microbilogia de bacterias anaerobicas

MICROBIOLOGIA Y MEDIOS DE CULTIVO

PRACTICAS DE LABORATORIO

Blgo. ALEJANDRO HANS RAMIREZ MUÑOZ

T.M. JACQUELINE BALQUI RIVERA

ICA – PERÚ

Microbiología y Medios de Cultivo – Práctica de Laboratorio

2

Ramirez - Balqui

3

MICROBIOLOGIA Y MEDIOS

DE CULTIVO

PRACTICAS DE LABORATORIO


4

Ramirez - Balqui

5

MICROBIOLOGIA Y

MEDIOS DE CULTIVO PRACTICAS DE LABORATORIO

EDICIONES CIENTIFICAS JACBARI S.R.Ltda. Av. Fernando León de Vivero. Urb. El Carmen C – 12 Ica – Perú. RUC: 10215479761 Se imprimieron 1000 ejemplares © Derechos reservados Primera Edición: Enero de 2004.


6

Ramirez - Balqui

7

INTRODUCCION

Esta primera edición, tiene como finalidad, al igual que publicaciones similares,

que el estudiante o profesional dedicado a la Microbiología cuente con un pequeño

manual que facilite el trabajo de laboratorio.

Esta edición, ha sido elaborada con algunos conceptos teóricos, hay también

nuevas tablas, gráficos y por supuesto se han agregado nuevos medios de cultivo; por

otro lado hay un reordenamiento de algunas tablas relacionadas con los discos de control

y susceptibilidad antimircrobiana. La presente edición consta de siete capítulos.

En el capítulo I se presentan algunos conceptos básicos de Microbiología Médica,

Microscopía y de la Taxonomía bacteriana. En el capítulo II se da la teoría esencial e

imprescindible para el conocimiento de las bacterias; es decir la estructura, nutrición y

metabolismo bacteriano.

En el capítulo III se desarrolla la teoría y metodología para una correcta

desinfección y esterilización, los agentes físicos y químicos y su acción sobre las

bacterias. En este mismo capítulo se ha comprendido lo más esencial sobre antibióticos,

como son su clasificación y su valoración.

En el capítulo IV se da el fundamento teórico y se desarrollan las técnicas para la

colaboración bacteriana; de la misma manera para la siembra, aislamiento y transplante

de bacterias tanto aerobias como anaerobias. En el capítulo V se da el conocimiento

teórico, clasificación y el correcto uso del material de laboratorio; incluyéndose además

los gráficos de un gran número de estos instrumentos.

En el capítulo VI se desarrolla lo concerniente a las definiciones básicas, métodos

de muestreo, aislamiento e identificación de microorganismos en los alimentos;

incluyéndose la moderna técnica de placa petrifilm.

Finalmente el VII y último capítulo trata de los medios de cultivo, razón de ser del

presente manual. Se desarrolla en cada uno de éstos su fundamento, composición,

preparación e interpretación. Solamente un adecuado empleo de los medios de cultivo

permitirá un correcto diagnóstico bacteriano.

Ica, Septiembre del 2003


8

Ramirez - Balqui

9

CONTENIDO

Pág.

Introducción

CAPITULO I. CONCEPTOS E HISTORIA DE LA MICROBIOLOGIA.

Introducción al concepto y contenido de la microbiología………………….. 16

Desarrollo histórico de la microbiología………………………………………. 17

Objeto de estudio de la microbiología………………………………………… 43

CAPITULO II. MICROBIOLOGIA MÉDICA, MICROSOCOPIA Y

TAXONOMIA BACTERIANA.

Microbiología Médica……………………………………………………………

Microscopía…………………………………………………….........................

Taxonomía bacteriana. Categorías taxonómicas…………..........................

Cepas o clones. Biotipos……………………………………...........................

Nomenclatura de las bacterias…………………………………………………

Patogenicidad y virulencia……………………………………………………...

Métodos inmunológicos en microbiología clínica…………………………….

Métodos moleculares en microbiología clínica……………………………….

Bacterias de interés médico (clasificación según Bergey)..........................

Bacterias de interés industrial………………………………..........................

CAPITULO III. INTRODUCCION A LA PRACTICA MICROBIOLOGICA

El ciclo del diagnóstico………………………………………………………….

Virulencia de los microorganismos…………………………………………….

Toma de muestra………………………………………………………………..

Transporte de muestras………………………………………………………...

Recepción de muestras y observaciones preliminares……………………...

Examen microscópico…………………………………………………………..

Procesamiento de los cultivos………………………………………………….


10

Interpretación de los cultivos…………………………………………………...

Informe de resultados………………………………………………………….

Seguridad en el laboratorio…………………………………………………….

Controles de calidad…………………………………………………………….

CAPITULO IV. ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO

BACTERIANO.

Estructura bacteriana. Pared celular…………………………………………..

Bacterias grammpositivas………………………………………………………

Bacterias grammnegativas……………………………………………………..

Bacterias ácido alcohol resistentes………………………….........................

Bacterias sin pared celular…………………………………………………….

Cápsula bacteriana……………………………………………………………...

Flagelo bacteriano……………………………………………..........................

Formas de las bacterias………………………………………………………...

Tamaño de las bacterias………………………………………………………..

Crecimiento bacteriano………………………………………………………….

Nutrición bacteriana……………………………………………………………..

Tipos tróficos de las bacterias………………………………………………….

Condiciones fisicoquímicas que influyen en el crecimiento bacteriano.......

Metabolismo bacteriano………………………………………………………...

Catabolismo o reacciones energéticas……………………...........................

Anabolismo o reacciones biosintéticas………………………………………..

CAPITULO V: EFECTO DE LOS AGENTES FISICOS SOBRE LAS

BACTERIAS.

Introducción: Efecto de los factores ambientales sobre las

bacterias………………………………………………………………...

Efecto de la Temperatura……………………………………………..

Liofilización……………………………………………………………..

Desecación……………………………………………………………..

Efecto de las radiaciones sobre las bacterias……………………...

Efecto de las ondas sonoras………………………………………….

Efectos de la presión hidrostática……………………………………

Efectos de la presión osmótica……………………………………….

Efectos del pH………………………………………………………….

CAPITULO VI: ACCION DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE LAS

Ramirez - Balqui

11

BACTERIAS.

Conceptos generales……………………………………………………………

Desinfectantes y antisépticos…………………………………………………..

Tipos de desinfectantes…………………………………………………………

Quimioterápicos de síntesis y antibióticos.…………………………………...

Qumioterápicos de síntesis…………………………………………………….

Antibióticos……………………………………………………………………….

Resistencia Bacteriana a los antibióticos……………………………………..

Bases genéticas de la resistencia……………………………………………..

Mecanismos bioquímicos……………………………………………………….

CAPITULO VII. COLORACION, SIEMBRA, AISLAMIENTO Y

TRANSPLANTE DE BACTERIAS.

Coloraciones bacterianas……………………………………………………….

Coloración Gram…………………………………………………………………

Coloración Ácidos Resistente (tinción de Ziehl – Neelsen)…………………

Coloración de cápsulas. Métodos de Hiss……………………………………

Siembra, aislamiento y transplante de bacterias…………………................

Aislamiento de bacterias aerobias en placas de Agar………………………

Métodos de siembra o transplante de bacterias aerobias en tubos……….

Aislamiento de microorganismos anaerobios………………………………...

CAPITULO VIII. INSTRUMENTACION, PROCEDIMIENTOS Y TECNICAS

DE LABORATORIO.

Normas de seguridad en el laboratorio de Microbiología…………………..

Material de laboratorio. Material de vidrio y otros……………………………

Equipos de laboratorio………………………………………………................

Limpieza del material de laboratorio y su esterilización…………................

Láminas ilustradas de los instrumentos y equipos de laboratorio………….

CAPITULO IX. MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS.

Definiciones.................................................................................................

Tipos de análisis a que pueden someterse los diferentes productos..........

Métodos de muestreo…………………………………………………………...

Preparación y dilución de las muestras de alimentos……………………….

Numeración de microorganismos aerobios, mesófilos viables…................

Numeración de Coliformes. Determinación del Número Mas Probable

(NMP)……………………………………………………………………………..


12

Numeración de Coliformes fecales. Determinación del NMP………………

Detección de Salmonella……………………………………………................

Numeración de Staphylococcus aureus coagulasa positivo………………..

Prueba de la Coagulasa………………………………………………………...

Prueba de la Termonucleasa…………………………………………………..

Aislamiento e identificación del Vibrio cholerae……………………………...

Técnica de la placa Petrifilm en recuento de E. coli y Coliformes…………

Técnica de placa Petrifilm para recuento rápido de S. aureus....................

CAPITULO X. MEDIOS DE CULTIVO.

Medios de Cultivo. Preparación, esterilización y conservación…………….

Clasificación de los Medios de Cultivo………………………………………..

Medios de transporte……………………………………………………………

Algunas pruebas en relación con el metabolismo bacteriano……………..

Relación de las bacterias con el oxígeno……………………………………..

Prueba de oxidación – Fermentación de Hugo – Leifson……….................

Bacterias fermentativas…………………………………………………………

Reacciones de la oxidasa………………………………………………………

Reacción de la catalasa………………………………………………………...

Reducción de los Nitratos………………………………………………………

Reacciones del Rojo Metilo y de Voges – Proskauer……………................

Reacciones basadas en el Catabolismo………………………………………

Productos resultantes de los procesos Anabólicos………………………….

Microbiología para pruebas del laboratorio clínico…………………………..

Detección de microorganismos productores de enfermedades……………

Cultivo de sangre………………………………………………………………..

Microbiología para el análisis de agua y aguas residuales.........................

Microbiología para alimentos y bebidas alcohólicas…………………………

Microbiología para productos lácteos…………………………………………

MEDIOS DE CULTIVO

Agar Almidón…………………………………………………………................

Agar Anaeróbico (Brewer)………………………………………………………

Agar Azida Sangre (Agar base con sangre y azida)…………………………

Agar Baird – Parker (Agar selectivo para Estafilococos)……………………

Agar Bismuto Sulfito de Wilson Blair………………………………...............

Agar Brolacin (Agar azul de bromo timol – lactosa – cistina)......................

Agar Brucella...............................................................................................

Ramirez - Balqui

13

Agar Catc (Agar citrato – azida – tween – carbonato base)........................

Agar Citrimide (Agar selectivo para Pseudomonas base)...........................

Agar Chocolate............................................................................................

Agar Citrato de Simmons.............................................................................

Agar Columbia (Agar con colistina y ácido nalidíxico)………………………

Agar Czapek Dox………………………………………………………………..

Agar Desoxicolato Citrato………………………………………………………

Agar DNAsa………………………………………………………………………

Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)………………………………………….

Agar Endo………………………………………………………………………...

Agar Extracto de Malta………………………………………………………….

Agar Fenilalanina………………………………………………………………..

Agar Fosfatasa…………………………………………………………………

Agar Gelatina…………………………………………………………..............

Agar Hierro Tres Azucares (TSI)………………………………………………

Agar Lactosa Rojo Fenol……………………………………………...............

Agar Levine (Agar de Levine con eosina y azul de metileno)………………

Agar Lisina Hierro (LIA)…………………………………………………………

Agar Littman (Agar con bilis de buey de Littman)……………………………

Agar Mac Conkey………………………………………………………………..

Agar Manitol Movilidad (M – Mov.)…………………………………………….

Agar Manitol Salado (AMS)…………………………………………...............

Agar de Middlebrook…………………………………………………………….

Agar Mosto……………………………………………………………………….

Agar Mueller Hinton……………………………………………………………..

Agar Mycophil……………………………………………………………………

Agar Nutritivo (AN)………………………………………………………………

Agar Packer (AP)………………………………………………………………..

Agar Papa Dextrosa…………………………………………………................

Agar Plate Count (Agar peptona de caseína – glucosa – extracto de

levadura)…………

Agar para cultivo de Microensayo…………………………………….............

Agar para Enterobactereaceas (HEKTOEN)...............................................

Agar para Salmonella (ÖNÖZ)…………………………………………………

Agar Salmonella – Shigella (ASS)……………………………………………..

Agar Sabouraud (Agar glucosado de Sabouraud)………………….............

Agar Sangre.................................................................................................

Agar Selectivo para Candida (Agar base para Candida con Verde Bromo


14

Cresol)....................

Agar Selectivo para Clostridios....................................................................

Agar para Dermatofitos (DTM)....................................................................

Agar Selectivo para Enterococos (Barnes)..................................................

Agar Selectivo para Estreptococos..............................................................

Agar Selectivo para Estafilococos Nº 110 (Chapman)................................

Agar Selectivo para Yersinia.......................................................................

Agar Sulfito..................................................................................................

Agar Thayer – Martin...................................................................................

Agar Tiosulfato – Citrato – Bilis – Sucrosa (TCBS).....................................

Agar Verde Brillante (Kauffman) (Agar verde brillante – rojo de fenol –

lactosa)......................

Agar Violeta Cristal – Rojo Neutro – Bilis (VRVA)…………………..............

Agar Xilosa – Lisina y Desoxicolato (XLD)..................................................

Agua Peptonada…………………………………………………………………

Agua Peptonada Tamponada………………………………………................

Caldo Brila (Caldo verde brillante – bilis – lactosa)………………………….

Caldo Cianuro……………………………………………………………………

Caldo de Enriquecimiento para Salmonella (Rappaport)……………………

Caldo de Enriquecimiento para Vibrio cholerae……………………………..

Caldo Hajna para Gramnegativos…………………………………………….

Caldo Extracto de Malta………………………………………………………...

Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI)………………………………………..

Caldo Lactosado…………………………………………………………………

Caldo Lauril Triptosa…………………………………………………………….

Caldo Malonato………………………………………………………................

Caldo Manitol Salado……………………………………………………………

Caldo Mosto……………………………………………………………………...

Caldo Nitrato……………………………………………………………………..

Caldo Nutritivo……………………………………………………………………

Caldo Peptonado………………………………………………………………...

Caldo Selenito……………………………………………………………………

Caldo Tetrationato Base………………………………………………………..

Caldo Tioglicolato (Medio Alternativo de la USP)……………………………

Caldo Triptosa…………………………………………………………………..

Caldo Urea……………………………………………………………...............

Discos Bactrol (Discos de control y susceptibilidad antimicrobiana)………

Medio Base para Fermentación de Azúcares y Alcoholes………………….

Ramirez - Balqui

15

Medio de Loefler (suero sanguíneo de Loefler)………………………………

Medio de Lowenstein – Jensen para Micobacterias…………………………

Medio de Hugo y Leifson (Medio basal para oxidación y fermentación)…..

Medio Gelatina Tioglicolato…………………………………………................

Medio Kliger Iron Agar (KIA) (Agar hierro dos azúcares)…………………...

Medios Microbiológicos: Agar Micológico, Agar Micológico con bajo pH,

Caldo – Micológico y Caldo Micológico con bajo pH

Medio para Movilidad – Indol – Orinitina……………………………………..

Medio para Movilidad con Infusión de Gelatina………………………………

Medio para Decarboxilasa de Arginina – Lisina – Ornitina………………….

Medio para Prueba de Rojo de Metilo y Voges Proskauer (MR – VP)…….

Medio SIM (Medio para sulfuro, Indol y Movilidad)………………................

Prueba de la Beta – Galactosidasa (ONPG)…………………………………

Prueba de la Citocromo – Oxidasa…………………………………………….

ANEXOS:

Tabla 32: Diferenciación de Enterobacteriaceaes mediante pruebas

bioquímicas………………………………………………………………………

Tabla 33: Pruebas claves para la identificación de las especies con mayor

significado clínico………………………………………………………..

Tabla 34: Identificación presuntiva de los estreptococos………… ……….

Tabla 35: Diferenciación de los cocos grampositivos catalasa negativos..

Tabla 36: Características diferenciales de las especies Neisseria aisladas

frecuentemente………………………………………………………..

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.


16

Ramirez - Balqui

17

CAPITULO I

CONCEPTOS E HISTORIADE LA MICROBIOLOGIA.

IInnttrroodduucccciióónn aall ccoonncceeppttoo yy ccoonntteenniiddoo ddee llaa mmiiccrroobbiioollooggííaa..

DDeessaarrrroolllloo hhiissttóórriiccoo ddee llaa mmiiccrroobbiioollooggííaa..

OObbjjeettoo ddee eessttuuddiioo ddee llaa mmiiccrroobbiioollooggííaa..


18

Ramirez - Balqui

19

CONCEPTOS E HISTORIADE LA MICROBIOLOGIA

I. INTRODUCCIÓN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA MICROBIOLOGÍA.

La Microbiología se puede definir, sobre la base de su etimología, como la ciencia que trata de

los seres vivos muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por

debajo del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga

determinado por la metodología apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los

microorganismos. Precisamente, el origen tardío de la Microbiología con relación a otras

ciencias biológicas, y el reconocimiento de las múltiples actividades desplegadas por los

microorganismos, hay que atribuirlos a la carencia, durante mucho tiempo, de los instrumentos

y técnicas pertinentes. Con la invención del microscopio en el siglo XVII comienza el lento

despegue de una nueva rama del conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los

siguientes 150 años su progreso se limitó casi a una mera descripción de tipos morfológicos

microbianos, y a los primeros intentos taxonómicos, que buscaron su encuadramiento en el

marco de los "sistemas naturales" de los Reinos Animal y Vegetal.

El asentamiento de la Microbiología como ciencia está estrechamente ligado a una serie de

controversias seculares (con sus numerosas filtraciones de la filosofía e incluso de la religión

de la época), que se prolongaron hasta finales del siglo XIX. La resolución de estas polémicas

dependió del desarrollo de una serie de estrategias experimentales fiables (esterilización,

cultivos puros, perfeccionamiento de las técnicas microscópicas, etc.), que a su vez dieron

nacimiento a un cuerpo coherente de conocimientos que constituyó el núcleo aglutinador de la

ciencia microbiológica. El reconocimiento del origen microbiano de las fermentaciones, el

definitivo abandono de la idea de la generación espontánea, y el triunfo de la teoría germinal

de la enfermedad, representan las conquistas definitivas que dan carta de naturaleza a la joven

Microbiología en el cambio de siglo.

Tras la Edad de Oro de la Bacteriología, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y Koch,

la Microbiología quedó durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada,

estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la Química, que le

aportaría varios avances metodológicos fundamentales. Sin embargo, una corriente, en

principio minoritaria, dedicada a los estudios básicos centrados con ciertas bacterias del suelo

poseedoras de capacidades metabólicas especiales, incluyendo el descubrimiento de las que

afectan a la nutrición de las plantas, logró hacer ver la ubicuidad ecológica y la extrema

diversidad fisiológica de los microorganismos. De esta forma, se establecía una cabeza de

puente entre la Microbiología y otras ciencias biológicas, que llegó a su momento decisivo


20

cuando se comprobó la unidad química de todo el mundo vivo, y se demostró, con material y

técnicas microbiológicas que la molécula de la herencia era el ADN. Con ello se asiste a un

íntimo y fértil intercambio entre la Microbiología, la Genética y la Bioquímica, que se plasma en

el nacimiento de la Biología Molecular, base del espectacular auge de la Biología desde

mediados de este siglo.

Por otro lado, el "programa" inicial de la Microbiología (búsqueda de agentes infectivos,

desentrañamiento y aprovechamiento de los mecanismos de defensa del hospedador)

condujeron a la creación de ciencias subsidiarias (Virología, Inmunología) que finalmente

adquirieron su mayoría de edad y una acentuada autonomía.

Por último, la vertiente aplicada que estuvo en la base de la creación de la Microbiología,

mantuvo su vigencia, enriquecida por continuos aportes de la investigación básica, y hoy

muestra una impresionante "hoja de servicios" y una no menos prometedora perspectiva de

expansión a múltiples campos de la actividad humana, desde el control de enfermedades

infecciosas (higiene, vacunación, quimioterapia, antibioterapia) hasta el aprovechamiento

económico racional de los múltiples procesos en los que se hallan implicados los

microorganismos (biotecnologías).

Así pues, la sencilla definición con la que se abrió este apartado, escondía todo un cúmulo de

contenidos y objetos de indagación, todos emanados de una peculiar manera de aproximarse a

la porción de realidad que la Microbiología tiene encomendada. En las próximas páginas

ampliaremos y concretaremos el concepto al que hemos hecho rápida referencia.

Realizaremos un recorrido por su el desarrollo de la Microbiología a lo largo de su historia, que

nos permitirá una visión concreta de algunos de sus característicos modos de abordar su

objeto de estudio; finalmente, estaremos en disposición de definir este último, desglosado

como objeto material y formal.

II. DESARROLLO HISTÓRICO DE LA MICROBIOLOGÍA.

La Microbiología, considerada como una ciencia especializada, no aparece hasta finales del

siglo XIX, como consecuencia de la confluencia de una serie de progresos metodológicos que

se habían empezado a incubar lentamente en los siglos anteriores, y que obligaron a una

revisión de ideas y prejuicios seculares sobre la dinámica del mundo vivo.

Siguiendo el ya clásico esquema de Collard (l976), podemos distinguir cuatro etapas o

periodos en el desarrollo de la Microbiología:

a) Primer periodo, eminentemente especulativo, que se extiende desde la antigüedad hasta

llegar a los primeros microscopistas.

b) Segundo periodo, de lenta acumulación de observaciones (desde l675 aproximadamente

hasta la mitad del siglo XIX), que arranca con el descubrimiento de los microorganismos por

Leeuwenhoek (l675).

c) Tercer periodo, de cultivo de microorganismos, que llega hasta finales del siglo XIX, donde

las figuras de Pasteur y Koch encabezan el logro de cristalizar a la Microbiología como

ciencia experimental bien asentada.

Ramirez - Balqui

21

d) Cuarto periodo (desde principios del siglo XX hasta nuestros días), en el que los

microorganismos se estudian en toda su complejidad fisiológica, bioquímica, genética,

ecológica, etc., y que supone un extraordinario crecimiento de la Microbiología, el

surgimiento de disciplinas microbiológicas especializadas (Virología, Inmunología, etc.), y la

estrecha imbricación de las ciencias microbiológicas en el marco general de las Ciencias

Biológicas. A continuación se realiza un breve recorrido histórico de la disciplina

microbiológica, desglosando los períodos 3º y 4º en varios apartados temáticos.

2.1. PERIODO PREVIO AL DESCUBRIMIENTO DEL MICROSCOPIO.

Si bien el descubrimiento efectivo de seres vivos no visibles a simple vista debió

aguardar hasta el último tercio del siglo XVII, sus actividades son conocidas por la

humanidad desde muy antiguo, tanto las beneficiosas, representadas por las

fermentaciones implicadas en la producción de bebidas alcohólicas, pan y productos

lácteos, como las perjudiciales, en forma de enfermedades infecciosas.

Diversas fuentes escritas de la antigüedad griega y romana hablan de gérmenes

invisibles que transmiten enfermedades contagiosas. Lucrecio (96-55 a.C.), en su "De

rerum natura" hace varias alusiones a "semillas de enfermedad". En el Renacimiento

europeo, Girolamo Frascatorius, en su libro "De contagione et contagionis" (1546) dice

que las enfermedades contagiosas se deben a "gérmenes vivos" que pasan de diversas

maneras de un individuo a otro. Estos inicios de explicación que renunciaban a invocar

causas sobrenaturales fueron probablemente catalizados por la introducción en Europa

de la sífilis, una enfermedad en la que estaba clara la necesidad de contacto para su

contagio. Pero la "cosa" que se transmite en la enfermedad siguió siendo objeto de

conjeturas durante mucho tiempo.

2.2. EL PERIODO DE LOS PRIMEROS MICROSCOPISTAS.

Ya en el siglo XIV, con la invención de las primeras lentes para corregir la visión, surgió

una cierta curiosidad sobre su capacidad de aumentar el tamaño aparente de los

objetos. En el siglo XVI surgieron algunas ideas sobre aspectos de la física óptica de las

lentes de aumento, pero no encontraron una aplicación inmediata. Se dice que Galileo

hizo algunas observaciones "microscópicas" invirtiendo su telescopio a partir de lentes

montadas en un tubo, pero en cualquier caso está claro que no tuvieron ninguna

repercusión.

La primera referencia segura sobre el microscopio (1621) se debe a Constantijn

Huygens, quien relata que el inglés Cornelis Drebbel tenía en su taller un instrumento

magnificador, que recibió el nombre de microscopium en l625, en la Accademia dei

Lincei, de Roma.

El descubrimiento de los microorganismos fue obra de un comerciante holandés de

tejidos, Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), quien en su pasión por pulir y montar

lentes casi esféricas sobre placas de oro, plata o cobre, casi llegó a descuidar sus

negocios. Fabricó unos cuatrocientos microscopios simples, con los que llegó a obtener

aumentos de casi 300 diámetros. En 1675 descubrió que en una gota de agua de

estanque pululaba una asombrosa variedad de pequeñas criaturas a las que denominó

"animálculos". En 1683 descubre las bacterias, por lo que se considera el "padre de la


22

Microbiología". Durante varias décadas Leeuwenhoek fue comunicando sus

descubrimientos a la Royal Society de Londres a través de una serie de cartas que se

difundieron, en traducción inglesa, en las "Philosophical Transactions". Sus magníficas

dotes de observador le llevaron asimismo a describir protozoos (como Giardia, que

encontró en sus propias heces), la estructura estriada del músculo, la circulación

capilar, a descubrir los espermatozoides y los glóbulos rojos (por lo que también se le

considera el fundador de la Histología animal), así como a detallar diversos aspectos

estructurales de las semillas y embriones de plantas. Leeuwenhoek se percató de la

abundancia y ubicuidad de sus animálculos, observándolos en vinagre, placa dental,

etc.

Aunque los descubrimientos de Leeuwenhoek despertaron interés al ser comunicados,

pocos intentaron o pudieron reproducirlos seriamente. Además, la fabricación de lentes

sencillas de gran aumento era difícil y el manejo de los microscopios simples, bastante

engorroso.

Simultáneamente el inglés Robert Hooke (1635-1703) usando microscopios

compuestos, describió los hongos filamentosos (1667), y descubrió la estructura celular

de las plantas (Micrographia, 1665), acuñando el término célula. Pero el trabajo con

microscopios compuestos aplicados al estudio de los "animálculos" languideció durante

casi 200 años, debido a sus imperfecciones ópticas, hasta que hacia 1830 se

desarrollaron las lentes acromáticas.

2.3. EL DEBATE SOBRE LA GENERACIÓN ESPONTÁNEA.

La autoridad intelectual de Aristóteles por un lado, y la autoridad moral representada por

la Biblia, por otro, junto con las opiniones de escritores clásicos como Galeno, Plinio y

Lucrecio, a los que se citaba como referencias incontrovertibles en la literatura médica

en la Edad Media y Renacimiento, dieron carta de naturaleza a la idea de que algunos

seres vivos podían originarse a partir de materia inanimada, o bien a partir del aire o de

materiales en putrefacción. Esta doctrina de la "generatio spontanea" o abiogénesis, fue

puesta en entredicho por los experimentos de Francesco Redi (1621-1697), quien había

acuñado la expresión "Omne vivum ex ovo" (1668), tras comprobar que los insectos y

nematodos procedían de huevos puestos por animales adultos de su misma especie.

Demostró que si un trozo de carne era cubierto con gasa de forma que las moscas no

podían depositar allí sus huevos, no aparecían "gusanos", que él correctamente

identificó como fases larvarias del insecto. Los descubrimientos de Redi tuvieron el

efecto de desacreditar la teoría de la generación espontánea para los animales y

plantas, pero la reavivaron respecto de los recién descubiertos "animálculos", de modo

que aunque se aceptó la continuidad de la vida en cuanto a sus formas superiores, no

todos estaban dispuestos a admitir el más amplio "Omne vivum ex vivo" aplicado a los

microorganismos.

Hubo que esperar un siglo más hasta que una serie de naturalistas recomenzaran el

ataque a la teoría preformacionista. Lazzaro Spallanzani (1729-1799) sostuvo una

disputa con J.T. Needham (1713-1781) en la que el primero demostró que los

"infusorios" no aparecían en muestras de maceraciones animales o vegetales sometidas

Ramirez - Balqui

23

durante tiempo suficiente a ebullición en frascos herméticamente cerrados, pero volvían

a aparecer si se practicaban agujeros en el recipiente. Sin embargo los

preformacionistas no se daban por vencidos; el mismo Needham, recogiendo una idea

ya expresada por Huygens, amigo de Leeuwenhoek, replicó -con argumentos vitalistas

muy propios de la época- que el calor había destruido la "fuerza vegetativa" de las

infusiones y había cambiado la "cualidad" del aire dentro de los frascos.

Durante el primer tercio del siglo XIX la doctrina de la arquegénesis o generación

espontánea recibió un último refuerzo antes de morir, debido por un lado a razones

extracientíficas (el auge del concepto de transmutación producido por la escuela de la

filosofía de la naturaleza), y por otro al descubrimiento del oxígeno y de su importancia

para la vida, de modo que los experimentos de Spallanzani se interpretaron como que al

calentarse las infusiones, el oxígeno del aire se destruía, y por lo tanto desaparecía la

"fuerza vegetativa" que originaba la aparición de microorganismos.

Theodor Schwann (1810-1882) presentó en 1836 un método seguro para refutar la

teoría abiogénica: calentó maceraciones en frascos a los que se había eliminado

previamente el aire, pero no continuó trabajando en esta línea.

Para complicar más las cosas, la publicación de "Sobre el origen de las especies" por

Darwin en 1859, fue utilizada por algunos preformacionistas para apoyar sus

argumentos. El mismo Haeckel, en una fecha tan tardía como 1866, se mostraba

escéptico ante las pruebas aportadas por Pasteur.

Fue, efectivamente Louis Pasteur (1822-1895) el que asestó el golpe definitivo y zanjó

la cuestión a favor de la teoría biogénica. En un informe a la Académie des Sciences de

París, en 1860 ("Expériences rélatives aux générations dites spontanées") y en escritos

posteriores comunica sus sencillos y elegantes experimentos: calentó infusiones en

matraces de vidrio a los que estiraba lateralmente el cuello, haciéndolo largo, estrecho y

sinuoso, y dejándolo sin cerrar, de modo que el contenido estuviera en contacto con el

aire; tras esta operación demostró que el líquido no desarrollaba microorganismos, con

lo que eliminó la posibilidad de que un "aire alterado" fuera la causa de la no aparición

de gérmenes. Antes bien, comprobó que los gérmenes del aire quedaban retenidos a su

paso por el largo cuello sinuoso, en las paredes del tubo, y no alcanzaban el interior del

recipiente donde se encontraba la infusión, quedando ésta estéril indefinidamente. Sólo

si se rompía el cuello lateral o si se inclinaba el frasco de modo que pasara parte de

líquido a la porción de cuello, los gérmenes podían contaminar la infusión y originar un

rápido crecimiento.

En 1861 Pasteur publica otro informe en el que explica cómo se pueden capturar los

"cuerpos organizados" del aire con ayuda de un tubo provisto de un tapón de algodón

como filtro, y la manera de recuperarlos para su observación microscópica. De esta

forma quedaba definitivamente aclarado el origen de los microorganismos, y se abría la

Edad de Oro del estudio científico de las formas de vida no observables a simple vista.


24

Los últimos escépticos quedaron silenciados cuando en 1877 John Tyndall (1820-1893)

aplicó su sistema de esterilización por calentamiento discontinuo (hoy conocida

precisamente como tindalización), que evidenció la existencia de formas microbianas de

reposo muy resistentes al calor, lo cual fue confirmado poco más tarde por Ferdinand

Cohn al descubrir las esporas bacterianas.

2.4. EL DEBATE SOBRE LOS FERMENTOS.

Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia microbiológica fue el

establecimiento de la relación que une ciertas transformaciones químicas que se dan en

las infusiones con el crecimiento de los gérmenes en ellas existentes. Cagniard-Latour

en 1836, y Schwann y Kützing en 1837 habían sugerido que las levaduras eran las

causantes de la fermentación alcohólica por la que el azúcar pasa a alcohol etílico y

dióxido de carbono, pero se encontraron con la crítica adversa de los grandes químicos

de la época (Berzelius, Wohler y Liebig). Liebig, hacia 1840, había realizado importantes

confirmaciones a la "teoría mineral" sobre la nutrición de las plantas, enfrentándose a la

"teoría del humus" sostenida por Thaer, asestando un golpe a las ideas vitalistas

heredadas de Leibniz. Puesto que se consideraba a las levaduras como plantas

microscópicas, se suponía que los procesos de fermentación y putrefacción se debían a

fenómenos químicos de descomposición y muerte encuadrables en el marco de la

teoría mineral de la fisiología vegetal. Su convencimiento de que toda actividad vital se

podía explicar en términos de química y física retrasó por algún tiempo la adscripción de

estos fenómenos a células vivas.

Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades ópticas de los

cristales de tartrato, venía suponiendo que estos compuestos tenían un orígen orgánico)

quien de nuevo intervino en el debate de forma decisiva. En 1857 demostró que los

agentes de la fermentación láctica eran microorganismos, trabajando sobre un problema

que había surgido entre los destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentación

alcohólica se vio sustituida por una indeseable fermentación láctica. Este fue el inicio de

una larga serie de estudios que habría de durar hasta 1876, en los que Pasteur

identificó distintos microorganismos responsables de diferentes clases de procesos

fermentativos. Así, en 1860 adscribe inequívocamente la fermentación alcohólica a

ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus Études sur le vin resume sus hallazgos al

respecto, inaugurando la Microbiología Aplicada, una de las primeras derivaciones

prácticas no empíricas emanadas de la Biología. A finales del siglo XIX eminentes

biólogos como Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad

en industrias y destilerías.

Trabajando sobre los agentes de la fermentación butírica, Pasteur descubrió la

presencia de microorganismos que se desarrollaban en ausencia de oxígeno, lo cual

desmentía la creencia de que todas las formas de vida necesitan aire para crecer.

Acuñó los términos aerobiosis y anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la

vida en presencia y en ausencia de oxígeno.

Ramirez - Balqui

25

Tras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendió las distintas

implicaciones energéticas subyacentes a la utilización de sustratos orgánicos en

presencia y en ausencia de oxígeno, demostrando que, en el segundo caso el

rendimiento (medido como crecimiento microbiano) era siempre menor, al no poder

realizarse la degradación total de las correspondientes sustancias.

Una profundización en los fenómenos de fermentación llegó cuando en 1897 Buchner

obtuvo, a partir de levaduras, una preparación enzimática (zimasa) que era capaz de

realizar la misma transformación de "fermentación" que las células vivas. Este

descubrimiento, que evocaba las propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad

la confluencia de los enfoques químico y biológico: las fermentaciones eran procesos

químicos catalizados por enzimas presentes dentro de células vivas, que podían ser

estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioquímica, nacida como una rama de

la química fisiológica, que se venía especializando en la enzimología, encontró una

alianza fructífera y duradera con la joven Microbiología.

2.5. LOS AVANCES TÉCNICOS.

La doctrina del pleomorfismo, vigente durante buena parte del siglo XIX, mantenía que

los microorganismos adoptaban formas y funciones cambiantes dependiendo de las

condiciones ambientales. A estas ideas se oponían frontalmente investigadores como

Koch, Pasteur y Cohn, que estaban convencidos de la especificidad y constancia

morfológica y fisiológica de cada tipo de microorganismo (monomorfismo). El

pleomorfismo había surgido como una explicación a la gran variedad de formas y

actividades que aparecían en un simple frasco de infusión, pero ya Pasteur, en sus

estudios sobre la fermentación, se había percatado de que los cultivos que aparecían

podían considerarse como una sucesión de distintas poblaciones de microorganismos

predominantes, que, a resultas de sus actividades, condicionaban la ulterior

composición de la comunidad microbiana. La solución definitiva a esta cuestión

dependía, de nuevo, de un desarrollo técnico, que a su vez iba a suministrar una de las

herramientas características de la nueva ciencia: los métodos de cultivo puro.

Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el micólogo Brefeld, quien logró aislar

esporas de hongos y cultivarlas sobre medios sólidos a base de gelatina. Por su menor

tamaño, este método se hacía inviable para las bacterias, por lo que se recurrió a un

método basado en diluciones: Lister, en 1878 realizó diluciones secuenciales de cultivos

mixtos, hasta lograr muestras en las que existía una sola célula. Pero la técnica era

larga y tediosa y, además, normalmente sólo se lograban aislar células del tipo

bacteriano más abundante en el cultivo original; sin embargo, el experimento sirvió para

confirmar la naturaleza "particulada" de los agentes de las fermentaciones.

Por aquella época Koch buscaba con ahínco métodos más sencillos de cultivo puro,

indispensables para proseguir sus investigaciones sobre bacterias patógenas. Primero

(y quizá de forma un tanto casual) empleó rodajas de patata como sustrato sólido

nutritivo sobre el que se podían desarrollar colonias macroscópicas de bacterias que

presentaban morfología característica, que Koch interpretó como resultantes del

crecimiento a partir de células individuales. Pero enseguida recurrió a compactar el


26

típico caldo de cultivo a partir de carne (diseñado por Loeffler) añadiéndole gelatina

(1881). El medio sólido así logrado era transparente, lo que permitía visualizar

fácilmente los rasgos coloniales, y contenía los nutrientes adecuados para el

crecimiento de una amplia gama de bacterias. Éstas eran inoculadas en la superficie del

medio con un hilo de platino pasado previamente por la llama, por la técnica de siembra

en estría. Sin embargo, la gelatina presentaba los inconvenientes de ser atacada por

determinados microorganismos, y de tener un bajo punto de fusión; ambos problemas

se solventaron cuando en 1882 el médico alemán Walter Hesse, siguiendo una

sugerencia de su mujer Fanny, introdujo el agar-agar (polisacárido extraído de algas

rojas) como nuevo agente solidificante. El trabajo de Koch ya citado tuvo la

trascendental consecuencia de derribar las ideas pleomorfistas, y supuso la primera

propuesta del concepto de especie dentro del mundo bacteriano. En 1887 Petri, un

ayudante de Koch, sustituyó las engorrosas bandejas de vidrio cubiertas con campanas,

usadas hasta entonces para los cultivos sólidos, por un sistema manejable de placas de

cristal planas, que se conoce como cajas de Petri.

El desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento fue una consecuencia de las

investigaciones llevadas a cabo por Beijerinck y Winogradsky entre 1888 y los primeros

años del siglo XX, sobre bacterias implicadas en procesos biogeoquímicos y

poseedoras de características fisiológicas distintivas (quimioautótrofas, fijadoras de

nitrógeno, etc.). Estos medios, donde se aplica a pequeña escala el principio de

selección natural, se diseñan de forma que su composición química definida favorezca

sólo el crecimiento de ciertos tipos fisiológicos de microorganismos, únicos capaces de

usar ciertos nutrientes del medio.

Otra importante aportación a este "período de cultivo" dentro del desarrollo de la

Microbiología surgió del uso de medios diferenciales, en los que se manifiesta algún

rasgo bioquímico o metabólico, lo que contribuye a la identificación microbiana. Fue

Würtz quien, en 1892, introdujo el uso de indicadores de pH, incorporados en los

medios, lo cual permitía revelar la producción de acidificaciones por fermentación en

ciertas bacterias.

Mientras tanto, en la ciudad de Jena se había creado una atmósfera de progreso donde

confluían grandes naturalistas como Haeckel, Strassburger o Abbé interaccionando con

una pujante editorial especializada en Biología y Medicina (Gustav Fischer) y con una

poderosa industria óptica y química. Estas influencias recíprocas se plasmaron en

numerosos proyectos que reflejaban la efervescencia de las ciencias naturales tras la

estela de Darwin (cfr. Jahn et al., 1985). Concretamente, la industria óptica de Abbé y

Zeiss, que se mantenía en conexión con la compañía vidriera Schott, pudo satisfacer la

necesidad de Koch de perfeccionar el microscopio compuesto, introduciendo lentes

acromáticas y una iluminación inferior provista de condensador. El mismo Abbé

desarrolló en 1878 el objetivo de inmersión en aceite. Por otro lado, la industria química

BASF, que por aquella época se encontraba en pleno auge de patentes de nuevos

colorantes, suministró al laboratorio de Koch una serie de derivados de anilina que

teñían las bacterias permitiendo su fácil visualización al microscopio en frotis de tejidos

infectados. En 1875 Carl Weigert tiñó bacterias con pirocarmín, un colorante que ya

Ramirez - Balqui

27

venía siendo usado desde hacía unos años en estudios zoológicos. En años sucesivos

se fueron introduciendo el azul de metileno (Koch, 1877), la fuchsina, y el violeta cristal.

En 1882-1883 Ziehl y Neelsen desarrollan su método de ácido-alcohol resistencia para

teñir Mycobacterium tuberculosis. En 1884 el patólogo danés Christian Gram establece

una tinción de contraste que permite distinguir dos tipos bacterianos en función de sus

reacción diferencial de tinción y que, como se vería mucho más tarde, reflejaba la

existencia de dos grupos de bacterias con rasgos estructurales distintivos. En 1890

Loeffler logra visualizar flagelos bacterianos por medio de su técnica de impregnación

argéntica. Como veremos más adelante, la misma industria de colorantes alemana

previa a la primera guerra mundial fue decisiva también para los comienzos de la

quimioterapia.

Estas innovaciones técnicas (métodos de cultivo, microscopía y tinciones) fueron

fundamentales (junto con los sistemas de esterilización abordados en el anterior

apartado) para la consolidación de la Microbiología como ciencia, permitiendo eliminar

las grandes dosis de especulación que hasta entonces habían predominado.

2.6. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS ENFERMEDADES.

Durante el siglo XIX la atención de muchos naturalistas se había dirigido hacia las

diversas formas de animales y plantas que vivían como parásitos de otros organismos.

Este interés se redobló tras la publicación de los libros de Darwin, estudiándose las

numerosas adaptaciones evolutivas que los distintos parásitos habían adquirido en su

peculiar estilo de vida. Sin embargo, la adjudicación de propiedades de parásitos a los

microorganismos vino del campo médico y veterinario, al revalorizarse las ideas sobre el

origen germinal de las enfermedades infecciosas.

En 1835 Agostino Bassi (1773-1856) demostró que cierta enfermedad del gusano de

seda (mal di segno), que había hecho su aparición en Lombardía, se debía a un hongo

(Botrytis bassiana). Cuatro años más tarde J.L. Schönlein descubrió la asociación de un

hongo con una enfermedad humana de la piel. En 1840 Henle, de la escuela fisiológica

de Johannes Müller, planteó la teoría de que las enfermedades infecciosas están

causadas por seres vivos invisibles, pero de nuevo la confirmación de estas ideas tuvo

que esperar a que la intervención de Pasteur demostrara la existencia de

microorganismos específicos responsables de enfermedades.

Hacia mediados del siglo XIX otra enfermedad infecciosa (pebrina) comenzó a

diseminarse por los criaderos de gusano de seda de toda Europa, alcanzando

finalmente a China y Japón. A instancias de su maestro Jean Baptiste Dumas, Pasteur

aceptó el reto de viajar a la Provenza para investigar esta enfermedad que estaba

dejando en la ruina a los industriales sederos, a pesar de que nunca hasta entonces se

había enfrentado con un problema de patología. Es más que probable que Pasteur viera

aquí la oportunidad de confirmar si sus estudios previos sobre las fermentaciones

podían tener una extensión hacia los procesos fisiológicos del hombre y de los

animales. Es sorprendente que, al principio no se mostrara dispuesto a aceptar la idea

de que la pebrina fuera una enfermedad ocasionada por un agente extraño, creyendo

durante los dos primeros años que se trataba de alteraciones meramente fisiológicas.


28

Tras una serie de tanteos, y en medio de una intensa actividad intelectual que le

obligaba a repasar continuamente los experimentos y las conclusiones extraídas,

inmerso en el drama personal de la muerte de su padre y de dos de sus hijas en un

corto lapso de tiempo, Pasteur llega finalmente, en 1869, a identificar al protozoo

Nosema bombycis como el responsable de la epidemia, y por medio de una serie de

medidas de control, ésta comienza a remitir de modo espectacular.

La intervención de bacterias como agentes específicos en la producción de

enfermedades fue descubierta a raíz de una serie de investigaciones sobre el carbunco

o ántrax, enfermedad que afecta a ganado y que puede transmitirse al hombre. C.

Davaine, entre 1863 y 1868, encontró que en la sangre de vacas afectadas aparecían

grandes cantidades de microorganismos a los que llamó bacteridios; además, logró

inducir la enfermedad experimentalmente en vacas sanas, inoculándoles muestras de

sangre infectada. En 1872 el médico alemán C.J. Eberth consiguió aislar los bacilos

filtrando sangre de animales carbuncosos. Pero fue Robert Koch (1843-1910), que

había sido alumno de Henle, quien con su reciente técnica de cultivo puro logró, en

1876, el primer aislamiento y propagación in vitro del bacilo del ántrax (Bacillus

anthracis), consiguiendo las primeras microfotografías sobre preparaciones secas,

fijadas y teñidas con azul de metileno. Más tarde (1881), Koch y sus colaboradores

confirmaron que las esporas son formas diferenciadas a partir de los bacilos, y más

resistentes que éstos a una variedad de agentes. Pero más fundamental fue su

demostración de que la enfermedad se podía transmitir sucesivamente a ratones sanos

inoculándoles bacilos en cultivo puro, obtenidos tras varias transferencias en medios

líquidos.

