Upload
nguyendien
View
244
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA FACULTAD DE CIENCIAS
Microbiología y biotecnología MANUAL DE PRÁCTICAS
BIOLOGIA: PLAN DE ESTUDIOS 2008
M. en C. Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Microbiología y biotecnología
2 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
CONTENIDO
No. de práctica
Nombre de la práctica No. Página
1a Bioseguridad 4
1b Observación al microscopio de preparaciones fijas 9
2 Preparación de medios de cultivo y la necesidad de practicar la técnica aséptica
12
3 Importancia de la técnica aséptica (ubicuidad de los microrganismos)
15
4 Observación morfológica de las colonias bacterianas 18
5 Técnicas de inoculación 24
6 Tinción de microorganismos 29
7 Tinción de esporas 34
8 Aislamiento de microorganismos aerobios mesofilos 40
9 Determinación del número de microorganismos esporógenos en alimentos
48
10 Recuento de bacterias heterótrofas totales en el suelo 51
11 Uso de los medios de cultivo 58
12 Efecto de los agentes físicos sobre los microrganismos 64
13 Efecto de los agentes químicos sobre los microrganismos 70
14 Relación entre los microorganismos y caries dental 76
15 Coeficiente fenólico 78
16 Determinación de la concentración mínima inhibitoria de un antibiótico
80
17 Estudio bacteriológico de bivalvos 82
Apéndice 1 Formato para presentar el reporte 84
Bibliografía 86
Microbiología y biotecnología
3 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
REGLAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Localizar todos los equipos de seguridad como extinguidores, lavador de ojos,
regaderas, etc.
Proteger los ojos si trabajará con reactivos corrosivos, peligrosos o con luz
ultravioleta.
Usar bata de laboratorio, lo protegerá del material corrosivo o blanqueadores.
Nunca pipetee con la boca o pruebe algún reactivo.
No fumar, comer o beber en el laboratorio.
El pelo largo de preferencia recogerlo.
No usar sandalias con los pies descubiertos.
No colocar los libros o cuadernos en el área de trabajo.
Reporte cualquier daño o accidente en el laboratorio.
Pregunte al maestro cualquier duda en el manejo de reactivos y/o equipos.
Todos los reactivos pueden ser un riesgo para la salud, trabaje con cuidado.
La mayoría de las prácticas de este laboratorio usan reactivos cancerígenos o
tóxicos, así como agentes potencialmente patógenos, trabaje con seriedad y
cuidado.
En caso de contaminarse con algún reactivo lavarse con agua rápidamente y
avisar al maestro.
Microbiología y biotecnología
4 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 1a
Bioseguridad
Objetivo: al terminar la práctica el estudiante será capaz de trabajar en un laboratorio de
microbiología de forma segura para preservar su salud, la de sus compañeros y la del medio; así
como de aplicar los conocimientos para disminuir algún riesgo biológico.
Introducción:
TELÉFONO DE EMERGENCIA 066
El laboratorio constituye el lugar de trabajo en la enseñanza y en la investigación, por eso
es preciso conocer las características que debe reunir. Existen algunos puntos comunes a casi
todos los tipos de laboratorio:
Localización y orientación del laboratorio: su localización depende del trabajo que en él se
realice. Por ejemplo, un laboratorio de biología marina debe ubicarse, obviamente cerca del
mar o en el mismo mar (barco) y no en una montaña, así como debe de buscarse que las
ventanas estén orientadas de forma tal que sea la iluminación natural la que predomine.
Instalaciones: las principales son: calefacción y ventilación, desagüe y provisión de agua,
gas, electricidad, líneas de vacío y aire a presión, iluminación.
1. La ventilación puede ser natural o artificial, debe de evitarse la formación de corrientes
de aire, ya que pueden perjudicar aparte del material de estudio, al personal que labora en
el laboratorio.
2. Deben evitarse los sistemas de desagüe abierto o de cámaras alimentadas para varios
sumideros. Los materiales de construcción deben ser capaces de soportar todas las
condiciones impuestas, para lo cual se recomienda usar caños y uniones de material
resistente a ácidos y solventes.
Microbiología y biotecnología
5 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
3. Es necesario que los conductos para los cables eléctricos, gas, agua, etc, sean accesibles y
estén fuera de los lugares de paso y además lleguen por instalaciones ocultas o
superficiales pero de forma que no obstruyan las superficies de las mesas.
4. La iluminación puede ser natural o artificial, la más conveniente por su intensidad es la
natural.
Entre los requisitos principales para los materiales de construcción tenemos:
a) Superficies lisas no porosas
b) Resistentes a la corrosión
c) No iónicas
d) Resistentes al calor
e) Impermeables
El conocimiento de las reglas de seguridad es de vital importancia para TU seguridad y la
de tus compañeros, lo más importante es pensar siempre con sentido común. La mayoría de los
accidentes en el laboratorio podrían haberse evitado si no se hubiera actuado irreflexivamente.
Los descuidos o el desconocimiento de posibles peligros en el laboratorio pueden originar
accidentes de efectos irreversibles. Es importante, por tanto, que cumplas con las instrucciones
que te indique el instructor acerca del cuidado que se debe tener en el laboratorio
Los mayores peligros en un laboratorio no son el fuego y las descargas eléctricas, sino el
descuido y la irresponsabilidad. Ocasionalmente, se producen accidentes por una falta en el
diseño, con frecuencia, por un mantenimiento no apropiado y en la mayoría de los casos, por un
operador que actúa antes de pensar. Es necesario que antes de empezar las sesiones de
laboratorio leas y comprendas y lo que en él se va a realizar, sigue las siguientes
recomendaciones.
La realización de las actividades experimentales además de cumplir con el objetivo para
el cual fueron diseñadas, deben de realizarse dentro de un ambiente de seguridad que nos permita
trabajar con un mínimo de riesgo, para lo cual deben de seguirse ciertas normas. Lee
detalladamente las siguientes reglas.
1. Prepárate siempre para cualquier experimento, leyendo las instrucciones antes de ir al
laboratorio. Ten presente todas las precauciones indicadas en la guía. LO QUE NO
ENTIENDAS PREGUNTASELO AL INSTRUCTOR ANTES DE EMPEZAR A
TRABAJAR. Cerciórate bien de lo que se está haciendo y de lo que hacen tus compañeros.
Evita las bromas y juegos en el laboratorio, así como comer y beber.
2. Nunca efectúes un experimento distinto al indicado sin previa autorización del instructor,
ASEGURATE DE QUE TE ESCUCHO BIEN, EFECTÚA CONTACTO VISUAL CON EL.
Microbiología y biotecnología
6 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
3. Siempre porta la bata dentro del laboratorio, así como el equipo de protección indicado en
cada práctica. Registra en tu cuaderno de notas, las técnicas empleadas y los resultados así
como las modificaciones que se hayan realizado.
4. Si llegara a ocurrir algún accidente en el laboratorio, informa inmediatamente al profesor y/o
al auxiliar de laboratorio y si es posible proporciona ayuda
a) Incendios: usa extintor o manta para sofocar incendios; los incendios pequeños se apagan
con una toalla; si el fuego alcanza a una persona se debe conducir inmediatamente a la
ducha (regadera) de seguridad, en caso de no contar con ella, enrollarla en la manta y
darle vueltas en el piso, nunca se debe permitir que una persona corra con las ropas
incendiadas pues esto aviva la combustión. Conserva la calma y evita situaciones
alarmistas innecesarias.
b) Ingestión de productos químicos: si accidentalmente se ingiere un ácido o un álcali fuerte,
proceder como se indica:
- Para ácidos: suministrar hielos, clara de huevo y conducirlo a servicios médicos.
TELÉFONO DE EMERGENCIA 066
- Para álcalis: suministrar vinagre o jugo de limón, leche, aceite de cocina y conducirlo
a servicios médicos. TELÉFONO DE EMERGENCIA 066
- Para sales como el nitrato de plata: agua y sal y conducirlo a servicios médicos.
TELÉFONO DE EMERGENCIA 066
c) Quemaduras externas con ácidos: lavar abundantemente con agua corriente y
posteriormente lavar con solución de bicarbonato de sodio al 1 % w/v. TELÉFONO DE
EMERGENCIA 066
d) Quemaduras externas con álcali: lavar abundantemente con agua corriente y
posteriormente lavar con solución de ácido bórico al 2 % w/v. TELÉFONO DE
EMERGENCIA 066
PARA LOS CASOS ANTERIORES SE DEBE DE FIJAR SI EL ACCIDENTADO ESTA
CONSCIENTE, NUNCA, nunca, NUNCA, NUNCA, SE DEBEN DE DAR LÍQUIDOS A UNA
PERSONA INCONSCIENTE.
5. No se deben probar o saborear los productos químicos o biológicos que estén bajo análisis,
tampoco se debe de comer o de llevar objetos a la boca. Bajo ninguna circunstancia se deben
de oler los cultivos microbianos
6. No toques nunca los cultivos con la mano, a menos que se le autorice DE FORMA
EXPLICITA A ELLO. Para manipularlos usa espátulas, asas bacteriológicas, pinzas, etc.
lávate las manos antes de salir del laboratorio.
7. Cuando dejes de usar un reactivo o una solución, regrésala a su lugar. Conserva en la mesa
de trabajo el mínimo de equipo y materiales necesarios y opera en condiciones de limpieza.
8. Al preparar cualquier solución de sustancias químicas se deben de seguir las instrucciones de
las prácticas o las que se indiquen en la dosificación de los reactivos. Una vez preparada se
deben envasar y etiquetar indicando de:
a. que sustancia y concentración se trata
b. fecha de preparación y caducidad
c. nombre de quien la elaboró
d. condiciones de almacenamiento
Microbiología y biotecnología
7 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
e. cuidados especiales (si procede).
9. Al prender la llama de un mechero, usa de preferencia un encendedor largo, préndelo primero
y colócalo sobre la parte superior del propio mechero (conectado a la toma de gas), enseguida
abre la llave del gas hasta obtener la intensidad de la flama requerida; ajustar en caso
necesario, el paso del aire para obtener una buena combustión. Al darse cuenta de una fuga
de gas, no se deben encender cerillos ni luces. SE DEBEN DE abrir puertas y ventanas para
que se ventile y no provocar una explosión. Una vez ventilada el área y solucionado el
problema, se podrá trabajar.
10. Deja pasar bastante tiempo para que se enfríen el vidrio y los objetos calientes antes de
guardarlos y/o manipularlos.
11. Cuando trabajes con equipo de vidrio, como tubos y termómetros, presta mucha atención
pues es un material frágil y se rompe fácilmente pudiendo producirte lesiones, estos
desafortunadamente son accidentes frecuentes.
12. Todos los sólidos y papeles que sean desechados se deben de arrojar a un recipiente
adecuado para desechos. No arrojar al drenaje cerillos, papel filtro, sólidos poco solubles o
cualquier material no indicado. NUNCA DEPOSITAR dos reactivos químicos juntos si se
desconoce su reactividad.
13. Antes de usar un reactivo o una solución se debe leer la etiqueta para identificarlo, tomar la
cantidad exacta y necesaria y tapar enseguida el frasco. En caso de duda, leer la hoja de
seguridad para tal reactivo (MSDS, por sus siglas en inglés), estas se encuentran en una
libreta en el almacén o en el laboratorio de donde tomaste el reactivo o medio.
14. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los compuestos utilizados, pese
solamente lo necesario. Guarda los frascos de las sustancias que hayas utilizado,
perfectamente tapados y limpios, las sustancias que así lo requieran deben guardarse en
frascos ámbar.
15. La mesa y el equipo de trabajo deben estar limpios antes de iniciar el experimento, debes de
cerciorarte de que tienes todo lo necesario en tu mesa de trabajo. Al finalizar la sesión, todo
debe quedar limpio antes de salir del laboratorio. Si se derrama algún reactivo o mezcla o
cultivo, AVISA AL MAESTRO O INSTRUCTOR para que te oriente acerca de la forma
correcta de limpiarlo. Los equipos se deben colocar en su sitio correspondiente. Cerciórate de
que las llaves de agua, aire, vacío y gas quedaron perfectamente cerradas, así como revisar
los aparatos y las instalaciones eléctricas. NINGÚN APARATO DEBE QUEDAR
ENCENDIDO SIN MOTIVO.
16. Al desconectar un aparato eléctrico del contacto, jala de la clavija, NUNCA del cable. No te
expongas a un corto circuito.
17. Antes de lavar recuerda que los materiales que contuvieron cultivos deben esterilizarse
primero. El lavado de material de vidrio, porcelana se efectúa comúnmente con detergente
líquido y agua fría o caliente. El lavado se repite varias veces, el material se revisa y se deja
escurrir después de haberlo enjuagado con agua destilada. Se recomienda secar el material
antes de usarlo. En ocasiones es posible que no baste con el simple lavado por lo que deben
de usarse escobillones de diferentes tamaños (procedimiento mecánico, pm).
¡CUIDADO! ESTO LO HARÁ SÓLO EL PERSONAL CALIFICADO PARA
TRABAJAR CON SUSTANCIAS REACTIVAS. Si los procedimientos anteriores no han dado
Microbiología y biotecnología
8 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
el resultado deseado, se puede lavar con sustancias químicas como ácido clorhídrico, ácido
nítrico, solución de hidróxido de sodio, agua regia, solución de permanganato de potasio,
hidróxido de amonio concentrado, etc. Se vierte el ácido o la solución de lavado y se deja
bastante tiempo y luego se procede al lavado. Los materiales grasosos pueden lavarse con mezcla
crómica, la cual puede calentarse para acelerar su acción. ¡CUIDADO! ESTO LO HARÁ SÓLO
EL PERSONAL CALIFICADO PARA TRABAJAR CON SUSTANCIAS REACTIVAS.
El trabajo en el laboratorio requiere frecuentemente de conexiones y de dispositivos sencillos
que podemos fabricar nosotros mismos. Con este fin se utiliza la tubería de vidrio, las mangueras
de látex y los mecheros de gas.
Cuestionario:
1. Explica cuales son las partes de la flama de un mechero y sus usos en el laboratorio
2. Explica las diferencias entre los mecheros bunsen y Fisher
3. ¿Cuál es el número al que debes de llamar en caso de una emergencia?
Microbiología y biotecnología
9 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 1b
Observación al microscopio de preparaciones fijas
Objetivo: al terminar la práctica el estudiante será capaz de determinar diferentes características
microscópicas de los microorganismos utilizadas para su identificación y clasificación por medio
del uso adecuado del microscopio óptico.
Introducción: debido a su pequeño tamaño (menor a 0.2 mm), los microorganismos deben de
ser tratados para poder observarlos, este tratamiento involucra un procedimiento para fijarlos a
una placa de vidrio (portaobjeto) para ser posteriormente teñidos y luego observados con un
instrumento que aumente su tamaño. En los laboratorios se emplea de forma común para
observarlos el microscopio óptico que tiene un límite de resolución (0.2 µm) que es menor al
tamaño de los microbios.
El microscopio consta fundamentalmente de partes mecánicas y ópticas. La parte mecánica,
soporte o cuerpo del microscopio, es en esencia un armazón mecánico que sostiene el sistema
óptico del aparato. Las características del soporte deben ajustarse a las necesidades funcionales
de los componentes de la parte óptica, a los cuales debe mantener sólidamente unidos entre sí, de
modo que no sufran vibraciones ni distorsiones y se mantengan siempre perpendiculares al eje
óptico que las atraviesa. Al mismo tiempo, el soporte debe estar provisto de mecanismo que
permita el desplazamiento de estas unidades a lo largo del eje óptico, de modo que puedan
variarse las distancias a que se encuentran. Finalmente la platina o pieza que sostiene la
preparación, debe formar ángulo recto con el eje óptico.
El soporte consta de un pie o base para darle estabilidad al microscopio y evitar que resbale,
sujeto al pie se encuentra el brazo, que es el que lleva las tres unidades ópticas del microscopio
así como los mecanismos para el enfoque, el brazo consta de la parte por donde se coge el
microscopio y se llama asa, la pieza que sostiene la preparación denominada platina y el tubo
que es la parte donde están montados los oculares en la parte superior y los objetivos en la parte
inferior.
Microbiología y biotecnología
10 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
La pieza que sostiene la preparación se llama platina que tiene movimientos de arriba a abajo y
de derecha a izquierda, debajo de ella se encuentra la subplatina que es el dispositivo donde va
montado el condensador, también en el brazo están los tornillos que permiten el enfoque, el
macrométrico que es el de ajuste rápido y grosero y el tornillo micrométrico que es el de ajuste
lento y preciso.
