UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA ESCUELA DE QUIMICA FACULTAD DE CIENCIAS INSTRUMENTAL ANALITICO

GUIA DE MTODOS DE ANLISIS POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

Caracas 2013 Profa. Rosa Amaro Prof. Luis Gmez

Prfa. Yosmery Vita Prof. Mara A. Alvarez

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TABLA DE CONTENIDO

Contenido Prlogo . 3 Determinacin de cido ascrbico en una pastilla de vitamina C .. 5 Determinacin de cafena en refresco (PEPSI) 6 Determinacin de cafena, acetaminofn y/ acido acetilsaliclico en analgsicos8

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PRLOGO La cromatografa lquida de alta eficiencia, es una tcnica analtica que presenta un amplio campo de aplicacin. En particular, la cromatografa de reparto en fase inversa, empleada en el laboratorio de instrumental analtico, es aplicable a la determinacin de sustancias orgnicas presentes en frmacos, productos de alimentacin y de la industria qumica, contaminantes de diferentes tipo as como en sustancias bioqumicas y otras presentes en muestras forenses y mdicas. Establecer las condiciones en el Sistema HPLC 1. Emplear eluentes grado HPLC. 2. Filtrar los eluentes a utilizar y luego desgasificar por un tiempo aproximado de 10 min mediante ultrasonido, 3 min mediante burbujeo con He. 3. Seleccionar el eluente (puro o mezclas de ellos) a utilizar en la separacin. 4. Si es un solo eluente colocar la salida de estos de forma manual de lo contrario si se va emplear mezcla de eluente colocar programacin de los mismos. 5. Purgar el equipo empleando el eluyente seleccionado, mediante la apertura de la vlvula de la bomba (solo dar dos vueltas). Colocar el flujo en un valor de 5 mL/min (botn designado como 2/flow), presionar enter (para dejar este valor como preestablecido) y presionar el botn pump para encender la bomba. Dejar el proceso de purga por 5 min aproximadamente. 6. Colocar el flujo en 0,2 mL/min y luego cerrar la vlvula. De esta manera se hace pasar el eluente(s) por la columna y las dems conexiones contiguas a la bomba. Al estabilizarse la presin se puede ir aumentando el flujo de 0,1 en 0,1 mL/min hasta llegar a 1 mL/min. 7. Una vez realizados los pasos anteriores puede procederse a inyectar la muestra a analizar y los patrones para la cuantificacin. Optimizacin de las condiciones de separacin y anlisis La optimizacin de las condiciones de separacin de los componentes (Composicin, flujo y presin de la fase mvil) se realiza con la solucin de muestra. Para comenzar, se seleccionan las condiciones intermedias de polaridad de la fase mvil, flujo y presin. Se inyecta la muestra y de acuerdo al cromatograma obtenido se ajustan las condiciones (una a una) para obtener la mejor separacin en el menor tiempo de anlisis. Razone el cambio de condiciones y consulte a su preparador o profesor antes de proceder a modificar las condiciones del anlisis, para evitar demoras en la realizacin de la prctica as como el consumo de fase mvil. Recuerde que el cambio de condiciones requiere la purga del sistema, antes de la prxima inyeccin. Una vez conocidas las condiciones de separacin, se procede a inyectar las soluciones patrones y las de muestra. Equipo El equipo de cromatografa que se encuentra en el laboratorio de Instrumental analtico tiene las siguientes caractersticas: Cromatgrafo de lquidos de alta eficiencia, marca Jasco Modelo L6-2080-02 Terniary gradient, Bomba Jasco PU-2080 plus HPLC, Desgasificador Populaire. Detector: UV/Vis 2075 plus ( Fotomultiplicador) Jeringa: Tipo Hamilton, apreciacin: 2 L

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Columna de acero Inoxidable (fase estacionaria: C18); Longitud: 250 mm; Dimetro interno: 4.6 mm; y Tamao de partcula del soporte: 5 m. DETERMINACIN DE CIDO ASCRBICO EN UNA PASTILLA DE VITAMINA C. Objetivos

