergleich zur Referenzperiode festgestellt werden.
Darüber hinaus wurde bei 3 Probanden der zeitliche Verlauf der AAVal-Bildung in den
jeweiligen Testperioden über einen Zeitraum von 24 Stunden untersucht. Die maximale
AAVal-Konzentration wurde bei den untersuchten Probanden im Zeitraum von 8-10 Stunden
erreicht, wobei anschließend ein Plateau-förmiger Verlauf der Bildungskurven beobachtet
wurde.
Um die Exposition gegenüber Acrylamid mit derjenigen von Acrolein zu vergleichen, wurde
der Gehalt an N-Acetyl-S-(3-hydroxypropyl)cystein (HPMA) im 24-Stunden-Sammelurin aus
der Rattenfütterungsstudie sowie in 10 Urinproben aus der Allgemeinbevölkerung bestimmt,
wobei es sich bei HPMA um den Hauptmetaboliten von Acrolein handelt. Dabei wurde über
den Gehalt an HPMA im Urin der Tiere eine theoretische mittlere Belastung von
46 ± 16 µg Acrolein/kg KG berechnet. Allerdings deuten die HPMA-Gehalte auf einen
geringen Beitrag der verabreichten Lebensmittel zur Acrolein-Gesamtexposition unter den
Versuchsbedingungen der Fütterungsstudie hin. In den untersuchten humanen Urinproben
zeigten die gemessenen HPMA-Gehalte relativ große individuelle Schwankungen. Dennoch
lässt sich bei den rauchenden Probanden eine signifikant erhöhte Ausscheidung von HPMA
im Vergleich zu den Nichtrauchern feststellen. Allerdings zeigen auch die Nichtraucher relativ
hohe Konzentrationen an HPMA im Urin, welche etwa um den Faktor 10 höher liegen als die
Summe der entsprechenden Acrylamid-Mercaptursäuren AAMA und GAMA. Insgesamt
Zusammenfassung
- 107 -
deuten die Gehalte an HPMA darauf hin, dass die Allgemeinbevölkerung einer relativ hohen
Belastung mit Acrolein ausgesetzt ist.
Methoden und Materialien
- 108 -
6 Methoden
6.1 Fütterungsstudie an der Ratte
Die Fütterungsstudie wurde im Rahmen des Projektes „Umsetzung neuer Verfahrensabläufe
in Produktionsanlagen für Kartoffel- und Getreideerzeugnisse mit reduzierten Gehalten an
Acrylamid und dessen Folgeprodukten“ (Projekt-Nr.: AiF 209 ZBG) in Kooperation mit der
Arbeitsgruppe Prof. Dr. Gert Fricker am Institut für pharmazeutische Technologie der
Ruprecht-Karls Universität Heidelberg durchgeführt.
6.1.1 Spezifikation der Acrylamid-haltigen Lebensmittel
Die geschnittenen (PFG) und aus Kartoffelerzeugnissen rekonstituierten Pommes frites
(PFR) wurden freundlicherweise vom Deutschen Institut für Lebensmitteltechnik e.V. (DIL),
die verwendete Brotkruste (BK) und der Lebkuchen (LK) vom Institut für Lebensmittel- und
Umweltforschung in Nuthetal (ILU) hergestellt.
Abb. 6.1: Verwendete Lebensmittel zur Durchführung der Fütterungsstudie, a: Lebkuchen (LK) b: geschnittene Pommes frites (PFG), c: rekonstituierte Pommes frites (PFR), d: Brotkruste (BK)
Methoden und Materialien
- 109 -
Die verwendeten Lebkuchen wurden nach einer Standardrezeptur für einfache braune
Lebkuchen hergestellt. Dazu wurde ein Grundteig aus Weizenmehl (Type 550, 21,7 %),
Roggenmehl (Type 1150, 9,3 %), Invertzuckercreme (25,2 %), Glucosesirup (2,8 %), 10 %-
iger Milchsäure (2 %), Wasser (23,6 %), Gewürz (9,4 %), ABC-Trieb (3,6 %) und Pottasche
(2,4 %) gemischt. Der Teig wurde zu einem Band mit 5 mm Dicke ausgerollt und rechteckige
Teigstücke mit einem Gewicht von ca. 40 g ausgestochen. Die Teigstücke wurden
anschließend in einem Etagenbackofen (Oberhitze 190 °C/Unterhitze 160 °C) für 20 min
gebacken.
Zur Herstellung der geschnittenen Pommes frites wurden Speisekartoffeln (Wernsing GmbH,
Addrup) zu Stäbchen geschnitten und lauwarm gewässert. Anschließend wurden die
Stäbchen mit einem Fön getrocknet (ca. 3 min in flacher Schicht, Oberfläche trocken) und in
300 g Portionen für 2 min bei 180 °C frittiert (Frymaster, Enodis, Eschborn). Die
rekonstituierten Pommes frites wurden aus einem Teig von 30 % Kartoffelflocken
(Emslandstärke, Emlichheim), 20 % Kartoffelgranulat (Emslandstärke, Emlichheim) und
50 % Leitungswasser hergestellt. Nach dem Ausrollen des Teiges auf eine Dicke von 8 mm
erfolgte zum Ausgleich der internen Wasserverteilung eine zweistündige Teigruhe.
Anschließend wurde der Teig in Stäbchen geschnitten (∅ = 8 mm) und in 300 g Portionen für
3 min bei 175 °C frittiert (Frymaster, Enodis, Eschborn). Die fertig frittierten Pommes frites
wurden unmittelbar nach der Herstellung eingefroren und unter Einbeziehung aller Chargen
gemischt (jeweils ca. 3 kg Endprodukt).
Zur Generierung möglichst hoher Acrylamid-Gehalte in der Brotkruste erfolgte der Einsatz
von Roggenvollkornmehl verbunden mit einer längeren Backzeit (60 min;
Temperaturgradient von 250 °C auf 210 °C) sowie der Zusatz von Invertzuckercreme (3 %
auf Gesamtmehl) und ABC-Trieb (1 % auf Gesamtmehl). Die Eingangsbestimmung der
Acrylamid-Gehalte erfolgte durch die herstellenden Institute, Kontrollmessungen wurden von
Eurofins Analytik, Hamburg durchgeführt.
Die ermittelten Gehalte der geschnittenen und rekonstituierten Pommes frites (PFG und
PFR) sowie Brotkruste sind in Tab. 6.1 aufgeführt. Nach Erhalt der Lebensmittel und nach
3 monatiger Lagerung bei -20 °C wurden weitere Kontrollmessungen durchgeführt (Eurofins
Analytik, Hamburg). Die Daten belegen, dass der Acrylamid-Gehalt der Lebensmittel PFR,
PFG und BK sich während der Lagerung nicht signifikant verändert. Zur Durchführung der
Fütterungsversuche wurden für die geschnittenen und rekonstituierten Pommes frites
Acrylamid-Gehalte von 2800 µg/kg sowie für Brotkruste 1400 µg/kg angenommen.
Methoden und Materialien
- 110 -
Tab. 6.1: Acrylamid-Gehalte in Pommes frites geschnitten (PFG), rekonstituiert (PFR) und Brotkruste (BK)
Hersteller [µg/kg] eurofins [µg/kg] eurofins [µg/kg] Datum 06/2007 06/2007 09/2007 PFG 2841 (DIL) 2800 2900 PFR 2847 (DIL) 2600 2800 BK 1294 (ILU) 1400 1400
Für den Acrylamid-Gehalt des Lebkuchens wurden im Rahmen mehrmals durchgeführter
Kontrollmessungen stark unterschiedliche Werte ermittelt (Tab. 6.2). Die in den jeweiligen
Messungen untersuchten Lebkuchen stammten aus der gleichen Probe und waren gleich
behandelt. Dazu wurden repräsentative Stichproben in flüssigem Stickstoff tiefgefroren,
pulverisiert und anschließend auf Trockeneis an die jeweiligen Institute verschickt.
Tab. 6.2: Ermittelte Acrylamid-Gehalte des Lebkuchens; A: Institut für Lebensmittel- und Umweltforschung, Nuthetal; B: Eurofins Analytik, Hamburg; C: Deutsches Institut für Lebensmitteltechnik e.V., Quakenbrück; D: Lehrstuhl für Lebensmittelchemie, Technische Universität München, Garching; E: Zentrallabor der deutschen Süßwarenindustrie, Bonn
Datum Institut Acrylamid-Gehalt [µg/kg]
02/07 A 3181
06/07 3600
07.09.07 4100
12.09.07
B
4500, 4700
A 3550
C 3700
D 4200 10/07
E 4250
11/07 D LC-MS: 3500, 3700; GC-MS: 5400
C 4100
A 3500 05/08
D LC-MS: 4000; GC-MS: 3700
11/08 eigene Messung LC-MS: 6321 ± 49
Methoden und Materialien
- 111 -
In Abhängigkeit von den Analysenergebnissen wurden zur Durchführung der
Fütterungsversuche für den Acrylamid-Gehalt des Lebkuchens unterschiedliche Werte
angenommen (Tab. 6.3).
Tab. 6.3: Mittlere Acrylamid-Gehalte des Lebkuchens (in Abhängigkeit von den vorliegenden Daten) zur Durchführung der Fütterungsversuche
Expositionsperiode [d] Acrylamid-Gehalte [µg/kg] 1 5400 3 3200 5 5400 7 3400 9 4063
6.1.2 Konditionierung der Tiere
Die männlichen Spraque-Dawley Ratten (Stamm Crl:CD(SD); 6-8 Wochen alt;
Körpergewicht ~ 250 g) wurden nach Eintreffen und Anpassung an die Umgebungs-
bedingungen (22 °C; Tag-Nacht Rhythmus) über 10 Tage mit einer Acrylamid-armen
Standarddiät (ssniff Spezialdiät; Bestimmung der Acrylamid-Gehalte durch EUROFINS
Hamburg: < 30 µg/kg; eigene Messungen: 11 ± 1 µg/kg) an die Futteraufnahme und den
Fresszyklus (bestimmte Menge in definiertem Zeitraum) im Stoffwechselkäfig gewöhnt. Nach
nüchtern setzen der Tiere über Nacht im Gemeinschaftskäfig wurde jeweils an Einzeltiere im
Stoffwechselkäfig 15 g Pelletfutter (Acrylamid-arm) verfüttert. Für die vollständige
Futteraufnahme wurde ein Zeitraum von 3 Stunden gewährt. Danach wurden die Tiere
wieder in die Gemeinschaftshaltung zurück verbracht und erhielten jeweils weitere 10 g
Standarddiät pro Tier.
AA-armes Futter in der Gruppe (10 g pro Tier)
Einzelhaltung im Stoffwechselkäfig:AA-armes Futter (15 g pro Tier)
Nüchtern setzen in der Gruppe über Nacht
AA-armes Futter in der Gruppe (10 g pro Tier)
Einzelhaltung im Stoffwechselkäfig:AA-armes Futter (15 g pro Tier)
Nüchtern setzen in der Gruppe über Nacht
18.00 Uhr 08.00 Uhr 11.00 Uhr 18.00 Uhr Abb. 6.2: Verlauf der Konditionierung
Methoden und Materialien
- 112 -
6.1.3 Behandlung der Tiere in der Hauptstudie
Pro Fütterungsperiode wurden jeweils 3 Tiere (Körpergewicht: 287 ± 16 g) aus den Gruppen
Trinkwasserkontrolle (Schlundsondierung; AA-TW), Lebkuchen (LK), Pommes frites
geschnitten (PFG) und Pommes frites rekonstituiert (PFR) (Tab. 6.4) mit
100 µg Acrylamid/kg KG/d gleichzeitig behandelt. In der Brotkruste konnten auch nach
Variation der Rezeptur (Zusatz von ABC-Trieb und von reduzierenden Kohlenhydraten) und
des Backprozesses (Institut für Lebensmittel- und Umweltforschung, Nuthetal) lediglich
Gehalte von maximal 1400 µg Acrylamid/kg generiert werden. Die täglich zugeführte Dosis
wurde deshalb bei Brotkruste (BK) auf 50 µg Acrylamid/kg KG reduziert und die
Trinkwasserkontrolle (Schlundsondierung; AA-TW) entsprechend angepasst. Bei den
durchgeführten Versuchen wurden jeweils 3 Tiere als Negativkontrolle (TW) mitgeführt.
Tab. 6.4: Behandlungsgruppen der Fütterungsstudie
Kontrolle
(TW)
AA-haltiges Trinkwasser
(AA-TW)
geschnittene Pommes
frites (PFG)
rekonstituierte Pommes
frites (PFR)
Lebkuchen (LK)
Brotkruste (BK)
AA-Gehalte (µg/kg) 2800 2800 3200-5400 1400
Tägliche AA-Dosis [µg/kg KG]
50 bzw. 100 100 100 100 50
Behandlung im Stoffwechsel- käfig
Trinkwasser und
Standarddiät ad lib.
Trinkwasser ad lib. Trinkwasser ad lib.
Während des Behandlungszyklus in der Hauptstudie (Abb. 6.3) wurden die Tiere täglich
gewogen, um die zu verabreichende Menge an Acrylamid-haltigem Lebensmittel bzw.
