Institutionen för naturvetenskap Examensarbete

Nathalie Carlsson Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap Nivå: Grundnivå Nr: 2011: BL3

Metodjämförelse mellan Hemocue WBC Diff, Advia 2120 och manuell mikroskopi avseende

differentialräkning av leukocyter

Metodjämförelse mellan Hemocue WBC Diff, Advia 2120 och manuell mikroskopi avseende differentialräkning av leukocyter Nathalie Carlsson Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen Extern handledare: Med Dr, PhD, Ingvar Rydén Länsenheten för Klinisk kemi

Kalmar länssjukhus SE-391 85 Kalmar

Intern handledare: Dr Med vet, Leg. Biomedicinsk analytiker, Susanne Widell Institutionen för

naturvetenskap Linnéuniversitetet SE-391 82 Kalmar Examinator: Dr Med vet, Maria Mattsson Institutionen för

naturvetenskap Linnéuniversitetet SE-391 82 Kalmar Examensarbetet ingår i biomedicinska analytikerprogrammet, 180 högskolepoäng

SAMMANFATTNING Patientnära instrument kan i vissa vårdsituationer ge snabba analysresultat på ett kostnadseffektivt sätt. En viktig patientnära analys är differentialräkning av leukocyter, som visar fördelning och utmognad av dessa blodceller. Störningar i bildningen av leukocyter sker vid infektioner och hematologiska sjukdomar. Med manuell mikroskopi räknas leukocyter i ett blodutstryk färgat med May-Grünwald Giemsa. En kvantitativ och kvalitativ bedömning utförs av alla blodceller. Advia 2120 utför differentialräkning av leukocyter genom cytokemiska reaktioner och ljusspridning i olika vinklar vid belysning av celler. Celler identifieras baserat på kärnkonfiguration, granulering och cellstorlek. Hemocue White Blood Cell (WBC) Diff har en charged coupled device (CCD) kamera som scannar celler i en mikrokyvett. Genom beräkning av optisk densitet från pixlars gråskalor och jämförelse med referensceller identifieras celler. Syftet med studien var att jämföra analysresultat gällande differentialräkning av leukocyter i venöst blod mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 samt i kapillärt blod mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi. Provmaterialet bestod av 62 venösa prover från patienter och 20 kapillära prover från friska vuxna personer. Resultatet vid jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 visade en korrelation på 0,99 vid beräkning av totala antalet leukocyter, neutrofila granulocyter och lymfocyter. En större spridning av resultat sågs vid beräkning av monocyter, eosinofila- och basofila granulocyter. Resultatet vid jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi visade en korrelation på 0,95 för neutrofila granulocyter och 0,84 för lymfocyter. För de andra celltyperna var korrelationen dålig. Hemocue WBC Diff fungerar bra vid beräkning av leukocyter på friska personer. Instrumentet är dock under utveckling och förbättringar på vissa parametrar kan behövas.

ABSTRACT Point of care instruments can provide faster testresults in a cost-effective manner. An

important test in primary care is the differential leukocyte count, showing

distribution and maturation of these blood cells. Disruption of the formation of

leukocytes occurs in infections and hematologic diseases.

With manual microscopy the leukocytes are counted in a blood smear stained with

May-Grünwald Giemsa. A quantitative and a qualitative assessment of all blood cells

is performed.

Advia 2120 perform the differential leukocyte count by cytochemical reactions and

lightscatter at different angles when illumination of cells. Cells are identified based

on the configuration of the nucleas, granulation and the size of the cell.

Hemocue White Blood Cell (WBC) Diff has a charged coupled device (CCD)

camera that scans the cells in a microcyvette. By calculating the optical density from

the gray values of pixels and comparison with reference cells the cell types can be

identified.

The aim of the study was to compare the results of the differential leukocyte count in

venous blood between Hemocue WBC Diff and Advia 2120, and in capillary blood

between Hemocue WBC Diff and manual microscopy. The test material consisted of

62 venous samples from patients and 20 capillary samples from healthy adults.

The results of the comparison between Hemocue WBC Diff and Advia 2120 showed

a correlation of 0,99 in calculating the the total number of leukocytes,

neutrophils and lymphocytes. A distribution of results was seen in the calculations

of monocytes, eosinophils and basophils. The results of the comparison between

Hemocue WBC Diff and manual microscopy showed a correlation of 0,95 for

neutrophils and 0,84 for lymphocytes. For the other celltypes the correlation was

poor.

Hemocue WBC Diff works well for the calculation of leukocytes in healthy people.

The instrument is under development and improvements in certain parameters may

be needed.

Innehållsförteckning

1. INTRODUKTION ........................................................................................................... 2

1.1 Patientnära analysverksamhet ......................................................................................... 2

1.2 Leukocyters bildning och roll i kroppen.......................................................................... 2

1.3 Cytokemisk färgning vid manuell bedömning av blod- och benmärgsceller .................... 4

1.4 Leukocytopoesens morfologi i MGG-färgning................................................................ 5

1.4.1 Granulocytopoesen .................................................................................................. 5

1.4.2 Monocytopoesen ..................................................................................................... 7

1.4.3 Lymfocytopoesen .................................................................................................... 7

1.5 Störningar i leukocytopoesen.......................................................................................... 8

1.5.1 Infektiösa tillstånd ................................................................................................... 8

1.5.2 Leukemi .................................................................................................................. 9

1.5.3 Myelodysplastiska syndrom ................................................................................... 10

1.5.4 Maligna lymfom .................................................................................................... 10

1.6 Manuell differentialräkning av leukocyter .................................................................... 11

1.7 Maskinell differentialräkning av leukocyter .................................................................. 13

1.7.1 Allmänt om automatiska cellräknare ...................................................................... 13

1.7.2 Advia 2120 ............................................................................................................ 15

1.7.3 Hemocue WBC Diff .............................................................................................. 18

1.8 Syfte ............................................................................................................................ 20

2. MATERIAL OCH METODER ...................................................................................... 20

2.1 Provmaterial ................................................................................................................. 20

2.1.1 Provmaterial för jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 .............. 20

2.1.2 Provmaterial för jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi . 21

2.2 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 .............................................. 21

2.2.1 Analys med Hemocue WBC Diff ........................................................................... 21

2.2.2 Analys med Advia 2120 ........................................................................................ 21

2.2.3 Manuell kontroll av prover efter larm från Hemocue WBC Diff ............................. 22

2.2.4 Kvalitetssäkring ..................................................................................................... 23

2.2.5 Statistiska analyser ................................................................................................ 24

2.3 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi .................................. 25

2.3.1 Provtagning ........................................................................................................... 25

2.3.2 Analys med Hemocue WBC Diff ........................................................................... 25

2.3.3 Framställning av preparat för manuell differentialräkning av leukocyter ................ 25

2.3.4 Differentialräkning av leukocyter med manuell mikroskopi ................................... 26

2.3.5 Statistiska analyser ................................................................................................ 26

3. RESULTAT ................................................................................................................... 26

3.1 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 .............................................. 26

3.2 Inomserieprecision på Hemocue WBC Diff .................................................................. 33

3.3 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi .................................. 35

4. DISKUSSION................................................................................................................ 39

4.1 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120 .............................................. 39

4.2 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi .................................. 41

4.3 Slutsats ........................................................................................................................ 42

5. TACKORD .................................................................................................................... 43

6. REFERENSER .............................................................................................................. 44

7. BILAGOR ..................................................................................................................... 46

1

FÖRKORTNINGAR

WBC White blood cell, leukocyter

LPK Leukocytpartikelkoncentration

Neutr. Neutrofil granulocyt

Lymf. Lymfocyt

Mono. Monocyt

Eos. Eosinofil granulocyt

Baso. Basofil granulocyt

5-partsdiff Differentialräkning av leukocyter med indelning i

neutrofila granulocyter, lymfocyter, monocyter, eosinofila

granulocyter och basofila granulocyter

MGG May-Grünwald Giemsa

EDTA Ethylenediaminetetra acetic acid, antikoagulansia

ALL Akut lymfatisk leukemi

AML Akut myeloisk leukemi

KLL Kronisk lymfatisk leukemi

PLL Prolymfocytleukemi

KML Kronisk myeloisk leukemi

MDS Myelodysplastiskt syndrom

LUC Stora ofärgade celler

MPXI Myeloperoxidas index

IG Omogna granulocyter

Atypi Atypiska lymfocyter

CCD kamera Charge coupled device kamera

Pixel En punkt med viss färg och placering som bygger upp en

bild

Sd Standardavvikelse

CV Variationskoefficient

R Korrelationskoefficient

R2 Determinationskoefficient

2

1. INTRODUKTION

1.1 Patientnära analysverksamhet

Patientnära analysverksamhet vid vårdcentralslaboratorium kan vara ett

kostnadseffektivt och säkert alternativ till analyser utförda på sjukhuslaboratorier.

Dessa analyser kan ge ett snabbt svar till den kliniskt ansvarige läkaren. Patienten

gynnas genom möjlighet till snabbare behandling eller korrigering av denna. Analys

kan dessutom ske direkt vid provtagning. Det medför snabbare besked för att

meddela analysresultat samt en minskning av väntetid och extra provtagningsbesök

för patienten. Ytterligare en fördel är att det underlättar för patienter som bor långt

bort från sjukhuset eller som har svårt att ta sig till laboratoriet.

Målet med verksamheten är att patientens hälsa skall stå i fokus (1).

Hemocue AB är ett företag som inriktar sig på att utveckla diagnostiska instrument

inom laboratoriemedicin för patientnära analysverksamhet. Genom tillverkning av

laboratoriesystem för mätning av exempelvis hemoglobin- och glukoskoncentration i

helblod, albumin i urin samt blodets koncentration av leukocyter har företaget

bidragit till att utvidga användningsområdet för patientnära analyser. Dessa

instrument kan användas på läkarmottagningar, vårdcentraler, äldreboende,

diabeteskliniker och sjukhusmottagningar (2).

Samtliga produkter är framställda för att användas med Hemocues patentskyddade

mikrokyvetter, som fungerar som både provbehållare och reaktionskammare.

Ungefär 10 µl blod sugs in i kyvetten med kapillärkraft och reaktioner som sker i

kyvetten kan sedan registreras i instrumentet (3).

1.2 Leukocyters bildning och roll i kroppen

Bildningen av leukocyter, leukocytopoesen, sker i benmärgen och stimuleras av olika

cytokiner. Alla blodceller härstammar från en pluripotent stamcell med förmåga till

självförnyelse, proliferation och differentiering. Den pluripotenta stamcellen ger

upphov till nya stamceller med varierande kapacitet till dessa egenskaper. Utifrån

3

myeloida- och lymfoida stamceller utvecklas leukocyterna i olika poeser till olika

mognadsstadier (4).

Leukocyter, vita blodkroppar, delas in i granulocyter, lymfocyter och monocyter.

Granulocyter delas vidare in i neutrofila-, eosinofila- och basofila granulocyter som

alla har olika funktioner. De olika granulocyterna har granula med affinitet för olika

basiska och sura färger, vilket utnyttjas vid morfologisk och maskinell klassifikation

av dem.