GGeenneerraall:: Determinar el contenido de cido ascrbico en pastillas de vitamina C usando la tcnica de cromatografa de lquidos de alta eficiencia (HPLC). EEssppeeccffiiccooss:: Adiestramiento en el manejo de equipos de cromatografa lquida de alta eficiencia. AApplliiccaarr eell ttrraattaammiieennttoo aaddeeccuuaaddoo ddee llooss ssoollvveenntteess yy mmuueessttrraa:: ffiillttrraacciinn yy ddeessggaassiiffiiccaacciinn ddee llooss mmiissmmooss.. Ajustar los parmetros instrumentales, que permitan obtener una buena separacin de los picos en la muestra de vitamina C. Analizar cuantitativamente el contenido de cido ascrbico mediante el uso de curva de calibracin externa. Determinar la precisin del anlisis y compararla con la dispersin de la composicin en el lote de produccin del frmaco. Parte Experimentales Condiciones Experimentales - Volumen de inyeccin 10L - Deteccin a 254 nm - Flujo y presin a optimizar - Fase mvil a optimizar (usualmente: 50 mM de KH2PO4) Esquema 1. Preparacin de la curva de calibracin.

Se prepara una madre de 200 ppm de acido ascrbico.

Se prepararan por dilucin cuatro patrones de 5, 10, 15 20 ppm

Se inyectan al HPLC bajo condiciones ptimas y grafique los valores de rea de pico en funcin de la concentracin

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Esquema 2. Preparacin de la muestra

SSee ppeessaa yy ppuullvveerriizzaa uunnaa ppaassttiillllaa

ppeessaarr 00..3300000000 gg

DDiissoollvveerr eenn aagguuaa,, ffiillttrraa eenn ppaappeell yy eennrraassaarr aa 110000 mmLL..

DDiilluuiirr:: 00,,4400 mmLL eenn 2255 mmLL

Filtrar (< 45 um) e inyectar al cromatgrafo Nota: - Realizar el procedimiento para tres pastillas (concentracin promedio y dispersin en

el lote de pastillas). Para una de las pastillas realizar el procedimiento por triplicado (concentracin promedio en la pastilla y precisin del procedimiento de anlisis).

Referencias - Principios de Anlisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001

Editorial Mc Graw Hill. - Rubinson K, Rubinson J, Anlisis Instrumental. Prentice Hall, Espaa, Pg. 636-

677. Ao 2001. - Cavazos R, N. A.; Rivera Z, L.; Torres de Navarro, E. Determinacin de fsforo y

cafena en bebidas de cola. Educacin qumica. V.12, pg. 116-120, ao.2001. - http://www.fad.es/sustancias/psicofrmacosestimulantes. DETERMINACIN DE CAFENA EN REFRESCO (PEPSI) Justificacin El consumo de refrescos es importante a nivel mundial. Se piensa que los refrescos de cola son bebidas relativamente inofensivas y que un excesivo consumo de estos productos no causa ms dao que caries dental y un aumento de peso, debido al alto contenido de azcar. Un refresco contiene cido fosfrico, cafena y nuez de cola entre sus componentes principales, estas sustancias pueden llegar a causar diferentes trastornos al organismo. El fsforo est relacionado con el calcio tanto en la nutricin humana como en la absorcin de este mineral. La cafena, por su parte, es la droga psicotrpica de mayor consumo en el mundo. Es un compuesto alcaloide (del grupo de las xantinas) que acta como estimulante en los humanos. La cafena produce vasoconstriccin; presenta efectos a nivel de los sistemas cardiovasculares, respiratorios y gastrointestinales. Adicionalmente, acta a nivel de los msculos esquelticos, del flujo sanguneo renal, la glucogenlisis y de la liplisis. El consumo en cantidades muy grandes puede provocar una intoxicacin. Sus sntomas son insomnio, nerviosismo, excitacin, cara rojiza, aumento de la diuresis y problemas gastrointestinales. En algunas personas los sntomas aparecen consumiendo cantidades muy pequeas, como 250 mg por da. Ms all de un gramo al da puede producir contracciones musculares involuntarias, desvaros, arritmia cardiaca, y agitaciones psicomotrices. Los sntomas de

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la intoxicacin con cafena son similares a los del pnico y de ansiedad generalizada. La *LD50 estimada de la cafena es de 10 g, cuyo equivalente es de un promedio de 51 tazas de caf. Objetivos General: - Determinar el contenido de cafena en un refresco (PEPSI) por HPLC. Especficos: - Ajustar las condiciones experimentales para la determinacin de la cafena en el

refresco. - Determinar el contenido de cafena en la muestra problema aplicando el mtodo de

calibracin absoluta. - Determinar la exactitud y la precisin de los resultados analticos obtenidos a travs

del mtodo aplicado. Parte Experimentales Condiciones Experimentales - Volumen de inyeccin 10L - Deteccin a 254 nm - Flujo y presin a optimizar - Fase mvil a optimizar (usualmente: 60% agua, 40% metanol) Preparacin de la curva de calibracin.