Los tres elementos ópticos del microscopio son: oculares, objetivos y condensador. De estos tres
el objetivo es el más importante ya que éste produce la imagen aumentada del objeto y la calidad
de esta imagen en cuanto a sus detalles estructurales y aspecto general no puede ser mejorada por
los demás elementos. Los microscopios que se utilizan en la facultad están dotados de objetivos
parafocales, que significa que si cualquiera de ellos está enfocado, al cambiar de objetivo, éste
queda prácticamente enfocado, de modo que, en todo caso será suficiente una ligera graduación
con el tornillo micrométrico para conseguir un enfoque perfecto. Esto es más evidente cuando se
pasa de objetivos de gran aumento a objetivos de pequeño aumento, ya que los últimos tienen
una gran profundidad de enfoque y puede suceder fácilmente que el enfoque inicial no esté bien
centrado sino que se realice en la parte superior o inferior de la profundidad de campo. Por tanto
para la comprobación de la parafocalidad de los objetivos conviene hacer el enfoque inicial con
el objetivo de mayor aumento sin inmersión y pasar después a los demás objetivos de mayor a
menor aumento. El aumento nominal es el que viene grabado sobre el cuerpo del objetivo y
aumento total es el aumento que se observa por el ocular, para calcularlo basta multiplicar el
aumento primario (nominal) por el del ocular.
La segunda unidad óptica fundamental del microscopio es el ocular, su objetivo es aumentar la
imagen producida por el objetivo, con el fin de que pueda llegar aumentada al ojo del
observador.
El tercer elemento óptico básico del microscopio es el condensador, su finalidad primordial es
iluminar la preparación en la parte enfocada por el objetivo de modo que el campo visual
presente una iluminación uniforme, una segunda finalidad es la de suministrar al objetivo un
cono de luz del tamaño y naturaleza adecuadas para la obtención de resultados óptimos.
Material:
Microscopio
Aceite de inmersión
Laminillas con tinciones bacterianas
Papel secante
Procedimiento:
Coloca el microscopio de forma estable en la mesa y ubica todos sus componentes.
Microbiología y biotecnología
11 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Toma una laminilla y límpiala de algún residuo de aceite o de polvo, a continuación colócala en
la platina y sujétala con las pinzas del carro móvil. Enfoca primero con el objetivo de menor
aumento (lupa) y localiza un área que sea fácilmente visible, continua con el siguiente objetivo
en aumento (seco débil) y así hasta finalizar con el de mayor aumento sin inmersión (seco
fuerte), pata comprobar la parafocalidad repite esta operación a la inversa, esto es, disminuye de
aumento. Regresa al seco fuerte y sin desenfocar, mueve el revólver (donde se encuentran los
objetivos) y déjalo en un punto intermedio, coloca una pequeña gota de aceite de inmersión y
enfoca ahora con el objetivo de inmersión en aceite, ésta es la imagen que debes de reportar,
fíjate en la forma de las células y en su agrupación, así como en el color que presentan.
Repite lo anterior con otra laminilla.
Cuestionario:
1. ¿Cuál fue el procedimiento que se te indicó para enfocar correctamente las muestras a
observar?
2. ¿Cuáles son las partes ópticas de un microscopio y cuál es la función de cada una de
ellas?
Microbiología y biotecnología
12 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 2
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y LA NECESIDAD DE PRACTICAR LA
TÉCNICA ASÉPTICA
Objetivo: al finalizar la práctica el alumno será competente para preparar medios de cultivo
sólidos y líquidos, de esterilizarlos, vaciarlos en cajas petri y tubos así como de practicar la
técnica aséptica y ver de manera objetiva la importancia de ésta.
Introducción: los microorganismos son ubicuos en la naturaleza, los podemos encontrar en el
aire, agua, tierra y aún en el interior de los organismos. Por éste motivo es necesario que al
investigar la presencia de determinados microorganismos o el número de ellos, el material a usar
esté libre de ellos (estéril.) Para esto se ejercen las técnicas asépticas y la esterilización del
material.
Las bacterias pueden ser clasificadas en autótrofas y heterótrofas, dentro de las primeras
se encuentran las bacterias del suelo y del agua, que obtienen C y N de la atmósfera y de la
materia inorgánica simple. Las heterótrofas requieren compuestos orgánicos (proteínas,
carbohidratos y grasas) como fuente de C y N.
Las proteínas se suministran como peptonas preparadas por digestión parcial de la carne
con enzimas pépticas. Los carbohidratos suministran el C necesario. Otros factores como las
vitaminas del complejo B, son requeridos por algunas bacterias (auxótrofas). En ocasiones es
necesario complementar los medios de cultivo con nutrimentos complejos como suero, sangre,
yema de huevo, etc. (medios enriquecidos) Existen medios de cultivo en donde los ingredientes
necesarios son conocidos en su totalidad (medios mínimos). En los medios mínimos que no
llevan metabolitos esenciales crecen los microorganismos protótrofos.
Los aerobios obligados precisan de una atmósfera con oxígeno para su desarrollo; los
anaerobios obligados son incapaces de reproducirse en presencia de oxígeno libre, los que
pueden reproducirse tanto en presencia como en ausencia de oxígeno son los anaerobios
facultativos.
Los microorganismos cuya temperatura óptima es menor es de 15 0C o menos y una
temperatura mínima de crecimiento de 0 0C o menos, se consideran psicrófilos verdaderos, los
microorganismos que crecen a temperaturas por arriba de los 45 o 50 0C se les llama termófilos.
Aquellos cuya temperatura mínima está por arriba de los 15 0C y su temperatura máxima por
debajo de los 45 0C, son los llamados mesófilos. A las temperaturas mínima, máxima y óptima se
les llama temperaturas cardinales.
Material:
Agar nutritivo
Caldo nutritivo
Microbiología y biotecnología
13 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Detergente
Papel estraza
2 pipetas de 1 mL
1 pipeta de 10 mL
Una espátula
Dos matraces Erlenmeyer de 250 mL
Una piceta con alcohol
Una piceta con agua destilada
Balanza granataria
Testigos de esterilización
4 cajas petri de vidrio
4 tubos con rosca
Un mechero Fisher
Procedimiento:
1. NO LIMPIES LA MESA DE TRABAJO
2. Limpia de polvo perfectamente todo el material de vidrio.
3. Lava perfectamente dos cajas, dos tubos con rosca, una pipeta de 1 mL, la pipeta de 10 mL y
los dos matraces con detergente.
4. Enjuaga el material lavado perfectamente con agua destilada (para evitar dejar restos del
detergente).
5. Prepara 50 mL de caldo nutritivo y coloca 10 mL en cada uno de los 4 tubos con ayuda de la
pipeta de 10 mL (El caldo se prepara en un matraz y luego se transfiere a tubos)
6. Prepara 100 mL de agar nutritivo en el matraz erlenmeyer restante, fúndelo (El agar se
prepara en un matraz erlenmeyer de al menos el doble del volumen de agar que se preparará).
CUIDADOSAMENTE con el mechero, USA GUANTES PROTECTORES. Deja enfriar a
más o menos 45 0C.
7. Vacía agar en las dos cajas que no lavaste, deja solidificar sin taparlas.
8. Envuelve las cajas y la pipeta de 1 mL que lavaste con papel estraza.
9. Coloca dentro del autoclave el material envuelto en papel estraza, dos de los tubos que
contienen caldo nutritivo y el matraz con el resto del agar que preparaste y esterilízalos (121 0C/15 min). Usa testigos de esterilización.
10. Con ayuda de la pipeta de 1 mL que no envolviste, transfiere un mL de un tubo a otro de los
que no metiste a la autoclave y regresa el mL al tubo original de la misma forma, este es un
ciclo, repite el ciclo 5 veces no enciendas el mechero, no cierres la puerta, puedes hablar
mientras trabajas (márcalos nEnA).
11. Verifica que las cajas que vaciaste en el paso 7 ya solidificaron, puedes tocarlo con los dedos,
para asegurarte de su estado (márcalas nEnA).
12. LIMPIA LAS MESAS CON AGUA Y JABÓN Y POSTERIORMENTE CON ALCOHOL.
CIERRA PUERTAS Y VENTANAS.
13. Cuando sea el tiempo de sacar el material del autoclave (presión cero y temperatura inferior a
80 0C), hazlo.
14. Vacía 25 mL por caja, haz esto con el mechero encendido. Cierra las cajas y deja solidificar
en reposo (márcalas EA.).
Microbiología y biotecnología
14 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
15. Con una pipeta ESTÉRIL, pasa 1 mL de un tubo con caldo estéril a otro con caldo estéril,
con el mechero encendido (márcalos EA.) Haz la operación inversa. Repite el ciclo 5 veces.
16. Cada vez que vacías agar en una caja petri recuerda que lo debes de dejar solidificar.
17. Incuba todo el material a 37 0C por 24 horas, recuerda que las cajas van en posición
invertida, esto es, con la tapa hacia abajo, el agar debe de quedar arriba.
18. Revisa tu material al día siguiente y anota tus observaciones
19. Etiqueta tu material NO CONTAMINADO y guárdalo en el refrigerador
Cuestionario:
1. ¿Porque las cajas petri se incuban en posición invertida?
2. ¿Qué es un testigo de esterilización?
3. ¿Qué es esterilización?
4. ¿Qué métodos existen para comprobar temperaturas y tiempos de esterilización?
5. ¿Cuándo se debe considerar que un material está medio estéril?
6. ¿Qué es el agar-agar
7. ¿Cuál es la composición del caldo nutritivo
8. ¿En qué difieren la composición del caldo nutritivo y del agar nutritivo?
9. Examine las fórmulas de los medios utilizados y explique cuáles de sus ingredientes sirven
como:
fuente de carbono
fuente de nitrógeno
fuente de energía
fuente de sales minerales
10. ¿De dónde procede el agar-agar?
11. ¿Para qué se utiliza el agar agar?
12. ¿Cómo se esterilizan los medios termolábiles?
13. ¿Qué hubiera pasado si el material se esteriliza, pero no se limpia la mesa y se habla mientras
se trabaja?
14. ¿Qué hubiera pasado si el material no se esteriliza, pero se limpia la mesa, no se habla
mientras se trabaja y se enciende el mechero?
Microbiología y biotecnología
15 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 3
IMPORTANCIA DEL USO DE LA TÉCNICA ASÉPTICA
(UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS)
Objetivo: al finalizar la práctica el alumno será capaz de comprobar que el uso de la técnica
aséptica es vital para obtener resultados óptimos en el laboratorio de microbiología.
Introducción: el termino asepsia se refiere a un estado libre de gérmenes, como el trabajo en el
laboratorio de microbiología consiste en poner en evidencia la presencia o ausencia de los
microbios (ya sea en lo general o en específico a un grupo de ellos), es notoria entonces la
importancia de trabajar en condiciones asépticas. Debido a que los microorganismos se
encuentran en prácticamente todo tipo de ambiente terrestre es necesario practicarla para evitar
los resultados falsos (ya sean falsos positivos o falsos negativos).
Los objetivos de la investigación microbiológica son encontrar algún tipo de
microorganismo o no encontrar ningún tipo de ellos en el material que se examina. Si el equipo,
reactivos, medios o la realización del trabajo no aseguran que los microorganismos encontrados
o no, lo son en razón del material, entonces no hay confiabilidad en los resultados.
Debido a la plasticidad genética que exhiben los microbios es posible encontrarlos en una
gran variedad de ambientes, esto es de fundamental importancia para el trabajo en condiciones
asépticas, pues no basta con saber de la ubicuidad de los microorganismos sino trabajar cuidando
todos los detalles.
Los microorganismos tienen diversas funciones: degradación de material orgánico,
fijación de nitrógeno atmósferico, producción de vitaminas, etc. Además de estas funciones
también son capaces de causar enfermedades es por esto que el estudiante debe de:
1. Estar conciente del riesgo potencial de los materiales y de los microorganismos que maneja.
2. Saber cuales son las rutas de entrada de los microorganismos patógenos al cuerpo humano y
por lo tanto causar infecciones.
3. Recibir las instrucciones adecuadas y de practicar una buena técnica microbiológica que
contenga efectivamente a los microorganismos de modo tal que no tengan acceso a estas
rutas.
Microbiología y biotecnología
16 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Existen al menos cuatro rutas por las cuales los microorganismos pueden entrar al cuerpo
humano y causar infección, estas son:
1. A través de los pulmones: los aerosoles (pequeñas gotas, <0.5 m) que contienen
microorganismos, se liberan frecuentemente durante las manipulaciones microbiológicas:
trabajo con asa y jeringas, pipetear, centrifugar, licuar, mezclar, homogenizar, vaciar, abrir
cajas y tubos de cultivo. La inhalación de estas gotas ha causado probablemente el mayor
número de infecciones adquiridas en el laboratorio.
2. A través de la boca: se pueden ingerir microorganismos durante las actividades de pipeteo y
pueden ser transportados a la boca por dedos y artículos contaminados (comida, cigarros,
plumas, etc.) que hayan estado en contacto con mesas de laboratorio contaminadas por
vertimientos, salpicaduras o por asentamiento de aerosoles.
3. A través de la piel: la piel raras veces está libre de cortadas y abrasiones (generalmente
diminutas) por las cuales los microorganismos pueden entrar al torrente sanguíneo. Las
infecciones también pueden resultar como consecuencia de inoculación accidental con
agujas, material de vidrio roto u otros utensilios afilados.
4. A través de los ojos: las salpicaduras de material infectado a los ojos o la contaminación de
estos por los dedos contaminados son también una ruta común.
Dependiendo de la peligrosidad de los microorganismos con los que se trabaja, existen
los niveles de seguridad o de contención, que van del nivel 1 para los microorganismos que no
poseen riesgo o este es mínimo, hasta el nivel cuatro para los microorganismos que poseen
riesgos altos de causar infección ya sea al trabajador o a la comunidad.
Material:
1. Dos cajas petri con agar nutritivo estériles.
2. Un mechero tipo Fisher.
3. Alcohol, algodón.
4. Un plumón marcador para vidrio.
5. Cerillos chispa
6. Probeta de 250 mL
7. Un matraz erlenmeyer de 250 mL
Procedimiento:
SE PUEDEN SUSTITUIR POR LAS DOS CAJAS EA DE LA PRÁCTICA ANTERIOR, EN
CASO DE QUE SE TE HAYAN CONTAMINADO, ENTONCES
1. Lava perfectamente las cajas petri.
2. Enjuágalas perfectamente con agua destilada (para evitar dejar restos del detergente).
3. Prepara agar con agua destilada.
4. Esteriliza el agar en autoclave (15/15)
5. Deja enfriar el agar hasta 45 0C aproximadamente
6. Vacía el agar en las cajas petri y deja solidificar.
Microbiología y biotecnología
17 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
7. Remueve la tapa de dos cajas petri que contengan agar nutritivo estériles y déjalas expuestas
al aire, en diferentes sitios por espacio de 30 minutos (ten la precaución de dejarlas en sitios
diferentes) Al termino de este tiempo coloca la tapa en su lugar.
8. Etiqueta estas cajas como “estériles, expuestas al aire”
9. Etiqueta estas cajas según la procedencia de la muestra.
10. Incuba las cajas a 370 C.
11. Revísalas por 24 a 48 horas para detectar cualquier crecimiento.
12. Anota los resultados de tus observaciones de cada cultivo y sus interpretaciones.
Cuestionario:
1. ¿Qué significan los términos:
estéril
aséptico
sepsis
estriar
ubicuidad
2. ¿Cuáles son a) las bacterias aerobias y b) las bacterias anaerobias?
3. ¿Cuáles son a) las bacterias auxótrofas y b) las bacterias protótrofas?
4. ¿Cuáles son a) las bacterias psicrófilas b) las bacterias psicrotrofas, c) mesófilas, d)
termofilas y e) termodúricas?
5. En qué consiste la técnica aséptica.
6. Explica porque limpio no es sinónimo de estéril
7. Menciona tres sitios con probabilidades escasas de tener microorganismos y explica el
porqué.
8. ¿A que nos referimos cuando hablamos de “falsos positivos” o “falsos negativos”?
Microbiología y biotecnología
18 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 4
OBSERVACIÓN MORFOLÓGICA DE COLONIAS BACTERIANAS
CLASIFICACION DE COLONIAS
Objetivo: al terminar la práctica el estudiante será capaz de determinar el tipo de crecimiento
bacteriano en medio sólido y líquido y clasificar distintas colonias bacterianas en medio sólido y
líquido para su posterior aislamiento y su identificación
Introducción: los pasos iniciales en la identificación de las bacterias involucran a los caracteres
morfológicos y los culturales. Las características culturales quizá sea una de las etapas más
orientadoras en la identificación de las bacterias, pues a través de ellas apreciamos la apariencia
de las colonias, creciendo en medios líquidos y agar inclinado, tipo de germinación en gelatina,
resistencia a los agentes físicos y químicos, propiedades metabólicas y actividad bioquímica.
