Upload
doankhanh
View
245
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Détection des dangers microbiologiques par les
méthodes normalisées ou alternatives validées,
intérêts et limites
Bertrand LOMBARD
Coordinateur Appui scientifique et technique
AFSSA-LERQAP, Maisons-Alfort
tél: 01 49 77 26 96, mél: [email protected]
Titre du diaporama
Plan
• Méthodes normalisées
• Méthodes alternatives validées
• Méthodes normalisées et validées dans le
contexte de l’accréditation des laboratoires et
de la réglementation européenne
2
Titre du diaporama
Pourquoi normaliser ?
• Analyse microbiologique des aliments
– Très variable
• Analyte vivant
• Nature biologique des réactifs (milieux de culture, souches, AC)
– Résultats intimement liés au principe de la méthode
• Microbiologie conventionnelle (croissance bactérienne)
• En particulier pour le dénombrement bactérien
– Pathogènes alimentaires = danger direct pour les
consommateurs
Besoin de définir des méthodes de référence
Normalisation = voie privilégiée pour définir ces
méthodes de référence (consensus)
4
Titre du diaporama
Présentation (1)
• Normalisation des méthodes d’analyse
microbiologique des aliments
o Principalement aux niveaux européen et
international
• ISO/TC 34/SC 9 « Aliments – Microbiologie »
• CEN/TC 275/WG 6 « Analyse des aliments, méthodes
horizontales – Microbiologie »
• Sous responsabilité française
o + quelques normes de routine NF ( pathogènes)
o Suivi français: Commission AFNOR V08B
« Microbiologie des aliments »
5
Titre du diaporama
Présentation (2)
• Méthodes normalisées en microbiologie des aliments
− Domaine d’application étendu = méthodes « horizontales »
Tous aliments (homme, animaux)
Environnement de transformation/stockage, production primaire
+ quelques méthodes sectorielles
− Détection/dénombrement
Bactéries surtout
+ levures/moisissures, virus, parasites
− Principe analytique
− Microbiologie conventionnelle dans la plupart des cas
large applicabilité
− Introduction de technologies nouvelles
si microbiologie conventionnelle non satisfaisante
6
Titre du diaporama
Normes générales
• BPL microbiologie des aliments (NF EN ISO 7218)
• AQ/performance milieux de culture (NF EN ISO TS 11133-1&2)
• Préparation échantillons/suspension-mère/dilutions (NF EN ISO 6887-1 à 5)
• Validation de méthodes (NF EN ISO 16140)
• Incertitude de mesure en microbiologie quantitative (XP ISO/TS 19036)
• Essais d’aptitude/microbiologie des aliments (projet EN ISO/TS 22117)
7
Titre du diaporama
Méthodes de référence pour les pathogènes (1)
• Bactéries
– Salmonella
• détection (NF EN ISO 6579)
• Dénombrement/NPP miniaturisée (projet NF EN ISO/TS 13305)
• Sérotypage (projet)
– L. monocytogenes: détection & dénombrement (NF EN ISO 11290-1&2)
– Staphylocoques coagulase positive
• Détection & dénombrement TCC+NPP (NF EN ISO 6888-1,2&3)
• + entérotoxines (projet)
– Bacillus cereus: détection & dénombrement TCC+NPP (NF EN ISO 7932, NF EN ISO 21871)
• + toxines (projet)
– Clostridium perfringens: dénombrement TCC (NF EN ISO 7937)
8
Titre du diaporama
Méthodes de référence pour les pathogènes (2)
• Bactéries (suite)
– Campylobacter: détection & dénombrement TCC (NF EN ISO 10272-1,2&3)
– Escherichia coli O157: détection (NF EN ISO 16654)
– STEC: détection (projet NF EN ISO 13136)
– Vibrio: détection (NF EN ISO/TS 21872-1&2)
– Yersinia enterocolitica: détection (NF EN ISO 10273)
– Shigella: détection (NF EN ISO 21567)
– E. sakazakii (Cronobacter spp.): détection (XP ISO/TS 22964: lait&PL)
9
Titre du diaporama
Méthodes de référence pour les pathogènes (3)
• Virus dans les aliments et eaux embouteillées
– Virus hépatite A et norovirus (projet)
• Parasites (futur)
– Trichinella
– Cryptosporidium
– Giardia
10
Titre du diaporama
Pourquoi des méthodes alternatives validées ?