Alla leukocyter deltar i immunförsvaret för att skydda kroppen mot infektioner.

Monocyter och neutrofila granulocyter är fagocyterande celler som tar in olika

antigener i sin cytoplasma och förstör dessa med kraftiga enzymer som finns i

granula. Monocyter kan även aktivera lymfocyter, tack vare sin antigenpresenterande

förmåga. Basofila granulocyter agerar vid allergiska reaktioner genom att släppa ut

histamin. Eosinofila granulocyter angriper parasiter genom att fästa sig vid dem och

spruta in giftiga enzymer. De deltar även vid allergiska tillstånd.

Huvudgrupperna av lymfocyter är T-celler (thymus-dependent), B-celler (bursa-

dependent) och NK-celler (natural killer). T-celler delas in i flera undergrupper.

T-hjälpar-cellernas funktion är bland annat att känna igen antigen på

antigenpresenterande celler och att aktivera andra T-celler och makrofager.

Cytotoxiska T-celler dödar infekterade celler som märkts in med antigenpeptider på

ytan. B-celler har förmågan att differentiera till plasmacell när de aktiveras av ett

antigen, och kan då producera antikroppar av olika typer. NK-celler har cytotoxisk

förmåga och kan attackera och döda tumörceller eller celler som angripits av virus

(4).

Totala antalet leukocyter mäts i leukocytpartikelkoncentration x109/L (LPK eller

WBC). En reducering av antalet leukocyter medför en ökad infektionsbenägenhet.

Detta kan ses vid stamcellssjukdomar, HIV och behandling med cytostatika. Ökat

antal leukocyter ses vid bakteriella (neutrofila granulocyter) eller virala infektioner

(lymfocyter) och vid hematologiska sjukdomar (4).

4

Friska vuxna individer har 3,5-8,8x109 leukocyter/L där neutrofila granulocyter och

lymfocyter är de dominerande celltyperna (tabell I). Den procentuella fördelningen

av leukocyter baseras på det totala antalet leukocyter.

Fördelningen av leukocyter hos barn är annorlunda än hos vuxna. Barn har

exempelvis ett högre antal lymfocyter (5,6). Värdena kan variera med ålder,

dygnsvariationer, träning, graviditet, fysisk stress och cigarettrökning (7).

Förstadier eller omogna celler i perifert blod finns normalt inte hos friska människor

(5,6).

Tabell I. Normalvärden för leukocyter hos vuxna individer (5,6)

1.3 Cytokemisk färgning vid manuell bedömning av blod- och benmärgsceller

För att manuellt studera cellmorfologi och kvantifiera celler i blod- och

benmärgsutstryk används cytokemiska färgningar. Färgning av celler och dess

innehåll i kärna och cytoplasma sker baserat på strukturernas kemiska egenskaper.

Cellkärnan och komponenter i cytoplasman har affinitet för olika färger beroende på

pH (8,9).

Färgningstekniken som används mest frekvent på kliniska laboratorier i Sverige är en

Pappenheimfärgning som kallas May-Grünwald-Giemsa (MGG). Med denna metod

sker färgning med en sur (eosin) och en basisk färg (metylenblått) (8,9). May-

Grünwald färgar strukturer i cytoplasman och Giemsa strukturer i cellkärnan.

Basiska komponenter får en blå, blå-grå eller violett färg och sura (acidofila)

komponenter får röd, orange eller rosa färg (8-10).

Celltyp x109/L %

Leukocyter 3,5- 8,8

Neutrofila granulocyter 1,8- 6,8 40- 70

Stavkärnig granulocyt < 0,7 < 5

Eosinofila granulocyter < 0,5 < 5

Basofila granulocyter < 0,2 < 3

Lymfocyter 0,9- 4,0 25- 45

Monocyter 0,2- 0,9 < 10

5

Spädning av MGG och sköljning mellan färgbaden bör ske med fosfatbuffert med

pH 6,8. Denna buffert benämns Sörensens buffert. Kranvatten bör undvikas på grund

av varierande pH som påverkar färgskalan så att cellstrukturer försvagas eller

försvinner.

För att undvika morfologiska förändringar av celler används ett bad med metanol för

fixering. Koncentrerad May-Grünwaldlösningen innehåller tillräckligt med metanol

för att fixering ska ske varför ett särskilt bad för detta ändamål inte behövs. Metanol

skall däremot användas om lösningen är utspädd eller om ett ofärgat preparat ska

sparas (8,9).

Ursprungsreceptet består av koncentrerad May-Grünwald eosinmetylenblått spätt

med koncentrerad metanol och Sörensens buffert, och Giemsalösning med azur-

eosinofil-metylenblått, metanol och Sörensens buffert. Giemsalösningen bör bytas

efter högst 4 timmar för att optimal färgningsintensitet ska uppnås. Reagensinnehåll

och färgningsmetodik kan skilja sig åt mellan olika laboratorium (8,9).

1.4 Leukocytopoesens morfologi i MGG-färgning

1.4.1 Granulocytopoesen

Granulocyter utvecklas i benmärgen från myeloblaster som är 11-20 μm i diameter.

De har en rund blårödlila kärna som är belägen centralt eller excentriskt.

Kärnstrukturen är finmaskig och slät med tydliga nukleoler. Cytoplasman är något

blåaktig och kan innehålla upp till tio azurblåa granula.

Promyelocyten är 11-25 μm i diameter och har en rund eller oval kärna med

nukleoler och en ljus uppklarning intill kärnan i cytoplasman. I den blåtonade

cytoplasman finns primära azurofila granula som innehåller myeloperoxidas,

lysozym och sura hydrolaser (4,11).

Myelocyten är 11-20 μm i diameter. Kärnstrukturen är tätare än hos promyelocyten

och kärnan rund, oval eller svagt bönformad. Nukleoler saknas. Myelocyten

utvecklar sekundära granula innehållande laktoferrin, B12, alkaliskt fosfatas,

lysozym och kollagenas. Den neutrofila myelocyten har stoftfina gråblå eller

6

rosafärgade granula. Den basofila myelocyten har mörkblåvioletta granula som

ligger i cytoplasman och ovanpå kärnan. Eosinofil myelocyten har röd-orange

granulering. Granulas affinitet för olika färger beror på dess innehåll. Neutrofila

granula innehåller peroxidas, kloracetatesteras, surt fosfatas och alkaliskt fosfatas.

Eosinofila granula består av peroxidas och surt fosfatas och basofila granula

innehåller surt fosfatas och klaracetatesteras (4,11).

Metamyelocyten är 11-18 μm i diameter och har en kärna som är brett bönformad.

Den har samma granulering som myelocyten. Primärgranula finns men i mindre

kvantitet.

Den stavkärniga granulocyten är 10-16 μm i diameter med en stavformad kärna.

Kärnstrukturen är grov där den smalaste delen är mer än 1/3 av den bredaste. Granula

är mestadels i form av sekundärgranula men även ett fåtal primärgranula finns. En

ökning av stavkärniga granulocyter och förstadier ses som en vänsterförskjutning och

förknippas med patologiska tillstånd. Normalt utgör stavkärniga granulocyter 0-5 %

av det totala antalet leukocyter i blodet (4,11).

Den segmenterade granulocyten är lika stor som den stavkärniga och har 3-5

mörkblålila kärnsegment som hålls ihop av tydliga filament. Cytoplasman är ljusrosa

med stor mängd ljusblå sekundärgranula och ett fåtal primärgranula (4,11).

I figur 1 nedan visas de olika utvecklingsstadierna från myeloblast till segmenterad

granulocyt.

Figur 1. Granulocytopoesens utvecklingsstadier. a.myeloblast, b. promyelocyt c. myelocyt d.metamyelocyt e.stavkärnig granulocyt f.segmenterad granulocyt (Bilder godkända för användning av Susanne Widell)

7

Om fler än 5 segment förekommer i mer än 5 % av de segmenterade granulocyterna

betraktas det som hypersegmentering, vilket kan förekomma vid B12- eller

folsyrabrist. Färre än 3 segment hos mer än 5 % av de segmenterade granulocyterna

ses som hyposegmentering (pseudo-Pelger kärna), vilket kan ses hos patienter med

Myelodysplastiskt syndrom eller Akut myeloisk leukemi. Eosinofila- och basofila

granulocyter har en kärna uppdelad på 2-3 segment (4,11).

1.4.2 Monocytopoesen

Monoblasten har samma morfologiska utseende som myeloblasten. Dessa kan inte

skiljas åt morfologiskt. Promonocyten har en oregelbunden kärna, stålblågrå

cytoplasma och synliga nukleoler. Karakteristiskt för monocyter är en stor,

oregelbunden kärna, stålblågrå cytoplasma med stoftfina granula och molnliknande

och luckert kromatin (figur 2). Vakuoler är vanligt förekommande i cytoplasman i

venöst blodprov taget i rör med EDTA-tillsats.

Då monocyten vandrar från blodbanan ut i vävnaden kan den omvandlas till

makrofag (4,11).

Figur 2. Olika mognadsstadier hos monocyten. a.monoblast b.mogen monocyt (Bilder godkända för användning av Susanne Widell)

1.4.3 Lymfocytopoesen

Lymfoblaster mognar och differentieras till B-lymfocyter eller T- lymfocyter.

Produktionen av alla lymfocyter sker i benmärgen. Blivande T-lymfocyter får

däremot sin immunologiska kapacitet i thymus.

8

Morfologiskt i blod ses små lymfocyter (8-10 μm i diameter) som karakteriseras av

en mörk och rund kärna med tätt kromatin och en osynlig nukleol och liten mängd

ljus till blåaktig cytoplasma. Stora lymfocyter (12-18 μm i diameter) har rikligare

och ljusare cytoplasma, en mer oregelbunden kärna och några kan ha ett fåtal stora

azurofila granula.

Plasmacellen förekommer normalt inte i blodet hos friska personer. Dess form är

oval och kärnan är oftast belägen i cytoplasmans ena kant. Cytoplasman är mörkblå

med en ljus uppklarning intill kärnan (4,11).

I figur 3 nedan visas lymfocytopoesens utvecklingsstadier från lymfoblast till mogen

lymfocyt och en differentierad plasmacell.

Andra varianter av lymfocyter kan förekomma vid vissa sjukdomstillstånd,

exempelvis vid virussjukdomar som mononukleos och cytomegalvirus (4,11).

Figur 3. Lymfocytopoesens utvecklingsstadier. a. lymfoblast b.liten lymfocyt c. stor lymfocyt d.plasmacell (Bilder godkända för användning av Susanne Widell)

1.5 Störningar i leukocytopoesen

1.5.1 Infektiösa tillstånd

Vid bakteriella infektioner sker en ökad produktion av granulocyter, och framför allt

neutrofila granulocyter. Granulocyter påverkas genom ökad granulering där granula

blir rödfärgade olikstora och reaktiva. I benmärgen sker en ökad produktion av

segmenterade- och stavkärniga granulocyter, som snabbt tar sig ut i blodet. Detta

tillstånd kallas för vänsterförskjutning i differentieringen (12).

