Métodos de Reconocimiento, Identificación e Individualización de Manchas de Semen

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Métodos de Reconocimiento, Identificación eMétodos de Reconocimiento, Identificación e Individualización de manchas de semenIndividualización de manchas de semen

Parte IIParte IIPor: Iris Catherine CarmaPor: Iris Catherine Carma

Lcda. En Biología (UCV), Esp. En Criminalística (IUPOLC).

En la siguiente sección se describen las nuevas

técnicas emergentes empleadas para la detección de

manchas de semen, estas son casi todas

confirmatorias, y la mayoría de ellas implican

marcadores inmunológicos que también pueden

señalar si la mancha pertenece a la especie humana.

Bauer en el año 2007 sugiere el uso del ARN

mensajero (ARNm) para detectar manchas de semen

en casos forenses. El mismo método es descrito

anteriormente por Álvarez y sus colaboradores en el

año 2004, empleando además, el co-aislamiento de

ADN y ARN. La Protamina 1 (PRM1) fue el primer

marcador específico del semen utilizado.

El método propuesto por Juusola y Ballantyne en el

año 2005 empleando la Reacción en Cadena de la

Polimerasa en Transcripción Reversa PCR-TR

también se aplica a la investigación de manchas de

semen, y consiste en la detección de dos genes

específicos de la esperma; la PRM1 y Protamina 2

(PRM2).

La Reacción en Cadena de la Polimerasa Transcripción Reversa PCR-TR (Reverse transcript

polymerase chain reaction RT-PCR, en inglés) es u

variante de la PCR, una técnica de laborat

comúnmente usada para generar una gran cantid

de copias de ADN, en un proceso llama

"amplificación", mediante el empleo de un equ

llamado termociclador (ver figura 1). En la PCR-T

una hebra de ARN es retro-transcrita a su A

complementario (ADNc) usando una enzima llama

transcriptasa reversa, y el resultado, se amplifica

una PCR tradicional. La PCR en Transcripc

Reversa no debe ser confundida con el PCR

tiempo real o la PCR cuantitativa PCR-Q, la cua

veces de manera errónea se abrevia PCR-TR.

Fig. 1 Termociclador: equipo que se utiliza para amplificar el AD

Los marcadores que se usan en estos ensayos q

emplean la PCR-TR son específicos, no produ

ningún falso positivo ni negativo, solamente puocurrir la inhibición o degradación del mate

genético por agentes químicos, físicos

microbiológicos presentes en la muestra. Una vers

actualizada de este experimento fue presentada en

año 2007 por Juusola y Ballantyne, ellos usaron

sistema de tres marcadores, los genes implicados s

PRM1 y PRM2 para el semen, junto con el g

GAPDH. Un estudio similar se realizó en el año 20

por Haas, Klesser, Kratzer y Bar con los genes PRy PRM2, ellos verificaron que se pueden obte



Otro enfoque de la PCR-TR desarrollado por

Nussbaumer y sus colaboradores en el año 2006 se

basa en la detección de la Calicreína (KLK), un

marcador útil para identificar el semen (también

conocido como el marcador de la PSA). En este

ensayo se ha demostrado que no existe reaccióncruzada con otros fluidos como la sangre, secreciones

vaginales y saliva, ni hubo un falso positivo. Además,

este marcador de ARNm, específico del semen a

demostrado gran estabilidad y se puede detectar a los

10 días de almacenamiento de la muestra a

temperatura ambiente sin búfer de estabilización. Esta

técnica demostró ser más sensible que los populares

ensayos a base de anticuerpos que detectan la PSA.

Trombka y sus colaboradores, en el año 2008

introdujeron un método no destructivo para la

identificación presuntiva de manchas de semen. El

método consiste en el empleo de una tecnología única

desarrollada por la NASA que utiliza un dispositivoportátil que emite Fluorescencia de Rayos X (XRF),

La XRF es una técnica de muestreo relativame

nueva, versátil, rápida y no destructiva, que recono

un gran número de elementos químicos y presenta

resultados en tiempo real, permitiendo decidir

muestreo adicional ante resultados analíticos

concluyentes. Logra alcanzar unos límites

detección de hasta 0.002% (20 p.p.m.).