Trinkwasser für die exakte Dosierung ermitteln zu können. Die Applikation des Acrylamid-
haltigen Trinkwassers mittels Schlundsonde erfolgte unter leichter Narkose. Dazu wurden die
Tiere im Exsikkator (Volumen: ~5,8 Liter) mit ca. 5 ml Isofluran, welches auf Zellstofftücher
aufgebracht wurde, innerhalb 60 Sekunden narkotisiert. Die übrigen Behandlungsgruppen
und Negativkontrollen wurden analog behandelt. Die Acrylamid-Dosis wurde den über Nacht
nüchtern gesetzten Tieren der AA-TW-Gruppe über zwei Schlundsondierungen zum
Zeitpunkt 0 und 1,5 Stunden nach Beginn der Fütterung verabreicht (je ca. 0,5 ml einer
17 µg/ml bzw. 25 µg/ml Acrylamid-Trinkwasserlösung), um die Acrylamid-Aufnahme zeitlich
den Fütterungsbedingungen anzunähern. Die Fütterung mit 4-11 g der Lebensmittel erfolgte
im Stoffwechselkäfig. Die Futteraufnahme erfolgte innerhalb eines Zeitraumes von
3 Stunden. Anschließend erhielten die Tiere noch 15 g Acrylamid-arme Standarddiät (AA-
Methoden und Materialien
- 113 -
TW-Gruppe: 25 g) im Gemeinschaftskäfig. Art und Sequenz der Behandlung war für alle
Gruppen gleich.
AA-armes Futter in der Gruppe
Einzelhaltung im Stoffwechselkäfig:AA-Exposition über Lebensmittel
bzw. Trinkwasser
Nüchtern setzen in der Gruppe über Nacht
AA-armes Futter in der Gruppe
Einzelhaltung im Stoffwechselkäfig:AA-Exposition über Lebensmittel
bzw. Trinkwasser
Nüchtern setzen in der Gruppe über Nacht
18.00 Uhr 08.00 Uhr 11.00 Uhr 18.00 Uhr
nach der letzten Exposition:Tiere verbleiben in Stoffwechselkäfigen
Sammeln von Urin und Fäces
nach 24 h:Töten der Tiere
Entnahme von Blut und Organen Abb. 6.3: Zeitzyklus der Fütterungsversuche
Nach der letzten Exposition verblieben die Versuchstiere zum Sammeln von Urin und Fäces
in ihren Stoffwechselkäfigen und erhielten Acrylamid-arme Standarddiät und Trinkwasser ad
lib. Nach 24 Stunden wurden die Versuchstiere durch cervikale Dislokation getötet und Blut
sowie Organe entnommen.
6.1.4 Kumulative Dosis (450 bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG) und 10 mg Acrylamid/kg KG
Nach dem nüchtern setzen der Versuchstiere über Nacht wurde die kumulative Dosis aus
der Fütterungsstudie (450 bzw. 900 µg Acrylamid/kg KG) an jeweils drei Versuchstiere durch
Schlundsondierung mit ca. 0,5 ml (in Abhängigkeit von der Körpermasse) einer 250 µg/ml
bzw. 500 µg/ml Acrylamid-Trinkwasserlösung verabreicht. 10 mg Acrylamid/kg KG wurden
zwei Versuchstieren durch Schlundsondierung mit jeweils ca. 0,5 ml einer 5 mg/ml
Acrylamid-Trinkwasserlösung appliziert. Die jeweiligen Schlundsondierungen wurden unter
leichter Isofluran-Narkose durchgeführt. Die Versuchstiere verblieben für 24 Stunden im
Stoffwechselkäfig, um Urin und Fäces zu sammeln. Anschließend wurden sie durch cervikale
Dislokation getötet und Blut sowie Organe entnommen. Das Versuchsprotokoll entsprach im
Übrigen der Behandlung mit Acrylamid-haltigem Trinkwasser in der Hauptstudie (Kap. 6.1.3).
Methoden und Materialien
- 114 -
6.1.5 Fütterungsversuch zur Bestimmung der Resorptionskinetik von Acrylamid und Glycidamid
Zur Untersuchung der Aufnahmekinetik von Acrylamid wurden an jeweils vier Versuchstiere
Einzeldosen von 100 µg Acrylamid/kg KG über geschnittene Pommes frites (PFG) bzw.
Trinkwasser (Schlundsondierung) verabreicht. Die Gewinnung von Blutproben erfolgte bei
jeweils drei Versuchstieren randomisiert zu den Zeitpunkten 30, 60, 120 und 240 min nach
der Acrylamid-Aufnahme mittels retrobulbärer Punktion. Die Bestimmung der
Hintergrundbelastung an Acrylamid und Glycidamid erfolgte bei drei Kontrolltieren. Das
Versuchsprotokoll entsprach der Behandlung der Tiere in der Hauptstudie (Kap. 6.1.3).
6.1.6 Einfluss von Isofluran auf den Metabolismus von Acrylamid
Um den Einfluss des zur Narkotisierung verwendeten Isoflurans auf den Metabolismus von
Acrylamid zu untersuchen, wurden an vier Versuchstiere an zwei aufeinanderfolgenden
Tagen jeweils 100 µg Acrylamid/kg KG verabreicht. Nach dem nüchtern setzen der
Versuchstiere über Nacht wurde die tägliche Dosis durch zwei Schlundsondierungen zum
Zeitpunkt 0 und 1,5 Stunden mit ca. 0,5 ml (in Abhängigkeit von der Körpermasse) einer
25 µg/ml Acrylamid-Trinkwasserlösung appliziert. Bei zwei Versuchstieren wurden die
jeweiligen Schlundsondierungen nach leichter Isofluran-Narkose durchgeführt, die beiden
anderen Tiere wurden ohne Narkotisierung behandelt. Die Mercaptursäuren wurden nach
den jeweiligen Applikationen im 24 Stunden Sammelurin bestimmt. Die Entnahme von Blut
zur Bestimmung der Hb-Addukte erfolgte 24 Stunden nach der letzten Applikation. Das
Versuchsprotokoll entsprach der Behandlung der Tiere in der Hauptstudie (Kap. 6.1.3).
Methoden und Materialien
- 115 -
6.2 Bestimmung von Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobin
Addukten im Rahmen der humanen Verzehrsstudie
„Bedeutung der CYP450 2E1-Aktivität für die Toxikokinetik
von Acrylamid beim Menschen“
In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Uwe Fuhr vom Institut für Pharmakologie der Universität
Köln wurden im Rahmen der humanen Verzehrsstudie „Bedeutung der CYP450 2E1-Aktivität
für die Toxikokinetik von Acrylamid beim Menschen“ (Studien-Nr. KPUK-03-ACR/PIL-01)
Addukte von Acrylamid und Glycidamid mit dem endständigen Valin des Hämoglobin
bestimmt. Ziel dieser Studie war es, die Rolle der CYP450 2E1-Aktivität bei der Toxikokinetik
von Acrylamid beim Menschen zu charakterisieren. Daneben sollten Informationen zur
Bedeutung der Glutathion-S-Transferasen beim Phase-II Metabolismus von Acrylamid und
Glycidamid gewonnen werden. Dazu wurde in einer klinischen Studie der Konzentrations-
Zeit-Verlauf von Acrylamid und seinen Metaboliten Glycidamid, AAMA und GAMA in Plasma
und Urin, sowie von den Hämoglobin-Addukten nach Gabe Acrylamid-reicher Nahrung
(Kartoffel-Chips) jeweils bei unbeeinflusster, gehemmter und induzierter CYP450 2E1-
Aktivität bestimmt. Des Weiteren wurde der Einfluss genetischer Varianten für CYP450 2E1
und Glutathion-S-Transferasen auf den Acrylamid-Metabolismus untersucht.
An der Studie nahmen 16 gesunde kaukasische Probanden (8 Männer; 8 Frauen) im Alter
von 20-45 Jahren (29,8 ± 5,9 Jahre) mit einem Body Mass Index von 22,9 ± 2,0 kg/m2 teil.
Um die Gesundheit der Probanden sicherzustellen wurden umfangreiche klinische
Voruntersuchungen durchgeführt. Die Probanden wurden angewiesen 72 Stunden vor bis
48 Stunden nach einer Studienperiode auf Acrylamid-reiche und Methylxanthin-haltige
Lebensmittel sowie Alkohol und jegliche Komedikation zu verzichten. Die stationäre
Aufnahme erfolgte 11 Stunden vor bis 24 Stunden nach einer Studienperiode. Während dem
stationären Aufenthalt erfolgte eine standardisierte Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme.
Dabei wurde 11 Stunden vor bis 6 Stunden nach Aufnahme der Kartoffel-Chips gefastet. Des
Weiteren sollte 1 Stunde vor bis 6 Stunden nach der Administration keine Flüssigkeit
aufgenommen werden und die Flüssigkeitsaufnahme wurde bis 72 Stunden post-Dosis auf
maximal 3 Liter beschränkt.
Die klinische Studie wurde in Form eines offenen, monozentrischen und randomisierten
„change–over“ Designs durchgeführt. Die vier Studienperioden sind mit einer
Auswaschphase von jeweils 14 Tagen zwischen zwei Studienperioden getrennt.
Methoden und Materialien
- 116 -
Tab. 6.5: Studienperioden
Phänotypisierung (P-Phase)
orale Gabe von 250 mg Chlorzoxazon (Parafon Forte® DSC 500 mg; ½ Tablette) Bestimmung von Chlorzoxazon und des Metaboliten 6-OH-Chlorzoxazon pre-dose und
2 Stunden danach mittels HPLC
Referenzperiode (R-Phase)
Gabe von 150 g Kartoffelchips mit einem Gehalt von 957-1000 µg Acrylamid (14,8 µg/kg KG) ohne Komedikation
Testperiode 1 (T1-Phase)
Gabe von 150 g Kartoffelchips mit einem Gehalt von 957-1000 µg Acrylamid (14,8 µg/kg KG) 10 Stunden nach oraler Applikation von 500 mg Disulfiram (Antabus® 0,5
Dispergetten)
Testperiode 2 (T2-Phase)
Gabe von 150 g Kartoffelchips mit einem Gehalt von 957-1000 µg Acrylamid (14,8 µg/kg KG) nach täglicher Aufnahme von 48 ml Ethanol über 7 Tage in Form von Bier
(jeweils 1 Liter Reissdorf Kölsch®)
In drei Studienperioden wurden jeweils 957-1000 µg Acrylamid (14,8 µg/kg KG) in Form von
Kartoffelchips (150 g, 6230 ± 990 µg Acrylamid/kg) in Verbindung mit 240 ml Trinkwasser mit
oder ohne Komedikation zur Bestimmung der Acrylamid-Toxikokinetik gegeben. In der
Studienperiode „Phänotypisierung“ wurde das CYP450 2E1-Substrat Chlorzoxazon zur
Bestimmung der CYP450 2E1-Aktivität gegeben (Tab. 6.5). Zur Hemmung der CYP450 2E1-
Aktivität erhielten die Probanden 10 Stunden vor Aufnahme der Acrylamid-haltigen
Kartoffelchips eine einmalige orale Dosis von 500 mg Disulfiram (Antabus® 0,5
Dispergetten). Zur CYP450 2E1-Induktion nahmen die Probanden über einen Zeitraum von 7
Tagen jeweils abends ca. 48 ml Ethanol in Form von Bier (Reissdorf Kölsch, Privatbrauerei
Heinrich Reissdorf & Co) auf.
Zur Bestimmung der Acrylamid- und Glycidamid-Hämoglobinaddukte wurden in drei
Studienperioden (R-Phase, T1-Phase und T2-Phase) jeweils 3 min vor Einnahme der
Acrylamid-reichen Nahrung sowie zu den Zeitpunkten 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 10;
12; 16 und 24 Stunden nach Gabe der Dosis Blutproben entnommen. Die Aufarbeitung der
Blutproben wurde gemäß der in Kapitel 6.3 beschriebenen Methode bis zur Gewinnung des
Hämolysates von Mitarbeitern des Instituts für Pharmakologie der Universität Köln
durchgeführt. Die erhaltenen Hämolysate wurden bei -80 °C im Biofreezer gelagert und unter
Kühlung mittels Trockeneis verschickt. Alle weiteren Aufarbeitungsschritte wurden gemäß
Kapitel 6.3 an der Technischen Universität Kaiserslautern, Fachbereich Chemie,
Fachrichtung Lebensmittelchemie und Toxikologie, durchgeführt.
Methoden und Materialien
- 117 -
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und
Glycidamid bei 13 Probanden in Blutproben der Referenzperiode und den Testperioden 1
und 2 jeweils zu den Zeitpunkten pre-dose und 24 Stunden mittels GC/MS bestimmt.
Weiterhin wurde bei 3 Probanden die Acrylamid-Hämoglobinadduktbildung zu den
Zeitpunkten pre-dose, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16 und 24 Stunden in den jeweiligen Studienperioden
mittels HPLC-MS/MS untersucht. Die randomisierte Abfolge der Studienperioden der
untersuchten Probanden ist in Tab. 6.6 gezeigt.
Tab. 6.6: Randomisierte Abfolge der Studienperioden
Abfolge der Studienperioden Proband 1. 2. 3. 4.
