7
Microfabricated isoelectric focusing device for direct electrospray ionization-mass spectrometry A novel microfabricated device for isoelectric focusing (IEF) incorporating an optimized electrospray ionization (ESI) tip was constructed on polycarbonate plates using laser micromachining. The IEF microchip incorporated a separation channel (50 m ´ 30 m ´ 16 cm), three fluid connectors, and two buffer reservoirs. Electrical potentials used for IEF focusing and electrospray were applied through platinum electrodes placed in the buffer reservoirs, which were isolated from the separation channel by porous mem- branes. Direct ESI-mass spectrometry (MS) using electrosprays produced directly from a sharp emitter ªtipº on the microchip was evaluated. The results indicated that this design can produce a stable electrospray and that performance was further improved and made more flexible with the assistance of a sheath gas and sheath liq- uid. Error analysis of the spectral data showed that the standard deviation in signal intensity for an analyte peak was less than ~ 5% over 3 h. The production of stable electrosprays directly from microchip IEF device represents a step towards easily fabri- cated microanalytical devices. Microchannel IEF separations of protein mixtures were demonstrated for uncoated polycarbonate microchips. Direct microchannel IEF-ESI- MS was demonstrated using the microfabricated chip with an ion-trap mass spectrom- eter for characterization of protein mixtures. Keywords: Microchip / Electrospray ionization / Isoelectric focusing / Proteins / Mass spectrome- try EL 3704 Jenny Wen Yuehe Lin Fan Xiang Dean W. Matson Harold R. Udseth Richard D. Smith Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA, USA 1 Introduction Microfabricated analytical devices are receiving growing interest [1±5] due to their potential to enhance sensitivity and speed, as well as for reduction of instrument size, cost, and weight. Initial attention has been focused pri- marily on the development of miniaturized separation sys- tems [6±10]. Most of the microanalytical devices reported have been fabricated on glass substrates using photoli- thography, wet chemistry, and chemical etching proc- esses [1±10]. Issues associated with the use of glass chips for such devices include the need for time-consum- ing manual fabrication methods, high temperature bond- ing requirements, and the highly fragile nature of the prod- ucts. As a result, alternatives being evaluated for microanalytical applications include thermoplastics, poly- methylmethacrylate [11] and polydimethylsiloxane [12]. Those materials are lightweight, chemically inert to com- mon reagents used in analyses easily bonded, and robust. An additional advantage of using thermoplastics for this application is their low surface charge, potentially eliminating the necessity of time-consuming coating steps for certain types of separations. Capillary isoelectric focusing (CIEF) is a technique for high resolution separations of proteins. However, conven- tional CIEF using fused silica capillary tubing commonly suffers from poor reproducibility resulting from inconsis- tent sample handling and poor hydrolytic stability of the capillary coatings [13±19]. Isoelectric focusing (IEF) de- vices microfabricated on polymer chips can circumvent some of these limitations and can potentially be inte- grated with similarly miniaturized injection and interfacing components, enabling much more rapid and automated analyses. Microfabricated separation devices reported so far have primarily utilized fluorescence [20±25] for detec- tion. A few research groups have reported the use of other detection methods, including UV, electrochemistry, refractive index, and mass spectrometric detection [26± 28]. Although electrospray ionization mass spectrometric (ESI-MS) detection has been interfaced with microchips, the combination of ªon chipº ESI with stable and reliable performance has not been demonstrated. Several approaches have been previously explored in attempting to develop stable and continuous electrospray from microchips. A common method has been to use a short capillary segment inserted into the end of a micro- chip channel for use as an electrospray ªemitterº [30±32]. However, due to the small channel dimensions involved, Correspondence: Dr. Richard D. Smith, Environmental Molecu- lar Science Laboratory, Mail Stop K8-98, Pacific Northwest Na- tional Laboratory, P.O. Box 999, Richland, WA 99352, USA E-mail: [email protected] Fax: +509-376-2303 Abbreviation: PET, polyethylene terephthalate Electrophoresis 2000, 21, 191±197 191 WILEY-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, 2000 0173-0835/00/0101-0191 $17.50+.50/0 General

Microfabricated isoelectric focusing device for direct electrospray ionization-mass spectrometry

Embed Size (px)

