Métodos para la siembra y

mantenimiento de virus en

laboratorio.

A diferencia de lo que sucede con la mayoría de las bacterias, hongos y protozoos, sólo

pueden multiplicarse en el interior de las células vivas, no pudiendo hacerlo en un

medio nutritivo carente de células.

Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son:

Animales de experimentación

Embriones animales

Cultivos celulares artificiales

Animales de experimentación:

La inoculación en animales de experimentación de muestras clínicas o de virus para su

aislamiento o propagación, es una técnica poco empleada debido a diversas dificultades

como el entrenamiento de los animales, la laboriosidad de la inoculación y el peligro de

difusión del virus con las excretas de las animales.

Se emplea únicamente cuando se trata de propagar virus cuya replicación en los otros

sistemas - embriones cultivos celulares - no es posible. Los animales más utilizados:

monos, los cobayos y los ratones lactantes.

Embriones animales

Los más utilizados son los embriones de pollo, los huevos fecundados se incuban hasta

el momento de su inoculación que suele oscilar entre 5 y 14 días. Las inoculaciones, que

pueden realizarse en diversas zonas del embrión (cavidad amniótica, saco vitelino o

cavidad alantoidea).

Se requiere de experiencia para su realización debido al tipo de inoculación y

extracción. La inoculación en la cavidad amniótica es la más utilizada para el

aislamiento del virus a partir de muestras clínicas.

Los virus sólo pueden reproducirse en determinadas partes del embrión; por

consiguiente, se deben inyectar en la región apropiada, ej. Losmixovirus crecen bien en

la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad

alantoidea. La infección puede producir una lesión tisular local conocida como pústula,

cuyo aspecto, a menudo, es característico del virus.

El método exacto de inoculación y la edad del embrión

Que se emplea, dependen del virus problema. ej. Para aislar en forma primaria el virus

de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en la

cavidad amniótica de embriones de 7 a 8 días; pero el virus se duplica fácilmente en la

membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 días, después de varias resiembras

(“adaptación”) en el amnios. Los focos más utilizados para la inoculación, a parte de las

cavidades amniótica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino.

Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrión en desarrollo,

recurriendo a la inoculación intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se

duplicó el virus dentro de las células de las membranas o del embrión, puede liberarse a

los líquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej. el

virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrión y en las

células de la membrana amniótica, pasa al líquido amniótico, que luego puede recogerse

con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes,

que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las células en las

lesiones o “pústulas” que se forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una

solución salina isotónica las membranas, logran liberarse estos virus.

En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrión de pollo puede provocar la

muerte del embrión (p.ej. virus de la encefalitis), producir pústulas o placas sobre la

membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas

en los líquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante

(p.ej. poliovirus tipo 2).

En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la técnica de

inoculación de huevos embrionados al correlacionar el número de pústulas contadas con

la dilución viral inoculada.

Actualmente el método preferido para cultivar virus de influenza aviar es la inoculación

en huevos embrionados libres de patógenos específicos (SPF) o huevos negativos a

anticuerpos específicos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de las muestras se

inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 días de incubación y se

incuba a 35-37ºC durante 4-7 días. Luego los huevos con embriones muertos, cuando

esto ocurra, o los que queden al final del periodo de incubación se refrigeran a 4 ºC y el

líquido alantoideo se chequea con la prueba de hemaglutinación. Si se detecta actividad

de hemoaglutinatión hay una probabilidad alta de la presencia de virus A de influenza o

de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reacción negativa deben inocularse al

menos en otro lote de huevos.

Entre los lugares deinoculación tenemos:

Membrana Corioalantoidea: Se emplean embriones de 10 – 12 días y

La cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.5 ml. Apropiada especialmente para el aislamiento

y cultivo de virus variolicos; virus de laringotraqueitis aviar y de la enfermedad de

Beyer(Pseudorrabia); que provocan focos o pústulas fácilmente visibles.

Cavidad Alantoidea: Se emplean embriones de 9 – 12 días y la

Cantidad de inoculo es de 0.1 – 0.2 ml. Entre los virus que desarrollan en el endodermo

alantoideo tenemos: peste, New Castle, virus de la bronquitis infecciosa, encefalitis

equina occidental y oriental Venezuela, parotiditis. Ventaja: simplicidad de la

inoculación y toma de muestra

Cavidad Amniótica

Se emplean embriones de 7 – 15 días y la cantidad de inóculo es de 0.1 – 0.2 ml. la edad

de los mismos depende fundamentalmente del tipo de virus o del estudio que se realiza.