1 R P T2 T1 2 T1 R P T2 3 T1 T2 P R 5 T2 T1 R P 6 P R T1 T2 8 R T1 T2 P 9 R P T2 T1
11 T1 T2 P R 12 P T2 T1 R 13 T1 R P T2 14 P T2 T1 R 15 T2 P R T1 16 T2 P R T1
6.3 Isolierung und Aufreinigung von Hämoglobin aus Human-
und Rattenvollblut
Die frisch gewonnen Blutproben können bis zur weiteren Verarbeitung für bis zu zwei
Stunden bei 37 °C im Wasserbad aufbewahrt werden. Zur Abtrennung des Blutplasmas
werden 0,5-2 ml Vollblut für 5 min bei 2400 rpm (800 x g) und Raumtemperatur (RT)
zentrifugiert. Nach Entfernen des Plasmas (Überstand) werden die Erythrocyten (Pellet)
dreimal mit 1-2 ml 0,9 %-iger Natriumchloridlösung gewaschen. Nach jedem Waschschritt
erfolgt eine Zentrifugation für drei Minuten bei 2400 rpm (800 x g) und RT. Nach Zugabe von
2 ml H2Obidest werden die Proben gevortext und für mindestens 2 Stunden tiefgefroren (-
30 °C). Nach dem Auftauen und erneuten Vortexen werden zu dem Hämolysat 10 ml einer
50 mM HCl in 2-Propanol gegeben und zur Extraktion des Hämoglobins kräftig geschüttelt.
Nach Zentrifugation für 10 min bei 5000 rpm (3500 x g) und RT wird der Überstand in 50 ml
Methoden und Materialien
- 118 -
Falcons überführt und nach Zugabe von 8 ml Ethylacetat zur vollständigen Ausfällung des
Hämoglobins für mindestens zwei Stunden bei 4 °C gelagert. Danach wird für drei Minuten
bei 3000 rpm (1250 x g) und RT zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Hämoglobin-
Pellet wird zweimal mit je 5 ml Ethylacetat und zweimal mit je 5 ml n-Hexan gewaschen,
wobei die Waschflüssigkeiten jeweils nach Zentrifugation für drei Minuten bei 3000 rpm
(1250 x g) und RT abdekantiert werden. Die erhaltenen Hämoglobin-Pellets werden zur
Trocknung über Nacht im Abzug aufbewahrt.
6.4 Bestimmung der Hämoglobin-Addukte von Acrylamid und
Glycidamid mittels GC-MS
6.4.1 Hämoglobin-Derivatisierung und Flüssig-Flüssig-Extraktion der PFPTHs
Es werden ca. 50 mg Hämoglobin in Kunststoffvials (13 ml) eingewogen und in 3 ml
Formamid durch vortexen gelöst. Nach Zugabe von 40 µl NaOH und 20 µl PFPITC werden
die Proben für 24 Stunden auf der Schüttelapparatur gelagert. Anschließend wird für 90 min
bei 45 °C im Schüttelwasserbad vollständig derivatisiert. Nach Zugabe der internen
Standards AA- bzw. GA-D7ValPFPTH (9,9 bzw. 9,5 pmol absolut) und vortexen werden die
Proteine mittels 400 µl gesättigter NaCl-Lösung gefällt. Durch Extraktion mit 2 x 3 ml
Diethylether und vortexen werden die PFPTHs extrahiert, wobei nach jedem
Extraktionsschritt eine Zentrifugation für 3 min bei 5700 rpm (4500 x g) und RT erfolgt. Die
erhaltenen Diethylether-Phasen werden in 15 ml Falcons vereinigt und im N2-Strom
eingeengt. Zur Acetonisierung des GAValPFPTHs wird der Überstand in 200 µl frisch
hergestelltem saurem Aceton (1 % H2SO4 konz.) aufgenommen, gevortext und über Nacht
bei RT gelagert. Nach Neutralisation mit 300 µl NaHCO3-Lsg. (0,1 M) werden 1,5 ml Toluol
zugeben und gevortext. Zur Verbesserung der Phasentrennung wird für eine Minute bei
3000 rpm (1250 x g) und RT zentrifugiert. Die erhaltene Toluol-Phase wird mit 2 x 2 ml
H2Obidest gewaschen (Vortex), wobei nach jedem Waschschritt für eine Minute bei 3000 rpm
(1250 x g) und RT zentrifugiert wird. Die Toluol-Phase wird nach dem Waschen in Eppis
überführt und im N2-Strom getrocknet. Nach dem Trocknen können die Proben bei
-30 °C gelagert werden. Vor der Messung wird der Rückstand in 100 µl Toluol aufgenommen
und gevortext. Nichtlösliche Bestandteile werden durch Zentrifugation für 15 min bei
13000 rpm (9500 x g) und Raumtemperatur abgetrennt. Zur Messung wird der Überstand
anschließend in 1,5 ml Braunglasvials mit 300 µl Glaseinsätzen überführt.
Methoden und Materialien
- 119 -
6.4.2 GC-MS
Die Messungen wurden mit einem Agilent 6890/5973 inert Quadrupol GC-MS Gerät mit PTV
(Programmable Temperature Vaporizer)-Injektor im Pulsed Splitless Modus in Verbindung
mit der Steuerungssoftware ChemStation durchgeführt. Die Ionisierung der Analyte erfolgte
mittels negativer chemischer Ionisation mit Methan als Reaktantgas. Die gaschromato-
graphische Trennung erfolgte auf einer unpolaren DB-XLB-Säule. Tab. 6.7 zeigt eine
Übersicht über die verwendeten Massenspuren der Analyte und internen Standards sowie
die Messparameter. Die Gesamtdauer für eine Analyse lag bei 22 min. Zur Schonung des
Detektors erfolgte die Detektion bei AAValPFPTH- und AAD7ValPFPTH zwischen 17 und 18
min; bei acGAValPFPTH- und acGAD7ValPFPTH zwischen 18 und 19 min. Die Validierung
der Methode wurde im Rahmen der Dissertation von Daniel Bertow durchgeführt [Bertow,
2008]. Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurden nach DIN-Vorschrift 32645
bestimmt und betrugen 0,4 bzw. 3,1 fmol für AAValPFPTH sowie 1,6 bzw. 8,0 fmol für
acGAValPFPTH (Angaben als absolute Stoffmengen).
Tab. 6.7: Messparameter GC-MS
Massenspuren der Analyte und internen Standards [m/z] AAValPFPTH 375
AAD7ValPFPTH 382 acGAValPFPTH 431
acGAD7ValPFPTH 438 MS-Parameter
Detektion Selected Ion Monitoring (SIM) Dwell-Time 70 ms
Ionisierungsenergie 70 eV Ionenquellentemperatur 150 °C Quadrupol-Temperatur 150 °C
Reaktantgas Methan-Fluss: 45 % Solvent Delay 15 min
GC-Parameter Injektionsvolumen 1 µl
PTV-Injektor 250 °C Flow 1,3 ml/min (13,7 psi)
Pulsed pressure 30 psi für 1 min
Säulenofen
90 °C für 1 min; mit 25 °C/min auf 120 °C; mit 10 °C/min auf 240 °C; mit 25 °C/min auf 310 °C;
halten für 5 min Interface 280 °C
Methoden und Materialien
- 120 -
6.5 HPLC-MS/MS
6.5.1 Allgemeines
Die HPLC-MS/MS Messungen der vorliegenden Arbeit wurden mittels der Tripel-Quadrupol-
Tandemmassenspektrometer API 2000 bzw. API 3200 (Applied Biosystems) in Verbindung
mit Elektronenspray-Ionisation (ESI) durchgeführt. Das Tuning und die Kalibrierung der
Massenspektrometer erfolgte mit Polypropylenglykol (PPG)-Standards (Applied Biosystems).
Eine Übersicht der verwendeten PPG-Standards in Abhängigkeit von Gerätetyp und
Polarisierung ist in Tab. 6.8 gezeigt.
Tab. 6.8: Verwendete PPG-Standards für Tuning und Kalibrierung
ESI positiv ESI negativ API 2000 PPG PPG 3000 API 3200 PPG (1/10 Verdünnung) PPG 3000
6.5.1.1 Tuning und Kalibrierung
Unter Tuning versteht man die Einstellung des Auflösungsvermögens des
Massenspektrometers. Dabei wird insbesondere die Peak-Breite (width) und -Schärfe mit
Hilfe von PPGs optimiert, um für die zu bestimmende Substanz eine maximale Sensitivität zu
erreichen. Dabei ist zu beachten, das bei höherer Auflösung die Sensitivität abnimmt. Unter
optimalen Bedingungen sollte für API 2000 und API 3200 die Peakbreite zwischen 0,6 und
0,8 amu bei 50 % der maximalen Peakhöhe liegen, was für sämtliche im Rahmen dieser
Arbeit durchgeführten HPLC-MS/MS Messungen sichergestellt wurde.
Die Kalibrierung soll die korrekte Zuordnung von massenspektrometrischen Signalen zu
einem bestimmten Masse/Ladungs-Verhältnis bei akzeptabler Massenverschiebung (mass
shift) gewährleisten. Die Kalibrierung der verwendeten HPLC-MS/MS Systeme erfolgte
mittels spezifischer Fragmentionen der PPG-Standards.
6.5.1.2 Optimierung der substanz- und quellenspezifischen Parameter
Zur Erzielung einer maximalen Sensitivität wurden sowohl die substanz- als auch die
quellenspezifischen Parameter der jeweiligen Analyte in Verbindung mit den entsprechenden
HPLC-Bedingungen optimiert. Abb. 6.4 zeigt den schematischen Aufbau der verwendeten
Tandem-Massenspektrometer mit den zu optimierenden Parametern.
Methoden und Materialien
- 121 -
GS1GS2TEMCURIS
CXPDP EP CEP
CE
Ionenquelle
CurtainPlate
Orifice Skimmer
Q0
Q2 Q3Q1
CADDetektor
GS1GS2TEMCURIS
CXPDP EP CEP
CE
Ionenquelle
CurtainPlate
Orifice Skimmer
Q0
Q2 Q3Q1
CADDetektor
Abb. 6.4: Schematische Darstellung eines Tandem-Massenspektrometers (API 3200); Erläuterung der Abkürzungen siehe Tab. 6.9 bzw. 6.10, modifiziert nach [Applied Biosystems, 2008]
Die analytabhängigen Parameter des Massenspektrometers DP, EP, CEP, CE, CAD und
CXP wurden mittels des „Quantitative Optimization“-Tools der Analyst Software 1.4.2 in
Verbindung mit der Spritzenpumpe (Flow: 10 µl/min) optimiert. Tab. 6.9 zeigt die optimierten
Parameter und deren Funktion.
Tab. 6.9: Analytabhängige Parameter
Parameter Funktion
DP (Declustering Potential) Potential zwischen Skimmer und Orifice: Minimierung von Lösungsmittel-Analyt-
Clustern EP (Entrance Potential) Transport und Fokussierung von Ionen in Q0
CEP (Collision Cell Entrance Potential) Potential zwischen Q0 und Q2-Eingang: Fokussierung von Ionen in Q2
CE (Collision Energy) Potential zwischen Q0 und Q2 zur Steuerung der Kollisionsenergie
CAD-Gas (Collision Activated Dissociation) Gasdruck des Kollisionsgases (N2) in Q2
CXP (Collision Cell Exit Potential) Potential zwischen Q2 und Q3: Überleitung der Ionen von Q2 nach Q3
Die quellenspezifischen Parameter wurden mittels des FIA (Flow Injektion Analysis)-Tools
der Analyst 1.4.2 Software optimiert. Dabei ist es notwendig anhand der Retentionszeiten
der Analyten die Zusammensetzung des Fließmittels zum Zeitpunkt der Elution zu ermitteln.
Anschließend wird unter isokratischen Bedingungen mit der entsprechenden
Fließmittelzusammensetzung und Flussrate der Analyt unter wechselnden
Quellenparametern mittels Loop-Injektion injiziert (ohne HPLC-Säule), um eine maximale
Signalintensität zu erreichen. Tab. 6.10 gibt einen Überblick über die optimierten Parameter
und deren Funktion.
Methoden und Materialien
- 122 -
Tab. 6.10: Quellenspezifische Parameter
Parameter Funktion
GS1 (Gas 1) Vernebelungsgas (N2): bildet kleine
Fließmittel-Tropfen; beeinflusst Spray-Stabilität und Sensitivität
GS2 (Gas 2) Hilfs-/Turbo-Gas (N2): Verdampfung der Spray-Tropfen
TEM (Temperatur) Temperatur des Hilfs-/Turbo-Gases: steigert Verdampfung der Spray-Tropfen und damit Bildung von Analyt-Ionen in der Gasphase
CUR (Curtain Gas) Gasfluss zwischen Curtain Plate und Orifice: schützt Ionenoptik vor Kontamination
IS (IonSpray Voltage) Potential der Spray-Nadel: ionisiert Probe
6.5.1.3 Quantifizierung der Analyte mittels isotopenmarkierter interner
Standards
Die Quantifizierung der Analyte in der vorliegenden Arbeit erfolgte mit isotopenmarkierten
internen Standards (IS), bei denen ein oder mehrere Atome des Moleküls durch stabile
Isotope höherer Masse substituiert sind. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zeigen Analyt
und isotopenmarkierter interner Standard nahezu identische chemische und physikalische
Eigenschaften. Daher kann bei der Probenaufarbeitung, Chromatographie, Ionisierung und
Detektion angenommen werden, dass sich Analyt und interner Standard gleich verhalten.
Zur Ermittlung der Kalibrierfunktionen werden Verdünnungsreihen der Analyten hergestellt,
die stets die gleiche Menge internen Standard enthalten. Dabei werden die erhaltenen
Peakflächenverhältnisse des Analyten zum internen Standard gegen die entsprechenden
Stoffmengenverhältnisse aufgetragen, woraus die Geradengleichung der Kalibriergerade
resultiert.
