União das Faculdades dos Grandes Lagos

Enfermagem, 1º período

Biologia Celular

Fernanda Carmone da Silva

Métodos de estudos das células

São José do Rio Preto

2013

Introdução

Como as células são pequenas e complexas, é difícil ver sua estrutura, descobrir sua

composição molecular e, ainda mais difícil, descobrir como seus vários componentes

funcionam. As ferramentas a nossa disposição determinam o que podemos aprender sobre

as células, e a introdução de novas técnicas frequentemente tem resultado em maiores

avanços na biologia celular. Parar compreender a biologia celular contemporânea é

necessário conhecer parte de seus métodos.

Visualização de células ao microscópio óptico

Uma limitação fundamental de todos os microscópios é que certo tipo de radiação não pode

ser utilizado para examinar detalhes estruturais muito menores do que o seu próprio

comprimento de onda. O limite fundamental para a resolução de um microscópio óptico é,

portanto, estabelecido pelo comprimento da onda de luz visível, que varia cerca de 0,4 µm

(para violeta) até 0,7 µm (para vermelho-escuro). Em termos práticos, as bactérias e as

mitocôndrias, que tem cerca de 500 nm (0,5 µm) de largura, geralmente são os menores

objetos dos quais o formato pode ser claramente discernido ao microscópio óptico; detalhes

menores do que esses são ocultados pelos efeitos resultantes da natureza da onda da luz.O

limite de separação pelo qual dois objetos ainda podem ser vistos como distintos, depende

tanto do comprimento de onda da luz quanto da abertura numerica do sistema de lentes

utilizado.

Quanto maior a abertura do microscópio, mais claramente o objeto pode ser visualizado.

Com luz violeta e uma abertura numérica de 1,4 o microscópio óptico pode alcançar, um

limite de resolução logo abaixo de 0,2 µm. Embora seja possível aumentar uma imagem o

quanto quisermos, jamais será possível distinguir dois objetos ao microscópio óptico que

estão separados por menos de µm, eles aparecerão como um único objeto. As células vivas

são vistas claramente em um microscópio de contraste de fase ou em um microscópio de

contraste de interferência diferencial. A única maneira de evitar que alguns componentes da

celular sejam perdidos ou alterados durante a preparação da amostra, é examina-las

enquanto estão vivas, sem fixa-las ou congela-las. Para isso, os microscópios ópticos com

sistemas ópticos especiais são especialmente uteis. O microscópio de contraste de fase e

o microscópio de contraste de inferência diferencial, exploram os efeitos de interferência

produzidos quando esses dois conjuntos de ondas se recombinam, criando uma imagem da

estrutura da celular. No microscópio de campo escuro, os raios de luz que iluminam são

direcionados pela lateral, de forma que somente a luz difundida passe pelas lentes do

microscópio. A célula aparece como um objeto iluminado contra o fundo escuro. Com um

microscópio normal de campo claro, a luz que passa através de uma célula em cultura,

forma a imagem diretamente. As microscopias de contraste de fase, de contraste de

interferência diferencial e de campo escuro tornaram possível visualizar os movimentos

envolvidos em processos como a mitose e a migração celular. Os sistemas eletrônicos, ou

digitais, de imagem e a tecnologia de processamento de imagens associada tiveram um

maior impacto na microscopia óptica. Algumas limitações práticas dos microscópios foram

em grande parte superadas. Os sistemas de imagem eletrônica também contornaram duas

limitações fundamentais do olho humano: o olho não pode ver bem com luminosidade muito

diminuída e não pode perceber pequenas diferenças de intensidade de luz contra um fundo

luminoso. Para aumentar nossa capacidade de observar células em condições de baixa

luminosidade, podemos acoplar uma câmara digital sensível a um microscópio, então é

possível observar as células por longos períodos a níveis muito baixos de luminosidade.

Como as imagens produzidas por câmaras estão na forma eletrônica, elas podem ser

prontamente digitalizadas, transferidas para um computador e processadas de varias

maneiras para extrair informações. O processamento da imagem digital pode superar as

limitações dos olhos. Como a maioria das amostrar de tecido é muito espessa para que

suas células individuais sejam examinadas, elas precisam ser cortadas em fatias

transparente muito finas. Para imobilizar, matar e preservar as células no tecido elas devem

ser tratadas com um fixador, que formam ligações covalentes com os grupos amino livres

das proteínas, de modo que sejam estabilizados e imobilizados na posição.