Este tipo de estrategias para demostrar el origen bacteriano de una enfermedad fue

llevado a una ulterior perfección en 1882, con la publicación de "Die Äthiologie der

Tuberkulose", donde se comunica por primera vez la aplicación de los criterios que

Henle había postulado en 1840. Estos criterios, que hoy van asociados al nombre de

Koch, son los siguientes:

a) El microorganismo debe de estar presente en todos los individuos enfermos.

b) El microorganismo debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro.

c) La inoculación del microorganismo crecido en cultivo puro a animales sanos debe

provocar la aparición de síntomas específicos de la enfermedad en cuestión.

d) El microorganismo debe poder ser reaislado del hospedador infectado de forma

experimental.

Fue asimismo Koch quien demostró el principio de especificidad biológica del agente

infeccioso: cada enfermedad infecciosa específica está causada por un tipo de bacteria

diferente. Estos trabajos de Koch abren definitivamente el campo de la Microbiología

Médica sobre firmes bases científicas.

Durante las dos décadas siguientes la Microbiología experimentó una auténtica edad de

oro, en la que se aislaron y caracterizaron muchas bacterias patógenas. La Alemania

del Reich, que a la sazón se había convertido en una potencia política y militar, se

Ramirez - Balqui

29

decidió a apoyar la continuidad de los trabajos del equipo de Koch, dada su enorme

importancia social y económica, creando un Instituto de investigación, siendo Koch su

director en el Departamento de Salud. De esta forma, en la Escuela Alemana se

aislaron los agentes productores del cólera asiático (Koch, 1883), de la difteria (Loeffler,

1884), del tétanos (Nicolaier, 1885 y Kitasato, 1889), de la neumonía (Fraenkel, 1886),

de la meningitis (Weichselbaun, 1887), de la peste (Yersin, 1894), de la sífilis

(Schaudinn y Hoffman, 1905), etc. Igualmente se pudieron desentrañar los ciclos

infectivos de agentes de enfermedades tropicales no bacterianas que la potencia

colonial se encontró en ultramar: malaria (Schaudinn, 1901-1903), enfermedad del

sueño (Koch, 1906), peste vacuna africana (debida al inglés Bruce, 1895-1897), etc.

2.7. DESARROLLO DE LA ASEPSIA, QUIMIOTERAPIA Y NTIBIOTERAPIA.

Los avances de las técnicas quirúrgicas hacia mediados del siglo XIX, impulsados por la

introducción de la anestesia, trajeron consigo una gran incidencia de complicaciones

post-operatorias derivadas de infecciones. Un joven médico británico, Joseph Lister

(1827-1912), que había leído atentamente los trabajos de Pasteur, y que creía que

estas infecciones se debían a gérmenes presentes en el aire, comprobó que la

aplicación de compuestos como el fenol o el bicloruro de mercurio en el lavado del

instrumental quirúrgico, de las manos y de las heridas, disminuía notablemente la

frecuencia de infecciones post-quirúrgicas y puerperales.

Más tarde, Paul Ehrlich (1854-1919), que había venido empleando distintas sustancias

para teñir células y microorganismos, y que conocía bien el efecto de tinción selectiva

de bacterias por ciertos colorantes que dejaban, en cambio, incoloras a células

animales, concibió la posibilidad de que algunos de los compuestos de síntesis que la

industria química estaba produciendo pudieran actuar como "balas mágicas" que fueran

tóxicas para las bacterias pero inocuas para el hospedador. Ehrlich concibió un

programa racional de síntesis de sustancias nuevas seguido de ensayo de éstas en

infecciones experimentales. Trabajando en el laboratorio de Koch, probó

sistemáticamente derivados del atoxilo (un compuesto que ya Thompson, en 1905,

había mostrado como eficaz contra la tripanosomiasis), y en 1909 informó de que el

compuesto 606 (salvarsán) era efectivo contra la sífilis. Aunque el salvarsán presentaba

algunos efectos colaterales, fue durante mucho tiempo el único agente disponible contra

enfermedades producidas por espiroquetas, y sirvió para ilustrar brillantemente la

validez del enfoque de la llamada quimioterapia (término acuñado por el mismo Ehrlich),

de modo que encauzó toda la investigación posterior.

En 1927 Gerhard Domagk, en conexión con la poderosa compañía química I.G.

Farbenindustrie, inició un ambicioso proyecto de búsqueda de nuevos agentes

quimioterápicos, siguiendo el esquema de Ehrlich; en 1932-1935 descubre la acción del

rojo de prontosilo frente a neumococos hemolíticos dentro del hospedador, pero señala

que esta droga es inactiva sobre bacterias creciendo in vitro. La explicación la

suministra el matrimonio Tréfouël, del Instituto Pasteur, al descubrir que la actividad

antibacteriana depende de la conversión por el hospedador en sulfanilamida. El

mecanismo de acción de las sulfamidas (inhibición competitiva con el ácido para-

aminobenzoico) fue dilucidado por el estadounidense Donald D. Woods. Las


30

investigaciones de éste encaminaron a la industria farmacéutica hacia la síntesis de

análogos de metabolitos esenciales, introduciendo un enfoque más racional frente a la

época anterior, más empírica.

En 1874, el médico inglés W. Roberts había descrito las propiedades antibióticas de

ciertos cultivos de hongos (Penicillium glaucum) contra las bacterias, e introdujo en

Microbiología el concepto de antagonismo. Otros investigadores de finales del siglo XIX

realizaron observaciones similares, pero fue Fleming quien, en 1929, logró expresar

ideas claras sobre el tema, al atribuir a una sustancia química concreta (la penicilina) la

acción inhibidora sobre bacterias producida por el hongo Penicillium notatum. Fleming

desarrolló un ensayo crudo para determinar la potencia de la sustancia en sus filtrados,

pudiendo seguir su producción a lo largo del tiempo de cultivo, y mostrando que no

todas las especies bacterianas eran igualmente sensibles a la penicilina. Las

dificultades técnicas para su extracción, junto al hecho de que el interés de la época aún

estaba centrado sobre las sulfamidas, impidieron una pronta purificación de la

penicilina, que no llegó hasta los trabajos de Chain y Florey (1940), comprobándose

entonces su gran efectividad contra infecciones bacterianas, sobre todo de Gram-

positivas, y la ausencia de efectos tóxicos para el hospedador.

Inmediatamente comenzó una búsqueda sistemática de microorganismos del suelo que

mostraran actividades antibióticas. En 1944 A. Schatz y S. Waksman descubren la

estreptomicina, producida por Streptomyces griseus, siendo el primer ejemplo de

antibiótico de amplio espectro. Los diez años que siguieron al término de la segundad

guerra mundial vieron la descripción de 96 antibióticos distintos producidos por 57

especies de microorganismos, principalmente Actinomicetos.

En la década de los 60 se abrió una nueva fase en la era de los antibióticos al

obtenerse compuestos semisintéticos por modificación química de antibióticos

naturales, paliándose los problemas de resistencia bacteriana a drogas que habían

empezado a aparecer, disminuyéndose en muchos casos los efectos secundarios, y

ampliándose el espectro de acción.

Aparte de la revolución que supusieron en el campo de la aplicación clínica, los

antibióticos ha permitido notables avances en el desentrañamiento de determinados

aspectos de arquitectura y función moleculares de las células susceptibles (paredes

celulares microbianas, ribosomas, síntesis proteica, etc.).

2.8. AUGE DE LA MICROBIOLOGÍA GENERAL.

Gran parte de los avances en Microbiología descritos hasta ahora se debieron a la

necesidad de resolver problemas prácticos. Pero hacia finales del siglo XIX una serie de

investigadores -algunos de ellos procedentes de áreas más clásicas de la Historia

Natural- desarrollaron importantes estudios básicos que fueron revelando una enorme

variedad de microorganismos y sus actividades metabólicas, así como su papel crucial

en ciclos biogeoquímicos, sus relaciones con procesos de nutrición vegetal, etc.

Ramirez - Balqui

31

El descubrimiento de la quimioautotrofía, obra del gran microbiólogo ruso Sergei

Winogradsky (1856-1953), obligó a revisar los conceptos previos, procedentes de la

Fisiología Vegetal, de que el crecimiento autotrófico dependía de la presencia de

clorofila. Winogradsky había comenzado investigando las bacterias del hierro

descubiertas por Cohn en 1875, observando que podían crecer en medios minerales,

por lo que supuso que obtenían su energía de la oxidación de sales ferrosas a férricas

(1888). En 1889, combinando técnicas de observación secuencial de cultivos

microscópicos con ensayos microquímicos sobre bacterias del azufre (Beggiatoa,

Thiothrix), infirió que estos microorganismos oxidaban sulfuro de hidrógeno hasta azufre

elemental (acumulando éste como gránulos), y luego hasta ácido sulfúrico, obteniendo

de este modo su energía. Estas observaciones pueden haber sido el arranque del

concepto de litotrofía. Pero el descubrimiento de la quimioautotrofía llegó cuando al año

siguiente Winogradsky y Omeliansky pasaron a estudiar las bacterias nitrificantes,

demostrando de manera clara que la energía obtenida de la oxidación del amonio o del

nitrito era usada para fijar CO2 (1889-1890). Más tarde el mismo Winogradsky extendió

la demostración a cultivos puros en los que el agente solidificante de los medios era el

gel de sílice. La explicación del proceso de oxidación de los compuestos de azufre no

llegó hasta los estudios de Dangeard (1911) y Kiel (1912). Nuevas capacidades

metabólicas fueron reveladas al estudiar los procesos respiratorios de las bacterias que

oxidan hidrógeno o metano (Söhngen, 1906).

El químico Berthelot había señalado (1885) que los microorganismos del suelo podían

incorporar nitrógeno molecular directamente del aire. Fue igualmente Winogradsky el

primero en aislar una bacteria capaz de fijar nitrógeno atmosférico (Clostridium

pasteurianum) y en explicar el ciclo del nitrógeno en la naturaleza (1890), siendo el

holandés Martinus Beijerinck (1851-1931) el descubridor de Azotobacter como bacteria

aerobia fijadora de vida libre (1901). Más tarde Beijerinck demostró por métodos

químicos que, en efecto, Azotobacter incorpora nitrógeno de la atmósfera mientras

crece (1908). La importancia de la fijación de nitrógeno para la nutrición vegetal llegó

con los estudios sobre bacterias formadoras de nódulos en las raíces de las

leguminosas. Ya los experimentos cuantitativos sobre plantas creciendo en recipientes,

realizados por Boussingault a mediados del siglo XIX, habían indicado que las

leguminosas asimilaban nitrógeno de la atmósfera. En 1866 Voronin descubrió las

bacterias de los nódulos radicales de esta familia de plantas. Frank, en 1879, demostró

que los nódulos parecían inducirse por las mismas bacterias albergadas en ellos, y

Ward (1887) usó bacterias procedentes de nódulos machacados para inocular semillas,

logrando la producción de nódulos en suelo estéril, y describiendo en un bello trabajo el

proceso de infección, con su producción de "hifas" (cordón de infección). Tras la

introducción del concepto de simbiosis por De Bary, en 1878, fue Schindler (1884) el

primero en describir los nódulos radicales como resultado de una simbiosis entre planta

y bacterias. Los trabajos de Hermann Hellriegel (1831-1895) y de su colaborador

Hermann Willfahrt (1853-1904), que trabajaban en la Estación Experimental de

Bernburg, comunicados en primer lugar en un congreso en Berlín, en 1886, y

publicados en un artículo ejemplar en 1888, asociaron la fertilidad nitrogenada natural

de las leguminosas con la presencia de sus nódulos radicales, señalando que estos

nódulos se inducían por microorganismos específicos; de este modo lograron una


32

brillante síntesis de las observaciones microbiológicas y químicas. El mismo año de

1888 Beijerinck logró el cultivo puro in vitro de las bacterias nodulares (a las que bautizó

como Bacillus radicicola), observando que no reducían nitrógeno en vida libre; más

tarde (1890) aportó la prueba definitiva de que las bacterias aisladas eran capaces de

nodular específicamente ciertas especies de leguminosas, adquiriéndose de esta forma

la facultad de fijar nitrógeno en su asociación con la raíz de la planta. Irónicamente el

nombre definitivo para las bacterias de los nódulos de leguminosas (Rhizobium) fue

propuesto por Frank, quien durante mucho tiempo se había negado a reconocer los

resultados de Hellriegel y Willfahrt, y que había oscilado en sus opiniones, desde

suponer que la fijación de nitrógeno era un rasgo general de las plantas, hasta creer

que las estructuras nodulares observadas a microcopio (bacteroides) eran gránulos de

reserva (incluidas las que él mismo observó en plantas no leguminosas de los géneros

Alnus y Eleagnus, originadas por una bacteria bautizada en su honor -Frankia); incluso

cuando se convenció de que los simbiontes eran bacterias (y no hongos o

mixomicetes), pensaba que éstas sólo estimulaban a que las plantas fijaran nitrógeno

en sus hojas; su "conversión" (y aún así incompleta y con reticencias) no llegó hasta

1892. El aislamiento de los bacteroides intranodulares (Prazmowski, 1890), y la relación

entre su formación y la fijación de nitrógeno (Nobbe y Hiltner, 1893) completó esta

primera oleada de investigación sobre este tema que tanta trascendencia presentaba

para la Agronomía. Estos estudios están en la base de todos los ulteriores trabajos de

Microbiología Agrícola, de modo que esta especialidad fue incorporada tempranamente

a los laboratorios científicos y estaciones experimentales.

Las obras trascendentales de Winogradsky y Beijerinck abrieron un nuevo horizonte

para el estudio de la diversidad microbiana. La escuela de Beijerinck, en la Universidad

Técnica de Delft, fue continuada por A.J. Kluyver y C.B. van Niel, siendo este último el

"padre" de la escuela norteamericana desde su establecimiento en California, ya que

formó a figuras tan importantes como R.Y. Stanier, R.E. Hungate o M. Doudoroff. La

escuela holandesa fundada por Beijerinck tuvo asimismo otra fructífera "colonia" en la

ciudad alemana de Konstanz, donde N. Pfennig continuó el trabajo emprendido junto a

van Niel en Delft. Todos estos autores, y sus colaboradores, fueron realizando

contribuciones esenciales sobre una amplia diversidad de bacterias, descubriendo la

variedad de las bacterias fotosintéticas, los tipos de organismos litotróficos, y

profundizando en multitud de aspectos estructurales y fisiológicos de las bacterias

recién descubiertas. Como dice T.D. Brock en una recensión de Kluyver (1961) "los

hombres de la escuela de Delft de Microbiología General fueron pioneros en una época

en la que la mayoría de los investigadores estaban demasiado fascinados por

problemas aplicados en medicina, agricultura o industria, como para preocuparse por

microorganismos quimiosintéticos o fotosintéticos, o por aquellos que muestran

fermentaciones inusuales...". Pero, como en tantas otras ocasiones, este enfoque de

ciencia básica ha sido extraordinariamente fértil, y aparte de la profundización en la

unidad y diversidad de la vida ha dado origen a penetrantes percepciones en multitud

de problemas planteados, tarde o temprano, a las ciencias biológicas.

2.9. DESARROLLO DE LA INMUNOLOGÍA.

Ramirez - Balqui

33

La inmunología es, en la actualidad, una ciencia autónoma y madura, pero sus orígenes

han estado estrechamente ligados a la Microbiología. Su objeto consiste en el estudio

de las respuestas de defensa que han desarrollado los animales frente a la invasión por

microorganismos o partículas extraños, aunque su interés se ha volcado especialmente

sobre aquellos mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de

especificidad y de memoria, frente a agentes reconocidos por el cuerpo como no-

propios, así como de su neutralización y degradación.

Como tantas otras ciencias, la Inmunología presenta un prolongado período pre-

científico, de observaciones y aproximaciones meramente empíricas. La resistencia a

ulteriores ataques de una enfermedad infecciosa fue ya recogida en escritos de la

antigüedad; el historiador griego Tucídides (464-404 a.C.) narra que en una epidemia

acaecida durante la guerra del Peloponeso, los enfermos eran atendidos solo por

aquellos que habían sobrevivido previamente a la enfermedad, en la seguridad de que

éstos no volverían a ser contagiados. Igualmente, en la antigua China se había

observado que las personas que en su niñez habían padecido la viruela no la adquirían

más adelante en su vida. Los mismos chinos, en el siglo XI a. C., fueron los primeros en

intentar una aplicación de estas observaciones que indicaban la inducción de un estado

protector por medio de una forma suave de la enfermedad: la inhalación de polvo de

escaras de viruela provocaba un ataque suave que confería resistencia ante infecciones

posteriores. Una modificación fue introducida en Occidente en el siglo XVIII por Pylarini

y Timoni, y fue popularizada en Gran Bretaña por Lady Mary Wortley Montagu, esposa

del embajador inglés en Constantinopla, tras una serie inicial de pruebas sobre

"voluntarios" (prisioneros). Sin embargo, este tipo de prácticas no llegaron a arraigar

ampliamente, ya que no estaban exentas de riesgos, entre los cuales figuraba la

posibilidad de transmisión de otras enfermedades.

El primer acercamiento a la inmunización con criterios racionales fue realizado por el

médico inglés Edward Jenner (1749-1823), tras su constatación de que los vaqueros

que habían adquirido la viruela vacunal (una forma benigna de enfermedad que sólo

producía pústulas en las manos) no eran atacados por la grave y deformante viruela

humana. En mayo de 1796 inoculó a un niño fluido procedente de las pústulas

vacunales de Sarah Nelmes; semanas después el niño fue inyectado con pus de una

pústula de un enfermo de viruela, comprobando que no quedaba afectado por la

enfermedad. Jenner publicó sus resultados en 1798 ("An enquiry into the causes and

effects of the variolae vaccinae..."), pronosticando que la aplicación de su método podría

llegar a erradicar la viruela. Jenner fue el primero en recalcar la importancia de realizar

estudios clínicos de seguimiento de los pacientes inmunizados, consciente de la

necesidad de contar con controles fiables.

La falta de conocimiento, en aquella época, de las bases microbiológicas de las

enfermedades infecciosas retrasó en casi un siglo la continuación de los estudios de

Jenner, aunque ciertos autores, como Turenne, en su libro "La syphilization" (1878)

lograron articular propuestas teóricas de cierto interés.


34

El primer abordaje plenamente científico de problemas inmunológicos se debió, de

nuevo, a Pasteur. Estudiando la bacteria responsable del cólera aviar (más tarde

conocida como Pasteurella aviseptica), observó (1880) que la inoculación en gallinas de

cultivos viejos, poco virulentos, las protegía de contraer la enfermedad cuando

posteriormente eran inyectadas con cultivos normales virulentos. De esta forma se

obtuvo la primera vacuna a base de microorganismos atenuados. Fue precisamente

Pasteur quien dio carta de naturaleza al término vacuna, en honor del trabajo pionero de

Jenner. En los años siguientes Pasteur abordó la inmunización artificial para otras

enfermedades; concretamente, estableció de forma clara que cultivos de Bacillus

anthracis atenuados por incubación a 45ºC conferían inmunidad a ovejas expuestas a

contagio por carbunco. Una famosa demostración pública de la bondad del método de

Pasteur tuvo lugar en Pouilly le Fort, el dos de junio de 1881, cuando ante un gentío

expectante se pudo comprobar la muerte del grupo control de ovejas y vacas no

inoculadas, frente a la supervivencia de los animales vacunados. Años después,

abordaría la inmunización contra la rabia, enfermedad de la que se desconocía el

agente causal. Pasteur observó que éste perdía virulencia cuando se mantenían al aire

durante cierto tiempo extractos medulares de animales infectados, por lo que dichos

extractos se podían emplear eficazmente como vacunas. Realizó la primera vacunación

antirrábica en humanos el 6 de julio de 1885, sobre el niño Joseph Meister, que había

sido mordido gravemente por un perro rabioso. A este caso siguieron otros muchos, lo

que valió a Pasteur reconocimiento universal y supuso el apoyo definitivo a su método

de inmunización, que abría perspectivas prometedoras de profilaxis ante muchas

enfermedades. Estos logros determinaron, en buena medida, la creación del Instituto

Pasteur, que muy pronto reunió a un selecto grupo de científicos, que enfocarían sus

esfuerzos en diversos aspectos de las inmunizaciones y de sus bases biológicas. A su

vez, los norteamericanos Salmon y Smith (1886) perfeccionaron los métodos

serologicos de Pasteur, lo que les permitió producir y conservar más fácilmente sueros

tipificados contra la peste porcina.

A finales del siglo XIX existían dos teorías opuestas sobre los fundamentos biológicos

de las respuestas inmunes. Por un lado, el zoólogo ruso Ilya Ilich Mechnikov (1845-

1916), que había realizado observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y

pulgas de agua, estableció, a partir de 1883, su "Teoría de los fagocitos", tras estudiar

fenómenos de englobamiento de partículas extrañas por los leucocitos de conejo y de

humanos. Informó que existían fenómenos de eliminación de agentes patógenos por

medio de "células devoradoras" (fagocitos) que actuaban en animales vacunados contra

el carbunco, y explicó la inmunización como una "habituación" del hospedador a la

fagocitosis. Más tarde, ya integrado en el Instituto Pasteur, propugnó la idea de que los

fagocitos segregan enzimas específicos, análogos a los "fermentos" digestivos (1900).

Esta teoría de los fagocitos constituyó el núcleo de la teoría de la inmunidad celular, de

modo que la fagocitosis se consideraba como la base principal del sistema de defensa

inmune del organismo.

Por otro lado, la escuela alemana de Koch hacía hincapié en la importancia de los

mecanisnos humorales. Emil von Behring (1854-1917) y Shibasaburo Kitasato (1856-

1931), a resultas de sus trabajos sobre las toxinas del tétanos y de la difteria,

Ramirez - Balqui

35

observaron que el cuerpo produce "antitoxinas" (más tarde conocidas como

anticuerpos) que tendían a neutralizar las toxinas de forma específica, y evidenciaron

que el suero que contiene antitoxinas es capaz de proteger a animales expuestos a una

dosis letal de la toxina correspondiente (1890). La intervención de Ehrlich permitió

obtener sueros de caballo con niveles de anticuerpos suficientemente altos como para

conferir una protección eficaz, e igualmente se pudo disponer de un ensayo para

cuantificar la "antitoxina" presente en suero. Ehrlich dirigió desde 1896 el Instituto

Estatal para la Investigación y Comprobación de Sueros, en Steglitz, cerca de Berlín, y,

a partir de 1899, estuvo al frente del mejor equipado Instituto de Terapia Experimental,

en Frankfurt. Durante este último periodo de su vida, Ehrlich produce una impresionante

obra científica, en la que va ahondando en la comprensión de la inmunidad humoral. En

1900 da a luz su "Teoría de las cadenas laterales", en la que formula una explicación de

la formación y especificidad de los anticuerpos, estableciendo una base química para la

interacción de éstos con los antígenos. Por su lado, R. Kraus visualiza por primera vez,

en 1897, una reacción antígeno-anticuerpo, al observar el enturbiamiento de un filtrado

bacteriano al mezclarlo con un suero inmune específico (Antisuero). En 1898 Jules

Bordet (1870-1961) descubre otro componente sérico relacionado con la respuesta

inmunitaria, al que bautiza como "alexina", caracterizado, frente al anticuerpo, por su

termolabilidad e inespecificidad. (Más tarde se impondría el nombre de complemento,

propuesto por Ehrlich). El mismo Bordet desarrolló, en 1901, el primer sistema

diagnóstico para la detección de anticuerpos, basado en la fijación del complemento, y

que inició una larga andadura, que llega a nuestros días.

La conciliación de las dos teorías se debió a Almorth Wrigth y Stewart R. Douglas,

quienes en 1904 descubren las opsoninas, anticuerpos presentes en los sueros de

animales inmunizados y que, tras unirse a la superficie bacteriana, incrementan la

capacidad fagocítica de los leucocitos.

El área de la inmunopatología inicia su andadura con la descripción del fenómeno de

anafilaxia producido por introducción en un animal de un suero de una especie distinta

(Portier y Richet, 1902; Arthus, 1903), lo que a su vez abriría la posibilidad de métodos

de serodiagnóstico, con aplicaciones múltiples en Medicina, Zoología, y otras ciencias

biológicas. En 1905 Pirquet sugiere que la enfermedad del suero (un fenómemo de

hipersensibilidad) tiene relación directa con la producción de anticuerpos contra el suero

inyectado, introduciendo el término de alergia para referirse a la reactividad

inmunológica alterada.

La inmunoquímica cobra un gran impulso en las primeras décadas del siglo XX con los

trabajos de Karl Landsteiner (1868-1943). Su primera contribución de importancia había

sido la descripción, mediante reacciones de aglutinación, del sistema de antígenos

naturales (ABC0) de los eritrocitos humanos (1901-1902), completada (en colaboración

con Von Dungern y Hirzfeld), con las subdivisiones del grupo A y el estudio de su

transmisión hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estímulo para avanzar en el

desentrañamiento de la especificidad química de los antígenos que determinan la

formación de anticuerpos. Landsteiner estudió sistemáticamente las características de

inmunogenicidad y especificidad de reacción de antígenos con anticuerpos, valiéndose


36

de la modificación química de antígenos, denominando haptenos a aquellos grupos

químicos que por sí mismos no desencadenan formación de anticuerpos, pero sí lo

hacen tras ser conjugados a proteínas portadoras.

La cuestión de las reacciones antígeno-anticuerpo se convirtió en otra polémica entre

escuelas hasta finales de los años 20. Mientras Ehrlich y sus seguidores mantenían que

estas reacciones tienen una base puramente química, Bordet y sus discípulos las

explicaban como fenómenos físicos de reacciones entre coloides. La resolución del

debate debió aguardar hasta finales de los años 30, al incorporarse avances técnicos

como la electroforesis, la cromatografía en papel, la ultracentrifugación y el microscopio

electrónico. Heidelberg y Kendall (1936) purificaron anticuerpos a partir de sueros por

disociación de precipitados. Tiselius (1939) demostró que los anticuerpos constituyen la

fracción gamma-globulínica del suero. Veinte años después R.R. Porter y G.M. Edelman

establecen la estructura de las inmunoglobulinas. Durante este lapso de tiempo se

descubre que la síntesis de anticuerpos ocurre en las células plasmáticas, aunque éstas

no son puestas en relación aún con los linfocitos; durante muchos años se siguió

creyendo que los linfocitos eran células pasivas, sin función inmune. Por aquella época

se describe, también, la diversidad de inmunoglobulinas, llegándose al establecimiento

de una nomenclatura. Enseguida comienza la era de los múltiples experimentos sobre

timectomía en ratones neonatos y sobre bursectomía en aves, así como los de

reconstitución de animales irradiados, con timocitos y células de la medula ósea, y que

permiten afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales T y

B, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente.

Una importante faceta de la inmunología de la primera mitad del siglo XX fue la

obtención de vacunas. Se lograron toxoides inmunogénicos a partir de toxinas

bacterianas, en muchos casos por tratamiento con formol: toxoide tetánico (Eisler y

Lowenstein, 1915) y toxoide diftérico (Glenny, 1921). En 1922 se desarrolla la vacuna

BCG contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium

tuberculosis, el bacilo de Calmette-Guérin. La utilización de coadyuvantes se inicia en

1916, por LeMoignic y Piroy.

La inmunogenética nace cuando Bernstein describe en 1921 el modelo de transmisión

hereditaria de los cuatro grupos sanguíneos principales, basándose en el análisis

estadístico de sus proporciones relativas, y con el descubrimiento por Landsteiner y

Levène (1927) de los nuevos sistemas MN y P. Los experimentos de transfusiones

sanguíneas interespecíficas permitieron distinguir la gran complejidad de los antígenos

sanguíneos, explicables según unos 300 alelos múltiples.

Una contribución esencial a las ideas sobre el mecanismo de formación de los

anticuerpos la realizó el australiano Macfarlane Burnet (1899-1985), al establecer su

teoría de la selección clonal; ésta argumenta que cada linfocito B sintetiza un único tipo

de anticuerpo, específico para cada antígeno (determinante antigénico), de modo que la

unión del antígeno causa la proliferación clonal del linfocito B, con la consecuente

síntesis incrementada de anticuerpos específicos. Igualmente, Burnet lanzó una

hipótesis sobre el mecanismo subyacente a la auto-tolerancia inmunológica, que fue

Ramirez - Balqui

37

confirmada experimentalmente por Peter Medawar. Más recientemente Niels Jerne ha

realizado nuevas aportaciones y refinamientos a la teoría de la selección clonal,

proponiendo un modelo de regulación inmune conocido como teoría de las redes

idiotípicas.

Los avances en Inmunología durante los últimos años han sido espectaculares,

consolidando a ésta como ciencia independiente, con su conjunto propio de

paradigmas, ya relativamente escindida de su tronco originario microbiológico. Entre los

hitos recientes hay que citar la técnica de producción de anticuerpos monoclonales a

partir de hibridomas, desarrollada originalmente por César Milstein y Georges Kohler en

1975, y que presenta una enorme gama de aplicaciones en biomedicina, o el

desentrañamiento de los fenómenos de reorganización genética responsables de la

expresión de los genes de inmunoglobulinas, por Susumu Tonegawa.

2.10. ORIGEN Y DESARROLLO DE LA VIROLOGÍA.

La Virología ha sido la ciencia microbiológica de origen más tardío, habiendo surgido

como resultado del hallazgo de enfermedades infecciosas en las que la demostración

de implicación de microorganismos se demostraba esquiva con los medios habituales

disponibles a finales del siglo XIX. La euforia que se vivía en los ámbitos científicos y

médicos, al socaire de la edad de oro de aislamiento de bacterias patógenas, se plasmó

en el prejuicio de que la incapacidad de hacer crecer los agentes causantes de ciertas

enfermedades se debía a una técnica inapropiada o mal aplicada.

El botánico ruso Dimitri Iwanovski había observado (1892) que la enfermedad del

mosaico del tabaco podía ser reproducida experimentalmente usando el fluido que

atravesaba los filtros de porcelana que normalmente retenían a las bacterias, pero

siendo incapaz de aislar y crecer el supuesto microorganismo, abandonó la

investigación. Pocos años más tarde (1898), y probablemente sin tener noticias del

trabajo de Iwanovski, Beijerink realizó experimentos similares con el mismo sistema, y

en otro rasgo de su genio, enfrentándose a los conceptos de la época, avanzó la idea

de que el agente filtrable (un contagium vivum fluidum, según su expresión), debía de

incorporarse al protoplasma vivo del hospedador para lograr su reproducción. Este tipo

de agentes infectivos que atravesaban los filtros de porcelana fueron llamados en

principio "virus filtrables", quedando más tarde su denominación simplemente como

virus. Aquel mismo año de 1898 Loeffler y Frosch descubren los virus animales al

comprobar que un virus filtrable es responsable de la glosopeda del ganado. En 1901

Reed descubre el primer virus humano, el de la fiebre amarilla, y en 1909 Landsteiner y

Pope detectan el de la poliomielitis. A comienzos de siglo Copeman desarrolla su

técnica de multiplicación de virus animales en embriones de pollo, con la que P. Rous

aísla y cultiva el virus del sarcoma aviar (1911).

Los virus bacterianos fueron descubiertos en 1915 por F.W. Twort, si bien su trabajo no

alcanzó la elegancia y claridad del desarrollado poco más tarde por el canadiense Félix

d'Hérelle (1917); fue éste quien acuñó el término bacteriófago, y supuso correctamente

que el fenómeno de lisis por estos agentes debía de estar ampliamente difundido entre

las bacterias. Aunque su esperanza en la aplicación de los fagos como elementos


38

bactericidas para uso médico no pudo satisfacerse, la contribución de los virus

bacterianos al avance de la genética y biología moleculares ha sido decisiva: de hecho,

los primeros estudios cuantitativos sobre replicación virásica se realizaron sobre fagos

de Escherichia coli, lo que suministró modelos aplicables a otros virus, incluidos los de

animales. En 1925 Bordet y Bal describen por primera vez el fenómeno de lisogenia,

pero las relaciones entre los ciclos lítico y lisogénico de los fagos no fueron aclaradas

hasta los estudios de André Lwoff (1950).

La primera visualización de un virus se debe a las observaciones a microscopio

ultravioleta del bacteriólogo inglés Barnard (1925), y en 1939 se realiza la primera

fotografía de un virus a microscopio electrónico. Pero los avances más significativos en

el estudio de la composición y estructura de los virus se inician con la purificación y

cristalización, por Wendell M. Stanley, del virus del mosaico del tabaco -TMV- (1935),

aplicando procedimientos típicos de la cristalización de enzimas. Inicialmente Stanley

comprobó que el TMV contenía gran proporción de proteína, pero poco más tarde

detecta, además, la presencia de ácido nucleico. A partir de aquí, la Virología entra en

una fase de ciencia cuantitativa, en la que participan numerosos físicos, bioquímicos y

genetistas, en un esfuerzo interdisciplinario que da origen a la moderna Biología

Molecular.

Un importante avance metodológico para el estudio de los virus animales se debió a

Enders, Weller y Robbins (1949), al desarrollar por primera vez un método para la

multiplicación virásica sobre cultivos de tejidos de mamíferos, técnica que fue

perfeccionada más tarde por el equipo de Renato Dulbecco.

Los recientes progresos en las numerosas técnicas de biología molecular han

propiciado una auténtica explosión de descubrimientos sobre la biología de los virus y

de sus células hospedadoras; baste citar la replicación del genomio de ARN de los

retrovirus por reversotranscripción a ADN, los fenómenos de transformación oncogénica

virásica y su aplicación a los estudios generales del cáncer, el diseño de vacunas

recombinantes por manipulación in vitro de genomios virásicos, la próxima aplicación

clínica de la primeras terapias génicas en humanos recurriendo a vectores virásicos,

etc. En el terreno de las necesidades urgentes, la metodología existente ha permitido la

rápida identificación y caracterización del virus de la inmunodeficiencia humana, lo que

se está traduciendo en una intensa y racional búsqueda de procedimientos para

prevenir y eliminar la inesperada epidemia de SIDA.

En años recientes han sido descubiertos dos nuevos tipos de entidades infectivas,

subvirásicas: T.O. Diener describió en 1967 la existencia de ARN desnudos infectivos

en plantas, a los que llamó viroides, y en 1981 Prusiner puso de manifiesto que

determinadas enfermedades de mamíferos se deben a partículas proteicas

aparentemente desprovistas de material genético, a las que bautizó como priones.

2.11. RELACIONES ENTRE LA MICROBIOLOGÍA Y OTRAS CIENCIAS BIOLÓGICAS.

El auge de la microbiología desde finales del siglo XIX se plasmó, entre otras cosas, en

el aislamiento de gran variedad de cepas silvestres de microorganismos, lo que

Ramirez - Balqui

39

suministró un enorme volumen de nuevo material biológico sobre el que trabajar,

aplicándose una serie de enfoques que eran ya habituales en las ciencias naturales

más antiguas; así, había que crear un marco taxonómico (con sus normas de

nomenclatura) para encuadrar a los organismos recién descubiertos, era factible

desarrollar trabajos sobre morfología y fisiología comparadas, sobre variabilidad y

herencia, evolución, ecología, etc. De este modo la joven Microbiología fue objeto, en

pocos años, de la utilización, a un ritmo acelerado, de los métodos taxonómicos y

experimentales que habían ido surgiendo y madurando desde el siglo XVIII en los

ámbitos de la "Historia Natural" clásica.

Los avances de Taxonomía Microbiana, vale la pena reseñar aquí los esfuerzos

tempranos para lograr un clasificación bacteriana por parte de Cohn (1875) y Migula

(1894), que sustentaban su concepto de especie predominantemente sobre caracteres

morfológicos. Pero hacia 1900 era evidente la arbitrariedad e insuficiencia de este tipo

de clasificaciones, de modo que los intentos posteriores hicieron uso de caracteres

bioquímicos (Orma Jensen, 1909), o de una mezcla de rasgos morfológicos,

bioquímicos, patogénicos y de tinción (Buchanan, 1915). El sistema de taxonomía

bacteriana adquirió un nuevo impulso a partir de la 1ª edición del "Bergey's Manual of

Determinative Bacteriology" (1923), y de las propuestas de Kluyver y van Niel

("Prospects for a natural system of classification of bacteria", 1936). En cuanto a la

nomenclatura, no fue hasta 1958 en que cuajó un Código Internacional de

Nomenclatura Bacteriológica, aunque ya se venía aplicando desde hacía tiempo el

procedimiento tipológico para los microorganismos, con criterios similares a los de la

Zoología y la Botánica.

El establecimiento de relaciones taxonómicas precisó el recurso a métodos cada vez

más amplios y afinados de análisis genético, estructural o fisiológico. En un apartado

anterior ya vimos las conexiones tempranas entre la Bioquímica y la Microbiología a

propósito del descubrimiento de la base enzimática de las fermentaciones, lo cual abrió

el camino para dilucidar el metabolismo energético microbiano, y para demostrar su

similitud química con rutas metabólicas de organismos superiores. Otro paso importante

en la percepción de la unidad bioquímica del mundo vivo deriva del descubrimiento de

las vitaminas (término acuñado por Funk en 1911), al establecerse que determinados

factores de crecimiento requeridos por algunos microorganismos eran químicamente

similares a las vitaminas necesarias en la dieta de los animales, y que este tipo de

compuestos representa precursores biosintéticos de coenzimas del metabolismo

celular. Así pues, este tipo de investigaciones sentó claramente la idea de la unidad

química de los seres vivos, independientemente de su encuadre taxonómico, y encauzó

una buena parte de los trabajos bioquímicos hacia los microorganismos, dadas sus

cualidades de facilidad de manejo y cultivo en laboratorio.

En cuanto a las conexiones de la Microbiología con la Genética, ya Beijerink, en 1900,

tras analizar la teoría de la mutación de De Vries, había predicho que los

microoganismos podrían convertirse en objetos de investigación más adecuados que

los sistemas animales o vegetales. Pero las primeras conexiones entre ambas ciencias

arrancan de la necesidad que hubo, a principios del siglo XX, de determinar la


40

sexualidad de los hongos con fines taxonómicos. En 1905 Maire demostró la existencia

de meiosis en la formación de ascosporas, y Claussen (1907) evidenció fusión de

núcleos en Ascomicetos, mientras que Kniepp, hacia finales de los años 30 había

recogido un gran volumen de información sobre procesos sexuales en Basidiomicetos.

El sueco Lindegren (1936) realiza las primeras cartografías genéticas en cromosomas

de Neurospora, durante su estancia en el laboratorio californiano de Morgan; este

último, propugnador de la "teoría de los genes" (1926), confiaba desde hacía años en

ampliar sus éxitos, logrados en Drosophila, hacia el estudio de la genética microbiana.

En 1941, otros dos discípulos de Morgan, Beadle y Tatum, aíslan mutantes auxotróficos

de Neurospora, con lo que se inicia el estudio de la base bioquímica de la herencia, y

convierten a este hongo en una valiosa herramienta de trabajo en esta línea de

investigación.

Las estrategias diseñadas por Beadle y Tatum fueron aplicadas por Luria y Delbrück

(1943) a cultivos bacterianos, investigando la aparición de mutaciones espontáneas

resientes a fagos o estreptomicina. La conexión de estos experimentos con las

observaciones previas de Griffith (1928) sobre la transformación del neumococo, llevó a

Avery y colaboradores (1944) a demostrar que el "principio transformante" portador de

la información genética es el ADN. En 1949 Erwin Chargaff demuestra bioquímicamente

la transmisión genética mediante ADN en Escherichia coli, y en 1952 Alfred Hershey y

Martha Chase, en experimentos con componentes marcados de fagos, ponen un

elegante colofón a la confirmación de la función del ADN, con lo que se derribaba el

antiguo y asentado "paradigma de las proteínas" que hasta mediados de siglo intentaba

explicar la base de la herencia. De esta forma, la Microbiología experimental se sitúa en

pleno centro del nacimiento de la Genética molecular, de la mano de los avances

paralelos en Bioquímica (análisis por rayos X de la estructura del ADN debido a Maurice

Wilkins y Rosalind Franklin, modelo de Watson y Crick de la doble hélice del ADN, etc.),

dando origen esta confluencia a lo que se ha llamado la "edad de oro" de la Biología

Molecular.

III. INTRODUCCIÓN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA MICROBIOLOGÍA.

El objeto de estudio de una ciencia se puede desglosar en dos apartados: objeto material y

objeto formal.

3.1. OBJETO MATERIAL: LOS MICROORGANISMOS La Microbiología es la ciencia que se ocupa del estudio de los microorganismos, es decir, de aquellos organismos demasiado pequeños para poder ser observados a simple vista, y cuya visualización requiere el empleo del microscopio. Esta definición implica que el objeto material de la Microbiología viene delimitado por el tamaño de los seres que investiga, lo que supone que abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonómicos: desde partículas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los protozoos y parte de las algas y de los hongos. De esta manera la Microbiología se distingue de otras disciplinas (como la Zoología y la Botánica) que se centran en grupos de seres vivos definidos por conceptos biológicos homogéneos, ya que su objeto de indagación se asienta sobre un criterio artificial que obliga a incluir entidades sin más

Ramirez - Balqui

41

relación en común que su pequeño tamaño, y a excluir a diversos organismos macroscópicos muy emparentados con otros microscópicos.

A pesar de esto (o incluso debido a ello), la Microbiología permanece como una

disciplina perfectamente asentada y diferenciada, que deriva su coherencia interna del

tipo de metodologías ajustadas al estudio de los organismos cuyo tamaño se sitúa por

debajo del límite de resolución del ojo humano, aportando un conjunto específico de

conceptos que han enriquecido la moderna Biología.

Podemos definir, pues, a los microorganismos como seres de tamaño microscópico

dotados de individualidad, con una organización biológica sencilla, bien sea acelular o

celular, y en este último caso pudiendo presentarse como unicelulares, cenocíticos,

coloniales o pluricelulares, pero sin diferenciación en tejidos u órganos, y que necesitan

para su estudio una metodología propia y adecuada a sus pequeñas dimensiones. Bajo

esta denominación se engloban tanto microorganismos celulares como las entidades

subcelulares.

3.1.1. MICROORGANISMOS CELULARES.

Comprenden todos los procariotas y los microorganismos eucarióticos (los

protozoos, los mohos mucosos, los hongos y las algas microscópicas).

3.1.2. VIRUS Y PARTICULAS SUBVIRASICAS.

Otro tipo de objetos de estudio de la microbiología son las entidades no celulares,

que a pesar de no poseer ciertos rasgos atribuibles a lo que se entiende por vida,

cuentan con individualidad y entidad biológica, y caen de lleno en el dominio de

esta ciencia.

Los virus son entidades no celulares de muy pequeño tamaño (normalmente

inferior al del más pequeño procariota), por lo que debe de recurrirse al

microscopio electrónico para su visualización. Son agentes infectivos de

naturaleza obligadamente parasitaria intracelular, que necesitan su incorporación

al protoplasma vivo para que su material genético sea replicado por medio de su

asociación más o menos completa con las actividades celulares normales, y que

pueden transmitirse de una célula a otra. Cada tipo de virus consta de una sola

clase de ácido nucleico (ADN o ARN, nunca ambos), con capacidad para codificar

varias proteínas, algunas de las cuales pueden tener funciones enzimáticas,

mientras que otras son estructurales, disponiéndose éstas en cada partícula

virásica (virión) alrededor del material genético formando una estructura regular

(cápsida); en algunos virus existe, además, una envuelta externa de tipo

membranoso, derivada en parte de la célula en la que se desarrolló el virión

(bicapa lipídica procedente de membranas celulares) y en parte de origen virásico

(proteínas).

En su estado extracelular o durmiente, son totalmente inertes, al carecer de la

maquinaria de biosíntesis de proteínas, de replicación de su ácido nucleico y de

obtención de energía. Esto les obliga a un modo de vida (sic) parasitario


42

intracelular estricto o fase vegetativa, durante la que el virión pierde su integridad,

y normalmente queda reducido a su material genético, que al superponer su

información a la de la célula hospedadora, logra ser expresado y replicado,

produciéndose eventualmente la formación de nuevos viriones que pueden

reiniciar el ciclo.

Los viroides son un grupo de nuevas entidades infectivas, subvirásicas,

descubiertas en 1967 por T.O. Diener en plantas. Están constituidos

exclusivamente por una pequeña molécula circular de ARN de una sola hebra,

que adopta una peculiar estructura secundaria alargada debido a un extenso, pero

no total, emparejamiento intracatenario de bases por zonas de homología interna.

Carecen de capacidad codificadora y muestran cierta semejanza con los intrones

autocatalíticos de clase I, por lo que podrían representar secuencias intercaladas

que escaparon de sus genes en el transcurso evolutivo. Se desconocen detalles

de su modo de multiplicación, aunque algunos se localizan en el nucleoplasma,

existiendo pruebas de la implicación de la ARN polimerasa II en su replicación, por

un modelo de círculo rodante que genera concatémeros lineares. Esta replicación

parece requerir secuencias conservadas hacia la porción central del viroide. Los

viroides aislados de plantas originan una gran variedad de malformaciones

patológicas. El mecanismo de patogenia no está aclarado, pero se sabe que

muchos de ellos se asocian con el nucleolo, donde quizá podrían interferir; sin

embargo, no existen indicios de que alteren la expresión génica (una de las

hipótesis sugeridas); cada molécula de viroide contiene uno o dos dominios

conservados que modulan la virulencia.

En 1986 se descubrió que el agente de la hepatitis delta humana posee un

genomio de ARN de tipo viroide, aunque requiere para su transmisión (pero no

para su replicación) la colaboración del virus de la hepatitis B, empaquetándose

en partículas similares a las de este virus. A diferencia de los viroides vegetales,

posee capacidad codificadora de algunas proteínas.

Los ARNs satélites son pequeñas moléculas de tamaño similar al de los viroides

de plantas (330-400 bases), que son empaquetados en cápsidas de determinadas

cepas de virus (con cuyos genomios no muestran homologías). Se replican sólo

en presencia del virus colaborador específico, modificando (aumentando o

disminuyendo) los efectos patógenos de éste.