La apariencia de las colonias se estudia en placas de agar simple o enriquecido según el
caso, apreciándose forma, elevación, bordes, tamaño, superficie, estructura, consistencia, color y
transparencia. (Figura 3-1)
Microbiología y biotecnología
19 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Bordes Formas
Formas Elevación.
FIGURAS 3-1. Bordes, formas y elevaciones más comunes de las colonias bacterianas
La germinación en gelatina da información sobre el tipo de crecimiento que ocurre a lo
largo del trazado de inoculación que se hace por picadura en el medio y la forma de licuación
que se extiende desde la línea de siembra. (Figura 3-2)
Microbiología y biotecnología
20 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
EN GEL: (SEMISÓLIDO)
Línea de picadura Licuefacción
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1. Filiforme 6. Crateriforme
2. Perlada 7. Forma de nabo
3. Papilar 8. Infundibuliforme
4. Vellosa 9. Saculada
5. Arborescente 10. Estratiforme
Figura 3-2. Línea de picadura en gel y licuefacción de la gelatina
En agar inclinado por inoculación en estrías se aprecia la intensidad y forma de
crecimiento, bordes, aspecto, color, consistencia y ¿olor?. (Figura 3-3)
ESTRIA EN AGAR.
1 2 3 4 5 6
1. Arborescente 4. Filiforme
2. Difuso 5. Rizoide
3. Equinulado 6. Esparcido
Figura 3-3. Crecimiento en agar inclinado
Microbiología y biotecnología
21 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
En un medio líquido, crecen a manera de sedimentos, turbidez del medio, o nata. El
crecimiento en medio líquido nos indica el grado de crecimiento y turbiedad, formación de
película (nata) en la superficie o de simple anillo en la pared del tubo, sedimento y ¿olor? (Figura
3-4)
EN MEDIO LÍQUIDO. (CALDO NUTRITIVO)
1 2 3 4 5 6
1. Sin crecimiento 4. Espumoso
2. Turbio 5. Con anillo
3. Floculento 6. Con sedimento
Figura 3-4. Crecimiento en medio líquido
Existen 3 medios de cultivo utilizados generalmente para el cultivo de bacterias: sólido,
semisólido y líquido, definidos por su estado físico. Cada tipo de medio tiene propiedades
particulares que hacen más adecuado el crecimiento para ciertas bacterias. La mayoría de los
medios sólidos y semisólidos contienen agar como agente gelificante. Las bacterias, en un medio
sólido, forman acumulaciones de células idénticas, llamadas colonias, que crecen sobre el agar
nutritivo contenido en la caja petri. Estas cajas son ideales para el cultivo de bacterias ya que
permiten la entrada de aire hacia el interior sin dejar entrar polvo. Las bacterias generalmente
crecen en grupos de colonias que surgen como resultado de una siembra.
Microbiología y biotecnología
22 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
La pigmentación, tamaño, forma, y la apariencia de una colonia en general, son
fundamentales para su identificación.
Material:
1 regla graduada en mm
1 asa bacteriológica
1 mechero Fisher
Metodología:
Describa la morfología de 2 (al menos) colonias bacterianas y aisladas de acuerdo con las siguientes
características:
1. tamaño
2. Color
3. Elevación: plana, convexa, elevada, pulvinada, umbonada
4. Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, huso
5. Bordes: enteros, lobulado, aserrado, filamentoso, rizado.
6. Superficie: lisa, rugosa, membranosa.
7. Aspecto: húmeda, seca.
8. Luz reflejada: brillante, mate.
9. Luz transmitida: opaca, traslucida o transparente
10. Consistencia: suave (butirosa, mucoide) o dura.
Describa el tipo de crecimiento en los tubos de acuerdo con las siguientes características:
1. Turbiedad: poca, mediana, abundante
2. Presencia de película o anillo
3. Sedimento: mucoide o granular
Microbiología y biotecnología
23 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
RESULTADOS:
Característica de la colonia Colonia 1 Colonia 2
Tamaño
Color
Elevación
Forma
Bordes
Superficie
Aspecto
Luz reflejada
Luz transmitida
Consistencia
Cuestionario.
1. ¿Cuales el inconveniente de oler los cultivos bacterianos?
2. ¿Como se puede medir la turbiedad?
BIBLIOGRAFIA.
Collins, C.H (1969). Metodos Microbiologicos. Editorial Acribia. Primera edicion. España
R. Granados , C. Villaverde (1998) Microbiologia. Editorial Paraninfo. Primera edicion .
España.
Hans. G Schegel. (1979) Microbiologia general. Editorial Omega. Segunda edicion. España.
Microbiología y biotecnología
24 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 5
TÉCNICAS DE INOCULACIÓN
Objetivo: al finalizar la práctica el alumno será capaz de obtener cultivos puros utilizando las
diferentes técnicas de inoculación.
Introducción: los microrganismos necesitan de sustancias nutritivas para su crecimiento,
desarrollo y mantenimiento. La gama de sustancias es muy amplia y van desde productos tan
simples como sales inorgánicas, CO2 y agua pasando por metabolitos simples como
aminoácidos, azúcares hasta llegar a sustancias complejas como sangre, extractos de carne, de
levadura y otros.
Un prerrequisito en la caracterización de especies microbianas es la disponibilidad de
estudiarlas en cultivo puro. El término cultivo puro denota que todas las células cultivadas tienen
un origen común y son descendientes de la misma célula. Es posible obtener cultivos puros
transfiriendo una sola célula a un medio estéril. Esto puede lograrse utilizando un
micromanipulador en conjunto con un microscopio. Sin embargo, los métodos indirectos son
más utilizados para obtener cultivos puros, por ejemplo, placas de medios nutritivos son
inoculadas para obtener colonias aisladas.
La suposición que se hace es que todas las células de la colonia se desarrollaron a partir
de una sola célula y por tanto representan un cultivo puro. Esto no siempre es cierto y entonces
es necesario examinar lo que se presume es un cultivo puro por medio de pruebas microscópicas.
Una vez que se tiene un cultivo puro lo deseable es mantenerlo sin cambios en sus
características, en condiciones viables por periodos de tiempo que van de semanas a años. Para
una preservación a corto tiempo de un cultivo se hacen transferencias periódicas a medio fresco.
Las preservaciones a largo plazo implican liofilización o congelación profunda.
Prácticamente todos los especímenes obtenidos de un ambiente natural contienen una
mezcla de microrganismos. Antes de poder hacer un estudio detallado de las características
Microbiología y biotecnología
25 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
inherentes a cada especie de las que constituyen la mezcla es imperativo que las especies sean
aisladas en un cultivo puro. La técnica de estriado en placa provee un método simple para este
propósito.
Material:
4 cajas de Petri con agar nutritivo
1 asa bacteriológica
1 mechero Fisher
Suspensión de bacterias
Metodología:
Estría cada una de las cuatro cajas con cada una de las siguientes técnicas.
Técnicas de inoculación en Placa.
Microbiología y biotecnología
26 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Existen varias formas para sembrar una población de microrganismos, la que de acuerdo
a nuestro experiencia da mejores resultados es la conocida como estriado en cuadrante. Se hace
de la siguiente forma:
Estríe la suspensión bacteriana en una caja Petri que contenga un agar adecuado de la
siguiente forma: con el asa estéril, primero se estría el inóculo inicial sobre un área
correspondiente a la zona 1, de forma continua, se puede estriar sobre una parte ya estriada, a
continuación se flamea el asa para esterilizarla, se enfría y se estría la zona correspondiente a la
zona 2, sin levantar el asa y sin pasar sobre lo estriado, es importante hacer notar que no se toma
inóculo del espécimen, sino que el inóculo para la zona 2 procede de la zona 1. Se flamea el asa
nuevamente y se repite el proceso, ahora tomando como inóculo para la zona 3 lo estriado de la
zona 2, de igual forma se procede para la zona 4.
Para el estriado en forma radiante se procede de la siguiente forma:
1. Dispersar una asada de organismos en una área pequeña cerca de un extremo de la placa.
2. Flamear el asa y enfriar.
3. Desde una esquina del área 1, hacer 6 o 7 trazos rectos en sentido opuesto a esta.
Flamear el asa y cruzar con trazos sobre los últimos que se hicieron, empezando cerca del
área 1.
Microbiología y biotecnología
27 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Para el estriado en forma de T llamada también Estría en tres Campos se hace lo siguiente:
1. Con un lápiz de cera marcar una "T" en el fondo de la placa, dividiendo la superficie en
una mitad y dos cuartos.
2. Inocular la mitad de la porción con una asada de organismos con una línea continua
desde un extremo de la placa hacia la mitad de la misma.
3. Después de flamear el asa, crucé el Área 1 al Área 2 con una línea continua, hasta llenar
el Área 2.
Después de flamear el asa otra vez, cruce del Área 2 al Área 3 con un trazo continuo.
Una última forma de estriar para obtener colonias aisladas es la técnica denominada estriado
continuo.
1. Iniciar en un extremo de la placa (área A) con una asada de organismos, dispersarlos con
un movimiento continuo y simple hacia el centro de la placa.
2. Rotar la placa 180 grados, de tal forma que la porción sin inocular quede frente a Ud.
Microbiología y biotecnología
28 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
3. Sin flamear el asa y usando la misma cara del asa, continué haciendo trazos de la misma
forma que lo hizo para el Área A y trabajando hacia el centro.
Recuerda siempre flamear el asa al terminar de inocular.
Cuestionario:
1. En términos prácticos, cual consideras que es la mejor técnica?
2. En términos de resultados, cual fue la mejor técnica?
3. Porque se debe de flamear el asa antes de empezar a estriar una nueva zona?
Microbiología y biotecnología
29 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 6
TINCIÓN DE MICROORGANISMOS
Objetivo: al terminar la práctica el estudiante será competente para fijar, teñir e identificar un
microorganismo de acuerdo a su morfología y su respuesta a los colorantes de Gram.
Introducción: debido a sus pequeñas dimensiones es necesario teñir a las células bacterianas
para aumentar el contraste. Debido a las diferencias químicas de los materiales celulares los
colorantes reaccionan de manera específica con ellos; por ejemplo los ácidos nucleicos y los
polisacáridos acídicos tienen carga negativa, por lo que los colorantes catiónicos se combinarán
fuertemente con ellos. El azul de metileno, el cristal violeta y la safranina son colorantes
catiónicos, como las superficies celulares están cargadas negativamente, se combinan con ellas
resultando células teñidas de azul, violeta o rojo respectivamente. Si en el proceso de tinción se
utiliza solamente un colorante se habla de tinciones simples.
Los colorantes generalmente se clasifican en colorantes básicos cuando muestran fuerte afinidad
por las porciones ácidas de la célula y colorantes ácidos si la afinidad es por las partes básicas
(alcalinas) de la célula. Muchas veces resulta conveniente usar una mezcla de dos colorantes, uno
ácido y el otro básico que tiñan de distintos colores. Al tratar una célula con esta mezcla, los
componentes ácidos aparecerán de color distinto a las partes alcalinas de la célula.
Las tinciones diferenciales son aquellas en las que se aprovechan las diferencias entre los
diferentes tipos celulares y/o entre las diferentes estructuras dentro de una misma célula. La
tinción diferencial más utilizada en microbiología es la tinción de Gram. La tinción de Gram
divide a las bacterias en dos grupos principales: las Gram positivas (+) y las Gram negativas (-).
Las diferencias en la pared celular hace que las bacterias Gram (+), tomen el colorante primario
que es el cristal violeta apareciendo por lo tanto de color violeta, mientras que las Gram (-) son
decoloradas y posteriormente toman el colorante de contraste que es la safranina, por lo que
aparecen al ocular de color rojo.
Microbiología y biotecnología
30 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Es importante destacar que en microbiología la tinción de Gram es uno de los procedimientos
más útiles, para identificar una bacteria es necesario saber a qué grupo de Gram pertenece.
Los procedimientos de tinción más usuales se hacen con preparaciones secas (frotis) de
microorganismos, los cuales son adheridos al portaobjetos (fijados) para posteriormente ser
sometidos al proceso de tinción, el cual consiste en agregar el colorante y dejarlo actuar por uno
o dos minutos, enjuagarlo (y si es el caso agregar otro y volver a enjuagar con agua) secarlo y
observar al microscopio.
Para observar a los microorganismos generalmente basta con preparar un frotis de células
microbianas para luego teñirlas. Puesto que las células son tan pequeñas, el propósito
simplemente se logra preparando una suspensión de células en agua; una gota de ésta suspensión
se extiende sobre un área del portaobjetos y se deja secar al aire. Se obtiene así una delgada capa
de células sin necesidad de usar equipo especializado.
Si se desea hacer un frotis de un caldo de microorganismos, el caldo se aplica directamente al
portaobjetos con la ayuda de un asa bacteriológica, sin dilución previa. Con el asa conviene
hacer dos o tres aplicaciones en un área reducida del portaobjetos, teniendo cuidado de no
extender demasiado la suspensión. Al preparar un frotis de medio sólido el problema a evitar es
la presencia de demasiadas células. Para esto se toma del medio sólido una cantidad minúscula
de material bacteriano (no mayor que una cabeza de alfiler) la cual se emulsifica con una gota de
agua sobre la superficie del portaobjeto. La gota se extiende luego sobre una superficie
relativamente grande del portaobjeto. Una vez seco el frotis debe aparecer ligeramente
blanquecino, como el residuo que se obtiene al evaporar una gota de leche diluida.
Una vez hecho el frotis hay que fijarlo, para asegurarse que las células no se desprenderán
durante los repetidos lavados a que se somete el portaobjeto para teñir la preparación. Mediante
la técnica de fijado se intenta detener toda actividad enzimática en la célula antes de observarla al
microscopio. Muchas, si no todas las células poseen enzimas capaces de destruir gran parte de
las estructuras intracelulares después de la muerte de la célula. En microbiología ésta destrucción
de estructuras celulares se evita por medio de la fijación por calor. Por lo tanto, si la célula no ha
sido fijada adecuadamente antes de teñirse, la acción destructora de estas enzimas impedirá la
apreciación de todo detalle. El calor además de inactivar a las enzimas ayuda a adherir las células
al portaobjetos minimizando así la pérdida de células durante el proceso de tinción.
Las formas bacterianas más comunes son: esféricas, llamadas cocos (estafilococos,
estreptococos, diplococos, tétradas, sarcinas) y cilíndricas llamadas bacilos (estreptobacilos,
espiroquetas).
Microbiología y biotecnología
31 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Material
20 portaobjetos (por equipo) 1asa bacteriológica
Azul de metileno safranina (Gram)
Cristal violeta (Gram) Lugol
1 piceta con alcohol 1mechero fisher
1 piceta con agua destilada muestras biológicas
1 par de guantes desechables (opcional) 1 puente de coloración
1 cuba de plástico 1 pinzas para tubo de ensayo
1 microscopio compuesto Etanol potable (para el grupo)
Papel secante cbp Aceite de inmersión
5 pipetas pasteur con bulbo
Procedimiento:
Frotis
a. Lave muy bien los portaobjetos con detergente, enjuágalos varias veces,
agrega unas gotas de alcohol etílico (no uses alcohol desnaturalizado). Sécalos
y flamea por unos segundos el lado superior de cada portaobjeto. Los
portaobjetos usos dificultan el trabajo y pueden ocasionar pérdida de material.
b. Calienta el asa hasta el rojo en la flama del mechero.
c. Si el cultivo procede de medio líquido, toma una o dos asadas y colócalas en
el centro del portaobjetos, con ayuda del asa extiéndelas con movimientos
circulares, déjalas secar al aire.
d. Si el cultivo procede de medio sólido, toma con el asa una o dos asadas de
agua destilada, colócalas en el centro del portaobjetos y con ayuda del asa
toma una pequeña porción de una colonia aislada, emulsifícala con el agua y
extiéndela en el centro del portaobjeto por medio de movimientos circulares,
déjala secar al aire. Debe de verse como una mancha de leche. Este es el
procedimiento estándar para hacer frotis.
e. Los frotis deben de ser ahora fijados al portaobjetos, esto puede hacerse por
medio del calor o por sustancias químicas.
f. Para fijar al calor se sigue el siguiente procedimiento: toma el portaobjetos y
con el frotis hacia arriba, pásalo lentamente sobre la llama del mechero unas
tres a cinco veces, asegúrate de que no está demasiado caliente en cada
ocasión, poniéndolo sobre el dorso de la mano, no debe ser doloroso al tacto.
Puedes utilizar unas pinzas para sujetar el portaobjeto
g. Para fijar con alcohol simplemente se colocan unas dos gotas de alcohol
sobre el frotis, se espera un minuto y luego se seca al aire. Los frotis ahora
están listos para ser teñidos.