La técnica XRF utiliza la emisión secundari

fluorescente de radiación X que se genera al exc

una muestra con una fuente emisora de rayos X.

radiación X incidente o primaria expulsa electrones

capas interiores del átomo. Entonces, los electro

de capas más externas ocupan los lugares vacantes

el exceso energético resultante de esta transición

disipa en forma de fotones: la llamada radiaciónfluorescente o secundaria. Esta radiación

fluorescencia es característica para cada eleme

Por lo tanto, es posible identificar un elemento quím

dentro del espectro de la muestra si se conoce

energía entre los orbitales atómicos implicados.

concentración de cada elemento se detecta midien

la intensidad de la energía asociada a cada transic

de electrones. Es decir, la salida de un análisis

XRF es un espectro que muestra la intensidad

radiación en función de la energía.

http://www.scienceinschool.org/repository/images/issue7mercury4_large.jpg



Las energías de unión de un elemento, se utilizan

como una huella dactilar en la técnica de XRF.

Cuando se cambia la energía y se observa un pico en

una energía particular, se sabe que el elemento está

presente.

Este método puede ser muy útil en casos

asociados a delitos que afectan las buenas

costumbres y el buen orden de las familias, ya que en

ellos se requieren ensayos rápidos y no destructivos

que permitan posteriormente individualizar la mancha

de semen mediante ensayos de biología molecular.

También tiene la ventaja de identificar manchas de

semen en el sitio del suceso, ya que el dispositivo es

portátil. El proceso sólo toma un minuto, y tiene una

precisión de más del 10% en la medición de 1 mL de

esperma distribuida en un área de 40 cm2.

Fig. 3.- Analizadores XRF portátiles con pequeña zona de análisis

Por último, una prueba de presunción desarrollada

recientemente para detectar manchas de semen es

una fuente de luz UV llamada Lumatec Superlight

400. Ésta emite luz de 320 hasta 700 nm y se ha

probado en muestras de semen humano y jabalí, así

como en diferentes tipos y colores de las telas (ver figura 4). La Superlight es capaz de detectar manchas,

almacenamiento de la muestra por tres y ci

semanas no mostro diferencias en los resultados. P

detectar el semen se recomienda usar una radiac

de 415 a 490 nm con lentes color naranja o rojo (V

figura 4).

Fig 4.- Mancha de semen irradiada con la lámpara LumatecSuperlight 400

Identificación confirmatoria y no destructIdentificación confirmatoria y no destruct

de varios fluidos del cuerpo:de varios fluidos del cuerpo:

La tecnología emergente que utiliza marcadores

ARNm es muy específica y sensible, pero ocasion

destrucción de la muestra, y a menos que se ana

simultáneamente el ADN, tal como señala Álvare

sus colaboradores, se necesitará material adicio

para la individualización de la mancha de semen.

La habilidad de identificar los fluidos del cuerpo

el sitio del suceso de manera no destructiva

importante para conservar la evidencia, ahorrar tiem

y practicar posteriormente la prueba de ADN. En e

contexto, existen dos técnicas; la espectroscopíafluorescencia y la espectroscopía de Raman, q

podrían ser la solución a esta problemática.

expectativa es que estas técnicas sean aceptadas

la comunidad forense. Al principio puede haber u

necesidad de comprobación en el laborato

criminalístico para demostrar que los resultados s

fiables y convenientes como testimonio en un juic

pero en el futuro estos métodos podrán prod

resultados aceptables para que el investigador puetener resultados rápidos y confiables.

http://www.scienceinschool.org/repository/images/issue7mercury4_large.jpg



t t l id d i d l

La espectroscopía de fluorescencia es una técnica

sensible que se basa en la detección en la muestra de

un fluoróforo, un grupo químico que absorbe radiación

(por lo general en la región ultravioleta) y que emite

luz a mayor longitud de onda. Esta técnica no utiliza

reactivos y no hay un contacto con la muestra, pero su

carácter no destructivo es cuestionable debido a la

posibilidad de foto-degradación del ADN por la

exposición a la luz ultravioleta.

La espectroscopía de fluorescencia es un tipo de

espectroscopía electromagnética que analiza la

fluorescencia de una muestra. En esta técnica se

utiliza un haz de luz, por lo general ultravioleta, que

excita los electrones de las moléculas de ciertos

compuestos y provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque no

necesariamente). Los dispositivos que miden la

fluorescencia se llaman fluorómetros o fluorímetros.

En la espectroscopía de fluorescencia, primero se

excita la muestra mediante la absorción de un fotón de

luz, desde su estado electrónico basal a uno de los

distintos estados vibracionales del estado electrónico

excitado. Las colisiones con otras moléculas causan

que la molécula excitada pierda energía vibracional

hasta que alcanza el estado vibracional más bajo del

estado electrónico excitado. La molécula desciende a

uno de los distintos niveles de vibración del estado

electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso.

