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DIAGNOSE DE VIROSES
DE PLANTAS
• DOENÇAS DE PLANTAS DE ETIOLOGIA VIRAL Grandes perdas últimas décadasAtividade humana (direta ou indireta).
• FATORESFacilidade de transporte de materiais (vírus e vetores)
• O mais importante passo para manejo de doenças de etiologia viral é a correta identificação!
INTRODUÇÃO
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
INTRODUÇÃO - Diagnose de fitoviroses
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
• IDENTIFICAÇÃO do agente causal – Medidas de Controle
• FITOPATÓGENOS - Sinais (externos)
Vírus?
• Testes para comprovação agente causal
DIAGNÓSTICO DE VÍRUS - Dificuldades
• Tamanho (pequenos)
• Pouca diversidade morfológica
• Sintomas similares (esp. distintas)
• Sintomas variáveis (mesma esp)
– cultivar
– condições ambientais
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
Testes de diagnose: rápidos, eficientes e baixo custo
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DE VIROSES VEGETAIS
1- BIOLÓGICO: propriedades biológicas: morfologiae gama de hospedeiros, modos de transmissão
2- SOROLÓGICO: detecção da proteína capsidial
3- MOLECULAR: detecção do ácido nucléico
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS DOS MÉTODOS
- Rapidez
- Custo
- Precisão
MÉTODOS BIOLÓGICOS
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
Métodos Biológicos
Morfologia, Microscopia eletrônica
Gama de hospedeiros
Transmissão
- Observação de:Partículas viraisInclusões virais
Inoculação:
-Gama de hospedeiras(comparação sintomas)
-Vetores:
Nematóides,
Fungos,
Insetos
(aleirodídeos, afídeose cigarrinhas)
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
1. MICROSCOPIA ELETRÔNICA
- Morfologia (tamanho, forma, envelope)
- Inclusões características: Potyvirus, Caulimovirus
- Partículas virais: confirmar a etiologia viral
- Limitações: custo, equipamento e mão-de-obra.
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
TOBACCO MOSAIC VIRUS - TMV
POTATO VIRUS Y - PVY
CUCUMBER MOSAIC VIRUS - CMV
BEAN GOLDEN MOSAIC VIRUS - BGMV
INCLUSÕES CITOPLASMÁTICAS PVY
SINTOMAS
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
SINTOMAS DAS VIROSES VEGETAIS- Pequeno valor diagnóstico
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
SINTOMA - espécies diferentes de vírus.
MESMO VÍRUS –CMV – Mais de 1000 hospedeiras, sintomas diferentes
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
.
SINTOMAS SEMELHANTES
- Deficiências nutricionais
- Toxinas produzidas por insetos
- Toxidez por agroquímicos
- Alta temperatura
- Distúrbios de origem genética
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
.
SINTOMAS DAS VIROSES VEGETAIS
Doenças bem conhecidas
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
Vira-cabeça do tomateiro (Tomato spotted wilt virus - TSWV)
- Sintomas de acordo com a hospedeira
- Especificidade por determinada sp (ou var da mesmasp.)
Nicotiana spp.
Chenopodium spp
Datura spp.
- Inoculação mecânica, vetor ou enxertia do suco daplanta infectada
3. GAMA DE HOSPEDEIRAS
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
Planta Indicadora
-A planta indicadora apresentará um quadrosintomatológico característico
-Algumas plantas indicadoras exibem sintomascaracterísticos de determinados vírus
-A técnica se dá com a inoculação do suco daplanta a ser testada
Chenopodium quinoa
Sintomas em plantas indicadoras de vírus transmitidos de forma mecânica
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
2. TRANSMISSÃO
- Vetores
- Inoculação Mecânica
- Enxertia
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
INOCULAÇÃO COM VETOR
CONSIDERAR:
- Espaço em casa de vegetação
- Experiência com inoculação por vetores evariabilidade do hospedeiro, vírus e ambiente
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
INOCULAÇÃO MECÂNICA
MÉTODOS SOROLÓGICOS
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
SOROLOGIA
Reação antígeno e anticorpo.
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
- Adaptado para amostra vegetais (Clark & Adams, 1977)
Sistema imunológico
ImunógenoAntígeno
Proteínas,polissacarídeos,glicoproteínas,
Anticorpos Ig ( A, D, E, G e M)
Sangue: remoção de glóbulos vermelhos e o líquido amarelo-palha
soro
anticorpos específicos e reconhece o antígeno que lhe originou
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
Teste de imunoadsorção com enzima ligada ao anticorpo (enzyme-linked imunosorbent assay ELISA)
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
• Antígeno• Anticorpo• Anticorpo conjugado a E (fosfatase alcalina)• Substrato E (Para-Nitro-Fenil-Fosfato ou
BCIP e NBT)
COMPONENTES
TIPOS DE ELISA • Direta: DAS (Double Antibody Sandwich)
• Indireta:
- Reação enzimática amplia a reação sorológica: Sensibilidade
ELISA DIRETA
Y
Y
Y
YE
= IgG específico
Lavar
Lavar
Lavar
Vírus imobilizado pelo IgG
( = vírus)
Vírus reage com IgG -E
IgG-E: detecção
YE= enzima conjugada ao IgG
Substrato da enzima
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
Y
Intensidade da cor em valores numéricos
ELISA INDIRETA
YE
Lavar
Lavar
Lavar
Vírus adsorvido
( = vírus)
IgG-E detecção colorimetricamente
E = enzima conjugada ao IgG produzido
em cabra (cabra anti-coelho)
Y Vírus imobilizado reage com IgG conjugado
Y =imunoglobulina IgG (produzido em coelho)
YY
Substrato da enzima
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
Intensidade da cor em valores numéricos
ELISADIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
Indireto Anticorpo
Direto Partícula Viral
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
Elisa Direta- Extremamente sensível eespecífico para o vírus que lhedeu origem.