6.5.1.4 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
Die Nachweisgrenze ist definiert als die kleinste Konzentration einer Verbindung, die mit
einem Analyseverfahren noch detektiert werden kann, wobei man von einem Signal/Rausch-
Verhältnis von 3:1 ausgeht [Hädrich und Vogelsang, 1996]. Die Bestimmungsgrenze ist
meist das Doppelte der Nachweisgrenze und legt den untersten Wert fest, der noch
reproduzierbar quantifiziert werden kann. Zur Ermittlung der Nachweis- und
Bestimmungsgrenzen wurden Verdünnungen der Analyte hergestellt und die Peakhöhe
gegen die Konzentration aufgetragen. Aus den Regressionsgeraden lassen sich durch
Einsetzen des jeweiligen Hintergrundrauschens die zugehörigen Nachweis- und
Bestimmungsgrenzen errechnen.
Methoden und Materialien
- 123 -
6.5.2 Bestimmung der Hämoglobinaddukte von Acrylamid und Glycidamid mittels HPLC-ESI-MS/MS
6.5.2.1 Massenspektrometrische Untersuchungen (MS/MS)
Die Messung der Acrylamid- und Glycidamid-Hb-Addukte wurde mittels des API 3200 HPLC-
MS/MS-Systems durchgeführt. Zur Überprüfung der Ionisierung und Fragmentierung von
AAVal- bzw. GAValPFPTH im Elektrospray wurden bei der Etablierung der HPLC-ESI-
MS/MS-Methode zunächst die Molekül- und Fragmentionen der AAVal- und GAValPFPTHs
identifiziert.
Dazu wurden mit Standardlösungen der Konzentration 10 µg/ml bei konstantem Flow
(Spritzenpumpe: 10 µl/min) Scans im Bereich von 150-420 m/z sowohl im negativen als auch
positiven Ionisationsmodus durchgeführt. Da die Molekül- und Fragmentionen im negativen
Ionisationsmodus deutlich höhere Intensitäten zeigten, wurden diese für die Etablierung der
HPLC-ESI-MS/MS-Methode herangezogen. In Abb. 6.5 und 6.6 sind die Molekül- bzw.
Produktionen von AAValPFPTH bzw. AAD7ValPFPTH, in Abbildung 6.7 und 6.8 von
GAValPFPTH bzw. GAD7ValPFPTH gezeigt.
[M-H]
[M-HF]
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[M-H]
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Abb. 6.5: Molekül- und Fragmentionen von AAValPFPTH
Methoden und Materialien
- 124 -
[M-H]
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Abb. 6.6: Molekül- und Fragmentionen von AAD7ValPFPTH
[M-H]
[M-HF]
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Abb. 6.7: Molekül- und Fragmentionen von GAValPFPTH
Methoden und Materialien
- 125 -
[M-H]
[M-HF]
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Abb. 6.8: Molekül- und Fragmentionen von GAD7ValPFPTH
Zur Optimierung der substanz- und quellenspezifischen Parameter wurden
Standardlösungen der Konzentration 250 ng/ml in Methanol verwendet. Aufgrund der relativ
hohen Intensitäten wurden die in Tab. 6.11 gezeigten Molekül (Q1)- und Fragment (Q3)-
Ionen sowie die dargestellten optimierten substanz- und quellenspezifischen Parameter der
Analyte bzw. internen Standards zur Etablierung der MRM-Methode herangezogen. Da
aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit von Analyt und internem Standard kaum Unterschiede
in den substanz- und quellenspezifischen Parametern vorhanden waren, wurden für den
internen Standard die optimierten Parameter des Analyten verwendet.
Methoden und Materialien
- 126 -
Tab. 6.11: Übersicht über die verwendeten m/z-Verhältnisse der Molekül- und Fragmentionen sowie die optimierten substanz- und quellenspezifischen Parameter
AAValPFPTH AAD7ValPFPTH GAValPFPTH GAD7ValPFPTH Q1 394,0 401,0 410,1 417,0 Q3 274,8 280,9 227,0 234,0
substanzspezifische Parameter [Volt] DP -45 -50 EP -4 -4,5 CE -36 -22
CXP -18 -4 CEP -22 -28
quellenspezifische Parameter CUR [psi] 20 CAD [psi] 3
IS [kV] -4500 TEM [°C] 450 GS 1 [psi] 25 GS 2 [psi] 30 Dwell time
[ms] 150
6.5.2.2 Chromatographie der PFPTHs
Durch die Verwendung einer Phenomenex Luna C18 (2) RP-Säule (150 x 2 mm; 3 μm)
konnten die Analyten AAValPFPTH und GAValPFPTH basisliniengetrennt werden. Die
Elution erfolgte mittels des in Tab. 6.12 gezeigten Gradienten bei einem Flow von 0,2 ml/min.
Um die Trennleistung der Säule zu erhalten und um Matrixeinflüsse auf die Analytsignale
von aufeinanderfolgenden Messungen zu verhindern, wurde ein Spülprogramm integriert.
Zum Schutz des Massenspektrometers vor Verunreinigungen wurde mit Hilfe des
integrierten Valco Valve der Eluent zwischen 10 und 14 min in die Ionenquelle überführt.
Tab. 6.12: Gradientenelution der PFPTHs von Acrylamid und Glycidamid, Fließmittel A: 0,1 % Ameisensäure; B: Acetonitril
Zeit [min] Fließmittel A [%] Fließmittel B [%] Initial 60 40
1 60 40 10 20 80 22 20 80 30 60 40
Methoden und Materialien
- 127 -
6.5.2.3 Hämoglobin-Derivatisierung und Festphasenextraktion (SPE)
Es wurden ca. 25 mg Hb (Isolierung von Hb s. Kap. 6.3) in Kunststoffvials (13 ml)
eingewogen und in 1,5 ml Formamid durch vortexen gelöst. Nach Zugabe von 20 μl NaOH
(1 M) und 10 μl PFPITC wurden die Proben für 90 min bei 45 °C im Schüttelwasserbad
derivatisiert. Zur internen Kalibrierung wurden anschließend 10 μl der Standardlösungen
(50 ng/ml-2 μg/ml) hinzugegeben. Die Ausfällung der Proteine erfolgte mit 400 μl gesättigter
NaCl-Lösung und 3 ml H2Obidest. Nach dem Vortexen wurden die Proben für 30 min bei
5000 rpm (3500 x g) und RT zentrifugiert und der erhaltene Überstand mittels SPE
aufgereinigt und aufkonzentriert.
Die Konditionierung der SPE-Säule erfolgte mit 2 ml MeOH, 2 ml H2Obidest und 1 ml eines
Formamid/Wasser-Gemisches (Verhältnis 50:50 v/v). Nach der Probenaufgabe wurde mit
1 ml H2Obidest und 1 ml eines MeOH/Wasser-Gemisches (Verhältnis 50:50 v/v) gewaschen.
Die Elution erfolgte mit 1,5 ml MeOH in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. Das benötigte Vakuum
zum Absaugen wurde mittels einer Wasserstrahlpumpe hergestellt. Anschließend erfolgte
die Aufkonzentrierung des Eluates im Stickstoffstrom auf circa 100 μl und die dabei
ausfallenden Proteine wurden durch Zentrifugieren bei 5000 rpm (3500 x g) für 30 min
abgetrennt. Die Lösung wurde mittels HPLC-MS/MS vermessen, wobei das
Injektionsvolumen in Abhängigkeit von dem verbleibenden Probevolumen bei 30-90 µl lag.
6.5.2.4 Linearität/Kalibriergerade PFPTHs
Zur Überprüfung der Linearität und Bestimmung der Kalibriergeraden wurden
Standardlösungen mit 5-1000 ng/ml AAValPFPTH bzw. GAValPFPTH vermessen, in denen
stets die gleiche Konzentration der internen Standards AAD7ValPFPTH und GAD7ValPFPTH
(100 ng/ml) enthalten war.
6.5.2.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurden von AAValPFPTH und
GAValPFPTH methanolische Lösungen der Konzentrationen 0,5-50 ng/ml hergestellt und
davon jeweils 10 μl mittels HPLC-MS/MS vermessen. Nach Auftragung der Peakhöhe gegen
die Konzentration ergaben sich die im Anhang gezeigten Regressionsgeraden.
Aus den Regressionsgeraden lassen sich durch Einsetzen des Hintergrundrauschens
(20 cps) die in Tab. 6.13 gezeigten Nachweis- und Bestimmungsgrenzen errechnen.
Methoden und Materialien
- 128 -
Tab. 6.13: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen AAValPFPTH bzw. GAValPFPTH (absolute Stoffmengen)
AAValPFPTH GAValPFPTH Nachweisgrenze [fmol] 12 30 Bestimmungsgrenze [fmol] 25 59
6.5.2.6 Wiederfindung und Identifizierung von Matrixeffekten
Zur Bestimmung der Wiederfindung der SPE-Methode und Identifizierung von Matrixeffekten
wurden als Referenzprobe zu je 190 μl MeOH jeweils 10 μl einer Standardlösung
(AAD7ValPFPTH + GAD7ValPFPTH, 5 μg/ml) gegeben (n = 3). Zur Identifizierung von
Matrixeffekten wurden ca. 25 mg Hb eingewogen und nach Zugabe von 1,5 ml Formamid,
20 μl NaOH (1 M) und 10 μl PFPITC im Schüttelwasserbad für 90 min bei 45 °C derivatisiert.
Nach dem Versetzen mit internem Standard (10 μl; 5 μg/ml) wurden 200 μl NaCl (gesättigt)
und 1,5 ml H2Obidest zugegeben, zentrifugiert (30 min; 5000 rpm (3500 x g)) und mittels SPE
(Kap. 6.5.2.3) aufgereinigt. Um die Wiederfindungsrate zu ermitteln wurden drei weitere
Proben mit der gleichen Menge IS versetzt wie die Referenzprobe und anschließend ohne
Zugabe von Hb und PFPITC analog der Proben zur Identifizierung von Matrixeffekten
aufgearbeitet. Nach dem Einengen der Proben unter N2 wurden diese auf ein Volumen von
200 μl eingestellt und mittels HPLC-MS/MS vermessen (Injektionsvolumen: 10 μl). Zur
Bestimmung der Wiederfindung und Identifizierung von Matrixeffekten wurden die
Peakflächen der internen Standards jeweils mit den Peakflächen der Referenzproben ins
Verhältnis gesetzt (Tab. 6.14).
Tab. 6.14: Wiederfindungsrate (WFR) der deuterierten PFPTHs nach SPE-Aufarbeitung von Standardlösungen und derivatisierten Proben, MW ± SD, n = 3
WFR (Standardlösung) WFR (Probe) AAD7ValPFPTH 81 ± 14 % 57 ± 5 % GAD7ValPFPTH 94 ± 13 % 22 ± 5 %
Methoden und Materialien
- 129 -
6.5.3 Bestimmung der Mercaptursäuren von Acrylamid und Glycidamid
6.5.3.1 Massenspektrometrische Untersuchungen (MS/MS)
Die Bestimmung der Mercaptursäuren von Acrylamid und Glycidamid wurde mit den
API 2000 und API 3200 HPLC-MS/MS-Systemen durchgeführt. Zur Identifizierung der
Molekül- und Fragmentionen wurden Scans im Bereich von 50-300 m/z mit
Standardlösungen der Konzentration 100-250 ng/ml bei einem Flow von 10 µl/min
(Spritzenpumpe) im negativen Ionisationsmodus durchgeführt. In Abbildung 6.9 und 6.10
sind die Molekül- bzw. Fragmentionen der Analyte AAMA bzw. GAMA und in Abbildung 6.11
und 6.12 der jeweiligen internen Standards D3-AAMA bzw. D3-GAMA gezeigt.