Los virusoides constituyen un grupo de ARNs satélites no infectivos, presentes

en el interior de la cápsida de ciertos virus, con semejanzas estructurales con los

viroides, replicándose exclusivamente junto a su virus colaborador.

Los priones son entidades infectivas de un tipo totalmente nuevo y original,

descubiertas por Stanley Prusiner en 1981, responsables de ciertas enfermedades

degenerativas del sistema nervioso central de mamíferos (por ejemplo, el "scrapie"

o prurito de ovejas y cabras, la encefalitis espongiforme bovina), incluyendo los

humanos (kuru, síndrome de Gerstmann-Straüssler, enfermedad de Creutzfeldt-

Ramirez - Balqui

43

Jakob). Se definen como pequeñas partículas proteicas infectivas que resisten la

inactivación por agentes que modifican ácidos nucleicos, y que contienen como

componente mayoritario (si no único) una isoforma anómala de una proteína

celular. Tanto la versión celular normal (PrPC) como la patógena (PrP

Sc en el caso

del "scrapie") son glicoproteínas codificadas por el mismo gen cromosómico,

teniendo la misma secuencia primaria. Se desconoce si las características

distintivas de ambas isoformas estriban en diferencias entre los respectivos

oligosacáridos que adquieren por procesamiento post-traduccional.

A diferencia de los virus, los priones no contienen ácido nucleico y están

codificados por un gen celular. Aunque se multiplican, los priones de nueva

síntesis poseen moléculas de PrP que reflejan el gen del hospedador y no

necesariamente la secuencia de la molécula del PrP que causó la infección previa.

Se desconoce su mecanismo de multiplicación, y para discernir entre las diversas

hipótesis propuestas quizá haya que dilucidar la función del producto normal y su

posible conversión a la isoforma patógena infectiva.

Recientemente se ha comprobado que, al menos algunas de las enfermedades

por priones son simultáneamente infectivas y genéticas, una situación insólita en

la Patología humana, habiéndose demostrado una relación entre un alelo

dominante del PrP y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. El gen del prión (Prn-p)

está ligado genéticamente a un gen autosómico (Prn-i) que condiciona en parte

los largos tiempos de incubación hasta el desarrollo del síndrome.

3.2. OBJETO FORMAL.

Todos los aspectos y enfoques desde los que se pueden estudiar los microorganismos

conforman lo que denominamos objeto formal de la Microbiología: características

estructurales, fisiológicas, bioquímicas, genéticas, taxonómicas, ecológicas, etc., que

conforman el núcleo general o cuerpo básico de conocimientos de esta ciencia. Por otro

lado, la Microbiología también se ocupa de las distintas actividades microbianas en

relación con los intereses humanos, tanto las que pueden acarrear consecuencias

perjudiciales (y en este caso estudia los nichos ecológicos de los correspondientes

agentes, sus modos de transmisión, los diversos aspectos de la microbiota patógena en

sus interacciones con el hospedador, los mecanismos de defensa de éste, así como los

métodos desarrollados para combatirlos y controlarlos), como de las que reportan

beneficios (ocupándose del estudio de los procesos microbianos que suponen la

obtención de materias primas o elaboradas, y de su modificación y mejora racional con

vistas a su imbricación en los flujos productivos de las sociedades).

Finalmente, la Microbiología ha de ocuparse de todas las técnicas y metodologías

destinadas al estudio experimental, manejo y control de los microorganismos, es decir,

de todos los aspectos relacionados con el modo de trabajo de una ciencia empírica.


44

Ramirez - Balqui

45

CAPITULO II

MICROBIOLOGIA MÉDICA, MICROSOCOPIA Y

TAXONOMIA BACTERIANA.

MMiiccrroobbiioollooggííaa MMééddiiccaa

MMiiccrroossccooppííaa

TTaaxxoonnoommííaa bbaacctteerriiaannaa.. CCaatteeggoorrííaass ttaaxxoonnóómmiiccaass

CCeeppaass oo cclloonneess.. BBiioottiippooss

NNoommeennccllaattuurraa ddee llaass bbaacctteerriiaass

PPaattooggeenniicciiddaadd yy VViirruulleenncciiaa

MMééttooddooss iinnmmuunnoollóóggiiccooss eenn mmiiccrroobbiioollooggííaa ccllíínniiccaa

MMééttooddooss mmoolleeccuullaarreess eenn mmiiccrroobbiioollooggííaa ccllíínniiccaa

BBaacctteerriiaass ddee iinntteerrééss mmééddiiccoo ((ccllaassiiffiiccaacciióónn sseeggúúnn BBeerrggeeyy))

BBaacctteerriiaass ddee iinntteerrééss iinndduussttrriiaall


46

Ramirez - Balqui

47

MICROBIOLOGIA MÉDICA, MICROSOCOPIA Y TAXONOMIA

BACTERIANA

I. MICROBIOLOGIA

En general, las bacterias son organismos unicelulares, desprovistos de clorofila que pueden

vivir libres o bien agruparse.

Su tamaño varia entre 0.2 y 3 micras de diámetro. Aunque son verdaderas células, su

estructura presenta rasgos especiales:

a) Por ser procarióticas carecen de núcleo diferenciado. El citiplasma presenta un solo

cromosoma en forma de anillo (ADN circular).

b) Una pared rígida (pared bacteriana) rodea la membrana plasmática. La composición

química de la pared bacteriana varía en los distintos grupos de bacterias y se refleja en la

capacidad de retener o no determinados colorantes. Según esto, las bacterias se clasifican

en grampositivas o gramnegativas. Además, ciertas bacterias presentan una capa viscosa

formada por azúcares complejos sobre la pared bacteriana que es lo que llamamos

cápsula.

c) Algunas bacterias son inmóviles; otras se desplazan mediante la utilización de cilios o

flegelos.

d) No presentan mitocondrias, aunque por tratarse de seres vivos, también respiran.

Según su forma o morfología reciben distintos nombres bacilos, con forma de bastón; vibrio,

semejantes a una coma; o parecidos a un sacacorchos, como los espirilos.

Por último, los cocos son de forma redondeada y pueden agruparse por parejas (diplococos),

en cadena (estreptococos) o de modo irregular (estafilococos).

En el mundo de las bacterias, las formas de alimentación son muy variadas. Algunas viven en

el suelo y, partiendo de sustancias inorgánicas, son capaces de sintetizar su propio alimento;

presentan, por tanto, nutrición autótrofa.


48

Dentro de este grupo podemos distinguir las que realizan la fotosíntesis, si bien se trata de un

proceso algo distinto del que tiene lugar en las plantas; poseen variedades únicas de clorofila

(bacterioclorofila), y las que aprovechan la energía de ciertas reacciones químicas (y no la del

sol) para construir sus propias sustancias. Entre ésta última, llamadas quimiotrofas, se

encuentran:

Las bacterias sulfurosas, que adsorben azúcar (o ácido sulfhídrico) y lo combinan con

oxígeno.

Las bacterias ferricas, que viven en aguas dulces o saladas en las que existe hierro en

disolución; absorben estos compuestos y los combina con el oxígeno.

Las bacterias hidrógenas, que combinan hidrógeno y oxígeno dando agua como

subproducto de su actividad.

Las bacterias nitrificantes, que oxidan ciertos compuestos nitrogenados.

Estos cuatros tipos de bacterias aprovechan la energía que se libera en las reacciones

descritas.

Sin embargo, la mayoría de las bacterias dependen de otros seres vivos para alimentarse.

Estas bacterias, heterótrofas, pueden ser saprofitas y vivir a expensas de la materia orgánica

en descomposición, los parásitos si viven sobre o dentro de animales o vegetales vivos, o

simbióticas cuando se asocian a otros organismos para obtener ambos un beneficio mutuo.

Las bacterias viven en todo tipo de medios: en el agua, en la tierra y en los seres vivos. En este

último caso pueden tener efectos benéficos para el organismo en el que se encuentran, como

sucede por ejemplo con unas bacterias del intestino del hombre, que producen una sustancia

muy importante: la vitamina K..

En muchos casos las bacterias producen enfermedades cuando se hallan presentes en los

animales y en las plantas. En tal caso reciben el nombre de bacterias patógenas.

Las "insignificantes" bacterias han producido grandes epidemias a lo largo de la historia, como

lo es el caso de la peste o el cólera. Pero también son responsables de enfermedades muy

comunes entre nosotros, tales como el canto o las anginas.

La reproducción más típica en las bacterias es la asexual, multiplicándose por simple escisión

o bipartición.

Este proceso es enormemente eficaz porque, en condiciones apropiadas, pueden llegar a

dividirse cada veinte minutos. A las seis o sietes horas, una sólo bacteria puede dar lugar a un

millón de descendiente. No cabe duda, que son los organismos vivos más abundantes sobre la

tierra.

Por su simplicidad ante organismos más complejos, las bacterias son muy utilizadas en la

investigación bioquímica y genética.

Algunos bacilos tienen la propiedad de formar estructuras de resistencia o esporas cuando las

condiciones se vuelven adversas.

Ramirez - Balqui

49

Los mecanismos parasexuales mediante los cuales realizan intercambios de material genético

son:

La conjugación: hay una bacteria donadora y otra receptora.

La transducción; el agente transmisor es un virus que transporta fragmentos de la última

bacteria que ha parasitado.

La transformación: una bacteria introduce fragmentos de ADN que hay libres en el medio.

En la conjugación, una célula donadora emite un apéndice tubular llamado pili o fimbria que

comunica su citoplasma con el de la célula receptora. Por esto puente puede pasar una porción

del cromosoma donador.

II. MICROSCOPIA.

Un microscopio simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que amplifica una

imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El

microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos.

El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos

separados estos deben estar como mínimo a esa distancia.

El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información.

La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espécimen,

la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración.

Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 m dada por una luz con

longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y

con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo,

pero no puede aumentar la resolución.

Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en

factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la alteración física de

la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.

2.1. TIPOS DE MICROSCOPIOS

Microscopio de campo claro – Es descendiente de los disponibles a partir de 1800.

Compuestos por:

Fuente luminosa que ilumina la muestra.

Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra.

Platina sobre la cual se coloca la muestra.

Objetivo que recibe la luz que atravesó la muestra.

Ocular que recibe directamente la imagen formada por el objetivo.


50

La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz. Con este

tipo de microscopio se deben utilizar métodos de tinción porque el campo claro de este

no produce un nivel útil de contraste.

Microscopio de contraste de fase – Permite observar células sin colorear y resulta

especialmente útil para células vivas.

Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas

partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por

regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase

con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras

longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y

del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y

produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen

corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen

corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan

para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el

microscopio de interferencia diferencial.

Microscopio de campo oscuro – El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las

estructuras del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro está

equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta.

En consecuencia el campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual

aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia

el objetivo.

El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un

proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de

polvo llega hasta la retina del ojo y las hacen visibles.

La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo

oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede

detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro,

debido al contraste creado.

Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas

en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis.

Microscopio de fluorescencia – Una molécula que fluorece emite luz de longitud de onda

que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz

ultravioleta. Se usa para revelar moléculas fluorescentes naturales, como la vitamina A

y algunos neurotransmisores. Al ser escasas las moléculas autofluorecentes su

aplicación más difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la

detección de antígenos o anticuerpos en procedimientos de coloración

Ramirez - Balqui

51

inmunocitoquímica. También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en

un animal o directamente en células y usarlas como marcadores. Estos métodos

sirvieron para estudiar uniones intercelulares, trayectorias de las fibras nerviosas en

neurobiología y en detección de marcadores del crecimiento fluorescentes en tejidos

mineralizados.

Se insertan distintos filtros entre la fuente de luz ultravioleta y la muestra para producir

luz monocromática o casi monocromática, o entre el espécimen y el objetivo

permitiendo que la estrecha banda de longitudes de onda de fluorescencia llegue hasta

el ojo o incida en una emulación fotográfica u otro procedimiento analítico.

Microscopio de barrido confocal – Se usa para estudiar la estructura de los materiales

biológicos. Emplea un sistema de iluminación con rayo láser que es muy convergente y,

en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo. La luz que emerge

del punto es dirigida a un tubo fotomultiplicador, donde es analizada. Se utiliza un

sistema de espejos para mover el rayo láser a través del espécimen, iluminando un solo

punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este

rayo móvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un

monitor de alta resolución. Este método tiene la ventaja de que se pueden tomar

imágenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la

imagen mediante un programa para dar una definición máxima a la imagen.

Es posible también crear imágenes múltiples a diferentes profundidades dentro del

espécimen y realizar reconstrucciones tridimensionales.

Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el microscopio de luz ultravioleta

depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz

ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una

resolución de 0,1 m. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del

funcionamiento de un espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en

fotografías. La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la

luz ultravioleta puede dañar la retina.

El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen determinados

aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación se puede

obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar el DNA y el RNA de cada

célula.

Microscopio de polarización – Este microscopio es una simple modificación del

microscopio óptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de

luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador entre el

objetivo y el observador.

Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ángulos de rotación

se usa para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada.

La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz

polarizada se denomina birrefringencia.


52

Exhiben birrefringencia el músculo estriado o esquelético y las inclusiones cristaloides

de las células intersticiales testiculares.

2.2. MICROSCOPIA ELECTRÓNICA.

Dentro de los microscopios electrónicos tenemos el de barrido y el de transmisión.

La ventaja de los microscopios electrónicos frente a los ópticos esta en que la longitud

de onda del haz de luz es aproximadamente 1/200, lo cual aumenta la resolución.

Microscopio electrónico de transmisión – La óptica es muy similar al óptico pero se

diferencia en que usa un haz de electrones en vez de un haz de luz visible.

Este microscopio se basa en los siguientes principios:

Una fuente, un filamento de tungsteno calentado que emite electrones (cátodo).

Un ánodo, hacia el cual son atraídos los electrones.

Una diferencia de potencial entre el cátodo y el ánodo imparte un voltaje de

aceleración entre 20.000 y 200.000 voltios a los electrones, que crea la haz.

El haz pasa por una serie de electroimanes que tienen las mismas funciones que las

lentes de vidrio de un microscopio óptico.

El condensador forma el haz y modifica el diámetro del haz que incide en el plano del

espécimen. El haz que atraviesa la muestra se coloca en foco y se aumenta por medio

de un objetivo y se aumenta aun más con una o más lentes proyectoras. La imagen final

se visualiza sobre una planilla cubierta por fósforo. Las porciones de la muestra que han

sido atravesadas por los electrones aparecen brillantes, las porciones que absorvieron o

esparcieron los electrones por su densidad inherente o debido al agregado de metales

pesados durante la preparación del espécimen aparecen oscuras. Se coloca una placa

fotográfica o un detector de video por encima o por debajo de la pantalla del visor, con

la finalidad de obtener un registro permanente de la imagen sobre la pantalla.

Las muestras se preparan sobre la misma base que la del microscopio óptico pero

requieren métodos más finos.

Los preparados la restricción que tienen es que en cada paso se trabaja con

especimenes de magnitud 3-4 órdenes menores o más finos que los utilizados para el

microscopio óptico. Debido a la gran resolución de estos microscopios electrónicos la

calidad de la fijación, es decir el grado de preservación de la estructura subcelular debe

ser la mejor posible.

La preparación de rutina de los especimenes para la microscopia electrónica de

transmisión comienza con la fijación con glutaraldehído, seguida de un lavado con un

buffer y de una fijación con tetróxido de osmio.

Ramirez - Balqui

53

Por lo general, se fijan para el microscopio electrónico de transmisión piezas de tejido

no mayores de 1 mm3.

El proceso de deshidratación es idéntico al empleado en la microscopia óptica.

El tejido incluido en material plástico se secciona por medio de micrótomos

especialmente diseñados, que usan cuchillas de diamante.

Debido al limitado poder de penetración de los electrones, el espesor de los cortes

preparados para el microscopio electrónico de transmisión varia entre 50 nm y 150 nm.

Estos cortes son demasiado finos para poder ser manipulados; se los hace flotar desde

el filo de la cuchilla en la superficie de una bandeja llena de líquido, se recuperan y se

colocan en rejillas de malla de cobre recubiertas por plástico. Estas rejillas tienen 50-

400 orificios por pulgada o hendiduras especiales para observar cortes seriados.

Por lo general, la coloración de los cortes para microscopio electrónico de transmisión

se realiza por medio del agregado a la muestra de materiales de elevada densidad,

tales como iones de metales pesados. Estos iones de metales pesados se unen a los

tejidos durante la fijación o la deshidratación o al sumergir las muestras en soluciones

de tales iones después del corte. El teróxido de osmio que se emplea de rutina en el

fijador se une a los componentes fosfolipídicos de las membranas, lo cual agrega

densidad a la membrana.

A menudo se agrega nitrato de uranilo a las soluciones alcohólicas usadas en la

deshidratación, con el fin de agregar densidad a los componentes de las uniones

celulares y a otros sitios. La inmersión secuencial en soluciones de acetato de uranilo y

citrato de plomo se usa rutinariamente para teñir los cortes antes de observarlos con

microscopio electrónico de transmisión.

La congelación-fractura es un método especial de preparación de la muestra para

microscopia electrónica de transmisión, de gran importancia en el estudio de

membranas.

El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso se elimina el fijador del

tejido por medio de lavados, antes de procesarlo. Se infiltra el tejido con un

crioprotector, como el glicerol y se congela rápidamente a unos –160 grados

centígrados.

Microscopio electrónico de barrido – Se asemeja más que al microscopio electrónico de

transmisión a los tubos de televisión de donde deriva la microscopia electrónica. Para

analizar la mayoría de los tejidos se deja la muestra, se deshidrata por desecación de

punto crítico, se cubre con una película evaporada de oro-carbón, se monta en un taco

de aluminio y se coloca en la cámara de muestras del microscopio. En los tejidos

mineralizados es posible eliminar todos los tejidos blandos con una lejía y analizar las

características estructurales del mineral.


54

Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a

través de la superficie un tubo de televisión. Los electrones reflejados desde la

superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la superficie son captados por

uno o más detectores y reprocesados para formar una imagen tridimensional en una

televisión.

Se pueden tomar fotografías para registrar los datos o la imagen en una cinta de video.

Se pueden usar otros detectores para medir los rayos X emitidos desde la superficie, la

catodoluminiscencia de las moléculas del tejido por debajo de la superficie y los

electrones de Auger emitidos en la superficie.

Muchos microscopios combinan las características de un microscopio electrónico de

transmisión y de barrido, el cual permite microanálisis por rayos X con sonda

electrónica.

Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos X emitidos cuando el

haz de bombardea el corte histológico, y mediante analizadores apropiados se

construye un mapa que muestra la distribución en los cortes de los elementos que

tienen número atómico mayor de 12, en concentración suficiente para producir rayos X

en cantidad tal que se pueda analizar.

III. TAXONOMIA BACTERIANA. CATEGORIAS TAXONOMICAS.

En el caso de las bacterias, el concepto de especie, un grupo de organismos que pueden

reproducirse entre ellos y dar descendencia fértil, no es apropiado, pues su reproducción es

asexual. En microbiología se dice que una especie está formada por un conjunto de

poblaciones clonales, o cepas, que se parecen mucho entre ellas y se pueden diferenciar de

otros grupos de bacterias.

La clasificación, de las bacterias se hace principalmente basándose en propiedades

bioquímicas, fisiológicas y ecológicas, como por ejemplo ser aeróbicas, anaeróbicas o aerobias

facultativas.

Para clasificar una bacteria, primero hay que aislarla para obtener un cultivo puro. Esto se

consigue distribuyendo la muestra, de manera que al sembrar las bacterias se desarrollen

separadamente y se pueda aislar un clon en concreto. Después este se ha de sembrar en

diferentes medios de cultivo, convenientemente preparados para realizar diferentes pruebas y

observar el tipo de crecimiento que se produce en ellos, por ejemplo ver si puede degradar la

lactosa o no, etc.

Niveles Taxonómicos:

Taxonomía.- Conjunto de técnicas y procedimientos para ordenar y agrupar a los seres vivos

en grupos afines o taxones.

Sistemática.- Se encarga de agrupar a los seres vivos de acuerdo a criterios de semejanzas y

diferencias y relaciones evolutivas. Establece árboles genealógicos:

Ramirez - Balqui

55

Reino

Phylum

Clase

Orden

Familia

Género

Especie

Reino.- Conjunto de phyla

Phylum.- Conjunto de clase

Clase.- Conjunto de órdenes similares.

Orden.- Conjunto de familias relacionadas

Familia.- Reúne a los géneros con grandes semejanzas.

Género.- Conjunto de especies muy cercanas entre sí.

Especie.- Es la unidad fundamental de clasificación y se define como conjunto de

organismos que poseen antepasados comunes anatómicos o fisiológicos

similares.

Robert Whittaker, biólogo estadounidense, propuso que los seres vivos se pueden clasificar en

cinco reinos:

Reino mineral, incluye a organismos unicelulares, procariontes, algunos de ellos forman

colonias, su reproducción es por bipartición, habitan en todos los lugares conocidos. La

mayoría son heterótrofos aunque algunos utilicen luz solar o bien energía que prende durante

los procesos de descomposición de compuestos orgánicos o inorgánicos.

Bacterias (importancia)

a) cocos Estafilococos:- Estreptococos:

b) Bacilos lactobacilos

c) Espirilos

Existen así mismo bacterias que son importantes para todos los seres vivos llamadas que son

fijadoras del N2 nitrógeno.

IV. CEPAS O CLONES

V. NOMENCLATURA.

VI. BACTERIAS DE INTERES MEDICO


56

VII. MICROORGANISMOS DE INTERES INDUSRIAL.

7.1. CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS

Existen millones de organismos vivos en la Naturaleza, siendo algo característico del

hombre su afán por ordenar esa gran variedad de organismos. Con esa necesidad de

ordenamiento surge la Taxonomía como la ciencia de la clasificación, nomenclatura e

identificación. La Clasificación es algo creado por el hombre. Consecuencia de esta

artificialidad es la controversia que existe desde mediados del siglo XVIII sobre las

divisiones que se establecen entre los seres vivos. Lo que comenzó con Linneo siendo

una sencilla división de los seres vivos, los reinos Animalia y Plantae, ha ido haciéndose

cada vez más complejo al pasar por distintas modificaciones hasta llegar a nuestros días

con la propuesta de los tres dominios y varios reinos y con la sospecha de que no será la

última, ya que los conocimientos de que se dispone son cada vez mayores, así como las

posibilidades de aumentar esos conocimientos.

Carolus Linnaeus, a mediados del siglo XVIII, ordenó a todos los seres vivos en dos

Reinos bien definidos: el Reino Animalia que agrupaba a los animales, organismos

móviles y heterótrofos; y el Reino Plantae que incluía a los vegetales, individuos

inmóviles, autótrofos y fotosintéticos. Según el esquema de los dos reinos, los protozoos

se incluyeron en el Reino Animalia y el resto de microorganismos en el Reino Plantae.

Sin embargo, esta clasificación encontró pronto dificultades ya que existían numerosos

microorganismos que poseían características intermedias que no permitían su clara

adscripción a uno de los dos reinos preestablecidos. En 1866 Ernst Haeckel propuso un

tercer reino, el Reino Protista, para reordenar todos los seres vivos con organización

biológica sencilla ya fueran unicelulares, cenocíticos o multicelulares, pero todos ellos

carentes de especialización tisular y en los que cada individuo era capaz de realizar las

funciones propias y específicas que los tejidos de organismos superiores, animales y

plantas, tenían encomendadas. Según Haeckel, el Reino Protista incluiría bacterias,

algas, hongos y protozoos. Sin embargo, la validez del Reino Protista fué cuestionada a

medida que se obtenía más información acerca de la estructura interna de los

microorganismos debido a los avances en microscopía electrónica.

En 1937 Chatton dividió el mundo de los seres vivos en dos grandes grupos según

tuvieran o no membrana nuclear. Aparecieron así los términos eucariota para definir

organismos con células nucleadas que van desde los protozoos, algas y hongos hasta los

animales y plantas; y procariota para agrupar células sin membrana nuclear, como es el

caso de las bacterias. La dicotomía eucariota-procariota fue utilizada por los taxónomos

como una característica filogenética de primera magnitud.

Aparecieron de esta forma los esquemas de cinco reinos en los que los microorganismos

procariotas constituyeron un grupo taxonómico filogenéticamente independiente. El más

aceptado de todos ellos fue el de Whittaker, que en 1969 propuso un sistema de

clasificación de los seres vivos basado en los dos niveles de organización celular y las

Ramirez - Balqui

57

tres formas principales de nutrición (fotosíntesis, absorción e ingestión) que dieron lugar a

los Reinos Monera (procariotas), Protista (eucariotas unicelulares), Plantae (eucariotas

fotosintéticos), Animalia (eucariotas fagotrofos) y Fungi (eucariotas osmotrofos). En el

esquema de Whittaker los microorganismos quedaron incluidos en los Reinos Monera

(bacterias), Protista (protozoos y microalgas) y Fungi (hongos filamentosos y levaduras).

Hasta este momento se utilizaron características morfológicas y fisiológicas hasta que el

desarrollo de la biología molecular permitió utilizar los constituyentes moleculares como

nuevos criterios clasificatorios.

Así, en 1987, Woese utilizando el 16S rRNA como reloj molecular comprobó que, a través

de la secuenciación de esta molécula, los procariotas quedaban divididos en dos grupos.

El primero de ellos incluye las bacterias más comunes, aisladas en su mayoría del

cuerpo, suelo y agua denominándose eubacterias. El segundo grupo incluye las bacterias

que producen metano (metanógenas), ciertas bacterias del azufre que pueden crecer en

ambientes muy ácidos y calientes (termófilas extremas) y bacterias que viven en

ambientes salinos (halobacterias). Estas bacterias se denominaron arqueobacterias.

En 1990 Carl Woese propuso un nuevo taxón superior a Reino que denominó Dominio

(Dominio → Reino → División → Clase → Orden → Familia → Género → Especie).

Todos los seres vivos se agruparían en 3 dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya. De los

cuales, dos son exclusivamente microbianos y están compuestos únicamente por células

procariotas pertenecientes al Reino Monera (Bacteria y Archaea) y el tercero (Eukarya),

formado por eucariotas, incluiría entre otros los Reinos Protista, Plantae, Animalia y

Fungi.

7.2. CARACTERISTICAS DE LOS MICROORGANISMOS INDUSTRIALES.

Existen una serie de características que comparten todos los microorganismos y que

suponen ciertas ventajas para su uso en la industria. la más fundamental, el pequeño

tamaño de la célula microbiana y su correspondiente alta relación de superficie a

volumen. Esto facilita el rápido transporte de nutrientes al interior de la célula y permite,

por consiguiente, una elevada tasa metabólica. Así, la tasa de producción de proteína en

las levaduras es varios órdenes de magnitud superior que en la planta de soja, que, a su

vez, es 10 veces más alta que en el ganado. Esta velocidad de biosíntesis microbiana

extremadamente alta permite que algunos microorganismos se reproduzcan en tan solo

20 minutos (Escherichia coli). Los ambientes capaces de albergar vida microbiana son

muy variados. Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre

el punto de congelación del agua y el punto de ebullición, en agua salada y dulce, en

presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado ciclos de vida que incluyen

una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes: en forma de esporas

permanecen inactivos durante años hasta que el medio ambiente, más favorable, permita

el desarrollo de las células. Los microorganismos se hallan capacitados para acometer

una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse así a muchas fuentes de

nutrición. Versatilidad que hace posible el que las fermentaciones industriales se basen

en nutrientes baratos.

Un microorganismo de uso industrial debe producir la sustancia de interés; debe estar


58

disponible en cultivo puro; debe ser genéticamente estable y debe crecer en cultivos a

gran escala. Otra característica importante es que el microorganismo industrial crezca

rápidamente y produzca el producto deseado en un corto período de tiempo. El

microorganismo debe también crecer en un relativamente barato medio de cultivo

disponible en grandes cantidades. Además, un microorganismo industrial no debe ser

patógeno para el hombre o para los animales o plantas. Otro requisito importante es la

facilidad de separar las células microbianas del medio de cultivo; la centrifugación es

dificultosa o cara a gran escala. Los microorganismos industriales más favorables para

esto son aquellos de mayor tamaño celular (hongos filamentosos, levaduras y bacterias

filamentosas) ya que estas células sedimentan más fácilmente que las bacterias

unicelulares e incluso son más fáciles de filtrar.

7.3. DIFERENTES TIPOS DE MICROORGANISMOS INDUSTRIALES.

Los microorganismos que sintetizan productos útiles para el hombre representan, como

máximo, unos pocos centenares de especies de entre las más de 100000 descritas en la

Naturaleza. Los pocos que se han encontrado con utilidad industrial son apreciados por

elaborar alguna sustancia que no se puede obtener de manera fácil o barata por otros

métodos.

a). Levaduras

Las levaduras se vienen utilizando desde hace miles de años para la fabricación de

pan y bebidas alcohólicas. La levadura que sin duda fue la primera y aún hoy en día

sigue siendo la más utilizada por el hombre es Saccharomyces cerevisiae de la que

se emplean diferentes cepas para la fabricación de cerveza, vino, sake, pan y

alcoholes industriales. Kluyveromyces fragilis es una especie fermentadora de la

lactosa que se explota en pequeña escala para la producción de alcohol a partir del

suero de la leche. Yarrowia lipolytica es una fuente industrial de ácido cítrico.

Trichosporum cutaneum desempeña un importante papel en los sistemas de

digestión aeróbica de aguas residuales debido a su enorme capacidad de oxidación

de compuestos orgánicos, incluidos algunos que son tóxicos para otras levaduras y

hongos, como los derivados fenólicos.

b). Hongos filamentosos.

Los hongos tienen una gran importancia económica, no tan sólo por su utilidad, sino

también por el daño que pueden causar. Los hongos son responsables de la

degradación de gran parte de la materia orgánica de la Tierra, una actividad

enormemente beneficiosa ya que permite el reciclaje de la materia viva. Por otro

lado, los hongos causan gran cantidad de enfermedades en plantas y animales y

pueden destruir alimentos y materiales de los que depende el hombre.

Los efectos perjudiciales de los hongos están contrarrestados por su utilización

industrial. Los hongos son la base de muchas fermentaciones como la combinación

de soja, habichuelas, arroz y cebada que dan lugar a los alimentos orientales miso,

shoyu y tempeh. Los hongos son también la fuente de muchos enzimas comerciales

(amilasas, proteasas, pectinasas), ácidos orgánicos (cítrico, láctico), antibióticos

Ramirez - Balqui

59

(penicilina), quesos especiales (Camembert, Roquefort) y, evidentemente, de las

setas.

c). Bacterias.

Entre las especies bacterianas de interés industrial están las bacterias del ácido

acético, Gluconobacter y Acetobacter que pueden convertir el etanol en ácido

acético. El género Bacillus es productor de antibióticos (gramicidina, bacitracina,

polimixina), proteasas e insecticidas. Del género Clostridium cabe destacar

Clostridium acetobutylicum que puede fermentar los azúcares originando acetona y

butanol. Las bacterias del ácido láctico incluyen, entre otras, las especies de los

géneros Streptococcus y Lactobacillus que producen yogur. Corynebacterium

glutamicum es una importante fuente industrial de lisina. El olor característico a tierra

mojada se debe a compuestos volátiles (geosmina) producido por Streptomyces

aunque su principal importancia radica en la producción de antibióticos como

anfotericina B, kanamicina, neomicina, estreptomicina, tetraciclina, etc.


60

Ramirez - Balqui

61

CAPITULO III

INTRODUCCION A LA PRACTICA MICROBIOLOGICA

CCoonncceeppttooss bbáássiiccooss..

CCllaasseess ddee nnuuttrriieenntteess..

MMeeddiiooss ddee ccuullttiivvoo..

MMeettaabboolliissmmoo eenneerrggééttiiccoo

CCaappttaacciióónn ddee eenneerrggííaa eenn llaass bbaacctteerriiaass qquuiimmiioottrrooffaass..

CCaappttaacciióónn ddee eenneerrggííaa eenn llaass bbaacctteerriiaass ffoottoottrrooffaass:: FFoottooffoossffoorriillaacciióónn..

OObbtteenncciióónn ddee eenneerrggííaa eenn HHaalloobbaacctteerriiuumm..

EEll ooxxííggeennoo yy eell mmeettaabboolliissmmoo bbaacctteerriiaannoo..


62

Ramirez - Balqui

63

CAPITULO IV

ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO

BACTERIANO

CCoonncceeppttooss bbáássiiccooss..

CCllaasseess ddee nnuuttrriieenntteess..

MMeeddiiooss ddee ccuullttiivvoo..

MMeettaabboolliissmmoo eenneerrggééttiiccoo

CCaappttaacciióónn ddee eenneerrggííaa eenn llaass bbaacctteerriiaass qquuiimmiioottrrooffaass..

CCaappttaacciióónn ddee eenneerrggííaa eenn llaass bbaacctteerriiaass ffoottoottrrooffaass:: FFoottooffoossffoorriillaacciióónn..

OObbtteenncciióónn ddee eenneerrggííaa eenn HHaalloobbaacctteerriiuumm..

EEll ooxxííggeennoo yy eell mmeettaabboolliissmmoo bbaacctteerriiaannoo..


64

Ramirez - Balqui

65

ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO BACTERIANO

I. NUTRICION BACTERIANA. CONCEPTOS BÁSICOS

La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las

sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y

se requieren para dos objetivos:

fines energéticos (reacciones de mantenimiento);

fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo).

Las biosíntesis de nuevos componentes celulares son procesos que requieren energía

procedente del medio ambiente. En el capítulo anterior vimos los principales modos de

captación y obtención de energía existentes en las bacterias.

El estudio de la nutrición microbiana se puede desglosar en varios apartados: así, podemos

considerar los tipos de nutrientes requeridos, los aspectos cuantitativos, e incluso podemos

abordar los aspectos ambientales (en cuyo caso entramos dentro del campo de la

Ecofisiología). Igualmente podemos estudiar la aplicación práctica de la nutrición bacteriana,

que se plasma sobre todo en el diseño de medios de cultivo para manejar los microorganismos

en el laboratorio.

Es importante tener claros desde el principio una serie de conceptos y nomenclaturas

relacionados con los principales tipos de nutrición bacteriana. Puesto que, como acabamos de

ver, la nutrición presenta un aspecto de aprovisionamiento de energía y otro de suministro de

materiales para la síntesis celular, podemos hablar de dos "clasificaciones" de tipos de

nutrición:

Desde el punto de vista de los fines de aprovisionamiento de energía, las bacterias se pueden

dividir en:

litotrofas: son aquellas que sólo requieren sustancias inorgánicas sencillas (SH2 S0, NH3,

NO2-, Fe, etc.).

organotrofas: requieren compuestos orgánicos (hidratos de carbono, hidrocarburos, lípidos,

proteínas, alcoholes...).

Desde el punto de vista biosintético (o sea, para sus necesidades plásticas o de

crecimiento), las bacterias se pueden dividir en:

autotrofas: crecen sintetizando sus materiales a partir de sustancias inorgánicas sencillas.

Ahora bien, habitualmente el concepto de autotrofía se limita a la capacidad de utilizar una

fuente inorgánica de carbono, a saber, el CO2.

heterótrofas: su fuente de carbono es orgánica (si bien otros elementos distintos del C

pueden ser captados en forma inorgánica).


66

Otros conceptos:

autotrofas estrictas son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgánica

como fuente de carbono.

Mixotrofas son aquellas bacterias con metabolismo energético litotrofo (obtienen energía de

compuestos inorgánicos), pero requieren sustancias orgánicas como nutrientes para su

metabolismo biosintético.

Sean autotrofas o heterótrofas, todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos

químicos, que se pueden clasificar (según las cantidades en que son requeridos) como:

macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y

micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...)

En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias

orgánicas y/o inorgánicas. Algunos de los nutrientes serán incorporados para construir

macromoléculas y estructuras celulares; otros solo sirven para la producción de energía, y no

se incorporan directamente como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos

papeles.

El mundo bacteriano, como conjunto, exhibe una gigantesca versatilidad metabólica de uso de

nutrientes: desde autótrofos que obtienen su carbono por reducción del CO2 y los demás

elementos a partir de fuentes igualmente inorgánicas, hasta heterótrofos capaces de usar

amplia gama de fuentes orgánicas de carbono.

A su vez, dentro de los heterótrofos, podemos encontrar muchos tipos de nutrición muy

distintos, desde bacterias metilotrofas que sólo usan metano o metanol como fuente de

carbono y energía, hasta los muy versátiles Pseudomonas, que pueden recurrir a degradar

más de 100 tipos de fuentes de C, incluyendo sustancias tan "exóticas" como hidrocarburos

alifáticos y cíclicos. De cualquier modo, entre los heterótrofos, una de las fuentes más típicas

de carbono consiste en glucosa.

En los heterótrofos-organotrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidación no muy

distinto del material celular -CH2O-) entran simultáneamente a:

metabolismo energético (donde la fuente de C se transforma en CO2, o en CO2 junto con

otras sustancias no totalmente oxidadas);

metabolismo plástico (anabolismo = biosíntesis de nuevo material celular).

Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las

bacterias que pueden nutrirse solamente de sustancias inorgánicas sencillas (H2O, CO2, N2,

NO3--, NH3, SO4

=, fosfatos, etc.) son minoría, pero sus procesos metabólicos son muy

interesantes. De hecho, existen tipos metabólicos que sólo han evolucionado en

procariotas.

Como paradigma de esto citaremos los microorganismos quimioautotrofos (o

quimiolitoautotrofos): obtienen su energía de la oxidación de sustancias inorgánicas

Ramirez - Balqui

67

sencillas, el carbono procede del CO2, y el resto de elementos a partir de sales inorgánicas, por

lo que pueden vivir en soluciones de sales minerales.

Lo habitual, sin embargo, es que muchas bacterias recurran, siempre que puedan, a tomar de los medios ciertos compuestos más complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintéticas.

II. CLASES DE NUTRIENTES

Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías:

universales: agua, CO2, fosfatos y sales minerales;

particulares;

factores de crecimiento.

2.1. NUTRIENTES UNIVERSALES.

El agua

Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se

pueden considerar como organismos acuáticos. Requieren cierto grado de humedad para

crecer. Desde el punto de vista de sus posibles papeles, el agua es:

el principal constituyente del protoplasto bacteriano;

el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas;

un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones

bioquímicas).

Las fuentes de agua pueden ser:

endógena: procedente de procesos de oxido-reducción;

exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las

membranas.

Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria:

Existen determinadas sustancias y superficies que absorben y adsorben

(respectivamente), de modo más o menos intenso, moléculas de agua, dejándolas

inasequibles a la bacteria.

Los solutos disueltos en agua (p. ej., sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas

de H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del

microorganismo.

La disponibilidad de agua se mide por un parámetro llamado actividad de agua o

potencial de agua, indicativo del agua libre, y que se expresa como

w

sw

P

P a

Donde PS es la presión parcial de vapor de agua en la solución problema y PW es la

presión parcial de vapor del agua destilada.

¿Cómo medir el potencial de agua de un medio líquido determinado? Se mide la

humedad relativa del aire que hay encima del medio (en frascos), y este valor se refiere al


68

valor de 100, que es la humedad del aire encima del agua destilada. O sea, la aW =

humedad relativa/100).

Las bacterias tienen valores de aW normalmente entre 0.90 y 0.99.

Bacterias de hábitats oligotróficos (como Caulobacter, Spirillum) tienen aW cercanos a

1.

Bacterias como Escherichia y Streptococcus, que viven en sangre y fluidos corporales,

tienen aW de alrededor de 0.995.

Bacterias marinas como ciertos Vibrio y Pseudomonas encuentran valores de 0.980.

Ciertos bacilos Gram-positivos que resisten mejor la sequedad poseen valores de

0.950.

En el extremo de resistencia encontramos ciertas bacterias xerófilas, capaces de vivir

a aW muy bajos (en torno a 0.75). Muchas de estas bacterias viven de hecho en

medios acuosos, pero donde gran parte del agua no está disponible por las razones

arriba citadas:

bacterias halófilas extremas, como la arqueobacteria Halobacterium, que habita

lagunas hipersalinas;

bacterias (y sobre todo, ciertos microorganismos eucarióticos como levaduras)

sacarófilos, que viven en jugos y zumos con altas concentraciones de azúcares

El CO2

El anhídrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias:

Las autotrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente

de energía la luz (en el caso de las fotoautotrofas) u oxidaciones de determinadas

sustancias inorgánicas (los quimioautolitotrofos).

Las arqueobacterias metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los

electrones procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía:

CO2 + 4H2 → CH4 + 2H2O (D G'0<0)

Los heterótrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de

electrones, necesitan pequeñas cantidades para las carboxilaciones en determinadas

rutas anabólicas y catabólicas.

El origen del CO2 puede ser:

endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente

orgánica de carbono;

exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas.

Normalmente, las bacterias crecen a la concentración de CO2 atmosférico (0.03%), pero

algunas bacterias (Neisseria, Brucella), cuando se aíslan por primera vez, requieren

atmósferas enriquecidas, con 5-10% de CO2. Ello parece deberse a que poseen alguna

enzima con baja afinidad hacia el carbónico; sin embargo, tras varios subcultivos, suelen

adaptarse a crecer a tensiones normales.

Ramirez - Balqui

69

Fósforo

Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánico o inorgánico. Las bacterias que

pueden usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen

absolutamente de ellos, ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los

fosfatos orgánicos son hidrolizados por fosfatasas extracelulares o (en las Gram-

negativas) periplásmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina).

El fósforo se usa principalmente para la síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos,

pero aparece también en coenzimas y en proteínas.

Sales minerales

Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl--) y de cationes para la célula.

Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente

grandes: K+, Mg

++, Ca

++, Fe

++.

El ión potasio (K+):

interviene en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan

en la síntesis de proteínas.

En Gram-positivas está asociado con los ácidos teicoicos de la pared.

El ión magnesio (Mg++

):

estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos;

como cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican transferencia de

grupos fosfato. Por ejemplo, en las reacciones que requieren ATP, el Mg++

puede unir

la enzima al sustrato durante el mecanismo de acción de la primera.

Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas.

El ión calcio (Ca++

):

es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas.

El hierro (principalmente como ión ferroso, Fe++

) suele estar acomplejado en la

naturaleza, formando sales insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas,

denominadas sideróforos, capaces de captar ese hierro (p.ej., hidroxamtas y

enterobactina). El hierro

participa en muchas moléculas implicadas en procesos de respiración, como

citocromos y ferroproteínas no hémicas (proteínas con Fe-S);

interviene como cofactor en ciertas enzimas.

Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las

bacterias necesitan minúsculas cantidades de otros elementos (oligoelementos), a los

que también se denomina como micronutrientes o elementos traza.

El manganeso (Mn++

) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir al

Mg++

.

El cobalto (Co++

) se requiere casi exclusivamente para la vitamina B12 (de hecho, si

suministramos esta vitamina al medio, la bacteria se vuelve independiente del Co++

libre).


70

El zinc interviene en la estabilización de complejos enzimáticos como las ADN- y ARN-

polimerasas.

El molibdeno participa en las llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas en la

asimilación de nitratos. Por otro lado, participa como cofactor, junto con el Fe, en el

complejo nitrogenasa de las bacterias fijadoras de N2 atmosférico.

El níquel participa en hidrogenasas, enzimas que captan o liberan H2.

2.2. NUTRIENTES PARTICULARES.

Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto, dependiendo del

tipo de bacteria que consideremos. Concretamente, los elementos N y S (que requieren

todos los seres vivos) pueden ser captados por las bacterias de modos muy distintos,

dependiendo de sus capacidades biosintéticas. Tanto el N como el S se encuentran en la célula en estado reducido:

el radical -NH2 forma parte de los aminoácidos (que a su vez son los sillares de las

proteínas) y de las bases nitrogenadas (que participan en los ácidos nucleicos y en

algunas coenzimas);

el radical -SH interviene en determinados aminoácidos y en coenzimas como la CoA. ¿En qué formas químicas entran N y S a las bacterias?

La mayoría de bacterias fotosintéticas y muchas heterótrofas asimilan estos elementos en

forma combinada inorgánica oxidada:

como NO3--, merced a la actuación secuencial de nitrato-reductasas y nitrito-

reductasas asimilatorias.

como SO4=. Este sulfato se activa con ATP, y luego se reduce hasta sulfito y

finalmente sulfhídrico, que ya tiene el estado de reducción adecuado para la

incorporación del S.

Muchas bacterias heterótrofas pueden usar alguna forma reducida:

de N inorgánico: amonio (NH4+)

de S inorgánico: sulfuros (S=, SH

-)

de N orgánico: aminoácidos, péptidos

de S orgánico: cisteína.

Muchas de las bacterias que pueden usar amonio como única fuente de nitrógeno

también pueden usar nitratos.

2.2.1. FIJACIÓN DE NITRÓGENO.

La atmósfera contiene enormes cantidades de nitrógeno no combinado (libre) en

estado gaseoso: el nitrógeno molecular o dinitrógeno (N2), que procede de

microorganismos desnitrificantes. Sin embargo, esta gran reserva sólo puede

servir de fuente de nitrógeno a ciertos procariotas, las llamadas bacterias

fijadoras de nitrógeno o diazotrofos. Esta notable capacidad bioquímica no ha

evolucionado en eucariotas. (Lo más a que ha llegado la evolución es a

seleccionar ciertos tipos de asociaciones simbióticas entre procariotas diazotrofos

y ciertos eucariotas).