Como os tecidos são macios e frágeis, necessitam ser envolvidos em um meio de suporte

antes de serem seccionados. Os meios comuns de emblocamento são ceras ou resinas.

Então podem ser endurecidos e seccionados. Depois disso, para impedir a passagem dos

feixes de luz, existem três abordagens principais para trabalhar com as secções.

Primeiro, as secções podem ser coradas com corantes orgânicos que tem alguma afinidade

especifica por determinados componentes subcelulares. Segundo, tecidos seccionados

podem ser utilizados para visualizar padrões específicos de expressão genica diferencial. E

terceiro, um método utilizado para localizar proteínas de interesse, que podem ser

localizadas nas células por microscopia de fluorescência. Os corantes fluorescentes

utilizados para corar as células são detectados por um microscópio de fluorescência, que é

semelhante a um microscópio óptico comum, exceto que a luz utilizada para iluminação,

passa através de dois conjuntos de filtros. O primeiro filtro permite apenas a passagem de

comprimentos de onda de excitem um determinado corante fluorescente, já o segundo

bloqueia a passagem desta luz, permitindo somente a passagem daqueles comprimentos de

onda emitidos quando o corante fluoresce. Os anticorpos, quando marcados com corantes

fluorescentes, tem um valor inestimável para localizar moléculas com partículas

eletrodensas. Quando utilizamos anticorpos como sondas para detectar e verificar

moléculas específicas nas células, frequentemente aumentamos o sinal fluorescente que

eles produzem por métodos químicos. O microscópio confocal alcança um resultado

similar aquele da deconvolução, mas o faz pela manipulação da luz antes de ela ser medida;

desta maneira, é uma técnica análoga, em vez de digital. Os detalhes ópticos do

microscópio confocal são complexos, mas a ideia básica é simples, e os resultados são

superiores aqueles obtidos por microscopia óptica convencional. O microscópio geralmente

é utilizado com óptica de fluorescência, mas em vez de iluminar toda a amostra de uma vez,

da maneira usual, o sistema óptico focaliza a qualquer instante um ponto de luz sobre um

único ponto da amostra, a uma profundidade especifica. O microscópio confocal tem sido

utilizado para resolver a estrutura de inúmeros objetos tridimensionais complexos, como as

redes de fibras citoesqueléticas no citoplasma e os arranjos de cromossomos e de genes no

núcleo. Uma maneira para estudar a química de uma única célula viva é inserir a ponta de

vidro de um microelétrodo sensível a íons diretamente no interior da celular, através da

membrana plasmática. Essa técnica é utilizada para medir concentrações intracelulares de

íons inorgânicos comuns. Em um microscópio TIRF, a luz do laser incide sobre a superfície

da cobertura de vidro no angulo critico preciso no qual a reflexão interna total ocorre. Por

causa dessa reflexão, a luz não penetra a amostra, e por isso, a maioria das moléculas

fluorescentes não é iluminada. Entretanto, apenas aquelas moléculas na camada mais

próxima a superfície tornam-se excitadas. Quando essas moléculas fluorescem, sua luz

emitida não esta mais competindo com a luz fora de foco das moléculas que estão acima,

podendo então ser detectadas.

Quatro tipos de microscopia óptica. Quatro imagens da mesma células de fibroblasto em

cultura. Todas as imagens podem ser obtidas com os mais modernos microscópios pela

troca dos componentes ópticos. (A) Microscopia de campo claro. (B) Microscopia de

contraste de fase. (C) Microscopia de constraste de interferência diferencial de Nomarski.

(D) Microscopia de campo escuro.

Imunofluorescência. (A) Uma micrografia eletrônica de transmissão da periferia de células

epiteliais em cultura, mostrando a distribuição dos microtúbulos e de outros filamentos.

(B) A mesma área corada com anticorpos fluorescentes contra tubulina, a proteína que se

monta para formar os microtúbulos, utilizando a técnica de imunocitoquímica indireta.