Tinción simple
Microbiología y biotecnología
32 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Procedimiento:
1. Coloca el portaobjetos con el frotis sobre el puente de coloración.
2. Cubre el frotis con el colorante (uno por frotis) y déjalo actuar el tiempo indicado:
i. azul de metileno 3 minutos
ii. cristal violeta un minuto
iii. safranina un minuto
3. Lava de “canto” con agua corriente
4. Deja secar al aire y observa con el objetivo de inmersión en aceite.
5. Haz esquemas de lo observado.
Tinción de Gram. (CLASA)
1. Coloca el portaobjetos con el frotis hacia arriba sobre el puente de coloración.
2. Cubre el frotis con cristal violeta por un minuto.
3. Escurre el exceso de solución, lava con agua de la llave y escurre.
4. Cúbrelo con la solución de lugol por un minuto
5. Escurre el exceso de solución, lava con agua de la llave y escurre.
6. Decolora con alcohol-cetona (usa alcohol hasta que domines el proceso de decoloración)
hasta que quede un tenue color violeta.
7. Lava con agua
8. Cubre el frotis con safranina de 30 a 60 segundos.
9. Escurre el exceso de solución, lava con agua de la llave y escurre.
10. Déjalo secar al aire y observa con aceite de inmersión.
Notas: Puedes tomar fotografía de tus observaciones en caso de que optes por dibujarlos
entonces tus dibujos deben ser claros y bien definidos. Ejecútalos a colores ciñéndote a los
colores observados en las preparaciones teñidas. No trates de dibujar todos los organismos que
observes sino aquellos que sean típicos, pon especial atención a las variaciones de forma y
tamaño y sobre todo a las formas de agrupación. Si los campos observados están saturados de
microorganismos de modo tal que dificultan la observación, busca un campo donde puedas
observar a las bacterias clara e individualmente. Generalmente es más fácil encontrar campos
más favorables en la periferia del frotis. Nunca dibujes manchas amorfas coloreadas.
El procedimiento para lavar los portaobjetos ya usados es el siguiente: sostén el portaobjetos
sobre el fregadero y pon varias gotas de xilenos (xilol) sobre el frotis, posteriormente enjuágalo
con agua y jabón. Repite la operación por lo menos otra vez para eliminar todo rastro de frotis.
Luego lava el portaobjetos de la manera ordinaria y guárdalo para ser usado posteriormente.
Cuestionario:
Microbiología y biotecnología
33 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
1. ¿Para qué se utiliza la tinción simple?
2. Mediante la tinción de Gram, ¿cómo se clasifican las bacterias?
3. ¿Cómo se denominan aquellos microorganismos que muestran variación en la respuesta a
la tinción de Gram?
4. ¿Cuál es la diferencia entre forma de involución y pleomorfismo?
5. ¿Qué es la fijación?
6. ¿Cuáles son los grupos cromóforos de un colorante básico?
7. ¿Porqué se tiñe el núcleo con colorantes básicos?
8. ¿Cuál es el fundamento de la tinción de gram?
9. Explique qué es un mordente.
10. Menciona tres géneros grampositivos y tres géneros gramnegativos.
Microbiología y biotecnología
34 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 7
TINCIÓN DE ESPORAS
Objetivo: al terminar la práctica el estudiante será competente para fijar, teñir e identificar un
microorganismo de acuerdo a la presencia, forma y localización de la espora.
Introducción: Las esporas son estructuras de resistencia a las condiciones adversas que pueden
prevalecer en el medio en el que se desarrollan los microorganismos, en el caso de las esporas
bacterianas no son estructuras de reproducción.
Figura 8.1 Diagrama de una espora
Solamente pocos géneros bacterianos forman endosporas (llamadas así porque se forman
en el interior de la célula vegetativa), entre estos sobresalen las bacterias grampositivas Bacillus
y Clostridium.
Estas estructuras son de las formas de vida más resistentes que se conocen: pueden
soportar temperaturas por arriba del punto de ebullición del agua y condiciones de extrema
desecación. Pueden permanecer viables en un estado metabólicamente inactivo por más de 300
años (se han recuperado especimenes del suelo de raíces de vegetales almacenados en el herbario
británico) y germinar en pocos minutos cuando las condiciones del medio les son favorables.
Microbiología y biotecnología
35 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Otro motivo de estudio de las bacterias esporógenas ha sido el tratar de entender en su totalidad
el mecanismo de la diferenciación en procariotes. Condiciones adversas, por ejemplo la falta de
nutrientes, dispara la formación de endosporas. Los mecanismos que se dan son: Formación de
una endospora en un bacilo gram positivo
Microbiología y biotecnología
36 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Figura 8.2 Formación de una espora
Microbiología y biotecnología
37 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Debido a su alta resistencia a la temperatura, los microbiólogos han tenido que diseñar, teniendo
en cuenta a las endosporas, métodos de esterilización para matarlas, ya que los otros organismos
sin duda estarán muertos. Más aún, es importante eliminar las esporas del alimento que va a ser
almacenado por periodos largos de tiempo, ya que algunas de estas bacterias esporógenas forman
toxinas letales, tal es el caso de la toxina botulínica producida por Clostridium botulinum, una de
las sustancias más letales conocidas.
La mayoría de las endosporas no son capaces de germinar inmediatamente después de haber sido
formadas. Ellas pueden germinar después de haber estado en dormancia por días o después de ser
brevemente calentadas (60 0C por cinco minutos.) Si los nutrientes adecuados están disponibles
la espora toma agua y se hincha, se rompen las cubiertas esporales y una célula vegetativa
empieza a desarrollarse.
La endospora es una estructura extremadamente resistente a los métodos ordinarios de tinción,
por lo que es posible por medio de una tinción simple teñir toda la célula excepto la espora, por
lo que resaltará como un cuerpo birrefringente. Otros métodos de tinción son aquellos en los a
través de medidas enérgicas se introduce el colorante en la espora, una vez teñida la espora es
difícil de extraer el colorante, por lo cual decolorando el soma bacteriano y luego contratiñendo,
la espora quedará teñida con el colorante primario y el citoplasma con el colorante secundario.
Material
10 portaobjetos (por equipo) 1 asa bacteriológica
azul de metileno 1 mechero fisher
Verde de malaquita Safranina 0.5% (no de Gram)
1 piceta con agua destilada 1 piceta con alcohol
Muestras biológicas 1 cuba de plástico 1
pinzas para tubo de ensayo 1 mechero de alcohol o microbunsen
1 par de guantes desechables (opcional) 1 puente de coloración
1 microscopio compuesto 2 Tripies
Papel secante cbp Aceite de inmersión
1 Charola de disección 3 pipetas pasteur con bulbo
Cloro (lavado de material)
Procedimiento:
Lava meticulosamente y desengrasa los portaobjetos, prepara 10 frotis de 5 diferentes colonias
(dos de cada una). Cinco frotis tíñelos (uno de cada colonia diferente) con azul de metileno y
Microbiología y biotecnología
38 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
déjalos reaccionar de 3 a 5 minutos, lávalos y sécalos al aire, obsérvalos con el aceite de
inmersión.
Los otros 5 serán teñidos con la técnica de Schaeffer-Fulton que consiste en:
1. Cubrir los frotis con verde de malaquita
2. Dejarlos reaccionar por un minuto.
3. Calentarlos hasta emisión de vapores con el mechero de alcohol por un minuto. Ten
cuidado de que no se sequen, si es necesario añade más verde de malaquita, para
reemplazar al que se evapora.
4. Dejarlos enfriar y lavarlos con agua corriente durante medio minuto
5. Contra teñir con safranina al 0.5% (no uses safranina de Gram) y déjala actuar por medio
minuto.
6. Lavarlos con agua corriente y seca al aire.
7. Examina la preparación con aceite de inmersión y has dibujo de las esporas y de las
células vegetativas. Las esporas son verdes y las células vegetativas rojas. Nota: no es necesario dibujar todo el campo sino tan sólo lo representativo
Cuestionario:
1. ¿A qué se debe la resistencia de la espora a ser teñida?
2. ¿Qué géneros bacterianos esporulados son los más comunes?
3. De acuerdo a su forma y posición ¿cómo se clasifican las esporas? Utiliza de modelo el
siguiente esquema, las faltantes, añádelas
4. ¿Cómo se realiza la tinción de los flagelos?
5. ¿En qué consiste la tinción de Ziehl-Neelsen? ¿Para qué se utiliza?
6. Si se te encargara el conteo de microorganismos aerobios esporulados de una muestra de
pimienta en polvo, ¿cómo la harías?
Microbiología y biotecnología
39 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Pintor: Charles Bell (1774-1842). Escuela Inglesa. Título: Opistótonos. 1809. Real
Colegio de Cirujanos de Edimburgo. Características: Óleo sobre lienzo
Microbiología y biotecnología
40 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 8
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS
(MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA)
Objetivo: al terminar la práctica el estudiante podrá determinar el número de microorganismos
en una muestra y de comparar los resultados de un aislamiento cualitativo y otro cuantitativo
Introducción: las bacterias están ampliamente distribuidas en la biosfera, desde los sedimentos
en las profundidades oceánicas hasta las corrientes superiores de aire de la superficie terrestre.
Las bacterias son extremadamente importantes para la fertilidad del suelo y tienen una función
significativa en los ciclos biogeoquímicos, son utilizadas en el tratamiento de las aguas negras.
Algunos antibióticos son productos metabólicos de bacterias, otras son importantes en la
industria, principalmente en la fermentativa. Algunas pocas bacterias son responsables de
enfermedades, deterioro de alimentos u otros materiales. Debido a la importancia que tienen las
bacterias en el establecimiento, desarrollo y mantenimiento de la vida en la tierra es importante
que profundicemos en el conocimiento de ellas.
Los medios de cultivo pueden ser sólidos o líquidos, en los primeros se identifican fácilmente las
colonias. Idealmente todos los medios de cultivo que se emplean en microbiología deberían ser
del tipo llamado sintético. Por otro lado, la gran mayoría de los medios microbiológicos
contienen sustancia de fórmula química desconocida, de composición o de concentración
variable: extracto de carne, varias peptonas, extracto de levadura. Estos medios presentan
mezclas heterogéneas de sustancias de composición y estructura química no identificada o de
concentración variable. Siempre que se le añaden estos productos al medio de cultivo este deja
de ser sintético.
Las bacterias que crecen en los medios de composición y de concentración química conocida,
además de que solamente llevan sales minerales y agua, se llaman autótrofas. Las que solamente
pueden crecer en medios en medios a los cuales se les han añadido sustancias orgánicas, ya sea
como fuente de carbono o de nitrógeno se eles denomina heterótrofas.
Microbiología y biotecnología
41 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
En la actualidad diversas casas comerciales venden medios de cultivo deshidratados, a los cuales
solo basta con añadir la cantidad de agua necesario y esterilizar de la manera indicada para poder
utilizarlos.
Siempre es necesario que el medio de cultivo empleado para cultivar microorganismos esté
completamente libre de toda forma de vida antes de usarse. Para esterilizar en ambiente húmedo
se utiliza la autoclave que es un aparato semejante a una gran olla de presión, en la cual se logran
temperaturas superiores a la temperatura de ebullición del agua por medio de un aumento de
presión. Otro método es la esterilización en seco, esto se logra en un horno de aire seco, la
cristalería se puede esterilizar de esta manera. Las soluciones que se descomponen o inactivan al
someterse a elevadas temperaturas, se esterilizan en frío, pasándolas a través de filtros de poros
pequeños que impiden el paso de las bacterias y de organismos de mayor tamaño.
Resumiendo; el desarrollo de los microorganismos bajo condiciones artificiales (medios de
cultivo) depende de varios factores importantes:
1. los alimentos adecuados deben estar disponibles
2. debe disponerse del oxígeno que se requiera
3. un cierto grado de humedad es necesario
4. el medio debe ofrecer la reacción adecuada
5. debe prevalecer la temperatura óptima
6. el medio debe estar estéril
7. debe eliminarse la contaminación
El crecimiento bacteriano es afectado por factores físicos, químicos y biológicos. Dentro de los
factores físicos, que impactan a las bacterias tenemos las condiciones gaseosas y la temperatura.
Las bacterias en su respuesta al oxígeno pueden clasificarse en cuatro grupos:
1. Aerobias, son aquellas que se desarrollan en presencia de oxígeno libre.
2. Anaerobias, son aquellas que para poder desarrollarse necesitan la ausencia del
oxígeno libre.
3. Anaerobias facultativas, son las que pueden desarrollarse tanto en presencia como en
ausencia de oxígeno libre.
4. Microaerofílicas: son las bacterias que crecen en tensiones bajas de oxígeno libre.
Se dice con frecuencia que las bacterias son fábricas químicas en miniatura, esto se debe a
que sintetizan una variada lista de productos químicos. Estas síntesis dependen de las reacciones
químicas, y la velocidad a la que suceden son profundamente influidas por la temperatura. La
Microbiología y biotecnología
42 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
temperatura óptima de crecimiento varia con los diferentes tipos de microorganismos y de
acuerdo a ésta podemos clasificar a los microorganismos en:
1. Psicrófilas, son aquellas que aún cuando son capaces de desarrollarse a temperaturas
inferiores a 0 ºC o superiores a 20 ºC, su temperatura óptima se encuentra dentro de este
intervalo.
2. Mesófilas, son las bacterias que tienen su temperatura óptima en el intervalo entre los 20
y 45 ºC.
3. Termófilas, son las bacterias que tienen temperaturas óptimas mayores a 45 ºC. Se
subdividen en
a. Termófilas facultativas o euritermófilas, son las bacterias termófilas que pueden
crecer dentro de los límites de las mesófilas.
b. Termófilas obligadas o estenotermófilas, éstas no se desarrollan en el intervalo de
las mesófilas y crecen mejor en temperaturas mayores a los 60 ºC.
Los factores de crecimiento son sustancias como vitaminas, aminoácidos, bases nitrogenadas,
etc. Que son indispensables para el crecimiento de los microorganismos. Los microbios que
pueden crecer en medios sintéticos a los cuales sólo se les ha añadido una fuente de carbono
orgánica (un azúcar por ejemplo) se les conoce como protótrofas, mientras que las que los
necesitan son llamadas auxótrofas. Por otro lado, los factores de crecimiento, pueden ser
esenciales si son necesarios para que el organismo se reproduzca o estimulantes o accesorios, si
los microorganismos pueden desarrollarse en su ausencia, pero en su presencia su crecimiento es
mejor (más rápido, actividad metabólica diferente)
Para poder determinar las características de especies concretas de microorganismos es necesario
aislar y desarrollar al microorganismo en el laboratorio como cultivo puro. Este proceso que se
conoce como sembrado en estría se logra transfiriendo los microorganismos de su ambiente a
uno artificial, esto se logra por medio del asa bacteriológica y un medio de cultivo adecuado, con
el asa estéril se toman los microorganismos y por movimientos de estría se siembran en la
superficie del medio de cultivo, después de un tiempo de incubación a una temperatura
determinada por las condiciones fisiológicas del organismo se apreciarán las “colonias”, que son
el resultado de n divisiones de una sola bacteria. Como es posible que más de una bacteria den
origen a una colonia se dice que son unidades formadoras de colonias (ufc). Una técnica similar
es la llamada espatulado, la cual se realiza por medio de una espátula de vidrio sobre la
superficie de una caja de petri que contiene el medio adecuado, para esto se coloca un pequeño
volumen que contiene a las bacterias sobre la superficie del agar y por movimientos verticales de
la espátula y rotatorios de la caja se distribuyen los microorganismos en la superficie del medio.
Para determinar el efecto que tienen sobre el ambiente es necesario determinar su concentración
también. Una de las técnicas más usadas para el conteo de microorganismos es la de diluciones
seriadas y vertido en placa, la cual consiste en hacer una serie de diluciones decimales seriadas y
agregar un volumen conocido de ellas a una caja petri estéril y a continuación vaciar sobre ella
Microbiología y biotecnología
43 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
agar fundido mezclando por movimientos rotatorios en uno y otro sentido, así como por
movimientos verticales y horizontales, todo esto sobre una superficie plana y sin levantar la caja.
Material
Muestra de suelo, agua, leche. 7 pipetas de 1 mL
1 mechero Fisher Agar nutritivo (c.b.p.)
6 cajas Petri vacias, estériles 1 piceta con alcohol
1 balanza granataria 1 piceta con agua destilada
6 tubos con rosca con 9 mL de agua peptonada
1 matraz Erlenmeyer de 500 mL Papel aluminio (10 cm2 aprox.)
1 espátula de vidrio 1 vaso de precipitado de 250 mL
Alcohol 2 cajas con agar nutritivo estéril
Procedimiento:
Técnica del espatulado
Procedimiento:
1. Toma una décima de mL de la dilución (e). (Ver adelante cuadro de diluciones)
2. Deposítala en el centro de una placa que haya estado en incubación durante un día.
3. Con ayuda de una espátula de tubo de vidrio, esterilizado por medio de calor, extiéndela con
movimientos de vaivén mientras realizas movimientos de rotación con la caja, ten cuidado de
no romper el agar.