Como las moléculas pueden caer a cualquiera de los

diferentes niveles de vibración en el estado basal, los

fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo

tanto, frecuencias. Así pues, mediante el análisis de

las diferentes frecuencias de luz emitida por

espectroscopia de fluorescencia, junto con sus

intensidades relativas, se puede determinar la

estructura de los diferentes niveles de vibración.

Powers y Lloyd (2004), han demostrado que la

espectroscopia de fluorescencia se puede usar para

identificar varios fluidos del cuerpo. La capacidad quetiene este ensayo de aplicarse a diferentes fluidos es

t í ti li li i l

conjeturas acerca de lo que podría ser una manc

desconocida.

Muchos de los componentes que se encuentran

los fluidos corporales pueden presentar fluorescen

como los ácidos nucleícos, proteínas y lípidos

grupo hemo en la sangre, productos de la degradac

de metabolitos en la orina y el semen seco.

composición individual de cada uno de es

componentes químicos en los fluidos del cuerpo

único y su huella química corresponderá a un espec

de emisión característico, en la figura 5 se muest

los espectros de emisión por espectroscopia

fluorescencia del semen, sangre, saliva y o

medidos con una longitud de onda de excitación

260 nm. La longitud de onda de excitación más butilizada fue de 260 nm, y aún no está claro si e

λ puede dañar el ADN presente en la muestra. E

técnica es ideal, ya que puede explorar rápidamente

material y es muy sensible. El uso de múltip

longitudes de onda y la detección de la fluorescen

en una amplia gama de longitudes de onda permite

identificación de un fluido corporal particular.

Fig. 5.- Espectros de emisión de fluorescencia del semen ( ), s

( ), sangre (- - -), saliva ( ) y orina ( ) a 260 nm. Esta técnices destructiva. La muestra debe analizarse a varias longitudesonda para que no sean confundidas con otros fluidos del cuerpoestá disponible ningún dato sobre la posible fotodegradaciónADN por la exposición prolongada a 260-nm la luz de UV.

Otro estudio independiente presenta un aparato

espectroscopia de fluorescencia portátil que pod

usarse en el sitio del suceso para identif

instantáneamente el fluido. El instrumento

diseñado en el año 2003 para descu

contaminaciones microbianas, pero su

sensibilidad lo convierte en un accesorio ideal para



una característica muy valiosa ya que elimina las

La espectroscopia de Raman

La espectroscopia de Raman es otra técnica Bio-

analítica no destructiva que tiene un gran potencial

para la identificación confirmatoria de semen en el sitio

del suceso. La espectroscopia de Raman en

comparación con la espectroscopia de fluorescencia,

exhibe una alta selectividad y especificidad, a pesar

de tener baja sensibilidad, esta técnica podría ser útil

en la investigación de mezclas de múltiples fluidos del

cuerpo.

La espectroscopía de Raman es una técnica que

proporciona en pocos segundos información química y

estructural de casi cualquier material o compuesto

orgánico y/o inorgánico permitiendo así su

identificación, el análisis mediante espectroscopía deRaman se basa en el análisis de la luz dispersada por

un material al hacer incidir sobre él un haz de luz

monocromático. Una pequeña porción de luz es

dispersada inelásticamente experimentando ligeros

cambios de frecuencia que son característicos del

material analizado e independiente de la frecuencia de

luz incidente. Se trata de una técnica de análisis que

se realiza directamente sobre el material a analizar sin

necesitar éste ningún tipo de preparación especial y

que no conlleva ninguna alteración de la superficie

sobre la que se realiza el análisis, es decir, es no-

destructiva.

La cantidad requerida de muestra para análisis con

un espectrómetro de Raman puede ser tan baja como

100 pg. Un espectro típico de Raman proporciona una

firma única de la frecuencia vibracional del material

analizado. La mancha podría estudiarse en el campo y

seguir disponible para su uso en el laboratorio de

análisis de ADN, y eso es muy importante para los

investigadores criminalistas.

El diseño de un espectrómetro de Raman portátil

es un escenario qué facilita la habilidad de hacer

identificaciones en el campo. La figura 6 muestra una

fotografía de un dispositivo portátil de espectroscopiade Raman.

Fig.6.- Dispositivo portátil de espectroscopía de Raman

El dispositivo portátil de espectroscopia de Ram

fue diseñado para identificar narcóticos, explosiv

polvos blancos, armas químicas y productos quími

industriales que se encuentran en una escena

crimen. Siempre y cuando se disponga del softw

adecuado y una base de datos, este dispositivo port

puede ser utilizado para la detección de flui

corporales en el campo. Es una técnica no destruct

que ha permitido el análisis de sangre, semen, sal

fluido vaginal y sudor. Los resultados reportados s

muy prometedores y muestran que los espect

obtenidos por espectroscopía de Raman para ca

fluido corporal es diferente y único (Fig. 7).