Comparação da microscopia de fluorescência convencional com a microscopia de

fluorescência confocal. (A) A imagem convencional não-processada é borrada pela

presença de estruturas fluorescentes acima e abaixo do plano de foco. (B) Na imagem

confocal, essa informação fora de foco é removida, resultando em uma secção óptica nítida

das células no embrião.

Visualização de células ao microscópio eletrônico

A microscopia óptica é limitada na fineza dos detalhes que ela pode revelar. Microscópios

que utilizam outros tipos de radiação podem resolver estruturas muito menores do que as

possíveis com luz visível. Essa resolução mais alta tem um custo: a preparação da amostra

para microscopia eletrônica é muito mais complexa e é muito mais difícil de ter certeza de

que a imagem visualizada corresponde precisamente a estrutura real sendo examinada.

Entretanto, é possível usar um congelamento muito rápido para preservar fielmente

estruturas para microscopia eletrônica. O microscópio eletrônico de transmissão é

semelhante a um microscópio óptico, embora seja muito maior e "invertido". A fonte de

iluminação é um filamento ou cátodo que emite elétrons do topo de uma coluna cilíndrica de

cerca de 2 m de altura. Como os elétrons são espalhados por colisões com moléculas de ar,

o ar precisa primeiro ser bombeado para fora da coluna para criar vácuo. A amostra é

colocada no vácuo, por meio de uma câmara de compressão, na trajetória do feixe de

elétrons. Como na miscrocopia óptica, a amostra em geral é corada. Alguns dos elétrons

que atravessam a amostra são espalhados pelas estruturas coradas com material

eletrodenso; o restante é focado para formar uma imagem de uma maneira análoga ao

processo de formação de uma imagem no microscópio óptico. A imagem pode ser

observada em uma tela fosforescente ou grava tanto em uma placa fotográfica como em

uma câmera digital de alta resolução. O contraste no microscópio eletrônico depende do

numero atômico dos átomos na amostra: quanto mais alto numero atômico, mais elétrons

espalhados e maior é o contraste. O Microscópio eletrônico de varredura, produz

diretamente uma imagem da estrutura tridimensional da superfície de uma amostra.

Normalmente é um aparelho menor, mais simples e mais barato do que um microscópio

eletrônico de transmissão. Ele utiliza os elétrons que são espalhados ou emitidos a partir da

superfície da amostra. A amostra a ser examinada é fixada, desidratada e coberta com uma

camada fina de metal pesado. Ela pode ser congelada rapidamente e então transferida para

um estágio resfriado da amostra, para exame direto no microscópio.

O microscópio eletrônico resolve a estrutura fina da célula. Esta secção fina é de uma célula

de levedura que foi rapidamente congelada e teve seu gelo vítreo substituído por solventes

orgânicos e então por resina plástica. Núcleo, mitocôndrias, parede celular, pilhas de Golgi e

ribossomos podem ser todos prontamente visualizados em um estado que provavelmente

seja o mais parecido possível com o real.

Microscopia eletrônica de varredura. (A) Uma micrografia eletrônica de varredura dos

estereocílios que se projetam de uma célula ciliada do ouvido interno de um sapo-boi. Para

comparação, a mesma estrutura é mostrada em (B) por microscopia óptica de contraste de

interferência diferencial e em (C) por microscopia eletrônica de transmissão a partir de

secções finas.

Citoquímica

Usado para identificar diferentes compostos químicos das células. Reações químicas

ajudam a mostrar estruturas intracelulares com colorações específicas. Podem ser usadas

amostras frescas. Pode ser aplicada em nível de microscopia óptica e de microscopia

eletrônica. No primeiro, o produto da reação citoquímica deve ser corado e no segundo,

deve dispersar elétrons. Os métodos citoquímicos têm por base reações químicas

específicas, ou a interação macromolecular de alta afinidade. Nos dois casos, o resultado

final é usualmente, a produção de compostos insolúveis, corados, ou elétron-densos, que

possibilitam a localização de substâncias específicas nos cortes de tecidos através do uso

do microscópio óptico ou eletrônico.

