Embed Size (px)
Citation preview
12/11/2009
1
Metode de Metode de
analiză a geneloranaliză a genelor
Expresia genelorExpresia genelor
ADNADN ARNm ARNm ProteinăProteină CaracterCaracter
5’5’--ATTGCAAGATTACCATGTATTGCAAGATTACCATGT--3’ 3’ Catena codogenă (netranscrisă)Catena codogenă (netranscrisă)
3’3’--TAACGTTCTAATGGTACATAACGTTCTAATGGTACA--5’ 5’ Catena anticodogenă (transcrisă)Catena anticodogenă (transcrisă)
Transcripţie
5’5’--AUUGCAAGAUUACCAUGUAUUGCAAGAUUACCAUGU--3’ 3’ ARNmARNm
Translaţie
Leu Leu –– Ala Ala –– Arg Arg –– Leu Leu –– Pro Pro –– Cys polipeptidCys polipeptid
Maturizare
Caracter fenotipic normalCaracter fenotipic normal
Expresia genelorExpresia genelor
ADNmut ARNmmut
Proteinăan Caracteran
5’5’--ATTATTAACAAGATTACCATGTCAAGATTACCATGT--3’ mutaţie 3’ mutaţie GG44→→AA
3’3’--TAATAATTGTTCTAATGGTACAGTTCTAATGGTACA--5’5’
Transcripţie
5’5’--AUUAUUAACAAGAUUACCAUGUCAAGAUUACCAUGU--3’ 3’ ARNmARNmmut
Translaţie
Leu Leu –– ThrThr –– Arg Arg –– Leu Leu –– Pro Pro –– Cys Cys polipeptidpolipeptidan
Caracter fenotipic anormalCaracter fenotipic anormal
Analiza genelor
Secvenţiere
PCR
Southern-blot
Hibridare in situ
ADN ProteineARN
Northern-blot
RT–PCR
Hibridare in situ
Western-blot
Secvenţiere
Analiza funcţiei
Analiza
histochimică
Utilizarea tehnicilor de analiză a Utilizarea tehnicilor de analiză a
acizilor nucleici în medicinăacizilor nucleici în medicinăAnaliza ADN:
depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al bolilor
genetice (prenatal, postnatal precoce);
identificarea polimorfismului individual → dactiloscopie
genomică (analiza filiaţiei);
depistarea ADN străin (bacterian, viral) → diagnosticul
bolilor infecţioase şi gradului de infectare.
Analiza ARNm:
analiza expresiei genice ţesut-specifică;
evaluarea gradului de expresie a genei normale /
patologice.
12/11/2009
2
Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin
acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)
RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z
M
--
++
10 kb
8 kb
6 kb
4 kb
2 kb
12 kb
10 kb
6 kb
5 kb
2,5 kb
2,5 kb
10 kb
6 kb
5 kb
Tehnici de analiză a genelorTehnici de analiză a genelor PCRPCR
Southern Southern -- blotblot
Secvenţierea ADNSecvenţierea ADN
Principii de bază Principii de bază
Etapele principaleEtapele principale
Componente necesare (la general)Componente necesare (la general)
Indicaţii şi limiteIndicaţii şi limite
PCRPCR
reacţia ciclică de polimerizare reacţia ciclică de polimerizare Principiile PCR Principiile PCR clonarea clonarea in vitroin vitro = amplificare = amplificare
Replicare semiconservativă, repetatăReplicare semiconservativă, repetată
Specificitatea Specificitatea primerilorprimerilor sintetici pentru genasintetici pentru gena––ţintăţintă
Hibridizarea ADNHibridizarea ADN--ţintă ţintă –– primerprimer ←complementar:complementar: Denaturare termică a ADN Denaturare termică a ADN -- de cercetatde cercetat
Modificarea ciclică a temperaturii:Modificarea ciclică a temperaturii: DenaturareDenaturare
RenaturareRenaturare
Sinteză Sinteză
12/11/2009
3
Clonarea in vitro – PCR
(reacţia ciclică de polimerizare a noilor
copii de ADN)
Componentele necesare pentru
clonarea in vitro (PCR):- ADN de cercetat
- Primeri specifici secvenţei de clonat –
complimentari secvenţelor flancante
- Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă
- Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dNTP)
- Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii:
- tº de denaturare ADN
- tº de renaturare (ADN+primer)
- tº de polimerizare (elongarea catenelor noi de
ADN)
Etapele tehnicii PCR
•Denaturarea ADN la 96oC
A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante
•Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor
•Elongarea catenelor ADN la 72oC
B. Repetarea automată a procedurilor de denaturare-
renaturare-elongare de 30-35 ori
C. Analiza produşilor PCR
- electroforeza
- colorarea
- interpretarea rezultatelor
Extragerea ADN Pregătirea
componentelor pentru
PCR
Amplificarea
ADN-ţintă
Electroforeza
produşilor PCR
Colorarea şi
vizualizarea produşilor
PCR
Interpretarea
rezultatelor
12/11/2009
4
Avantajele PCRAvantajele PCR
Metodă rapidăMetodă rapidă
••Metodă ieftinăMetodă ieftină
••Utilizarea cantităţilor mici de material analizatUtilizarea cantităţilor mici de material analizat
••Nu necesită izotopi radioactiviNu necesită izotopi radioactivi
••Interpretarea uşoară a rezultatelorInterpretarea uşoară a rezultatelor
Dezavantajele PCRDezavantajele PCR
••Necesitatea cunoaşterii secvenţei nucleotidice Necesitatea cunoaşterii secvenţei nucleotidice
amplificateamplificate
••Necesitatea primerilor sintetici, specifici Necesitatea primerilor sintetici, specifici
secvenţei analizatesecvenţei analizate
Utilizarea PCRUtilizarea PCR
••Identificarea inserţiilor/deleţiilor nucleotidiceIdentificarea inserţiilor/deleţiilor nucleotidice
••Identificarea mutaţiilor punctiforme (substituţiile Identificarea mutaţiilor punctiforme (substituţiile
nucleotidice)nucleotidice)
••Identificarea expresiei genice (Identificarea expresiei genice (RTRT--PCRPCR))
••Dactiloscopia genomică (filiaţie)Dactiloscopia genomică (filiaţie)
••Identificarea agenţilor infecţioşiIdentificarea agenţilor infecţioşi
••Identificarea gradului de infecţie (Identificarea gradului de infecţie (quantitative PCRquantitative PCR))
Identificarea inserţiilor / deleţiilorIdentificarea inserţiilor / deleţiilor Identificarea mutaţiilor punctiformeIdentificarea mutaţiilor punctiforme
Identificarea agenţilor infecţioşiIdentificarea agenţilor infecţioşi
12/11/2009
5
Stabilirea paternităţii (filiaţiei)Stabilirea paternităţii (filiaţiei) Tehnica
Southern-blot Bazată pe RFLPs
Hibridizare cu sonde marcate
Cu transferul FR din gel-electroforeză pe un
suport solid (pe membrane de nitroceluloză)
Hibridarea acizilor nucleiciHibridarea acizilor nucleici
••Unirea complementară a fragmentelor Unirea complementară a fragmentelor
(moleculelor) de acizi nucleici:(moleculelor) de acizi nucleici:
••ADN de cercetat cuADN de cercetat cu
••sonda oligonucleotidicăsonda oligonucleotidică
••În reacţie participă molecule monocatenareÎn reacţie participă molecule monocatenare
••Moleculele ADNMoleculele ADN--ţintă sunt fixateţintă sunt fixate
••MoleculeleMoleculele--sonde sunt marcate radioactiv sau sonde sunt marcate radioactiv sau
fluorescentfluorescent
••Identificarea complexelor hibride se realizează Identificarea complexelor hibride se realizează
prin intermediul autoradiografieiprin intermediul autoradiografiei
Tehnica SouthernTehnica Southern--blotblot
Extragerea ADNExtragerea ADN Restriţia ADNRestriţia ADN Electroforeza ADNElectroforeza ADN
Denaturarea şi Denaturarea şi
transferul ADNtransferul ADN
pe membranepe membrane
AutoradiografiaAutoradiografiaHibridare cu sonda Hibridare cu sonda
Vizualizarea şi Vizualizarea şi