9

Vid svåra bakteriella infektioner kan inklusioner ses i granulocyters cytoplasma.

Dessa är runda och gråblå till färgen. De kallas för Döhles kroppar och består av

aggregat av endoplasmatiskt retikel. Dessa kan ses vid exempelvis pneumoni (4).

Vid virusinfektioner ökar istället lymfocyter betydligt. Lymfocyterna har varierande

utseende med olika storlekar, olika mängd cytoplasma och eventuell förekomst av

granula. Reaktiva lymfocyter kan förekomma vid infektioner orsakade av Epstein

Barr virus, och i vissa fall av parasitsjukdomar. I blodet förekommer då atypiska

lymfocyter med oregelbunden kärna, nukleoler och en ökad mängd blåskuggig

cytoplasma. Ofta råder även en relativ granulocytopeni och trombocytopeni (12).

1.5.2 Leukemi

Leukemi är samlingsnamnet på en grupp blodcancersjukdomar. De delas in i akut

eller kronisk leukemi beroende på sjukdomsförlopp, symtom och vilka poeser som är

drabbade (4).

Definitionen av akut leukemi är en expansion av omogna elakartade hematopoetiska

celler i benmärg och perifert blod. Expansionen resulterar i en brist på normala

blodkroppar, vilket yttrar sig i anemi, blödningar och en ökad risk för infektioner (4).

De stora huvudgrupperna inom akut leukemi är akut lymfatisk leukemi (ALL) och

akut myeloisk leukemi (AML). ALL dominerar hos barn, AML hos vuxna. Hos båda

grupperna kan genetiska förändringar påvisas i stamceller. Med kromosomanalyser

kan specifika kromosomrubbningar upptäckas, vilket har prognostisk betydelse.

Karakteristiskt för ALL är en expansion av omogna lymfatiska celler, vilka

morfologiskt ses som blaster i perifert blod. Granulocytopoesen är nedsatt.

Vid AML ses istället en expansion av myeloida celler med blaster i blodet. Ett fynd

som ibland kan hittas är Auerstavar, vilket är aggregat av granula (4).

Kronisk leukemi delas in i kronisk lymfatisk leukemi (KLL) och kronisk myeloisk

leukemi (KML). KLL drabbar ofta äldre och har ett stillsamt förlopp trots att den är

obotlig. Den upptäcks ofta vid utredning av symtom som inte är kopplade till

10

leukemin. Många är symtomfria trots det kraftiga cellantalet i benmärg, blod, mjälte

och lymfknutor.

KLL-cellen är en mogen B-lymfocyt. Inga blaster förekommer i blodet, istället

dominerar mogna lymfocyter. En form av KLL är prolymfocytleukemi (PLL) där

prolymfocyter dominerar.

KML kännetecknas av höga nivåer av granulocyter där alla myeloiska förstadier från

omogen blast till mogen granulocyt påvisas i blodet. Även eosinofila- eller basofila

granulocyter kan öka. Vanliga fynd är även kärnförande erytrocyter på grund av

splenomegali (förstorad mjälte). Philadelphiakromosomen (translokation 9,22) är

något som är diagnostiskt vid KML (4).

1.5.3 Myelodysplastiska syndrom

Myelodysplastiska syndrom (MDS) är en grupp av maligna stamcellssjukdomar med

mognadsstörningar inom en eller flera poeser. Det är sjukdomar som mestadels

drabbar äldre människor.

I blodet råder ofta pancytopeni (brist på alla blodceller) med hypogranulering hos

granulocyter, pseudo-Pelgerkärna och abnorm morfologi hos blodcellerna. För

diagnos krävs anemi samt granulocytopeni eller trombocytopeni.

MDS orsakas av kromosomrubbningar i stamceller till följd av exempelvis

joniserande strålning. Det kan även utvecklas efter cytostatikabehandling.

30 % av patienter med MDS utvecklar AML (4).

1.5.4 Maligna lymfom

Maligna lymfom är en grupp tumörsjukdomar som uppstår i lymfatisk vävnad, där de

sedan kan sprida sig till annan vävnad. Huvudgrupperna utgörs av Hodgkins

sjukdom och Non-Hodgkins lymfom. Vanliga symtom vid dessa sjukdomar är

svullna lymfkörtlar och leukemi-liknade symtom såsom nattliga svettningar, feber

och viktnedgång. Förutom förstorade lymfkörtlar kan även en förstoring av mjälten

förekomma (4).

11

Vid Hodgkins sjukdom påvisas maligna jätteceller, Reed-Sternberg-celler, som ofta

är minoriteten av celler i tumören. I lymfkörtlarna finns förutom tumörceller även

benigna inflammatoriska celler. Dessa utgörs av lymfocyter, neutrofila granulocyter

och plasmaceller. I blodet förekommer leukocytos med en lätt till måttlig ökning av

neutrofila granulocyter. I många fall kan även eosinofila granulocyter öka (4,12).

Non-Hodgkins lymfom delas in i lågmalign och högmalign sjukdom. Vid den

lågmaligna varianten är de lymfatiska cellerna små och liknar morfologiskt normala

lymfocyter. Den vanligaste formen av lågmaligna lymfom är B-KLL-lymfomen.

Patienter med denna typ av lymfom har oftast lång överlevnad.

Vid högmalignt lymfom dominerar blastceller i den lymfatiska vävnaden.

Tumörceller kan i undantagsfall hittas i perifert blod och benmärg. I snittat

benmärgsmaterial kan härdar av blaster och små lymfatiska celler hittas.

Lymfoblastiskt lymfom är ett högmalignt lymfom som har benägenhet att sprida sig

till benmärgen. Det är ett lymfom som kan drabba både barn och vuxna och som kan

vara av både B- och T-cellstyp (4, 12).

1.6 Manuell differentialräkning av leukocyter

För att bedöma kvantitativa förskjutningar mellan leukocyter utförs

differentialräkning av dessa. Det ger en bild av fördelningen mellan de olika

celltyperna, dess differentieringsstadium samt dess morfologi. Det kan vara till hjälp

vid misstanke om infektioner och vid hematologiska utredningar (12).

Differentialräkning av leukocyter kan ske i venöst blod med tillsats av EDTA

(ethylenediaminetetra acetic acid) eller i kapillärt blod taget direkt från

fingerblomman. Blodet stryks i båda fallen ut på ett objektsglas. Utstryket bör utföras

inom 4 timmar för att undvika åldrande av celler och påverkan av EDTA i venösa

prover (till en ökad vakuoliseringsgrad). Blodfilmen skall strykas ut så att den

gradvis övergår till ett tunnare lager där celler kan studeras var för sig och lätt

identifieras. Blodutstryket färgas därefter med May-Grünwald-Giemsa för att

möjliggöra klassifikation av de olika celltyperna (13).

12

Differentialräkning av leukocyter kan utföras manuellt i mikroskop eller maskinellt

med cellräknare. Vid räkning i mikroskop granskas preparatet vid en låg förstoring

för att avgöra om blodfilmen är tekniskt bra struken och att cellerna går att bedöma.

Antalet trasiga celler får överstiga 2 % endast hos patienter med kronisk lymfatisk

leukemi. I annat fall är utstryket inte tekniskt acceptabelt. För närmare granskning av

celler och dess strukturer används 60x eller 100x förstoring med olja.

Vid differentialräkningen granskas preparatet från sidokant till sidokant i ett

encellslager och minst 200 celler bör räknas. Varje cellslag får ett procentuellt värde,

som räknas om till totalantal baserat på totala antalet leukocyter.

Cellerna klassificeras i neutrofila granulocyter, eosinofila granulocyter, basofila

granulocyter, lymfocyter, monocyter, blaster, promyelocyter, myelocyter,

metamyelocyter, stavkärniga granulocyter och eventuella plasmaceller. Skadade och

trasiga celler räknas inte. Förekomst av omogna erytrocyter anges per 100 räknade

leukocyter (13).

Förutom kvantitativa uppskattning av dessa utförs även en kvalitativ bedömning av

leukocyter, erytrocyter och trombocyter. Den kvalitativa bedömningen av

granulocyter utgörs av hypo- eller hypersegmentering, vilket anges om det ses hos

mer än 5 % av cellerna. Hos monocyter anges eventuell abnorm morfologi.

Avvikande former av lymfocyter anges som lymfocyter med variantformer, vilket

anges om de är fler än 5 % av det totala antalet lymfocyter (13).

För bedömning av den röda blodbilden granskas erytrocyternas storlek, form och

innehåll. Normala mogna erytrocyter är bikonkava, kärnlösa och är 7-9 μm i

diameter. I mitten ses en liten ljusuppklarning. Förstadier såsom kärnförande

erytrocyter ska enbart finnas i benmärgen hos friska individer. Fynd av dem i perifert

blod kan vara tecken på en patologisk ökning av erytropoesen eller en extramedullär

blodbildning till följd av splenektomi.

Morfologiska avvikelser kan ske vid infektioner och hematologiska sjukdomar. Vid

macro- och mikrocytos är majoriteten av erytrocyterna större än 9 μm respektive

mindre än 7 μm i diameter. Makrocyter är vanliga fynd vid leversjukdomar,

alkoholism, megaloblastisk anemi och MDS. Mikrocytos förekommer vid järnbrist.

13

Innehållsatypier utgörs av hypo- eller polykromasi. Vid hypokromasi ses en större

uppklarning i cellens mitt till följd av minskat hemoglobininnehåll. Polykromasi

kännetecknas av olikfärgade erytrocyter med inkomplett utfyllnad av hemoglobin.

Dessa är ofta retikulocyter, omogna erytrocyter.

Anisocytos innebär en storleksvariation bland erytrocyterna. Vid poikilocytos har

erytrocyterna olika former. Ovala celler kan förekomma vid megaloblastisk anemi.

Sfäriska celler är ofta mikrocyter och kan hittas vid hemolytisk anemi eller hos

individer efter blodtransfusion. Skärvor av celler kallas sickelceller och ses hos

patienter med sickelcellsanemi. Droppformade celler (teardrops) är karakteristiskt för

myelofibros. Targetceller är makrocyter som har en ökad infärgning i mitten. De ses

vid leversjukdomar och thalassemi.

Erytrocyter kan även ha inklusioner i cytoplasman. Howell-Jolly kroppar är fragment

av kärnmaterial som ses som en röd rund inklusion. Dessa kan ses vid hemolytisk

anemi. Basofil punktering är mörkblå korn som är aggregat av ribosomer. Dessa

förekommer vid hemolytisk anemi och blyförgiftning (4).

Kvalitativa störningar av trombocyter utgörs av trombocytopeni, trombocytos samt

avvikande former. Vid den kvalitativa bedömningen anges även förekomst av

aggregat (13).

1.7 Maskinell differentialräkning av leukocyter

1.7.1 Allmänt om automatiska cellräknare

Införande av automatiska cellräknare har haft stor betydelse inom vården.