Preparacin de la muestra

Desgasificar la muestra con ultrasonido por 15 min o una corriente de He por 3 min.

Diluir la muestra (4 veces), filtrar < 45 um e inyectar al cromatgrafo

Se prepara una madre de 2000 ppm de cafena.

Preparar por dilucin patrones de 10, 20, 30, 40 y 50 ppm

Inyectar bajo condiciones ptimas de presin y flujo y graficar los valores de rea de pico vs concentracin

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DETERMINACIN DE CAFENA, ACETAMINOFN Y/ ACIDO ACETILSALICLICO EN ANALGSICOS. Justificacin Los analgsicos son medicinas que reducen o alivian los dolores de cabeza, musculares, artrticos y muchos otros achaques y dolores. Existen muchos tipos diferentes de analgsicos y cada uno tiene sus ventajas y riesgos. Algunos tipos de dolor responden mejor a determinadas medicinas que a otras. Adems, cada persona puede tener una respuesta ligeramente distinta a un analgsico. La cafena es una sustancia bastante conocida por todos pero de la que en realidad, se ignoran muchos aspectos que pueden influir en la actividad fsica. La cafena ha sido consumida por el hombre desde hace siglos. Constituye la sustancia psicoactiva ms empleada en el mundo y se encuentra naturalmente en las hojas de t, los granos de caf y en el cacao. La cafena es un estimulante directo y moderado del sistema nervioso central y tambin estimula el corazn y el sistema cardiovascular. La combinacin del acetaminofn y la cafena tienen como finalidad obtener un sinergismo en cuanto al efecto analgsico. La cafena se ha usado durante muchos aos como adyuvante analgsico. Sin embargo, los efectos analgsicos adyuvantes de la cafena no han sido seriamente investigados desde un pool de anlisis que se realizaron en 1984 y que demostraron que la cafena reduce la cantidad de acetaminofn que se necesita para conseguir el mismo efecto en aproximadamente un 40%. Investigaciones in-vitro e in-vivo han proporcionado alguna evidencia de que la cafena puede tener acciones antinociceptivas por medio del bloqueo de los receptores de la adenosina, inhibicin de la sntesis de la ciclo-oxigenasa-2, o por cambios en estados de emocin. Pero esta accin slo se tiene en cuenta en algunos casos. Esto sugiere que las actuales dosis usadas de analgsico y cafena pueden influir en los efectos analgsicos adyuvantes de la cafena. Ensayos clnicos sugieren que la cafena en dosis mayores de 65mg puede ser provechosa para el aumento de la analgesia, sin embargo, excepto para el dolor de cabeza, los beneficios son ambiguos. En este experimento se determinar el contenido de la cafena, acetaminofn y/o acetilsaliclico presente en analgsicos disponibles comercialmente, usando la tcnica de curva de calibracin externa. Para ello se estudiarn los efectos que tiene el cambio de la composicin de la fase mvil sobre la separacin de los componentes de una mezcla patrn de estos compuestos y se realizar un estudio cualitativo para determinar que componentes estn presentes en la muestra para su posterior estudio cuantitativo.

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Objetivos.

GGeenneerraall:: -- Determinar el contenido de cafena, acetaminofn y/ acido acetilsaliclico en

frmaco usando la tcnica de cromatografa de lquidos de alta eficiencia (HPLC). EEssppeeccffiiccooss:: - Optimizar las condiciones de anlisis para la mezcla de componentes en el frmaco - Determinar cuantitativamente los componentes el frmaco mediante curva de

calibracin externa. - Comparar la precisin del anlisis y la precisin del lote de pastillas. Parte Experimental Condiciones Experimentales - Volumen de inyeccin: 10 L - Deteccin a 254 nm - Flujo y presin a optimizar - Soluciones para preparar las fase mvi: - Solucin A: 1000 mL de una solucin acuosa al 1% cido actico - Solucin B: 1000 mL de una solucin de Metanol grado HPLC al 1% cido actico (El cido actico se emplea para igualar la fuerza inica de las fases y no define la polaridad de las mismas). Anlisis Cualitativo Procedimiento: - Prepare soluciones madres de 1000 mg/L de cada patrn. Para ello se disuelve el

slido correspondiente en 40,0 mL de la solucin B y se enrasa a un volumen 100,0 mL usando la solucin A.

