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METODOLOGIA DE DETECÇÃO DE GLÚTENMETODOLOGIA DE DETECÇÃO DE GLÚTEN
Instituto Adolfo LutzDivisão de Bromatologia e Química
Serviço de AlimentosSeção de Doces e Amiláceos
Rejane Weissheimer de [email protected]
RWA
Por que da ADVERTÊNCIA nos rótulos dos alimentos, em relação à presença ou ausência de glúten
DOENÇA CELÍACA
TRATAMENTO
Intolerância às proteínas provenientes do trigo, centeio, aveia e cevada
PROLAMINAS
Frações proteícas solúveis em álcool
Alimentação totalmente isenta de
glúten
proteína do trigo = Glúten = glutenina + gliadina
Pro-Ser-Gln-Gln-Pro
RWA
RWA
LEGISLAÇÃO
Lei Federal nº 8543/1992 Determinou a impressão de advertência em rótulos e embalagens de alimentos industrializados que contenham glúten ou apresentem em sua composição trigo, centeio, malte, cevada, aveia e/ou seus derivados.
Resolução RDC nº 40/2002 Estendeu a obrigatoriedade da advertência “CONTÉM GLÚTEN” em caracteres com destaque, nítidos e de fácil leitura também as bebidas embaladas.
Lei nº 10.674/2003 Obriga as inscrições “CONTÉM GLÚTEN” ou “NÃO CONTÉM GLÚTEN” para os produtos alimentícios comercializados, como medida preventiva e de controle da doença celíaca.
RWA
IMPLANTAÇÃO
Implantação de métodos analíticos sensíveis e específicos para
detecção de glúten em alimentos.
Testes Imunológicos
Parceria BQ e BM
Projeto FAPESP
Objetivo: desenvolver metodologia Comparação ELISA in house x kit comercial ω gliadina
RWA
ELISA
RWA
Equipamentos básicos: balança, pHmetro, agitador de tubos (PHOENIS), agitador orbital (FANEM), misturador digestor de líquidos (HEIDOLPH) e centrífuga (CELM)
EQUIPAMENTOS
RWA
Lavadora de placas Wellwash 4 – Labsystems
Leitora de placasMultiskan Ascent - Labsystems
RWA
Glúten de trigo (gluten from wheat)
SIGMA –– G5004
Gliadina (Gliadin): SIGMA – G-3375,
PADRÕES DE CONTROLE
RWA
KITS
TRANSIA PLATE PROLAMINS DIFFCHAMB – Art. N◦ PR0320
TRANSIA PLATE PROLAMINS DIFFCHAMB – Art. N◦ PR0320
RIDASCREEN® GLIADIN R BIOPHARM - Art. N◦ R7001
RIDASCREEN® GLIADIN R BIOPHARM - Art. N◦ R7001
RWA
RWA
Amostras do teste de gliadina: controle negativo, controle A e controle B
(positivas)
RWA
KIT PARA ELISA
COMPOSIÇÃO: ω GLIADINA e R5
Substrato TMB concentrado (tetrametilbenzidina)
Solução de lavagem concentrada (tampão Tris-salino)
Solução diluente concentrada (PBS com gelatina e timerosal)
Solução finalizadora (ácido fosfórico 25%).
Placa de microtitulação com 12 tiras (96 alvéolos) sensibilizada com: * anticorpo anti-ω gliadina (ω gliadina) * pentapeptideo (R5) Padrão de gliadina liofilizada e padrões prontos
Conjugado peroxidase anti-gliadina (peroxidase ligada a anticorpo monoclonal de rato Anti-ω gliadina) diluído em PBS
Controles alto, médio e baixo
RWA
DOT DOT ELISA NA DETECÇÃO DE GLIADINA
Linhas A – H: Diluição seriada ½ . Colunas: 1) Curva-padrão gliadina; 2, 3 e 4) Padrões glúten 3000, 400 e 160ppm; 5) Amostra FAPAS; 6) Sopa de feijão com macarrão; 7) Grão de cevada; 8, 9 e 10) Amido de milho, sopa de vegetais e Arroz - controle negativo
A
B
C
D
E
F
G
H
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CODEX ALIMENTARIUS
Alimento naturalmente sem glúten até 20ppm
Mistura de alimentos naturalmente sem glúten até 100ppm
RWA
Dot ELISA
N.º ALI MENTO ELI SA (ppm) Dot ELI SA ROTULAGEM
1 Sopa de abobrinha 34 -
2 Sopa de carne 44 -
3 Sopa de mandioquinha ND -
4 Sopa de três queijos ND -
5 Sopa de galinha ND -
6 Caldo de carne ND -
7 Pipoca ND -
8 Macarrão ND -
9 Leite ND - Não
10 Creme de arroz ND - Contém
11 Amido de milho ND - Glúten
12 Creme de milho ND -
13 Biscoito sequilho ND -
14 Soja ND -
15 Lasagne ND -
16 Farinha de mandioca ND -
17 Sêmola de milho ND -
18 Farinha de arroz ND
19 Caldo de carne 54 -
20 Sopa de f eijão e macarrão 2393 +++
21 Biscoito maisena 745 +++
22 Sopa de cebola 2996 +++ Contém
23 Centeio 1704 +++ Glúten
24 Cevada ND
25 Biscoito integral aveia e mel 2679 +++
26 Farinha de aveia 247 -
ND = Não detectável – Abaixo dos limites de quantificação (10ppm)
DETECÇÃO DE GLIADINA EM ALIMENTOS INDUSTRIALIZADOS
RWA
DESAFIOS
1. Composição do alimento – diferença entre as matrizes
quantidade e ingredientes do alimento interferem diretamente na quantificação do analito
VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA PARA CADA ALIMENTO
2. Procedência dos ingredientes
3. Diferentes respostas ente os kitsExtração PadrãoReferência
Resultados de controle interlaboratorial FAPAS para Mistura de pão seco (2712B) e Misturas para bolo de chocolate (2733 A e B)
Resultados de controle interlaboratorial FAPAS para Mistura de pão seco (2712B) e Misturas para bolo de chocolate (2733 A e B)
Material teste /kit Valor de consenso de
glúten (mg/Kg)
Nº escores dentro [z]≤2
Nº total de escores
% Intervalo satisfatório
2712-BR-Biopharm
35,4 21 23 91 22,7-48,2
2712-BTepnel & Transia
131,9 15 19 79 84,4-179,4
2733-AR-Biopharm
7,12 21 23 91 -
2733-BR-Biopharm
173 26 29 90 -
2733-BTepnel
61,1 5 5 83 -
2733-BNeogen
177 11 11 100 -
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PRIORIDADES
Profissionais capacitados Padrões Controles internos Validação do método para os laboratórios Comprovação do resultado com outro método
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ELISAFONTE DE GLIADINA DOS INGREDIENTES PCR
SEQUENCIAMENTO
CONCLUSÃO
TRABALHO INTEGRADOTRABALHO INTEGRADO
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ALIMENTO
IALCVS
ANVISA
EQUIPE MULTIDISCIPLINAR
CVE