Ramirez - Balqui

71

La fijación del N2 es un proceso de reducción que convierte el nitrógeno molecular

en amoniaco, según la siguiente ecuación:

N2 + 8H+ + 8e + 18 ATP → 2NH3 + H2 + 18 (ADP + Pi)

Esta reacción está catalizada por un complejo enzimático denominado

nitrogenasa o dinitrogenasa, que consta de dos componentes:

Componente I o nitrogenasa propiamente dicha; posee un cofactor de hierro y

molibdeno (FeMoCo) que forma parte del centro activo. Por ello, a este

componente también se le conoce como molibdoferroproteína. (En realidad

existen dos copias del cofactor, cuya estequiometría es MoFe7S9-homocitrato)

Componente II o nitrogenasa-reductasa, que posee átomos de Fe

acomplejados con S de determinadas cisteínas (por lo que este componente se

denomina a veces ferroproteína).

Dos cosas llaman la atención de la ecuación anterior:

Obsérvese que la reacción requiere un gran aporte de energía en forma de al

menos 18 ATP (en ocasiones puede llegar a 24 ATP). Ello se debe a que el

dinitrógeno (N = N) es una molécula extremadamente inerte (su energía de

disociación es de 940 kJ), y su reducción precisa una gran energía de

activación para transferirle 6 electrones.

Parte de la actividad nitrogenasa (así como ATP y electrones) "se pierden" en

reducir dos iones H+ hasta H2. Se desconoce la razón de este "despilfarro",

pero se sabe que es un efecto intrínseco de este complejo enzimático. Los electrones para la reducción llegan al complejo por medio de una ferredoxina,

que los transfiere al componente II, que queda reducido al tiempo que por cada

dos electrones transferidos se hidroliza una molécula de ATP. La nitrogenasa-

reductasa reducida se asocia entonces con la nitrogenasa (componente I), y le

transfiere los electrones. Una vez reducida la molibdoferroproteína, ésta transfiere

los electrones (y los protones) al N2, hasta convertirlo en dos moléculas de

amoniaco. (El centro activo es FeMoCo). Un aspecto muy importante del complejo nitrogenasa es su extrema sensibilidad

al oxígeno, de modo que queda rápida e irreversiblemente inactivado por este

gas. Ahora bien, esto no significa que la capacidad de diazotrofía esté relegada a

bacterias anaerobias, ya que, como veremos en la sección de taxonomía, la

evolución ha "inventado" distintas estrategias para proteger a la nitrogenasa en

fijadores aerobios. Debido a lo "caro" que resulta fijar nitrógeno, no es extraño comprobar que este

proceso esté regulado de forma muy estricta ante la presencia en el medio de

fuentes combinadas de nitrógeno (nitratos, amonio, aminoácidos):

la actividad nitrogenasa se ve inhibida ante la presencia de N combinado;

ante N combinado, se reprime la transcripción de los genes codificadores

de la nitrogenasa y demás funciones relacionadas (genes nif). La nitrogenasa es una enzima relativamente "inespecífica", ya que puede reducir

otras pequeñas moléculas provistas de triples enlaces, como cianuros (N = C-) y


72

acetileno (HC = CH). La reducción de acetileno a etileno sirve de base al método

más usual de medir la actividad nitrogenasa, el llamado ensayo de reducción del

acetileno, que se registra mediante aparatos de cromatografía gaseosa.

2.3. FACTORES DE CRECIMIENTO.

Los factores de crecimiento son moléculas orgánicas específicas que, en muy pequeña

cantidad, algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función

plástica (no son sillares de macromoléculas) ni sirven como fuente de energía. Suelen ser

coenzimas o sus precursores, vitaminas, que determinadas bacterias no pueden fabricar

por sí mismas, al carecer de parte o toda de una ruta biosintética.

Ejemplos:

las bacterias del género Brucella requieren como factores de crecimiento en sus

medios de cultivo la biotina, niacina, tiamina y ácido pantoténico.

Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridín-nucleótidos.

En la siguiente tabla se muestran algunas de las vitaminas y cofactores requeridos por

algunas bacterias:

Factor o vitamina Funciones principales

p-aminobenzoico (PABA) Precursor del ácido fólico

Acido fólico Metabolismo de compuestos C1,

transferencia de grupos metilo.

Biotina Biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2

Cobalamina (vitamina B12) Reducción y transferencia de compuestos

C1; síntesis de desoxirribosa

Niacina (ácido nicotínico) Precursor del NAD; transferencia de

electrones en reacciones redox

Riboflavina Precursor de FAD y FMN

Ácido pantoténico Precursor de la CoA

Tiamina (vitamina B1) Descarboxilaciones; transcetolasas.

Complejo B6 (piridoxal,

piridoxamina)

Transformaciones de aminoácidos y

cetoácidos

Grupo Vitamina K,

quinonas

Transportadores de electrones (ubiquinonas,

menaquinonas, etc.)

I. MEDIOS DE CULTIVO

El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el

laboratorio. Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos

requerimientos de macro- y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que

cada nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la

cantidad relativa de cada nutriente. Los microbiólogos, en su trabajo cotidiano, están

acostumbrados a manejar multitud de "recetas" o fórmulas correspondientes a muchos tipos de

medios de cultivo.

Ramirez - Balqui

73

Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide

en estado de gel) en la que están presentes todas las sustancias necesarias para el

crecimiento de un(os) determinado(s) microorganismo(s). Los medios de cultivo se pueden

clasificar, en primera instancia, en tres grandes tipos:

1). Medios complejos o indefinidos: su composición química exacta se desconoce, ya que

son el producto de realizar infusiones y extractos de materiales naturales complejos:

Ejemplos:

Digeridos crudos de extracto de carne

Digeridos de extracto de levadura

Digeridos de peptona de carne o de soja

Digeridos de caseína (de la leche).

Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido

químicamente. Si lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento

bacteriano, este tipo de medios es ideal, ya que su confección es fácil y rápida (basta

pesar una cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por casas comerciales,

disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e incubar la bacteria con la

que queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N orgánicos,

sales minerales y micronutrientes. Sin embargo, con ellos no podemos tener un control

nutricional preciso, ya que desconocemos la composición química y proporción exacta de

los distintos nutrientes.

2). Medios sintéticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades

concretas de distintas sustancias químicas puras, orgánicas y/o inorgánicas. La

composición concreta de un medio sintético dependerá de la bacteria que queramos

cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria con grandes capacidades

biosintéticas será más sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores

posibilidades biosintéticas.

3). En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio "mezcla" de los anteriores,

denominado medio semisintético: llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y

cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas.

Cualquiera que sea el tipo de medio, de los tres que acabamos de citar, podemos

elaborar dos tipos de "versiones", según su estado aparente:

medios líquidos (por ejemplo, los dos de la tabla)

medios sólidos: derivan de los líquidos simplemente añadiendo a la solución nutritiva

un coloide en estado de gel, que solidifica (da consistencia) a esta solución.

En los primeros tiempos de la Bacteriología sólo se conocía como sustancia gelificante

incorporable a los medios la gelatina. Sin embargo, presenta muchos inconvenientes, ya

que funde a 25oC (por encima de esta temperatura el medio se licúa), y además, muchas

bacterias presentan gelatinasas que hidrolizan la gelatina.


74

El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de algas rojas (p. ej. Gelidium), del

cual existen versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas

en el polisacárido agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto

de evitar la introducción de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las

interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria).

El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los

100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias, que son mesófilas.

Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautotrofos) se suele recurrir a un

gelificante inorgánico, el silicagel o gel de sílice.

Finalmente, introduciremos otra serie de conceptos relativos a medios de cultivo, que al

igual que los anteriores, serán tratados con la suficiente amplitud en las sesiones de

clases prácticas:

Medios selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de

microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos sólidos que

incorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero

permiten el crecimiento de otras. (P. ej. medios que llevan violeta cristal inhiben el

crecimiento de bacterias Gram-positivas.

Medios diferenciales son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos

de bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del

medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color de

una sustancia indicadora presente en el medio.

Ejemplos:

en el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias

producen cambios de color y precipitación de sales cuando producen ácidos por

fermentación de ciertas fuentes de carbono.

El medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual

revela la capacidad (y el tipo) de hemolisis de ciertas bacterias.

Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales.

P. ej., el agar de MacConkey, que el alumno manejará en la segunda tanda de prácticas.

Se trata de un medio de color rosado y transparente, que posee, entre otras sustancias,

lactosa, peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal.

Este medio es selectivo contra muchas bacterias Gram-positivas debido al violeta cristal,

y también contraselecciona muchas Gram-negativas debido a las sales biliares (que son

agentes tensioactivos que desorganizan muchas membranas externas). En cambio, las

Enterobacterias están evolutivamente adaptadas a soportar sales biliares en su hábitat

natural (el intestino de vertebrados superiores), y pueden crecer en este medio.

Ramirez - Balqui

75

En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de

Enterobacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción de ácidos.

Las bacterias fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio gran cantidad de ácidos

orgánicos, lo que provoca que sus colonias, y sus alrededores aparezcan de color rojo

intenso, debido al viraje del rojo neutro; además, se forma un halo turbio a cierta distancia

de estas colonias, fenómeno ocasionado por la precipitación de las sales biliares inducida

por la acidez. En cambio, las bacterias Lac-, al no poder usar la lactosa, recurren como

fuente de C a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto carbonado,

excretando iones NH4+, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el

indicador rojo neutro vira a amarillo.

II. METABOLISMO ENERGÉTICO.

El metabolismo es el conjunto de reacciones bioquímicas que permiten el crecimiento de un

organismo (por lo tanto, en bacterias, que conduce a la creación de nuevas células). El

metabolismo de la célula comprende dos grandes tipos de reacciones:

1. reacciones de mantenimiento, que suministran

a. energía

b. poder reductor

c. precursores metabólicos

2. reacciones del anabolismo (biosíntesis), que usan energía y poder reductor procedente de

las reacciones de mantenimiento.

Las bacterias requieren aporte continuo y de acceso inmediato de energía, que es usada en

procesos de:

biosíntesis (anabolismo)

transporte activo

translocación de proteínas a través de la membrana citoplásmica

movimiento flagelar

bioluminiscencia

En bacterias, al igual que en eucariotas, la conservación intracelular de energía ocurre

principalmente por medio de la síntesis de ATP:

ADP3-

+ H+ + PO4H

2- → ATP

4- + H2O

La hidrólisis de ATP hasta ADP y P genera una variación de energía libre ∆Go'= -31 kJ (-7,3

kcal). La síntesis de ATP a partir de ADP y P requiere una ∆Go' de +31 kJ. Los métodos

usados por las bacterias para generar este ATP son principalmente:

fosforilación a nivel de sustrato;

fosforilación oxidativa;

fotofosforilación (durante la fotosíntesis).

Cada uno de estos procesos implica uno o varios pasos de reacciones redox exergónicas,

pero la manera en que esas reacciones exergónicas se acoplan a la síntesis de ATP varía

entre la fosforilación a nivel de sustrato y las otras dos.

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/07_Micro.html



http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/15_Micro.html#ferment

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/15_Micro.html#resp

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/15_Micro.html#fototr


76

En esta reacción se libera energía libre, cuyo valor viene expresado por la fórmula:

∆G0'= - n · F · ∆E0'

n = nº de electrones transferidos

F = constante de Faraday = 96,6 kJ·volt-1

·equivalentes--1

∆E0' es la diferencia entre los potenciales de reducción del donador (pareja D/DH2) y del

aceptor (pareja A/AH2).

Una reacción redox exergónica de este tipo se puede acoplar a la consecución de trabajo útil:

formación de un compuesto rico en energía;

formación de un gradiente de concentración y/o de carga eléctrica a ambos lados de una

membrana.

Ambos tipos de trabajo se pueden usar en la síntesis de ATP.

Por lo tanto, los seres vivos, para poder obtener su moneda energética (principalmente ATP),

han de captar alguna fuente de energía externa, del medio ambiente. Veamos, pues, cuáles

son los tipos de energía que captan las bacterias y los correspondientes tipos de

metabolismos energéticos:

1. Si la energía procede de radiaciones (en los cuantos de una determinada longitud de onda

de la luz visible): bacterias fototrofas, que a su vez pueden ser:

a. fotolitotrofas: captan energía lumínica en presencia de sustancias inorgánicas;

b. fotoorganotrofas: captan energía lumínica con requerimiento de sustancias orgánicas.

2. Si la energía se desprende a partir de moléculas químicas en reacciones biológicas de

óxido-reducción: bacterias quimiotrofas, que a su vez pueden ser:

a. quimiolitotrofas: captación de energía química a partir de sustancias inorgánicas;

b. quimiorganotrofas: captación de energía química a partir de sustancias orgánicas.

Veamos ahora lo que diferencia a grandes rasgos a la fosforilación a nivel de sustrato respecto

de la fosforilación oxidativa y la fotofosforilación:

A) La fosforilación a nivel de sustrato es un sistema usado por ciertas bacterias

quimiorganotrofas. El sustrato orgánico (donador de electrones) es oxidado por un

coenzima (p. ej., NAD+), de manera que se origina un intermediario no fosforilado con una

gran energía de hidrólisis. Dicho intermediario experimenta una sustitución con un fosfato,

para dar la correspondiente forma acil-fosfato (siendo este enlace de alta energía).

Finalmente, este acil-fosfato dona su fosfato de alta energía al ADP, que pasa a ATP.

Las fosforilaciones a nivel de sustrato se caracterizan por lo siguiente:

son procesos escalares (es decir, no influye su situación espacial dentro de la célula);

son series de reacciones bioquímicas en las que la transferencia de un grupo químico

(ej., el fosfato) se cataliza por enzimas solubles (en el citoplasma);

existen intermediarios metabólicos (antes de llegar al ATP) en los que el fosfato está

unido covalentemente.

Ramirez - Balqui

77

B) En cambio, tanto la fosforilación oxidativa como la fotofosforilación son procesos

caracterizados por:

ser vectoriales (orientados en el espacio);

estar ligados a membrana;

implicar una secuencia ordenada de transportadores de electrones que sufren

oxidaciones y reducciones reversibles (cadena transportadora de electrones, c.t.e.).

no hay intermediarios covalentes ricos en energía, sino que la transferencia de energía

se realiza por medio de un gradiente electroquímico de protones (y, en algunos

casos, de cationes). Este gradiente de protones se puede emplear a su vez para:

o síntesis de ATP,

o transporte de nutrientes,

o translocación de proteínas fuera del protoplasto,

o movimiento flagelar.

III. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS BACTERIAS QUIMIOTROFAS.

En los organismos quimiotrofos, la captación de energía consiste esencialmente en la

oxidación de un sustrato reducido (orgánico en quimiorganotrofos e inorgánico en

quimiolitotrofos) con una reducción concomitante de un aceptor de electrones (que a su vez

puede ser orgánico o inorgánico), y todo ello acoplado a un sistema de fosforilación del ADP,

que se convierte en ATP.

3.1. FOSFORILACIÓN A NIVEL DE SUSTRATO. FERMENTACIONES.

Recordemos aquí lo dicho anteriormente: La fosforilación a nivel de sustrato es un

sistema usado por ciertas bacterias quimiorganotrofas. El sustrato orgánico (donador de

electrones) es oxidado por un coenzima (p. ej., NAD+), de manera que se origina un

intermediario no fosforilado con una gran energía de hidrólisis. Dicho intermediario

experimenta una sustitución con un fosfato, para dar la correspondiente forma acil-fosfato

(siendo este enlace de alta energía). Finalmente, este acil-fosfato dona su fosfato de alta

energía al ADP, que pasa a ATP.

gliceraldehido-3-P → 1,3-difosfoglicérico → 3-fosfoglicérico

La fosforilación a nivel de sustrato está acoplada a un proceso metabólico denominado

fermentación. Durante la fermentación, el sustrato orgánico reducido (DH2) es

catabolizado, de modo que como acabamos de ver, se produce ATP. Este catabolismo

genera, además:

equivalentes de reducción (en forma de NADH y otros cofactores reducidos), e

intermediarios oxidados de la ruta catabólica.

Pues bien, es característico de las fermentaciones que los equivalentes de reducción

reaccionen con uno de esos intermediarios (A), que de este modo se reduce a AH2

(producto de la fermentación), regenerándose el cofactor en forma oxidada (NAD+)

para el siguiente ciclo.


78

El rendimiento de las fermentaciones, expresado como variación de energía libre, es

bajo. En la fermentación homoláctica se producen 2 moles de ATP por cada mol de

glucosa consumido (frente a los 28 moles de ATP/mol de glucosa en la respiración

aerobia). Esto significa que para que el microorganismo crezca en estas condiciones,

degrada grandes cantidades de sustrato fermentable.

Las fermentaciones se dan en determinados microorganismos quimiorganotrofos, que

pueden ser anaerobios obligados o anaerobios facultativos (cuando crecen en ausencia

de O2).

Hay una gran variedad de fermentaciones microbianas, y cada tipo libera uno o varios

productos de fermentación característicos. Algunos ejemplos:

Fermentación láctica Lactato

Fermentación alcohólica etanol, CO2

Fermentación ácida-mixta etanol, succinato, acetato, formiato,

lactato, CO2, H2

Fermentación butilénglicólica butilénglicol, CO2

Fermentación aceto-butírica acetato, acetona, butirato, butanol,

etanol, CO2, H2

3.2. FOSFORILACIÓN OXIDATIVA. RESPIRACIONES.

Respiración es la obtención de energía por oxidación de sustratos orgánicos (en

quimiorganotrofas) o inorgánicos (quimiolitotrofas), pero los coenzimas reducidos (ej.,

NADH) transfieren los electrones a un aceptor final oxidado, no directamente (como en la

fermentación), sino a través de una cadena transportadora de electrones.

Si el aceptor final es el O2, hablamos de respiración aerobia;

Si el aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.), respiración anaerobia.

En ambos casos, la transferencia se da ordenadamente, en la dirección de mayor

potencial redox positivo, con la consiguiente liberación de energía libre. Como veremos

enseguida, esta energía libre se va a traducir en un potencial electroquímico de protones,

cuya disipación a través de ATP-asas de membrana origina ATP, conociéndose este

proceso como fosforilación oxidativa.

Esquema y balance de la fosforilación oxidativa

Como el alumno seguramente sabrá, el mecanismo de la fosforilación oxidativa se suele

explicar en base a la teoría quimiosmótica de Mitchell (1961 y años siguientes).

Recordemos que la c.t.e. está formada por una serie ordenada de moléculas

transportadoras situadas (en bacterias) en la membrana citoplásmica (y en sus

invaginaciones), moléculas que sufren oxidaciones y reducciones reversibles:

DH2 + A → AH2 + D

Ramirez - Balqui

79

El alumno conocerá por la asignatura de Bioquímica los principales tipos de componentes

de las c.t.e. respiratorias

flavoproteínas (Fp), dotadas de grupos FAD o FMN

proteínas no hémicas de Fe-S

quinonas:

o ubiquinona (UQ)

o menaquinona (MQ), más frecuente en bacterias Gram-positivas.

citocromos (proteínas hémicas con Fe quelado).

Observar que algunos de estos transportadores transportan átomos de H (o sea,

protones y electrones), mientras que otros transportan únicamente electrones.

La situación de los transportadores dentro de la membrana es asimétrica, lo que

condiciona que el transporte sea un proceso vectorial (es decir, tiene un sentido

determinado), de modo que los H salen hacia afuera y los electrones tienden a entrar al

interior.

Como resultado de todo ello, tenemos que existen determinados puntos de la c.t.e.

(llamados bucles o lazos translocadores de protones) en los que el efecto neto es la

salida de protones al exterior de la membrana citoplásmica (concretamente, en los puntos

donde confluyen un transportador de H y otro de electrones). Es decir, existe una

translocación de protones hacia el exterior ligada a las reacciones redox que ocurren en

la c.t.e.

Por otro lado, la membrana es impermeable a los protones, por lo que los protones

translocados a resultas del funcionamiento de las c.t.e. no pueden entrar directamente.

Por lo tanto, se crea un gradiente electroquímico de protones, compuesto de gradiente

osmótico de esos iones H+ (∆pH) y un gradiente de carga eléctrica (∆). Este gradiente

es una forma de energía potencial que puede realizar trabajo.

El valor de este gradiente electroquímico de protones o fuerza protón motriz (f.p.m.) es:

∆p = ∆ –Z · ∆H (expresado en milivoltios, mV),

Donde Z = 2,3 R · T/F, siendo R = constante de los gases, T = temperatura absoluta, F =

constante de Faraday

Como ya dijimos, esta ∆p (f.p.m.) es capaz de realizar trabajo, bajo la forma de:

transporte activo

alimentar el motor flagelar

síntesis de ATP.

Veamos, pues, cómo se produce esta síntesis de ATP a partir del gradiente de

protones:

La síntesis de ATP ocurre gracias al complejo ATP-asa, funcionando como ATP-

sintetasa. Este complejo consta de varios polipéptidos que conforman dos porciones:


80

la hidrofóbica BF0, inserta en la membrana citoplásmica, y la BF1 a modo de tallo que

se proyecta hacia el interior celular.

La porción BF0 forma un canal a través de la membrana, por donde pueden pasar H+

desde el exterior al interior, y agua desde dentro hacia afuera.

La porción BF1 es la parte enzimáticamente activa del complejo.

Esencialmente, el mecanismo consiste en que la disipación del gradiente de protones a

través de BF0 suministra la energía para la síntesis de ATP por parte de la BF1. La

reacción se puede expresar así:

2H+ (ext) + ADP (int) + P (int) → 2H

+ (int) + ATP (int) + H2O (ext)

El balance final del funcionamiento de la c.t.e. es:

DH2(int) + A(int) + ADP(int) + P(int) → D(int) + AH2 + ATP(int) + H2O (ext)

El esquema anterior hace referencia al funcionamiento de una cadena transportadora con

un solo bucle translocador de protones. Pero en la realidad las c.t.e. suelen poseer más

de uno de estos bucles.

Véase en la Fig. la c.t.e. de Paracoccus, una bacteria que posee un sistema similar al

de las mitocondrias, donde se observan 3 sitios donde termodinámicamente la

variación de energía libre es suficiente para apoyar la síntesis de una molécula de

ATP.

Véase también la c.t.e. de E. coli, cuando usa el O2 como aceptor final de electrones.

En esta cadena podemos constatar algo relativamente frecuente en las cadenas

bacterianas:

En los quimiolitotrofos, la c.t.e. respiratoria funciona en los dos sentidos:

en su sentido "normal", ya estudiado. Un donador inorgánico de electrones cede

electrones, que llegan a la c.t.e., que crea un gradiente de protones, cuya disipación a

través de ATP-asa genera ATP;

pero estas bacterias necesitan equivalentes de reducción (NADPH) para reducir el

CO2 (su fuente exclusiva de C) hasta material orgánico celular [CH2O]. Este NADPH lo

logran merced a un flujo invertido de electrones a través de la c.t.e., usando para

ello como energía parte del potencial de protones generado por el flujo normal.

Cadenas de electrones ramificadas:

Muchas cadenas respiratorias aerobias muestran ramificaciones alternativas, sobre todo

a nivel de los citocromos terminales. El papel principal de estas ramificaciones es lograr

flexibilidad en la ruta de transferencia de electrones, de manera que se obtengan

rendimientos máximos en ciertos sustratos y condiciones de crecimiento, y para

minimizar los efectos nocivos de otros.

Por ejemplo, cuando Azotobacter (fijador aerobio de N2) crece fijando nitrógeno, usa

una ramificación que gasta muchísimo oxígeno como aceptor final (aunque el

Ramirez - Balqui

81

rendimiento en ATP es menor); con ello logra evitar que entre oxígeno al citoplasma,

con lo que protege a la nitrogenasa de la inactivación por oxígeno.

Mecanismo de la ATP-sintasa dependiente de protones

En los años recientes se está avanzando en el mecanismo de la ATP-sintasa (con

concesión de premio Nobel de Química 1997 a tres biólogos que han contribuido en este

aspecto):

F0 es un complejo integral de membrana, que transloca los protones. Está compuesto

de {a, b2, c10}. F1 constituye la porción intracitoplasmática, dotada de los sitios

catalíticos. Su composición se puede expresar como {3, 3, , , ). Ambas porciones

están unidas entre sí por enlaces iónicos e hidrófobos.

Al parecer, la translocación de unos 4 protones a través de F0 está acoplada, por

medio de grandes cambios conformacionales, a la síntesis de una molécula de ATP en

las subunidades de la F1, por un notable mecanismo de catálisis rotacional:

El que los 4 protones entren por F0 parece que induce un cambio conformacional en la

subunidad de F1, que a su vez obliga a girar al F1, con una síntesis de ATP.

Las ATP-asas de membrana pueden funcionar también en sentido inverso al de síntesis,

es decir, como ATP-hidrolasas: se produce hidrólisis de ATP y extrusión de protones al

exterior. Por lo tanto, en este sentido de funcionamiento, se genera un gradiente de

protones a expensas de gasto de ATP intracelular. Esto muestra una vez más que el ATP

y el gradiente de protones se pueden considerar como formas diferentes e

interconvertibles de energía celular.

Las ATP-asas productoras de gradientes de protones existen en bacterias no

respiratorias, que carecen de c.t.e., como por ejemplo, las bacterias anaerobias del ácido

láctico. Estas bacterias obtienen su ATP por fosforilación a nivel de sustrato, en sus

procesos de fermentación, y a su vez, parte del ATP lo convierten, por las ATP-asas

hidrolíticas, en una fuerza protón-motriz que se usa para transporte de nutrientes y para

alimentar al motor flagelar.

Respiraciones anaeróbicas

Como ya hemos dicho, en algunas bacterias, al final de la c.t.e. puede existir un aceptor

diferente del oxígeno (respiración anaerobia). Los aceptores y sus respectivos productos

reducidos (A → AH2) son:

NO3-- → N2

SO42-

→ SH2

fumarato → succinato

CO2 → CH4

Fe3+

→ Fe2+

Con estos aceptores se obtiene menos energía que con el oxígeno, porque la pareja

O2/H2O es más oxidante que las otras.

El uso de nitratos, sulfatos y CO2 como aceptores finales de electrones (y no como

material a incorporar al metabolismo plástico) se denomina metabolismo disimilativo (o


82

desasimilativo). Para distinguirlo del asimilativo. El producto reducido se excreta al

ambiente de la bacteria.

El uso disimilativo de nitrato se llama desnitrificación, y ocurre por medio de una serie

de fases donde el N va cambiando su estado de oxidación:

NO3-- → NO2

- (nitrito) → NO (óxido nítrico) → N2O (óx. nitroso) → N2 (dinitrógeno)

Hasta la llegada de las actividades industriales humanas, todo el dinitrógeno de la

atmósfera procedía de estos procesos desnitrificantes.

El uso de sulfato como aceptor de electrones sólo lo hacen las bacterias

sulfatorredutoras, por una ruta especial en la que el sulfato primero tiene que activarse

con ATP (formando la adenosina-fosfo-sulfato, APS). La mayoría son quimiorganotrofos,

pero algunos pueden usar H2 donador de electrones (quimiolitotrofos).

Las arqueobacterias metanogénicas son los únicos seres vivos capaces de obtener

energía acoplando la oxidación del hidrógeno molecular con el uso de CO2 como aceptor

de electrones (actuando en estas condiciones como quimiolitotrofos):

4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O

Tipos de quimiolitotrofos

Insistamos en el hecho de que la capacidad de obtener energía por fosforilación oxidativa

a partir de donadores inorgánicos de electrones sólo ha evolucionado en ciertos grupos

de procariotas. Cada grupo fisiológico usa un tipo de donador inorgánico:

bacterias de hidrógeno (H2)

bacterias del hierro (Fe2+

)

bacterias del azufre (S2-

, S0).

bacterias nitrificantes, con dos subtipos diferentes: las oxidadoras de amoniaco

(llamadas nitrosas) y las oxidadoras del nitrito (llamadas nítricas).

En general, el mecanismo de generación de ATP es similar al de quimioorganotrofas

respiradoras. Los electrones extraídos del donador exógeno (en este caso inorgánico)

pasan a una cadena transportadora de electrones hasta un aceptor final, que suele ser el

oxígeno.

Pero a excepción del H2, los demás donadores inorgánicos de electrones tienen un

potencial de oxidación E0' menor que el del NADH, por lo que la oxidación de estos

donadores inorgánicos sólo puede generar energía, pero no poder reductor de modo

directo. Para obtener poder reductor emplean transporte inverso de electrones: parte del

gradiente electroquímico creado se emplea en hacer que electrones viajen por la c.t.e. (o

una parte de ella) en sentido inverso, para poder reducir el NAD.

Ramirez - Balqui

83

IV. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN LAS BACTERIAS FOTOTROFAS: FOTOFOSFORILACIÓN

Los organismos fotosintéticos usan energía de la luz para convertir el CO2 en material celular,

según la fórmula general:

2 H2A + CO2 (hv) luz de energía [CH2O] + H2O + 2 A

En Oxifotobacterias, algas y plantas verdes, H2A = H2O, como agente reductor. Por lo tanto,

al oxidarse se genera O2.

En Anoxifotobacterias el reductor exógeno ("H2A") puede ser H2, S=, S2O3

-, etc.

Tenemos, pues, dos modalidades de fotosíntesis, la oxigénica y la anoxigénica. Como

veremos, en ambas pueden existir dos versiones de un mecanismo de obtención de energía a

partir de la luz visible: fotofosforilación cíclica y acíclica.

En la fotofosforilación cíclica (FFC) no existe aporte de un agente reductor externo ni de

agente oxidante externo.

Su única función es transformar la energía de la luz en un gradiente de protones (f.p.m.),

que a su vez puede convertirse en ATP.

No se originan equivalentes de reducción (NADPH), y por lo tanto, no hay fijación de CO2.

En cambio, en la fotofosforilación acíclica (FFA) un donador exógeno de electrones (H2A)

servirá para que, por acción de la luz, se produzcan equivalentes de reducción (NADPH, o

NADH), que a su vez se usarán para la reducción (asimilación) de CO2 hasta materia orgánica.

Al igual que en la cíclica, se produce gradiente de protones, convertible en ATP.

4.1. COMPONENTES DEL APARATO FOTOSINTÉTICO.

Fotosistemas: Catalizan la conversión de la energía de la luz, capturada en

moléculas excitadas de clorofila o bacterioclorofila en una forma útil de energía. Están

constituidos por complejo antena y centro de reacción.

Cadenas transportadoras de electrones: Estas cadenas están ligadas de forma

estrecha al centro de reacción, y crean una f.p.m.

Antes de describir el funcionamiento del aparato fotosintético, describamos brevemente

las principales moléculas implicadas:

A) Clorofilas y bacterioclorofilas. Estos tetrapirroles cíclicos quelados con Mg++

pueden formar parte tanto de los pigmentos antena como de los centros de reacción.

Las clorofilas del centro de reacción son mucho menos abundantes que las del

complejo antena. Típicamente son 4 moléculas, de las cuales dos están asociadas a

proteínas, de modo que en este estado actúan como "trampas" para los cuantos de

luz. Como veremos, estas clorofilas especiales, tras excitarse, se oxidan, por lo que

se denominan clorofilas fotoactivas. La luz convierte a estas clorofilas desde su

estado basal a su estado excitado, en el que tienen un E0' negativo, por lo que

entonces pueden ceder electrones (oxidarse) fácilmente.


84

B) Carotenoides. Forman parte del complejo antena. Sus funciones son:

protección contra los efectos potencialmente perjudiciales derivados de la

interacción entre la luz y el oxígeno;

como pigmentos antena, captadores de luz (aunque menos eficientes que otros).

C) En las Oxifotobacterias, existe, además un conjunto de ficobiliproteínas,

organizadas en complejos supramoleculares denominados ficobilisomas,

dispuestos (como ya vimos en el tema 8) en la superficie de los tilacoides.

Las principales ficobiliproteínas son ficocianina, ficoeritrina y aloficocianina, y

constituyen el complejo antena en las Cianobacterias.

D) Feofitinas y bacteriofeofitinas. Son similares a las respectivas (bacteria) clorofilas,

excepto que no están queladas con Mg++

. Actúan como aceptores inmediatos del

electrón que pierde cada (bacterio) clorofila del centro de reacción.

E) Otros componentes. En el mismo centro de reacción se encuentran los primeros

componentes de la c.t.e. fotosintética: quinonas especiales acomplejadas con Fe.

Por lo demás, las c.t.e. fotosintéticas contienen moléculas de tipos parecidos a las ya

estudiadas en las c.t.e. respiratorias: quinonas, citocromos y ferroproteínas no

hémicas.

4.2. FUNCIONAMIENTO DE UN FOTOSISTEMA.

Para estudiar el funcionamiento, hagámonos una idea de cómo están organizados los

principales componentes que acabamos de citar dentro del aparato fotosintético:

Complejo antena

Es un conjunto de pigmentos captadores de luz, en gran número (desde unos 50 hasta

miles). Sobre ellos incide la luz solar, de manera que se van transfiriendo la energía de

unos a otros, en paquetes (excitones), pero sin oxidarse, en un fenómeno conocido como

resonancia inductiva.

El complejo antena actúa como un "embudo", captando energía lumínica, y canalizándola

hacia el centro de reacción, donde como veremos enseguida, esta energía podrá ser

convertida a una forma útil.

Centro de reacción (C.R.).

Para hacernos una idea concreta de un centro de reacción, mostraremos uno de los

mejor estudiados: el de la anoxifotobacteria purpúrea Rhodopseudomonas viridis (el

primero en desentrañarse a nivel molecular, en el año 1985, mediante técnicas de

difracción de rayos X).

posee 4 bacterioclorofilas, de las cuales dos (denominadas P870) son las

fotoquímicamente activas, debido a su asociación con tres proteínas del centro de

reacción (denominadas L, M y H). Todo el conjunto se encuentra en la bicapa lipídica.

2 bacteriofeofitinas

2 ubiquinonas y un Fe, que constituyen el complejo Q·Fe.

Ramirez - Balqui

85

Antes de dar una visión más detallada, veamos un pequeño resumen del modo de

funcionamiento del centro de reacción:

Llega un cuanto de luz al par de bacterioclorofilas especiales. La bacterioclorofila

(Bcfla.) se excita (Bclfla*);

la Bclfla* excitada se oxida (pierde un electrón) → Bclfla+;

el electrón es captado rápidamente por el aceptor inmediato (la bacteriofeofitina), que

a su vez lo pasa a la quinona cercana.

En todo este proceso se va produciendo una separación de cargas, porque el

electrón va quedando cada vez más separado de la Bclfla+ oxidada. El electrón pasará

a otra quinona situada fuera del C.R., convirtiéndose en un electrón de alta energía.

Veamos en detalle la secuencia de transferencias en el centro de reacción.

1. Cada Bclfla. especial (P870 en el ejemplo que estamos estudiando), tras excitarse

(pasar Bclfla*), se oxida (pierde electrón), pasando a Bclfla+.

2. El electrón pasa a una Blcfla. "normal" (P800, no asociada a proteínas).

3. El electrón original de cada una de las dos Blcflas. especiales es recogido por las

bacteriofeofitinas.

4. Los dos electrones (uno por feofitina) pasan a una ubiquinona (QA) estrechamente

ligada al centro de reacción (la quinona se reduce: QAH). Observar que se ha originado

una separación de cargas, de modo que se ha formado una especie de "agujero"

cargado positivamente: las bacterioclorofilas con carga positiva tienen ahora una alta

afinidad por electrones.

5. La Bclfla+. captura un electrón de un citocromo cercano (cit c2, ligado al centro de

reacción). Normalmente este citocromo es un donador débil de electrones, pero ahora

los cede, debido al intenso "agujero" de carga positiva representado por las Bclflas+.

6. Mientras tanto, el electrón de la QA pasa a una segunda ubiquinona del centro de

reacción (QB).

7. El electrón abandona el centro de reacción y pasa a otra quinona, que se encuentra

libre en la bicapa lipídica. Esta quinona, una vez reducida, es un buen reductor

(donador de electrones). El electrón pasa a la c.t.e. (con citocromos b-c).

8. El funcionamiento de esta c.t.e. provoca una translocación de protones fuera de la

membrana, o sea, un potencial electroquímico de protones o f.p.m., cuya disipación a

favor de las ATP-asas se traduce en producción de ATP (fotofosforilación).

4.3. TIPOS DE FOTOFOSFORILACIÓN.

Fotofosforilación cíclica

En la FFC, la (bacterio) clorofila del centro de reacción (fotosistema I) sirve tanto como

donador primario de electrones como aceptor final de electrones procedentes de una

c.t.e.

Los electrones no pueden salir del ciclo. Cuando los electrones pasan por la confluencia

entre una quinona y un complejo de citocromos se produce translocación de protones al

exterior, lo que supone ∆p, que a su vez se puede convertir en ATP.


86

Como los electrones no pueden salir del ciclo, no se crea poder reductor. Por lo tanto,

este poder reductor ha de venir de otra fuente, y no del funcionamiento del fotosistema.

(Fuente química, que permite un flujo invertido de electrones).

Fotofosforilación acíclica

En Anoxifotobacterias: FFA anoxigénica

El fotosistema I (FSI) se excita y la Bclfla. Se oxida (Bclfla+). Los electrones cedidos por el

C.R. sirven para reducir (junto con protones) al NAD (P)+ hasta NAD (P)H + H

+ (es decir,

se crea poder reductor).

Ahora bien, ¿cómo se regenera la bacterioclorofila, es decir, cómo se reduce la Bclfla+

oxidada? En la FFA existe un donador exógeno de electrones distinto del H2O: SH2, S0,

H2, ciertos compuestos orgánicos. Dicho donador cede electrones al C.R. a través de una

c.t.e., que como es habitual, crea un potencial ∆p (f.p.m.) convertible en ATP.

En Oxifotobacterias, al igual que en algas verdes y plantas superiores: FFA

oxigénica

Estos organismos usan H2O como donador exógeno de electrones; la FFA es más

compleja, ya que el H2O requiere un elevado potencial de reducción para poder extraerle

los electrones, y el FSI no es un oxidante suficientemente fuerte como para captar

electrones directamente del agua.

La manera de resolver este problema es acoplar un fotosistema adicional (FSII), dotado

de un E0' más alto que el FSI, y que funciona en paralelo con éste.

El FSI se activa y se oxida por la luz, transfiriendo los electrones a una ferredoxina,

que a su vez los cede al NADP+, para generar poder reductor (NADPH + H

+).

Ahora bien, como hemos dicho, el FSI+ no puede regenerarse directamente por el

agua, sino que recibe los electrones desde el FSII, a través de una c.t.e. (por

supuesto, con creación de ∆p y por lo tanto, ATP).

Esta c.t.e. consta de la serie de transportadores siguiente:

PQ (plastoquinona) ─ citocromo b·f ─ PC (plastocianina)

El FSII se excita por la luz (y como acabamos de decir, envía los electrones al FSI vía

c.t.e.). Este FSII+ sí puede regenerarse extrayendo los electrones del H2O,

desprendiéndose O2.

En resumen, el FSI+ actúa como un aceptor final de electrones procedentes del FSII. A su

vez, el FSII+ (oxidado) se reduce directamente por el agua (merced a un complejo

enzimático que contiene Mn, llamado complejo lítico del agua o "reloj oxidante del agua").

V. CAPTACIÓN DE ENERGÍA EN HALOBACTERIUM.

Algunas arqueobacterias halófilas (p. ej., Halobacterium) presentan una capacidad de síntesis

de ATP mediada por la luz, pero sin implicación de clorofilas ni fijación de CO2. Cuando estas

bacterias se encuentran en condiciones de baja aireación (bajas tensiones de O2), sintetizan

Ramirez - Balqui

87

una cromoproteína especial llamada bacteriorrodopsina, que forma "parches" de color púrpura

en sus membranas citoplásmicas.

La bacteriorrodopsina consta de:

porción proteica: bacteriopsina, que forma 7 hélices atravesando la membrana;

grupo cromóforo: retinal (el mismo de la rodopsina retiniana de los vertebrados). El retinal

es un carotenoide C20 que puede absorber la luz y catalizar la transferencia de protones a

través de la membrana. Se encuentra unido como una base de Schiff a una determinada

lisina de la bacteriopsina.

El retinal, como base de Schiff (con una carga positiva), tiene en principio la configuración 13-

cis. Esta forma del retinal absorbe un cuanto de luz de = 565 nm, de lo que resulta un

bombeo de un protón fuera de la membrana. Para regenerar la base de Schiff, la forma neutra

anterior pasa conformación todo-trans, capta un protón y pasa a la forma protonada 13-cis.

El funcionamiento del sistema crea, pues, un gradiente de protones, cuya disipación a favor de

ATP-asas de membrana es convertido a ATP. Obsérvese que funciona como una bomba de

protones, que saca H+ al exterior.

VI. EL OXÍGENO Y EL METABOLISMO BACTERIANO.

6.1. REACCIONES MEDIADAS POR FLAVOPROTEÍNAS.

Aparte de las bacterias que usan O2 como aceptor terminal de electrones de sus c.t.e.

respiratorias, todos los procariotas presentan algunos enzimas que pueden reaccionar

directamente con este oxígeno. De estos enzimas, los más típicos son las

flavoproteínas, que se pueden autooxidar en presencia de O2, dando inevitablemente

peróxido de hidrógeno (H2O2), que es un compuesto muy tóxico; también se pueden

generar pequeñas cantidades de otro producto tóxico, el radical superóxido (O2 -). Por lo

tanto, no es de extrañar que en bacterias haya evolucionado un arsenal de enzimas para

detoxificar estas sustancias:

Protección respecto de los peróxidos:

En muchas bacterias aerobias existe el enzima catalasa:

H2O2 catalasa H2O + 2 O2

Algunos anaerobios aerotolerantes producen peroxidasa, capaz de eliminar cualquier

peróxido, incluyendo el de hidrógeno. Las peroxidasas catalizan la oxigenación de

compuestos orgánicos por el peróxido de hidrógeno, que pasa a agua:

H2O2 + NADH + H+ peroxidasa

2 H2O + NAD+

Protección respecto del superóxido:

El radical superóxido se produce por:

acción de oxidasas;


88

autooxidación de quinonas, ferredoxinas y flavoproteínas.

Este radical es muy tóxico, de modo que todas las bacterias aerobias y anaerobias

aerotolerantes presentan el enzima superóxido dismutasa (SOD), que cataliza la

conversión del superóxido en oxígeno molecular y agua oxigenada, que a su vez se

destruye por los mecanismos que acabamos de ver:

2 O2- + 2 H

+ SOD

O2 + H2O2

6.2. RELACIONES DE LAS BACTERIAS CON EL OXÍGENO.

Dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de

peróxidos y superóxidos, que acabamos de estudiar. Veamos los tipos de bacterias

según sus relaciones con el oxígeno:

Bacterias aerobias: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas

ocasiones) como aceptor final de electrones para la captación de energía química.

Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica

(del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como

microaerófilas.

Algunas microaerófilas lo son permanentemente (microaerófilas estrictas).

Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando crecen usando determinadas

fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilas condicionales).

Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia de oxígeno, debido

a que pueden usar aceptores finales distintos del oxígeno, o porque poseen

metabolismo estrictamente fermentativo.

Anaerobias estrictas: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen de catalasa,

peroxidasa y SOD, y por lo tanto, no pueden eliminar los productos nocivos resultantes

del oxígeno.(Por ejemplo, las especies de Clostridium, y las arqueobacterias

metanogénicas).

Anaerobias aerotolerantes (aerodúricas): Al igual que las anteriores, presentan un

metabolismo energético anaerobio, pero soportan el oxígeno debido a que poseen

enzimas detoxificadores. Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como

Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). También se les llama anaerobios

indiferentes.

Anaerobios facultativos: Pueden realizar metabolismo energético aerobio o

anaerobio, dependiendo del ambiente y la disponibilidad de aceptores finales de

electrones. Ejemplos son las enterobacterias como E. coli.

Ramirez - Balqui

89

CAPITULO V

EFECTO DE LOS AGENTES FISICOS SOBRE LAS

BACTERIAS

IInnttrroodduucccciióónn:: EEffeeccttoo ddee llooss ffaaccttoorreess aammbbiieennttaalleess ssoobbrree llaass bbaacctteerriiaass..

EEffeeccttoo ddee llaa TTeemmppeerraattuurraa..

LLiiooffiilliizzaacciióónn

DDeesseeccaacciióónn

EEffeeccttoo ddee llaass rraaddiiaacciioonneess ssoobbrree llaass bbaacctteerriiaass

EEffeeccttoo ddee llaass oonnddaass ssoonnoorraass

EEffeeccttooss ddee llaa pprreessiióónn hhiiddrroossttááttiiccaa

EEffeeccttooss ddee llaa pprreessiióónn oossmmóóttiiccaa

EEffeeccttooss ddeell ppHH


90

Ramirez - Balqui

91

ESTRUCTURA, NUTRICION Y METABOLISMO BACTERIANO

I. INTRODUCCION: EFECTO DE LOS FACTORES AMBIENTALES SOBRE LAS BACTERIAS.

Debido a su pequeño tamaño y a su estilo de vida individual, las células procarióticas sufren los

cambios ambientales de un modo mucho más directo e inmediato que las células de los

organismos pluricelulares. A lo largo de miles de millones de años, las bacterias han venido

estando sometidas a diversas presiones ambientales, y han respondido evolutivamente

creando numerosos mecanismos de adaptación. Actualmente, las únicas formas de vida

existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente procarióticas. Desafiando

a nuestras ideas preconcebidas de lo que es la vida "normal", encontramos extraordinarios

seres vivos unicelulares viviendo a pH muy ácidos o muy alcalinos, medrando en salmueras y

salinas, o reproduciéndose a temperaturas de más de 100ºC y a grandes presiones...En este

capítulo y en el siguiente veremos algunas de estas notables adaptaciones.