Informationen om olika analyter och betydelsen för dess förekomst har ökat och

analysresultat har kunnat levereras snabbare än tidigare (14).

Med cellräknare som analyserar blodceller i helblod erhålls information både

kvantitativt och kvalitativt. Den kvalitativa informationen består av analytisk

interferens och förekomst av abnorma celltyper som påträffas vid patologiska

14

tillstånd. Dessa celler kan bestå av blaster, omogna erytrocyter eller granulocyter och

atypiska lymfocyter (14).

Den analytiska prestandan hos cellräknare bedöms genom precision, noggrannhet

och klinisk sensitivitet. Precisionsstudier kan ge information om resultatens variation

genom mätningar i en serie. Vid tolkning av analysresultat är det viktigt att känna till

att prover kan påverkas av variationer vid hanteringen innan analys samt i själva

analysprocessen.

Noggrannhet i en serie mätningar handlar om hur nära analysresultatet ligger det

sanna värdet. Det har betydelse då varje individuellt analysresultat ska placeras inom

ett referensintervall där det finns övre och lägre gränser för normalintervall. Låg

noggrannhet medför en lägre känslighet.

Klinisk sensitivitet är instrumentets förmåga att skilja på normala och patologiska

prover. Klinisk specificitet definieras som andelen patienter med känd sjukdom som

får sant resultat med metoden som testas.

Många cellräknare som analyserar blodstatus och differentialräkning av leukocyter

har förmågan att upptäcka omogna eller patologiska celler och anger en förekomst av

dessa genom larmfunktioner. Därmed är den kliniska sensitiviteten vanligtvis hög.

Brister kan finnas i den kliniska specificiteten, exempelvis då larm om patologiska

celler kan visa sig vara normala celler vid kontroll i mikroskop (14).

Automatiska cellräknare som utför differentialräkning av leukocyter ska kunna

påvisa kvantitativa förändringar hos en normal population av leukocyter samt

upptäcka morfologiskt avvikande former. Detta innefattar identifiering av omogna

eller atypiska celler. De har inte förmågan att klassificera dem, men ger larm vid

förekomst av dem.

Cellräknare räknar tusentals celler i ett prov. Resultatet ges ut både i procent och som

absolut värde. Vid manuell mikroskopering räknas 100-200 celler i ett blodutstryk.

Det kan ha sina nackdelar i att celler kan fördelas olika i preparatet och att

fördelningen blir annorlunda. Bedömningen kan dessutom skilja sig åt mellan två

individer. Som bedömare krävs kunskaper om morfologin hos både normala och

patologiska celler samt kunskap om metodikens begränsningar (14).

15

1.7.2 Advia 2120

Cellräknaren Advia 2120 (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA) är

ett diagnostiskt instrument för helblodsanalyser av blodstatus, retikulocyter och

differentiering av leukocyter (5-partsdiff). Vid 5-partsdiffen anges fördelningen av

neutrofila granulocyter, basofila granulocyter, eosinofila granulocyter, lymfocyter

och monocyter (6).

Instrumentet består av en analysatordel och en datastation med monitor.

Analysatordelen består av aspirationsenheter, optiska enheter (perox- och laseroptik

samt hemoglobin-kolorimeter), UFC-block (unified fluids circuit), pumpar för prov,

reagens och tvättlösning, vakuum- och tryckregulatorer, en blodventil, en

manöverpanel och ett avfallssystem. UFC-blocket består av akrylplattor som

innehåller fyra reaktionskammare samt vägar för vätske- och luftflöde och ventiler.

Bakom blocket finns en reagenspump (15).

För analys krävs venöst helblod med tillsats av EDTA(K2) eller kapillärblod. Provet

kan aspireras på tre olika sätt; i en provväxlare i slutet system, manuellt öppet eller

manuellt slutet. 175 μl blod aspireras och förs till blodventilen, som roterar och

späder provet med respektive reagens. Blandningen av prov och reagens fördelas till

respektive reaktionskammare, där en cytokemisk reaktion sker. Suspensionen förs till

en flödescell för analys, därefter till slasken och respektive kanal sköljs.

Analysresultatet skickas till instrumentdatorn för bedömning (6,15).

Differentialräkning av leukocyter med Advia 2120 sker genom två skilda metoder.

För beräkning av det absoluta och procentuella antalet basofila granulocyter används

Basofil/lobularitetsmetoden. Metoden bygger på att celler belyses med laser, vilket

resulterar i ljusspridning från en hög och en låg vinkel baserat på cell- eller

kärnstorlek respektive kärnkonfiguration. De optiska signalerna omvandlas till

elektriska pulser av fotodioder. Pulserna sammanställs i ett cytogram som visar

ljusspridningen vid hög och låg vinkel (figur 4). Signaler vid hög vinkel visas på x-

axeln och står för kärnans konfiguration. Signaler från låg vinkel visas på y-axeln

och visar cellens storlek. Olika celltyper hamnar i olika populationer och särskiljs i

16

brus (t ex skräp, icke-lyserade erytrocyter), mättnad (t ex luftbubblor), blastkärnor,

monocyt- och lymfocytkärnor, kärnor från neutrofila- och eosinofila granulocyter

och intakta basofila granulocyter.

Figur 4. Baso cytogram från Advia 2120. 1. Brus 2. Blast 3. Monocyter och lymfocyter 4. Basofila granulocyter 5. Misstänkt basofil granulocyt 6. Mättnad 7. Neutrofila- och eosinofila granulocyter (Cellbilder godkända för användning av Susanne Widell)

För beräkning av resterande neutrofila granulocyter, eosinofila granulocyter,

lymfocyter och monocyter används Peroxidasmetoden, där celler belyses med en

halogenlampa. Ljusspridning sker vid låg vinkel, baserat på peroxidasinnehåll, och

vid hög vinkel, baserat på cellstorlek. Data registreras och sammanställs i ett

cytogram med cellstorlek på y-axeln och peroxidasaktivitet på x-axeln (figur 5).

Lymfocyter, basofila granulocyter och stora ofärgade celler (LUC) innehåller inte

peroxidas och förblir ofärgade och hamnar i cytogrammets vänstra del. LUC kan

utgöras av blaster, atypiska lymfocyter eller plasmaceller. Neutrofila granulocyter

har hög peroxidasaktivitet och är stora celler, så de hamnar i cytogrammets övre

högra del. Med hjälp av cytogrammet kan även brus, kärnförande erytrocyter och

trombocytaggregat identifieras. Med Peroxidasmetoden kan även MPXI

(myeloperoxidase index), vilket kan ge en indikation om granulocyter har brist på

endogent myeloperoxidas (6,15).

17

Figur 5. Perox cytogram från Advia 2120. 1. Brus 2. Kärnförande erytrocyter 3. Trombocytaggregat 4. Lymfocyter och basofila granulocyter 5. LUC 6. Monocyter 7. Neutrofila granulocyter 8. Eosinofila granulocyter (Cellbilder godkända för användning av Susanne Widell)

Med båda metoderna kan det totala antalet leukocyter beräknas med hjälp av de två

cytogrammen. Ett värde erhålls från respektive kanal. I första hand lämnas resultatet

ut från Baso-kanalen (6).

Advia 2120 har larmfunktion för onormala prover. Atypiska lymfocyter (Atypi) och

omogna granulocyter (IG) graderat plus 1 kan uppkomma då provet är gammalt.

Larm om förekomst av blaster, Atypi och IG 2-3 och kärnförande erytrocyter kräver

manuell eller maskinell differentialräkning av leukocyter. Om antalet kärnförande

erytrocyter överstiger 10 % av det totala antalet leukocyter bör detta värde räknas om

efter manuellt mikroskopi.

Manuell mikroskopi utförs även vid LUC över 6 % eller 0,4x109/L, MPXI mer än +/-

25 (tyder på myeloperoxidasbrist) och basofila granulocyter över 5 % av totala

antalet leukocyter (6).

18

1.7.3 Hemocue WBC Diff

Hemocue White Blood Cell (WBC) Diff (Hemocue AB, Ängelholm, Sverige) utför

kvantitativ bestämning av totala antalet leukocyter och differentialräkning av dessa i

kapillärt eller venöst blod. Instrumentet är utformat för användning inom patientnära

verksamhet för analys på både barn och vuxna. Det är fabrikskalibrerat och kräver

minimalt med underhåll samt är enkelt att arbeta med. Analysresultat visas inom 5

minuter och uttrycks både i procent och som absolut värde (7).

Instrumentet är avsett att användas med Hemocue WBC Diff mikrokyvetter. Även

Hemocues WBC mikrokyvetter för analys av totala antalet leukocyter kan användas.

Mikrokyvetten är engångsmaterial och består av polystyren. 10 µl blod krävs för

analys och kan tas direkt från fingerblomman eller från ett venöst provrör

innehållande antikoagulantia. Provet ska analyseras inom 8 timmar efter

provtagningen. Venösa prover blandas 1-2 minuter på rullblandare eller manuellt

genom att röret vänds 10-20 gånger (7).

För analys av ett prov sugs blod in i kyvetten med kapillärkraft. I kyvetten

hemolyseras erytrocyter av saponin och leukocytkärnor färgas in med metylenblått. I

mikrokyvetten finns surfynol 465 och triton x-100, vars funktioner är att minska

ytspänningen (7,16,17).

Mikrokyvetten skall placeras i instrumentet inom 40 sekunder efter att den fyllts. I

instrumentet scannas området i kyvetten, ca 140 µm, av en charge coupled device

(CCD) kamera. Kameran rör sig 5 µm åt gången, fokuserar in på celler och tar 37

bilder som sätts samman i en bild där sedan varje cell scannas (7).

Kameran scannar av färgintensiteten hos cellerna och mäter den optiska densiteten,

förmågan att absorbera ljus, i olika punkter (pixlar) på dessa. Färgskalor omvandlas

därefter till gråskalor från 0 (vitt) till 4 (kraftigt infärgad). Varje cell får ett specifikt

mönster som kan jämföras med celler i ett referensbibliotek. Det inlagda

referensbiblioteket har över 50 000 celler som manuellt klassificerats.

Referenscellernas form och färgintensitet har tagits fram och tränats i ett neuralt

nätverk, där algoritmer används för att känna igen ett specifikt mönster. Varje cell i

19

referensbiblioteket har en specifik optisk densitet (7,18). Information om

mätprincipen har verifierats av Stellan Lindberg på Hemocue AB.

Metoden är mycket lik den som används av Cellavision Diffmaster (Cellavision AB,

Lund, Sverige) med samma analysprincip (19).

Värden som ges ut är totala antalet leukocyter, neutrofila granulocyter, lymfocyter,

monocyter, eosinofila granulocyter och basofila granulocyter.

Mätintervallet för totala antalet leukocyter är 0,3-30,0x109/L. Differentialräkning

visas när totala antalet leukocyter är 1.0-30,0x109 /L. Det nedre mätvärdet för

neutrofila granulocyter är 0,8x109/L, för lymfocyter 0,3x109/L och för resterande

leukocyter 0,0x109/L. De högsta mätvärdena är 30,0x109/L för neutrofila

granulocyter och lymfocyter, 5,0x109/L för monocyter, 1,5x109/L för eosinofila

granulocyter och 1x109/L för basofila granulocyter.