Fig. 7.- Espectros de Raman para semen humano, semen canfluido vaginal, saliva, sudor y sangre con la excitación en longitud de onda (λ) de 785 nm. Este es un método no-destrucy altamente específico que produce un espectro único para cfluido corporal.

En cada fluido del cuerpo la composición quím

dif t (t bl 1) t h ú i d fl id



es diferente (tabla 1) y esto hace único a cada fluido

Tabla 1: Composición química de los fluidos del

cuerpoSangreSangre SemenSemen SalivaSaliva FluidoFluido

vaginalvaginal

OrinaOrina Sudor Sudor

Hemoglobina Fosfatasa

acida

Amilasa Fosfatasa

Acida

Urea Urea

Fibrinogeno Antígeno

prostático

Lisozymas Acido

Láctico

Creati-

nina

Acido

Láctico

Eritrocitos Espermatozoides

Mucina Acidocítrico

Acidoúrico

Colina

Glucosa Colina Células

epiteliales

Bucales

Urea Colina Sodio

Inmuno-

globulinas

Espermina Tiocianato Péptidasa

vaginal

Glico

proteína

Tamm-

Horsfall

Potasio

Semeno-

gelina

Potasio Células

epiteliales

glicogenad

as

Inmuno-

globulina

Zinc Bicarbona-

to

Acido

acético

Acido

cítrico

Fosforo Piridina

Acido

Láctico

Glucosa Escualeno

Fructosa Inmuno-

globulinas

Inmuno-

globulinas

Urea

Acido

Ascórbico

Inmuno-

globulinas

En el futuro será necesario evaluar el uso de la

espectroscopía de Raman para el análisis de mezclas

de fluidos corporales, así como para el análisis de

manchas en diferentes substratos. Potencialmente, las

mezclas de varios fluidos del cuerpo se pueden

caracterizar con espectroscopia de Raman mediante

diferentes herramientas estadísticas, incluyendo la

significancia estadística (SFA) y mínimos cuadrados

alternados (ALS) utilizando un software como

MATLAB 7.0.

Cada fluido del cuerpo contiene picos en el

espectro de Raman correspondientes a determinados

componentes biológicos, y una mezcla de fluidos

producirá un espectro que es la combinación de dos o

más picos de los espectros, que se pueden analizar

matemáticamente en forma individual. Además, la

espectroscopia de Raman es capaz de distinguir el

semen humano del canino. La capacidad de distinguir la especie a la cual corresponde un fluido corporal en

l iti d l t bié i t t Ot

sangre humana entre las de gato y perro, mediante

empleo de la espectroscopia Raman. Se necesi

más estudios para determinar la capacidad de e

método para identificar especies.

Existen numerosas técnicas, tanto nuevas co

antiguas, que pueden ser aplicadas en la identificac

de manchas de semen en el sitio del suceso. Algun

son confirmatorias y pueden ser concluyentes

identificar la presencia de semen, y otras pueden

utilizadas como pruebas presuntivas o de detecci

La mayoría de estas técnicas son destructivas

impiden el análisis posterior del ADN presente en

mancha. Además, algunos métodos sólo pued

llevarse a cabo en el laboratorio, retrasando

obtención de los resultados. La aplicación de la bespectroscopía no destructiva podría ser la solució

la identificación universal y rápida de los flui

corporales y también puede ser de gran ayuda a

investigadores criminalistas para identificar

sospechoso de cometer un delito ya que permite

posterior análisis del ADN de las muestras.

Actualmente los expertos de la Policía Estadal

Investigación Forense y el Instituto Forense (NER

en Nueva York están realizando estudios p

desarrollar un nuevo método que emplea

espectroscopía de Raman para la identificac

automática de fluidos del cuerpo en el sitio del suce

pero se necesita más investigación en esta á

Además, se encuentran trabajando en el empleo

herramientas estadísticas para distinguir las diferen

especies de animales a partir de una muestra

sangre, incluyendo los seres humanos, los gatos y

perros.

Con el desarrollo de dispositivos portátiles

fluorescencia de rayos X y la espectroscopía

fluorescencia y la espectroscopía de Raman, así co

la aplicación de herramientas estadísticas avanzad

y el desarrollo del software necesario, la técnica

bio-espectroscopía tiene el potencial de ser uherramienta muy valiosa en la investigación de fluid

l



el sitio del suceso también es muy importante Otro corporales

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