Algumas reações químicas são:

Azul da Prússia - Identificação de ferro

Peroxidase - Detecção da enzima mieloperoxidase

Sudan Black B - Revelação de lipídios

Ácido reativo de Schiff (PAS) - Evidenciação de carboidratos

Fostatase Acalina - Neutrófilos maduros, osso, fígado, rins, placenta. Ajuda a determinar a

atividade da célula.

Centrifugação

As técnicas que permitem o fracionamento celular e a obtenção de frações relativamente

puras de organelas contribuíram muito para o desenvolvimento da biologia celular. As

organelas são separadas pela centrifugação de um homogeneizado de células em que as

membranas plasmáticas são rompidas e os constituintes celulares dispersos em um meio

líquido, geralmente contendo sacarose (este glicídio é muito utilizado porque mantém a

integridade dos componentes celulares e evita a tendência de as organelas aglutinarem-se

quando as células se rompem). O isolamento de uma organela através de centrifugação

depende de seu coeficiente de sedimentação, isto é, do seu tamanho, forma e densidade,

bem como da densidade e a viscosidade da solução em que está sendo centrifugada. A

centrifugação fracionada consiste em uma série de centrifugações a velocidades crescentes.

As organelas ou inclusões maiores e mais densas sedimentam primeiro, o sobrenadante de

cada centrifugação é centrifugado de novo, porém em maior velocidade. Desse modo, os

componentes celulares vão sendo sucessivamente separados. Em geral o sobrenadante

que permanece após a última centrifugação é denominado fração solúvel. Na centrifugação

contragradiente as partículas são separadas por suas diferenças de densidade. O gradiente

consiste em uma solução cuja concentração é máxima na parte profunda do tubo de

centrifugação e mínima na superfície, apresentando um aumento gradual de concentração

de cima para baixo. Sobre esse gradiente estabilizado coloca-se o homogeneizado celular e

faz-se a centrifugação. As partículas migram em direção centrífuga e param onde ocorre um

equilíbrio entre a ação da força centrífuga e a tendência de flutuação da partícula. Tais

etapas e técnicas são realizadas em baixas temperaturas, para impedir que os sistemas

enzimáticos funcionem, o que lesaria as organelas durante sua separação.

Romatografia em coluna

As proteínas e os ácidos nucléicos isolados das células são frequentemente separados por

esta técnica. Ela baseia-se no fato de que, quando se faz uma mistura de proteínas

dissolvidas em água passar por uma coluna constituída por uma matriz sólida e porosa,

contida num tubo de vidro, a velocidade de migração das diferentes proteínas varia

conforme a interação de cada uma delas com a matriz. Mandando-se um fluxo contínuo de

proteínas, que sai pela parte inferior da coluna, pode-se coletar separadamente as proteínas

contidas na amostra inicial. A técnica é muito usada para purificação de anticorpos.

Autoradiografia

Pode ser aplicada como uma técnica citoquímica para a detecção de isótopos radioativos no

interior do tecido. Baseia-se na sensibilidade das emulsões fotográficas às radiações

ionizantes. Como não existem átomos radioativos nas células, pode-se seguir a

incorporação e a migração de compostos radioativos introduzidos nas células com

finalidades experimentais.

Eletroforese em gel

Essa técnica tem diversas variantes para esclarecer diversos problemas. Uma delas é para

determinar o tamanho das moléculas proteicas. Colocando a mistura de proteínas sobre o

gel e subtendo a um campo elétrico, faz com que todas as moléculas migram na direção do

pólo positivo. A velocidade dessa migração dependerá exclusivamente do tamanho da

molécula de cada cadeia polipeptídica.

Conclusão

Várias técnicas de microscopia estão disponíveis para observar as células e cada uma tem

um propósito diferente. Essas técnicas contribuem muito para o conhecimento sobre elas,

mas as que foram citadas são apenas algumas das utilizadas. Atualmente existem técnicas

disponíveis para detectar, medir e seguir quase que qualquer molécula em uma célula viva,

ajudando cada vez mais o estudo das mesmas.

Referências:

ALBERTS, Bruce. Biologia Molecular da Célula. 5ª Ed. Artmed, 2010.

Em: <http://amigonerd.net/biologicas/farmacia/metodos-para-estudo-das-celulas>