interpretarea interpretarea
rezultatelorrezultatelor
Utilizarea tehnicii Utilizarea tehnicii
SouthernSouthern--blotblot
•• Identificarea inserţiilor / deleţiilor mariIdentificarea inserţiilor / deleţiilor mari
•• Identificarea mutaţiilor punctiforme ce Identificarea mutaţiilor punctiforme ce
afectează SRafectează SR
•• Dactiloscopia genomică RFLPsDactiloscopia genomică RFLPs
RFLPs şi analiza genotipului
Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C
Alela Normală cu 3 SR Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2
B (Nm)B (Nm)
C (mm)C (mm)
A (NN)A (NN)
12/11/2009
6
Tehnica Tehnica NorthernNorthern--blotblot
••Extragerea ARN din ţesutul ţintăExtragerea ARN din ţesutul ţintă
••Electroforeza ARN în condiţii de Electroforeza ARN în condiţii de
denaturaredenaturare
••Transfer pe membrană de Transfer pe membrană de
nailonnailon
••Hibridarea cu sonda marcatăHibridarea cu sonda marcată
••AutoradiografiaAutoradiografia
Tehnica NorthernTehnica Northern--blotblot
Extragerea ARNExtragerea ARN Electroforeza ARNElectroforeza ARN
Transferul ARNTransferul ARN
pe membranepe membrane
AutoradiografiaAutoradiografiaHibridare cu sonda Hibridare cu sonda
Vizualizarea şi Vizualizarea şi
interpretarea interpretarea
rezultatelorrezultatelor
Utilizarea tehnicii Utilizarea tehnicii
NorthernNorthern--blotblot
••Identificarea expresiei genice în anumite Identificarea expresiei genice în anumite
ţesuturi, anumite condiţiiţesuturi, anumite condiţii
••Identificarea variantei de Identificarea variantei de splicingsplicing a proARNma proARNm
••Identificarea nivelului de expresieIdentificarea nivelului de expresie
••Identificarea agenţilor infecţioşi (ribovirusuri)Identificarea agenţilor infecţioşi (ribovirusuri)
Identificarea nivelului Identificarea nivelului
de expresie şi a variantei de expresie şi a variantei
de de splicingsplicing
12/11/2009
7
Secvenţierea ADNSecvenţierea ADNStabilirea secvenţei de nucleotideStabilirea secvenţei de nucleotide
Metoda chimică (tehnica MaxamMetoda chimică (tehnica Maxam--Gilbert, 197Gilbert, 19733))
Metoda dideoxi (tehnica SMetoda dideoxi (tehnica Saanger, 197nger, 19755))
Metoda automată (cu utilizarea agenţilor fluorescenţi)Metoda automată (cu utilizarea agenţilor fluorescenţi)
ADNmutARNmmut
Proteinăan Caracteran
55’’--ATTATTAACACAAAGATTACCATGTGATTACCATGT--3’ 3’ mutaţie Gmutaţie G44→→AA
3’3’--TAATAATTGTTCTAATGGTACAGTTCTAATGGTACA--5’5’
Transcripţie
55’’--AUUAUUAACACAAAGAUUACCAUGUGAUUACCAUGU--3’ 3’ ARNmARNmmut
Translaţie
Leu Leu –– ThrThr –– Arg Arg –– Leu Leu –– Pro Pro –– Cys Cys polipeptidpolipeptidan
Caracter fenotipic Caracter fenotipic anormalanormal
55’’--ATTACAATTACAAAGATTACCATGTGATTACCATGT--3’ catena codogen3’ catena codogenăă
3’3’--TAATAATTGTTCTAATGGTACAGTTCTAATGGTACA--5’5’ catena anticodogenă catena anticodogenă (matriţă)(matriţă)
3’3’--TAATAATTGTTCTAATGGTACAGTTCTAATGGTACA--5’5’
55’’--ATTAATTACC--3’3’
3’3’--TAATAATTGTTCTAATGGTACAGTTCTAATGGTACA--5’5’
55’’--ATTAATTACACAAA--3’3’
3’3’--TAATAATTGTTCTAATGGTACAGTTCTAATGGTACA--5’5’
55’’--ATTAATTACACAAAGG--3’3’
3’3’--TAATAATTGTTCTAATGGTACAGTTCTAATGGTACA--5’5’
55’’--ATTAATTACACAAAGGAA--3’3’
3’3’--TAATAATTGTTCTAATGGTACAGTTCTAATGGTACA--5’5’
55’’--ATTAATTACACAAAGATGATTT--3’3’
3’3’--TAATAATTGTTCTAATGGTACAGTTCTAATGGTACA--5’5’
55’’--ATTAATTACCAA--3’3’
3’3’--TAATAATTGTTCTAATGGTACAGTTCTAATGGTACA--5’5’
55’’--ATTAATTACACAAAGAGATT--3’3’