Hasta ahora hemos venido considerando el crecimiento de las bacterias en función de su fondo

genético, en relación con los nutrientes, y en unas hipotéticas condiciones ideales (óptimas).

Sin embargo, el trabajo experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores

ambientales, es decir, una serie de agentes físicos y químicos que

1. modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de

dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;

2. condicionan la distribución de los microorganismos en sus ecosistemas y hábitat naturales;

3. permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijación de

parámetros para:

a. la mutagénesis,

b. la esterilización y desinfección,

c. la quimioterapia.

No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental. Así,

unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en cambio

ser neutras o beneficiosas para otra.

Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre los

efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden

simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si la hubiera) o de

reproducción.

Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera:

AGENTES FÍSICOS AGENTES QUÍMICOS


92

Temperatura Desinfectantes y antisépticos.

Desecación Quimioterápicos de síntesis

Radiaciones Antibióticos

Ondas sonoras

Presión hidrostática

Presión osmótica

II. EFECTO DE LA TEMPERATURA

2.1. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO

La temperatura es uno de los parámetros ambientales más importantes que condicionan

el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos.

La temperatura afecta a la velocidad de crecimiento (y, por lo tanto al tiempo de

generación, g). Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones ambientales se

mantienen constantes) muestra una curva característica de tasa de crecimiento en

función de la temperatura, donde podemos distinguir tres puntos característicos

llamados temperaturas cardinales:

Temperatura mínima: por debajo de ella no hay crecimiento.

Temperatura máxima: por encima de ella tampoco existe crecimiento.

Temperatura óptima: permite la máxima tasa de crecimiento (o sea, g mínimo).

El margen entre la temperatura mínima y la máxima se suele llamar margen de

crecimiento, y en muchas bacterias suele comprender unos 40 grados.

La temperatura mínima se puede explicar en función de:

un descenso de la fluidez de la membrana, de modo que se detienen los procesos

de transporte de nutrientes y el gradiente de protones;

un aumento de la viscosidad del citoplasma;

un debilitamiento de los enlaces hidrófobos de las proteínas (debido a cambios

físicos en la estructura del agua de solvatación) que provoca inactivación de enzimas

alostéricos y de actividad funcional de los ribosomas. En muchos casos los

polisomas no se ensamblan.

Por encima de la temperatura mínima la tasa de crecimiento va aumentando

proporcionalmente hasta alcanzar la temperatura óptima, debido a que las

reacciones metabólicas catalizadas por enzimas se van aproximando a su óptimo. En

dicha temperatura óptima las enzimas y reacciones se dan a su máxima tasa posible.

A partir de la temperatura óptima, si seguimos subiendo la temperatura se produce

un descenso acusado de la tasa de crecimiento hasta alcanzar la temperatura

máxima. Dicha temperatura refleja:

desnaturalización e inactivación de proteínas enzimáticas esenciales;

colapsamiento de la membrana citoplásmica;

lisis térmica de la bacteria.

Ramirez - Balqui

93

Obsérvese en el gráfico que la temperatura óptima está más cerca de la máxima que

de la mínima.

Cada especie o cepa bacteriana tiene temperaturas cardinales distintas, de modo

que una bacteria puede presentar una temperatura óptima superior a la temperatura

máxima de otra, o inferior a la temperatura mínima de una tercera.

Según el rango de temperaturas al que pueden crecer las distintas bacterias, se

pueden establecer tres tipos principales:

1. psicrófilas o criófilas: crecen a partir de entre -5 a 5oC.

a. Las llamadas psicrófilas obligadas tienen t0 óptima a 15-18oC y t0 máxima

a19-22oC, como por ejemplo Flavobacterium. La bacteria Polaromonas

vacuolata, recientemente aislada en aguas heladas de la Antártida es lo que

pudiéramos llamar un psicrófilo extremo: tiene su óptimo de crecimiento en

4ºC, y es incapaz de crecer a 14ºC.

b. Las psicrófilas facultativas (también llamadas psicrotrofas) presentan t0

óptima en torno a los 20-30oC y máximas a los 35

oC.

2. Las mesófilas presentan t0 mínimas a los 10-15oC, óptimas a los 25-40

oC y

máximas entre 35 y 47oC. La mayor parte de las bacterias (incluyendo las

patógenas) pertenecen a esta categoría.

3. Las termófilas presentan mínimos a 25oC, óptimos a 50-75

oC y máximos entre

80 y 105oC. Dentro de esta categoría se suele distinguir las termófilas extremas

(hipertermófilas), que pueden llegar a presentar óptimos cercanos a los 100oC, y

que taxonómicamente pertenecen al dominio de las Archaea.

a. Las termófilas estrictas (o estenotermófilas), con óptimos por encima de los

80ºC son de hecho incapaces de crecer a menos de 37oC, como las citadas

arqueas (Ej., Thermoproteus, Pyrococcus, Pyrodictium). La arquea Pyrolobus

fumarii, habitante de los humeros termales submarinos tiene su óptimo nada

menos que a 105ºC y puede llegar a aguantar 113ºC, y parece detiene su

metabolismo (por "frío") a la "agradable" temperatura de 90ºC (!)

b. Las termófilas facultativas (o euritermófilas) pueden crecer a menos de 37oC,

como p. Ej. Thermus aquaticus.

Veamos brevemente unos cuantos casos de bacterias (y algún microorganismo

eucariótico) adaptado a medios con temperaturas extremas, y sus respectivas

adaptaciones a dichas condiciones:

Ejemplos de medios permanentemente fríos son la mayor parte de las aguas

oceánicas (cuya temperatura media es de unos 5oC, pero que en las

profundidades alcanzan sólo 1-2oC por encima de cero) y las áreas

permanentemente heladas del Ártico y de la Antártida.


94

En los medios helados existen pequeñas bolsas o microcavidades de agua

líquida, donde pueden medrar algunos microorganismos. Un ejemplo no

bacteriano muy característico es el alga de las nieves (Chlamydomonas nivalis),

que llega a conferir color rojo a la nieve en algunas zonas de montaña a mitad de

la estación estival.

Los psicrotrofos (psicrófilos facultativos) son más abundantes, ya que están

adaptados a soportar grandes oscilaciones térmicas, y en verano pueden crecer

a unos 30oC-40ºC.

Algunas bacterias y hongos pueden crecer en alimentos (carne, leche, frutas y

hortalizas) que se guardan en frigoríficos, alterando las cualidades

organolépticas e incluso, echándolos a perder (una experiencia que casi todos

hemos tenido).

Las principales adaptaciones bioquímicas a medios fríos exhibidas por estos

microorganismos son:

enzimas más resistentes al frío;

sistemas de transporte adaptados a bajas temperaturas;

los fosfolípidos de la membrana celular aumentan la proporción de ácidos

grasos insaturados (y en algunas bacterias, poliinsaturados); ello supone que

la membrana sigue en su estado semifluido, evitándose su congelación.

Los hábitats naturales con temperaturas permanentemente altas (por encima

de 45-50oC) están restringidas a unas pocas zonas de la biosfera, normalmente

relacionadas con fenómenos volcánicos:

fuentes termales volcánicas terrestres (en zonas de EE UU, Japón, Nueva

Zelanda e Islandia);

fuentes termales submarinas: los llamados "humeros" (fumarolas

hidrotermales) asociados a las grandes dorsales oceánicas);

fumarolas.

Como ejemplo "clásico", muy conocido por documentales de divulgación,

recordemos que en el famoso Parque Nacional de Yellowstone, en EE UU, existe

la mayor concentración mundial de fuentes volcánicas, con géiseres que emiten

a más de 100oC, siendo esta temperatura bastante constante, con oscilaciones

de +/- 1 ó 2oC. Cuando esta agua sale, lo hace a punto de ebullición. El riachuelo

que genera va bajando su temperatura en su recorrido, de modo que se genera

un gradiente de temperatura en el que se pueden estudiar fascinantes

comunidades microbianas adaptadas a esas diversas temperaturas. Allí fue

donde T.D. Brock descubrió la eubacteria termófila Thermus aquaticus, de la que

se extrae la ADN polimerasa termorresistente empleada en la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR). Recientemente se está recurriendo a usar la

polimerasa de una arquea hipertermófila, Pyrococcus furiosus, que funciona muy

bien a 100ºC.

Ramirez - Balqui

95

Si confeccionamos una tabla donde se agrupen distintos seres vivos en función

de las temperaturas máximas a las que pueden vivir comprobaremos (Fig.1) que

los procariotas, como conjunto aguantan más que los eucariotas. Dentro de los

procariotas, las bacterias no fotosintéticas crecen a mayores temperaturas que

las fotosintéticas. Obsérvese que existen bacterias con óptimos a 55, 70 e

incluso 100oC (el asombroso Pyrodictium crece a 110

oC). Como ya dijimos, el

"récord" de termofilia lo tienen ciertas arqueobacterias (como la que acabamos

de citar), y crecen a esas temperaturas a gran velocidad (tiempos de generación

g del orden de 1-7 horas).

Se han aislado bacterias termófilas en medios artificiales, como calentadores de

agua domésticos e industriales.

Las principales adaptaciones bioquímicas a altas temperaturas en células

vegetativas bacterianas son:

enzimas termorresistentes. Algunas de ellas tienen un interior molecular muy

hidrófobo;

ribosomas termorresistentes;

membranas ricas en ácidos grasos saturados, que permiten enlaces

hidrofóbicos más fuertes.

En Arqueas hipertermófilas los lípidos son muy especiales: en vez de basarse

en ésteres de ácidos grasos con el glicerol, se trata de éteres de

hidrocarburos unidos al glicerol (el enlace éter es más resistente). Algunas,

además, en vez de la típica bicapa lípídica, exhiben una monocapa

bioquímica de C40-bifitanil-tetraéteres (resultado de unirse "cola con cola" dos

C20-fitanil-diéteres), que condicionan una extrema resistencia a agentes

ambientales.

2.2. EFECTO LETAL DEL CALOR.

Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de crecimiento, se dejan

sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de viabilidad significa que las bacterias

dejan de ser capaces de crecer y dividirse, aun cuando las transfiramos a un medio

idóneo. La muerte por calor es una función exponencial de primer orden:

N . K - dt

dNT

O sea, y como se puede constatar en el gráfico adjunto, la acción del calor supone la

muerte de una fracción constante (KT) de la población sobreviviente en cada momento.

La cinética de primer orden sugiere que no existen efectos acumulativos, sino que la

muerte se debe a la destrucción o inactivación irreversible de una molécula o estructura

esencial (como p. ej. el ADN cromosómico o por creación de un daño irreparable en la

membrana).


96

En la práctica podemos encontrarnos con gráficos distintos al anterior, debidos a

desviaciones respecto de esta cinética:

¿Cómo podemos caracterizar o medir en la práctica la inactivación por calor de una

suspensión bacteriana? Aquí algunos parámetros utilizados:

tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las

bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura;

tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al 10% la

densidad de la suspensión, a una determinada temperatura (también llamado valor

D);

punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en

un tiempo determinado (normalmente el tiempo de referencia empleado es de 10

min.).

Ejemplos

punto térmico mortal Especies

55oC Escherichia coli

60oC Mycobacterium tuberculosis

120oC Endosporas de especies muy resistentes de Bacillus.

Estos tres parámetros se emplean frecuentemente en industrias alimentarias, como en

las de fabricación de conservas, centrales lecheras, etc.

Antes de seguir adelante, es importante tener claro que, dependiendo de la temperatura

y el tiempo a que sometamos un material a tratamiento térmico, lograremos

inactivación parcial de la población microbiana (es decir, queda una fracción de

células viables) o bien esterilización (inactivación total).

En general, entendemos por esterilización todo tratamiento de un material con un

agente físico (como el calor, que nos ocupa en este momento) o químico (como

veremos en el capítulo 19) que acarrea la eliminación de toda forma de vida en él. Una

vez estéril, el material sigue estéril indefinidamente con tal de que esté encerrado en un

compartimiento estanco, sellado y libre del contacto con microorganismos del ambiente

exterior.

Centrándonos de nuevo en el calor, la inactivación parcial o la esterilización se pueden

lograr por calor húmedo o por calor seco.

La inactivación (total o parcial) por calor se debe a la desnaturalización de proteínas y a

la fusión de lípidos de membrana, debido a que se rompen muchos enlaces débiles,

sobre todo los puentes de hidrógeno entre grupos C = O y H2-N . Estos enlaces se

rompen más fácilmente por calor húmedo (en atmósfera saturada de vapor de agua),

debido a que las moléculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrógeno.

Ramirez - Balqui

97

2.2.1. Calor húmedo

Por lo tanto, la inactivación por calor húmedo requiere menores temperaturas que

la que se realiza en ausencia de agua. Veamos algunos ejemplos de condiciones

de inactivación total por calor húmedo:

Microorganismo Condiciones

La mayoría de células vegetativas, de bacterias,

levaduras y hongos

80oC, 5-10 min.

bacilo tuberculoso 58oC, 30 min.



Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis 60oC, 60 min.

La mayoría de esporas de bacterias patógenas 100oC, pocos min.

esporas del patógeno Clostridium botulinum 100oC, 5,5 horas

esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 100oC, muchas horas

esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos 120oC, 15 minutos

Veamos los métodos principales de lograr esterilización de materiales por calor

húmedo:

Autoclave (introducido por Chamberland en 1884).- Es un aparato que permite

calentar muestras por calor húmedo a temperaturas superiores a las de ebullición

del agua (sin que ésta hierva), debido a que el tratamiento se efectúa en un

compartimiento estanco saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la

atmosférica. (El funcionamiento del autoclave será oportunamente explicado en

clases prácticas). Los parámetros de esterilización suelen ser: temperatura 121oC

y 10-15 min. Como se puede deducir, estos parámetros vienen fijados por la

resistencia de las esporas de especies saprofitas (ver última línea de la tabla

anterior), que son las formas de vida que más aguantan el calor sin perder

viabilidad.

(Hay que tener en cuenta que, en la práctica, a veces hay que emplear

condiciones diferentes; por ejemplo: si queremos esterilizar grandes volúmenes de

líquido, habrá que prolongar el tratamiento, 30 o 40 min., ya que el centro del

recipiente donde va el líquido tarda más en alcanzar la temperatura de

esterilización. Los medios de cultivo que incluyen glucosa deben esterilizarse a

115oC, ya que a temperaturas superiores la glucosa "carameliza"; por lo tanto, en

estas ocasiones, el tiempo también es mayor: 30 min).

La acción rápida del calor húmedo depende en buena parte del alto valor de calor

latente del agua (540 cal·g-1

); ello hace que los objetos más fríos (como las

muestras a esterilizar) se calienten rápidamente por condensación de agua en su

superficie.

Tindalización (nombre en honor de John Tyndall).- Es un método de esterilización

fraccionada para materiales que se inactivan o estropean a más de 100oC.


98

Consiste en someter el material a varios ciclos (normalmente 3 ó 4) de dos fases

sucesivas cada uno:

a. en la primera fase el material se calienta a una temperatura entre 50 y 100oC,

durante 1 ó 2 horas;

b. en la segunda fase el material se incuba en una estufa, a 30-37oC durante 24

horas.

Durante las fases de tipo a) mueren todas las células vegetativas de la muestra,

pero permanecen viables las esporas, que quedan activadas para germinar.

Durante las fases de tipo b) se produce la germinación de las esporas activadas

en la respectiva fase anterior. En la siguiente fase de tipo a) morirán las células

vegetativas procedentes de la germinación en la fase anterior; y así

sucesivamente, hasta que al cabo de unos cuantos ciclos no queda ningún

microorganismo en la muestra.

Como se puede ver, este método es bastante engorroso y consumidor de tiempo,

por lo que en los últimos años ha sido reemplazado por otro método de

esterilización, aunque ya no dependiente del calor: se trata de la esterilización por

filtración. Consiste de hacer pasar una solución a través de una membrana o filtro

de un tipo de material (normalmente nitrato de celulosa) que presenta poros de un

tamaño inferior al de cualquier célula bacteriana (diámetro de poro =0,22 mm).

Aplicaciones principales del calor húmedo:

1. En la práctica cotidiana del laboratorio de microbiología, en la esterilización de

medios de cultivo y soluciones.

2. En la esterilización de material quirúrgico.

3. En la esterilización o inactivación parcial, en las industrias alimentarias

(conservas, leche y derivados).

En la industria conservera se emplean los parámetros ya estudiados de punto

térmico mortal y tiempo térmico mortal; este último permite elegir la temperatura

que altera menos las cualidades del material a conservar.

El tiempo térmico mortal varía según:

el tipo de material: normalmente, los materiales ácidos (tomates, frutas)

requieren menos tiempo que los neutros (como el maíz o las alubias).

la concentración de azúcares, proteínas o grasas: una mayor concentración de

este tipo de sustancias supone emplear más temperatura y/o más tiempo.

la concentración de sales: puede obligar a aumentar o disminuir los valores de

tiempo y temperatura, dependiendo del tipo de microorganismos.

En la industria láctea se emplean como métodos de esterilización el autoclave o la

llamada uperización.

La uperización consiste en un tratamiento de calor húmedo donde se emplean

temperaturas muy altas durante unos pocos segundos (p. Ej.: 135-150oC durante

Ramirez - Balqui

99

1-2 seg.).- Pero no siempre es imprescindible esterilizar la leche, sino que puede

bastar eliminar los posibles microorganismos patógenos que pueden contaminarla,

y que son más sensibles al calor que los saprófitos inofensivos. Con esta

inactivación parcial de la población microbiana de la leche logramos que ésta se

conserve durante unos días, sin alterar apenas sus cualidades organolépticas y

nutricionales. He aquí los procedimientos más habituales para conseguir esto:

La pasteurización (en honor a Pasteur, que la introdujo en los años 1860)

consiste en tratar la leche a 63oC durante 30 min, tras los cuales se enfría y

envasa rápidamente.-

La pasteurización instantánea (también conocida por sus siglas en inglés HTST,

de high temperature-short time) se logra calentando a 72oC durante sólo 15

segundos, tras de lo cual la muestra se enfría rápidamente. Esta técnica es la más

usada actualmente, ya que:

mata más rápidamente;

mata mejor organismos más resistentes;

altera menos el sabor;

actúa en flujos continuos (y permite procesar grandes volúmenes de leche).

Tras la pasteurización, el número de bacterias viables desciende un 97-99%. Los

potenciales patógenos que pueda llevar la leche (Brucella, Salmonella, bacilo

tuberculoso, Streptococcus, etc.) son eliminados fácilmente.

La pasteurización también se emplea para la preparación de vacunas a base de

microorganismos inactivados por el calor.

2.2.2. Calor seco:

Como ya dijimos, la esterilización por calor seco necesita recurrir a mayores

temperaturas que la efectuada por el calor húmedo, ya que al no existir agua, la

rotura de puentes de hidrógeno y la desnaturalización de proteínas, así como la

fusión de membranas, se efectúan a mayores energías. Otros efectos del calor

seco son los daños por oxidación y el provocar un aumento de la concentración de

electrolitos.

Aplicaciones del calor seco:

1. El llamado horno de Pasteur, mediante calentamiento a 160-170oC durante

2-3 horas permite esterilizar materiales inertes de laboratorio resistentes al

calor: material de vidrio y metálico, aceites y jaleas, etc.

2. Flameado a la llama (hasta el rojo) de asas metálicas de siembra, con las

que se inoculan las bacterias.

3. Incineración de materiales de desecho.

2.3. EFECTO DE LAS BAJAS TEMPERATURAS SOBRE LAS BACTERIAS.

Las bajas temperaturas (por debajo de la temperatura mínima) no son útiles para la

esterilización, ya que, aunque existen algunas bacterias que mueren por congelación (p.


100

ej., especies patógenas de Neisseria), el efecto de este tratamiento sobre otras muchas

es, sobre todo, bacteriostático, sin contar aquellos organismos psicrófilos o psicrotrofos.

Los efectos de someter una suspensión bacteriana a temperaturas menores de 0oC

dependen de:

el medio donde están suspendidas las bacterias;

el modo en que se realice la congelación y una ulterior descongelación.

2.3.1. Congelación de la suspensión en un medio habitual.

Cuando la temperatura es ligeramente inferior al punto de congelación del medio,

el citoplasma queda en sobrefusión (sin congelar) entre -1 y -10oC. Pero como la

tensión de vapor de agua en el interior es mayor que en el exterior, existe una

tendencia a restablecer el equilibrio, que puede ser:

por pérdida de agua de la célula (cuando la congelación se efectúa

lentamente), o bien

por cristalización de agua en el interior (cuando la congelación se realiza

rápidamente).

En ambos casos la consecuencia es que las sales intracelulares se concentran, lo

que supone que la solución del citoplasma puede llegar a saturarse, con

precipitación de sales. Ello conlleva varias consecuencias:

los cristales de sales y la alta concentración de electrolitos provocan la

desnaturalización de proteínas y daños a la membrana, de modo que

pueden salir componentes del citoplasma (fosfato, ribosa, péptidos y

nucleótidos, procedentes de la actuación de ribonucleasas y peptidasas

latentes).

Otro efecto de menor importancia es el daño mecánico a la pared celular y a

la membrana provocada por los cristales de hielo.

En general, el enfriamiento rápido es más lesivo que el lento, existiendo una

velocidad óptima. Cuando una bacteria se enfría rápidamente a -35oC se producen

cristales de hielo que provocan daños cuando la muestra se descongela.

Por lo tanto, otro factor a tener en cuenta es la manera de realizarse la

descongelación, y el número de ciclos de congelación-descongelación. La

descongelación lenta es más letal que la rápida, ya que aumenta el volumen de

cristales de hielo.

El grado de muerte por congelación se puede desglosar en dos componentes:

1. El efecto inmediato: muertes que ocurren al congelarse la muestra;

2. El efecto de almacenamiento, consistente en la lenta pérdida de viabilidad

debida al tiempo que permanecen las bacterias sobrevivientes en estado

congelado, y que depende de la temperatura a la que se mantenga la muestra.

Aplicaciones de la congelación:

Ramirez - Balqui

101

La congelación se aplica, en laboratorio, para preservar muestras bacterianas

durante largos periodos de tiempo. Como acabamos de ver, y con objeto de

maximizar la viabilidad bacteriana el mayor tiempo posible, es importante cómo se

efectúa tanto la descongelación como la descongelación. Una vez congeladas, las

bacterias supervivientes conservan su viabilidad durante mucho tiempo, siempre

que la temperatura se mantenga por debajo del punto eutéctico.

en nieve carbónica (CO2 sólido), a -78oC;

en nitrógeno líquido, a -180oC.

Por ello, este método es usado en el laboratorio para guardar cultivos durante

largas temporadas. El inconveniente de emplear nieve carbónica o nitrógeno

líquido es que hay que reponerlos con relativa frecuencia. Como veremos

enseguida, hay métodos menos engorrosos y caros de mantener viables muestras

microbianas durante largos periodos de tiempo.

2.3.2. Congelación en presencia de sustancias que evitan daños a las bacterias.

Para preservar aún mejor las bacterias a bajas temperaturas, se recurre a añadir a

la suspensión ciertas sustancias, como por ejemplo:

Sustancias no ionizables de bajo peso molecular que provocan la

solidificación amorfa y vítrea, en lugar de la cristalización, evitando así la

formación de zonas intracelulares con alta concentración de sales: glicerina,

sacarosa, lactosa, dimetilsulfóxido (DMSO).

Materiales ricos en proteína: leche, suero, extracto de carne.

Proteínas purificadas (p. Ej., la albúmina).

Determinadas macromoléculas: polivinilpirrolidona (PVP), dextranos.

La suspensión bacteriana puede aguantar varios meses congelada con estas

sustancias a -25 a -30oC, en congelador.

III. LIOFILIZACION.

La liofilización es la desecación al vacío de una muestra previamente congelada. Aplicada a

bacterias, es uno de los métodos que mantiene por más tiempo la viabilidad bacteriana (varios

años). Para obtenerla, el cultivo bacteriano se adiciona de leche o suero (véase epígrafe

anterior), se congela sobre nieve carbónica (-78oC), y se conecta a una bomba de vacío, que

provoca la desecación. La eliminación de toda el agua sobre la muestra congelada aumenta la

viabilidad de ésta, que se guarda en ampollas cerradas de vidrio a temperatura ambiente,

hasta su uso, que como vemos, puede ser incluso muchos años después.

IV. EFECTO DE LA DESECACION SOBRE LAS BACTERIAS

La desecación al aire (sin vacío) mata a las células vegetativas bacterianas, pero no a las

endosporas. La sensibilidad a la desecación varía de una especie a otra.

Ejemplos:

Mycobacterium tuberculosis (el bacilo tuberculoso) es muy resistente al aire (en ausencia

de luz), de ahí que pueda aguantar varios meses a partir de los esputos de enfermos.


102

En cambio, el vibrión colérico (Vibrio cholerae) muere expuesto al aire al cabo de sólo dos

horas.

Las causas de la muerte son, principalmente:

el aumento de concentración intracelular de sales, lo que conlleva efectos tóxicos y

desnaturalizantes de proteínas;

daños por oxidación.

La mayor eficacia de la desecación al aire se logra con 50% de humedad relativa.

V. EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS BACTERIAS.

5.1. CONCEPTOS GENERALES SOBRE RADIACIONES Y BIOMOLÉCULAS.

Se puede definir la radiación como la propagación de energía por el espacio. Los

principales tipos de radiaciones que pueden tener efectos sobre los seres vivos son:

radiación electromagnética (longitudes de onda, en nm)

Radiación infrarroja (IR) 800-106

Radiación visible 380-800

Ultravioleta (UV) 13,6-380

Rayos x 0.14-13.6

Rayos 0.001-0.14

Rayos cósmicos < 0.001

La radiación particulada, con carga y masa consiste en:

rayos (núcleos de He).

rayos (electrones).

Como se recordará, la radiación electromagnética presenta un doble aspecto: ondulatorio

y cuántico (paquetes discretos de energía, cuantos o quanta).

Cuando una molécula absorbe la energía de un cuanto de radiación electromagnética, se

pueden producir una serie de cambios en los niveles energéticos de algunos de sus

átomos.

La energía de un cuanto (E) está inversamente relacionada con su longitud de onda ( ,

en nm), según la ecuación de Planck:

λ

c . h E

Siendo h = constante de Planck (6.62·10-27

erg·seg-1

) y c = velocidad de la luz (2.99·1017

nm·seg-1

)

Teniendo en cuenta los valores de las constantes y la equivalencia 1 eV =1.59·10-12

erg,

la ecuación de Planck se puede expresar como:

Ramirez - Balqui

103

λ

1240 E (En eV)

Sustituyendo por sus valores concretos correspondientes a distintos tipos de

radiaciones electromagnéticas, se calculan fácilmente los respectivos rangos de energía:

Rayos x: 9000-91 eV

Luz UV: 91-3.3 eV

Visible: 3.3-1.5 eV

Fuentes de radiaciones:

Las fuentes naturales nos llegan desde el espacio: radiaciones de la luz solar (visible +

UV) y los rayos cósmicos. Sin embargo, la capa de ozono de la alta atmósfera sirve de

pantalla, evitando que lleguen a la biosfera las longitudes de onda del ultravioleta de

menos de 190 nm, que son las más energéticas.

Los UV generados artificialmente son apantallados por material de vidrio.

Los rayos cósmicos tampoco llegan a la superficie terrestre.

Las principales fuentes artificiales de radiaciones (aparte de las visibles) son:

máquinas de rayos X;

radioisótopos (como el Co-60);

reactores nucleares;

aceleradores de partículas.

5.2. CLASES DE EFECTOS DE LAS RADIACIONES.

El número de cuantos absorbidos por un sistema biológico es proporcional al producto

de: duración de la radiación por la intensidad de la radiación y por el coeficiente de

absorción del material.

Los efectos derivados de la absorción de esa radiación dependen de:

la energía de la radiación absorbida;

la naturaleza del material.

Hagamos un tratamiento del tema en función de que la radiación provoque o no

ionizaciones en el material, lo cual depende de la energía de los cuantos:

1) Si la energía es E>10 eV, hablamos de radiaciones ionizantes: son los rayos X y los

rayos ..

El fotón de gran energía incide sobre el átomo, provocando la expulsión de un electrón

de gran energía (fotoelectrón), y quedando el átomo en forma ionizada (cargado

positivamente). El electrón expulsado suele tener energía suficiente para originar una

nueva ionización, de la cual surge otro electrón de alta energía, etc. produciéndose

una cadena de ionizaciones, con transferencia linear de energía, hasta que ésta

se disipa en el material: el último electrón de la cadena es captado por otro átomo o


104

molécula, que queda cargado negativamente. El resultado final es que se forman

pares de iones (uno positivo y otro negativo).

A su vez, esos iones originados tienden a experimentar reorganizaciones electrónicas

ulteriores, que dan pie a cambios químicos en el sistema que se había sometido a la

irradiación.

2) Si la energía es E<10 eV, no se producen ionizaciones: los electrones del átomo o

molécula pasan transitoriamente (de 10-8

a 10-10

segundos) a un nivel energético

superior (entonces se habla de que el átomo o molécula están excitados), pero

enseguida dicho electrón vuelve al estado energético inicial.

En su regreso a su nivel energético previo, el electrón puede dar origen a una variedad

de fenómenos:

fluorescencia: emisión de energía a una longitud de onda mayor que la del fotón

incidente;

fotosensibilización: la energía se transfiere a otra molécula;

reacciones fotoquímicas: se origina un cambio químico;

emisión de calor: la energía simplemente se disipa en colisiones entre moléculas.

La luz visible y UV pueden dar origen a reacciones fotoquímicas, aparte de calor. Pero

la radiación infrarroja sólo conduce a disipación de calor, si bien ciertas bacterias

fotosintéticas anoxigénicas pueden aprovechar el infrarrojo para la fotosíntesis.

5.3. EFECTOS DE LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS APLICACIONES.

Los efectos de las radiaciones ionizantes dependen de la dosis de exposición, o sea, de

la cantidad de radiación a que se somete un material. Se suele medir en unidades

Roentgen (R):

1 R = energía de absorción de 83 erg·g-1

de aire.

Por otro lado, la dosis de absorción es la fracción de la dosis de exposición que

realmente se absorbe por el sistema biológico (es decir, es la dosis biológicamente

efectiva). Se suele medir en rads:

1 rad = energía de absorción de 100 erg·g-1

de aire.

En la práctica, la unidad que se emplea en Biología es el megarad (Mrad), equivalente a

un millón de rads, y que es el rango de la dosis requerida para esterilizaciones. También

se emplea el Gray (1Gy equivale a 100 rads).

En general, los microorganismos son más resistentes a las radiaciones ionizantes que los

seres superiores. Por ejemplo, la dosis de reducción decimal (D10) para las endosporas

de ciertas especies de Clostridium es de 2000-3000 Gy. Las células vegetativas de la

bacteria Deinococcus radiodurans (observe el nombre específico) es de 2.200 Gy. Otras

especies más "normales" poseen una dosis de reducción decimal en torno a 200-600 Gy.

Compare estos datos con el valor de sólo 10 Gy como dosis letal para humanos.

Ramirez - Balqui

105

Las fuentes de radiaciones ionizantes son los aparatos de rayos x, los rayos y los

radioisótopos, como el Co60

o el Cs137

.

Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos como indirectos, así

como mutagénicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis de radiación,

mientras que los letales indirectos y mutagénicos se consiguen a menores dosis.

1. Efecto letal directo: por impacto de cuantos de radiación ionizante sobre alguna

molécula esencial para la vida. Los estudios cuantitativos demuestran que debe de

existir una molécula vital única que, al ser alterada, provoca la muerte (teoría del

golpe único). Esta molécula debe ser el ADN (ya que obviamente es absolutamente

esencial y suministra una sola copia de la mayoría de los genes bacterianos), y no

las proteínas, de las que existen muchas copias en la célula, y que podrían

regenerarse. Los daños al ADN son, principalmente: roturas en ambas cadenas, y

entrecruzamiento entre dichas cadenas, que no puedan repararse.

2. Efecto mutagénico: deriva de la producción de daños menores al ADN que pueden

repararse por mecanismos propensos a error.

3. Efecto letal indirecto: este tipo de efecto es el más importante, y deriva de la

radiolisis del agua que provoca la aparición de radicales hidroxilo (OH-) e hidrógeno

naciente (H+). El hidrógeno naciente o radical H libre es un potente reductor, y el

radical hidroxilo es un potente oxidante. El radical hidroxilo reacciona fácilmente con

macromoléculas, sobre todo con ADN, provocando roturas en ambas cadenas, lo

cual se traduce en efectos de letalidad. Si, además, la bacteria está expuesta al

oxígeno mientras se la está irradiando, el efecto es aún más intenso, debido a que el

O2 reacciona con los radicales libres, originando cadenas de reacciones de

autooxidación, muy destructivas, y promoviendo la formación de peróxidos y

epóxidos, asimismo letales:

H + O2 → HO2

2 HO2- → H2O2 + O2

Las principales aplicaciones de las radiaciones ionizantes son la esterilización de:

material farmacéutico;

material médico-quirúrgico (guantes de cirujano, suturas de nylon, jeringas

desechables, agujas, bisturíes, catéteres, prótesis, etc.);

alimentos envasados (aunque en algunos países aún sigue abierta la polémica por

parte de ciertos grupos sobre la seguridad de este tratamiento).

La dosis de esterilización por radiación se suele establecer en 12 veces la dosis de

reducción decimal (12 D10) requerida frente a las endosporas de Clostridium botulinum.

Debido al gran poder penetrante de las radiaciones hay que mantener unas normas y

controles de seguridad muy estrictos en su manipulación: planchas protectoras de plomo

y revisiones periódicas de los manipuladores.


106

5.4. EFECTOS DE LAS RADIACIONES ULTRAVIOLETA.

La radiación UV tiene un efecto letal y mutagénico, que depende de su longitud de onda.

Ello se debe a la absorción selectiva de longitudes de onda por parte de ciertas

moléculas biológicas:

Las proteínas tienen dos picos (es decir, máximos) de absorción: uno a 280 nm,

debido a los aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230 nm, debido a los

enlaces peptídicos.

El ADN y el ARN absorben a 260 nm, debido al enlace doble entre las posiciones 4 y 5

de las bases púricas y pirimidínicas.

Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios químicos en las

moléculas absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadas

genéricamente fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivación de

macromoléculas, aunque, como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismos

para paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas.

Las consecuencias de inactivar proteínas o ARN no se dejan sentir a efectos de letalidad,

ya que existen muchas copias de cada uno de estos tipos de macromoléculas, y se

pueden volver a sintetizar.

En cambio, la inactivación del único cromosoma de la bacteria tiene efectos letales

primarios y efectos mutagénicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de acción

biológica de la luz UV equivale al de absorción del UV por el ADN (260 nm).

5.4.1. FOTOPRODUCTOS DEL ADN OCASIONADOS POR LA LUZ UV.

Los fotoproductos generados por la luz UV en el ADN derivan principalmente de

alteraciones en las bases pirimidínicas (citosina, timina):

a. dímeros de pirimidina (anillo ciclobutano)

b. fotoproducto de la endospora (5-timinil-5,6-dihidrotimina)

c. hidratos de pirimidina.

Los dímeros de pirimidina son los fotoproductos más importantes en las células

vegetativas bacterianas. El principal es el dímero de timina (T-T), aunque también

se producen T-C y C-C. Se trata de aductos (uniones) entre dos pirimidinas

adyacentes en la misma hebra de ADN, mediante la creación de un anillo de

ciclobutano. Su efecto principal es la distorsión local de la configuración de la

doble hélice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases

complementarias; ello, a su vez, provoca una interferencia en los procesos de

replicación y transcripción, y secundariamente en el crecimiento y la respiración.

A dosis muy altas de rayos UV se forman también dímeros entre pirimidinas de las

dos cadenas, es decir, se provocan entrecruzamientos de las dos hebras que

igualmente afectan a la replicación y a la transcripción, aunque este tipo de daños

reviste menos significación biológica.

Ramirez - Balqui

107

El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina. Como vimos en el

capítulo 12, se forma en la endospora bacteriana debido al alto grado de

deshidratación, pudiendo ejercer igualmente efectos inactivantes.

Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se forman a altas

dosis de luz UV. Tienen efecto mutagénico (no letal), favoreciendo la aparición de

transiciones T = A a C = G.

5.4.2. MECANISMOS DE REPARACION DE LOS FOTOPRODUCTOS.

Debido al carácter esencial del ADN como molécula central informativa de los

seres vivos, la evolución ha desarrollado una serie de mecanismos capacitados

para enfrentarse con los posibles daños ocasionados por la luz ultravioleta. Los

principales mecanismos hallados en bacterias se pueden agrupar así:

1. Mecanismos prerreplicativos:

a. reparación fotoenzimática o fotorreactivación, que permite la reparación

directa del daño en sí.

b. reparación por escisión y resíntesis.

2. Mecanismos posreplicativos:

a. reparación por recombinación.

b. reparación inducible de emergencia (SOS).

A) Reparación fotoenzimática

Se debe a la actuación de una enzima denominada fotoliasa o enzima

fotorreactivante, que muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las

fotoliasas reparan directamente los dímeros de pirimidina, en una reacción

que requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda (luz azul). Estas

enzimas poseen dos grupos prostéticos coloreados (cromóforos):

flavina reducida (FADH2)

una pterina.

Mecanismo

1. La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa

reconoce el dímero de pirimidina, y se une a él, formando un complejo

enzima-sustrato [E-S].

2. La flavina reducida (FADH2) de la fotoliasa, en presencia de luz ( = 300-

500), se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dímero de

pirimidina, rompiéndolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar.

Aunque se sabe que el segundo cromóforo (la pterina) favorece la reparación,

no está claro cuál es su papel exacto.

No todas las bacterias tienen enzimas fotorreactivantes, pero en cambio la

fotorreparación está muy extendida entre eucariotas.


108

B) Reparación por escisión-resíntesis.

La distorsión en la doble hélice provocada por el dímero es reconocida por un

complejo proteico con actividad de endonucleasa correctora, conocido como

correndonucleasa o escinucleasa. El daño se repara indirectamente (es

decir, no se actúa sobre el propio fotoproducto), sino que las bases dañadas

se eliminan (se escinden) formando parte de un oligonucleótido, y el hueco

resultante se rellena por resíntesis reparadora de ADN.

Mecanismo:

1. Un complejo formado por dos subunidades de la proteína UvrA y una de la

UvrB (Uvr [A2B]) se une cerca del dímero de pirimidina, usando la energía

de la hidrólisis del ATP, y merced a su actividad helicasa, desenrolla

localmente la doble hélice.

2. Se une la proteína UvrC, con lo que se completa el complejo Uvr [A2BC],

es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena dañada del ADN, cerca

del dímero.

3. La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el

dímero: corta el 8º enlace fosfodiéster "a la izquierda" del dímero (o sea,

hacia el lado 5') respecto de la localización del dímero y corta el 4º o 5º

enlace fosfodiéster "a la derecha" (en dirección 3' del dímero). Por lo tanto,

se produce y libera un fragmento de unos 12 nucleótidos de longitud, que

incluye al dímero de pirimidina, al mismo tiempo que se retira la

escinucleasa, que se separa en sus polipéptidos constituyentes.

4. Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este hueco es

ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II

(codificada por el gen uvrD), que llevan a la síntesis de nuevo ADN para

rellenar el hueco (por supuesto, en sentido 5'--->3'), tomando como molde

la cadena intacta, y usando como cebador ("primer") el extremo 3'-OH que

se había generado en la fase anterior.

5. Finalmente, la actuación de la ADN-ligasa sella la cadena (regeneración

del enlace fosfodiéster del lado 5').

C) Reparación por recombinación.

Cuando la ADN-polimerasa-III bacteriana (que es la enzima que normalmente

replica el cromosoma) se encuentra, en la cadena que está usando como

molde, con un dímero de pirimidina, deja de replicar esa zona, y "salta" unos

1000 nucleótidos más adelante para seguir la replicación. Por lo tanto, deja un

gran hueco o mella de unos 1000 nucleótidos. Esta discontinuidad (llamada

mella post-replicativa) se puede rellenar por el mecanismo de reparación por

recombinación general, recurriendo a la proteína RecA, que verifica una

recombinación con la hebra parental homóloga intacta.

Mecanismo:

1. Numerosas unidades de proteína RecA recubren la zona de cadena

sencilla de la mella posreplicativa, formando estructuras helicoidales.

Ramirez - Balqui

109

2. La proteína RecA promueve emparejamiento homólogo de la cadena

sencilla a la que recubre con la doble cadena "hermana" intacta.

3. Se produce un intercambio recíproco de cadenas.

4. El extremo 3'-OH libre de la cadena dañada (que merced al intercambio

recíproco está ahora emparejada con la cadena complementaria

procedente de la doble hélice "hermana") sirve de cebador a la ADN-

polimerasa-I, que sintetiza ADN nuevo usando como molde la cadena

complementaria intacta del dúplex.

5. Ligación e isomerización espontáneas, que produce la llamada "estructura

de Holliday", una figura en "X" donde hay dos sobrecruzamientos

("crossing-over") que mantienen unidos entre sí a los dos duplex.

6. Resolución de los dos sobrecruzamientos por sendas roturas y

religaciones, lo cual genera dos dobles hélices ininterrumpidas. Como se

ve en la figura, uno de estos dúplex lleva el dímero de pirimidina, y el otro

es una doble cadena intacta, aunque parte de ella contiene ADN de nueva

síntesis.

Como se puede ver, el mecanismo de reparación por recombinación no repara

por sí mismo la lesión en el ADN, pero logra reparar la mella postreplicativa,

evitando que se detenga la replicación del cromosoma. Al final del proceso el

dímero como tal sigue sin reparar, pero ahora tendrá una oportunidad de ser

reparado por algún otro mecanismo, como el de escisión-resíntesis.

D) Reparación de emergencia (SOS) propensa a error.

Cuando la bacteria se somete a dosis elevadas de luz UV o a determinados

agentes químicos que dañan severamente el ADN, o que interfieren

seriamente con la replicación, puede ocurrir que los sistemas de reparación

que hemos visto hasta ahora no sean suficientes para reparar todos los

daños; en estas circunstancias se pone en marcha un nuevo mecanismo, que

es inducible y que calificamos como de emergencia, ya que tiende a

salvaguardar la viabilidad de la célula, a costa de acumular mutaciones con

frecuencia elevada (y por eso lo llamamos también propenso a error).

El sistema SOS en realidad consiste en una serie de funciones "de

emergencia" ante estrés, una de las cuales es este tipo de reparación de ADN

propenso a error. Otras funciones del sistema SOS son:

Inducción de varios profagos (lo veremos en la sección de Virología, al

tratar el fago l).

Retraso en la formación del tabique transversal, por lo que las células se

alargan anormalmente. (El significado adaptativo de esta respuesta de

inhibición de la septación parece ser el impedir la segregación de ADN sin

reparar a la célula hija, lo que podría ocasionarle la muerte).

Desconexión de la respiración.

Incremento de la degradación de proteínas.

Descripción del sistema en una célula normal (no sometida a daños al ADN):


110

El gen lexA posee un nivel basal de expresión, de modo que codifica la

proteína LexA, que actúa como represor sobre su propio gen (represión

autógena), así como sobre los genes recA, uvrA, B, C, umuDC. La represión

no es total, sino que se da un nivel basal de producción de los polipéptidos

correspondientes a estos genes. Así, por ejemplo, el nivel de proteína RecA

es suficiente para efectuar los procesos normales de recombinación, y los

niveles de UvrABC son suficientes para reparar pequeños daños en el ADN.

Descripción del sistema en una célula severamente dañada:

Una célula seriamente afectada por un agente que daña el ADN o interfiere

con su replicación poseerá zonas de cromosoma con ADN de cadena sencilla

(c.s.) sin reparar. Pues bien, este ADN de c.s. constituye una señal de

situación de emergencia para la proteína RecA: dicha proteína se une a esas

regiones de c.s., de modo que adquiere una actividad proteasa muy específica

(para distinguir esta actividad, usamos la nomenclatura RecA*). La proteína

RecA* (activada como proteasa) induce la proteólisis del represor LexA

(rompiéndolo entre dos aminoácidos concretos hacia la mitad de la molécula).

Por lo tanto, ya no hay suficiente proteína LexA intacta como para seguir

reprimiendo a los genes citados (recA, uvrABC, umuDC). Dichos genes

(llamados genéricamente genes SOS) se pueden expresar ahora a altos

niveles, de modo que:

Aumentan los niveles de RecA, lo que conlleva un aumento de la eficiencia

de la reparación por recombinación;

Aumentan los niveles de la escinucleasa (Uvr[A2BC]), lo que supone

mejorar la reparación por escisión-resíntesis;

Se expresan los genes umuDC, lo que se traduce en un aumento de la

mutagénesis. Pero) por qué aumenta la mutagénesis? El mecanismo

exacto no está claro. Se sabe que en esta situación de emergencia algunos

dímeros de pirimidina son procesados con la intervención de los productos

de recA y de umuD y umuC, de modo que hay una síntesis de

emergencia de ADN que acarrea la frecuente introducción de bases

incorrectas (es decir, es un proceso de reparación propenso a error).

Hay dos hipótesis principales sobre este respecto:

1. Los genes umuD,C codificarían una nueva polimerasa de emergencia con

menor fiabilidad de copia que las polimerasas habituales;

2. O bien, los productos de umuDC modificarían alguna polimerasa normal

(como la ADN-Pol-III) de manera que ésta "relajaría" su capacidad

correctora de pruebas (exonucleasa 3' → 5'), de modo que ante ausencia

de molde, o ante un molde afectado por el daño colocaría nucleótidos "al

azar", lo que sería la base de las frecuentes mutaciones.