Resultat som ligger över mätintervallet svaras ut som HHH och resultat under

mätintervallet visas som LLL. Vid patologiska tillstånd med förekomst av omogna

eller atypiska celler erhålls enbart värdet för totala antalet leukocyter. För

differentialräkning av dessa ska provet kontrolleras på ett sjukhuslaboratorium för att

utreda orsaken till larmet.

Larm kan även visas om analysen inte utförts på grund av mätningsfel då bilden är

oskarp, om ljusstyrkan är otillräcklig eller om batterispänningen är för låg. Vid

resultat som är högre eller lägre än förväntade resultat kan orsaken vara felaktig

provtagning, felaktig förvaring av prov eller att mikrokyvetten är skadad eller

gammal (7).

Kända interferenser som har uppmärksammats är hos patienter som har mer än 2 %

kärnförande erytrocyter. Hos dessa patienter kan det totala antalet leukocyter bli

falskt förhöjt (7). Inom en snar framtid kommer Hemocue att förbättra instrumentets

förmåga att skilja på omogna erytrocyter och ett larm kommer att finnas för detta

ändamål.

Till instrumentet kan skrivare, tangentbord, streckkodsläsare och dator kopplas för

att underlätta inmatning av patient-ID och överföring av resultat för bedömning (7).

20

1.8 Syfte

Syftet med arbetet var att undersöka korrelationen av analysresultat gällande

differentialräkning av leukocyter i venöst blod mellan Hemocue WBC Diff och

Advia 2120 samt differentialräkning av leukocyter i kapillärt blod mellan Hemocue

WBC Diff och manuell mikroskopi.

2. MATERIAL OCH METODER

2.1 Provmaterial

2.1.1 Provmaterial för jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120

Provmaterialet var i form av rumstemperarade venösa blodprover med tillsats av

EDTA (K2) som antikoagulantia. 62 venösa patientprover med en spridning i

leukocytnivåer valdes ut. Av dessa 62 prover utgjordes 15 stycken av prover tagna

inom primärvården, resterande hade tagits på sjukhusets avdelningar och

mottagningar. De flesta prover kom från vuxna män och kvinnor i åldrarna 17-86 år,

endast ett fåtal från barn i åldrarna 10-16 år. Alla prover kom från patienter med

okänd anamnes.

De olika leukocytnivåerna låg på 2,1-5,0x109/L, 5,1-11,0x109/L samt 11,1-25x109/L.

Prover valdes ut så att 32 % av proverna som analyserades låg på den lägsta nivån, ca

48 % på den mellersta nivån och ca 19 % på den högsta nivån.

De första fem proverna kördes som dubbelprover på båda instrumenten för att

utesluta att någon signifikant skillnad i analysresultat fanns vid analys av samma

prov. Resterande prover analyserades som enkelprover. Analyserna utfördes inom 8

timmar efter provtagningen. Differentialräkning av leukocyter utfördes på båda

instrumenten och utfördes inom 8 timmar efter provtagningen. Tiden mellan

analyserna på respektive instrument översteg inte 2 timmar.

21

2.1.2 Provmaterial för jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell

mikroskopi

Underlaget för studien var 20 kapillära prover som togs på vuxna individer. Dessa

var män och kvinnor i åldrarna 23-65. Samtliga personer betraktades som friska.

2.2 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120

2.2.1 Analys med Hemocue WBC Diff

Provet vändes manuellt 10-12 gånger för hand. Med hjälp av en 25 µl mikrokapillär

togs blod från röret och placerades på en plastbit med hydrofob yta. Hemocue WBC

Diff mikrokyvett fylldes i ett moment genom att spetsen hölls i ca 45o vinkel mot

bloddroppen. 10 µl blod sögs in i mikrokyvetten med kapillärkraft. Överskott av blod

torkades bort från mikrokyvettens utsida med en luddfri tork. Kyvetten

kontrollerades att den inte hade förekomst av luftbubblor och placerades därefter i

kyvetthållaren inom 40 sekunder efter fyllningen. Kyvetthållararmen fördes mot

mätläget och kyvetthållaren gled in i instrumentet för mätning (7).

I kyvetten hemolyserades erytrocyter med saponin (500 µg/g). Metylenblått (20

µg/g) färgade in leukocyternas cellkärnor. I instrumentet scannade CCD kameran

området i kyvetten. Matematiska beräkningar och jämförelse med referensceller

användes för identifiering av leukocyter (7).

2.2.2 Analys med Advia 2120

Provet vändes manuellt 10-12 gånger och ca 175 µl blod aspirerades därefter i

manuellt slutet system. Provet fördes till blodventilen för spädning med reagens (6).

För att beräkna det totala antalet leukocyter från Baso-kanalen och det absoluta och

procentuella antalet basofila granulocyter användes Basofil/lobularitetsmetoden. För

lysering av erytrocyter och trombocyter tillsattes Baso reagens innehållande saltsyra

(9 mmol/L), ftalsyra (21,5 mmol/L), konserveringsmedel och surfaktant.

22

Behandlingen med reagenset och en temperaturhöjning till 32-34o C i

reaktionskammaren resulterade i att alla leukocyter utom basofila granulocyter

förlorade cytoplasman. Cellsuspensionen passerade flödescellen, där cellerna

belystes med laseroptik. Ljusspridning skedde från hög (5-15 o) och låg vinkel (2-3 o)

baserat på storleken på cellen eller kärnan och kärnans konfiguration. Med hjälp av

fotodioder omvandlades de optiska signalerna till elektriska pulser. Beräkning av

basofila granulocyter och det totala antalet leukocyter skedde utifrån Baso-

cytogrammet som framställdes genom tolkning av de elektriska pulserna (6,12).

För beräkning av totala antalet leukocyter från Perox-kanalen, lymfocyter,

monocyter, neutrofila granulocyter, eosinofila granulocyter, LUC och MPXI

användes Peroxidasmetoden. Erytrocyter och trombocyter lyserades med Perox 1

reagens innehållande natriumdodecylsulfat (0,36 mmol/L), sorbitol (620 mmol/L),

natriumklorid (8,4 mmol/L) och formaldehyd (5,7 %). För att underlätta lyseringen

skedde en temperaturökning till 64-72o C i reaktionskammaren. Leukocyterna

fixerades av formaldehyd. Färgning skedde med Perox 2 och Perox 3 reagens. Perox

2 reagensets innehåll av 4-kloro-1-naftol (44,8 mmol/L) agerade substrat för

väteperoxiden (0,3 %) i Perox 3 reagenset, vilket gjorde att en mörk fällning bildades

vid närvaro av endogen peroxidasaktivitet i cellers granula.

Cellsuspensionen från reaktionskammaren fördes till flödeskyvetten där celler

belystes med en halogenlampa. Absorption, till följd av cellens peroxidasinnehåll,

mättes vid 0-10 o vinkel och ljusspridning, baserat på cellstorlek, mättes vid 5-15 o

vinkel.

För identifiering och beräkning av totala antalet leukocyter, lymfocyter, monocyter,

neutrofila granulocyter, eosinofila granulocyter, LUC och MPXI användes Perox-

cytogrammet (6,12).

2.2.3 Manuell kontroll av prover efter larm från Hemocue WBC Diff

En del av de prover som analyserades på Advia 2120 utan larm och som vid analys

med Hemocue WBC Diff fick larm och därmed inga värden på differentialräkningen

av leukocyter, plockades ut för kontroll med mikroskopi för att undersöka

23

anledningen till larmet. Samtliga prover hade leukocytvärden mellan 11,0 och

25,0x109/L och alla hade ökat antal neutrofila granulocyter.

Total fyra prover (prov 63-66) plockades ut för manuell mikroskopi. Av dessa var

det ett prov som hade tagits inom primärvården (prov 63), resterande kom från

sjukhusets avdelningar och mottagningar. Ytterligare fem prover (prov 67-71)

kontrollerades av en legitimerad biomedicinsk analytiker på Hemocues laboratorium.

Dessa prover var alla tagna på sjukhuset.

Blodutstryk framställdes på objektsglas med en automatisk diffstrykare, Hemaprep. 5

µl blod applicerades några mm från klarglasets övergång till mattrand. Då

diffstrykarens spak drogs ner fördes utstrykningsglaset mot bloddroppen, som flöt ut

utmed objektsglasets kant. Då spaken släpptes ströks blodet ut med en jämn och

snabb rörelse och bildade en blodfilm som gradvis övergick från tjock till tunn film

och hade en småfransig avslutning (20).

Glasen lufttorkades och färgades därefter med May-Grünewald-Giemsa pH 6,8,

innehållande ospädd May-Grünewaldlösning och Giemsa brukslösning som spätts

1/50 med Sörensens buffert. Vid färgningen placerades objektsglasen i ett ställ som

ställdes ner i en bägare med metanol för fixering i 5 minuter. Därefter färgades de i

en bägare med May-Grünewaldlösning 1 minut, sköljdes av i vatten och färgades

med Giemsa i 25 minuter. Efter färgningen sköljdes glasen av med vatten och

ställdes för att lufttorka vid en fläkt (10).

Vid kontroll av proven användes ett ljusmikroskop med 50x och 100x förstoring med

immersionsolja (20). Prov undersöktes med avseende på förekomst av omogna celler

eller celler med förändrad morfologi. Vid förekomst av ökat antal stavkärniga

granulocyter utfördes differentialräkning av 200 leukocyter och antalet stavkärniga

granulocyter kunde uppskattas.

2.2.4 Kvalitetssäkring

Interna kvalitetskontroller används för att kontrollera att analysresultat ligger inom

området som man för metoden kalibrerat. Dagliga analyser ger en uppfattning om

24

spridning av mätresultat finns i metoden och om instrumentet fungerar och ger rätt

analyssvar (21).

De interna kvalitetskontrollerna på Advia 2120 ligger på tre nivåer; en låg (AD1), en

normal (AD2) och en hög (RET H). De analyseras varje morgon, efter byte av

reagens och efter att instrumentet gått i standbyläge. Även en normalkontroll från

blodgivare används. Den agerar som slask och pool. Poolens analysresultat jämförs

mellan de två Advia-instrumenten på laboratoriet (6).

Externa kvalitetskontroller skickas kontinuerligt från Equalis och används för att

kontrollera att metoderna på olika laboratorier både nationellt och internationellt

överensstämmer och att de håller rätt kvalité (21). Externa kontroller analyseras tio

gånger om året och utgörs av färskt EDTA-blod (6).

Kvalitetskontroller på Hemocue WBC Diff utgörs av ett automatiskt självtest som

utförs vid start av instrumentet och efter varje mätning för att kontrollera prestandan.

För varje mätning kontrolleras hantering av prov och mikrokyvett, provet,

mikrokyvetten och analyzern. Om kvalitetskontrollen misslyckas anges detta genom

ett felmeddelande. I instrumentet finns inlagda referensceller som jämförs med

provets celler, vilket fungerar som en kontroll vid analys (7).