Saco Vitelino

Se emplean embriones de 5 – 8 días de incubación y la cantidad de inóculo es de 0.2 – 1

ml. Vía es sumamente adecuada para el aislamiento y cultivo de los virus de

enfermedades venéreas, neumonía y rickettsias. El vitelo es empleado para la

preparación de vacunas y como antígeno para reacciones serológicas de los virus ya

mencionados.

Vía Intravenosa

La membrana corialantoidea está irrigada por vasos sanguíneos, es susceptible de

inoculación para casos especiales, virus queocasionan cambios hematológicos; por

ejemplo, virus de la Leucemia. Son empleados embriones de 10 - 15 días y la cantidad

de inóculo es de 0.02 - 0.05 ml.

Vía Intracerebral (embrión)

Se emplea embriones de 8 – 14 días, específicamente para virus que producen

alteraciones cerebrales: la rabia, herpes, etc; 0.01 –0.02 ml.

EFECTO CITOPÀTICO (CPE),´

Los virus invaden las células causando normalmente algún tipo de cambio visible en el

crecimiento de las células .Ejemplo efecto citopàtico (CPE), es un deterioro delas

células del cultivo de tejidos causado por el virus.´

La CPE puede tener diferentes aparienciasdependiendo de un virus particular y del tipo

decélulas en el cultivo.

Cambios morfológicos visibles en célulasinfestadas con virus.

Incluye la paralización del ARN celular y de lasíntesis de proteínas, fusión celular,

liberaciónde enzimas lisosomales, cambios en lapermeabilidad de las membranas

celulares,cambios difusos de las estructurasintracelulares, presencia de cuerpos

deinclusión virales, y aberraciones cromosómicas

EFECTOS CITOPATOGÉNICOS´

Los efectos citopatogénicos virales aportan unvalioso método para la identificación

yclasificación de los virus que producen lainfección.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material de Laboratorio:

• Ovoscopio.

• Tijera Quirúrgica.

• Agua Destilada.

• Azul de Metileno.

• Agujas Hipodérmicas.

• Placas Petri amplias.

Los virus pueden propagarse en las membranas extraembrionarias o en el propio

embrión. Anatómicamente el huevo embrionado de gallina presentan en su estructura

las siguientes partes:

1.- Embrión

2.- Cavidad amniótica

2a.- Membrana amniótica

3.- Saco vitelino

4.- Albúmina

5.- Cavidad alantoidea

6.- Membrana corioalantoidea

7.- Membrana externa del huevo

8.- Cáscara

9.- Cámara de aire

Cultivos celulares

Se trata de multiplicar y mantener células in vitro. La células se obtienen de un

fragmento de un órgano u embriones de pollo, por trituración y posterior disgregación

con tripsina (enzima), lo que permite obtener células aisladas que se introducen en

frascos con medos de cultivo líquidos adecuados (botellas o placas Petri).

Las células en los frascos pueden estar en suspensión, es decir, libres en el medio de

cultivo líquido o adosadas a la pared del frasco y bañadas por el medio (las células

producen un material glicoprotéico que permite su adhesión a las superficies). En el

primer caso se trata de células en suspensión y en segundo en monocapa.

El medio de cultivo utilizado para los cultivos celulares es bastante complejo, e incluye

aminoácidos, vitaminas, sales, glucosa y buffer de bicarbonato. Para un mejor

crecimiento, se da la adición de una pequeña cantidad de suero sanguíneo, y también

suele añadirse varios antibióticos para impedir la contaminación bacteriana. También se

añade un indicador de pH coloreados para evidenciar esta contaminación.

Algunos cultivos celulares pueden crecer indefinidamente y constituyen las llamadas

líneas celulares permanentes, estos cultivos son más convincentes para investigación

vírica. En otros casos no ocurre un crecimiento indefinido, pero permanece vivo por

unos días, estos son los llamados cultivos primarios, que aunque también sean útiles hay

que prepararlos en cada análisis.

Acción citopática: Lesión que causan algunos virus a las células in vitro. Pueden ser

intensas y precoces, produciendo en 24 o 48 horas la muerte celular, acompañada de

lisis fácilmente observable al inspeccionar los cultivos celulares con microscopio.

El efecto citopático es muy diferente debido al tipo de virus. En otras ocasiones las

alteraciones morfológicas que se producen en las células son mínimas o tardías y muy

difíciles de detectar. En las células infectadas por determinados virus pueden observarse

cuerpos de inclusión.

Los cuerpos de inclusión pueden visualizarse, después de la tinción de las células con

hematoxilina-eosina, como masas con morfología más o menos característica y

localización nuclear o citoplasmática típica, según los virus que los originan. Están

constituidos por acúmulos del material vírico sintetizado depositados en zonas celulares

alteradas.