Hay pruebas que favorecen a esta segunda hipótesis.

De esta manera, la célula salvaría su integridad en esta situación "límite", pero

a costa de adquirir frecuentes mutaciones.

Ramirez - Balqui

111

5.4.3. APLICACIONES PRACTICAS DE LA LUZ UV.

La luz UV se puede producir artificialmente en lámparas de vapor de mercurio de

baja presión, que emiten el 90% de su radiación a 254 nm. La unidad de energía

de radiación se mide en watts / (seg·cm2).

Por ejemplo, una lámpara de 15 watios emite una energía de 38m watts·cm-2seg.

-

1, a una muestra situada a 1 metro de la lámpara.

La luz UV es efectiva sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. La dosis

letal para células vegetativas suele estar entre 1800 y 6500 watt·cm-2

, pero las

endosporas requieren 10 veces más dosis.

El uso práctico de la luz UV como agente esterilizante está limitado, ya que tiene

poco poder penetrante: no entra en objetos sólidos, y además se ve apantallada

por el cristal y penetra poco en los líquidos. Su aplicación concreta más frecuente

es en el control de infecciones por vía aérea: lámparas de desinfección en salas

de hospitales y de laboratorios de investigación. En Microbiología se emplea la luz

UV como agente mutagénico en bacterias (en muchos estudios que requieran

obtener mutantes correspondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las

correspondientes bases genéticas).

5.5. EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE.

A diferencia de la UV, la luz visible es de baja energía, y además, sus cuantos no tienen

efectos selectivos sobre el ADN, por lo que no sería de esperar, en principio, que este

tipo de radiación tuviera efectos negativos sobre las bacterias. Sin embargo, la luz visible

puede ejercer un efecto negativo indirecto, en el fenómeno de sensibilización

fotodinámica.

5.5.1. Sensibilización fotodinámica natural.

La luz visible de fuerte intensidad (p. Ej., exposición a pleno sol) es capaz de

matar las bacterias, debido a que ciertas moléculas de éstas (riboflavinas,

porfirinas, citocromos) absorben la energía de los cuantos y se excitan durante 10-

6-10

-8 seg., tras lo cual reemiten la energía a otras moléculas, originando

fotooxidaciones en residuos His y Trp de las proteínas y en las bases de los

ácidos nucleicos. También se puede generar oxígeno singlete (1O2), que es un

radical muy reactivo, oxidante, que puede destruir la célula con rapidez.

Así pues, en la práctica de laboratorio habitual, no es conveniente exponer las

bacterias en cultivo a la luz, sino que habrán de cultivarse en oscuridad (salvo el

cultivo de las bacterias fototrofas).

Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintéticas, y las que se propagan vía aérea)

poseen abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las protegen de estos

efectos fotosensibilizadores. (Los carotenoides captan la energía del oxígeno

singlete y la reenvían al estado basal, no excitado).


112

5.5.2. Sensibilización fotodinámica artificial:

Si a una suspensión de bacterias añadimos ciertos pigmentos artificiales

fluorescentes (colorantes), como el rosa de Bengala, el azul de metileno, la

eosina, etc., la energía del visible absorbida por dichos pigmentos no la reemiten

como fluorescencia, sino que provoca cambios en proteínas y ácidos nucleicos.

Esto conduce a efectos de esterilización, sobre todo por desnaturalización de

proteínas.

VI. EFECTOS DE LAS ONDAS SONORAS.

Las ondas sonoras audibles para los humanos poseen un rango de frecuencias entre los 9

kilociclos y los 20 kilociclos/segundo. Por encima de 20 Kc se sitúan las ondas supersónicas

(hasta los 200 Kc/seg.) y las ultrasónicas (desde 200 hasta 2000 Kc/seg.). Estos tipos de

ondas de frecuencias superiores a las audibles (sobre todo las ultrasónicas) tienen el efecto de

desintegrar las células.

El fundamento de esta acción es el siguiente: el paso del sonido a través de un líquido

produce cambios de presión alternantes (por los sucesivos frentes de ondas), que a grandes

frecuencias originan cavidades (burbujas de gases disueltos) de unos 10 m de diámetro

(fenómeno de cavitación). Dichas cavidades van aumentando de tamaño y terminan

colapsando violentamente, dando lugar a enormes presiones locales (de hasta 1000

atmósferas o 10 Tm/cm2). Las consecuencias del colapso son:

la célula se desintegra;

si existe oxígeno en el líquido de suspensión, se forman peróxidos (como el H2O2);

despolimerización de macromoléculas;

cortes en ambas hebras del ADN.

Las bacterias son variables en cuanto a su susceptibilidad a las vibraciones sonoras. En

general, son más sensibles las Gram-negativas y más resistentes las Gram-positivas. Sin

embargo, ante un tratamiento por ultrasonidos siempre cabe la posibilidad de que sobrevivan

algunos individuos, por lo que este método no tiene utilidad para la esterilización.

El uso habitual de los supra- y ultrasonidos en laboratorio es para la llamada "sonicación" o

disrupción ultrasónica de células para obtener extractos celulares, en investigaciones

bioquímicas. El tratamiento se realiza en un aparato llamado generador de ultrasonidos o

"sonicador", que opera en un rango de frecuencias desde 9 hasta 100 Kc/seg.

VII. EFECTO DE LA PRESION HIDROSTATICA.

La mayor parte de las especies bacterianas de hábitats continentales no pueden crecer (e

incluso mueren) cuando son sometidas a altas presiones (unos 600 Kg/cm2). Ello se debe a los

siguientes efectos adversos:

aumento de la viscosidad del citoplasma;

disminución de la capacidad de las enzimas de unirse a sus respectivos sustratos;

(posiblemente) interferencia en procesos de transporte a nivel de membrana;

(posiblemente) interferencia en la biosíntesis de proteínas;

Ramirez - Balqui

113

interferencia en la división celular: las bacterias se alargan, se filamentan, pero sin

producción de tabique transversal (crecimiento sin división celular).

Sin embargo, existen bacterias (sobre todo marinas) que toleran o requieren altas presiones

(barotolerantes y barófilas, respectivamente):

Bacterias barotolerantes:

Crecen a la presión atmosférica, pero aguantan hasta unas 500 atmósferas. Su hábitat son las

aguas oceánicas, entre los 2000 y los 4000 metros de profundidad.

Bacterias barófilas:

Crecen óptimamente a más de 400 atmósferas. Podemos distinguir entre barófilas moderadas

(facultativas) y barófilas extremas (obligadas):

Las barófilas moderadas son aquellas bacterias que pueden crecer a presión atmosférica,

aunque su óptimo está a unas 400 atmósferas. Habitan profundidades entre los 5000 y 7000

metros.

Las barófilas extremas presentan óptimos de crecimiento a muy altas presiones (por encima de

600-700 atmósferas), y son incapaces de crecer a presión atmosférica. Se han llegado a

aislar a más de 10000 metros de profundidad. Debido a que a esas profundidades la

temperatura del agua es de sólo 2-3oC, suelen ser simultáneamente criófilas. Este tipo de

bacterias está empezando a ser investigado actualmente, y su manejo es engorroso, ya que

hay que cultivarlas en cámaras especiales presurizadas que suministran las altas presiones

que requieren.

Aplicación práctica de las altas presiones a bacterias barosensibles:

La llamada prensa de French (que frecuentemente se denomina incorrectamente como prensa

francesa) es un aparato de laboratorio que permite aplicar grandes presiones y brusca

descompresiones, lo que logra la rotura mecánica de las bacterias, con objeto (al igual que la

sonicación) de obtener extractos libres de células.

VIII. EFECTOS DE LA PRESIÓN OSMÓTICA.

Exceptuando los micoplasmas, que carecen de pared celular, las bacterias pueden vivir en

medios tanto hipotónicos como hipertónicos, debido a la protección de una pared celular rígida

y a la membrana citoplásmica semipermeable.

Normalmente el citoplasma de las bacterias poseen una osmolaridad ligeramente superior a la

del entorno, lo que garantiza el paso de agua al interior. La presión de turgor es relativamente

constante porque la membrana citoplásmica se topa con la rigidez de la pared celular. Esta

presión de turgor permite que la bacteria aguante cambios bruscos de concentración de solutos

en su entorno (dentro de ciertos límites). Pero esto plantea una pregunta (que intentaremos

responder a continuación): ¿cómo logra la bacteria ajustar su osmolaridad interna a esos

cambios exteriores?.


114

A) En medios hipotónicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la que ejerce

todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la

membrana citoplásmica tienda a sufrir una presión de turgor excesiva.

Recordemos que las bacterias Gram-negativas poseen dos compartimentos acuosos: el

citoplasma y el periplasma. Como se dijo oportunamente, en el periplasma existe un

oligosacárido especial, derivado de la membrana (el MDO, consistente en 6-10 unidades

de -D-glucosa unidas por enlaces (1 → 2), y con residuos de fosforilcolina y fosfatidil-

etanolamina), que interviene en regular la osmolaridad. Sus grupos negativos están

contrarrestados por contraiones positivos, que igualmente colaboran en la regulación

osmótica.

En un medio con baja osmolaridad (p. Ej., aguas fecales) aumenta la concentración del

MDO, lo cual supone un aumento de la osmolaridad del periplasma, que presiona contra el

peptidoglucano. De esta manera la presión de turgor del protoplasto se transmite al

periplasma y de él al peptidoglucano, que es la estructura más resistente.

B) En medios hipertónicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma). Las

bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la

osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del

ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la

concentración de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamado

genéricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles

mecanismos:

bombeando iones al interior;

sintetizando una molécula orgánica osmóticamente activa;

bombeando sustancias osmoprotectoras.

1. En el caso de los iones, el ión bombeado suele ser el potasio (K+), por un sistema de

antiporte K+/H

+. Ahora bien, para que no se desequilibre la fuerza iónica, la entrada de

K+ suele ir en paralelo con una salida de otros cationes, que suelen ser poliaminas

(como la putrescina). Se ha propuesto que existe un sistema de antiporte K+/putrescina

que en ciertas bacterias tiende a mantener la fuerza iónica mientras aumenta la

tonicidad interior, como sistema para compensar la alta tonicidad del medio. La señal

que desencadena el transporte de iones potasio es directamente la presión de turgor

de la membrana y no la osmolaridad externa.

2. Como ejemplos de síntesis de solutos orgánicos compatibles y osmóticamente activos

tenemos el glutamato, la glutamina y la trehalosa.

Muchas bacterias Gram-negativas sintetizan glutamato ante grandes concentraciones

extracelulares de iones Na+. El mecanismo es el siguiente: al añadir grandes cantidades de

Na+, se produce un eflujo (salida) de H

+ al exterior de la célula, lo que supone la

alcalinización del citoplasma. En estas condiciones se activa la enzima glutamato-

deshidrogenasa (GDH), que sintetiza grandes cantidades de glutamato, que funciona como

soluto compatible que equilibra la osmolaridad del medio.

Ramirez - Balqui

115

En ciertas enterobacterias lo que ocurre es una inhibición del uso metabólico del

glutamato, por lo que este se acumula.

Igualmente se da una acumulación de trehalosa por inducción de una ruta biosintética e

inhibición de la ruta catabólica.

La ectoína es un derivado cíclico de la prolina, sintetizado como soluto compatible por

ciertas anoxifotobacterias purpúreas.

Ahora bien, si el medio es muy hipertónico, estos mecanismos ya son incapaces de evitar

la salida de agua desde el citosol, lo cual conlleva una retracción de la membrana

citoplásmica. La pérdida de agua puede suponer la deshidratación del citoplasma, lo que

conlleva la detención del crecimiento.

En Gram-positivas se produce una plasmolisis auténtica (retracción de la membrana

citoplásmica respecto de la pared rígida suprayacente)

En Gram-negativas no existe auténtica plasmolisis, ya que la pared celular y la

membrana citoplásmica se retraen al mismo tiempo. Las bacterias entéricas crecen

lentamente por encima de 0.65M de NaCl.

3. Sin embargo, las bacterias pueden crecer a osmolaridades superiores a la máxima

teórica, si en el medio existen determinados compuestos llamados osmoprotectores.

La bacteria bombea esos compuestos a su interior, usándolos como solutos

compatibles.

Ejemplos de osmoprotectores:

Prolina (p. ej. en Salmonella typhimurium y Staphilococcus aureus)

Betaína (glicínbetaína), un derivado trimetilado de la glicocola (en cianobacterias y

en algunas Gram-positivas).

Colina (en Escherichia coli).

Ectoína en enterobacterias.

Por ejemplo, S. typhimurium crece muy lentamente en 1M de ClNa, pero mejora si al

medio se añade 1mM de prolina. Un método normal de aislar S.aureus es comprobar el

crecimiento en medio con 7.5% de ClNa en presencia de prolina.

Algunas bacterias han desarrollado evolutivamente sistemas inducibles de transporte de

estas sustancias, muy eficaces para garantizar su utilización como solutos compatibles. Es

el caso de la colina en E. coli, que una vez introducida se metaboliza hasta el auténtico

soluto compatible, la glicínbetaína.

Algunas bacterias patógenas, al destruir tejidos de su hospedador, provocan la liberación

de sustancias, algunas de las cuales les sirven como osmoprotectores ante la alta

osmolaridad de los fluidos corporales.

Otro mecanismo de control ante variaciones de presión osmótica presente en algunas

bacterias Gram-negativas, es la variación en la proporción de porinas de membrana

externa.


116

Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios hipertónicos, y en

general se llaman osmófilos. Entre los osmófilos podemos distinguir los sacarófilos y los

halófilos.

Uno de los ejemplos de microorganismos sacarófilos no es una bacteria, sino las

levaduras, que viven en jugos vegetales, néctares, zumos, etc. Utilizan como solutos

compatibles polioles como el sorbitol, el ribitol, etc.

Entre los organismos halófilos, podemos distinguir los halófilos moderados y los halófilos

extremos o hiperhalófilos.

Halófilos moderados: suelen ser bacterias marinas que viven en 3.5% de NaCl, y que ven

inhibido su crecimiento a concentraciones mayores o menores de sales. Los halófilos

moderados tienen requerimientos concretos de una aw equivalente a la de agua de mar,

así como concentraciones determinadas de iones Na+. El papel jugado por este Na

+ es:

mantenimiento de los sistemas de membrana citoplásmica y transporte;

estabilización de la pared celular;

requerimiento por parte de muchas enzimas.

Halófilos extremos (hiperhalófilos), representados paradigmáticamente por las arqueas

de la familia Halobacteriaceae (halobacterias), que viven en (y de hecho requieren)

concentraciones saturantes de sales (salitrales, lagunas salinas). Usan como soluto

compatible el K+, concentrándolo a partir del medio donde viven, hasta que el citoplasma

queda prácticamente saturado con él (4 a 7 M). Esta gran concentración de potasio es

esencial para mantener la estabilidad y actividad de sus ribosomas, enzimas y sistemas de

transporte. Pero las estructuras superficiales de estas arqueas requieren altas

concentraciones de cloruro sódico.

Dejando aparte las bacterias halófilas, hay algunas bacterias halotolerantes (como por

ejemplo, S. aureus), pero la inmensa mayoría de los procariotas viven a valores de

actividad de agua de 0.98. Por ello, un método que ya se conocía empíricamente en la

antigüedad para conservar ciertos alimentos era el desecarlos o salarlos, o añadirles

grandes cantidades de azúcar (como en las mermeladas).

IX. EFECTO DEL pH.

La mayoría de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio,

manteniendo al mismo tiempo su pH interno óptimo prácticamente constante.

Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH 8, pero su pH interno es

siempre 7.6 o muy cercano a ese valor.

Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, éstas se pueden clasificar

en:

Neutrófilas, si crecen de modo óptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8.

Acidófilas, si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5.

Alcalófilas, si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5.

Ramirez - Balqui

117

La mayor parte de las bacterias son neutrófilas. Muchas bacterias neutrófilas modifican el pH

del medio, y resisten entornos relativamente ácidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas bacterias

fermentativas excretan ácidos, mientras otras alcalinizan el medio, p. ej., produciendo amonio a

partir de desaminación de aminoácidos.

Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen más o menos amplio de pH

(alrededor de un óptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a la membrana y

al transporte de solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplásmico cae rápidamente hasta 5

o menos, la bacteria puede morir.

Uno de los mecanismos que, al menos en neutrófilos parece controlar el pH interior es un

sistema de antiporte H+/K

+: a pH ácidos, el interior celular puede quedar en principio más

alcalino que el exterior. Este sistema introduce protones en el interior y saca iones potasio. De

esta manera neutralizan el pH interior y siguen teniendo un potencial de membrana para

establecer una fuerza protón motriz que les suministre energía.

Si el pH interior cae en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S. typhimurium inducen una

respuesta de tolerancia a ácidos, consistente en ATPasas translocadoras de protones

(expulsan protones al exterior) y chaperonas (proteínas celadoras) para corregir las proteínas

desnaturalizadas.

Existen algunos notables procariotas cuyo pH óptimo es muy bajo (acidófilos extremos u

obligados): Algunas eubacterias del género Thiobacillus (T. thiooxidans, T. ferrooxidans) y las

arqueas del género Sulfolobus tienen su óptimo a pH 2, y generan ellas mismas estos bajos pH

al oxidar sulfuros hasta ácido sulfúrico. (Sulfolobus es un notable ejemplo de procariota

extremófilo: su hábitat son fuentes termales ácidas y solfataras: es un termoacidófilo). De

hecho, estas bacterias necesitan esas altas concentraciones de H+ para mantener la integridad

de sus membranas y envueltas: a pH neutro esas envueltas se desintegran.

Las especies alcalófilas obligadas tienen óptimos de pH en torno a 10-11. Por ejemplo,

Bacillus alcalophilus, cuyo pH interno es de 9. Sus hábitats típicos son suelos carbonatados y

lagunas alcalinas (algunos son también halófilos, como Natronobacterim gregoryi).


118

Ramirez - Balqui

119

CAPITULO VI

ACCIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE LAS

BACTERIAS

CCoonncceeppttooss ggeenneerraalleess..

DDeessiinnffeeccttaanntteess yy aannttiissééppttiiccooss..

TTiippooss ddee ddeessiinnffeeccttaanntteess..

QQuuiimmiiootteerrááppiiccooss ddee ssíínntteessiiss yy aannttiibbiióóttiiccooss.. IInnttrroodduucccciióónn..

QQuuiimmiiootteerrááppiiccooss ddee ssíínntteessiiss

AAnnttiibbiióóttiiccooss

RReessiisstteenncciiaa bbaaccttrriiaannaa aa llooss aannttiibbiióóttiiccooss

BBaasseess ggeennééttiiccaass ddee llaa rreessiisstteenncciiaa

MMeeccaanniissmmooss bbiiooqquuíímmiiccooss iimmpplliiccaaddooss eenn llaa rreessiisstteenncciiaa aa aannttiibbiióóttiiccooss


120

Ramirez - Balqui

121

ACCIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE LAS

BACTERIAS

I. CONCEPTOS GENERALES

Existen ciertas sustancias químicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo

ejercer dos tipos de efectos diferentes:

bacteriostáticos: cuando impiden el crecimiento bacteriano;

bactericidas: cuando destruyen (matan) las bacterias.

En general, si no sólo nos referimos a las bacterias, sino a cualquier tipo de microorganismos,

hablamos respectivamente de agentes microbiostáticos y microbicidas. Ahora bien, para

una misma sustancia química, la línea de demarcación entre un efecto microbiostático y otro

microbicida depende muchas veces de la concentración de dicha sustancia y del tiempo

durante el que actúa.

¿Cómo podemos saber que un microorganismo está "muerto"? El único criterio válido es la

pérdida irreversible de la capacidad de división celular, es decir, de la pérdida de viabilidad, y

se suele comprobar empleando técnicas con placas de Petri (es decir, confirmando que no

crecen en medios sólidos adecuados). (Pero ni siquiera esto es garantía de que una bacteria

"no viable" está "muerta": hay bacterias viables pero no cultivables. Como se ve, demostrar que

una bacteria está "muerta" es algo bastante complicado).

Antes de proceder al estudio de las diversas moléculas que pueden afectar el crecimiento y/o

la viabilidad de los microorganismos, veamos unas cuantas definiciones básicas.

Agentes esterilizantes son aquellos que producen la inactivación total de todas las

formas de vida microbiana (o sea, su "muerte" o pérdida irreversible de su viabilidad).

(También existen agentes físicos esterilizantes, como ya vimos en los dos capítulos

anteriores).

Agentes desinfectantes (o germicidas) son agentes (sobre todo químicos)

antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patógenos (infecciosos) de un

material. Pueden (y en muchos casos suelen) presentar efectos tóxicos sobre tejidos vivos,

por lo que se suelen emplear sólo sobre materiales inertes.

Agentes antisépticos son sustancias químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis

o putrefacción de materiales vivos. Se trata de desinfectantes con baja actividad tóxica

hacia los tejidos vivos donde se aplican.

Quimioterápicos son compuestos químicos con actividad microbicida o microbiostática,

con una toxicidad suficientemente baja como para permitir su administración a un

organismo superior, en cuyos fluidos corporales y tejidos permanece estable un cierto

tiempo a concentraciones tales que los hace eficaces como antimicrobianos dentro del

organismo.


122

II. DESINFECTANTES Y ANTISÉPTICOS

Como se recordará cuando tratamos el tema del calor como agentes esterilizante, la muerte de

una población bacteriana se podía representar como una curva exponencial, expresión de la

cinética de primer orden. Este tipo de cinética también es aplicable a la muerte microbiana

cuando se aplica un agente químico a una concentración suficientemente alta:

Sin embargo, cuando se aplican menores concentraciones del agente, se pueden encontrar

cinéticas diferentes, expresables como curvas sigmoidales:

Como se ve, hay un margen en el que la curva sigue una cinética de primer orden, pero dicha

cinética no se puede extrapolar: obsérvese que a tiempos prolongados la curva se hace casi

paralela al eje de abscisas, lo cual indica que queda una fracción de células viables.

2.1. FACTORES QUE AFECTAN LA POTENCIA DE UN DESINFECTANTE

Concentración del agente y tiempo de actuación

La concentración para obtener un determinado efecto, así como el rango de

concentraciones en que se puede demostrar un determinado efecto, dependen de:

tipo químico del desinfectante,

tipo de microorganismos a eliminar,

método de ensayo del efecto.

Existe una estrecha relación entre la concentración del agente y el tiempo necesario

para matar una determinada fracción de la población bacteriana, según la siguiente

expresión:

K t . cn

Donde C es la concentración del agente, n es el coeficiente de dilución (una constante),

y t es el tiempo de actuación.

Esta ecuación nos dice qué relación existe entre la variación de la concentración del

agente y el tiempo para matar una fracción de la población microbiana.

Por ejemplo:

los fenoles poseen un coeficiente de dilución n = 5 ó 6; ello implica que aun

pequeños cambios en la concentración provocan cambios muy acentuados en el

tiempo para lograr un mismo efecto: así, si reducimos la concentración de fenol

desde un valor dado a su mitad, necesitamos emplear 64 veces más de tiempo para

conseguir matar una misma proporción de bacterias.

En cambio, los hipocloritos (constituyentes de las lejías) tienen coeficiente n = 1, lo

que se refleja en que pequeños cambios en la concentración requieren pequeños

cambios en el tiempo de aplicación.

Finalmente, y refiriéndonos al tiempo, no todas las bacterias mueren al mismo tiempo, ni

siquiera cuando se aplica un exceso del agente (repásense los gráficos anteriores).

Ramirez - Balqui

123

pH.

El pH afecta tanto a la carga superficial neta de la bacteria como al grado de ionización

del agente. En general, las formas ionizadas de los agentes disociables pasan mejor a

través de las membranas biológicas, y por lo tanto son más efectivos.

los agentes aniónicos suelen ser más efectivos a pH ácidos;

los agentes catiónicos muestran más eficacia a pH alcalinos.

Temperatura

Normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la potencia de los desinfectantes.

Para muchos agentes la subida de 10 grados supone duplicar la tasa de muerte. Pero

con el fenol, la subida de 10 grados representa multiplicar por 5 o por 8 la eficacia.

Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a la población

microbiana

Según la especie empleada: p. ej., el bacilo tuberculoso resiste los hipocloritos mejor

que otras bacterias;

Según la fase de cultivo;

Dependiendo de la presencia de cápsulas o de esporas (suelen conferir más

resistencia);

Número de microorganismos iniciales.

Presencia de materiales extraños

La existencia de materia orgánica en el material a tratar (p. ej., sangre, suero, pus)

afecta negativamente a la potencia de los desinfectantes de tipo oxidante (como los

hipocloritos) y de tipo desnaturalizante de proteínas, hasta el punto que pueden llegar a

hacerlos inactivos en cuanto a su poder desinfectante y/o esterilizante.

Los principales mecanismos por los que se pierde actividad son:

adsorción (o sea, absorción superficial) del desinfectante a coloides de proteínas;

formación de complejos inertes o poco activos;

unión de grupos activos del desinfectante a proteínas extrañas.

Ejemplos:

los agentes mercuriales se inhiben por sustancias que lleven grupos sulfhidrilo (-SH).

las sales cuaternarias de amonio se inhiben en presencia de jabones y lípidos.

Por lo tanto, para el empleo eficaz de muchos desinfectantes hay que contar con este

factor, determinando previamente el gasto de materia orgánica inerte, o calculando la

potencia neta del desinfectante en presencia de la materia orgánica.

2.2. DETERMINACION (EVALUACION) DE LA POTENCIA DE UN DESINFECTANTE.

La determinación de la actividad desinfectante de un determinado agente es necesaria

para conocer su posible eficacia. El método primario que se viene empleando desde

hace muchos años es comparar la potencia del compuesto a ensayar con la de un

desinfectante-tipo o estándar, que por motivos históricos es el fenol.


124

Coeficiente fenol o coeficiente fenólico: consiste en la siguiente relación.

min. 5 en no pero min, 10 en ismomicroorgan ese a mata que fenol del dilución máxima

min. 5 en no pero min, 10 en ismomicroorgan un a mata que ntedesinfecta del dilución máxima

En los EEUU, la Administración Federal de Alimentos y Medicamentos (F.D.A.= Food

and Drug Administration) emplea un test oficial para desinfectantes en condiciones

normalizadas, usando una serie de cepas bacterianas concretas, cuya susceptibilidad al

fenol se conoce exactamente:

una cepa concreta de Salmonella typhimurium

una cepa de Staphylococcus aureus

una cepa de Pseudomonas aeruginosa

El método consiste, en esencia, en lo siguiente:

1. un cultivo de una de estas cepas se diluye 10 veces (1/10) en sucesivas diluciones

del desinfectante problema, y se dejan a 20 minutos;

2. de cada una de las diluciones se siembran alícuotas, a los 5 y a los 10 minutos, en

placas de Petri provista con un medio de cultivo adecuado;

3. se determina el coeficiente fenol según la fórmula que hemos expuesto;

4. una vez determinado, se recomienda usar concentraciones 5 veces superiores a las

indicadas por el coeficiente fenol.

Limitaciones de este método:

El coeficiente fenol sólo es indicativo cuantitativamente en desinfectantes

químicamente similares al fenol, y que tengan coeficientes de dilución (n) parecidos.

Aun cuando conozcamos el coeficiente fenol de un compuesto, su valor indicativo se

limita a las diluciones que se hayan empleado en la determinación.

Hay que atender a las condiciones de valoración, ya que como dijimos antes, la

presencia de materia orgánica supone una merma del poder real de desinfección.

Para solucionar algunos de estos inconvenientes se han puesto a punto otros métodos

de valoración:

Prueba de la concentración equivalente

Consiste en determinar la concentración del desinfectante a ensayar que ejerce el

mismo efecto sobre la bacteria de referencia que otra concentración de un

desinfectante-tipo (estándar).

Determinación de la toxicidad del desinfectante

Como se comentó anteriormente, no todos los agentes esterilizantes son aptos como

desinfectantes de tejidos, ya que pueden presentar efectos tóxicos. Por ello, siempre

que se intenta introducir el uso de un nuevo compuesto desinfectante, hay que evaluar

su potencial tóxico, mediante el llamado índice de toxicidad, que es el cociente entre el

poder desinfectante y el poder tóxico

Ramirez - Balqui

125

III. TIPOS DE DESINFECTANTES.

Se suelen clasificar de acuerdo con su mecanismo de acción:

A) AGENTES QUE DAÑAN LA MEMBRANA.

1). Detergentes.

a). acatiónicos

b). aniónicos

c). no iónicos

2). Compuestos fenólicos.

a). fenol

b). cresoles

c). difenilos halogenados

d). alquilésteres del para-hidroxibenzoico

e). aceites esenciales de plantas

3). Alcoholes.

a). etanol

b). isopropanol

B) AGENTES DESNATURALIZANTES DE PROTEINAS.

1). Ácidos y bases fuertes

2). Ácidos orgánicos no disociables

C) AGENTES MODIFICADORES DE GRUPOS FUNCIONALES.

1). Metales pesados

a). mercuriales

b). compuestos de plata

c). compuestos de cobre

2). Agentes oxidantes

a). halógenos

b). agua oxigenada

c). permanganato potásico

d). ácido peracético

3). Colorantes

a). derivados de la anilina

b). derivados de la acridina (flavinas)

4). Agentes alquilantes

a). formaldehido

b). glutaraldehido

c). óxido de etileno

d). -propionil-lactona

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/19_Micro.htm#deter






http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/19_Micro.htm#desnat

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/19_Micro.htm#modifi

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/19_Micro.htm#metal

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/19_Micro.htm#oxi

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/19_Micro.htm#tintur

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/19_Micro.htm#alqui


126

3.1. AGENTES QUE DAÑAN LA MEMBRANA CELULAR.

Los solventes orgánicos (fenoles, alcoholes) y los desinfectantes tensioactivos

(detergentes) dañan la integridad estructural de la membrana (es decir, la disposición

ordenada de lípidos y proteínas), de modo que interfieren con su función, ejerciendo un

efecto neto de

Interferencia con procesos de transporte y metabolismo energético;

Salida de pequeñas moléculas de la célula.

3.1.1. Detergentes (desinfectantes tensioactivos o surfactantes).

Los detergentes sintéticos, al igual que los jabones, contienen una porción

hidrofóbica (normalmente una larga cadena lipófila) y una porción hidrófila (un

grupo polar), lo cual les permite formar micelas en solución acuosa, así como

formar capas que cubren y solubilizan moléculas hidrófobas.

Según sea la porción hidrófila, los detergentes se pueden clasificar en:

Detergentes iónicos:

detergentes catiónicos (grupo activo con carga positiva)

detergentes aniónicos (grupo activo con carga negativa)

Detergentes no iónicos (no suelen tener actividad antimicrobiana).

3.1.1.1. Detergentes catiónicos.

Son los detergentes más potentes en cuanto a su actividad desinfectante,

siendo activos contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Los

principales son los llamados compuestos de amonio cuaternario:

Sales de amonio cuaternario, sobre todo aquellas que van como

cloruros o bromuros. Su fórmula general se puede representar así:

Los cuatro sustituyentes (R1 a R4) del N son cadenas de hidrocarburos

variados. Las sales de amonio cuaternario más activas son aquellas que

tienen tres grupos alquílicos cortos y un grupo alquílico largo: cloruro de

cetilpiridinio, cloruro de benzalconio.

Mecanismo de acción: La porción hidrófoba penetra en las membranas,

mientras que el grupo polar catiónico se asocia con los fosfatos de los

fosfolípidos, provocando alteraciones en dichas membranas, reflejadas en

la pérdida de su semipermeabilidad, con salida de metabolitos de N y P

desde el citosol. Es entonces cuando el detergente puede entrar al interior

celular, con un efecto secundario de desnaturalización de proteínas. Su

actividad se mejora a pH alcalino.

Son rápidamente bactericidas a concentraciones muy bajas (del orden de

una parte por millón, 1 ppm), siempre que en el material a tratar no exista

materia orgánica.

Ramirez - Balqui

127

Usos, ventajas e inconvenientes: Tienen baja toxicidad, por lo que se

pueden emplear como desinfectantes y antisépticos de la piel. Se

emplean igualmente en la desinfección de material de industrias

alimentarias.Su actividad se ve neutralizada por jabones y fosfolípidos,

precipitando en su presencia.

3.1.1.2. Detergentes aniónicos.

Con grupos carboxilo como porción hidrófila:

jabones

saponinas

sales biliares

ácidos grasos disociables

Con grupos sulfato como porción hidrófila:

dodecilsulfato sódico (SDS), también llamado laurilsulfato sódico

sulfonato de alquilbenceno

Mecanismo: Provocan una gran disrupción de membranas, con efectos

de lisis. Son activos sobre todo a pH ácido, preferentemente sobre

bacterias Gram-positivas, pero poco sobre Gram-negativas, ya que éstas

quedan más protegidas por la barrera del lipopolisacárido de la membrana

externa.

Usos: Cuando los detergentes aniónicos se combinan con ácidos, se

logran desinfectantes sanitarios muy potentes (debido al efecto sinérgico

de ambos componentes) y de rápida actuación (unos 30 segundos).

3.1.1.3. Detergentes no iónicos.

No tienen actividad antimicrobiana, pero algunos tienen empleo en otros

campos de la Microbiología: los ésteres del ácido oleico (bajo nombres

comerciales como CarbowaxJ, Tween-80J) pueden adicionarse a medios

de cultivo para evitar la formación de grumos y favorecer el crecimiento

disperso de ciertas bacterias (como Mycobacterium tuberculosis); además

el oleico puede estimular el crecimiento.

3.1.2. Fenoles.

Son rápidamente bactericidas a bajas concentraciones, causando:

daños a membranas, con pérdida de constituyentes citoplásmicos;

inactivación irreversible de oxidasas y deshidrogenasas de membrana;

desnaturalización de proteínas.

Tienen baja solubilidad en agua, por lo que se emplean en fórmulas que incluyen

agentes emulsificadores (jabones) que, además, aumentan su actividad.


128

3.1.2.1. Fenol.

El fenol o ácido carbólico, históricamente uno de los primeros

desinfectantes en usarse, sólo se emplea en la actualidad como patrón

para ensayar el poder desinfectante de otros compuestos.

A partir del fenol se pueden lograr desinfectantes con mayor actividad

antibacteriana y con menor toxicidad sustituyendo hidrógenos del anillo

bencénico por radicales alquílicos o por halógenos. Hé aquí algunos

ejemplos:

3.1.2.2. Cresoles.

Son los alquil-fenoles. El radical alquílico puede estar en posición orto,

meta o para, dando respectivamente el orto-cresol, el meta-cresol y el para-

cresol. Normalmente se emplea la mezcla de los tres, denominada

tricresol.

Se obtienen por destilación del alquiltrán de carbón, y se emplean como

emulsiones de jabón verde bajo los nombres comerciales de Lysol J y

Creolín J.

Se usan como desinfectantes de material de desecho bacteriológico y

como desinfectantes de la piel.

3.1.2.3. Difenilos halogenados.

El hexaclorofeno (hexacloro-orto-difenilmetano) es bacteriostático a bajas

concentraciones (sobre todo contra cocos Gram-positivos), incluso

incorporado en jabones, pasta de dientes y cosméticos.

Algunas marcas comerciales incluían hace unos años este compuesto,

hasta que se comprobó que su absorción por la piel, sobre todo inflamada,

puede causar neurotoxicidad e incluso, toxicidad sistémica, por lo que en la

actualidad ha dejado de usarse.

3.1.2.4. Alquilésteres del para-hidroxibenzoico.

Actúan de forma similar a los alquilfenoles, pero no son tóxicos, debido a

que al ser ingeridos, se hidrolizan rápidamente, dando el inocuo para-

hidroxibenzoato.

Se emplean como conservantes de alimentos y de productos

farmacéuticos.

3.1.2.5. Ciertos aceites esenciales de origen vegetal.

Desde la antigüedad, y de modo empírico, se vienen usando algunos

aceites esenciales de plantas aromáticas como conservantes y

antisépticos, ya que como se ha podido comprobar, contienen varios

compuestos fenólicos:

Ramirez - Balqui

129

el timol (de Thymus, los tomillos);

el eugenol se emplea en odontología como antiséptico.

3.1.3. Alcoholes.

Los alcoholes desorganizan las bicapas lipídicas penetrando en la región

hidrocarbonada de los lípidos. No afectan a las endosporas, por lo que no son

esterilizantes. Su acción desinfectante mejora conforme aumenta la longitud de la

cadena alifática de los alcoholes, hasta aquellos con 8 a 10 átomos de carbono

(C8-C10), ya que los alcoholes de cadenas más largas de C10 tienen una baja

solubilidad en agua.

3.1.3.1. Etanol (CH3-CH2OH).

Se emplea en desinfección de la piel antes de inyecciones cutáneas, así

como en desinfección de los termómetros clínicos, siempre que se deje el

tiempo suficiente de contacto. Es más efectivo en soluciones acuosas entre

50-70%, ya que para su mejor acción se implica la intervención del agua. A

100% de pureza es poco efectivo.

3.1.3.2. Isopropanol.

Es menos volátil y más efectivo que el etanol. Se emplea igualmente en

desinfección de termómetros. Sin embargo, su efecto tóxico (narcótico) es

mayor y más duradero que aquel.

3.2. AGENTES DESNATURALIZANTES DE PROTEINAS.

3.2.1. Ácidos y álcalis fuertes.

Son activamente bactericidas, debido a sus grupos H+ y OH

- disociados,

respectivamente. En principio, su actividad es proporcional al grado de

disociación, pero algunos hidróxidos son más potentes de lo sugerido por su

mero grado de disociación, debido a la acción tóxica directa que puede ejercer el

catión metálico.

Existen ciertas especies bacterianas que resisten relativamente bien la acción de

bases fuertes. Tal es el caso del bacilo tuberculoso. Esto se aprovecha para

aislarlo y purificarlo: se licúa un esputo de enfermo sospechoso en una solución

1M de sosa (NaOH) y se deja 30 minutos antes de sembrar. Bajo estas

condiciones, prácticamente sólo sobrevive el Mycobacterium tuberculosis.

3.2.2. Ácidos orgánicos.

Los ácidos orgánicos, que son poco disociables, ejercen sus efectos en cuanto a

moléculas intactas (sin disociar), que penetran a la célula.

El ácido benzoico y el ácido sórbico se usan ampliamente como conservantes

alimentarios.

Ciertos ácidos (como el acético, láctico, propiónico) aparecen en alimentos

fermentados, actuando como conservantes naturales. Estos mismos, así como el


130

cítrico se pueden añadir a otros tipos de alimentos, para prolongar el periodo de

posible almacenamiento de los productos.

3.2.3. El ácido bórico se ha usado como conservante (a veces ilegal) de alimentos,

así como en oftalmología.

3.3. AGENTES MODIFICANTES DE GRUPOS FUNCIONALES DE PROTEINAS Y DE

ACIDOS NUCLEICOS.

Esta amplia clase de agentes se caracteriza, en general, por los siguientes efectos:

alteran grupos que forman parte de los centros activos de enzimas y otras proteínas;

alteran grupos funcionales de ácidos nucleicos, componentes de pared y de

membrana.

Como ya vimos en la clasificación de agentes desinfectantes, dentro de este grupo se

distinguen a su vez:

1. metales pesados

2. agentes oxidantes

3. tinturas de colorantes

4. agentes alquilantes

3.3.1. Metales pesados.

Las sales solubles de Hg, As, Ag, Cu, etc., "envenenan" la actividad enzimática

formando mercáptidos con los grupos -SH de la cisteína. También interaccionan

con -NH2, -COOH y radicales fosfato.

Los más efectivos son los derivados del mercurio y de la plata (actúan a menos

de 1 ppm).

3.3.1.1. Mercuriales. Se vienen usando desde antiguo en Medicina.

Cloruro de mercurio (HgCl2). En solución al 0,1% fue muy usado como

desinfectante potente, pero es muy tóxico, y apenas se emplea en la

actualidad.

Compuestos orgánicos de mercurio (como el Mercurocromo, la

Mercromina, el Mertiolato): No son totalmente fiables como

desinfectantes y presentan cierta (aunque baja) toxicidad, pero se

emplean mucho como antisépticos de la piel y de heridas.

Sales de fenilmercurio. Son potentes inhibidores no sólo de bacterias,

sino de levaduras, hongos y algas. Se usan especialmente en el control

de posibles contaminantes microbianos (p. ej., bacterias oportunistas del

género Pseudomonas) en productos farmacéuticos, cosméticos y

oftalmológicos.

Ramirez - Balqui

131

3.3.1.2. Compuestos de plata.

Bien sea en forma de sales solubles, o en preparaciones coloidales, los

compuestos de plata se usan ampliamente como antisépticos, aunque

están restringidos, al tener efectos irritantes y cáusticos.

Nitrato de plata (AgNO3). Es muy bactericida frente al gonococo

(Neisseria gonorrhoeae), y por ello se usa habitualmente para prevenir la

oftalmia gonocócica del recién nacido.

Coloides orgánicos de plata. En ellos los iones Ag+ se van liberando

lentamente. Tienen efectos bacteriostáticos, y encuentran su principal

aplicación en oftalmología.

Cremas de nitrato de plata y sulfodiazina de plata. Usadas para el

tratamiento de quemaduras, han reducido notablemente la mortalidad

derivada de las grandes quemaduras.

3.3.1.3. Sales y compuestos de cobre.

No tienen aplicación en Bacteriología Médica, pero se emplean en

Agricultura para el control de hongos y algas.

3.3.2. Agentes oxidantes.

Los efectos de los agentes oxidantes que se tratan a continuación son la

inactivación de proteínas enzimáticas (convirtiendo los radicales -SH en

disulfuros -S-S-). Además, los más potentes también atacan radicales amino, el

grupo indol (presente en el triptófano), y la tirosina.

3.3.2.1. Halógenos.

Son bactericidas muy útiles y muy potentes. El iodo no tiene parangón

como desinfectante de la piel, y el cloro no tiene igual en el tratamiento

de aguas.

Yodo: Aparte de su efecto oxidante, se combina irreversiblemente con

residuos de tirosina de las proteínas. Sus principales presentaciones son

la tintura de iodo y los iodóforos.

Tintura de iodo: es una mezcla de 2% de I2 + 2% de IK en alcohol de

70%. Su máximo efecto bactericida lo tiene a pH<6. Es un magnífico

antiséptico de la piel, de hecho el mejor de los conocidos, pero tiene un

efecto doloroso y cáustico en heridas abiertas.

Iodóforos: son mezclas de iodo con agentes tensioactivos

(detergentes), en los que éstos actúan como portadores del iodo, al que

van liberando lentamente, sin provocar irritación. También se emplean

en desinfección de instalaciones de industrias alimentarias.


132

Cloro. El cloro fue uno de los primeros antisépticos en usarse (antes de

conocerse su mecanismo, e incluso antes de que se supiera el auténtico

papel de los microorganismos en las enfermedades infecciosas). Holmes

(Boston, 1835) y Semmelweiss (Viena, 1847) lo introdujeron en la

práctica de los médicos y matronas para impedir la transmisión de la

sepsis puerperal, que era contagiada de mujer a mujer por las manos de

los doctores y de las parteras, y que era una notable causa de

mortalidad de mujeres durante muchos siglos.

El cloro se presenta bajo las formas de Cl2 (gaseoso), hipocloritos y

cloraminas. El efecto desinfectante se debe a la liberación de cloro libre

(Cl2); a su vez, el Cl2 reacciona con el agua para dar ácido hipocloroso,

que a pH ácido o neutro es un oxidante fuerte:

Cl2 + H2O → ClOH + H+ + Cl

-

(ClO)2Ca + H2O → Ca++

+ H2O + 2 ClO-

(ClO)2Ca + 2H2O → Ca(OH)2 + 2 ClOH

La disociación del ácido hipocloroso depende del pH (se realiza a pH<7)

ClOH → H+ + ClO

-

Cloro gaseoso: a 1-3 ppm se usa en la cloración de aguas para bebida

y de aguas de piscinas. Su actividad se ve muy influida (mermada) por la

presencia de materia orgánica; por ello, se suele determinar la demanda

de cloro del agua a tratar. Descontada dicha demanda, el cloro gaseoso

mata rápidamente (15-30 segundos) a sólo 1 ppm.

Soluciones de hipocloritos: hipocloritos de sodio, de calcio o de litio. A

200 ppm de cloro se usan ampliamente, ya como líquidos (lejías), o en

polvo, en industrias alimentarias y lácteas (para desinfectar el

equipamiento y maquinaria que ha de entrar en contacto con los

alimentos a procesar), en restaurantes, hoteles, hospitales, etc.

3.3.2.2. Agua oxigenada.

El peróxido de hidrógeno (H2O2), en solución al 3%, se usó en otro

tiempo como desinfectante, pero está actualmente en desuso, debido a

que algunas bacterias son resistentes, por la posesión de catalasas y

peroxidasas. Además, en desinfección de heridas abiertas su efecto es

muy pobre, porque el agua oxigenada es descompuesta por la catalasa

tisular.

Se emplea en la desinfección de lentillas blandas, dejando tiempo

suficiente de actuación. También, en desinfección de superficies inertes

y equipos quirúrgicos.

Ramirez - Balqui

133

3.3.2.3. Permanganato potásico (K3MnO4).

Al 1%, se usa como antiséptico uretral.

3.3.2.4. Acido peracético (CH3-CO-O-OH).

Es un fuerte agente oxidante. En forma de vapor se usa en la

esterilización de cámaras de cría de animales libres de gérmenes.

3.3.3. Tinturas de colorantes básicos.

Algunos colorantes derivados de la destilación del alquitrán de carbón, sobre

todo los trifenilmetanos y las acridinas, no sólo tiñen las bacterias (recuérdense

las prácticas), sino que también actúan como antibacterianos, incluso a

pequeñas concentraciones. Los colorantes básicos son los más efectivos.