2.2.5 Statistiska analyser

För att utvärdera resultaten av de venösa proverna som hade analyserats på Hemocue

WBC Diff och på Advia 2120 gjordes en metodjämförelse i Excel där data plottades

i ett diagram med regressionslinje med beräkning av korrelation. För att undersöka

eventuella systematiska fel (bias) i form av metodfel eller instrumentala fel, gjordes

en uppskattning av bias enligt National Committee for Clinical Laboratory Standards

EP9-A (22).

För att undersöka metodens variation inom en mätserie utfördes inomserieprecision

på Hemocue WBC Diff (21). Två patientprover med leukocytvärden på en hög och

en låg nivå valdes ut och analyserades i en serie med 20 replikat. Den höga nivån

25

hade totala leukocyter på 11,5x109/L och den låga nivån 3,1x109/L. Resultaten

sammanställdes i Excel där medelvärde, standardavvikelse (Sd), variationskoefficient

(CV) och variationsvidd beräknades.

2.3 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi

2.3.1 Provtagning

Fingertoppen rengjordes med desinfektionsmedel, som sedan fick lufttorka. Prov

togs vid sidan av fingerblomman med en lancett med 2 mm stickdjup. De tre första

dropparna torkades bort. För att få en tillräckligt stor droppe pressades tummen i

riktning mot fingertoppen (7).

2.3.2 Analys med Hemocue WBC Diff

Mikrokyvetten fylldes i ett enda moment genom att kyvettspetsen hölls i ca 45o

vinkel mot bloddroppen. 10 µl blod sögs in i mikrokyvetten med hjälp av

kapillärkraft. Överskott av blod torkades bort från mikrokyvettens utsida med en

luddfri tork. Kyvetten kontrollerades att den inte hade förekomst av luftbubblor. Den

placerades sedan i kyvetthållaren inom 40 sekunder efter fyllningen.

Kyvetthållararmen fördes mot mätläget och kyvetthållaren gled in i instrumentet för

mätning. Analys utfördes enligt tidigare beskrivning (7).

2.3.3 Framställning av preparat för manuell differentialräkning av leukocyter

Med hjälp av en mikrokapillär togs blod från fingerblomman (20). Två blodutstryk

gjordes per prov. Blodutstryk och färgning av dessa utfördes enligt tidigare

beskrivning.

26

2.3.4 Differentialräkning av leukocyter med manuell mikroskopi

Manuell differentialräkning utfördes i ljusmikroskop med 50x och 100x förstoring

med immersionsolja. 100 celler räknades per glas. Totalantalet av varje celltyp togs

fram genom att den procentuella fördelningen av respektive celltyp räknades om

baserat på det totala antalet leukocyter, som erhållits från Hemocue WBC Diff (20).

2.3.5 Statistiska analyser

Resultaten av differentialräkningen av leukocyter med Hemocue WBC Diff och

manuell mikroskopi sammanställdes i Excel. En regressionslinje bestämdes och en

uppskattning av bias utfördes enligt National Committee for Clinical Laboratory

Standards EP9-A (22).

3. RESULTAT

3.1 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120

Korrelation sågs vid låga såväl som förhöjda nivåer av totala antalet leukocyter med

en korrelationskoefficient, R, på 0,99 (figur 6). Figur 7 visar uppskattning av det

systematiska felet, bias. Större spridning av värdena ses vid högre leukocytnivåer.

Figur 6. Resultatet av totala antalet leukocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff i absoluta tal (109/L)

27

Figur 7. Resultatet av uppskattning av bias gällande totala antalet leukocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff Korrelationen mellan instrumenten vid analys av neutrofila granulocyter var mycket

god, 0,99. Resultaten överensstämde något sämre vid högre nivåer, (figur 8). Figur 4

visar uppskattningen av bias gällande neutrofila granulocyter. Bäst resultat sågs vid

värden som låg inom referensområdet, 1,8-6,8x109/L. Vid högre värden sågs högre

variation mellan instrumenten. Spridningen i analysresultat var mindre gällande

neutrofila granulocyter än spridningen för totala antalet leukocyter (figur 9).

Figur 8. Resultatet av antalet neutrofila granulocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff i absoluta tal (109/L)

28

Figur 9. Resultatet av uppskattning av bias gällande neutrofila granulocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff En god korrelation sågs även vid beräkning av lymfocyter (0,99). Få höga värden

erhölls i studien så därför låg få värden i det övre referensområdet på 4,0x109/L. En

patient visade mycket högre värde än övriga på båda instrumenten. Detta värde,

13,3 x109 lymfocyter/L på Advia 2120, blev 13,2 x109 lymfocyter/L på Hemocue

WBC Diff. När detta värde räknades bort blev korrelationskoefficienten 0,94.

Höga värden skiljde sig inte mer åt mellan instrumenten än vad de lägre värdena

gjorde. Detta kan ses i figur 11, där skillnad i analysresultat ses både på låga och

något högre nivåer.

Figur 10. Resultatet av antalet neutrofila granulocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff i absoluta tal (109/L)

29

Figur 11. Resultatet av uppskattning av bias gällande lymfocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff Vid beräkningen av monocyter sågs ingen korrelation mellan instrumenten.

Spridningen av analysresultaten mellan instrumenten blev hög. Detta gav en

korrelationskoefficient på 0,44 där få punkter låg på regressionslinjen (figur 12).

Differensen mellan analysresultaten var större än för övriga leukocyter och fanns på

både höga och låga nivåer. De flesta punkterna i bias-diagrammet i figur 13 ligger

samlade kring y-axelns 0-linje.

Figur 12. Resultatet av antalet monocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff i absoluta tal (109/L)

30

Figur 13. Resultatet av uppskattning av bias gällande monocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff

En viss överensstämmelse av eosinofila granulocyter sågs mellan de båda

instrumenten (figur 14). Korrelationen var 0,84. Punkterna var spridda kring

regressionslinjen. De flesta värden som låg på linjen, eller precis vid den, var låga.

En punkt avvek mer än övriga. Advia 2120 bestämde totala antalet eosinofila

granulocyter i detta prov till 0,50x109/L medan Hemocue WBC Diff gav ett värde på

0,12x109/L. Det systematiska felet var lågt då differensen mellan analysresultaten var

liten (figur 15).

Figur 14. Resultatet av antalet eosinofila granulocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff i absoluta tal (109/L)

31

Figur 15. Resultatet av uppskattning av bias gällande eosinofila granulocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff Många prover hade lågt antal basofila granulocyter som svarades ut som mindre än

0,1x109/L. I figur 16 och 17 ses resultat från totalt 27 prover. Ingen korrelation sågs

(0,2).

Figur 16. Resultatet av antalet basofila granulocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff i absoluta tal (109/L)

32

Figur 17. Resultatet av uppskattning av bias gällande basofila granulocyter vid differentialräkning med Advia 2120 och Hemocue WBC Diff Prover som plockades ut för kontroll i mikroskop hade inga larm vid analys med

Advia 2120. Advias resultat för dessa prover visas i tabell II. Hemocue WBC Diff

gav enbart ut värden för totala antalet leukocyter. För proverna 63-71 var dessa

värden 10,3x109/L, 11,6 x109/L, 11,6 x109/L, 11,8 x109/L, 16,7 x109/L, 18,0 x109/L,

17,8 x109/L, 24,8 x109/L respektive 10,4 x109/L. Dessa stämde bra överens med

totala antalet leukocyter som beräknats av Advia 2120.

Tabell II. Resultatet av differentialräkning av leukocyter för prov 63-71 med Advia 2120 Prov WBC

(109/L)

Neutr.

(109/L)

Lymf.

(109/L)

Mono.

(109/L)

Eos.

(109/L)

Baso.

(109/L)

63 11,9 8,8 1,8 0,7 0,2 0,1

64 12,5 9,3 1,9 0,9 0,2 0,1

65 12,8 10,6 1,6 0,5 0,0 0,0

66 10,8 8,6 0,9 0,8 0,2 0,0

67 16,7 15,3 0,7 0,4 0,1 0,1

68 19,8 18,0 0,8 0,7 0,0 0,0

69 18,3 15,0 2,1 1,0 0,1 0,0

70 25,4 20,8 3,5 0,6 0,2 0,1

71 11,2 8,5 1,8 0,7 0,0 0,0

33

Totala antalet leukocyter i prov 63 var 10,3 x109/L, och en liten ökning kunde ses av

neutrofila granulocyter. Vid kontroll i mikroskop sågs enstaka stavkärniga neutrofila

granulocyter och en delvis granulafattig myelopoes.

Maskinell differentialräkning av leukocyter i prov 64 och 65 gav samma mönster

som för prov 63. Vid manuell mikroskopi av prov 64 sågs en myelopoes med delvis

ökad granulering. Prov 65 hade 1,2x109 stavkärniga granulocyter/L vid

differentialräkning i mikroskop. Antalet neutrofila granulocyter var 9,5 x109/L,

lymfocyter 1,7 x109/L, monocyter 0,5 x109/L samt eosinofila- och basofila

granulocyter 0,1 x109/L vid räkning i mikroskop.

Prov 66 hade förhöjda neutrofila granulocyter och antalet lymfocyter låg vid den

nedre gränsen av det normala intervallet. Resterande leukocyter låg på normal nivå.

Manuell mikroskopi visade inget onormalt.

Prov 67 och 68 hade förhöjda neutrofila granulocyter, lite kraftigare ökning än de

ovanstående proverna, och ett reducerat antal lymfocyter. Manuell mikroskopi av

prov 67 visade många stora trombocyter och aggregat av dessa samt några enstaka

myelocyter. I prov 68 kunde atypiska monocyter ses.

Prov 69 hade förhöjda neutrofila granulocyter och en liten förhöjning av monocyter.

Mikroskopisk undersökning av provet visade en del stora trombocyter samt enstaka

myelocyter.

Prov 70 och 71 hade enbart förhöjda neutrofila granulocyter. Inget onormalt kunde

ses vid manuell mikroskopi.

3.2 Inomserieprecision på Hemocue WBC Diff

Studie av repeterbarhet på Hemocue WBC Diff med inomserieprecision av

patientprover på hög och låg nivå gav bra resultat för totala antalet leukocyter,

neutrofila granulocyter och lymfocyter (tabell III och VI).