4. Al asimilarse el líquido al medio tapa la caja y métela a incubar a 37 0C durante 24 a 48
horas.
5. Hazlo por duplicado
Método de las diluciones (NOM-092-SSA1-1994)
Procedimiento:
1. Coloca en un matraz 99 ml de diluyente (agua peptonada o solución reguladora de
fosfatos) Para nuestro propósito bastará con un tubo de rosca con 9 mL de agua
peptonada
2. Agrega 9 mL de agua destilada a los tubos.
3. Esterilízalos en autoclave por 15 minutos.
4. Esteriliza las 7 pipetas de 1 mL en el horno o en la autoclave.
5. Haz diluciones de la muestra que vas a examinar de acuerdo al siguiente esquema:
Microbiología y biotecnología
44 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
CANTIDAD DE SOLUTO CANTIDAD DE
DILUYENTE
DILUCION
11 g o 11 mL de muestra 99 mL 10-1
(a)
1 mL de (a) 9 mL 10-2
(b)
1 mL de (b) 9 mL 10-3
(c)
1 mL de (c) 9 mL 10-4
(d)
1 mL de (d) 9 mL 10-5
(e)
1 mL de (e) 9 mL 10-6
(f)
En nuestro caso la dilución (a) se hará con 1 g o 1 mL de muestra
1. Al terminar de hacer cada dilución agita el tubo 25 veces. Agitar la muestra manualmente
con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7
segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual debe
encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el
diluyente.
2. Con una pipeta estéril coloca un mL de las diluciones (f) (e) y (d) (sigue este orden) en
cajas petri estériles. Haz esto por duplicado.
3. Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según la NOM-110-SSA1-
1994, Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico,
en las cajas Petri, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6
movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en
sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta
lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje
la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. .(Agrega a cada caja petri de 15 a 20 mL de
agar fundido y enfriado a 45 0
C. Mezcla mediante movimientos rotatorios y deja que
solidifique el agar.)
4. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de
esterilidad.
5. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente
hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20
minutos.
6. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura
que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, véase el
cuadro 1.
Microbiología y biotecnología
45 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
CUADRO 1
Grupo Bacteriano Temperatura Tiempo de Incubación
Termofílicos aerobios 55 ± 2°C 48 ± 2 h
Mesofílicos aerobios* 35 ± 2°C 48 ± 2 h
Psicrotróficos 20 ± 2°C 3 - 5 días
Psicrofílicos 5 ± 2°C 7 - 10 días
* En el análisis de agua potable y agua purificada se debe incubar a 35 ± 2°C durante
24 h.
7. En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para
disminuir el error en la cuenta.
8. Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos
y levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del estereoscopio para
resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas
partículas de alimento
NOTA: TODO EL TRABAJO DEBE DE REALIZARSE EN CONDICIONES DE
ASEPSIA Y LAS ASAS, LAS PIPETAS Y LA ESPATULA DEBEN DE ESTAR
ESTERILES.
Reglas para contar colonias:
1. Posterior a la incubación, las colonias resultantes se cuentan utilizando un contador de
colonias tipo Québec, este cuenta con un enrejado que nos facilita el contarlas, se escogen
los duplicados que presenten entre 25 y 250 colonias por caja y se determina el promedio.
Se multiplica el promedio por el factor de dilución para obtener la cuenta en placa por
gramo o por mililitro.
Nota en algunos casos pueden usarse para la determinación cuentas de una sola caja o el
promedio de triplicados o más cajas por dilución.
2. En el caso de no tener cajas con 25 a 250 colonias se procede de la siguiente forma:
a. Si solamente una de las cajas está dentro del intervalo se cuentan ambas y se
promedia.
b. Si las cajas de dos diluciones decimales consecutivas tienen entre 25 y 250 se
cuentan ambas diluciones (4 cajas) y se reporta el promedio como la cuenta en
placa por mililitro o gramo, excepto si la cuenta más alta es mayor por dos
veces o más el valor de la cuenta más en cuyo caso se utiliza la cuenta más baja.
Microbiología y biotecnología
46 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
c. Si ninguna caja tiene entre 25 a250 colonias pero una o más tienen más de 300, se
usa la dilución con valores más cercanos a 250. Para esto se usa el enrejado:
i. Si hay menos de 10 por cm2, se cuentan las colonias en trece (13)
cuadros representativos de la distribución de colonias y se multiplica
por 5 para obtener el número de colonias por caja (se cuentan 11 si
las cajas son de plástico, área de las cajas de vidrio 65 cm2, de las de
plástico 56 cm2). Se reporta como “Cuenta en placa estimada” por
gramo o por mililitro.
ii. Si hay más de 10 por cm2, se cuentan las colonias en 4 cuadros, se
promedia y se multiplica por 65 si se usaron cajas de vidrio o por 56
si fueron cajas de plástico. Se reporta igual que en I.
iii. Si hay más de 100 colonias por cm2, se reporta como “Estimado
>6500” veces el factor de dilución, ejemplo:
“Estimado>65,000,000”. No se reporte como “demasiado
numerosas para ser contadas”
iv. Siempre reporte los resultados de tales cajas como cuenta aeróbica
“estimada” por caja por gramo o por mililitro.
d. Si se encuentran menos de 25 colonias en cada caja, se obtiene el número
promedio , se multiplica por el factor de dilución y se reporta como cuenta
aeróbica “estimada” por caja, ejemplo: Estimado 18.
e. Si no se encuentran colonias en ninguna dilución se reporta como “estimado”
menor que el factor de dilución, ejemplo: Estimado <10, si no se encontraron
colonias en la dilución 10-1
.
f. Otras claves: SC = sin colonias, Spr = diseminadas (si más de la mitad de la caja
está cubierta, no se use para contar), AL = accidente de laboratorio, IG =
inhibidor de crecimiento (sólo si se observa inhibición del crecimiento, i.e. si las
diluciones más altas tienen cuentas más altas que las diluciones más bajas,
verificar primero que no sea un problema de dilución, en este último caso sería
AL), DNSC = demasiado numerosas para ser contadas (no se use a menos que la
dilución más alta, sea realmente incontable. Las siglas respectivas en inglés son:
NC, Spr, LA, GI y TNTC
3. Los resultados de las cuentas después de ser multiplicados por el factor de dilución se
redondean a dos cifras significativas para evitar dar la idea de exactitud ficticia..
4. Ejemplos:
Promedio
Muestra Colonias/ dilución Razón Cuenta aeróbica Sección
10-3
10-4
de cuentas por gramo (mL) aplicable
1 151 16 150,000 1
2 272 39 1.4 330,000 2b
3 120 35 2.9 120,000 2b
4 Spr 40 400,000 1, 2f
Microbiología y biotecnología
47 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
5 375 17 380,000 est. 2ci
6 DNSC 8010 >65,000,000 est. 2ciii
7 9 1 9,000 est. 2d
8 0 0 <1,000 est. 2e
Cuestionario:
1. Diseña un método para producir microorganismos aerobios a escala industrial
2. Explica tres métodos diferentes para cultivar bacterias anaerobias.
3. ¿Cuál es la temperatura óptima de las bacterias que habitan en el intestino de los
pichones? ¿porqué?
4. Diga porqué el uso de las bacterias estenotermófilas ha revolucionado a la microbiología
y cuales son sus ventajas en la industria fermentativa.
5. Explica las ventajas y las desventajas de los métodos anteriores para aislar
microorganismos.
6. Explica tres métodos para la preservación de cultivos puros.
7. ¿Cuál es el número de unidades formadoras de colonia en tu muestra?
8. ¿Qué son ciclos biogeoquímicos?
9. ¿Cómo actuan las bacterias sobre los metales? ¿Qué significa el término “biofouling”?
10. En qué consisten las técnicas de siembra por estría en placa, técnica de siembra por
difusión en placa, técnica de vertido en placa, técnica del enriquecimiento de cultivo,
técnica de diluciones seriadas y técnica de aislamiento de una célula?
11. Diseña un método para producir, a escala industrial, bacterias esporuladas aerobias.
Referencias:
NOM-092-SSA1-1994
NOM-109-SSA1-1994
NOM-110-SSA1-1994
Microbiología y biotecnología
48 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 9
DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS ESPORÓGENOS EN
ALIMENTOS.
Objetivo: al terminar la práctica el estudiante podrá determinar el número de microorganismos
esporógenos potencialmente dañinos en alimentos.
Introducción: El conocer la cantidad de microorganismos potencialmente dañinos en algunos
alimentos tales como almidón, azúcar, harina y especias utilizados como ingredientes en otros
alimentos es importante. En algunas ocasiones es importante saber también la cantidad de
esporas que pueden sobrevivir al procesamiento. Además de los mesófilos, las esporas
termorresistentes son también importantes de determinar. Una forma de detectar la cantidad de
esporas en los alimentos es el uso del choque térmico. Un análisis similar al realizado en la
práctica anterior combinado con este te permitirá saber la cantidad de esporógenos dentro del
total de mesófilos aerobios.
Material
Muestra de especia (pimienta) 1 matraz de 250 mL
7 pipetas de 1 mL 1 mechero Fisher
10 cajas petri 1 matraz de 500 mL
1 balanza 8 tubos de ensayo
Agua destilada estéril 1 pipeta de 10 mL
1 termómetro de 100 0C 1 baño maria
1 tripié 1 asa bacteriológica
4 portaobjetos Colorantes para esporas
1 piceta con alcohol 1 piceta con agua destilada
Agar nutritivo o agar para cuenta de colonias
Agar dextrosa triptona o agar púrpura bromocresol
Microbiología y biotecnología
49 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Procedimiento:
1. Pesa 11 g de pimienta negra molida y mézclalos con 99 ml de agua destilada estéril.
2. Transfiere 10 mL a dos tubos estériles de 22 mm de diámetro. Asegúrate de
transferir parte del sedimento. Coloca un termómetro en un tubo para que sirva de
control de temperatura. Marca la línea donde son los 10 mL.
3. Calienta los tubos en un baño con agitación constante a una temperatura de 82 – 83
ºC,
4. Mantén los tubos a 80 ºC por 10 minutos, con agitación constante o o hierve los
tubos por cinco minutos, Se restaura la cantidad de agua en el tubo, que se haya
perdido por evaporación.
5. Enfría rápidamente al chorro de agua
6. Prepara diluciones decimales seriadas hasta 10-5
(el tubo que se calentó es 10-1
)
7. Vacía en cajas con agar para cuenta de colonias, mezcla bien e incuba a 32 ºC
por 48 a 72 horas.
8. Verifica que sean esporógenos por medio de la tinción de Schaeffer-Fulton.
9. Cuenta las colonias resultantes y reporta como “esporógenos mesófilos aerobios por
gramo”
Procedimiento de acuerdo a la NMX-F-248-1975:
Unas vez ejecutadas las diluciones de las siembras arriba indicadas (incisos 7.1, 7.2, 7.3,
y 7.4, ), se hierve la suspensión inicial (inciso 6) durante 5 minutos.
Se restaura la cantidad de agua que se haya perdido por evaporación. Se preparan dos series de
tres cajas de Petri. Se distribuyen 10 ml de la suspensión hervida en las tres cajas Petri. Se agrega
medio de agar dextrosa triptona o agar púrpura bromocresol, si se desea diferenciar las bacterias
productoras de ácido. Se incuba a 32°C por 72 horas una de las series en condiciones de
anaerobiosis y la otra en aerobiosis.
Nota: en la NMX-F-248-1975 dice 10 ml en realidad deben ser 1.0 mL
Cuestionario:
1. ¿Cuál es el objeto de enfriar rápidamente los tubos?
2. ¿Explica la razón para determinar esporas mesófilas o termófilas en los alimentos?
3. ¿Describe un método adecuado para determinar esporas termofílicas en alimentos en
lugar de mesofílicas?
4. ¿Describe un método adecuado para determinar esporógenos anaeróbicos en lugar de
aeróbicos?
5. Si un ingrediente tiene 106 células vegetativas más 5 X 10
5 esporas por gramo ¿Cuántas
colonias nos revelará el análisis después de un choque térmico?
6. Nombra dos organismos esporógenos aerobios y dos anaerobios y el tipo de alimento
donde es posible encontrarlos.
7. Explica tres métodos diferentes para cultivar bacterias anaerobias.
Microbiología y biotecnología
50 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Referencias:
NORMA MEXICANA NMX-F-248-1975
DETERMINACION DE MICROORGANISMOS EN ESPECIAS Y CONDIMENTOS DE
CANELA EN POLVO
Microbiología y biotecnología
51 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 10
RECUENTO DE BACTERIAS HETEROTROFAS TOTALES EN SUELO
TÉCNICA DEL NUMERO MÁS PROBABLE
Objetivo: al terminar la práctica el estudiante podrá poner en práctica la Técnica del Número
más Probable (NMP) para realizar recuento de microorganismos del suelo.
Introducción: el suelo constituye un gran reservorio de microorganismos que cumplen sus ciclos
vitales mineralizando materia orgánica disuelta y particulada, proceso del que obtienen energía
para su metabolismo y materia prima para sus constituyentes celulares. La biomasa y la
producción secundaria bacteriana representan una fracción importante de la producción y
biomasa total. Las poblaciones microbianas son controladas tanto en el agua como en el suelo,
por depredadores específicos como los protozoos incorporándose así a las cadenas tróficas de los
sistemas.
Los tamaños de las poblaciones de bacterias son bastante constantes en el agua en donde
muestran buena correlación con la concentración de materia orgánica presente. El contenido de
materia orgánica en el agua varía entre 1 mg/l en ambientes muy oligotróficos y más de 5 mg/l
en ambientes muy contaminados. Existen índices del estado trófico o del grado de contaminación
de las aguas basados en su contenido de bacterias heterótrofas; utilizando estos indicadores los
resultados obtenidos del recuento de bacterias pueden aportar información para el conocimiento
de un ecosistema y su funcionamiento.
El número de bacterias heterótrofas totales en el suelo se correlaciona más con el contenido de
agua del mismo que con la cantidad de nutrientes; habiendo suficiente humedad los nutrientes
pasan a ser el factor limitante del crecimiento. Cualquiera sea el ambiente en el que se
desarrollen estas comunidades microbianas, el tamaño de las poblaciones es sumamente
dinámico y cambia fácilmente ante las alteraciones fisicoquímicas o nutricionales en las que se
desarrollan.
Microbiología y biotecnología
52 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
En prácticas anteriores se explicaron algunas técnicas que se utilizar para realizar el recuento de
microorganismos; entre ellas el número de microorganismos viables mediante el Recuento en
Placa es uno de los más usados. En esta práctica se empleará la técnica de Número más Probable
que es aplicable tanto para muestras de agua como de suelo. Primero se empleará dicha técnica
para realizar recuento de microorganismos heterótrofos totales en muestras de suelos de diversos
orígenes, esta misma metodología con algunas variantes se utiliza para determinar organismos
coliformes en agua, esto es medir la contaminación en agua.
Material:
-10 tubos de ensayo con 9 mL de agua destilada estéril rotulados desde 10 -1
hasta 10 -10
-10 pipetas estériles de 1 ml
-30 tubos de ensayo conteniendo caldo nutritivo estéril, cada uno debidamente rotulado
con la dilución a la que corresponde por triplicado
-pipetas automáticas de 100 µl (0.1 ml) con puntas estériles o pipetas de 1 ml graduadas
-mechero fisher
Procedimiento:
Extrae una muestra de suelo, pesa 1 g de la misma y colócala en un tubo de ensayo que contiene
9 ml de agua destilada estéril rotulado con 10 -1
que corresponde al primer nivel de dilución
(1:10).
Agítala de acuerdo a la NOM y toma 1 ml del sobrenadante con otra pipeta estéril y agrégalo al
segundo tubo con agua destilada estéril rotulado como 10-2
(1:100), correspondiente al segundo
nivel de dilución. Procede de la misma manera hasta el tubo correspondiente a la última dilución
10 -10
(1:10,000,000,000).
De esta manera se espera que los primeros tubos tengan la mayor concentración bacteriana y que
en los últimos tienda a cero.
Una vez que dispones de estos 10 tubos que contienen la solución del suelo, procede a sembrar
una alícuota de 0.1 mL, por triplicado de cada uno de ellos, en los tubos que contienen caldo
nutritivo, a partir de la dilución 10-1
. (fig 1).
Microbiología y biotecnología
53 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Fig. 1: Diluciones seriadas y siembra en caldo nutritivo por triplicado
Nota: ten en cuenta que la muestra utilizada siempre tiene cierto nivel de humedad, por lo tanto
los resultados obtenidos están en relación con un gramo de peso húmedo y deberán referirse a un
gramo de peso seco. Para ello se toman 5 g de la muestra que se utilizó para sembrar y se lleva
hasta peso seco constante, se calcula el porcentaje de humedad del suelo para luego corregir el
número hallado.