En general, su mecanismo depende de su afinidad hacia los grupos fosfato

(ácidos) presentes en las nucleoproteínas.

Encuentran su uso como antisépticos de lesiones dermatológicas, infecciones de

la piel y pequeñas heridas.

Su principal inconveniente es que muchos de ellos se inactivan en presencia de

suero y otras proteínas.

3.3.3.1. Colorantes de trifenilmetano:

Son derivados de la anilina. Entre ellos se encuentran el verde brillante,

el verde malaquita, el violeta de genciana, el violeta cristal y la fuchsina

básica.

Son muy selectivos hacia bacterias Gram-positivas, sobre las que son

efectivos a sólo 0,2-2 ppm. En cambio, las Gram-negativas suelen ser

resistentes, debido a su membrana externa.

El efecto antibacteriano se debe a la pseudobase, que es más lipófila

que el respectivo catión, y bajo esa forma accede al interior celular,

donde se une a los grupos fosfato de los ácidos nucleicos.

3.3.3.2. Colorantes derivados de la acridina (llamados flavinas, por su color

amarillento -Lat: flavus-).

Los ejemplos típicos son la acriflavina, la proflavina y la tripoflavina.

Interfieren en la biosíntesis de ácidos nucleicos (intercalándose en la

doble hélice del ADN) y proteínas. Son bactericidas y bacteriostáticos

sobre una gran diversidad de bacterias.

A diferencia de las anilinas, ejercen su acción también en presencia de

materiales como suero, pus, etc.

Su uso principal es la antisepsia de heridas.


134

3.3.4. Agentes alquilantes.

Son agentes esterilizantes, activos tanto sobre células vegetativas como sobre

esporas, que ejercen su efecto letal por su acción alquilante de proteínas y

ácidos nucleicos.

3.3.4.1. Formaldehido (HCHO).

La alquilación la produce reemplazando hidrógenos lábiles de ciertos

grupos químicos (-NH2, -OH, -COOH y -SH), produciendo: hidroximetilaciones

condensaciones (entrecruzamientos).

Usos comerciales: como gas, en la descontaminación de habitaciones;

como formalina (solución acuosa al 35%);

como paraformaldehido (polímero sólido de 91-99% de pureza).

La formalina se emplea para preservar tejidos, en líquidos de

embalsamamiento, y al 0,2-0,4% en la preparación de vacunas de virus.

3.3.4.2. Glutaraldehído.

Es menos tóxico y más potente que el formaldehído, y no se afecta por

materiales con proteínas. Cada vez se emplea más como esterilizante

frío de instrumental quirúrgico. Es el único recomendado para esterilizar

equipamiento de terapia respiratoria.

3.3.4.3. Oxido de etileno.

Tiene un efecto similar al del formaldehído: Sustituciones y

entrecruzamientos irreversibles en grupos amino, sulfhidrilo, etc., de

proteínas. También reacciona con grupos fosfato y anillos nitrogenados

de los ácidos nucleicos. Es un agente empleado como esterilizante gaseoso, aunque es de

acción lenta. Se emplea cuando no se puede recurrir a la esterilización

por calor: esterilización de material de plástico, drogas, ciertos productos

biológicos, equipamiento electrónico. La operación se realiza en

cámaras parecidas al autoclave. Sin embargo, es un método caro y

exhibe ciertos riesgos: presenta acción vesicante y toxicidad para el

hombre (mutágeno y carcinógeno).

3.3.4.4. -propionil-lactona.

Es 25 veces más activa que el formaldehído. Actúa como gas en

presencia de 80-90% de humedad relativa, aunque es poco penetrante.

IV. QUIMIOTERÁPICOS DE SÍNTESIS Y ANTIBIÓTICOS. INTRODUCCIÓN

Los quimioterápicos son sustancias con actividad antimicrobiana (microbicida o

microbiostática) con toxicidad suficientemente baja como para poder ser administrados a un

Ramirez - Balqui

135

organismo por la vía adecuada, hasta alcanzar y mantener concentraciones eficaces en los

tejidos. Recordemos aquí esta página notable de la historia de la Microbiología:

1900-15 Ehrlich concibe la idea de usar compuestos químicos de

síntesis como "balas mágicas" selectivas hacia

microorganismos, pero inofensivas para las personas o

animales superiores. En 1909 descubre que el salvarsán es

efectivo contra la sífilis. Acuña el término "quimioterapia".

1932-35 Domagk, siguiendo los pasos de Ehrlich, descubre la acción

del rojo de prontosilo (la primera sulfamida) sobre el

neumococo y otros estreptococos in vivo.

1940 Woods descubre el mecanismo de acción de las sulfamidas.

Estamos en plena "Edad de oro de la Quimioterapia de

síntesis".

1929 Fleming descubre la penicilina, el primer antibiótico natural,

pero fracasa en su intento de purificarlo. La industria

farmacéutica se muestra "indiferente".

1940 Chain y Florey purifican la penicilina.

1944 Waksman, un microbiólogo de suelos, ha iniciado una

búsqueda de microorganismos productores de antibióticos.

Descubre la estreptomicina. Comienza la época dorada de los

antibióticos (quimioterápicos naturales), y la búsqueda racional

rinde decenas de nuevos antimicrobianos procedentes de

Actinomicetos, otras bacterias y hongos.

V. QUIMIOTERÁPICOS DE SÍNTESIS

5.1. INHIBIDORES EN LA RUTA DE BIOSINTESIS DEL TETRAHIDROFOLATO (THF).

La ruta biosintética del ácido tetrahidrofólico está ilustrada en la Fig.1. El THF es lo que

se denomina habitualmente "donador de unidades de 1 átomo de carbono", y los seres

vivos lo requieren en ciertas rutas biosintéticas:

biosíntesis de los aminoácidos Met, Gly. Además, las Eubacterias lo necesitan para el

grupo formilo del fMet-ARNt (el ARN transferente que incorpora la formil-metionina al

comienzo de la proteína).

Biosíntesis de las purinas y pirimidinas, y sobre todo del dTMP.

Biosíntesis del pantoténico.

Como veremos a continuación, sobre algunos pasos de esta ruta actúa una serie de

agentes quimioterápicos, muchos de ellos con gran importancia clínica.

5.1.1. SULFAMIDAS (SULFONAMIDAS).

Como ya hemos comentado, su descubrimiento y la comprobación de su acción

quimioterápica, marcaron el comienzo de la Quimioterapia con criterios racionales.

Despertaron gran interés cuando se mostró que su mecanismo de acción depende

del hecho de que funcionan como análogos de metabolitos, actuando como

inhibidores competitivos respecto de cierta enzima.


136

Domagk (1935), siguiendo la estela de Ehrlich, descubre que el Rojo de Prontosilo

confiere protección a ratones inoculados experimentalmente con estreptococos.

Sin embargo, se vio que este mismo compuesto no inhibía a los mismos

estreptococos in vitro, es decir, en tubo de ensayo o en placas de Petri. ¿Cuál era

la razón de este disimilar comportamiento de esta sustancia in vivo e in vitro? La

explicación la encontró el matrimonio Tréfouël (que a la sazón trabajaba en el

Instituto Pasteur): el metabolismo de los ratones rompe el Rojo de Prontosilo, que

por sí mismo es inactivo contra las bacterias, generando el compuesto activo (con

actividad antibacteriana): la sulfanilamida (para-aminobencenosulfonamida).

A partir de la sulfanilamida se sintetizaron desde entonces gran número de

derivados por sustitución de uno de los hidrógenos del grupo sulfonamida,

formando estos derivados la llamada familia de las sulfamidas.

Ejemplos:

sulfapiridina (por unión del grupo piridina)

sulfatiazol (con el grupo tiazol)

sulfadiazina (con el grupo pirimidina)

sulfaguanidina.

Lo que tienen en común las sulfamidas con actividad antibacteriana es:

tener libre el grupo amino en para (o, como le ocurre al rojo de Prontosilo, que

quede libre en el organismo hospedador como consecuencia de algún

procesamiento metabólico);

grupo sulfona (-SO2-) unido al anillo bencénico;

La sustitución del grupo amido unido a la sulfona, aunque no modifica

sustancialmente la actividad antibacteriana, puede suponer una serie de ventajas

de tipo farmacológico:

disminuir la toxicidad hacia el organismo hospedador;

aumentar su solubilidad en agua;

mejorar la absorción del compuesto por el intestino (lo que permite

administración vía oral);

mayor persistencia de la sulfamida en el organismo (excreción más lenta), lo

que permite dar menos dosis para lograr el mismo efecto.

La introducción de las sulfamidas en los años 40 supuso un gran éxito en el

tratamiento de enfermedades provocadas por cocos Gram-positivos (infecciones

estreptocócicas y neumonías por el neumococo). Aunque la "época dorada de las

sulfamidas" ya ha pasado (debido sobre todo al ulterior descubrimiento de

antibióticos naturales), hoy día siguen empleándose en el tratamiento de

infecciones de las vías urinarias, algunas formas de meningitis, y en Veterinaria.

Ramirez - Balqui

137

Mecanismo de acción de las sulfamidas (descubierto por Woods y cols. en

1940):

Las sulfamidas tienen un efecto bacteriostático. Su acción antibacteriana se

debe al hecho de que funcionan como análogos estructurales del ácido para-

aminobenzoico (PABA), inhibiendo competitivamente por el acceso a la enzima

dihidropteroil-sintetasa.

Como se puede ver, la dihidropteroil-sintetasa cataliza la condensación del

PABA con el 2-amino,4-hidroxi, 6-hidroximetil dihidropteroil-pirofosfato, que

lleva a la síntesis de ácido dihidropteroico (una de las fases intermedias de la

síntesis del tetrahidrofólico -THF). En la figura se puede apreciar que el PABA y

las sulfamidas son muy parecidas. De hecho, la sulfamida es usada por la

enzima como un sustrato alternativo al PABA. En este caso, la enzima

cataliza una reacción que genera un producto que no puede actuar como

intermediario en los siguientes pasos de la ruta de síntesis del THF.

Los microorganismos son sensibles a las sulfamidas porque sus necesidades

de THF las han de satisfacer sintetizándolo a partir de PABA usando la ruta de

la que estamos hablando. Sin embargo, los animales son resistentes, debido a

que carecen de esta ruta, y en cambio, se aprovisionan de fólico directamente

en su dieta. Pero áun más: en teoría el ácido fólico de la dieta del organismo

hospedador podría anular el efecto terapéutico si fuera captado por la bacteria,

pero en la realidad esto no ocurre, porque el fólico no puede entra a la célula

bacteriana.

El notable éxito terapéutico de las sulfamidas, junto con el desentrañamiento de

su mecanismo de acción, condujo durante los años 40 y 50 a una gran línea de

investigación consistente en sintetizar compuestos que fueran análogos de

factores bacterianos de crecimiento, con la esperanza de "diseñar"

racionalmente nuevos quimioterápicos. Sin embargo, el gran esfuerzo de

búsqueda no rindió apenas frutos. Y la razón hay que buscarla de nuevo en la

excepcional confluencia de hechos que acabamos de citar para las sulfamidas

y que hacen que las sulfamidas funcionan tan bien: inhibición competitiva,

presencia de la ruta en bacterias pero ausencia en animales, la no entrada del

fólico en bacterias pero sí en las células animales. Esta "suerte" no ha

acompañado cuando se ha investigado el posible potencial de análogos de

otros metabolitos.

5.1.2. SULFONAS.

Son derivados de la dapsona (4,4'-diamino-difenilsulfona). Aunque no se usa

contra infecciones normales, ha encontrado una importante aplicación en el

tratamiento de la lepra (producida por Mycobacterium leprae); de hecho es el

quimioterápico de elección para esta enfermedad. Probablemente su mecanismo

de acción esté basado en actuar como competidor del PABA.

5.1.3. PARA-AMINOSALICILICO (PAS).

Es uno de los agentes que se emplean para el tratamiento de la tuberculosis

(provocada por Mycobacterium tuberculosis). Alcanza el interior de los monocitos


138

y macrófagos, que son las células donde penetra el bacilo tuberculoso (que es un

parásito intracelular)

Al igual que el PAS, las sulfonas parecen actuar como competidores del PABA,

pero se desconoce la razón por la que estos dos compuestos sean tan específicos

de las especies patógenas de Mycobacterium.

5.1.4. INHIBIDORES DE LA DIHIDROFOLATO-REDUCTASA (DHFR).

El último paso en la síntesis del THF es la reducción del dihidrofólico (DHF),

catalizado por la dihidrofolato-reductasa (DHFR). Esta reacción es inhibida por dos

quimioterápicos:

el metotrexato, que al ser tóxico no encuentra aplicación clínica;

el trimetoprím, que tiene un uso clínico, sobre todo en terapia sinérgica junto

con el sulfometoxazol (una sulfamida). Este doble quimioterápico se emplea

contra infecciones urinarias recurrentes, bronquitis crónicas por neumococos, y

algunas infecciones de Salmonella y Shigella.

Tienen efectos bactericidas, con alta afinidad hacia la enzima DHFR bacteriana,

pero baja hacia la DHTR de animales. Esto deriva del hecho de que, aunque la

mayor parte de los seres vivos tienen DHFR, la enzima bacteriana difiere en

estructura respecto de la de mamíferos.

Existen inhibidores específicos de las versiones de la DHFR de ciertos protozoos

parásitos: así por ejemplo, la pirimetamina y el proguanil se usan contra

Plasmodium, el agente de la malaria. Incluso el metotrexato se puede emplear en

el tratamiento de ciertos cánceres.

5.2. ISONIAZIDA.

Es la hidrazida del ácido isonicotínico (también conocida por sus iniciales inglesas, INH).

Como se puede ver, es un análogo estructural de dos vitaminas: la nicotinamida y el

piridoxal.

e incluso

intracelularmente, lo que permite su empleo contra las especies patógenas de

Mycobacterium, y en general contra bacterias ácido-alcohol resistentes (Nocardia,

Corynebacterium).

Mecanismo de acción: Ejerce varios efectos, probablemente debido a mecanismos

pleiotrópicos (relacionados entre sí):

interferencia -por mecanismo aún desconocido- con la biosíntesis de la pared celular

de las bacterias AAR, que conduce a desorganizar los ácidos micólicos;

actuación como antimetabolito de nicotinamida y piridoxal;

activación de la NAD-asa, lo que conduce a reducir el "pool" de NAD.

Ramirez - Balqui

139

5.3. QUINOLONAS.

El ácido nalidíxico (4-oxo, 8-azaquinolina) se sintetizó en 1962, y encontró su aplicación

en el tratamiento de infecciones por Gram-negativas del tracto urinario, donde se

concentra.

Recientemente se han sintetizado las llamadas fluoroquinolonas, como por ejemplo el

ciprofloxacín. Presentan 600 veces más actividad que el nalidíxico, y actualmente se

recetan frecuentemente como quimioterápicos de amplio espectro.

Mecanismo de acción: Las quinolonas bloquean la ADN-girasa, uniéndose a la

subunidad de tipo A. Recordemos que las bacterias poseen una clase especial de

topoisomerasas de tipo II, llamadas girasas, que introducen superenrollamiento negativo

en la doble hélice del ADN. La ADN-girasa está constituida por dos subunidades de tipo A

y dos de tipo B (A2B2); las de tipo A producen los cortes y empalmes sucesivos en la

doble cadena, mientras que las subunidades B son ATPasas que proporcionan la energía

para la reacción.

El bloqueo de las quinolonas sobre la girasa supone que ésta queda "congelada" en la

fase en que el ADN está unido al enzima. Ello provoca la acumulación de roturas de

doble cadena, lo que conduce a la muerte de la bacteria.

En la sección 3.5 de este capítulo (sobre antibióticos que inhiben el metabolismo de los

ácidos nucleicos) veremos algunos que actúan sobre las subunidades de tipo A.

5.4. NITROFURANOS.

Los nitrofuranos, como por ejemplo la nitrofurantoína, tienen efecto contra Gram-positivas

y Gram-negativas, sobre todo en la orina, siendo poco efectivos en otros fluidos

corporales.

5.5. 5-FLUOROCITOSINA (FLUCITOSINA, 5FC).

Es un análogo estructural de la citosina, interfiriendo con la síntesis de ADN y ARN. Su

aplicación es como antifúngico, sobre todo contra infecciones por algunas levaduras.

VI. ANTIBIÓTICOS.

Los antibióticos son sustancias normalmente de bajo peso molecular producidas por seres

vivos (antibióticos naturales) o modificadas artificialmente a partir de ellas (antibióticos

semisintéticos), que a pequeñas concentraciones tienen efectos antimicrobianos (microbicidas

o microbiostáticos), tras ser administrados por vía adecuada a un organismo receptor.

La mayor parte de los antibióticos proceden del metabolismo secundario de microorganismos

procariotas (actinomicetos, Bacillus, etc.) o eucariotas (hongos de los géneros Penicillium,

Cephalosporium, etc.).

Se conocen unos 5 000 antibióticos distintos, y cada año se descubre unos 300 nuevos. Su

importancia económica se pone de manifiesto al pensar en las 100.000 TM de antibióticos

producidas al año, por un valor equivalente a 400.000 millones de pesetas.


140

La mayor parte de los antibióticos comerciales se emplean para tratar enfermedades de

etiología bacteriana, aunque algunos se usan contra hongos y levaduras, y unos pocos

presentan actividad antitumoral.

Desde el punto de vista químico, se clasifican en grandes familias:

antibióticos que contienen carbohidratos;

lactonas macrocíclicas;

quinonas y compuestos relacionados;

antibióticos peptídicos y con aminoácidos;

heterociclos del N;

heterociclos del O;

aromáticos;

alifáticos;

etc.

La mayoría de los antibióticos son moléculas complejas, con regiones hidrofóbicas que facilitan

el transporte al interior celular. Muchos poseen varios anillos, algunos de los cuales mejoran la

interacción de la molécula con su diana macromolecular.

Para estudiarlos es más útil agrupar a los antibióticos no por clases según su naturaleza

química, sino en función de las "dianas" sobre las que actúan y con las que interfieren:

A) antibióticos que interfieren con la biosíntesis de la pared celular

B) antibióticos que actúan sobre la membrana celular

C) antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas

D) antibióticos que actúan sobre la síntesis de ácidos nucleicos.

Los antibióticos más abundantes, y los mejor estudiados, son los que interfieren con enzimas

de la biosíntesis del peptidoglucano de las eubacterias, y los que interfieren con la función del

ribosoma.

6.1. INHIBIDORES DE LA BIOSINTESIS DE LA PARED CELULAR BACTERIANA.

6.1.1. FOSFOMICINA (FOSFONOMICINA).

Este antibiótico de estructura muy simple está producido por Streptomyces fradiae. Su

acción inhibitoria es ejercida a nivel de la primera reacción de la síntesis del PG, a saber,

impidiendo la condensación reductora del UDP-NAG con el PEP para dar UDP-NAM. Ello

lo logra uniéndose con la enzima transferasa correspondiente, inactivándola.

Aunque tiene baja toxicidad para organismos superiores, apenas ha encontrado

aplicación en la clínica (se empleó en España, pero no está admitido en los EE UU).

6.1.2. CICLOSERINA.

Producido por Streptomyces orchidaceus, este antibiótico muestra cierto parecido

estructural con la D-alanina, lo que explica el hecho de que actúa como inhibidor

competitivo de las dos reacciones secuenciales de la síntesis del PG donde

aparece la D-ala:

Ramirez - Balqui

141

inhibe la racemasa que cataliza la conversión de L-ala en D-ala;

inhibe la D-alanil-D-alanina sintetasa (que condensa dos D-ala para dar el

dipéptido D-ala-D-ala).

La cicloserina tiene mayor afinidad que el sustrato natural (D-ala) hacia las dos

enzimas.

Es un antibiótico de amplio espectro, pero apenas se emplea clínicamente, debido

a su neurotoxicidad. Se recurre a él sólo para tratar ciertos casos de tuberculosis,

en combinación con otros antibióticos.

6.1.3. VANCOMICINA.

Es un glucopéptido complejo producido por Streptomyces orientalis. Se une rápida

e irreversiblemente con el extremo D-alanil-D-alanina del pentapéptido del

precursor del PG que se halla unido al undecaprenil-P (a nivel de membrana

citoplásmica), de modo que inhibe la reacción de transglucosidación.

Es un antibiótico de espectro estrecho, bactericida frente a muchas bacterias

Gram-positivas. Recientemente se está usando frente a infecciones severas de

Staphylococcus aureus y de Streptococcus pneumoniae que sean resistentes a

otros antibióticos. Es la droga de elección ante colitis asociadas a antibióticos

ocasionadas por Clostridium difficile.

6.1.4. RISTOCETINA.

Es un antibiótico parecido al anterior, producido por Nocardia lurida, y que, al igual

que la vancomicina inhibe la transglucosidación, siendo activo frente a Gram-

positivas.

6.1.5. BACITRACINA-A.

Producida por Bacillus subtilis variedad "tracy" (de ahí su nombre), es un

antibiótico polipeptídico provisto de un anillo tiazol, bactericida frente a muchos

Gram-positivos así como frente al Gram-negativo Neisseria. Es demasiado tóxico

(sobre todo nefrotóxico) como para ser administrado sistémicamente, pero tiene

uso tópico (p. ej., en cirugía del colon).

Su mecanismo de acción estriba en que se une al pirofosfato del undecaprenil-P-

P, e impide su regeneración hasta undecaprenil-P por la fosfatasa específica; por

lo tanto, evita la reentrada del undecaprenil-P en el ciclo biosintético del PG.

6.1.6. ANTIBIOTICOS -LACTAMICOS.

Todos los antibióticos de este grupo contienen un anillo característico: el anillo -

lactámico.

Todos los subgrupos de -lactámicos se pueden considerar derivados de un

núcleo químico en el que, además del anillo lactámico puede existir un heterociclo

conjugado:


142

Núcleo Ejemplos

Penám Penicilinas

Cefén Cefalosporinas

Carbapenem Tienamicina

Oxacefén Moxalactam

Clavám Clavulánico

Monobactam aztreonám

PENICILINAS

Como ya sabemos, las penicilinas fueron los primeros antibióticos naturales en

descubrirse, pero en general, todos los ß-lactámicos tienen el mismo mecanismo

de acción. Nos concentraremos en estudiar las penicilinas.

El grupo común a todas las penicilinas es el ácido 6-aminopenicilánico (6-APA),

que en realidad es un dipéptido ciclado por condensación de L-cys y D-val, que

genera el anillo ß-lactámico (anillo A) y el anillo tiazolidínico (anillo B). Las

penicilinas se pueden considerar derivadas del 6-APA, sustituyendo el hidroxilo (-

OH) del grupo carboxilo por un radical acilo (R). Este radical acilo es variable de

unas penicilinas a otras. La variación se puede lograr de dos maneras principales:

modificando el medio de cultivo donde se hace crecer la cepa del hongo

Penicillium.

por transformaciones químicas "in vitro", lo que genera las llamadas penicilinas

semisintéticas.

La penicilina natural, purificada por primera vez en los años 40, es la penicilina-G

(o benzil-penicilina), en la que el radical acilo es el grupo bencilo (fenilacético).

Esta penicilina presenta una serie de limitaciones e inconvenientes:

tiene un espectro estrecho: actúa frente a estreptococos del grupo A y otros

cocos Gram-positivos, pero no frente a la mayoría de bacterias Gram-

negativas.

Es sensible a ácidos, por lo que no puede ser administrada vía oral (se inactiva

a su paso por el estómago).

Es susceptible a enzimas inactivadoras (penicilinasas) producidas por muchas

bacterias.

Se elimina rápidamente por la orina (no permanece mucho tiempo en el

organismo receptor).

En algunos individuos puede provocar respuestas de hipersensibilidad (alergia

a la penicilina).

Para solventar estos problemas se fueron "creando" variantes de esta penicilina

que mejoraban algunas de sus cualidades. Por ejemplo, manipulando el medio de

cultivo del hongo se pudo lograr la llamada penicilina-V (fenoximetil-penicilina),

que es más resistente a bajos pH. Sin embargo, las más recientes generaciones

de penicilinas son semisintéticas. Para obtenerlas se partir del núcleo del 6-APA.

Ramirez - Balqui

143

El 6-APA se puede obtener de dos modos distintos:

cultivando el hongo en medio carente de ácidos grasos (lo que evita la adición

de radical acilo);

o bien partiendo de penicilina G, y digiriéndola con amidasas específicas que

producen el 6-APA.

Una vez obtenido el 6-APA, éste se hace reaccionar químicamente con un

compuesto carboxílico. Dependiendo del compuesto en cuestión, se obtiene una

amplia variedad de penicilinas semisintéticas, con propiedades mejoradas:

con más amplio espectro de acción;

con más tiempo de permanencia en suero y fluidos corporales;

con resistencia a penicilinasas y en general -lactamasas;

resistentes pH ácido, y por lo tanto susceptibles de ser administradas vía oral.

Estas penicilinas semisintéticas se pueden englobar en tres grupos principales:

1). resistentes a penicilinasas.Se usan sobre todo frente a cocos Gram-

positivos (Staphylococcus aureus, S. epidermidis).

2). De espectro ampliado. Permiten un uso efectivo frente a muchas bacterias

Gram-negativas (Haemophilus influenzae, E. coli, Proteus, Salmonella,

Shigella, etc.).

Dentro de este grupo, destacamos las "aminopenicilinas", como la ampicilina,

o la amoxicilina: el grupo -NH2 del radical acilo permite que estas penicilinas

puedan atravesar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas.

Resisten los ácidos, pero desgraciadamente sólo tienen la mitad de actividad

contra Gram-positivas, y algunas son inactivadas por -lactamasas.

3). Penicilinas anti-Pseudomonas. La carbenicilina y la piperacilina se usan

frente a Pseudomonas, un patógeno oportunista muy peligroso cuando

coloniza grandes quemaduras, heridas quirúrgicas, etc.

Mecanismo de acción de las penicilinas y otros antibióticos -lactámicos:

Todas las penicilinas (incluidas las semisintéticas), son bactericidas sobre

bacterias en crecimiento, y poseen el mismo mecanismo: Inhiben el sistema

enzimático implicado en la reacción de transpeptidación del peptidoglucano

naciente, o sea que impiden los entrecruzamientos entre cadenas de PG. Ello

origina:

acumulación de precursores del PG, sin ensamblar;

activación de una serie de autolisinas (amidasas, glucosidasas), que

hidrilozan el PG maduro de la bacteria; si la bacteria se encuentra en un medio

hipotónico, termina lisándose.

En Gram-positivas, además, se produce desorganización de los ácidos teicoicos

y lipoteicoicos. (De hecho, parece que en este tipo de bacterias son estos ácidos

los que regulan de algún modo a las autolisinas).


144

Por lo tanto, la acción bactericida y lítica de las penicilinas depende de que la

bacteria se encuentre creciendo en un medio hipotónico. Cuando la bacteria no

está creciendo, no está haciendo renovación ("turnover") de su pared celular, lo que

implica que la penicilina no tiene "diana" sobre la que actuar; por lo tanto, en estas

condiciones la bacteria puede sobrevivir.

Esta es la base de las "recaídas" de muchas infecciones, una vez que se ha dado

por terminado el tratamiento de un paciente con un antibiótico ß-lactámico.

Una visión más en profundidad del mecanismo de acción:

Las penicilinas tienen como dianas a una serie de autolisinas llamadas proteínas

de unión a la penicilina (PBPs). Como ya vimos en el apartado 5 del capítulo 6,

las PBPs son proteínas implicadas en las últimas fases de la síntesis y maduración

del PG. Veamos en la siguiente tabla las funciones de las PBPs de E. coli, y los

efectos sobre cada una al añadir penicilina.

PBPs con actividad

transglucosidasa y

transpeptidasa:

función natural acción penicilina

PBP 1a y PBP 1b Elongación del cilindro

celular

lisis rápida

PBP 2 Condiciona la forma de la

célula

la célula se redondea y

muere

PBP 3 Formación del septo

transversal

Filamentación y muerte

PBPs con actividad

D-D

carboxipeptidasa

(endopeptidasa)

Función natural acción penicilina

PBP 4, PBP 5, PBP

6

Eliminan la D-ala terminal

delpentapéptido

(maduración PG)

no letal

Así pues, las PBPs 1 a 3 son esenciales para la bacteria, y son las dianas de las

penicilinas que explican la actividad bactericida. Se ha propuesto que el grupo -CO-

N- del anillo ß-lactámico funciona como un análogo estructural del sustrato de las

transpeptidasas implicadas en la reacción de entrecruzamiento (transpeptidación)

entre el péptido del PG naciente y el del PG aceptor. La penicilina se combina con

el sitio activo de la transpeptidasa, dando un complejo enzima-penicilina (peniciloil-

transpeptidasa) inactivo y bastante estable.

-LACTÁMICOS BASADOS EN EL NÚCLEO DEL ÁCIDO 7-

AMINOCEFALOSPORÁNICO

El núcleo cefém es el ácido 7-aminocefalosporánico. Existen dos tipos de -

lactámicos naturales (y sus derivados semisintéticos) basados en este núcleo:

cefalosporinas, producidas por hongos del género Cephalosporium;

Ramirez - Balqui

145

cefamicinas, producidas por ciertas especies del actinomiceto Streptomyces.

Desde un punto de vista biosintético, derivan de los dos mismos aminoácidos que

las penicilinas, pero aquí, uno de los metilos (-CH3) de la valina se incorpora al

anillo en vez de quedar fuera, haciendo que el anillo B sea el anillo dihidrotiazina.

La cefalosporina natural tiene poca actividad, pero sustituyendo artificialmente R1 y

R2 se obtienen derivados semisintéticos muy activo. Como es habitual con muchos

antibióticos de uso clínico, a lo largo de los años la industria farmacéutica ha ido

"creando" sucesivas "generaciones" de estos compuestos, con aplicaciones y

ventajas diferentes:

Las cefalosporinas se introdujeron en principio para uso en pacientes alérgicos a las

penicilinas. Algunas de ellas combinan la ventaja de tener un amplio espectro

(incluyendo bacterias difíciles de tratar, como Haemophilus) y el de ser resistentes a

las -lactamasas de muchas bacterias Gram-negativas.

MONOBACTÁMICOS

Tienen un núcleo monocíclico (sólo el anilo -lactámico). El derivado semisintético

aztreonam se puede usar contra bacterias Gram-negativas aerobias (estrictas o

facultativas) como Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas y Enterobacterias.

Su espectro de acción estrecho es útil, ya que su administración vía oral "respeta"

mejor la flora intestinal autóctona del paciente.

CARBEPÉNICOS

Se basan en el núcleo del carbapeném. Ejemplos son las tienamicinas (como el

imipeném). Poseen un espectro muy amplio, con actividad intensa contra casi todas

las bacterias de interés médico, incluyendo resistentes a otros antibióticos ß-

lactámicos: Staphylococcus aureus, Streptococcus, Pseudomonas, Bacteroides,

Haemophilus, Neisseria, etc.

INHIBIDORES DE LA -LACTAMASA

Un ejemplo típico es el ácido clavulánico (una oxa--lactama): tiene poca actividad

como antibiótico, pero se une a las -lactamasas, inactivándolas

irreversiblemente. Actualmente los médicos lo recetan con frecuencia en

combinación con alguna ampicilina (una aminopenicilina, como vimos): la mezcla

ampicilina + clavulánico tiene efectos sinérgicos (se potencian el uno al otro). El

clavulánico pasa fácilmente a través de porinas al espacio periplásmico de muchas

bacterias Gram-negativas, donde se acumula, y allí inactiva a las -lactamasas;

mientras tanto, la ampicilina, "salvada" de la inactivación de las lactamasas, puede

ejercer su efecto bactericida (por bloqueo de la transpeptidación del PG).

6.2. ANTIBIOTICOS QUE ACTUAN SOBRE LA MEMBRANA CELULAR.

A diferencia de los antibióticos que actúan a nivel de pared, los que interfieren con la

membrana celular ejercen sus efectos independientemente de que el microorganismo


146

esté o no creciendo. Suelen carecer de especificidad (afectan a membranas de

procariotas y de organismos superiores), por lo que resultan más o menos tóxicos para

los mamíferos y, en general, han encontrado escasa aplicación clínica.

6.2.1. ANTIBIOTICOS POLIPEPTIDICOS.

Son antibióticos producidos por especies de Bacillus durante las primeras fases de

la esporulación. Se trata de moléculas con aminoácidos en configuraciones L y D,

y con presencia de ciertos aminoácidos "raros" (no proteinogenéticos). Algunos de

estos antibióticos son polipéptidos cíclicos. Su síntesis no se realiza en los

ribosomas, sino que se produce por una secuencia de reacciones enzimáticas que

nada tienen que ver con el proceso de traducción de los mensajeros genéticos.

Suelen ser antibióticos de efecto bactericida. Su mecanismo consiste en que se

unen a la cara externa de la membrana citoplásmica (y, además, a la membrana

externa de las bacterias Gram-negativas), alterando su estructura y su

permeabilidad osmótica; ello condiciona la inhibición de procesos básicos de la

membrana, así como la salida de metabolitos del citoplasma.

POLIMIXINAS

Producidas por Bacillus polymyxa, son decapéptidos cíclicos con aminoácidos en

L y D, y con abundancia del "raro" L-diaminobutírico (L-DAB), y que llevan unido

una cadena alifática C8 (el 6-metil-octanoico).

Su actividad está restringida a Gram-negativas: el anillo peptídico, que está

cargado positivamente, se une electrostáticamente con los grupos negativos de la

membrana externa, desplazando a los cationes Mg++

y otros que estabilizan dicha

membrana; al mismo tiempo, la "cola" hidrofóbica (la cadena alifática) del

antibiótico se introduce entre las cadenas de ácidos grasos de la membrana. El

efecto neto de todo ello es que se desorganiza la estructura y la función de la

membrana externa.

Presentan toxicidad para organismos superiores (sobre todo nefrotoxicidad), por lo

que su empleo parenteral se reserva para infecciones severas de Pseudomonas.

Pero es apto para uso tópico.

TIROCIDINA-A Y GRAMICIDINA-S

Producidas por Bacillus brevis, son antibióticos plenamente cíclicos, con efectos

similares a la polimixina.

6.2.2. IONOFOROS.

Los antibióticos ionóforos actúan aumentando grandemente la permeabilidad de la

membrana hacia iones inorgánicos específicos. Forman canales que atraviesan la

membrana, dejando un hueco central que permite el paso de cationes concretos,

lo que se traduce en una disipación de los gradientes electroquímicos a

ambos lados de la membrana (destruyendo, por tanto, la capacidad de obtención

de energía de las bacterias).

Ramirez - Balqui

147

VALINOMICINA

Es un depsipéptido cíclico, formado por la ciclación de tres unidades del siguiente

módulo:

D-hidroxibutírico-D-valina-Lactato-L-valina

Como se puede comprobar, se trata de una cadena de -aminoácidos y -

hidroxiácidos alternantes, conectados por enlaces peptídicos y enlaces éster. Las

cadenas alifáticas se disponen hacia afuera del anillo, mientras que los grupos

carboxilo se colocan hacia adentro, dejando un canal hidrófilo que permite el libre

paso de K+, lo que desacopla los mecanismos de obtención de energía a nivel de

membrana.

GRAMICIDINA A

Es un antibiótico a base de aminoácidos alternantes en configuraciones D y L, que

forma una estructura helicoidal. Disipa iones K+, así como Na

+ e H

+. La

configuración permite al antibiótico formar una especie de cilindro donde la cadena

sigue una hélice que está estabilizada por puentes de H casi paralelos al eje del

cilindro, dejando un canal central de 0.4 nm de diámetro, y con las cadenas

laterales de los aminoácidos dirigidas hacia auera, formando una especie de vaina

hidrófoba. Esto permite que la molécula se inserte a través de la membrana,

dejando un canal por el que pueden pasar iones, con la consiguiente destrucción

del gradiente electroquímico.

6.2.3. ANTIBIOTICOS POLIÉNICOS.

Son de tipo macrólido (o sea, un gran anillo provisto un enlace lactónico); este tipo

de antibióticos se caracteriza por poseer una porción flexible hidroxilada y otra

porción más rígida, a base de dobles enlaces conjugados.

La anfotericina B (producida por Streptomyces nodosus) y la nistatina (por S.

nursei) contienen, además, el aminoazúcar llamado micosamina.

Inhiben selectivamente las membranas que contienen esteroles: por lo tanto,

actúan sobre microorganismos eucarióticos (hongos, levaduras), pero no sobre los

procarióticos, a excepción de los micoplasmas. Parece que son bastante

específicos hacia el ergosterol (muy abundante en hongos), pero debido al

parecido de éste con el colesterol, tienen cierta toxicidad hacia los animales

superiores (su margen de seguridad terapéutica es muy estrecho).

Estos antibióticos tienen forma de bastón rígido (debido a la configuración todo -

trans de los dobles enlaces conjugados). Una de las superficies de este cilindro es

hidrófoba (la de los dobles enlaces), y la superficie opuesta es hidrófila (la que es

rica en hidroxilos). En un extremo del bastón, la micosamina y el carboxilo forman

una zona altamente polar. Los modelos fisicoquímicos revelan que 10 moléculas

del antibiótico se agregan entre sí, con los ejes de sus respectivos bastones

paralelos entre sí y perpendiculares a la membrana (atravesándola), de modo que


148

dejan un canal central de uno 0,7 nm de diámetro, y con los grupos polares hacia

afuera. Esta estructura permite el paso libre de iones, así como el que se escapen

metabolitos (como la glucosa) desde la célula al exterior.

6.3. ANTIBIOTICOS QUE INTERFIEREN EN LA BIOSINTESIS DE PROTEINAS.

Se recomienda al alumno repasar, siquiera sea en esquema, el proceso de síntesis de

proteínas, con sus fases de iniciación, elongación y terminación).

Los antibióticos que interfieren en la síntesis de proteínas son muy variados y

abundantes, y la mayoría de ellos funcionan interfiriendo con el ribosoma, sobre todo los

que se unen a proteínas ribosómicas y/o a alguno de los ARN ribosómicos. Nosotros

vamos a detenernos principalmente en aquellos antibióticos que afectan a la elongación

de la cadena naciente del polipéptido. Obviamente, los más útiles son aquellos que tienen

efectos selectivos frente a los ribosomas 70S procarióticos, pero no sobre los 80S

eucarióticos. Dentro de ellos, y siguiendo el orden natural del funcionamiento de la

elongación de la cadena polipeptídica, podemos agruparlos según la fase concreta de la

elongación sobre la que actúan:

1. inhibición del reconocimiento de un aminoacil-ARNt (aa-ARNt) hacia el sitio A del

ribosoma;

2. introducción de errores en la lectura de los ARNm;

3. inhibición de la reacción de formación del enlace peptídico;

4. inhibición de la traslocación del peptidil-ARNt (pp-ARNt) desde el sitio A al sitio P.

5. bloqueo de los factores de elongación.

6.3.1. INHIBIDORES DE LA FASE INICIAL DE LA ELONGACION (O SEA, DEL

RECONOCIMIENTO Y ENTRADA DEL aa-ARNt AL SITIO "A" DEL

RIBOSOMA).

TETRACICLINAS

Son antibióticos de muy amplio espectro (frente a Gram-positivas, Gram-

negativas, Rickettsias y Clamidias, e incluso Micoplasmas), producidos por

distintas especies de Streptomyces. Actúan como bacteriostáticos, siempre y

cuando las bacterias estén en crecimiento activo. Como se puede ver por su

espectro, son útiles incluso contra bacterias que viven como parásitos

intracelulares (como las Rickettsias), debido a que su carácter hidrofóbico

facilita su difusión a través de membranas.

Mecanismo de acción: Provocan que la unión del aa-ARNt al sitio A del

ribosoma sea inestable y esté distorsionada, con lo cual se evita la elongación

de la cadena. In vitro actúan tanto frente a ribosomas 70S como frente a los 80S.

Entonces, ¿por qué in vivo sólo inhiben a las bacterias? La explicación está en el

hecho de que las bacterias transportan complejos tetraciclina-Mg de forma

"suicida", cosa que no ocurre en eucariotas. Al llegar la tetraciclina a la subunidad

30S, se une a las proteínas S4 y S18 del ribosoma 70S intacto, ejerciendo el

efecto que hemos descrito en el párrafo anterior.

Efectos secundarios:

Ramirez - Balqui

149

Las tetraciclinas naturales se absorben mal por el intestino, y pueden destruir la

flora autóctona, favoreciendo infecciones secundarias. Las semisintéticas evitan

este problema.

Se depositan en tejidos calcificados, ocasionando daños a huesos y dientes, y

tiñendo los dientes de amarillo en los niños.

6.3.2. INDUCTORES DE ERRORES EN LA LECTURA DEL ARNm.

AMINOGLUCÓSIDOS.

Es un grupo amplio y variado de antibióticos producidos por diversas especies de

Streptomyces. Como se puede ver en las figuras, todos tienen en común varios

rasgos químicos:

son muy polares, policatiónicos;

presentan un anillo de aminociclitol (un ciclohexitol o inositol con grupo amino);

uno o más azúcares, incluyendo al menos un aminoazúcar (aparte del

aminociclitol). Así, por ejemplo, la estreptomicina contiene como aminociclitol la

llamada estreptidina, mientras que otros aminoglucósidos presentan la 2-

desoxiestreptamina).

Ejemplos de

aminoglucósidos

de uso clínico

bacteria productora

Estreptomicina Streptomyces griseus

Kanamicina S. kanamyceticus

Amikacinas (derivados semisintéticos de la kanamicina)

Neomicina S. fradiae

Gentamicina Micromonospora purpurea

Los aminoglucósidos son antibióticos bactericidas de amplio espectro. Sus

propiedades farmacocinéticas se deben al carácter polar del policatión:

mala absorción vía oral (hay que administrarlos vía parenteral);

penetran poco en el fluido cerebroespinal;

se excretan rápidamente por la orina.

Por otro lado, en algunos individuos pueden ocasionar reacciones adversas:

parálisis neuromuscular, ototoxicidad (pueden llegar a provocar sorderas) y

nefrotoxicidad. Su margen de dosis terapéutica es estrecho, por lo que su uso

debe limitarse frente a infecciones ocasionadas por bacterias resistentes a otros

antibióticos.

Mecanismo de acción: Como veremos enseguida, su mecanismo no se limita a lo

que dice el presente epígrafe (inducir errores en la lectura del mensajero), sino

que tienen efectos pleiotrópicos (múltiples), que se influyen entre sí. El mecanismo

lo podemos desglosar en varias fases:

1. Unas pocas moléculas del antibiótico entran a la bacteria, probablemente

aprovechando pequeñas imperfecciones de la membrana en crecimiento;


150

2. estas moléculas se unen a los polisomas, es decir, los polirribosomas que

están traduciendo el ARNm (p. ej., la estreptomicina se une al ARNr 16S de la

subunidad 30S). Allí provocan errores en la lectura del ARNm, al distorsionar

la estructura del ribosoma. Concretamente, el efecto aquí es que los codones

del ARNm se emparejan con ARNt cargados "erróneos", en los que sólo 2 de

las 3 bases del anticodón corresponden correctamente con las del codón.

3. Por lo tanto, la bacteria comienza a sintetizar proteínas defectuosas;

algunas de ellas son proteínas de membrana, que al incorporarse a la bicapa

lipídica, introducen imperfecciones en su funcionamiento y estructura. Se van

formando cada vez más "canales", correspondientes a defectos en esa

membrana;

4. a través de los nuevos "canales" e imperfecciones de la membrana, entran

cada vez más moléculas del antibiótico, con lo cual todo el proceso se acelera

y retroalimenta positivamente, de modo autocatalítico.

El efecto final es bactericida:

se detiene finalmente la síntesis de proteínas;

se producen daños irreversibles a las membranas.

Cada aminoglucósido se une a una zona distinta de la subunidad 30S del

ribosoma, por lo que no suelen darse reacciones cruzadas de resistencia entre

distintos antibióticos de este grupo.

La mayoría de los aminoglucósidos se une a varios sitios a la vez, dentro de la

subunidad 30S, por lo que la aparición espontánea de mutaciones de resistencia a

ellos suele ser baja. Una excepción a esto es el caso de la estreptomicina.

Efectos de la estreptomicina:

Diana de la estreptomicina: La estreptomicina ejerce su efecto antibiótico

uniéndose a una zona concreta del ARNr 16S del ribosoma eubacteriano.

Mutación de resistencia a la estreptomicina: Con relativa frecuencia (10--

9/célula y división) surge en la población bacteriana una mutación espontánea que

convierte a la bacteria afectada en resistente a la estreptomicina (fenotipo StrR);

esta mutación afecta al gen strA, que codifica la proteína S12 de la subunidad

pequeña del ribosoma. El efecto de la mutación es alterar la proteína S12 de

modo que el ribosoma que contenga esa proteína mutante evita la unión de la

estreptomicina con el ARNr 16S (de algún modo, la S12 mutante "tapa" la vía de

acceso del antibiótico a su diana molecular).

Supresión fenotípica de mutaciones puntuales: Como veremos en la sección

de Genética Bacteriana (cap.23), uno de los tipos de mutaciones se denomina

puntual, porque transforma un par de bases en otro distinto; ello puede suponer

alterar el sentido del codón afectado (el codón mutante puede codificar un

aminoácido distinto al original, o incluso puede ser uno de los tres codones de

parada de traducción), lo cual puede conducir a que la proteína mutante

respectiva deje de ser funcional.