34

Tabell III. Resultat av inomserieprecision vid 20 mätningar av ett patientprov på hög nivå med totala antalet leukocyter på 11,5x109/L

Celltyp Medelvärde

(109/L)

Sd

(109/L)

CV

(%)

Variationsvidd

(109/L)

WBC 11,50 0,33 3 1,40

Neutr. 9,60 0,28 3 1,20

Lymfocyter 1,30 0,11 9 0,40

Monocyter 0,50 0,07 15 0,30

Eos. 0,10 0,0 36 0,10

Baso. 0,0 0,02 447 0,10

Tabell IV. Resultat av inomserieprecision vid 20 mätningar av ett patientprov på låg nivå med totala antalet leukocyter på 3,1x109/L

Celltyp Medelvärde

(109/L)

Sd

(109/L)

CV

(%)

Variationsvidd

(109/L)

WBC 3,44 0,18 5 0,70

Neutr. 1,93 0,15 8 0,60

Lymfocyter 1,09 0,11 10 0,40

Monocyter 0,25 0,05 21 0,10

Eos. 0,15 0,05 35 0,10

Baso. 0,01 0,02 447 0,10

Totala antalet leukocyter hade låg standardavvikelse (0,33 och 0,18 x109/L),

variationskoefficient (3 och 5 %) och variationsvidd (1,4 och 0,7 x109/L) både på

hög och låg nivå. Variationsvidden var lägre på låg nivå.

Neutrofila granulocyter på låg nivå hade något högre variationskoefficient (8 %) än

neutrofila granulocyter på hög nivå (3 %). Variationsvidden var lägre på låg nivå (0,6

x109/L) än på hög nivå (1,2 x109/L).

Variationskoefficienten ökade ytterligare något för lymfocyter och monocyter

samtidigt som variationsvidden minskade. Värdena för eosinofila- och basofila

granulocyter skiljde sig inte mycket åt och värdena varierade inte heller mycket då

hög och låg nivå jämfördes. Variationskoefficienten hos dessa två parametrar var

mycket hög, 447 %.

35

3.3 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi

Korrelationen av analysresultat gällande neutrofila granulocyter mellan Hemocue

WBC Diff och manuell mikroskopi visas i figur 18. Överensstämmelsen mellan

instrumenten liknade den vid jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia

2120, med en korrelation på 0,95. Punkterna låg dock inte lika bra på linjen och

spridningen var större (figur 19).

Figur 18. Resultatet av antalet neutrofila granulocyter vid differentialräkning med Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi uttryckt i absoluta tal (109/L)

Figur 19. Resultatet av uppskattning av bias gällande neutrofila granulocyter vid differentialräkning med Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi

36

Korrelationen för lymfocyter mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi

var lägre än för den mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120. Korrelationen var

0,84. Större spridning i resultat kan även ses i figur 21. Spridning fanns på alla

nivåer.

Figur 20. Resultatet av antalet neutrofila granulocyter vid differentialräkning med Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi uttryckt i absoluta tal (109/L)

Figur 21. Resultatet av uppskattning av bias gällande lymfocyter vid differentialräkning med Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi

37

Ingen korrelation mellan analysresultat gällande monocyter fanns och stor spridning

sågs i resultaten. Spridning kunde ses både på låg och hög nivå (figur 22 och 23).

Figur 22. Resultatet av antalet monocyter vid differentialräkning med Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi uttryckt i absoluta tal (109/L)

Figur 23. Resultatet av uppskattning av bias gällande monocyter vid differentialräkning med Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi Korrelationen av analysresultat vid beräkning av eosinofila granulocyter visas i figur

24 nedan. Korrelationen var dålig och en stor spridning i analysresultat kunde ses, se

figur 25. Spridningen var något större vid högre nivåer.

38

Figur 24. Resultatet av antalet eosinofila granulocyter vid differentialräkning med Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi uttryckt i absoluta tal (109/L)

Figur 25. Resultatet av uppskattning av bias gällande eosinofila granulocyter vid differentialräkning med Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi Antalet basofila granulocyter var låga i många prover, både vid analys med Hemocue

WBC Diff och vid manuell räkning i mikroskop. Data sammanställdes därför inte för

cellerna i diagram med regressionslinje eller bias-diagram. Basofila granulocyter

sågs i fler prover med manuell mikroskopi jämfört med vad Hemocue WBC Diff

beräknade vid analys (bilaga 1 och 2 för rådata).

Med manuell mikroskopi kunde ett mindre antal celler i myelopoesens tidigare

stadier hittas. I prov 7 hittades en metamyelocyt och i flera prover hittades enstaka

stavkärniga neutrofila granulocyter. I prov 9 fanns en eosinofil myelocyt och i prov

39

10 en eosinofil metamyelocyt. I prov 5 fanns en aktiverad monocyt med blåskuggig

cytoplasma. Erytrocyter och trombocyter var normala i samtliga prover.

4. DISKUSSION

4.1 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och Advia 2120

Vid jämförelse av analysresulat från 62 patientprover mellan Hemocue WBC Diff

och Advia 2120 sågs bäst korrelation vid analys av totala antalet leukocyter och

neutrofila granulocyter. Korrelationen var även acceptabel för lymfocyter.

För resterande parametrar sågs en stor spridning mellan resultaten. Eosinofila- och

basofila granulocyter förekommer normalt i låga koncentrationer i blodet, vilket kan

vara en anledning till att resultaten i dessa celltyper skiljde sig åt. Detta är också

anledningen till att en del värden gällande basofila granulocyter togs bort ur

statistiken. Alla hade svarats ut som mindre än 0,1x109/L. Exakt värde av dessa är

inte relevant eftersom inget var patologiskt. Vid studie av bias är alla värden bra

samlade kring 0-gränsen, vilket tyder på att det inte rör sig om ett instrumentalt eller

metodologiskt fel. Advia 2120 svarar ut värden med fler decimaler även i

procentuella enheter. Hemocue WBC Diff svarar enbart ut i två decimaler i absoluta

tal och som heltal i procent. Detta gör att om basofila granulocyter detekteras med

Hemocues instrument och antalet inte kommer upp till 1 % så blir resultatet 0 %,

medan Advia 2120 kan räkna exempelvis 0,2 % och få ut ett absolut värde. Detta är

dock inte kliniskt relevant vid så låga värden, men kan vara en anledning till att få

basofila granulocyter svaras ut från Hemocues instrument. Beräkning av monocyter

skiljde sig mycket åt mellan instrumenten. I ett av de prover som kontrollerades med

manuell mikroskopi kunde även atypiska monocyter ses. Att korrelationen var så

dålig behöver inte enbart bero på metodfel, vilket kan ses i bias-diagrammet där

värdena inte är så spridda utan ligger relativt bra på nivåer inom monocyters

referensintervall. Det kan bero på biologiska faktorer, såsom påverkan av EDTA i

det venösa blodprovet. EDTA påverkar vakuoliseringsgraden hos monocyter, vilket

förändrar morfologin hos dessa celler (13). Detta kan även vara en anledning till att

vissa prover, som analyserades utan larm på Advia 2120, inte svarades ut på

40

Hemocue WBC Diff. Aktiverade monocyter får också en förändrad morfologi och

skulle kunna betraktas som atypiska eller patologiska.

Monocyters kärna kan dessutom anta olika former och kan ligga på olika sätt vid

beräkning med bildanalys. Detta kan säkert vara en svårighet vid identifikation av

dessa celler.

De prover som, på Hemocue WBC Diff, inte svarades ut med differentialräkning av

leukocyter visade inget patologiskt vid kontroll i mikroskop. Dessa prover hade alla

ökat antal leukocyter med en lätt till måttlig ökning av neutrofila granulocyter.

Vid mikroskopering av dessa prover hittades olika fynd i varje prov. Förutom

atypiska monocyter sågs stora trombocyter, en ökad granulering hos granulocyter,

granulafattig myelopoes, enstaka myelocyter och en lätt ökning av stavkärniga

granulocyter. Dessa fynd är inte patologiska och proverna borde utan problem ha

analyserats med Hemocue WBC Diff. Värdet för totala antalet leukocyter stämde bra

överens med Advias erhållna värde så inget tyder på att Hemocues instrument skulle

ha räknat exempelvis stora trombocyter som någon typ av leukocyt. Enstaka

myeolocyter och metamyelocyter samt viss ökning av stavkärniga granulocyter kan

finnas hos personer utan att det behöver vara patologiskt. Vid kontroll i mikroskop

sågs endast en myelocyt i blodutstryket som granskades och Advia 2120 gav inget

larm om omogna granulocyter.

Ökad granulering och granulafattig myelopoes kan försvåra identifieringen av celler,

både vid manuell och maskinell differentialräkning av leukocyter. Celler kan

misstolkas som basofila granulocyter på grund av mängden och den starkt färgbara

granula som kan ligga både i cytoplasman och på kärnan.

Detta är något som borde kollas upp närmare för att se hur Hemocue WBC Diff

reagerar på celler med sådant utseende.

Endast ett prov taget på vårdcentral kontrollerades manuellt i mikroskop men flera

prover från primärvården analyserades på Hemocue WBC Diff utan resultat på 5-

partsdiffen. Så teorin om att prover från inneliggande patienter på sjukhuset kan ha

celler som är mer påverkade, av exempelvis mediciner, fallerar lite. Det kan inverka,

men det är inte uteslutande en anledning till att prov betraktas som patologiska och

41

inga värden erhålls. Det här instrumentet är gjort för att reagera på det som är

onormalt och ge larm om detta för att prov ska kontrolleras på sjukhuslaboratorium.

Men om ett sådant här prov skulle skickas från vårdcentralen hade inget onormalt

hittats vid analys med Advia 2120 och det hade aldrig funnits någon anledning till att

kontrollera provet med manuell differentialräkning i mikroskop. Därmed hade prover

skickats i onödan och svarstiden hade ändå blivit lång.

Studie av inomserieprecision gav bra resultat och variationsvidden av värdena var låg

både för provet på hög nivå och för det på låg nivå. En hög variationskoefficient

kunde dock ses för eosinofila- och basofila granulocyter på båda nivåerna. Det beror,

som ovan, på låga koncentrationer av dessa celler. Båda hade medelvärde på

0,0x109/L med en standardavvikelse på 0,02x109/L och en variationsvidd på

0,10x109/L. Därmed är det många prover som svarats ut med mindre än 0,1x109/L

och därför blir variationskoefficient så hög.

4.2 Jämförelse mellan Hemocue WBC Diff och manuell mikroskopi

20 kapillära prover analyserades vid jämförelsen mellan Hemocue WBC Diff och

manuell mikroskopi. Dessa individer ansågs friska och vid analys hittades inget som

tydde på motsatsen.

Proverna hade mer spridning i sina värden jämfört med spridningen mellan Hemocue

WBC Diff och Advia 2120. De bästa resultaten sågs vid jämförelse mellan neutrofila

granulocyter. Lymfocyter hade något sämre korrelation och resterande leukocyter

hade riktigt dålig korrelation med spridda resultat enligt bias-diagrammen. Om

värdena i absoluta tal jämförs ses en liten skillnad mellan resultaten men så mycket

skiljer det inte. Skillnaden är inte heller diagnostiskt relevant i dessa prover eftersom

alla betraktades som friska individer med leukocyter inom respektive

referensintervall.

En anledning till att neutrofila granulocyter varierar lite mellan instrumenten är att

Hemocues WBC Diff räknar in stavkärniga granulocyter och metamyelocyter i

42

gruppen för neutrofila granulocyter, medan dessa räknas i egna grupper vid manuell

mikroskopi.