• Méthodes de référence – La plupart de microbiologie conventionnelle
Méthodes lourdes (main d’œuvre) et longues ( bactérien)
─ Processus de normalisation au niveau international = long (3/4 ans)
Développement méthodes alternatives − Faisant appel aux nouvelles technologies
− Brevetées/commerciales (kits)
− Plus rapides, moins lourdes (automatisées)
• Mais les utilisateurs ont besoin de garanties sur la performance de ces méthodes Systèmes de validation/certification par tierce partie
Processus moins long que normalisation (1-2 ans) En France: Validation AFNOR des méthodes alternatives
12
Titre du diaporama
Validation AFNOR des méthodes alternatives: présentation (1)
• AFNOR Certification
1.Etude expérimentale des performances de la
méthode
– Référentiel technique = Norme NF EN ISO 16140
– 2 protocoles: méthodes qualitatives et quantitatives
– 2 phases
• Etude intra-laboratoire (laboratoire expert)
• Essai inter-laboratoires
– Evaluation des résultats: Bureau Technique
(composition paritaire)
13
Titre du diaporama
Validation AFNOR des méthodes alternatives: présentation (2)
2. Exigences assurance qualité pour fabricant de
méthode
– Base: ISO 9001
– Audits réguliers du fabricants et de la ligne de
production de la méthode
Performance de la méthode = même niveau dans
le temps
• Certification: 4 ans renouvelables
• Liste méthode validées:
www.afnor-validation.org
14
Titre du diaporama
Validation AFNOR des méthodes alternatives: liste méthodes validées (1)
• Dénombrement staphylocoques
– 3 milieux de culture
• Détection Salmonella = 25 tests validés
– 4 milieux de culture
– 15 tests immuno-enzymatiques
– 1 test hybridation moléculaire
– 5 tests PCR
• Détection E. coli O157 = 6 tests validés
– 1 milieu de culture
– 2 tests immuno-enzymatiques
– 3 tests PCR
15
Titre du diaporama
Validation AFNOR des méthodes alternatives: liste méthodes validées (2)
• Détection Listeria spp. = 10 tests validés
– 2 milieux de culture
– 6 tests immuno-enzymatiques
– 2 tests PCR
• L. monocytogenes = 22 tests validés
– Détection
• 9 milieux de culture
• 4 tests immuno-enzymatiques
• 2 tests hybridation moléculaire
• 2 tests PCR
– Dénombrement
• 5 milieux de culture
16
Titre du diaporama
MÉTHODES NORMALISÉES
ET VALIDÉES
DANS LE CONTEXTE DE
L’ACCRÉDITATION DES
LABORATOIRES ET DE LA
RÉGLEMENTATION EUROPÉENNE
17
Titre du diaporama
Accréditation des laboratoires
• Norme NF EN ISO 17025 (2005)
• Article 5.4.5 sur validation des méthodes
Valider méthodes non normalisées
Inclut méthodes alternatives
• NF EN ISO 16140 = outil de choix en
microbiologie des aliments
– Si kits validés AFNOR, pas besoin de validation
par le laboratoire utilisateur
18
Titre du diaporama
Contexte réglementaire européen (1)
• Règlement CE 2073/2005 modifié: critères
microbiologiques des aliments
– Application du règlement 852/2004 (art. 4&12)
– Applicable
• Formellement aux exploitants de la chaîne alimentaire
• Indirectement/en partie aux contrôles officiels
– Pour chaque critère microbiologique (Annexe I)
1 méthode de référence = Norme EN ISO en général
19
Titre du diaporama
Contexte réglementaire européen (2)
• Utilisation méthodes alternatives = possible
– Disposition générale (art. 5)
– Conditions
• Méthode validée/méthode de référence en Annexe I
• Si commerciale, certifiée par tierce partie
• Selon EN ISO 16140 (ou tout autre protocole similaire
internationalement reconnu)
– Si kit validé AFNOR
• OK pour autocontrôles (et contrôles officiels en France)
vérifier conformité des produits aux critères
microbiologiques du règlement 2073/2005
20
Titre du diaporama
• Pourquoi utiliser les méthodes de référence
normalisées ou les kits validés ?
Réduire les sources de variation
Faciliter la reconnaissance des résultats/contrôles
• Relation client/fournisseur
• Autocontrôles/reconnaissance par DDSV (PH)
• Contrôles officiels
• Commerce international
Base fiable pour
• Accréditation des laboratoires
• Critères microbiologiques réglementaires
(règlement 2073/2005)
22