Cálculo del Número mas Probable
Se siembran como mínimo tres tubos para cada dilución aunque se pueden utilizar también
cinco réplicas de cada uno de ellos, lo que disminuye la desviación. Revisa los tubos para
detectar crecimiento hasta por 72 horas. Al cabo de tres días, lee los resultados, toma como
positivos a aquellos tubos con caldo nutritivo en los que ha habido desarrollo (se ven turbios
debido a la proliferación de microorganismos).
Toma nota, para cada dilución, del número de tubos positivos (+) y se obtiene un número
característico representado por tres cifras. La primer cifra del número característico
corresponderá al nivel de dilución menos concentrado en el que todos los tubos sean positivos.
En la siguiente tabla se indican, a modo de ejemplo, los resultados obtenidos para dos siembras
distintas con tres repeticiones para cada nivel de dilución.
Microbiología y biotecnología
54 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Nivel de dilución 10 -1
10 -2
10 -3
10 -4
10 -5
10 -6
10 -7
10 -8
10 -9
10 -10
Ejemplo 1 +++
(3)
+++
(3)
+++
(3)
+++
(3)
+--
(1)
---
(0)
---
(0)
---
(0)
---
(0)
---
(0)
Ejemplo 2 +++
(3)
++-
(2)
++-
(2)
---
(0)
---
(0)
---
(0)
---
(0)
---
(0)
---
(0)
---
(0)
Ejemplo 1: número característico 310 (para la dilución 10 -4
)
Ejemplo 2: número característico 322 (para la dilución 10 -1
)
Una vez que has obtenido el número característico, búscalo en una tabla en la que figuran todas
las combinaciones posibles y para las que se ha calculado, mediante un método estadístico, el
número más probable de microorganismos presentes en la muestra. Ver tabla del apéndice 2 del
Bacteriological Analytical Manual.
Microbiología y biotecnología
55 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Tabla de Mc Crady (para tres réplicas por dilución)
Número
característico
Número de
microorga-
nismos
Número
característico
Número de
microorga-
nismos
Número
característico
Número de
microorga-
nismos
000 0,0 201 1,4 302 6,5
001 0,3 202 2,0 310 4,5
010 0,3 210 1,5 311 7,5
011 0,6 211 2,0 312 11,5
020 0,6 212 3,0 313 16,0
100 0,4 220 2,0 320 9,5
101 0,7 221 3,0 321 15,0
102 1,1 222 3,5 322 20,0
110 0,7 223 4,0 323 30,0
111 1,1 230 3,0 330 23,0
120 1,1 231 3,5 331 45,0
121 1,5 232 4,0 332 110,0
130 1,6 300 2,5 333 140,0
200 0,9 301 4,0
Se ingresa en la tabla con el número característico y se lee el número más probable de
microorganismos en el volumen de siembra. En este caso, en el que el inóculo de partida es un
gramo de suelo, se refiere el número final al peso seco de la muestra.
Microbiología y biotecnología
56 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Número característico N.M.P de microorganismos
Ejemplo 1 310 4,5
Ejemplo 2 322 20
A este número obtenido de la tabla debe multiplicárselo por la inversa de la menor dilución en la
que se han hallado 3 (+), es decir que corresponde a la dilución de la primer cifra del número
característico.
Ejemplo 1: 4,5x10 4 bacterias/g de suelo
Ejemplo 2: 20x10 1
bacterias /g de suelo
Además, como se señaló anteriormente, a este valor se le debe corregir en función del porcentaje
de humedad de la muestra.
Cuestionario:
1. ¿Cuál es la NOM que se aplica para la técnica de agitar los tubos?
2. ¿Qué dice al respecto la NOM citada anteriormente?
3. ¿Por qué se refieren los datos a gramos de tierra seca?
4. ¿Qué importancia tiene saber el número de microorganismos en una muestra de suelo?
Bibliografía:
-NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-112-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS.
DETERMINACION DE BACTERIAS COLIFORMES. TECNICA DEL NUMERO MAS
PROBABLE.
-AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (APHA), American Water Works
Association & Water Pollution Control Federation. 1989. Standard Methods for the examination
of Water and Wastewater. 17th ed. APHA, Washington, D.C. USA. Part 9000.
- Bacteriological Analytical Manual
Microbiología y biotecnología
57 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Appendix 2
Most Probable Number from Serial Dilutions BAM Appendix 2: Most Probable Number from
Serial Dilutions, October 2010. Author: Robert Blodgett
http://www.fda.gov
Table 1. For 3 tubes each at 0.1, 0.01, and 0.001 g inocula, the MPNs per
gram and 95 percent confidence intervals.
Pos. tubes MPN/g
Conf. lim. Pos. tubes MPN/g
Conf. lim.
0.10 0.01 0.001 Low High 0.10 0.01 0.001 Low High
0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --
Microbiología y biotecnología
58 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 11
USO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
(EFECTO DE LOS NUTRIENTES, AGENTES INHIBIDORES Y SUSTANCIAS QUE
DETERMINAN LA SELECTIVIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.)
Objetivo: al terminar la práctica el estudiante podrá seleccionar el medio de cultivo que le
permita al microrganismo exhibir las propiedades bioquímicas que serán base para su
identificación.
Introducción: se entiende por crecimiento microbiano el aumento del número de
microrganismos a lo largo del tiempo, es decir, al crecimiento de bacterias, el estudio que se hace
puede servir también para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos.
Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo
del ciclo celular tiene lugar la replicación del material genético, la síntesis de componentes
celulares, la elongación de la bacteria para alcanzar un tamaño doble del inicial y su división por
bipartición para dar lugar a dos células hijas. La duración del ciclo celular coincide con el tiempo
de generación y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este.
El crecimiento de una población resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los
individuos de dicha población.
La mayoría de los cultivos de microorganismos son del tipo denominados asincrónicos,
puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular.
Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran células que acaban de
dividirse, otras que están replicando su ADN, otras que están creciendo, otras que están iniciando
la división celular, etc. Por el contrario, en un cultivo sincrónico todas las células se encuentran
simultáneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrónicos son muy
difíciles de mantener por lo que su importancia está principalmente ligada a los estudios básicos
de biología microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en
condiciones de crecimiento próximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta
Microbiología y biotecnología
59 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
sincronización del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales
probablemente se comporten como relativamente sincrónicas.
Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes números en
un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los microrganismos en la mayoría
de los casos depende de su número, entender cómo se produce el crecimiento microbiano es
importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o
aplicados.
Cultivo de microrganismos: el cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles
las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma
controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las
características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de
nutrientes en el medio.
Medios de cultivo: un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten
energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la
fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autótrofos si es el
CO2 atmosférico (microorganismos que fotosintetizan) y heterótrofos si utilizan carbono
orgánico.
La fórmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que
supone que los componentes de las células son: carbono que representa alrededor del 50% del
peso seco, oxígeno (32%), nitrógeno (14%), fósforo (3%), azufre (en torno al 1%) y otros
elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mo, Cu y Zn.
La elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en
una forma asimilable. Así, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgánico para los
heterótrofos y como CO2 para los autótrofos, el N en forma de NH4, de NO3 o de NO2 o en
forma de aminoácidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de
PO4-3
, el S procede de aminoácidos sulfurados o de SO4-2
, etc. Además, en ciertos casos, es
necesario añadir a los medios de cultivo algunos aminoácidos o vitaminas que determinados
tipos de microorganismos no pueden sintetizar.
En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la fórmula elemental más
concreta es: C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056, esta composición puede variar
ligeramente en función de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El conocimiento
de la fórmula elemental del microorganismo que se cultiva, facilita la formulación del medio de
cultivo más adecuado para el mismo.
Microbiología y biotecnología
60 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Clasificación: los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos o simples, cuando
su composición química se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque están
compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de
carne, etc.). Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser líquidos o sólidos si se añade algún
agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar).
En función de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser,
selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microrganismos mientras suprimen el de
otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios). La elección de un medio selectivo debe ser
apropiada para el aislamiento del organismo que interesa. Las sustancias inhibitorias pueden ser
colorantes, antibióticos, sales biliares y sustancias que afecten el metabolismo enzimático de
algunas especies. Los medios selectivos para especies Gram- , pueden incluir cristal violeta el
cual inhibe el crecimiento de muchas bacterias Gram+. La penicilina con una concentración de
5.50 unidades/ml inhibe la mayoría de las bacterias Gram+ y por lo tanto el medio se hace
selectivo para bacterias Gram-. Los medios selectivos para bacterias Gram+, incluyen Telurito de
Potasio, azida sódica, etc. Que inhiben el crecimiento de bacterias Gram-. Diferenciales cuando
alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por
ejemplo medios con hematíes para identificar colonias de microorganismos hemolíticos),
selectivo-diferenciales cuando combinan las dos características anteriores (por ejemplo, el agar
de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten
aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla de una población mixta de
gran tamaño.
Crecimiento microbiano en medio líquido: si la bacteria crece en un medio líquido, en la
mayoría de los casos las células que se producen en cada división continúan su vida
independientemente formándose una suspensión de células libres.
En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar, mínimamente,
cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano:
1.- Fase lag o de adaptación: durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo
a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para
iniciar la fase de crecimiento exponencial.
2.- Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima y el
tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad máxima
los nutrientes del medio. La evolución del número de células durante esta fase se explica con
modelos matemático.
3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u otros
parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al
Microbiología y biotecnología
61 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulación y liberación de metabolitos
secundarios que pueden tener importancia industrial. Los microorganismos entran en fase
estacionaria porque se agota algún nutriente esencial del medio o porque los productos de
desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el
crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente
represente con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los
ambientes naturales.
4.- Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del cultivo.
Figura 10.1 Curva de crecimiento ideal para un microorganismo que se reproduce por
duplicación
Procedimiento de enriquecimiento. Cuando se necesita obtener un cultivo de un
organismo determinado es necesario una técnica de enriquecimiento adecuada para esa especie.
Los métodos se basan en cualquier característica fisiológica del organismo deseado, por ejemplo,
pH o temperatura óptima, requerimientos nutricionales o tolerancia a algunos inhibidores. En
algunos casos se puede hacer un tratamiento térmico de suspensiones de suelo para el
aislamiento de organismos esporulados y otros organismos termo-resistentes, seguido por un
plaqueo en medio sólido. Otras veces se puede usar diferentes temperaturas de incubación, de
manera que el organismo deseado aumente su número en relación con el de los otros organismos
presentes. El procedimiento de enriquecimiento en medio líquido es inadecuado para dar un
cultivo puro, y el procedimiento final de aislamiento, comprende la obtención de colonias
separadas en medio sólido.
Microbiología y biotecnología
62 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
La preparación de medios terminados a partir de materiales deshidratados debe hacerse
de acuerdo a las instrucciones. Sólo debe usarse equipos y cristalería química limpios. El agua
debe ser siempre destilada o desmineralizada, salvo indicación en contra. La pesada exacta de los
materiales y la medida correcta de agua son esenciales. El calor debe ser directo o en baño de
agua hirviendo o recipientes envueltos en vapor con agitación. El calentamiento excesivo debe
evitarse. La homogeneidad también es esencial, especialmente para medios que contienen
agentes gelificantes. El mezclado debe ser suave para lograr homogeneidad sin espuma ni
burbujas.
La esterilidad se hace de varias formas, generalmente por autoclave o filtración. Casi
todos los medios se esterilizan a 121°C durante 15 minutos para volúmenes de hasta 500 ml.
Para volúmenes mayores el tiempo debe extenderse a 20, 30 ó más minutos según sea necesario.
Para verificar la esterilización placas y tubos con el medio se deben incubar a 20-25°C ó 30-
35°C durante uno o dos días. Los medios deben guardarse en un refrigerador.
Material
Muestras de microorganismos 1 caja con agar nutritivo
1 caja con agar EMB 1 mechero Fisher
1 caja con MacConkey sorbitol 1 asa bacteriológica
4 portaobjetos Colorantes para esporas
Colorantes para Gram 1 puente de coloración
1 piceta con alcohol 1 piceta con agua destilada
2 tubos con caldo nutritivo
Procedimiento:
2. Divide cada una de las cajas en dos partes.
1. Marca una mitad como A y la otra como B
2. Siembra por estría abierta un microrganismo en cada una de las mitades A y en la
mitad B siembra el “otro” microrganismo.
3. Incuba las cajas a 37 0C por 24 a 48 horas.
4. Observa y reporta si hay diferencias entre las mitades de los diferentes medios.
5. Determina si son Gram + o Gram – y verifica si son esporógenos por medio de la
tinciones adecuadas.
Cuestionario:
1. ¿Cuál es la composición química de cada medio?
2. ¿A que tipo corresponde cada medio? Clasifícalos.
3. Según el crecimiento ¿se puede saber de que microrganismos se trata?
4. ¿A que tipo de Gram pertenece cada uno?
5. ¿Cuál es la razón de los diversos componentes de los diferentes medios?
Microbiología y biotecnología
63 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Referencias:
NORMA Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones
sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades.
Microbiología y biotecnología
64 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 12
EFECTO DE AGENTES FÍSICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS
Objetivo: al término de la práctica el alumno determinará el efecto que tienen diferentes agentes
físicos sobre el crecimiento de los microorganismos y la aplicación de estos para el control de
ellos.
Introducción: existen muchos factores en el ambiente que son letales o potencialmente letales
para los microorganismos. Por regla general, los microorganismos son más resistentes a estos
factores que las células eucarióticas. Variaciones drásticas en temperatura, pH, presión osmótica
y otras se suceden con gran rapidez. Por ejemplo: una pequeña gota de humedad en una roca es
capaz de propiciar una inmensa población activa de microorganismos hasta que la temperatura se
eleva y la gota se evapora por completo; esto es típico de las condiciones a veces óptimas y en
ocasiones todo lo contrario en las cuales los microorganismos viven.
Las actividades metabólicas de un organismo son el resultado de la suma de todas las
reacciones químicas y como estas son influenciadas por la temperatura, en consecuencia el
proceso vital también lo está. Los microorganismos se desarrollan en una amplia gana de
temperaturas, desde las muy bajas, características de los psicrófilos, hasta las muy altas,
características de los termófilos.
Todos los microorganismos tienen una temperatura, mínima, óptima y máxima de
desarrollo. Las temperaturas superiores a la máxima, generalmente los matan, mientras que las
inferiores a la mínima usualmente les producen éstasis y por ello se les considera preservativas.
La cantidad de agua en el medio a cualquier temperatura tiene efectos notables para la
supervivencia de los microorganismos, debido a esto es que se utilizan altas temperaturas
combinadas con altos grados de humedad para destruir microorganismos (autoclave). El calor
húmedo es más rápido y eficaz que el calor seco para destruir microorganismos y las células
vegetativas son más sensibles al calor que las esporas.
Se utilizan tres términos para indicar el grado de resistencia al calor que tienen las
bacterias:
Microbiología y biotecnología
65 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
i) Punto térmico letal, que es la temperatura más baja a la cual una suspensión de
bacterias muere en 10 minutos.
ii) Tiempo térmico letal, es el tiempo más corto necesario para matar una suspensión
de bacterias (o esporas) a una temperatura determinada y bajo condiciones
específicas.
iii) Reducción decimal de tiempo, esto es, el tiempo en minutos necesario para matar
al 90 % de la población (son los minutos del tiempo térmico letal que pasan a
través de un ciclo logarítmico).
Las bajas temperaturas son útiles para preservar cultivos, ya que los microorganismos
tienen la capacidad única de sobrevivir al frío muy intenso. Las temperaturas de preservación
varían desde 7 0C hasta –196
0C. Desde un punto de vista práctico podemos considerar a las altas
temperaturas como microbicidas y a las bajas temperaturas (0 0C o menores) como
microbiostáticos.
Todos los organismos dependen del agua; la mayor parte de su masa es agua y todas sus
actividades se realizan en ambientes acuosos. La desecación de las células microbianas y su
medio produce la detención de la actividad metabólica, seguida de una declinación de la
población viable total. El tiempo de supervivencia a la desecación es variable y depende de:
1. La clase de microorganismos
2. El material en el que, o con el que, se desecan los microorganismos
3. La terminación del proceso de desecación
4. Las condiciones físicas a las cuales los microorganismos son expuestos, por ejemplo,
la luz, temperatura, humedad, etc.
5.
Estas generalidades se aplican al secado con aire. En el proceso de liofilización, los
microorganismos son sometidos a gran deshidratación en estado de congelación y después a
sellado al vacío, los cultivos liofilizados de microorganismos permanecen viables por muchos
años.