NH
OH
O
O S
S O
NH2
[M-H]
NH
OH
O
O S O
NH2
AAMA
)( )(
NH
OH
O
O
NH
OH
O
O S
NH
OH
O
O S
S O
NH2
[M-H][M-H][M-H]
NH
OH
O
O S O
NH2
AAMA
)( )(
NH
OH
O
O S O
NH2
AAMA
)( )(
NH
OH
O
O
NH
OH
O
O
Abb. 6.9: Molekül- und Fragmentionen der Acrylamid-Mercaptursäure (AAMA)
Methoden und Materialien
- 130 -
NH
OH
O
O S
NH
OH
O
O S
S O
NH2
OH
NH
OH
O
O S O
NH2
OH
GAMA
)( )(
NH
OH
O
O S O
NH2
OH
GAMA
)( )(
[M-H][M-H]
NH
OH
O
O
NH
OH
O
O
Abb. 6.10: Molekül- und Fragmentionen der Glycidamid-Mercaptursäure (GAMA)
[M-H]S O
NH2
D DD
NH
OH
O
O S
D
NH
OH
O
O S O
NH2
D D
)(
D3-AAMA
)(
NH
OH
O
O
[M-H][M-H]S O
NH2
D DD
NH
OH
O
O S
D
NH
OH
O
O S O
NH2
D D
)(
D3-AAMA
)(
D
NH
OH
O
O S O
NH2
D D
)(
D3-AAMA
)(
NH
OH
O
O
NH
OH
O
O
Abb. 6.11: Molekül- und Fragmentionen des internen Standards D3-AAMA
Methoden und Materialien
- 131 -
S O
NH2
D DDOH
NH
OH
O
O S
[M-H]
NH
OH
O
O
NH
OH
O
O S O
NH2
OHD DD
)( )(
D3-GAMA
)(
S O
NH2
D DDOH
NH
OH
O
O S
NH
OH
O
O S
[M-H][M-H]
NH
OH
O
O
NH
OH
O
O
NH
OH
O
O S O
NH2
OHD DD
)( )(
D3-GAMA
)(NH
OH
O
O S O
NH2
OHD DD
)( )(
D3-GAMA
)(
Abb. 6.12: Molekül- und Fragmentionen des internen Standards D3-GAMA
Zur Optimierung der substanz- und quellenspezifischen Parameter wurden
Standardlösungen der Konzentration 250 ng/ml Methanol verwendet (Spritzenpumpen-Flow:
10 µl/min), wobei die Optimierung des API 2000 HPLC-MS/MS-Systems mittels des Manual
Tuning Tools der Analyst 1.4.1 Software manuell durchgeführt wurde. Aufgrund der relativ
hohen Intensitäten wurden die in Tab. 6.15 und 6.16 gezeigten Molekül (Q1)- und Fragment
(Q3)-Ionen sowie die dargestellten optimierten substanz- und quellenspezifischen Parameter
der Analyte bzw. internen Standards zur Etablierung der MRM-Methode bei den HPLC-
MS/MS-Systemen API 2000 bzw. API 3200 herangezogen. Generell wurden aufgrund der
strukturellen Ähnlichkeit der beiden Analyte und entsprechenden internen Standards keine
wesentlichen Unterschiede in den substanz- und quellenspezifischen Parametern
festgestellt. Deshalb erfolgte die Etablierung der API 2000 Methode für sämtliche Analyte
und internen Standards mit identischen substanz- und quellenspezifischen Parametern.
Methoden und Materialien
- 132 -
Tab. 6.15: Übersicht über die verwendeten m/z-Verhältnisse der Molekül- und Fragmentionen der Analyte bzw. internen Standards sowie die optimierten substanz- und quellenspezifischen Parameter des API 2000 HPLC-MS/MS-Systems
AAMA D3-AAMA GAMA D3-GAMA Q1 233,0 235,9 249,0 251,9 Q3 103,9 106,8 119,9 122,9
substanzspezifische Parameter [Volt] DP -30 EP -5 CE -15 FP -400
quellenspezifische Parameter CUR [psi] 30 CAD [psi] 5
IS [kV] -3500 TEM [°C] 475 GS 1 [psi] 30 GS 2 [psi] 45
Dwell time [ms] 75 Tab. 6.16: Übersicht über die verwendeten m/z-Verhältnisse der Molekül- und Fragmentionen der Analyte bzw. internen Standards sowie die optimierten substanz- und quellenspezifischen Parameter des API 3200 HPLC-MS/MS-Systems
AAMA D3-AAMA GAMA D3-GAMA
Q1 233,0 235,9 249,0 251,9 Q3 103,9 106,8 119,9 122,9
substanzspezifische Parameter [Volt] DP -25 -30 EP -5 -4,5 CE -22 -22
CXP -1 -1 CEP -14 -16
quellenspezifische Parameter CUR [psi] 10 CAD [psi] 5
IS [kV] -4500 TEM [°C] 450 GS 1 [psi] 30 GS 2 [psi] 30
Dwell time [ms] 75
Methoden und Materialien
- 133 -
6.5.3.2 Chromatographie der Mercaptursäuren
Die chromatographische Trennung der Mercaptursäuren wurde in Anlehnung an Boettcher et
al. (2005a) auf einer Phenomenex Luna C8 (2) RP-Säule (150 x 4,6 mm; 3 μm) durchgeführt.
Die Elution erfolgte unter isokratischen Bedingungen bei einem Flow von 0,3 ml/min. Da die
Urinproben nach der SPE-Aufreinigung immer noch eine hohe Matrixbelastung aufwiesen,
wurde zur Verhinderung von Matrixeinflüssen auf die Analytsignale von
aufeinanderfolgenden Messungen ein Spülgradient integriert. Zum Schutz des
Massenspektrometers vor Verunreinigungen wurde der Eluent mit Hilfe des integrierten
Valco Valve zwischen 4 und 17 min in die Ionenquelle überführt. Die injizierten
Probenvolumina lagen bei 30-50 µl.
Tab. 6.17: Isokratische Elution der Mercaptursäuren von Acrylamid und Glycidamid und Spülgradient, Fließmittel A: 0,1 % Ameisensäure mit 5 % (v/v) Acetonitril; Fließmittel B: Acetonitril
Zeit [min] Flussrate [ml/min] Fließmittel A [%] Fließmittel B [%] Initial 0,3 100 0
1 0,3 100 0 17 0,3 100 0 18 0,6 100 0 22 0,6 10 90 35 0,6 10 90 40 0,6 100 0 45 0,3 100 0
6.5.3.3 Aufreinigung und Aufkonzentrierung der Mercaptursäuren
mittels Festphasenextraktion
Die Isolierung der Mercaptursäuren erfolgte in Anlehnung an Boettcher et al. (2005a). Die
aufgetauten Urinproben (Lagerung bei -30 °C) wurden gevortext und zentrifugiert (5000 rpm,
3500 x g; 20 min; RT). Anschließend erfolgte die Bestimmung der Urinvolumina der
Versuchstiere mittels einer Messpipette und Urin-Aliquots von 0,1-4 ml wurden mit
Ammoniumformiatpuffer (50 mM; pH 2,5) auf ein Endvolumen von 8 ml verdünnt. Nach dem
Hinzufügen der internen Standards D3-AAMA und D3-GAMA (jeweils 40 µl; 10-100 µg/ml)
wurde mit 4 N HCl ein pH-Wert von 2,5 (pH-Meter) eingestellt. Danach wurde die gesamte
Probelösung auf eine mit 4 ml Methanol, 2 ml H2Obidest und 2 ml HCl (pH 2,5) konditionierte
SPE-Säule (Isolute ENV+; 100 mg; 10 ml) gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 2 ml
HCl (pH 2,5) und 1 ml HCl (pH 2,5) mit 10 % Methanol (v/v) erfolgte die Trocknung des
Säulenmaterials an der Wasserstrahlpumpe. Anschließend wurde mit 1,85 ml Methanol (1 %
Ameisensäure; v/v) eluiert und die in der SPE-Säule verbleibenden Reste des Elutionsmittels
Methoden und Materialien
- 134 -
mittels Wasserstrahlpumpe in 1,5 ml Reaktionsgefäße überführt. Die methanolischen
Lösungen wurden anschließend im Stickstoffstrom bis zur Trockene eingedampft und in 500-
1000 µl Ameisensäure (0,1 % v/v) aufgenommen. Nach der Zentrifugation (13000 rpm;
9500 x g; 20 min; RT) wurde der Überstand zur Vermessung mittels HPLC-MS/MS in 1,5 ml
Braunglas-Vials überführt.
6.5.3.4 Linearität/Kalibriergeraden
Zur Überprüfung der Linearität und Bestimmung der Kalibriergeraden wurden methanolische
Standardlösungen mit 2,5-8000 ng/ml AAMA bzw. GAMA bei einem Injektionsvolumen von
10 µl vermessen, in denen stets die gleiche Konzentration der internen Standards D3-AAMA
und D3-GAMA (jeweils 3 µg/ml) enthalten war.
6.5.3.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen API 3200
Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenze wurden von AAMA und GAMA
methanolische Lösungen der Konzentrationen 2,5-100 ng/ml hergestellt und davon jeweils
10 μl mittels HPLC-MS/MS vermessen. Nach Auftragung der Peakhöhe gegen die
Konzentration ergaben sich die im Anhang gezeigten Regressionsgeraden.
Aus den Regressionsgeraden lassen sich durch Einsetzen des Hintergrundrauschens
(25 cps) die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen errechnen.
Tab. 6.18: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen AAMA bzw. GAMA (API 3200; absolute Stoffmengen)
AAMA GAMA Nachweisgrenze [fmol] 86 112 Bestimmungsgrenze [fmol] 172 224
6.5.3.6 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen API 2000
Die Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenze erfolgte analog Kap. 6.5.3.5, wobei
von AAMA und GAMA methanolische Lösungen der Konzentrationen 12,5-250 ng/ml bei
einem Injektionsvolumen von 50 µl und einem Hintergrundrauschen von 30 cps vermessen
wurden.
Methoden und Materialien
- 135 -
Tab. 6.19: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen AAMA bzw. GAMA (API 2000, absolute Stoffmengen)
AAMA GAMA Nachweisgrenze [pmol] 4 6 Bestimmungsgrenze [pmol] 8 12
6.5.3.7 Wiederfindung der SPE-Methode
Zur Bestimmung der Wiederfindung der SPE-Methode wurden Referenzstandards der
Konzentration 100 µg/ml D3-AAMA bzw. 12,9 µg/ml D3-GAMA vermessen (n = 3).
Äquivalente Stoffmengen der Standardsubstanzen wurden auf ein Endvolumen von 4 ml mit
H2Obidest verdünnt und wie unter Kap. 6.5.3.3 beschrieben mittels SPE aufkonzentriert.
Die Wiederfindung resultiert aus dem Verhältnis der Peakflächen nach SPE-Aufreinigung
und den Peakflächen der Referenzproben. Für AAMA bzw. GAMA wurden Wiederfindungen
von 97 ± 15 % bzw. 49 ± 10 % ermittelt.
6.5.3.8 Lauf-zu-Lauf- und Tag-zu-Tag-Variabilität
Zur Bestimmung der Lauf-zu-Lauf-Variabilität wurden die Mercaptursäuren in
unterschiedlichen Urinproben (n = 3) in aufeinanderfolgenden Messungen (n = 4)
quantifiziert. Zur Bestimmung der Tag-zu-Tag-Variabilität erfolgte die Bestimmung der
Mercaptursäuren in unterschiedlichen Urinproben (n = 3) an zwei aufeinanderfolgenden
Tagen.
Tab. 6.20: Lauf-zu-Lauf- und Tag-zu-Tag-Variabilität der AAMA- und GAMA-Bestimmung
Variabilität AAMA [%] GAMA [%] Lauf-zu-Lauf 2,1 ± 0,4 3,5 ± 0,6 Tag-zu-Tag 0,4 ± 0,2 1,3 ± 0,3
Methoden und Materialien
- 136 -
6.5.4 Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid
6.5.4.1 Massenspektrometrische Untersuchungen (MS/MS)
Die Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid wurde mittels des API 3200 HPLC-MS/MS-
Systems durchgeführt. Zur Identifizierung der Molekül- und Fragmentionen wurden
Produktionen-Scans im Bereich von 40-100 m/z mit Standardlösungen der Konzentration
250 ng/ml bei einem Flow von 10 µl/min (Spritzenpumpe) im positiven Ionisationsmodus
durchgeführt. In Abbildung 6.13 und 6.14 sind die Molekül- bzw. Produktionen des Analyten
Acrylamid und internen Standards D5-Acrylamid, in Abbildung 6.15 und 6.16 von Glycidamid
bzw. 13C3-Glycidamid gezeigt.
[M-H]
[M+H] +
O+
NH2
O
)(
Acrylamid
[M-H][M-H]
[M+H] +[M+H] +
O+
O+
NH2
O
)(
Acrylamid
Abb. 6.13: Molekül- und Fragmentionen von Acrylamid
Methoden und Materialien
- 137 -
+ HNH2
O
D
D
D
+
O
D
D
D
+
N
O
D
D
D
D
D H
H
)(
D5-Acrylamid
+ HNH2
O
D
D
D
+
+ HNH2
O
D
D
D
+
O
D
D
D
+
N
O
D
D
D
D
D H
H
)(N
O
D
D
D
D
D H
H
)(
D5-Acrylamid
Abb. 6.14: Molekül- und Fragmentionen des internen Standards D5-Acrylamid
+
O
+
NH2
O +O
O
)(NH2
O
O
)(
[M+H] +
Glycidamid
+
O
+
NH2
O +O
O
+O
O
)(NH2
O
O
)( )(NH2
O
O
)(
[M+H] +[M+H] +
Glycidamid
Abb. 6.15: Molekül- und Fragmentionen von Glycidamid
Methoden und Materialien
- 138 -
[M+H] +
+
O
**
+
NH2
O
*
+O
O
***
NH2
O
O
** *)( )(
13C3-Glycidamid
[M+H] +[M+H] +
+
O
**
+
NH2
O
*
+O
O
***
++O
O
***
NH2
O
O
** *)( )(
13C3-Glycidamid
Abb. 6.16: Molekül- und Fragmentionen des internen Standards 13C3-Glycidamid
Beim internen Standard D5-Acrylamid führt der Lösungs- bzw. Ionisationsprozess
offensichtlich an der Aminogruppe zu einem Austausch der Deuterium-Atome gegen
Wasserstoff-Atome. Das Massenspektrum von D5-Acrylamid zeigt daher anstelle der
erwarteten m/z 77 lediglich Molekülionen mit m/z 75. Zur Optimierung der substanz- und
quellenspezifischen Parameter wurden Standardlösungen der Konzentration 250 ng/ml
Methanol verwendet (Spritzenpumpen-Flow: 10 µl/min). Tab. 6.21 zeigt die Molekül (Q1)-
und Fragment (Q3)-Ionen sowie die optimierten substanz- und quellenspezifischen
Parameter der Analyte bzw. internen Standards, welche zur Etablierung der ESI+-MRM-
Methode herangezogen wurden.