Vid differentialräkning i mikroskop hittades eosinofila myeolocyter i två prover. På

laboratoriet för klinisk kemi i Kalmar svaras dessa ut som eosinofila granulocyter,

ingen närmare klassifikation görs (21). Att en metamyelocyt och en aktiverad

monocyt hittades i två prover är inte heller något som är patologiskt.

4.3 Slutsats

Hemocue WBC Diff bygger på bildanalys och jämförelse av celler i blodprov med

inlagda referensceller, en metod som skiljer sig åt både från metoden som Advia

2120 använder och från manuell mikroskopi. Det är en metod med en analysprincip

som är mycket lik den som används av Cellavision Diffmaster. Det som skiljer sig är

att man kan godkänna klassifikationen som Cellavision har gjort och flytta om celler

som placerats i fel grupp (20). Denna möjlighet har man inte med Hemocue WBC

Diff. Det behöver inte betyda att instrumentet ofta gör fel, men problemen som

Cellavision har kan förväntas finnas på detta instrument också. Cellavision har

svårigheter att klassificera stavkärniga granulocyter och gör även fel vid ökad

granuleringsgrad av celler. Därför är det inte en helt orimlig teori om att Hemocue

WBC Diff kan ha svårigheter med detta också. Det kan vara anledningen till att vissa

prover, som kontrollerats att de inte är patologiska, ändå betraktas som avvikande

från det normala och inga värden ges ut på 5-partsdiffen.

Korrelationen av analysresultat vid jämförelse med Advia 2120 och vid jämförelse

med manuell mikroskopi är mycket god på vissa parametrar, lite sämre på andra.

Bäst resultat ses hos friska individer med leukocyter som ligger inom

referensområden.

Hemocue WBC Diff är ett instrument som är under utveckling. Förbättringar finns

att göra och håller på att utföras. Införande av larm för kärnförande erytrocyter är

något som kommer att vara användbart med tanke på att högt antal av dessa kan

interferera och påverka antalet leukocyter. Problemen med prover som inte gett

resultat, trots att de inte är patologiska, har uppmärksammats tidigare men inte

43

kontrollerats grundligt. Förbättringar kan behöva göras för att undvika att många

prover tagna inom primärvården skickas till sjukhuslaboratorium utan att det

egentligen finns en anledning till det. Om dessa prover ändå är normala har transport

och analys gjorts i onödan och svarstiden för resultat har ändå blivit lång, något som

patientnära instrument ska förhindra. I slutändan kan det här instrumentet vara

mycket användbart och ge snabb och värdefull information som gynnar både

patienter, läkare och vårdenheter.

5. TACKORD

Ett stort tack ges till Hemocue AB för utlånande av instrument och reagens som

gjorde det möjligt att utföra studien. Ett särskilt tack riktas till Stellan Lindberg och

Eva Drott Hejdeman på Hemocue för stort engagemang och för att de har funnits till

hands vid frågor och funderingar kring arbetet.

Tack till handledarna, Ingvar Rydén och Susanne Widell, för hjälp med idéer och

lösningar kring arbetet och för hjälp med bearbetning av texten.

Tack till personal på avdelningen för Klinisk kemi vid Kalmar Länssjukhuset som

ställde upp på kapillär provtagning för att få material till den kapillära studien. Ett

särskilt tack ges till Ingela Lagström för råd och funderingar som hjälpt vid

uppkomst av problem.

Tack till sambo och vänner för stöd och inspiration under denna tid.

44

6. REFERENSER

1. Beyette FR, Kost GJ, Gaydos CA, Weigl BH. Point-of-care technologies for health care. IEEE Transactions on biomedical engineering. 2011 Mar; 58(3): 732-735

2. http://www.hemocue.com/index.php?page=4096 2011-03-30 kl. 17.40

3. Hemocue WBC Diff Microcyvette bipacksedel, November 2010

4. Gahrton G., Lundh B., (1997). Blodsjukdomar, 3:e uppl., Natur och Kultur, Stockholm

5. Möllerberg H., (1984). Kliniska laboratorieundersökningar, Almqvist och

Wiksell, Stockholm

6. Dawod M., Rydén I., kvalman/metoder.D16/diff-A0749.doc, Interna dokument och metodbeskrivningar för Advia 2120, Avdelningen för Klinisk kemi, Länssjukhuset i Kalmar, 2007

7. Hemocue WBC Diff Bruksanvisning, November 2010

8. Miale J.,(1982). Laboratory Medicine, 6:e uppl., appendix: methods

9. Hoffbrand, A., V., Pettit, J. E., (1988). Clinical Haematology. Sandoz Atlas.

Gover Medical Pub.

10. Hilén, G., kvalman/metoder.D16/färgutstryk0943.doc, Interna dokument och metodbeskrivningar för mikroskopi, Avdelningen för Klinisk kemi, Länssjukhuset i Kalmar, 2009

11. Nordenson N.G, (1961). Kliniska laboratoriemetoder III Klinisk morfologisk

hematologi, 3:e uppl., Nordstedts förlag, Stockholm

12. Sundström C., Öst Å., (1985). Morfologisk benmärgsdiagnostik, Natur och Kultur, Stockholm

13. Nordin G., Equalis Standard S001 Version 2.1 2006,

www.equalis.se/media/20920/rekommenderad%20rutinmetod%20f%C3%B6r%20standardiserad%20morfologisk%20klassificering%20och%20bed%C3%B6mning%20av%20celler%20i%20blodutstryk.pdf 2011-04-11 kl.22.45

45

14. Buttarello M., Plebani M. Automated blood cell counts. American Society for Clinical Pathology. 2008 Jul; 130(1): 104-116

15. Siemens Advia 2120 Operatörshandbok, O67D0147-01, v2. 00.00, december 1996

16. Pahi A.B., Kiraly Z., Puskas S. Mass spectrometric characterization of the

non-ionic gemini surfactant Sufynol 465 and a microcalorimetric study of its micelle formation in water. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2009 Aug; 345(1-3); 13-17

17. www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/

1/t8532pis.Par.0001.File.tmp/t8532pis.pdf 2011-03-30 kl.18.30

18. Vilhar B., Greilhuber J., Dolenc Koce J., Temsch E.M., Dermastia M. Plant genome size measurement with DNA image cytometry. Annals of Botany. 2001 Apr; 87; 719-728

19. Ceelie H., Dinkelaar R.B., van Gelder W. Examination of peripheral blood

films using automated microscopy; evaluation of Diffmaster Octavia and Cellavision DM96. Journal of Clinical Pathology. 2007 Jan; 60(1):72-79

20. Hilén, G., kvalman/metoder.D16/diff-M1024.doc, Interna dokument och

metodbeskrivningar för mikroskopi, Avdelningen för Klinisk kemi, Länssjukhuset i Kalmar, 2009

21. Nilsson-Ehle P., (2003). Laurells Klinisk kemi i praktisk medicin, 8:e uppl.,

Studentlitteratur AB, Lund

22. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method comparison and bias estimation using patient samples, approved guideline. NCCLS utgivna EP9-A 1995, NCCLS Villanova, PA

46

7. BILAGOR

Bilaga 1

Resultat av differentialräkning av leukocyter i kapillärblod med Hemocue WBC

Diff

Tabell I. Resultat av differentialräkning av leukocyter i kapillärt blod med Hemocue WBC Diff

prov WBC (109/L)

Metamy. (109/L)

Stav (109/L)

Segment (109/L)

Lymfocyt (109/L)

Monocyt (109/L)

Eos. (109/L)

Baso. (109/L)

1 6,0 - - 3,6 2,1 0,3 0,1 0,0 2 6,0 - - 3,2 2,3 0,3 0,2 0,0 3 6,7 - - 3,2 3,0 0,3 0,1 0,0 4 4,7 - - 2,5 1,9 0,2 0,1 0,0 5 6,3 - - 3,4 2,5 0,2 0,1 0,0 6 6,7 - - 3,2 3,0 0,5 0,1 0,0 7 8,0 - - 4,0 3,4 0,5 0,1 0,0 8 5,2 - - 3,1 1,7 0,3 0,1 0,0 9 5,7 - - 2,5 2,7 0,3 0,1 0,0 10 4,2 - - 1,9 1,8 0,4 0,1 0,0 11 8,6 - - 5,0 3,0 0,5 0,2 0,0 12 7,2 - - 4,0 2,5 0,3 0,3 0,0 13 5,7 - - 2,8 2,4 0,3 0,1 0,0 14 8,8 - - 5,4 2,8 0,3 0,3 0,0 15 8,1 - - 4,3 2,9 0,4 0,5 0,0 16 9,8 - - 6,6 2,4 0,6 0,2 0,0 17 5,0 - - 3,1 1,5 0,2 0,1 0,0 18 7,8 - - 4,2 3,2 0,3 0,2 0,0 19 7,8 - - 4,2 3,0 0,5 0,1 0,1 20 6,1 - - 4,0 1,8 0,2 0,1 0,0

47

Bilaga 2

Resultat av differentialräkning av leukocyter i kapillärblod med manuell

mikroskopi

Tabell I. Resultat av differentialräkning av leukocyter i kapillärt blod med manuell mikroskopi

prov WBC (109/L)

Metamy. (109/L)

Stav (109/L)

Segment (109/L)

Lymfocyt (109/L)

Monocyt (109/L)

Eos. (109/L)

Baso. (109/L)

1 6,0 0,0 0,0 3,5 2,1 0,3 0,0 0,0 2 6,0 0,0 0,1 2,8 2,8 0,2 0,1 0,0 3 6,7 0,0 0,0 2,8 3,2 0,5 0,2 0,0 4 4,7 0,0 0,0 2,3 2,1 0,1 0,1 0,1 5 6,3 0,0 0,1 2,7 3,0 0,4 0,1 0,0 6 6,7 0,0 0,0 3,6 2,5 0,5 0,1 0,0 7 8,0 0,1 0,1 4,0 3,1 0,8 0,0 0,0 8 5,2 0,0 0,0 2,7 2,1 0,3 0,1 0,1 9 5,7 0,0 0,0 2,0 3,0 0,4 0,3 0,1 10 4,2 0,0 0,1 1,8 2,1 0,1 0,1 0,0 11 8,6 0,0 0,1 5,2 3,2 0,1 0,1 0,0 12 7,2 0,0 0,1 3,9 2,9 0,1 0,2 0,0 13 5,7 0,0 0,1 2,6 2,6 0,1 0,3 0,1 14 8,8 0,0 0,0 4,7 3,4 0,4 0,2 0,1 15 8,1 0,0 0,1 3,2 4,1 0,4 0,2 0,1 16 9,8 0,0 0,1 6,7 2,5 0,4 0,2 0,0 17 5,0 0,0 0,1 2,9 1,7 0,2 0,1 0,2 18 7,8 0,0 0,1 3,5 3,7 0,4 0,0 0,1 19 7,8 0,0 0,0 4,3 3,3 0,2 0,0 0,1 20 6,1 0,0 0,0 3,6 2,1 0,2 0,1 0,1

Kalmar Växjö 391 82 Kalmar Tel 0480-446200 info.nv@lnu.se Lnu.se