Osmosis es la difusión de productos a través de una membrana semipermeable que separa
a dos soluciones de diferentes concentraciones y que llega a un equilibrio al igualarse la
concentración a ambos lados de la membrana. Si las células son colocadas en una solución más
concentrada que su interior, el agua pasará a través de la membrana celular, que es
semipermeable, de la región de menor concentración de sustancias disueltas (el interior de la
célula) a la solución que rodea a la célula dando como resultado su deshidratación, esto es
conocido como plasmolisis. En el caso contrario (menor concentración de sales en el medio
exterior) la corriente se invertirá y el agua pasará al interior de la célula, a este fenómeno se le
conoce como plasmoptisis.
La mayor parte de los microorganismos son inhibidos por altas concentraciones de sal
(10-15%) o de azúcar (50-70%) hecho que es utilizado para preservar alimentos por medio de las
Microbiología y biotecnología
66 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
salmueras o de los almíbares. Sin embargo existen microorganismos que resisten altas presiones
osmóticas e incluso las necesitan para desarrollarse (osmofílicos). Aquellos que necesitan altas
concentraciones de sal para desarrollarse son llamados halofilicos, los que necesitan altas
concentraciones de azúcar son llamados sacarofílicos.
Las radiaciones electromagnéticas pueden interaccionar con la materia. Los rayos gama y
los rayos X que tienen energía de más de 10 eV son llamados radiaciones ionizantes porque
tienen suficiente energía para empujar los electrones fuera de las moléculas e ionizarlas. Cuando
estas radiaciones pasan a través de las células se produce hidrógeno libre, radicales hidroxilo y
algunos peróxidos, que a su vez producen diferentes tipos de daño celular. Las radiaciones
ionizantes producen poco calor en el material irradiado, siendo entonces utilizados para
esterilizar materiales en un proceso conocido como esterilización en frío.
Las radiaciones menos energéticas, particularmente la luz ultravioleta, no ionizan, sino
que son absorbidas en forma específica por diferentes compuestos. Las longitudes de onda de
alrededor de los 254 nm son los que tienen mayor eficacia como bactericidas, la luz solar, bajo
determinadas condiciones, tiene capacidad microbicida pero de un grado limitado.
Una suspensión de bacterias expuestas a la luz ultravioleta por varios minutos y luego a la
luz visible presentará mayor número de supervivientes que aquellas expuestas solamente a la luz
ultravioleta, esto es explicado por la presencia de una enzima luz-dependiente que reconoce a los
dímeros de timina en el DNA y repara el daño, restableciendo la estructura normal del mismo.
Existe otro mecanismo de reparación del daño causado al DNA por la luz ultravioleta que no es
luz-dependiente.
Materiales, reactivos y medios:
Caldo nutritivo (cbp) Agar nutritivo (cbp)
Sacarosa (cbp) Cloruro de sodio (cbp)
Cultivo de 24 horas de E. coli Cultivo de 24 horas de B. subtilis
3 tubos con agar nutritivo inclinado estériles
3 tubos con caldo nutritivo más sacarosa al 10, 20 y 40% estériles
3 tubos con caldo nutritivo más cloruro de sodio al 5, 15 y 30% estériles
4 tubos con 20 mL de agar nutritivo en bloque estériles
4 tubos estériles vacíos estériles 4 tubos con 5 mL de caldo nutritivo estériles
4 cajas petri (vidrio) estériles 2 cajas petri con agar nutritivo estéril
1 tubo con dos hisopos estériles 2 pipetas de 1 mL estériles
1 termómetro 0-100 0C 1 incubadora a 37
0C
1 refrigerador. 2 discos de cartulina negra
1 lámpara de luz ultravioleta de 254 nm 2 tubos con 10 mL de caldo nutritivo
1 asa bacteriológica 1 mechero de gas
1 baño maría a 65 0C 1 baño maría a 37
0C
Microbiología y biotecnología
67 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Procedimiento:
Temperatura
1. Inocular tres tubos de agar nutritivo inclinado con una asada del microorganismo de
prueba.
2. Incubar los tubos a temperaturas de: 4 0C (refrigerador), ambiente y a 37
0C, por 18
horas a 24 horas.
3. Usar el siguiente sistema para indicar el grado de crecimiento:
+ + + Crecimiento excelente
+ + Crecimiento bueno
+ Crecimiento pobre
0 No crecimiento
Presión osmótica
1. Inocular los tubos de caldo nutritivo-sacarosa y caldo nutritivo-cloruro de sodio de
distintas concentraciones con una asada del microorganismo de prueba.
2. Incubar con agitación a 37 0C, por 18 horas a 24 horas.
3. Indicar el grado de crecimiento de manera similar a lo indicado en “temperatura” .
Desecación
Día 1.
1. Colocar una asada del microorganismo de prueba en el fondo de cuatro cajas estériles
vacías. Numerarlas del uno al cuatro (#1 al #4).
2. Solamente a la caja marcada con el número uno (#1) vaciarle enseguida de 15 a 20 mL de
agar nutritivo estéril fundido y enfriado a ± 45 0C.
3. Incubar las cuatro cajas a 37 0C.
Día 2.
4. Sacar solamente la caja número uno (#1) a las 24 horas y contar el número de ufc/caja.
Descartar esta caja.
Día 3.
5. Solamente a la caja marcada con el número dos (#2) vaciarle a las 48 horas de 15 a 20
mL de agar nutritivo estéril fundido y enfriado a ± 45 0C.
6. Incubar las tres cajas restantes a 37 0C. (#2, #3 y #4)
Día 4.
Microbiología y biotecnología
68 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
7. Sacar solamente la caja número 2 (#2) a las 72 horas y contar el número de ufc/caja.
Descartar esta caja. Día 5.
8. Solamente a la caja marcada con el número tres (#3) vaciarle a las 96 horas de 15 a 20
mL de agar nutritivo estéril fundido y enfriado a ± 45 0C.
9. Incubar las dos cajas restantes a 37 0C.
Día 6.
10. Sacar solamente la caja número tres (#3) a las 120 horas y contar el número de ufc/caja.
Descartar esta caja. Día 7.
11. A la caja marcada con el número cuatro (#4) vaciarle a las 144 horas de 15 a 20 mL de
agar nutritivo estéril fundido y enfriado a ± 45 0C.
12. Incubarla a 37 0C.
Día 8.
13. Sacarla a las 168 horas y contar el número de ufc/caja. Descartar esta caja.
Tiempo térmico mortal.
1. Colocar en una serie de cuatro tubos estériles un mL de cultivo de la bacteria de prueba.
2. Colocarlos en un baño maría a una temperatura de 65 0C, durante los siguientes tiempos:
Tubo No. Tiempo en minutos
1 3
2 7
3 15
4 30
3. Una vez terminado el tiempo de calentamiento para cada tubo con cultivo, se sacan del
baño y se toma una asada de cada uno para resembrarlo a un nuevo tubo con caldo
nutritivo.
4. Incubarlos a 37 0C durante 24 horas.
5. Indicar el grado de crecimiento de manera similar a lo indicado en “temperatura”
Luz ultravioleta.
1. Sembrar con el hisopo la bacteria de prueba en toda la superficie de cultivo de una caja
de petri estéril.
Microbiología y biotecnología
69 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
2. Cortar un disco de cartulina negra de tamaño apropiado de tal modo que cubra
sobradamente la caja de petri. Recortar una figura geométrica o cualquier símbolo en el
centro.
3. Quitar la tapa de la caja petri y en su lugar colocar el disco de cartulina negra.
4. Exponer la caja a la acción de la luz ultravioleta por 10 minutos. PRECAUCIÓN: LOS
RAYOS ULTRAVIOLETA SON MUTAGENOS, POR LO QUE SE DEBE DE
APAGAR LA FUENTE DE ESTOS ANTES DE INTRODUCIR O SACAR LAS
CAJAS. NO SE DEBE DE IRRADIAR NINGUNA PARTE DEL CUERPO NI
MIRAR A LA FUENTE DE LUZ ULTRAVIOLETA DE MANERA DIRECTA,
SIEMPRE PROCEDA CON CUIDADO.
5. Quitar los discos de cartulina y colocar nuevamente la tapa de las cajas.
6. Incubar las cajas a 37 0C durante 24 a 48 horas
7. Comparar el crecimiento de las áreas expuestas a la luz ultravioleta contra aquellas en las
que no hubo exposición.
Opcional: exponga las cajas irradiadas cinco minutos a la luz visible, antes de ponerlas a incubar.
Cuestionario:
1. ¿Explica cuál es el mecanismo de esterilización del calor húmedo y cuál el del calor
seco?
2. Realiza un esquema de una célula animal en: i) medio hipertónico, ii) medio hipotónico y
iii) medio isotónico. ¿Cuál es la diferencia con una célula de E. coli? ¿Cuál con un
protoplasto de E. coli?
3. ¿Qué importancia tiene el destapar la caja petri antes de ser irradiada con luz ultravioleta?
¿Cómo actúa ésta?
Microbiología y biotecnología
70 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 13
EFECTO DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS
Objetivo: al término de la práctica el alumno analizará el efecto que tienen diferentes agentes
químicos al determinar el efecto que tienen sobre el crecimiento de los microorganismos para
considerar la aplicación de estos para el control de ellos.
Introducción: La destrucción de los microorganismos por agentes químicos es lo que se conoce
con el nombre de desinfección. La búsqueda de compuestos químicos que muestren una alta
toxicidad para los microorganismos y que causen el menor daño posible al hombre o a sus
propiedades (animales, plantas, instalaciones, etc) es continua.
Los germicidas (sustancias que destruyen gérmenes sean o no patógenos) es sinónimo de
microbicida pueden ser fungicidas, bactericidas, alguicidas, etc. según destruyan hongos,
bacterias, algas o algún otro tipo de microorganismo. Se dice que una sustancia es desinfectante
si posee la capacidad de destruir o eliminar microorganismos causantes de enfermedades, siendo
completos si su actividad es sobre la forma vegetativa y esporas e incompleto si sólo es efectivo
sobre la forma vegetativa. Los antisépticos son sustancias que detienen o inhiben el crecimiento
de una bacteria sin matarla. El término sanitizado significa que el número de bacterias está por
debajo de lo establecido como margen de seguridad para la salud, se utiliza en alimentos,
bebidas, vestuario, utensilios, etc.
La distinción entre un bactericida y un bacteriostático, es que este último no mata los
microorganismos, detiene solamente su crecimiento y su desarrollo continúa una vez que es
eliminado el agente, la diferencia es muy sutil, los dos grupos muestran muchas interrelaciones y
ella puede depender del tiempo y las condiciones de exposición. Por ejemplo, el fenol en
concentraciones del 5% es un desinfectante activo contra un gran número de gérmenes pero esta
concentración y menores constituyen un alimento para algunas especies de Pseudomonas.
Los mecanismos mediante los cuales las sustancias químicas pueden dañar a las células
microbianas o virus pueden agruparse en:
Microbiología y biotecnología
71 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
1. Interferencia con la replicación de la información genética.
2. Desajuste de la traslación de la información genética y la síntesis de proteínas.
3. Alteración de la estructura y función de la pared celular.
4. Interferencia con el funcionamiento de la membrana celular.
5. Alteración directa de las proteínas celulares.
6. Alteración química directa de otros compuestos vitales de la célula.
Varios factores, aparte del desinfectante, están involucrados en el efecto bactericida, entre
estos tenemos:
1. Concentración y tiempo de exposición
2. Edad del cultivo: en general las células de los cultivos jóvenes en la fase logarítmica del
crecimiento son más susceptibles que las de los cultivos viejos.
3. Concentración de bacterias: se requiere más tiempo para matar poblaciones grandes de
bacterias que pequeñas.
4. Composición química del medio de cultivo o del tejido: los compuestos reductores
normalmente presentes en el tejido, protegerán a los microorganismos de los agentes
oxidantes. La leche, la sangre, el suero y otros materiales proteínicos ofrecen alguna
protección contra los desinfectantes que coagulan el citoplasma bacteriano.
5. Temperatura: la actividad de la mayoría de los desinfectantes es directamente
proporcional al incremento de la temperatura.
Para que una sustancia o compuesto químico sea considerado un buen desinfectante, deberá
poseer el máximo de cualidades que caracterizan al desinfectante ideal:
Escasa o nula toxicidad para el hombre.
Gran poder germicida en altas diluciones.
Rápida acción.
Estabilidad en presencia de sustancias orgánicas.
Máxima solubilidad en agua.
Buena penetración
No tener olor desagradable.
No dañar ropa o utensilios.
Ser económico.
El poder bactericida de un producto químico se valora comparándolo con el fenol en
condiciones idénticas sobre un determinado microorganismo y en igual tiempo de acción, esto es
conocido como Coeficiente Fenólico; este se obtiene dividiendo la dilución más alta del
germicida que mata a las bacterias en 10 minutos, pero no en cinco por la correspondiente
dilución del fenol. Si el coeficiente es mayor de uno, el desinfectante es más potente que el fenol
y si es menor de uno, es más débil que este.
Microbiología y biotecnología
72 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Para realizar la prueba, se preparan diluciones distintas del fenol y del desinfectante a probar
en agua destilada., a cinco mL de cada dilución se le agrega 1.5 mL de un cultivo en caldo de 24
h de estafilococo dorado o bacilo de la tifoidea y se toman porciones con el asa de platino (d = 4
mm) a los 5, 10 y 15 minutos para resembrarlos en 10 mL de caldo. Luego de una incubación de
48 h se efectúa la lectura.
Algunos tipos de desinfectantes y ejemplos de ellos son:
Ácidos: ácido clorhídrico, ácido benzoico.
Álcalis: hidróxido de sodio.
Sales de metales pesados: nitrato de plata
Fenol y cresol
Halógenos: hipoclorito de sodio.
Compuestos oxidantes: permanganato de potasio.
Agentes reductores: formaldehído
Alcoholes: etanol.
Glicoles: etilenglicol.
Colorantes: cristal violeta.
Jabones y detergentes.
Sales cuaternarias de amonio.
Los agentes químicos utilizados interna o externamente para el tratamiento de las infecciones
son más comúnmente designados como agentes quimioterapéuticos y su aplicación se llama
quimioterapia, algunos de ellos son:
Prontosil
Sulfonamidas
Nitrofuranos
Ácido nalidixico
Isoniacida
Procedimiento:
Efecto del pH.
1. Inocula con una asada de la suspensión de microorganismos, los tubos que contienen caldo
nutritivo a diferentes pH (una asada por tubo).
2. Incuba los tubos a 37 0C por 24 h.
3. Examina la turbidez después de la incubación.
4. Reporta tus resultados usando el siguiente sistema:
Microbiología y biotecnología
73 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
0 No turbidez (claro, similar a un tubo sin inocular)
+ Turbidez ligera
++ Turbidez moderada
+++ Turbidez fuerte (similar a la de los tubos de donde procede el inoculo)
Efecto de antibióticos, metales pesados, detergentes, colorantes, etc.
1. Humedece el hisopo con la suspensión bacteriana y siembra masivamente las tres cajas con
agar nutritivo estéril.
2. Esteriliza las pinzas flameándolas con alcohol, enfríalas. Toma con ellas los discos y
colócalos sobre las cajas de manera uniforme, procurando que quede entre ellos un espacio
mayor al doble de sus diámetros.
3. Incuba las cajas a 37 0C por 24 h.
4. Después de la incubación observa y mide el diámetro de la zona de inhibición.
Acción bacteriostática de un colorante.
1. Licua el agar nutritivo de los cuatro tubos por medio del calor y consérvalos en el baño
maría.
2. Prepara diluciones 10-4
, 10-5
y 10
-6 del colorante.
3. Coloca un mL de cada una de las diluciones recién preparadas en cajas petri estériles vacías.
4. Agrega el agar de los tubos a las cajas petri (tubo por caja) y homogeniza con el colorante
por medio de movimientos rotatorios. La cuarta caja que no tiene colorante se emplea como
testigo.
5. Deja que solidifiquen, con un marcador divídelas en dos en la superficie externa inferior,
marca una mitad como “A” y la otra como “B”.
6. Siembra ambas mitades por estría abierta, con los dos cultivos respectivos (no se te olvide
incubar siempre el mismo microorganismo en la mitad marcada con la misma letra).
7. Incuba a 37 0C por 24 h.
8. Observa y registra el crecimiento de cada cultivo en las diferentes diluciones.
9. Establece, si las hay, las diferencias entre los dos tipos de microorganismos.
Materiales, reactivos y medios:
4 tubos con 20 mL de agar nutritivo en bloque, estériles
4 cajas petri de vidrio estériles, vacías
3 tubos con 9 mL de agua destilada, estériles
1 tubo con dos hisopos estériles
1 tubo con caldo nutritivo estéril a pH 2.0
1 tubo con caldo nutritivo estéril a pH 3.0
Microbiología y biotecnología
74 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
1 tubo con caldo nutritivo estéril a pH 4.0
1 tubo con caldo nutritivo estéril a pH 5.0
1 tubo con caldo nutritivo estéril a pH 6.0
1 tubo con caldo nutritivo estéril a pH 7.0
1 tubo con caldo nutritivo estéril a pH 9.0
3 cajas petri estériles con agar nutritivo estéril
3 pipetas de 1 mL estériles.