Methoden und Materialien
- 139 -
Tab. 6.21: Übersicht über die verwendeten m/z der Molekül- und Fragmentionen der Analyte bzw. internen Standards sowie die optimierten substanz- und quellenspezifischen Parameter zur massenspektrometrischen Bestimmung von Acrylamid und Glycidamid
Acrylamid D5-Acrylamid Glycidamid 13C3-Glycidamid Q1 72,1 75,1 88,1 91,1 Q3 55,1 58,1 71,0 74,0
substanzspezifische Parameter [Volt] DP +31 +21 EP +5,5 +6 CE +15 +11
CXP +4 +4 CEP +14 +10
quellenspezifische Parameter CUR [psi] 10 CAD [psi] 5
IS [kV] +5500 TEM [°C] 450 GS 1 [psi] 20 GS 2 [psi] 40
Dwell time [ms] 100
6.5.4.2 Chromatographie von Acrylamid und Glycidamid
Die chromatographische Trennung von Acrylamid und Glycidamid wurde auf einer
Phenomenex Luna C8 (2) RP-Säule (150 x 4,6 mm; 3 μm) durchgeführt. Die Elution erfolgte
mittels des in Tab. 6.22 gezeigten Gradienten. Die Retentionszeiten lagen bei 12 min für
Acrylamid und 9 min für Glycidamid. Um Matrixeinflüsse auf die Analytsignale von
aufeinanderfolgenden Messungen zu vermeiden, wurde ein Spülgradient integriert. Zum
Schutz des Massenspektrometers vor Verunreinigungen wurde mit Hilfe des integrierten
Valco Valve der Eluent zwischen 6 und 17 min in die Ionenquelle überführt. Die injizierten
Probenvolumina lagen bei 30-90 µl.
Tab. 6.22: Gradientenelution von Acrylamid und Glycidamid und Spülgradient, Fließmittel A: 0,05 % Ameisensäure, Fließmittel B: Methanol
Zeit [min] Flussrate [ml/min] Fließmittel A [%] Fließmittel B [%] Initial 0,3 99 1
1 0,3 99 1 15 0,3 80 20 25 0,6 10 90 35 0,6 10 90 40 0,6 99 1 45 0,3 99 1
Methoden und Materialien
- 140 -
6.5.4.3 Isolierung von Acrylamid und Glycidamid aus Rattenurin
Aliquots der Urinproben (1-3 ml) wurden mit den internen Standards versetzt (absolut: 200-
1000 ng D5-Acrylamid; 280-560 ng 13C3-Glycidamid), gevortext und zentrifugiert (3000 x g;
15 min; RT). Danach wurde die Urinprobe auf eine mit 4 ml Methanol und 2 x 4 ml H2Obidest
konditionierte SPE-Säule (Isolute ENV+; 500 mg; 6 ml) gegeben. Nach dem Waschen der
Säule mit 2 x 2 ml H2Obidest erfolgte die Elution mit 2 ml 60 %-iger Methanol-Lösung (v/v). Die
in der SPE-Säule verbleibenden Reste des Elutionsmittels wurden mittels
Wasserstrahlpumpe in die Elutionsgefäße (15 ml Kunststoff-Falcons) überführt. Die Eluate
wurden anschließend im Stickstoffstrom bis zu einem Volumen von 500-1000 µl eingeengt
und in Eppendorf-Reaktionsgefäße pipettiert. Nach der Zentrifugation (13000 rpm; 9500 x g;
20 min; RT) wurde der Überstand zur Vermessung mittels HPLC-MS/MS in 1,5 ml
Braunglas-Vials überführt (Injektionsvolumen: 30-50 µl).
6.5.4.4 Wiederfindung von Acrylamid und Glycidamid
Die Wiederfindungsraten der verwendeten SPE-Methode zur Bestimmung von Acrylamid
und Glycidamid in Urin wurden im Rahmen der Diplomarbeit von Natalie Gerhardt ermittelt
[Gerhardt, 2008]. Sie betrugen 84 ± 11 % für Acrylamid und 73 ± 2 % für Glycidamid.
6.5.4.5 Isolierung von Acrylamid und Glycidamid aus Rattenserum
Die Blutentnahme (ca. 0,5 ml) erfolgte durch retrobulbäre Punktion in 1,5 ml Eppendorf-
Reaktionsgefäße. Anschließend wurden die Blutproben zur vollständigen Blutgerinnung für
30 min auf Eis gelagert und danach zentrifugiert (13000 rpm; 9500 x g; 15 min; RT). Die
erhaltenen Serumproben (Überstand) wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 °C im
Biofreezer gelagert.
Aus den aufgetauten und gevortexten Serumproben wurden 100-200 µl Aliquots
entnommen, zentrifugiert (13000 rpm; 9500 x g, 15 min; RT) und mit internen Standards
versetzt (absolut: 0,13-0,26 nmol D5-Acrylamid; 0,16-0,31 nmol 13C3-Glycidamid). Nachdem
die Proben auf ein Endvolumen von 400 µl mit H2Obidest verdünnt und homogenisiert waren,
wurde die Lösung auf eine mit 4 ml Methanol und 2 x 2 ml H2Obidest konditionierte SPE-Säule
(Isolute ENV+; 100 mg; 10 ml) gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 0,4 ml H2Obidest
und 0,4 ml 2 %-iger Methanol-Lösung (v/v) wurde mit 1 ml 10 %-iger Acetonitril-Lösung (v/v)
eluiert und die in der SPE-Säule verbleibenden Reste des Elutionsmittels mittels
Wasserstrahlpumpe in die Elutionsgefäße (Eppendorf-Reaktionsgefäße) überführt. Die
Lösungen wurden anschließend im Stickstoffstrom bis zu einem Volumen von 100 µl
eingeengt und bei einem Injektionsvolumen von 90 µl mittels HPLC-MS/MS vermessen.
Methoden und Materialien
- 141 -
6.5.4.6 Wiederfindung von Acrylamid und Glycidamid in Serumproben
Als Referenzproben wurden zu je 95 μl H2Obidest jeweils 5 μl einer Standardlösung (1 µg/ml
D5-Acrylamid; 1,4 µg/ml 13C3-Glycidamid) gegeben (n = 3). Um die Wiederfindungsrate der
SPE-Methode zu ermitteln wurden 200 µl H2Obidest mit der gleichen Menge internen Standard
wie die Referenzproben versetzt und anschließend wie unter Kap. 6.5.4.5 beschrieben
aufgearbeitet. Zur Identifizierung von Matrixeffekten bzw. Bestimmung der Wiederfindung der
Analyten in Rattenserum wurden 200 µl Rattenserum mit den gleichen Mengen internen
Standards wie die Referenzproben versetzt und ebenfalls wie unter Kap. 6.5.4.5 beschrieben
aufgearbeitet. Nach dem Einengen der Proben unter N2 wurden diese auf ein Volumen von
100 μl eingestellt und mittels HPLC-MS/MS vermessen (Injektionsvolumen: 90 μl). Durch
Vergleich der Peakflächen der internen Standards der aufgearbeiteten Proben bzw. der
Referenzproben wurden die Wiederfindungsraten ermittelt.
Tab. 6.23: Wiederfindungsrate (WFR) von Acrylamid und Glycidamid nach SPE-Aufarbeitung von Standardlösungen und Serumproben, MW ± SD, n = 3
WFR (Standardlösung) WFR (Serum) D5-Acrylamid 30 ± 1 % 27 ± 3 % 13C3-Glycidamid 61 ± 3 % 43 ± 6 %
6.5.4.7 Nachweisgrenze von Glycidamid in Rattenserum
Zur Bestimmung der Nachweisgrenze von Glycidamid in Rattenserum wurden Serum-
Aliquots (200 µl; n=3) mit 0,54-0,72 ng 13C3-Glycidamid (entspricht 0,03-0,04 µM) versetzt
und wie unter Kap. 6.5.4.5 beschrieben aufgearbeitet und vermessen. Dabei zeigte sich,
dass aus einer Konzentration von 0,035 µM eine Peakhöhe im Bereich der Nachweisgrenze
(3-faches Grundrauschen; 150 cps) resultiert.
6.5.4.8 Bestimmung von Acrylamid in der Standarddiät und im
Lebkuchen
Zur Bestimmung von freiem Acrylamid in der Standarddiät und in Lebkuchen wurden 1-15 g
des Probenmaterials in ein 50 ml Becherglas eingewogen und auf ein Endvolumen von 30 ml
mit H2Obidest aufgefüllt. Nach Zugabe des internen Standards (1 µg D5-Acrylamid absolut)
wurde für 1 Stunde auf dem Magnetrührer bei Raumtemperatur extrahiert. Nach
Zentrifugation (3000 x g; 30 min; RT) wurden 10 ml Aliquots der Überstände wie unter Kap.
6.5.4.3 beschrieben aufgearbeitet und mittels HPLC-MS/MS vermessen.
Methoden und Materialien
- 142 -
6.5.4.9 Linearität/ Kalibriergeraden
Zur Überprüfung der Linearität und Bestimmung der Kalibriergeraden wurden methanolische
Standardlösungen mit 50-1000 ng/ml Acrylamid bzw. 200-7500 ng/ml Glycidamid bei einem
Injektionsvolumen von 10 µl vermessen, in denen stets die gleiche Konzentration der
internen Standards (200 ng/ml D5-Acrylamid; 280 ng/ml 13C3-Glycidamid) enthalten war.
6.5.4.10 Nachweis- und Bestimmungsgrenze
Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenze wurden methanolische Lösungen der
Konzentrationen 5-90 ng/ml Acrylamid bzw. 7-126 ng/ml Glycidamid hergestellt und davon
jeweils 10 μl mittels HPLC-MS/MS vermessen. Nach Auftragung der Peakhöhe gegen die
Konzentration ergaben sich die im Anhang gezeigten Regressionsgeraden.
Für die Berechnung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurde ein
Hintergrundrauschen von 50 cps angenommen.
Tab. 6.24: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für Acrylamid und Glycidamid (absolute Angaben)
Acrylamid Glycidamid Nachweisgrenze [pmol] 0,7 4 Bestimmungsgrenze [pmol] 1,3 8
Methoden und Materialien
- 143 -
6.5.5 Bestimmung von HPMA (Hydroxypropyl-Mercaptursäure)
6.5.5.1 Massenspektrometrische Untersuchungen (MS/MS)
Die Bestimmung von HPMA erfolgte mittels des API 2000 MS/MS-Systems. Die Abbildungen
6.17 und 6.18 zeigen die Molekül- bzw. Fragmentionen des Analyten HPMA bzw. des
internen Standards D3-HPMA. Zur Identifizierung der Molekül- und Fragmentionen wurden
Produktionen-Scans im Bereich von 50-230 m/z mit Standardlösungen der Konzentration
10 µg/ml bei einem Flow von 10 µl/min (Spritzenpumpe) im negativen Ionisationsmodus
durchgeführt.
S
OH
[M-H]
NH
OH
O
O S
OH
)(
HPMA
NH
OH
O
O
NH
O
)(
S
OH
S
OH
[M-H][M-H]
NH
OH
O
O S
OH
)(
HPMA
NH
OH
O
O
NH
OH
O
O
NH
OH
O
O
NH
O
NH
O
)(
Abb. 6.17: Molekül- und Fragmentionen von HPMA
Methoden und Materialien
- 144 -
S
OH
[M-H]
NH
OH
O
O S
OHD
DD
)(
D3-HPMA
NH
O
D
DD
NH
OH
O
O
D
DD
)(
S
OH
S
OH
[M-H][M-H]
NH
OH
O
O S
OHD
DD
)(
D3-HPMA
NH
O
D
DD
NH
O
D
DD
NH
OH
O
O
D
DD
NH
OH
O
O
D
DD
)(
Abb. 6.18: Molekül- und Fragmentionen des internen Standards D3-HPMA
Die Massenspektren zeigen, dass sowohl der interne Standard als auch der Analyt das
Produktion mit m/z-Verhältnis 91 mit hoher Intensität bilden. Da dieses Fragment zur
Etablierung der ESI--MRM-Methode verwendet werden sollte, musste eine gegenseitige
Beeinflussung des Analyten bzw. internen Standards ausgeschlossen werden. Zur
Überprüfung wurden methanolische Lösungen des Analyten oder internen Standards bis zu
einer Konzentration von 10 µg/ml in das HPLC-MS/MS-System injiziert (Injektionsvolumen:
10 µl).
Methoden und Materialien
- 145 -
D3-3-HPMAD3-3-HPMA
Abb. 6.19: Ionenspuren des Analyten (m/z 220,1→91,0; oben) bzw. internen Standards (m/z 223,0→91,0; unten); 1 µg/ml D3-HPMA; Injektionsvolumen: 10 µl
Wie Abb. 6.19 verdeutlicht, kommt es im untersuchten Konzentrationsbereich zu keiner
gegenseitigen Beeinflussung der beiden verwendeten Ionenspuren. Zum Zeitpunkt der
Elution des internen Standards zeigt die Ionenspur des Analyten lediglich das
Hintergrundsignal. Beim Vermessen einer entsprechenden Analytlösung wurde eine
Beeinflussung der Ionenspur des internen Standards ebenfalls nicht beobachtet.