Ramirez - Balqui

151

Pues bien, cuando una bacteria que posee una mutación puntual que inactiva una

determinada proteína (fenotipo mutante) se pone en un medio con estreptomicina

u otro antibiótico aminoglucósido, con cierta frecuencia la lectura errónea del

ARNm del gen mutante ("erróneo") conduce a que la proteína sea funcional,

generándose un fenotipo silvestre. A este fenómeno se le denomina supresión

fenotípica (en este caso inducida por estos antibióticos), para distinguirlo de la

supresión genotípica, que como veremos oportunamente, regenera el fenotipo

pero por medio de cambios en el genomio.

Este efecto depende de la porción del anillo aminociclitol de la molécula del

aminoglucósido, y su mecanismo es a nivel del sistema secundario de corrección

de errores de lectura que tiene el ribosoma ("corrección de pruebas").

Mutantes dependendientes de la estreptomicina: Existe una mutación alélica

de la StrR (es decir, que afecta al mismo gen), pero que en vez de dar fenotipo de

resistencia al antibiótico produce un fenotipo por el que la bacteria depende de la

estreptomicina para poder crecer (!). Esta mutación (denotada Strd) tiene unos

efectos muy específicos de supresión fenotípica condicionada:

la proteína ribosómica mutante S12, en ausencia de estreptomicina, hace que

el ribosoma traduzca introduciendo frecuentes errores (hay ambigüedades en la

lectura de los mensajeros); por lo tanto, en ausencia de este antibiótico, la

bacteria no crece.

Si a la bacteria se le suministra el antibiótico, éste compensa fenotípicamente

el efecto de la mutación de la proteína S12, de modo que ahora los

ribosomas pueden efectuar correctamente la traducción de los ARNm (se

reactivan los ribosomas para su funcionalidad normal).

6.3.3. ANTIBIOTICOS INHIBIDORES DE LA FORMACION DEL ENLACE PEPTIDICO.

Se trata de un grupo variado y heterogéneo de agentes antibacterianos que

interfieren con el centro peptidil-transferasa de la subunidad grande del ribosoma.

Cloranfenicol (antes llamado cloromicetina)

Antiguamente la industria lo obtenía a partir de Streptomyces venezuelae, pero

actualmente es más barato fabricarlo por síntesis química. Es un bacteriostático

de amplio espectro. Se absorbe bien vía oral y penetra bien en todos los tejidos,

incluyendo cerebro y líquido cerebroespinal, por lo que se puede usar frente a

meningitis ocasionadas por Haemophilus influenzae, así como tratamiento de

fiebres tifoideas y anaerobios Gram-negativos.

Sin embargo, hay que controlar bien las dosis, ya que puede provocar supresión

de médula ósea (aplasia medular); de hecho, casi no se emplea en países de

Occidente, aunque se receta demasiado en el Tercer Mundo.

Mecanismo de acción: Se une a varios lugares de la subunidad 50S, entre los

cuales el más importante es la proteína L16, que forma parte del centro peptidil-


152

transferasa, cerca del sitio del ribosoma donde encaja el extremo aminoacil del

ARNt, en el sitio A.

El cloranfenicol ha sido muy útil en el estudio de los ribosomas, ya que estabiliza

los polisomas rápidamente.

Lincomicina y clindamicina.

La lincomicina está producida por Streptomyces lincolniensis, y la clindamicina es

un derivado clorado del anterior, mucho más eficaz y con mejor absorción

intestinal. Son útiles para tratar infecciones donde no pueda aplicarse penicilina, y

contra anaerobios como Bacteroides.

Mecanismo de acción: Se une a la subunidad 50S del ribosoma procariótico,

bloqueando la formación del enlace peptídico. Parece que esto lo logra

interfiriendo con la colocación adecuada del aa-ARNt en el sitio A, y del pp-ARNt

en el sitio P. Hace que se desorganicen los polisomas, disociándose en sus

subunidades 30S y 50S.

Algunos macrólidos como la carbomicina

La carbomicina (producida por Streptomyces halstedii) y otros macrólidos se unen

a la proteína L4 de la subunidad 50S, inhibiendo la formación del enlace peptídico.

6.3.4. INHIBIDORES DE LA TRANSLOCACION.

El representante más típico es otro macrólido, la eritromicina. (Actualmente se

usan mucho en clínica dos derivados semisintéticos de ella: la roxitromicina y la

claritromicina). Producida por Streptomyces erithraeus), es un agente

bacteriostático que se administra en infecciones de vías respiratorias

ocasionadas por Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila (legionelosis),

Corynebacterium dyphteriae (difteria) y Bordetella pertussis (tosferina).

Mecanismo de acción: Se une a la proteína L15, que forma parte del centro

peptidil-transferasa. Bloquea el paso de translocación interfiriendo

específicamente con la liberación del ARNt desacilado, es decir, impide que el

ARNt "descargado" (una vez que ha cumplido su misión al transferirse el péptido

naciente al aa-ARNt del sitio A) salga del sitio P; por lo tanto, el pp-ARNt cargado

y situado en el sitio A no puede translocarse al sitio P, y se produce la parada de

la síntesis de proteinas.

6.3.5. INHIBIDORES DE LOS FACTORES DE ELONGACION.

Tiostreptón

Es un antibiótico policíclico muy grande, producido por ciertas especies de

Streptomyces. Se une a la subunidad 50S, concretamente a la proteína L11 y a

una zona concreta del ARNr 23S, impidiendo la unión de los factores de

elongación EFTu y EFG.

Ramirez - Balqui

153

Ácido fusídico

Es un derivado esteroideo producido por hongos del género Fusarium, usado

contra estafilococos resistentes a -lactámicos. Se une al factor de elongación

EFG, inhibiendo la liberación del complejo EFG-GDP, por lo que el pp-ARNt queda

fijado en el sitio P, lo cual impide que se pueda unir el complejo ternario EFTu-

GTP-ARNt.

Kirromicina y pulvomicina

Se unen al factor EFTu. La kirromicina bloquea la liberación del complejo binario

EFTu-GDP; la pulvomicina bloquea la adición de aa-ARNt al EFTu para formar el

complejo ternario.

En resumen de este apartado, existen antibióticos que afectan prácticamente

cualquier aspecto de la función del ribosoma. Muchos de ellos, aparte del interés

clínico que puedan tener, han sido muy útiles para desentrañar diversos aspectos

de la estructura y función del ribosoma.

6.4. ANTIBIÓTICOS QUE INTERFIEREN EN LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS.

6.4.1. INHIBIDORES DE LA FUNCION DEL ADN.

Pocos de los antibióticos que interfieren con las funciones del ADN son útiles en

clínica, ya que no pueden discriminar entre ADN de procariotas y eucariotas. Sin

embargo, han sido muy valiosos para estudiar diversos aspectos de la biología

molecular del ADN

Actinomicina-D (Dactinomicina)

Observar en la figura que su grupo cromóforo tiene tres anillos y es planar; de

cada anillo de los extremos sale una lactona pentapeptídica. Esta estructura es

importante para entender su mecanismo de acción:

El hecho de tener tres anillos conjugados en un plano le permite intercalarse

entre pares de bases adyacentes de la doble hélice del ADN, mientras que las

dos L-treoninas establecen puentes de H con guaninas del ADN adyacentes al

sitio de intercalación del antibiótico. De esta forma inhibe la replicación del ADN

y su transcripción a ARNm.

Mitomicina C

Al entrar a la célula es convertida a su forma hidroquinona, que es muy reactiva,

funcionando como un agente alquilante bifuncional que origina

entrecruzamientos entre las dos hebras del ADN. Las consecuencias de ello

son:

las dos hebras no pueden separarse durante el intento de replicación, por lo

que ésta se detiene.

A continuación el ADN entrecruzado es atacado y destruido por las nucleasas

de la propia célula.


154

Novobiocina y coumermicina

Se unen a la subunidad B de las ADN girasas bacterianas, impidiendo el

superenrollamiento negativo del ADN al competir por el sitio de unión de esta

subunidad al ATP.

6.4.2. INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCION.

Las ARN polimerasas de virus, de bacterias y de mamíferos difieren mucho entre

sí, por lo que los tipo de antibióticos que las afecten suelen ser bastante

selectivos. Recuérdese que las ARN polimerasas eubacterianas constan de un

núcleo {a2'} y que requieren el factor para la iniciación de la transcripción.

Rifampicinas

Son antibióticos producidos por Streptomyces mediterranei, con buena actividad

contra bacterias Gram-positivas y contra Mycobacterium tuberculosis. Se han

usado en clínica moléculas naturales (como la rifampicina) así como derivados

semisintéticos (como la rifampina). Constan de un anillo cromóforo aromático

atravesado por un largo puente de naturaleza alifática.

Su mecanismo de acción estriba en la inhibición del inicio de la transcripción,

uniéndose de modo no covalente a la subunidad ß de la ARN polimerasa

eubacteriana.

Estreptolidigina

Se une también a la subunidad ß de la ARN polimerasa, pero su efecto es inhibir

la fase de elongación de la transcripción.

VII. RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBIOTICOS

La síntesis de quimioterápicos artificiales y el descubrimiento y mejora de los antibióticos han

supuesto en este siglo una auténtica revolución médica en el tratamiento de enfermedades

infecciosas. Sin embargo, la extrema versatilidad y adaptabilidad de los microorganismos ha

impedido que la victoria humana sobre las bacterias patógenas haya sido total: muchas

bacterias han ido desarrollando en los últimos decenios mecanismos que las protegen frente a

muchos fármacos.

Ya el mismo Paul Ehrlich, al introducir por primera vez la quimioterapia en protozoos, se dio

cuenta (1907) de que algunas cepas desarrollaban resistencia a la droga durante el curso del

tratamiento.

Tras el optimismo inicial que acompañó a los éxitos de la introducción de las sulfamidas y

penicilinas (años 40 y 50), se constató igualmente un fenómeno de surgimiento de resistencias

bacterianas a estas drogas. Si bien la quimioterapia ha doblegado las grandes epidemias

bacterianas del pasado, las enfermedades infecciosas siguen con nosotros, constituyendo un

serio problema.

De hecho, desde la introducción de la antibioterapia en todo el mundo, estamos realizando un

gigantesco "experimento" de intervención genética en los seres vivos más abundantes del

Ramirez - Balqui

155

planeta: las bacterias. Estamos "sufriendo" la verdad de la supervivencia darwiniana de los

más aptos, ya que la presión selectiva que representa la aplicación a gran escala de los

quimioterápicos ha permitido la diseminación de cepas microbianas con mecanismos de

resistencia que, en muchas ocasiones dificultan el adecuado tratamiento clínico.

Al cabo de 6 años de introducir la penicilina G, la frecuencia de cepas de Staphylococcus

aureus resistentes en los hospitales ingleses pasó de menos del 10% a un 60%.

Actualmente el valor ronda el 90%.

Con los nuevos ß-lactámicos también han empezado a surgir cepas bacterianas resistentes,

aunque aún con frecuencia relativamente baja.

Actualmente existen problemas de tratamiento con las enterobacterias, e incluso con el

gonococo y el meningococo, que tradicionalmente habían sido muy sensibles a las

penicilinas.

Recientemente se ha dado la voz de alarma por la diseminación de cepas de bacilo

tuberculoso resistentes a los quimioterápicos de elección a los que eran sensibles. La

capacidad de las bacterias de desarrollar resistencias constituye una seria amenaza al

futuro uso de los antibióticos, y hace que se tengan que invertir grandes sumas de dinero y

esfuerzos de investigación adicionales para intentar hacer frente al problema. Algunos

autores han comparado este problema con el episodio de Alicia en el País de las Maravillas

en el que la Reina Roja tenía que correr cada vez más deprisa para quedarse en el mismo

sitio.

Sin embargo, algunos quimioterápicos de última generación han vuelto a levantar esperanzas:

las fluoroquinolonas están manteniendo e incluso incrementando su efectividad. Por otro lado,

hay que pensar en un dato de tipo evolutivo: la mayor parte de las especies bacterianas han

sido seleccionadas de modo natural con fenotipos sensibles a antibióticos; los cambios

genéticos mutacionales que las convierten en resistentes puede que disminuyan su adaptación

a otros factores ecológicos, de modo que probablemente la presión de los antibióticos en

realidad conduzca en muchos casos a un equilibrio entre cepas sensibles y cepas resistentes.

De hecho se ha comprobado un descenso en la frecuencia de cepas resistentes a los

antibióticos que se introdujeron hace más tiempo, lo que quizá indique que para ellos se está

alcanzando dicho equilibrio.

Aclaraciones de nomenclatura:

llamamos cepa insensible a aquella cuyo fenotipo silvestre le permite "resistir" de modo

natural a un determinado antibiótico. La base de esta insensibilidad suele ser alguna

estructura de la bacteria que actúa como barrera (como por ejemplo, la membrana externa

de Gram-negativas, que dificulta el paso de muchos agentes antibacterianos).

Llamamos cepa resistente a una variante surgida por cambios genéticos a partir de un

fenotipo silvestre originalmente sensible.

VIII. BASES GENÉTICAS DE LA RESISTENCIA

Una de las aplicaciones prácticas más interesantes de los avances realizados en las últimas

décadas en el campo de la Genética Bacteriana ha sido comprender los mecanismos genético-

moleculares de la resistencia a antibióticos, lo que está permitiendo un "ataque" más racional a


156

este problema clínico. Una cepa bacteriana puede volverse resistente a un antibiótico por dos

tipos principales de mecanismos:

1). mutación en un gen cromosómico;

2). introducción de un plásmido R de resistencia. Este segundo mecanismo supone el

problema más serio, ya que:

a. está muy extendido;

b. puede conferir resistencia a varios antibióticos a la vez;

c. a diferencia del mecanismo mutacional, no suele suponer una desventaja adaptativa (no

disminuye la tasa de crecimiento de la bacteria ni le hace perder sus propiedades de

virulencia).

8.1. SELECCION DE MUTANTES RESISTENTES.

Las mutaciones génicas se dice que son espontáneas cuando ocurren sin intervención

de procedimientos mutagénicos experimentales. Las mutaciones bacterianas

espontáneas son aleatorias, y afectan a un gen cualquiera con frecuencias dentro del

rango de 10--5

a 10--10

por célula y división.

En los años 50 se observó el siguiente fenómeno: cuando un cultivo bacteriano de una

cepa sensible a un antibiótico se pone en contacto con ese antibiótico, al cabo del

tiempo se comprueba que todo el cultivo consta de bacterias resistentes.

Esta es precisamente la base genética del surgimiento de ciertas cepas patógenas

resistentes a antibióticos: el fármaco inhibe o mata las bacterias silvestres sensibles,

pero no afecta a los pocos individuos que por mutación espontánea hayan adquirido un

alelo resistente; estos individuos se multiplican, de modo que al final son los más

prevalentes.

El conocimiento de la frecuencia de aparición de mutación a resistencia a un

quimioterápico o antibiótico en una determinada especie bacteriana, así como el sitio de

acción de dicho fármaco, son factores importantes para una aproximación racional a la

quimioterapia.

Así por ejemplo, el bacilo tuberculoso produce frecuentemente lesiones en el pulmón,

donde se concentran enormes cantidades de la bacteria. Aquí, la quimioterapia con un

solo agente no da éxito, ya que aunque ese agente mate a casi todos los individuos de

esta especie bacteriana, no afectará a la pequeña subpoblación que posea el alelo

resistente; estos pocos individuos sobrevivirían a este tratamiento, y recolonizarían el

resto del pulmón, por lo que la infección persistiría. Así pues, en este tipo de casos hay

que tratar con varios quimioterápicos simultáneamente (la probabilidad de resistencias

múltiples basadas en mutaciones espontáneas equivale al producto de las

probabilidades individuales).

8.2. RESISTENCIA POR INTERCAMBIO GENÉTICO.

La principal amenaza al éxito de la quimioterapia está representada por la transmisión

genética de plásmidos de resistencia a antibióticos (plásmidos R).

Ramirez - Balqui

157

Veamos un poco de historia: en los años 50, poco después de la introducción de los

primeros antibióticos, se detectó en Japón un espectacular aumento de pacientes de

disentería bacilar resistentes al tratamiento con varios de estos antibióticos. Las cepas

de Shigella dysenteriae aisladas de estos pacientes poseían el fenotipo SuR, Str

R, Cm

R,

TetR. Se comprobó que los genes correspondientes a esas resistencias formaban parte

de un gran plásmido. Los plásmidos de este tipo se denominan plásmidos R. Pero aún

más: los mismos pacientes tenían en sus intestinos cepas de Escherichia coli (que

como sabemos ya, es un simple comensal que forma parte de nuestra flora endógena)

que eran igualmente resistentes a esos antibióticos. Ello sugería que este tipo de

plásmidos se podía transferir de unas especies a otras. La explicación estribaba en un

fenómeno de intercambio dependiente de contactos célula-célula, llamado

conjugación.

En resumidas cuentas, se descubrió que existen plásmidos R capaces de diseminarse

por conjugación no sólo entre células de la misma especie, sino entre especies

distintas, incluyendo bacterias patógenas.

Al poco tiempo comenzaron a aparecer en Occidente cepas patógenas resistentes a

uno o varios antibióticos. Actualmente las cepas con resistencias múltiples codificadas

por plásmidos son muy abundantes en todo el mundo, lo que complica (y a veces

desaconseja) la quimioterapia.

Existen plásmidos R de distintos grupos de incompatibilidad. Son abundantes en

Pseudomonas y en Enterobacterias, desde donde pueden ser transferidos a una amplia

gama de bacterias Gram-negativas (plásmidos promiscuos).

Aparte de los plásmidos R conjugativos existen otros no conjugativos, que sin embargo

pueden ser transferidos entre distintas bacterias por otros medios:

los plásmidos no conjugativos movilizables pueden ser transferidos por otro plásmido

conjugativo compatible residente en la misma célula.

por transducción (mediante bacteriófagos);

por transformación (ADN desnudo del plásmido puede ser captado por una bacteria

sensible receptora;).

Ventajas adaptativas de los plásmidos R:

Los plásmidos R han evolucionado en respuesta a presiones selectivas ambientales

(antibióticos usados por los humanos o inhibidores presentes en los medios naturales de

las bacterias).

1). Son capaces de conferir varias resistencias simultáneamente a las bacterias que los

adquieran.

2). Tienen capacidad de diseminarse epidémicamente de modo "horizontal" (es decir,

entre células distintas de la misma especie o -en el caso de los promiscuos- distintas

especies).

3). Están constituidos por "módulos" móviles (transposones), de modo que tienen

flexibilidad para adquirir nuevos módulos a partir de otras especies.

4). Economía: cuando no existe presión selectiva, pueden perderse de la mayor parte de

las bacterias de una determinada población (curación espontánea), pero su modo de


158

transmisión "epidémica" los capacita para diseminarse rápidamente a la mayoría de

la población cuando la ocasión lo requiere (cuando vuelve la presión selectiva).

5). No tienen apenas efectos negativos sobre los demás caracteres de la bacteria

(incluyendo, en las patógenas, su poder virulento).

6). Muchos de ellos responden a mayores concentraciones del antibiótico aumentando

su número de copias (amplificación del número de copias en los plásmidos de control

relajado.

Otro ejemplo de esta facultad de diseminación y evolución lo tenemos en que desde que

los hospitales hacen uso frecuente de detergentes catiónicos como desinfectante, ha

crecido la proporción de cepas de Staphylococcus resistentes a dichos agentes.

Como se puede comprender, el estudio epidemiológico de los plásmidos R reviste

actualmente un gran interés de cara a la salud pública. Este tipo de estudios recurre

principalmente a dos tipos de enfoques:

por detección de grupos de incompatibilidad (algo complejo);

por análisis de restricción y comparación de mapas físicos (más fácil y rápido).

IX. MECANISMOS BIOQUIMICOS IMPLICADOS EN LA RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS.

Los principales mecanismos se pueden agrupar de la siguiente manera:

1. Disminución de la permeabilidad hacia el antibiótico.

2. Inactivación enzimática del antibiótico

3. Modificación química de la diana sobre la que actúa el antibiótico

4. Síntesis de una enzima resistente.

9.1. DISMINUCION DE LA PERMEABILIDAD CELULAR HACIA EL ANTIBIOTICO.

Modificación de una barrera preexistente

Como ya sabemos, la membrana externa de Gram-negativas supone una barrera natural

que hace que muchas bacterias de este grupo sean insensibles a varios antibióticos (p.

ej., la vancomicina y la bacitracina no pueden atravesar las porinas).

No todas las bacterias Gram-negativas son igualmente impermeables a los mismos

antibióticos:

Entre las menos impermeables están Haemophilus y Neisseria, que dejan pasar a

numerosos ß-lactámicos.

Las Enterobacterias suelen ser intermedias.

Las bacterias del gén. Pseudomonas son insensibles a la mayoría de antibióticos -

lactámicos, porque no pueden pasar a través de la membrana externa. Se han aislado

mutantes que se han vuelto resistentes a los -lactámicos de última generación: el

cambio ha afectado a una determinada porina que ahora no deja pasar a estos nuevos

antibióticos.

En otros casos, la resistencia se debe a alteraciones en la cápsula: algunos neumococos

resistentes a estreptomicina y eritromicina dependen de este tipo de mecanismo.

Ramirez - Balqui

159

Mecanismo de extrusión activa del antibiótico

El ejemplo más típico estriba en la resistencia a las tetraciclinas desarrollada por muchas

bacterias. Como sabemos, el efecto inhibidor de las tetraciclinas depende de la

acumulación activa de este tipo de antibióticos por parte de las bacterias. Pues bien,

ciertos plásmidos R poseen transposones (como el Tn10 o el Tn1721) que codifican un

sistema para "bombear" tetraciclina desde el interior bacteriano hacia el exterior, en

contra del gradiente de concentración.

Igualmente se conocen resistencias a sulfamidas dependientes de un mecanismo

específico de impermeabilidad.

Alteración del mecanismo de transporte del antibiótico

Cuando el antibiótico accede al interior bacteriano por algún mecanismo de transporte

específico, una mutación que afecte a dicho sistema de transporte supondrá una mayor

resistencia al antibiótico. Por ejemplo, en E. coli la cicloserina entra aprovechando el

sistema de transporte de la valina o la glicocola. Determinados mutantes incapaces de

transportar estos aminoácidos son resistentes a la cicloserina.

9.2. INACTIVACION ENZIMATICA DEL ANTIBIOTICO.

Este tipo de mecanismo depende en muchos casos de plásmidos R. Los ejemplos típicos

son las resistencias a -lactámicos, la resistencia al cloranfenicol y las resistencias a

aminoglucósidos.

Resistencia a -lactámicos por acción de -lactamasas

Como ya sabemos, ciertas bacterias producen penicilinasa (-lactamasa), capaz de

abrir el anillo -lactámico de la penicilina para dar ácido peniciloico, que carece de

actividad antibacteriana. Lo mismo ocurre con las cefalosporinas, donde la -lactamasa

(cefalosporinasa) genera un producto inestable inactivo que se descompone

rápidamente. Sin embargo, la naturaleza de la cadena lateral (grupo acilo, R) influye

notablemente en la susceptibilidad de rotura del anillo -lactámico por las lactamasas.

-lactamasas codificadas por cromosoma y de bajo nivel (-lactamasas de tipo

TEM).

Están muy distribuidas entre bacterias Gram-negativas, y confieren resistencia a

cefalosporinas y penicilinas. La base de la resistencia en muchos casos es la siguiente:

cuando se expone la bacteria al -lactámico durante mucho tiempo, pueden

seleccionarse determinadas mutaciones en genes cromosómicos que codifican proteínas

parecidas de tipo PBP, de modo que adquieren un fuerte promotor que permite su

expresión a alto nivel. Este tipo de -lactamasa es excretada al medio, donde inactiva al

antibiótico.

-lactamasas de origen plasmídico.

En la Gram-positiva Staphylococcus aureus existen cuatro variantes, responsables del

espectacular aumento de cepas resistentes de esta especie surgidas en los años 50. Se

trata de enzimas inducibles: el gen que codifica la -lactamasa se induce por pequeñas

cantidades de penicilina o cefalosporina, y se producen enormes cantidades del


160

antibiótico, que se excreta, de modo que inactiva al ß-lactámico en el entorno de la

bacteria. El gen responsable es portado por plásmidos de tipo R (que llevan genes de

resistencia para otros antibióticos).

En las Gram-negativas se han descubierto unos 20 tipos de -lactamasas de codificación

plasmídica. Suelen ser enzimas de síntesis constitutiva que se expresan a bajos niveles,

y cuya localización es periplásmica; esta localización permite que el antibiótico sea

inactivado antes de que llegue a la membrana citoplásmica, donde se localizan las

proteínas diana de los -lactámicos. Algunas de ellas vienen codificadas por genes

plasmídicos que forman parte de transposones (p. ej., el Tn1 o el Tn4).

¿Cuál es el origen de las -lactamasas?

Aunque la prevalencia de cepas (sobre todo patógenas) resistentes a -lactámicos es un

fenómeno que se "disparó" desde los años 50 con el uso masivo de estos antibióticos,

está claro que la resistencia debía de existir previamente al uso humano de los

antibióticos. La aplicación clínica a gran escala (incluyendo el abuso) de las penicilinas y

cefalosporinas sólo ha permitido que veamos en acción un caso "acelarado" de evolución

bacteriana, donde las cepas más aptas han sobrevivido y se han multiplicado, y en el

que, merced a los procesos de intercambio genético y a la construcción "modular"

(transposones) de muchos plásmidos R, las entidadess genéticas responsbles se han

diseminado de unas especies bacterianas a otras. Se supone que en la Naturaleza (p. ej.,

en los suelos), ciertas cepas bacterianas, antes de la aparición de la Quimioterapia,

poseían ya mecanismos para destruir los -lactámicos segregados por hongos con los

que coexistían.

Profundizando más en el tema, parece que las propias -lactamasas proceden

evolutivamente (por mutaciones sucesivas) de alguno de los genes que originalmente

codificaban algunas de las "autolisinas" (PBPs) que intervienen en la maduración del

peptidoglucano. Es decir, las -lactamasas serían formas modificadas de las mismas

dianas (p. ej., las transpeptidasas) sobre las que actúan los -lactámicos.

Como sabemos, los -lactámicos forman complejos covalentes estables con algunas de

las PBPs (peniciloil-PBPs), que hacen que estas autolisinas se inactiven. Pues bien,

existen indicios de que las -lactamasas serían unas "autolisinas" evolucionadas que en

vez de formar complejos estables con los -lactámicos, se habrían especializado en

cortar el anillo lactámico (dando peniciloico) a expensas de su actividad transpeptidasa

original.

Resistencia al cloranfenicol

La resistencia al cloranfenicol suele deberse a una enzima inactivante de dicho

antibiótico, denominada cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT), que normalmente está

codificada por genes plasmídicos. Uno de los genes de CAT de Gram-negativas más

estudiados forma parte del transposón Tn9.

La CAT convierte el cloranfenicol en su derivado 3-acetoxi, usando el acetil-CoA; a

continuación una reacción química (no catalizada por enzima) hace que el grupo acetoxi

Ramirez - Balqui

161

pase a la posición 1; finalmente ocurre una segunda acetilación catalizada

enzimáticamente, que genera el producto final, 1,3-diacetoxi-cloranfenicol. Los derivados

mono o diacetilados del cloranfenicol son inactivos como antibióticos.

Resistencia a ciertos aminoglucósidos

Como ya vimos en el capítulo anterior, los aminoglucósidos son un grupo amplio y

abundante de antibióticos, por lo que no es sorprendente que las bacterias hayan

evolucionado distintos mecanismos para inactivarlos; se pueden agrupar en tres tipos:

Fosforilación

Adenilación

Acetilación

Las fosforilaciones y adenilaciones se dan sobre grupos -OH susceptibles, mientras que

las acetilaciones recaen sobre determinados grupos -NH2.

La modificación enzimática de los aminoglucósidos ocurre en el espacio periplásmico o

en la membrana citoplásmica, y produce un doble efecto:

el antibiótico modificado covalentemente ya no puede usar el mecanismo de transporte

facilitado a través de la membrana; por lo tanto, accede en menor cantidad al

citoplasma;

el compuesto modificado ya no puede afectar al ribosoma, por lo que no ejecuta

acción inhibitoria sobre el crecimiento de la bacteria.

9.3. MODIFICACION QUIMICA DE LA DIANA DEL ANTIBIOTICO.

Resistencia a la estreptomicina

Este mecanismo ya fue comentado en la mutación cromosómica strA produce una

proteína ribosómica S12 alterada que impide la unión de la estreptomicina.

Resistencia a la eritromicina

Ciertos plásmidos de cepas de Staphylococcus aureus y de Streptococcus codifican una

metilasa de ARN inducida por la presencia de eritromicina: esta enzima modifica por

metilación un determinado nucleótido del ARNr 23S de la subunidad grande del

ribosoma. Concretamente introduce dos metilos en el N de una determinada adenina,

usando S-adenosilmetionina (SAM) como donador. Esto produce un cambio

conformacional en el ribosoma que disminuye su afinidad hacia la eritromicina y hacia la

lincomicina (resistencia cruzada a los dos antibióticos).

El mecanismo genético subyacente al carácter inducible de la metilasa es muy

interesante; en lugar de un mecanismo a nivel transcripcional, como es habitual en las

bacterias, se trata de un mecanismo de regulación traduccional: en las bacterias en

ausencia de eritromicina el ARNm de la enzima posee una estructura secundaria que

evita su traducción por los ribosomas, pero en presencia de eritromicina este ARNm

cambia de conformación y puede ser leído, produciéndose la metilasa que inactivará la

diana del antibiótico.

http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/20_Micro.html#errores


162

Resistencia a las rifampicinas

Como ya sabemos por el cap. 20, las rifampicinas actúan uniéndose a la subunidad de

la ARN polimerasa eubacteriana. La resistencia a estos antibióticos depende de una

mutación cromosómica que altera dicha subunidad, haciéndola insensible a estos

inhibidores.

Resistencia a las quinolonas, novobiocina y coumermicina

Las mutaciones cromosómicas que interesan a la subunidad A de la ADN-girasa

bacteriana producen resistencia al ácido nalidíxico. Sin embargo, las quinolonas de última

generación (fluoroquinolonas como el ciprofloxacino) no se ven afectadas, quizá debido a

la enorme potencia de estos quimioterápicos.

Las mutaciones cromosómicas que afectan a la subunidad B de la girasa rinden

resistencia a la novobiocina y a la coumermicina

9.4. SINTESIS DE UNA NUEVA ENZIMA RESISTENTE.

Resistencia a sulfamidas

Determinados plásmidos R portan genes de resistencia a sulfamidas (SuR), que codifican

una dihidropteroico sintetasa muy resistente a la acción de estos quimioterápicos, debido

a que tienen una afinidad 10 000 veces menor que la enzima normal codificada por el

cromosoma.

Resistencia a trimetoprim

Muchos plásmidos R llevan un gen que codifica una dihidrofolatorreductasa (DHFR) muy

resistente al trimetoprim.

Resistencia a meticilina

En muchos hospitales medran cepas muy peligrosas de Staphylococcus aureus

resistentes al -lactámico meticilina. Estas cepas producen una forma especial de

proteína PBP2 (la llamada PBP2a) que posee una baja afinidad por los -lactámicos,

incluyendo la meticilina. Parece que el gen codificador correspondiente reside en un

transposón.

Ramirez - Balqui

163

REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS

1). ABRAHAM, E.P. (1981): Antibióticos beta-lactámicos. Inv. y Ciencia 59 (agosto): 30-41.

2). AHARONOVWITZ, Y., G. COHEN, J.F. MARTIN (1992): Penicillin and cephalosporin

biosinthetic genes: structure, organization, regulation and evolution. Annu. Rev. Microbiol.

46: 461-496.

3). ANRAKU, Y. (1988): Bacterial electron transport chains. Ann. Rev. Biochem. 57: 101-

132.

4). ANRAKU, Y., R.B. GENNIS (1987): The aerobic respiratory chain of Escherichia coli.

Trends Biochem. Sci. 12: 262- 266.

5). BAARBER, J. (1987): Photosynthetic reaction centres: a common link. Trends Biochem.

Sci. 12: 321-326.

6). BAGG, A., J.B. NEILANDS (1987): Molecular mechanism of regulation of siderophore-

mediated iron assimilation. Microbiol Rev. 51: 509-518.

7). BALDRY, P. (1981): La batalla contra las bacterias. Reverté, Barcelona.

8). BASTARRECHEA, F., L. SERVIN-GONZALEZ, A.A. COVARRUBIAS (1986): Regulación

de la asimilación de compuestos nitrogenados en Escherichia coli. En: Bioquímica y

Biología Molecular (coordinador: L. Cornudella). Salvat, Barcelona, págs. 192-197.

9). BROCK, T.D. (1961): Milestones in Microbiology (reedición de 1975). American Society

for Microbiology, Washington, D.C.

10). CAMPBELL, W.H., J.R.KINGHORN (1990): Functional domains of assimilatory nitrate

reductases and nitrite reductases. Trends Biochem. Sci. 15:315-319.

11). COLEMAN, G., W.J. COLEMAN (1990): Cómo producen oxígeno las plantas. Inv. y

Ciencia (abril): 50-

12). COLLARD, P. (1976): The development of Microbiology. Cambridge University Press,

Cambridge. Existe versión española: "El desarrollo de la Microbiología", Ed. Reverté.

13). CROSA, J.H. (1989): Genetics and molecular biology of siderophore-mediated iron

transport in bacteria. Microbiol. Rev. 53: 517-530.

14). CSONKA, L.N., A.D. HANSON (1991): Prokaryotic osmoregulation: genetics and

physiology. Annu. Rev. Microbiol. 45: 569-606.

15). CSONKA, L.N., W. EPSTEIN (1996): Osmoregulation. En: "Escherichia coli and

Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology", 2ª edición (F.C. Neidhart, ed.).

American Society for Microbiology Press. Washington, D.C., págs. 1210-1223.

16). CUNDLIFFE, E. (1989): How antibiotic-producing organisms avoid suicide. Ann. Rev.

Microbiol. 43: 207-233.

17). de KRUIJF, P. : Cazadores de microbios. Biblioteca Científica Salvat.

18). DEBRÉ, P. (1995): Louis Pasteur. Barcelona: Círculo de Lectores-Ediciones Debate.

19). DEMMING, J.W. (1987): Ecological strategies of barophilic bacteria in the deep ocean.

Microbiol. Sci. 3: 205-211.

20). DICKERSON, R.E. (1980): El citocromo c y la evolución del metabolismo energético. Inv.

y Ciencia (mayo): 76-88.

21). DUBOS, R. Louis Pasteur. Biblioteca Salvat de Grandes Biografías.

22). F.E.M.S. (1996): Extremophiles. Número especial de la revista FEMS Microbiology

Reviews, 18 (mayo).

23). FERGUSON, S.J. (1987): Denitrification: a question of the control and organization of

electron and ion transport. Trends Biochem. Sci. 12: 354-357.


164

24). FOSTER, J.W. (1992): Beyond pH homeostasis: the acid tolerance response of

Salmonellae. ASM News 58: 266-270.

25). FRANKLIN, T.J., G.A. SNOW (1989): Biochemistry of antimicrobial action (4th edition).

Chapman and Hall, Londres. Para los contenidos del presente tema, se recomienda el

capítulo 3.

26). FRANKLIN, T.J., G.A. SNOW (1989): Biochemistry of antimicrobial action. Chapman and

Hall, Londres.

27). FRANKLIN, T.J., G.A. SNOW (1989): Biochemistry of antimicrobial action (4th edition).

Chapman and Hall, Londres. Se recomienda leer el capítulo 8.

28). GARCIA LOBO, J.M., F. DE LA CRUZ (1990): Mecanismos de formación de

transposones bacterianos con resistencia a múltiples antibióticos. En: "Microbiología

1990" (coordinado por J. Casadesús y F. Ruiz-Berraquero). pp. 45-51. Secretariado de

Publicaciones de la Universidad de Sevilla.

29). GARLAND, P.B. (1981): The evolution of membrane-bound bioenergetics systems: the

development of vectorial oxidoreductions. En: "Molecular and cellular aspects of microbial

evolution", págs. 273-283. (Eds.: M.J. Carlile, J.F. Collins, B.E.B. Moseley). Cambridge

University Press, Cambridge.

30). HARDER, W., L. DIJKHUISEN (1983): Physiological responses to nutrient limitation. Ann.

Rev. Microbiol. 37: 1-23.

31). HARRISON Jr., A.P. (1984): The acidophilic thiobacilli and other acidophilic bacteria that

share their habitat. Ann. Rev. Microbiol. 38: 265-292.

32). HERRERO, A., E. FLORES (1990): Las cianobacterias: fotosíntesis y fijación de

nitrógeno. En "Microbiología 1990", pág. 112-121. Univ. de Sevilla.

33). HOOPER, A.B., A.A. DISPIRITO (1985): In bacteria which grow on simple reductants,

generation of a proton gradient involves extracytoplasmic oxidation of substrate.

Microbiol. Rev. 49: 140-157.

34). HOWARD-FLANDERS, P. (1982): Reparación inducible del ADN. Inv. y Ciencia 64

(enero): 28-37.

35). INGRAHAM, J.L., A.G. MARR (1996): Effect of temperature, pH and osmotic stress on

growth. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular

biology", 2ª edición (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology Press.

Washington, D.C., págs. 1570-1578.

36). JAHN, I., R. LÖTHER, K. SENGLAUB (eds.) (1990): Historia de la Biología. Labor,

Barcelona. (Original alemán: VEB Gustav Fischer Verlag, Jena 1985).

37). JONES, C.W. (1982): Bacterial respiration and photosynthesis. ASM, Whashington, D.C.

38). KLEINHAUF, H., H. von DÖHREN (1987): Biosynthesis of peptide antibiotics. Ann. Rev.

Microbiol. 41: 259-289.

39). KOLTER, R., F. MORENO (1992): Genetics of ribosomally synthesized peptide

antibiotics. Annu. Rev. Microbiol. 46: 141-164.

40). KRIEG, N.R. (1988): Bacterial classification: an overview. Can. J. Microbiol. 34: 536-540.

41). KRULWICH, T.A. (1990): Bacterial energetics. Academic Press, Londres.

42). KRULWICH, T.A., A.A. GUFFANTI (1989): Alkalophilic bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 43:

435-463.

43). KUSHNER, S.R. (1987): DNA repair. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium.

Cellular and molecular biology". (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology.

Washington, D.C. (1987), págs. 1044-1053.

Ramirez - Balqui

165

44). LESSIE, T.G., P.V. PHIBBS, jr. (1984): Alternative patways of carbohydrate utilization in

Pseudomonads. Ann. Rev. Microbiol. 38: 359-387.

45). LINDAHL, T., B. SEDGWICK, M. SEKIGUCHI, Y. NAKABEPPU (1988): Regulation and

expression of the adaptative response to alkilating agents. Ann. Rev. Biochem. 57: 133-

157.

46). LOSADA, M. (1977): Los distintos tipos de fotosíntesis y su regulación. Inv y Ciencia

(abril): 6-8.

47). MADIGAN, M.T., B.L. MARRS (1997): Extremófilos. Inv y Ciencia 249 (junio): 60-66.

48). MARGULIS, L., K.V. SCHWARTZ (1985): Cinco Reinos. Labor, Barcelona.

49). MARTIN, J.F., P. LIRAS (1989): Organization and expression of genes involved in the

biosynthesis of antibiotic and other secondary metabolites. Ann. Rev. Microbiol. 43: 173-

206.

50). MATIN, A. (1978): Organic nutrition of chemolithotrophic bacteria. Ann. Rev. Microbiol.

32: 433-468.

51). MATIN, A., E.A. ANGER, P.H. BLUM, J.E. SCHULTZ (1989): Genetic basis of starvation

survival in nondifferentiating bacteria. Ann.Rev. Microbiol. 43: 293-316.

52). MAURER, I.M. (1969): A test for stability and long-term effectiveness in disinfectants.

Pharm. J. 203: 529-534.

53). MILLER, K.J., J.M. WOOD (1996): Osmoadaptation by rhizosphere bacteria. Annu. Rev.

Microbiol. 50: 101-136.

54). MURRAY, R.G.E. (1984): Higher taxa, or a place for everithing...?. En: "Bergey's manual

of Systematic Bacteriology". Williams & Wilkins, Baltimore.

55). MYERS, T. (1988): Failing the test: germicides or use dilution technology? ASM News 54:

1921.

56). NEIDHART, F.C., J.L. INGRAHAM, M. SCHAECHTER (1990): Physiology of the bacterial

cell: a molecular approach. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. Consultar el

capítulo 8.

57). NEIDHART, F.C., J.L. INGRAHAM, M. SCHAECHTER (1990): Physiology of the bacterial

cell: a molecular approach. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. Consultar el

cap. 5, especialmente págs. 148-171.

58). NEIDLANS, J.B. (1982): Microbial envelope proteins related to iron. Ann. Rev. Microbiol.

36: 285-309.

59). NELSON, N., L. TAIZ (1989): The evolution of H+-ATPases. Trends Biochem. Sci. 14:

113-116.

60). NICHOLS, D.G. (1987): Bioenergética: introducción a la teoría quimiosmótica. Ed.

Reverté, Barcelona. (Versión original: "Bioenergetics- an introduction to the

Chemiosmotic Theory", Academic Press, Londres, 1982., pero acaba de salir -1993- la

segunda edición inglesa).

61). PARMEGGIANI, A., G.W.M. SWART (1985): Mechanism of action of kirromycin-like

antibiotics. Ann. Rev. Microbiol. 39: 557-577.

62). POOLE, R.K., W.J. INGLEDEW (1987): Patways of electrons to oxygen. En: "Escherichia

coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology". (F.C. Neidhart, ed.).

American Society for Microbiology. Washington, D.C. (1987), págs. 170-200.

63). RADMAN, M., R. WAGNER (1988): Fidelidad en la duplicación del ADN. Inv. y Ciencia

145 (octubre): 20-29.

64). REES, D.C., H. KOMIYA, T.O. YEATES, J.P. ALLEN, G. FEHER (1989): The bacterial


166

photosynthetic reaction center as a model for membrane proteins. Ann. Rev. Biochem.

58: 607-633.

65). RUPP, W.D. (1996): DNA repair mechanisms. En: "Escherichia coli and Salmonella

typhimurium. Cellular and molecular biology", 2ª edición (F.C. Neidhart, ed.). American

Society for Microbiology Press. Washington, D.C., págs. 2277-2294.

66). SALYERS, A.A., B.S. SPEER, N.B. SHOEMAKER (1990): New perspectives in

tetracycline resistance. Molec. Microbiol. 4: 151-156.

67). SANCAR, A., G.B. SANCAR (1988): DNA repair enzymes. Ann. Rev. Biochem. 57: 29-67.

68). SANCAR, G.B., A. SANCAR (1987): Structure and function of DNA photolyases . Trends

Biochem. Sci. 12: 259-261.

69). SANDERS, C.C. (1987): Chromosomal cephalosporinases responsible for multiple

resistance to newer beta-lactam antibiotics. Ann. Rev. Microbiol. 41: 573-593.

70). SLONCZEWSKI, J.L., J.W. FOSTER (1996): pH-regulated genes and survival at extreme

pH. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology", 2ª

edición (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology Press. Washington, D.C.,

págs. 1539-1550.

71). SPENCER, M.E., J.R. GUEST (1987): Regulation of citric acid cycle genes in facultative

bacteria. Microbiol Sci. 4: 164-168.

72). STACKEBRANDT, E. (1988): Phylogenetic relationships vs. phenotypic diversity: how to

achieve a phylogenetic classification system of the eubacteria. Can. J. Microbiol. 34: 552-

556.

73). TABITA, F.R. (1988): Molecular and cellular regulation of autotrophic carbon dioxide

fixation in microorganisms. Microbiol. Rev. 52: 155-189.

74). TEMPEST, D.W., O.M. NEIJSSEL (1984): The status of YATP and maintenance energy as

biologically interpretable phenomenon. Ann. Rev. Microbiol. 38: 459-486.

75). TRIEU-CUOT, P., M. ARTHUR, P. COURVALIN (1987): Origin, evolution and

dissemination of antibiotic resistance genes. Microbiol. Sci. 4: 263-266.

76). Van VERSEVELD, H.W., G. BOSMA (1987): The respiratory chain and energy

conservation in the mitochondrion-like bacterium Paracoccus denitrificans. Microbiological

Sci. 4: 329-333.

77). VINING, L.C. (1990): Functions of secondary metabolites. Ann. Rev. Microbiol. 44: 395-

427.

78). WALKER, G.C. (1996): The SOS response of Escherichia coli. En: "Escherichia coli and

Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology", 2ª edición (F.C. Neidhart, ed.).

American Society for Microbiology Press. Washington, D.C., págs. 1400-1416.

79). WOMBLE, D.D., R.H. ROWND (1988): Genetic and physical map of plasmid NR1:

comparison with other IncFII antibiotic resistance plasmids. Microbiol. Rev. 52: 433-451.

80). WOOD, H.G., S.W. RAGSDALE, E. PEZACKA (1986): The acetyl-CoA pathway: a newly

discovered pathway of autotrophic growth. Trends Biochem. Sci. 11: 14-17.

81). YOUVAN, D.C., B.L. MARSS (1987): Mecanismo molecular de la fotosíntesis. Inv. y

Ciencia 131 (agosto): 34-41.

82). ZACCAI, G., H. EISENBERG (1990): Halophilic proteins and the influence of solvent on

protein stabilization. Trends Biochem. Sci. 15: 333-337.

83). ZUBER, H. (1986): Structure of ligth-harvesting antenna complexes of photosynthetic

bacteria, cyanobacteria and red algae. Trends Biochem. Sci. 11: 414-419.

Ramirez - Balqui

167

Documents

microbilogia de bacterias anaerobicas