- Prepare por dilucin soluciones patrn: Prepare 25 mL de soluciones estndares que contengan: a) 10 mg/L de acetaminofn; b) 300 mg/L de acetilsaliclico; y c) 60 mg/L de cafena. Use la fase mvil A para enrasar cada una de ellas.

- Prepare 50 mL de una solucin estndar que contenga la mezcla de: 10 mg/L de acetaminofn, 300 mg/L de acetilsaliclico y 60 mg/L de cafena. Use la fase mvil A para realizar el enrase.

- Prepare la solucin de muestra de acuerdo al procedimiento descrito en las practicas anteriores

Efecto de la composicin de fase mvil sobre la separacin Estudie el efecto del efecto de las fases mviles de la tabla sobre la separacin de los tres componentes en la muestra en estudio.

Fase Mvil % A (H2O/Hac) % B (CH3OH/Hac)1 80 20 2 55 45 3 65 35

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a- Inyecte la solucin patrn mezcla de los componentes, filtrando previamente < 45 um y emplee la fase mvil de polaridad intermedia, as como el flujo y presin intermedios. b. De acuerdo al cromatograma obtenido, razone el cambio de la fase mvil que debe utilizar para la separacin apropiada de los componentes. c. Empleando la fase mvil apropiada, modifique el flujo y luego la presin para obtener el mejor cromatograma. d- Bajo las condiciones ptimas inyecte las soluciones de cada patrn por separado para identificar cada componente. Anlisis Cualitativo en la muestra - Prepare una solucin de su muestra desconocida pesando 150 mg y disolviendo en 20 mL de la mezcla B y enrase a un volumen de 50,0 mL usando la solucin A. - Para determinar los componentes de mayor concentracin diluya 0,1 mL de la solucin anterior en un baln aforado de 10 mL usando la solucin A. Inyecte la solucin y obtenga el cromatograma bajo las condiciones ptimas determinadas para la solucin patrn mezcla. - Para determinar los componentes de menor concentracin de la muestra tome una alcuota de 2 mL de la solucin anterior y afore a 10 mL en un baln usando la solucin A. Inyecte la solucin y obtenga el cromatograma bajo las condiciones ptimas determinadas para la solucin patrn mezcla. - Compare los tiempos de retencin obtenidos para los picos en los cromatogramas de su muestra de analgsicos e identifique los compuestos presentes en ella. Nota: Filtre las soluciones de muestra < 45 um antes de inyectarlas al cromatgrafo. Curva de calibracin. Anlisis de la muestra

Prepare cuatro patrones multicomponentes en balones de 10,0 mL o 25,0 mL y afore con Solucin A

Compuesto Intervalo de concentracin Acetaminofen 5 - 20 ppm

cido acetilsaliclico 100 - 400 ppm Cafena 20 - 80 ppm

Inyecte cada solucin y grafique los valores de rea de pico en funcin de la concentracin. Compruebe la linealidad de la curva.

Pese y pulverice tres pastillas por separado

Pese 0,1500 g de cada una de ellas y disuelva por separado en 40,0 mL de la solucin B. Enrase a 100,0 mL usando la solucin A

Filtre 5 mL de las muestras con un filtro de celulosa o nylon de 0,45 um e e inyecte al cromatgrafo por separado

Diluya cada una de las soluciones (0,1 0,2 mL en 10 mL) para determinar los componentes de alta o baja concentracin, respectivamente

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Nota. Realice el procedimiento por triplicado para una de las pastillas,. El reporte se realiza como: - Promedio del anlisis de las tres pastillas: Masa de componente por tableta (mg por tableta) Masa de componente / masa de pastilla (en las unidades que correspondan) - Promedio del triplicado de anlisis para una pastilla Masa de componente por tableta (mg por tableta) Masa de componente / masa de pastilla (en las unidades que correspondan) - Discuta si la dispersin de la composicin en el lote difiere de la precisin del anlisis. Referencias - Principios de Anlisis Instrumental Skoog Holler Nieman, 5ta Edicion, 2001

Editorial Mc Graw Hill. - Rubinson K, Rubinson J, Anlisis Instrumental. Prentice Hall, Espaa, Pg. 636-

677. Ao 2001. - http://www.osanet.euskadi.net/r85publ01/es/contenidos/informacion/sinopsis_cevim

e/es_1225/sinopsis099.html#02 - http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/painrelievers.html - ttp://www.howtodothings.com/es/salud-y-vida-sana/c%C3%B3mo-utilizar-la-

cafe%C3%ADna-para-el-tratamiento-de-las-migra%C3%B1as.