Zur Optimierung der substanz- und quellenspezifischen Parameter wurden
Standardlösungen der Konzentration 250 ng/ml Methanol verwendet (Spritzenpumpen-Flow:
10 µl/min). Zur Etablierung der MRM-Methode wurden die in Tab. 6.25 gezeigten Molekül
(Q1)- und Fragment (Q3)-Ionen sowie optimierten substanz- und quellenspezifischen
Parameter des Analyten bzw. internen Standards herangezogen. Aufgrund der strukturellen
Ähnlichkeit von Analyt und internem Standard wurde mit identischen substanz- und
quellenspezifischen Parametern gearbeitet.
Methoden und Materialien
- 146 -
Tab. 6.25: Übersicht über die verwendeten m/z-Verhältnisse der Molekül- und Fragmentionen des Analyten bzw. internen Standards sowie die optimierten substanz- und quellenspezifischen Parameter des API 2000 HPLC-MS/MS-Systems
HPMA D3-HPMA Q1 220,1 223,0 Q3 91,0 91,0
substanzspezifische Parameter [Volt] DP -21 EP -9,5 CE -16 FP -330
quellenspezifische Parameter CUR [psi] 55 CAD [psi] 2
IS [kV] -3500 TEM [°C] 350 GS 1 [psi] 30 GS 2 [psi] 10
Dwell time [ms] 75
6.5.5.2 Chromatographische Bedingungen
Die chromatographische Trennung von HPMA wurde auf einer Phenomenex Luna C8 (2)
RP-Säule (150 x 4,6 mm; 3 μm) durchgeführt. Die Elution erfolgte mittels des in Tab. 6.26
gezeigten Gradienten. Die Retentionszeit lag bei 12-13 min. Um Matrixeinflüsse auf die
Analytsignale von aufeinanderfolgenden Messungen zu vermeiden, wurde ein Spülgradient
integriert. Zum Schutz des Massenspektrometers vor Verunreinigungen wurde mit Hilfe des
integrierten Valco Valve der Eluent zwischen 8 und 16,9 min in die Ionenquelle überführt. Für
die Messungen wurden jeweils 10 µl Probelösung injiziert.
Tab. 6.26: Gradientenelution von HPMA und Spülgradient, Fließmittel A: 0,1 % Ameisensäure mit 5 % Acetonitril (v/v), Fließmittel B: Acetonitril
Zeit [min] Flussrate [ml/min] Fließmittel A [%] Fließmittel B [%] Initial 0,3 100 0
1 0,3 100 0 20 0,3 20 80 21 0,6 20 80 30 0,6 20 80 35 0,6 100 0 40 0,3 100 0
Methoden und Materialien
- 147 -
6.5.5.3 Isolierung von HPMA aus Urin
Die Aufarbeitung von Human- und Rattenurin erfolgte analog der Isolierung von Acrylamid-
und Glycidamid-Mercaptursäuren (Kap. 6.5.3.3). Für die Festphasenextraktion wurden 0,5-
4 ml Urin und 12,9 nmol D3-HPMA (absolute Stoffmenge) als interner Standard verwendet.
6.5.5.4 Linearität/ Kalibriergerade
Zur Überprüfung der Linearität und Bestimmung der Kalibriergerade wurden methanolische
Standardlösungen mit 2,5 ng-10 µg/ml HPMA bei einem Injektionsvolumen von 10 µl
vermessen, in denen stets die gleiche Konzentration des internen Standards (2,9 µg/ml D3-
HPMA) enthalten war.
6.5.5.5 Nachweis- und Bestimmungsgrenze HPMA
Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenze wurden methanolische Lösungen der
Konzentrationen 2,5-500 ng/ml HPMA hergestellt und davon jeweils 10 μl mittels HPLC-
MS/MS vermessen. Nach Auftragung der Peakhöhe gegen die Konzentration ergaben sich
die im Anhang gezeigten Regressionsgeraden.
Für die Berechnung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurde ein
Hintergrundrauschen von 50 cps angenommen. Daraus resultierte eine Nachweisgrenze von
0,5 pmol und eine Bestimmungsgrenze von 0,9 pmol (Angaben als absolute Stoffmengen).
6.5.5.6 Wiederfindung der Festphasenextraktion sowie Tag-zu-Tag-
und Lauf-zu-Lauf-Variabilität
Zur Bestimmung der Wiederfindung der SPE-Methode wurden Referenzstandards der
Konzentration 1 µg/ml D3-HPMA vermessen (Injektionsvolumen: 10 µl; n = 3). Äquivalente
Stoffmengen der Standardsubstanzen wurden auf ein Volumen von 4 ml mit H2Obidest
verdünnt und wie unter Kap. 6.5.3.3 beschrieben mittels SPE aufkonzentriert. Das
eingeengte Eluat wurde auf ein Endvolumen von 1 ml mit 0,1 %-iger Ameisensäure
eingestellt und ebenfalls vermessen. Die Wiederfindungsrate resultierte aus dem Verhältnis
der Peakflächen nach SPE-Aufreinigung zu den Peakflächen der Referenzproben und lag
bei 67 ± 4 %.
Zur Bestimmung der Lauf-zu-Lauf-Variabilität wurde HPMA in einer Urinprobe in
aufeinanderfolgenden Messungen (n = 3) quantifiziert. Zur Bestimmung der Tag-zu-Tag-
Variabilität wurde HPMA in einer Urinprobe an zwei aufeinanderfolgenden Tagen bestimmt.
Sowohl die Lauf-zu-Lauf- als auch Tag-zu-Tag-Variabilitäten lagen unter 5 % des
Messwertes.
Methoden und Materialien
- 148 -
6.6 Geräte
API 2000 HPLC-MS/MS HPLC: 2x Series 200 Micro Pump Series 200 Autosampler (Perkin Elmer) MS/MS: API 2000 mit ESI-Ionen- quelle (Applied Biosystems)
API 3200 HPLC-MS/MS HPLC: Jasco 2008 (Jasco) MS/MS: API 3200 mit ESI-Ionen- quelle (Applied Biosystems)
Eppi-Tischzentrifuge 5415 (Eppendorf)
Feinwaage CP224S (Sartorius)
Gefrierschrank (-20 °C) Comfort*** (Liebherr)
GC-MS GC: 6890; MS: 5973inert mit Software Chem Station (Agilent)
GC-Säule DB-XLB, 30 m x 0,25 mm ID, 0,25 μm Filmdicke (J&W Scientific)
Grobwaage Sartorius Typ 1404
Magnetrührer mit Heizplatte MR3301K (Heidolph)
pH-Meter pH 522 (WTW)
Pipetten Eppendorf Research P2,5-P5000
Schüttelapparatur Typ 3015 (GFL)
Stoffwechselkäfig Tecniplast, Buguggiate Vortex-Gerät (Heidolph)
Vakuumkammer Macherey und Nagel
Wasserbad Köttermann
Zentrifugen Megafuge 1.0R (Heraeus)
Centrifuge 5804 R (Eppendorf)
Methoden und Materialien
- 149 -
6.7 Chemikalien
AAMA synthetisiert von S. Foth, AK Eisenbrand AAValPFPTH, AAD7ValPFPTH synthetisiert von D. Bertow, AK Eisenbrand Acrylamid (p.a.) Merck
Aceton (Spektroskopie) Merck
Acetonitril (Gradient Grade) J.T. Baker
Ammoniumformiat Sigma
Ameisensäure Merck
D3-AAMA synthetisiert von S. Foth, AK Eisenbrand
D5-Acrylamid CDN Isotopes
D3-GAMA synthetisiert von M. Redecker, AK Eisenbrand
D3-HPMA Toronto Research Chemicals Inc. Diethylether (p.a.) Riedel de Haen
Ethylacetat (p.a.) J.T. Baker
Formamid (p.a.) Merck
GAMA synthetisiert von S. Foth, AK Eisenbrand
GAValPFPTH, GAD7ValPFPTH synthetisiert von D. Bertow, AK Eisenbrand Glycidamid Toronto Research Chemicals Inc.
Helium 5.0 Air Liquide
HCl (37 %) J.T. Baker 13C3-Glycidamid Toronto Research Chemicals Inc.
HPMA Toronto Research Chemicals Inc.
iso-Propanol (p.a.) Merck
Isofluran Baxter
Methanol (Gradient Grade) J.T. Baker
Na2CO3 (p.a.) Riedel de Haen
NaCl (p.a.) Merck
NaOH (p.a) Merck
n-Hexan (p.a.) J.T. Baker
Pentafluorphenylisothiocyanat (PFPITC) Fluka
PPG-Kalibrierlösung Applied Biosystems
PPG 3000-Kalibrierlösung Applied Biosystems
Methoden und Materialien
- 150 -
Schwefelsäure (p.a.) J.T. Baker
Stickstoff (technisch) Air Liquide Deutschland GmbH
Toluol (für die Spektroskopie) Merck
Methoden und Materialien
- 151 -
6.8 Verbrauchsmaterialien
Braunglas-Vials (1,5 ml; PTFE-Verschluss) Abi Med
Isolute ENV+ SPE-Kartuschen Separtis (100 mg/6 ml; 500 mg/10 ml)
Kanülen zur Blutabnahme (Multifly®-Set) Sarstedt
Kunststoff-Schraubgefäße (15, 50 ml) Greiner bio-one GmbH
Kunststoff-Schraubgefäße (13 ml) Sarstedt
Mikro-Glaseinsatz (300 µl) Abi Med
Monovetten (mit EDTA) Sarstedt
Pipettenspitzen Greiner Bio-One GmbH
Strata C18e SPE-Kartuschen Phenomenex (55 µm, 200 mg/3 ml)
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- 152 -
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Anhang
- 164 -
0 10 20 30 40 500
1000
2000
3000
4000
5000
6000
y = 122,3437 xR = 0,999
AAValPFPTH Lineare Regression
Konzentration [ng/ml]
Peak
höhe
[cps
]
0 10 20 30 40 500
500
1000
1500
2000
2500
3000
y = 49,1962 xR = 0,996
GAValPFPTH Lineare Regression
Peak
höhe
[cps
]
Konzentration [ng/ml]
8 Anhang
8.1 Regressionsgeraden der Nachweis- und Bestimmungs-
grenzen
8.1.1 AAValPFPTH
8.1.2 GAValPFPTH
Konzentration [ng/ml]
Peakhöhe[cps]
0,5 84 1 126 2 259 3 319 5 618
10 1080 20 2310 30 3710 40 4970
Konzentration [ng/ml]
Peakhöhe[cps]
0,5 31 1 68 2 165 3 198 4 205
10 500 20 877 30 1450 40 1830 50 2620
Anhang
- 165 -
0 50 100 150 200 2500
200
400
600
800
1000
1200
y = 4,8403 xR = 0,999
Konzentration [ng/ml]
Peak
höhe
[cps
]
AAMA Lineare Regression
0 50 100 150 200 2500
100
200
300
400
500
600
700
y = 2,956 xR = 0,995
Konzentration [ng/ml]
Peak
höhe
[cps
]
GAMA Lineare Regression
8.1.3 AAMA (API 2000)
Konzentration [ng/ml]
Peakhöhe[cps]
12,5 198 25 239 50 343 100 537 250 1150
8.1.4 GAMA (API 2000)
Konzentration [ng/ml]
Peakhöhe[cps]
12,5 165 25 186 50 234 100 311 250 698
Anhang
- 166 -
0 20 40 60 80 1000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
y = 37,1754 xR = 0,998
AAMA Lineare Regression
Peak
höhe
[cps
]
Konzentration [ng/ml]
0 20 40 60 80 1000
500
1000
1500
2000
2500
3000
y = 26,8321 xR = 0,996
GAMA Lineare Regression
Konzentration [ng/ml]
Peak
höhe
[cps
]
8.1.5 AAMA (API 3200)
Konzentration [ng/ml]
Peakhöhe[cps]
2,5 312 5 416
12,5 601 25 941 50 2020 100 3600
8.1.6 GAMA (API 3200)
Konzentration [ng/ml]
Peakhöhe[cps]
2,5 221 5 230
12,5 462 25 609 50 1490 100 2600
Anhang
- 167 -
0 20 40 60 80 1000
500
1000
1500
2000
2500
3000
y = 32,2691 xR = 0,999
Acrylamid Lineare Regression
Peak
höhe
[cps
]
Konzentration [ng/ml]
0 20 40 60 80 100 120 1400
100
200
300
400
500
600
y = 4,2997 xR = 0,992
Glycidamid Lineare Regression
Peak
höhe
[cps
]
Konzentration [ng/ml]
8.1.7 Acrylamid
Konzentration [ng/ml]
Peakhöhe[cps]
5 167 10 372 20 615 30 1030 50 1620 70 2260 90 2880
8.1.8 Glycidamid
Konzentration [ng/ml]
Peakhöhe[cps]
7 46 14 121 28 164 42 221 70 323 98 385 126 527
Anhang
- 168 -
0 100 200 300 400 5000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
y = 14,8208 xR = 0,999
3-HPMA Lineare Regression
Peak
höhe
[cps
]
Konzentration [ng/ml]
8.1.9 HPMA
Konzentration [ng/ml]
Peakhöhe[cps]
2,5 214 5 215
12,5 236 25 419 50 855 100 1560 250 3860 500 7300
Anhang
- 169 -
0 2 4 6 8 100
2
4
6
8
10
12
Lineare Regression
y=1,199x-0,08147R=0,999
Area
(AAV
alPF
PTH
) / A
rea(
AAD 7V
alPF
PTH)
n(AAValPFPTH) / n(AAD7ValPFPTH)
0 2 4 6 8 100
2
4
6
8
10
Lineare Regression
y=0,919x-0,06365R=0,999
Area
(GAV
alPF
PTH
) / A
rea(
GAD
7Val
PFPT
H)
n(GAValPFPTH) / n(GAD7ValPFPTH)
8.2 Kalibriergeraden/Linearität