1 asa bacteriológica
1 mechero de gas
1 termómetro 0-100 0C
1 baño maría a ~50 0C
1 incubadora a 37 0C
Caldo nutritivo (cbp)
Agar nutritivo (cbp)
Cultivo de 24 horas de Escherichia coli
Cultivo de 24 horas de Bacillus subtilis
1 pinzas de disección de puntas finas
1 solución de cristal violeta 1:1000
discos de papel con antibióticos, metales pesados, detergentes, colorantes, etc.
Cuestionario:
1. ¿Cómo funcionan los siguientes tipos de desinfectantes y cuál es su aplicación?
Halógenos
Alcoholes
Sales cuaternarias de amonio
2. ¿Cómo funcionan las sulfonamidas, cómo se llama el tipo de inhibición enzimática que
ejercen?
3. Si es correcto decir que un bactericida es una sustancia que mata bacterias, porque no es
correcto decir que un viricida mata virus. ¿O, si lo es, porqué?
4. Menciona una aplicación de un agente bacteriostático.
5. Calcula el coeficiente fenólico del siguiente desinfectante:
FENOL
Dilución Tiempo en minutos
5 10 15
1:80 - - -
1:90 + - -
1:100 + + +
Microbiología y biotecnología
75 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
DESINFECTANTE DE PRUEBA
Dilución Tiempo en minutos
5 10 15
1: 250 - - -
1: 275 + - -
1:300 + + -
1: 300 + + +
+ = VIVOS - = MUERTOS
6. ¿Cuál es la función del ácido para-aminobenzoico en los organismos?
Microbiología y biotecnología
76 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 14
RELACIÓN ENTRE MICROORGANISMOS Y CARIES DENTAL
Objetivo: el alumno analizará la complejidad de la comunidad microbiana oral por medio de un
ensayo microbiológico y bioquímico para relacionar sus resultados con la actividad cariogénica.
Introducción: la boca humana es un lugar fascinante. En ella abundan cientos de especies
bacterianas, y algunos se encuentran solamente en ella. Desafortunadamente, algunas de las
bacterias que viven en nuestra cavidad oral pueden pudrir nuestros dientes. Si conocemos y
entendemos el mundo microbiano de nuestra boca, podremos prevenir la destrucción causada por
microorganismos y promover un ecosistema oral benigno.
Procedimiento:
Mastica la goma o la parafina pura por espacio de tres minutos con el fin de estimular la
salivación, durante este tiempo, colecta la saliva en la caja Petri estéril. Se recomienda colectar
los especimenes antes del desayuno y antes de cepillar los dientes. Transfiere con la ayuda de la
pipeta estéril 0.2 mL de saliva a un tubo que contenga agar de Snyder fundido y a
aproximadamente 45 0C, deja solidificar ambos tubos a temperatura ambiente por medio de una
hora en posición vertical, incuba ambos tubos a una temperatura de 37 0C por 72 horas.
Examina los tubos diariamente durante tres días y anota los cambios de color comparados con el
tubo sin inocular. La observación de cambio de color se facilita usando luz reflejada y
observando contra un fondo blanco. El cambio de color será del azul verdoso del control a
amarillo. Usa la siguiente clave para reportar:
Positivo: cambio en color de tal forma que el verde ya no es dominante; repórtalo como ++ o
++++ según la intensidad del cambio.
Negativo: no hay cambio de color o solamente una ligera desviación, pero el color verde
todavía es dominante. Repórtalo como 0 o +
Microbiología y biotecnología
77 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Interpretación:
Actividad cariogénica Horas de incubación
(Relativa al número de bacilos) 24 48 72
MARCADA POSITIVO
MODERADA NEGATIVO POSITIVO
LEVE NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO
NEGATIVA NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO
Material:
8. Una goma de mascar, sin azúcar.
9. Dos tubos de ensayo con rosca, conteniendo 10 mL de agar Snyder
10. Dos tubos de ensayo con rosca, conteniendo 10 mL de agar Snyder, por sesión
11. Un mechero tipo Fisher.
12. Dos cajas petri estériles, de vidrio
13. Dos pipetas de un mL, estériles.
14. Un plumón marcador para vidrio.
15. Cerillos.
Notas:
La interpretación de los datos de laboratorio dados antes deben relacionarse con la actividad
clínica y la experiencia y compresión de algunos factores:
1. Los datos indican sólo lo que está sucediendo en el momento en el cual el espécimen fue
colectado
2. Para comparar con exactitud, es necesario obtener por lo menos dos muestras con
intervalo de dos semanas
3. Solo cuando dos o más especimenes han sido cultivados, cualquier relación o predicción
puede hacerse
4. Deben estudiarse suficientes casos para establecer el valor de significancia para el
propósito indicado.
Cuestionario:
9. ¿Cuándo una flora normal deja de serlo?
10. ¿Qué es habitat?
11. ¿Cuál es el mecanismo de acción de la lisozima y de la lactoperoxidasa?
12. Define los siguientes términos
Organismo axénico
Organismo gnotoxénico
Organismo heteroxénico
Organismo holoxénico
Microbiología y biotecnología
78 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 15
COEFICIENTE FENÓLICO
Objetivo: al término de la práctica el alumno determinará la concentración de una sustancia que
es necesaria para tener el mismo efecto que tiene una solución de fenol en el control de
microorganismos.
Introducción: El poder bactericida de un producto químico se valora comparándolo con el fenol
en condiciones idénticas sobre un determinado microorganismo y en igual tiempo de acción, esto
es conocido como Coeficiente Fenólico; este se obtiene dividiendo la dilución más alta del
germicida que mata a las bacterias en 10 minutos, pero no en cinco por la correspondiente
dilución del fenol. Si el coeficiente es mayor de uno, el desinfectante es más potente que el fenol
y si es menor de uno, es más débil que este.
Procedimiento: para realizar la prueba (modificada), se preparan diluciones distintas del fenol y
del desinfectante a probar en agua destilada, a cinco mL de cada dilución se le agrega 1.5 mL de
un cultivo en caldo de 24 h de E. coli o B. cereus. Se toman porciones con el asa de platino (d =
4 mm) a los 5, 10 y 15 minutos para resembrarlos en una caja Petri que contiene agar nutritivo.
Luego de una incubación de 48 h se efectúa la lectura.
Diluciones: De la dilución de fenol prepare las siguientes diluciones:
mL de fenol (# de dilución)
mL de diluyente Dilución:
3 (1) 27
3 (2) 24
De la dilución del desinfectante de prueba prepare las siguientes diluciones:
mL del desinfectante X(# de dilución)
mL de diluyente Dilución:
4.0 (3) 36.0
3.6 (4) 36.4
3.2 (5) 36.8
2.8 (6) 37.2
2.4 (7) 37.6
Microbiología y biotecnología
79 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Dibujar 3 líneas separadas en el fondo de las cajas Petri, marcarlas 5, 10 y 15, además de
la dilución correspondiente (# de dilución)
Forma de inocular: Colocar 5.0 mL de cada dilución en un tubo perfectamente marcado,
agregar 1.5 ml del cultivo al primer tubo de fenol, después de transcurrido 0.5 minutos agregar
1.5 ml de cultivo al segundo tubo de fenol, proceder de igual forma con los tubos de las
diluciones del desinfectante de prueba, siempre debe de existir un lapso de tiempo de 0.5
minutos entre tubo y tubo. Al llegar a los 5 minutos empiece con el tubo 1 y así continúe cada
0.5 minutos
Materiales, reactivos y medios:
3 tubos con solución de fenol
6 tubos con solución de deseinfectante de prueba
1 tubo con cultivo de 24 horas de Escherichia coli
1 tubos con cultivo de 24 horas de Bacillus subtilis
10 cajas Petri con agar nutritivo
3 pipetas de 5 mL estériles.
1 asa bacteriológica
1 mechero de gas
1 incubadora a 37 0C
Caldo nutritivo (cbp)
Cuestionario:
1. Calcula el coeficiente fenólico del siguiente desinfectante:
FENOL
Dilución Tiempo en minutos
5 10 15
1:80 - - -
1:90 + - -
1:100 + + +
DESINFECTANTE DE PRUEBA
Dilución Tiempo en minutos
5 10 15
1: 250 - - -
1: 275 + - -
1:300 + + -
1: 300 + + +
+ = VIVOS - = MUERTOS
2. ¿Cuál es la función del ácido para-aminobenzoico en los organismos?
Microbiología y biotecnología
80 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No. 16
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA DE UN
ANTIBIÓTICO
Objetivo: al término de la práctica el alumno determinará la concentración mínima inhibitoria a
un antibiótico de una bacteria aislada, utilizando el método de dilución en caldo.
Introducción: La técnica de dilución en caldo permite determinar la actividad de un agente
antimicrobiano sobre un microorganismo, en forma de concentración mínima inhibitoria (CMI):
la menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento. A partir de este dato
puede determinarse si es posible tratar una infección causada por ese microorganismo con ese
antimicrobiano. Si la CMI es menor que la concentración de antimicrobiano que se alcanza en
los tejidos de cuerpo humano, el tratamiento puede tener éxito y el microorganismo se considera
sensible; en caso contrario fracasará y el microorganismo se considera resistente. Un
antibiograma es un estudio de la sensibilidad de un microorganismo dado a distintos
antimicrobianos. Las distintas especies y estirpes microbianas presentan distintos grados de
sensibilidad a los diversos agentes, de ahí que sea necesario hacer una evaluación para poder
seleccionar el compuesto más apropiado para el tratamiento de una infección bacteriana.
Procedimiento:
1.- Preparación del inóculo
Esta técnica sólo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello, previamente se
procederá, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa.
La preparación del inóculo se realiza sembrando una colonia aislada del microorganismo en
estudio en un tubo de caldo Müeller-Hinton e incubando a 37ºC durante 18-20 h.
2.- Preparación de las diluciones de antibiótico
a) Rotular los tubos de caldo Müeller-Hinton: 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 y 0 mg/ml.
b) Pipetear 1 ml del tubo que contiene la solución de ampicilina (16 mg/ml) al marcado con 8
c) Mezclar bien pipeteando y transvasar 1 ml al tubo siguiente (4 mg/ml).
d) Repetir el paso anterior hasta llegar al tubo marcado con 0.25 mg/ml, del que se desecha 1 ml
e) No añadir antibiótico al tubo marcado 0.
3.- Siembra
Tomar una muestra del cultivo de E. coli con una pipeta Pasteur e inocular una gota en cada tubo
de la serie de diluciones (incluidas las de 16 y 0 mg/ml). Finalmente, incubar los tubos a 37ºC
durante 20 h.
Interpretación
Microbiología y biotecnología
81 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
Al día siguiente, observar si hay turbidez en los tubos. De los que no presenten crecimiento, el
que contenga la concentración más baja de antibiótico corresponderá a la CMI. El tubo que no
contiene antibiótico debe estar turbio (control positivo).
Figura 10.1. Determinación de la CMI.
Materiales, reactivos y medios:
Cultivo bacteriano en medio líquido de Escherichia coli
7 tubos con 1 ml de caldo Müeller-Hinton,
Solución de ampicilina (16 mg/ml) en caldo Müeller-Hinton (2 ml)
7 pipetas de 1 ml
1 pipeta Pasteur.
Microbiología y biotecnología
82 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
PRACTICA No. 17
ESTUDIO BACTERIOLÓGICO DE BIVALVOS
Objetivo: el alumno será capaz de determinar la calidad bacteriológica de bivalvos mediante un
análisis del número más probable.
Introducción: los alimentos del mar pueden contaminarse bacteriológicamente por las descargas
de las aguas residuales de las comunidades que tienen descargas directamente al cuerpo de agua
sin tratamiento o sin control sobre el tratamiento. La contaminación también puede deberse a los
arrastres del agua de lluvia. Algunos de los microorganismos encontrados son: bacilo de la
tifoidea, éste tiene una larga sobrevivencia tanto en ostiones intactos como en su carne y jugo (15
a 60 días). Vibrio parahaemolyticus microorganismo causante de gastroenteritis y el virus de la
hepatitis infecciosa.
En algunos casos los causantes de contaminación son los mismos organismos marinos, tal
es el caso de las mitilotoxinas, que son causa de envenenamiento. Estas son adquiridas por los
bivalvos al ingerir algunas especies de dinoflagelados, responsables de las “mareas rojas”
Procedimiento: 1. Transportar los bivalvos en bolsas de plástico sobre hielo.
2. En el laboratorio, librarlos del fango; lavarlos con agua corriente, cepillarlos en su exterior y
secarlos sobre papel absorbente. Se deben de eliminar las conchas que no estén
herméticamente cerradas o que mostraron espuma en su superficie.
3. Abrir las conchas asépticamente.
4. Recoger tanto el líquido como la carne en un frasco estéril hasta alcanzar la marca de 200
mL.
5. Añadir un volumen igual de agua y homogenizar en licuadora
6. Dejar reposar dos minutos (o más si es necesario) para que sedimenten las partículas
mayores.
7. Inocular por quintuplicado tubos de fermentación con caldo lauril triptosa de la siguiente
forma:
La primera serie, cada tubo con 2 mL de la muestra homogenizada y diluida 1:2;
La segunda serie con un mL de la muestra diluida (en total) 1:10;
La tercer serie con un mL de la muestra diluida (en total) 1:100.
Microbiología y biotecnología
83 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
8. Incubar los tubos a 35 0C, hacer las lecturas a las 24 y 48 horas. Aquellos que presenten gas
(hasta aquí es la prueba presuntiva), sembrarlos en tubos de fermentación conteniendo caldo
bilis verde brillante
9. Incubar a 35 0C por periodos iguales de tiempo.
10. Con los resultados así obtenidos, determinar el “número más probable” (NMP) confirmado
de coliformes, empleando las tablas correspondientes.
11. NORMAS;
Cuando los bivalvos frescos contienen 230 o más coliformes/100 mL, NO reúnen las
condiciones sanitarias adecuadas; se pueden tolerar recuentos de hasta 2400 coliformes/100
mL siempre que esto no ocurra en más de dos muestreos sucesivos.
Material:
Bolsas de plástico vaso de ppt de 500 mL
Hielera licuadora
Hielo agua destilada estéril
Papel absorbente 30 tubos con rosca
Fibra 30 tubos durham
Caldo lauril triptosa 3 tubos con rosca con 9 mL de s.s.f. estéril
3 pipetas de 1 mL 1 pipeta de 10 mL
Incubadora caldo bilis verde brillante
Mejillones (choros) o almejas
Cuestionario:
1. De acuerdo a las condiciones climáticas de Ensenada ¿en qué época del año se deberían de
esperar mayor número de coliformes? ¿por qué?
2. ¿Qué significa el término “organismos indicadores”?
3. ¿Qué características deben de reunir los organismos indicadores?
Microbiología y biotecnología
84 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
(FORMATO PARA PRESENTAR EL REPORTE)
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGIA
CAMPUS ENSENADA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No.:
NOMBRE DE LA PRÁCTICA
ALUMNO(S):
NOMBRE DE ALUMNO 1
NOMBRE DE ALUMNO 2
RESPONSABLE:
M. en C. MIGUEL HUMBERTO CARRILLO MENDÍVIL
ENSENADA, B. C. (día) de (mes) de (año)
La fecha corresponde al día que se realizó la práctica
Microbiología y biotecnología
85 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA
UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
BIOLOGÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA No.
NOMBRE DE LA PRÁCTICA
Objetivo: al finalizar la práctica el alumno será competente para
Introducción:
Material:
Procedimiento:
Cuestionario:
Literatura revisada:
Microbiología y biotecnología
86 Miguel Humberto Carrillo Mendívil
BIBLIOGRAFIA
Collins, C.H (1969). Metodos Microbiologicos. Editorial Acribia. Primera edicion. España
R. Granados , C. Villaverde (1998) Microbiologia. Editorial Paraninfo. Primera edicion .
España.
Hans. G Schegel. (1979) Microbiologia general. Editorial Omega. Segunda edicion. España.
NORMA Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones
sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades.
NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de
bacterias aerobias en placa
NORMA Oficial Mexicana NOM-109-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Procedimientos para la
Toma, Manejo y Transporte de Muestras de. Alimentos para su Análisis Microbiológico.
NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de
muestras de alimentos para su análisis microbiológico
Norma Mexicana NMX-F-248-1975 determinación de microorganismos en especias y
condimentos de canela en polvo
Most Probable Number from Serial Dilutions BAM Appendix 2: Most Probable Number from
Serial Dilutions, October 2010. Author: Robert Blodgett
http://www.fda.gov