A, T, C, T A, T, C, T –– ddNTPddNTP (2(2’’,3,3’’--dddNTPdNTP))
pentru stoparea sintezei
55’’--ATTAATTA ---- primer marcat P32
pentru ADN-polimerază
A, T, C, T A, T, C, T –– dNTP (2dNTP (2’’--dNTP)dNTP)
pentru sinteza noilor catene
Tehnica dideoxiTehnica dideoxi
••Sinteza enzimatică a Sinteza enzimatică a
ADNADN
••Utilizarea în paralel a Utilizarea în paralel a
nucleotidelor ce nucleotidelor ce
conţin deoxiriboză şi conţin deoxiriboză şi
dideoxiribozădideoxiriboză
••Stoparea sintezei în Stoparea sintezei în
cazul incorporării cazul incorporării
ddNTPddNTP
55’’--ATTAATTACACAAA--3’3’
55’’--ATTAATTACACAAAGG--3’3’
55’’--ATTAATTACACAAAGGAA--3’3’
55’’--ATTAATTACACAAAGATGATTT--3’3’
55’’--ATTAATTACCAA--3’3’
55’’--ATTAATTACACAAAGAGATT--3’3’
55’’--ATTAATTACACAAAGATTGATTAA--3’3’
55’’--ATTAATTACACAAAGATTACCGATTACCAA--3’3’
55’’--ATTAATTACACAAAGATTACCAGATTACCATT--3’3’
55’’--ATTAATTACACAAAGATTACCATGATTACCATGG--3’3’
55’’--ATTAATTACACAAAGATTACCATGGATTACCATGTT--3’3’
+
-A T C G
55’’--ATTAATTACC--3’3’
55’’--ATTAATTACACAAAGATTAGATTACC--3’3’
55’’--ATTAATTACACAAAGATTACGATTACCC--3’3’ 55’’--ATTAATTACACAAAGATTACCATGTGATTACCATGT--3’3’
A
T
G
C
Tehnica dideoxiTehnica dideoxi
••Extragerea ADNExtragerea ADN
••Denaturarea ADNDenaturarea ADN
••Sinteza catenelor Sinteza catenelor
complementare utilizând complementare utilizând
primeri marcaţi cu primeri marcaţi cu 3232P în P în
prezenţa dNTP şi ddNTPprezenţa dNTP şi ddNTP
••Electroforeza în condiţii Electroforeza în condiţii
de denaturarede denaturare
••Vizualizarea fragmentelor Vizualizarea fragmentelor
marcate prin marcate prin
autoradiografieautoradiografie
12/11/2009
8
+
-
(+) 5' TAAATGGCTATAAATGGCTA.......3'(-)
Metoda automatăMetoda automată
HibridareaHibridarea in situin situ
••Pregătirea Pregătirea
preparatelor de preparatelor de
cromozomicromozomi
••Denaturarea ADNDenaturarea ADN
••Hibridarea cu sonda Hibridarea cu sonda
marcatămarcată
••Vizualizarea la Vizualizarea la
microscopul opticmicroscopul opticHibridarea Hibridarea in situin situ cu cu
utilizarea preparatelorutilizarea preparatelor
de cromozomi metafazicide cromozomi metafazici
Hibridarea Hibridarea in situin situ cu cu
utilizarea preparatelorutilizarea preparatelor
cu nuclei interfazicicu nuclei interfazici
Hibridarea Hibridarea in situin situ pentru pentru depistarea secvenţelor ADNdepistarea secvenţelor ADN
Hibridarea Hibridarea in situin situ cu cu
utilizarea utilizarea probei probei senssens (stânga) (stânga)
şi şi antisens antisens (dreapta)(dreapta)
Hibridarea Hibridarea in situin situpentru depistarea pentru depistarea secvenţelor ARNsecvenţelor ARN
Analiza Analiza
histochimică histochimică ––
identificarea identificarea
proteinelor în ţesutproteinelor în ţesut
12/11/2009
9
Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor
nucleici:1. Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de
gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de
reglare, studiul consecinţelor mutaţiilor.
2. Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice
- prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naşterii
copiilor cu anomalii genetice sau manifestării unor
patologii severe.
3. Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea
vectorilor de gene etc.).
4. Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în
diagnosticul bolilor infecţioase.
5. Identificarea polimorfismelor individuale în analiza
filiaţiei, în criminalistică.