8.2.1 AAValPFPTH
8.2.2 GAValPFPTH
Area (Analyt)/ Area (IS)
n (Analyt)/n (IS)
0,05 0,051 0,1 0,102
0,199 0,203 0,285 0,305 0,407 0,406 0,658 0,508 1,083 1,016 2,274 2,032 4,41 4,063 7,292 6,095 9,797 8,127
12,123 10,158
Area (Analyt)/ Area (IS)
n (Analyt)/n (IS)
0,037 0,051 0,074 0,102 0,154 0,203 0,214 0,305 0,31 0,407 0,49 0,509
0,794 1,017 1,696 2,034 3,356 4,069 5,795 6,103 7,616 8,137 9,12 10,172
Anhang
- 170 -
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,00,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
y = 0,9392 x - 0,00972R = 0,998
lineare Regression
Are
a(A
AM
A) /
Are
a(D
3-AA
MA
)
n(AAMA) / n(D3-AAMA)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,00,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
lineare Regression
y = 0,9451 x - 0,01099R = 0,998
Are
a(G
AM
A) /
Are
a(D
3-GA
MA
)
n(GAMA) / n(D3-GAMA)
8.2.3 AAMA
8.2.4 GAMA
Area (Analyt)/ Area (IS)
n (Analyt)/n (IS)
0,00145 0,00084 0,00357 0,00169 0,00383 0,00422 0,00716 0,00844 0,0183 0,01688 0,0398 0,03376 0,0751 0,08441 0,152 0,16882 0,304 0,33763 0,597 0,67526 1,21 1,35052 1,77 2,02578 2,65 2,70104
Area (Analyt)/ Area (IS)
n (Analyt)/n (IS)
0,00184 0,00083 0,00166 0,00167 0,0037 0,00417 0,0073 0,00833 0,0178 0,01667 0,0381 0,03333 0,0753 0,08333 0,153 0,16667 0,303 0,33333 0,589 0,66667 1,18 1,33333 1,76 2,0 2,64 2,66667
Anhang
- 171 -
0 1 2 3 4 5 60,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
y = 0,7908 x - 0,0167R = 0,999
Lineare Regression
Are
a(A
A) /
Are
a(D
5-AA
)
n(AA) / n(D5-AA)
0 5 10 15 20 25 300
5
10
15
20
25
30
y = 0,9648 x + 0,0277R = 0,999
Lineare Regression
Are
a(G
A) /
Are
a(13
C3-G
A)
n(GA) / n(13C3-GA)
8.2.5 Acrylamid
8.2.6 Glycidamid
Area (Analyt)/ Area (IS)
n (Analyt)/n (IS)
0,201 0,25 0,395 0,5 0,813 1 1,52 2 2,3 3
3,07 4 4,04 5
Area (Analyt)/ Area (IS)
n (Analyt)/n (IS)
0,79 0,71 3,51 3,57 8,13 8,93 17,96 17,86 25,57 26,79
Anhang
- 172 -
0 1 2 3 40
1
2
3
4
y=1,02007x+0,01141R=0,999
Area
(3-H
PMA)
/ Ar
ea(D
3-3-H
PMA)
n(3-HPMA) / n(D3-3-HPMA)
8.2.7 HPMA
Area (Analyt)/ Area (IS)
n (Analyt)/n (IS)
0,00498 0,00087 0,00388 0,00175 0,00385 0,00437 0,00853 0,00874 0,0171 0,01748 0,0337 0,03495 0,0972 0,08738 0,19 0,17476 0,349 0,34952 0,751 0,69904 1,59 1,39807 2,13 2,09711 2,77 2,79615 3,6 3,49518
Anhang
- 173 -
8.3 Verwendete Formeln
Lineare Regression: y = B*x + A nach Origin 6.1 mit Messpunkten (x/y):
y-Achsenabschnitt (A):
( )
N
yxxxyA
iii
ii
ii
i ⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⋅⎟
⎠
⎞⎜⎝
⎛−⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛
=∑∑∑∑ 2
Steigung (B):
( )
N
yxyxnB i i
ii
iii∑ ∑∑ ⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛−⋅
=
Nenner (N): 2
2∑ ∑ ⎟⎠
⎞⎜⎝
⎛−=
i iii xxnN
Fehler der Steigung (mB):
NnnSmB )2( −
=
Fehler des y-Achsenabschnittes (mA):
Nn
xSm i
i
A )2(
2
−=
∑
Fehlerquadratsumme (S):
∑=
−−=n
iii ABxyS
1
2)(
Anhang
- 174 -
Arithmetischer Mittelwert ( x ):
n
xx i
i∑=
Standardabweichung ( 1−nσ ):
∑=
− −⋅−
±=n
iin xx
n 1
21 )(
11σ
Die Prüfung auf Normalverteilung erfolgte im Rahmen der Humanstudie durch den
Anderson-Darling Test.
Als Signifikanztest wurde der unabhängige, 2-seitige t-Test herangezogen.
Veröffentlichungen
Veröffentlichungen
Posterbeiträge Franz Berger, Julia Feld, Matthias Baum, Gerhard Eisenbrand „Acrylamide: Impact of food-matrices on bioavailability and biological effects on rats.” 25 Jahre Lebensmittelchemie & Toxikologie an der TU Kaiserslautern, Symposium „Cornerstones of Life Sciences in Chemistry“, 28.9.07, Kaiserslautern
Franz Berger, Julia Feld, Matthias Baum, Gerhard Eisenbrand „Acrylamid: Einfluss der Lebensmittelmatrix auf Bioverfügbarkeit und biologische Effekte in der Ratte.“ GDCH-Jahrestagung 2008, Regionalverband Süd-West, 3.-4.3.08 in Stuttgart-Hohenheim
Franz Berger, Julia Feld, Matthias Baum, Gerhard Eisenbrand „Acrylamide: Impact of food matrices in bioavailability and biological effects on rats.” DGPT-Jahrestagung 2008, 11-13.03.2008 in Mainz
Matthias Baum, Franz Ingo Berger, Julia Feld, Gerhard Eisenbrand „Influence of food matrices on bioavailability and biological effects of acrylamide in the rat.” AACR Annual Meeting 2008, 12-16.4.08 in San Diego, USA
Julia Feld, Franz Ingo Berger, Matthias Baum, Gerhard Eisenbrand „Biomarker der Exposition und biologischen Wirksamkeit von Acrylamid in vivo.“ 37. Deutschen Lebensmittelchemikertag, 8.-10.09.2008 in Kaiserslautern
Julia Feld, Franz Ingo Berger, Matthias Baum, Gerhard Eisenbrand „Effect Of Food Matrices On Bioavailability And Biological Effects Of Acrylamide in Rats.” 45th Congress of the European Societies of Toxicology, 05.-08.10.2008 in Rhodos, Griechenland
Franz Berger, Julia Feld, Matthias Baum, Gerhard Eisenbrand „Balance of toxification and detoxification of acrylamide in the rat.” DGPT-Jahrestagung 2009, 10-12.03.2009 in Mainz
Matthias Baum, Franz Berger, Julia Feld, Gerhard Eisenbrand „Is there an effect of food matrices on the bioavailability of acrylamide?” SOT Annual Meeting 2009, 15-19.3.09 in Baltimore, USA
Matthias Baum, Franz Ingo Berger, Julia Feld, Gerhard Eisenbrand „Acrylamide in food: Balance of toxification and detoxification in the rat at doses, reflecting dietary worst case situations.” AACR Annual Meeting 2009, 18-22.4.09 in Denver, USA
Veröffentlichungen
Publikationen Franz Berger, Julia Feld, Matthias Baum, Gerhard Eisenbrand „Acrylamide: Impact of food-matrices on bioavailability and biological effects in rats” Naunyn-Schmiedeberg’ s Archives of Pharmacology, Volume 377, Supplement 1, March 2008
Baum M, Berger FI, Feld J, Gerhardt N, Eisenbrand G „Impact of food matrices on bioavailability and biological effects of acrylamide in rats”. Research Association of the German Food Industry AiF 209 ZBG, 62-70, 2008 Julia Feld, Franz Berger, Matthias Baum, Gerhard Eisenbrand „Balance of toxification and detoxification of acrylamide in the rat” Naunyn-Schmiedeberg’ s Archives of Pharmacology, Volume 379, Supplement 1, March 2009
Baum M, Berger FI, Feld J, Eisenbrand G „Acrylamid: Bioverfügbarkeit aus Lebensmitteln.“ Lebensmittelchemie Vol. 63 No. 2-2009
Doroshyenko O, Fuhr U, Kunz D, Frank D, Kinzig M, Jetter A, Reith Y, Lazar A, Taubert D, Kirchheiner J, Baum M, Eisenbrand G, Berger FI, Bertow D, Berkessel A, Sörgel F, Schömig E, Tomalik-Scharte D „In vivo role of cytochrome P450 2E1 and glutathione-S-transferase activity for acrylamide toxicokinetics in humans.” Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2009 Feb;18(2):433-43.
Dank
Bedanken möchte ich mich bei
• dem Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.V. (FEI) für die finanzielle Unterstützung
im Rahmen des FEI-Projektes „Entwicklung und Anwendung neuer Verfahrensabläufe in
Produktionsanlagen für Kartoffel- und Getreideerzeugnisse mit reduzierten Gehalten an
Acrylamid und dessen Folgeprodukten“ (AiF 209 ZBG) in Zusammenarbeit mit dem Bund
für Lebensmittelrecht und Lebensmittelkunde e.V. (BLL) unter dem Teilprojekt „Acrylamid
in Lebensmitteln: Einfluss spezifischer Lebensmittelmatrices auf Bioverfügbarkeit und
biologische Effekte in der Ratte“
• der DFG für die finanzielle Unterstützung und Herrn Prof. Dr. med. Fuhr vom Institut für
Pharmakologie der Universität Köln für die Bereitstellung der Blutproben zur
Untersuchung der Hämoglobinaddukte im Rahmen des DFG-Projektes „Bedeutung der
CYP2E1-Aktivität für die Toxikokinetik von Acrylamid beim Menschen“ (Studiennummer:
KPUK-03-ACR/PIL-01)
• dem Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. Gert Fricker, Institut für pharmazeutische
Technologie, Ruprecht-Karls Universität Heidelberg für die Unterstützung bei der
Durchführung der Tierversuche
• den Arbeitskreisen von Frau Prof. Dr. Elke Richling und Herrn Prof. Dr. Dr. Dieter
Schrenk für die technische und materielle Unterstützung
• Dr. Michael Granvogl (TU München), Dr. Knut Franke (DIL Quakenbrück) und Dr. Heinz
Kaiser (ILU Nuthetal) für die Bestimmung der Acrylamid-Gehalte in den verwendeten
Lebensmitteln
• Ingrid und Heike für die Unterstützung bei allen Problemen
• Ari, Michael, Karl-Heinz, Rainer und Eva für die stete Hilfs- und Diskussionsbereitschaft
• meinen Laborkollegen Julia, Nadine, Nico, Tamara, Hannah und Daniel für die fachlichen
Diskussionen und das freundschaftliche Verhältnis.
Außerdem möchte ich allen anderen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben,
danken.
Lebenslauf
Lebenslauf
Persönliche Daten Name: Franz Ingo Berger Anschrift: Herderstraße 6; 66894 Martinshöhe Geburtsdatum: 19.09.1975 in Kaiserslautern Familienstand: verheiratet; 1 Kind
Studium 04/2006-06/2009 Promotion bei Prof. Dr. Gerhard Eisenbrand im Fachbereich Chemie;
Fachrichtung Lebensmittelchemie und Toxikologie der Technischen Universität Kaiserslautern; Thema „Metabolismus und Bioverfügbarkeit der Lebensmittelkontaminante Acrylamid in Ratte und Mensch“
04/2006-03/2008 Promotionsstipendium nach dem Landesgraduiertenförderungsgesetz
10/2001-03/2006 Studium der Lebensmittelchemie an der TU Kaiserslautern Diplomarbeit im Arbeitskreis von Prof. Dr. Gerhard Eisenbrand mit dem
Thema „Struktur-Aktivitätsbetrachtung indigoider Bisindole zur Wirkung an humanen Topoisomerasen“
Abschluss: Diplom-Lebensmittelchemiker
Berufstätigkeit seit 11/2009 BASF SE, Tätigkeit im Bereich Regulatory Toxicology Chemicals
06/1999-09/2001 BASF AG, Ludwigshafen; Tätigkeit als Chemielaborant (Qualitätssicherung im Bereich Ammoniak- und Methanolsynthese)
Berufsausbildung 09/1996-05/1999 Ausbildung zum Chemielaboranten BASF AG, Ludwigshafen
Wehrdienst 10/1995-07/1996 Absolvierung des Wehrdienstes in Gerolstein und Zweibrücken
Schulbildung 1992-1995 Hofenfels-Gymnasium Zweibrücken; Allgemeine Hochschulreife 1988-1992 Realschule Zweibrücken 1986-1988 Gemeinsame Orientierungssstufe von Realschule und Hofenfels-
Gymnasium Zweibrücken 1982-1986 Grundschule Martinshöhe