- Detecta a partícula viral
- Um conjugado para cadaantígeno
Elisa Indireta- Menos sensível, mais simples.
- Detecta anticorpos
- Conjugado pode ser usadocontra qualquer tipo devírus(IgG -cabras reconheceIgG- coelho )
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
COMPARAÇÃO
MÉTODOS MOLECULARESHibridização Molecular
PCR
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
DNA
NUCLEOTÍDEOS
COMPLEMENTARIEDADE
HIBRIDIZAÇÃO MOLECULAR
• Conceito:Formação de fitasduplas entre fitas simples deácidos nucléicos
• Complementaridade dassequências de nucleotídeos
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
• Amplificação do Sinal.
2
Ácido Nucléico Imobilizado
Ácido Nucléico Imobilizado
Sonda
Sonda
Sondas Radioativas
** ** * * *
nucleotídeo radioativo (P-32)
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTASHibridização molecular
Membrana
Membrana
Sondas Não Radioativas Digoxigenina/PA
EY YYE EE YEYRevelar
NBT-BICP
Colorimetria
ECL
Quimioluminescência
TCGGCGT
TCGGCGT
AGCCGCA TG AA ATC
*
*
DNA viralDNA da planta
Sonda
Sonda
Nitrocelulose/náilon
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
PASSOS HIBRIDIZAÇÃO
- Dot-Blot- Tissue printing
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
PASSOS HIBRIDIZAÇÃO
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
PASSOS HIBRIDIZAÇÃO
1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
MM
1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
Sonda: 18S rRNA Sonda: TYLCV-IL
TX
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
DOT-BLOT
TISSUE- PRINTING1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
MM
TX
PCR (aqui)
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
1) Romper Paredes Celulares : liberar os constituintes celulares
Macerar N liq
2) Romper Membranas Celulares
Solventes CTAB, SDS
3) Proteger o DNA (DNAses)
Tam. pH 8 + EDTA
4) Separar AN de Ptna
Fenol: Clorof. (desnaturante)
EXTRAÇÃO DE DNA
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
5) Precipitar o AN
Isopropanol
6) Lavar e ressuspender AN
Alcool, H2O
EXTRAÇÃO DE DNA
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
Eletroforese em gel de agarose
Agarose + TBE + Brometo de et
Migração de mol.
Como visualizar o DNA?
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
PREPARANDO O SUPORTE PARA O GEL
PREPARANDO A AGAROSE + TBE
APLICAÇÃO DE AMOSTRAS EM GEL DE AGAROSE
VISUALIZAÇÃO EM UV
The Nobel - in Chemistry 1993
"for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method"
Kary B. Mullis USA
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
-Técnica baseada na amplificação de DNAdelimitada por dois primers
- O que são primers?Oligonucleotídeos (20-25 ntd)
Flanquear a região de interesse
- Qual a região de interesse?
- Qual a região de interesse?
- Begomovirus spp
-Tomato clorothic mottle virus?
PCR (Polymerase Chain Reaction)REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
DESNATURAÇÃO
ANELAMENTO
EXTENSÃO
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
93-94ºC
40 - 60ºC
72ºC
Etapas:
1 – Separação das fitas
2 – Anelamento dos primers
3 – Extensão da fita
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
35 CICLOS COM 3 ETAPAS CADA
2n
PRIMEIRO CICLO SEGUNDO CICLO TERCEIRO CICLO
SEPARAÇÃO DAS
FITAS E
ANELAMENTO
DO PRIMER
SÍNTESE
DE DNA
SEPARAÇÃO DAS
FITAS E
ANELAMENTO
DO PRIMER
SÍNTESE
DE DNA
SEPARAÇÃO DAS
FITAS E
ANELAMENTO
DO PRIMER
SÍNTESE
DE DNA
FRAGMENTO
DE DNA
ETAPAS DO PROCESSO
1- Extração DNA e/ou RNA (Transcriptase-Reversa)
2- Preparação de um ‘Mix’.
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
3- Termociclador
4- Eletroforese em gel de agarose
5- Revelação do gel
1) DNA molde2) Primer3) Enzima Taq DNA polimerase4) Tampão5) Cloreto de Magnésio6) Nucleotídeos7) Água
O que necessitamos para uma amplificação do DNA?
Sequenciamento PCR - Específico em caso de primers universais
TERMOCICLADORES
Depois da PCR concluída – Gel de agarose
Eletroforese em gel de agarose
M - - + + + - - - - - - - - +
DIAGNOSE DE VIROSES DE PLANTAS
1 Kb
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QUAL MÉTODO UTILIZAR ?
• Qual pergunta?Planta está infectada por vírus? Qual espécie viral?
• Sensibilidade do métodoQual quantidade viral o método pode medir ou detectar
• Acurácia e reproducibilidade
• Adaptabilidade as condições de cada laboratório
• Número de amostras que podem ser processadas Tempo – Número de operadores
• Grau de treinamento requerido
TÉCNICAS USADAS EM CONJUNTO.