Citation preview

������������� ��� ���� �������� ���� ������� �������� �������������� ��������

� ����� ����� ����� ����� �� �������� ������� ����� ���������� �� ������������������ ���������� ����� ��� ��� �������� �� ����� ����� ������ ����� ���������������� ��� ��� ������ ��������� � ��������� ������ � ! � � "! � �#$ ��% ���� ����� �������% ��� ��� ���� �������� ������� ���������� ���� ����� ������� ��� ��������� ��� ������� ������ �������� �������� ����� �� ��� ���� �������% ���� ��� �������� ��� ��� ��������� ������ � ����� ���& ����� '��� ���&���� ��������� �(�� ����� ���������� ������ ��������� � ���� ������ )���* �� ��� ������ ��� ���������� ��� ������ �������� �������� ������ �� ����� � ��� �� ��������� ��� ���� �������� ��� ������������ ��� ���� ��� ���+� �� ���� ��� ��������� �� � ������ ��� ��� ������ ��,&���� �� �������� �� ��� ������ ���� ������ ���� ��� ������� ��������� �� ��������������� �� �� ������� ���- ��� ���� ���� . / ��� " �� ��� �������� �� ��� ������������ ������ ��� ������ ��� ����� �������� � ���� ������ ������ �� �&���� ������������ ������� (�������� ��� ���������� �� ������ ��+���� �������������� �� ������� ����� ����� �������� '��� ��������� ���&���&(� ��� ����������� ����� ��� ����� ����� ��� ���� �� ���&��� ���� ������&��� �� ������������ �� ������ ��+�����

�������� (����� 0 ��������� ���������� 0 �������� ������� 0 1������ 0 (��� �������&

�� �2 "3!4

���� ����� ������ ����!�� �" �����#��� � $" %���$������ !" &���

������������ (����������� 2� �����% 1����5������� 5�������2� �����% 6������% 7�%8��

' (���������

(���� ����� ��������� ������ �� ������� ������������� 9#: ; ��� �� ���� ��������� �� ������ �������������� �����% �� ���� �� �� ������� �� ��������� ����%���% ��� ������� ������� ��������� ��� ��� ������ ��&����� �� ��� ����������� �� ����������� ��������� ���&���� 9$:#!;� (��� �� ��� ������������ ������ ���������� ��� �� ����� �� ����� �� ������ ����� �������&��������% ��� �������% ��� ������ ������ ��&����� 9#:#!;� ������ ��������� ���� ��� ��� �� ��������� �� ��� ������ ������ ��� ���� �� ����&�����&��� ������ �� ������ �������% ���� ��������� ���&��� �,��������% ��� ��� ������ ������ ����� �� ��� ���&���� �� � �����% ����������� ���� ��������� �������������� ����������� ������ ������������% ����&���������������� 9##; ��� ����������������+��� 9#<;������ �������� �� �����������% �������� ���� �� ��&��� ������� ���� �� �������� ������ �����% ���� ���� �� ���������� ��������� �� ����� �������������� ���� ���������� �� ���� ��� ����� ����% �����������

����������� ��� �������� �� ����&�������� ������ ������� ����� ����� �� �����������

=������� �������� ������� �=���� �� � �����,�� ������ ��������� ���������� �� �������� >�����% �����&������ =��� ����� ����� ����� ������� �� ��� ������������� ��� ��� ������ ����� �������� ��� �������&���� ������ �������� ��� ��� �������� ��� ����� �� ���������� ������� 9#":#?;� �������� ������� ����� ��&���� ����� ����� �� ������ ���� �� ����������� �� ����� ����������� ��� �� ����������� � ����&����� ���� �������� ����������� ��@����� ��� ������������������% ��� ���� ��� ��� ���� ��� ������������������ (���� ����� ��������� ������ ������ ���� ���� ������� �������� ��������� 9<!:< ; �� ����&����� � ��� ����� ����� ���� ������ ��� ��� ������ �������� �������% �������� 8A% ������������%������� ����+% ��� ���� ��������� �������� 9<$:<B;� �������� ��������� ���������� ���� �������������&(�� �������� ��� ��� �������� ���� �������%��� �� ������� �� )�� ���* ��� ���� ��� �� ��� ���� ���������� ��� ��� ��� ������������

������ �������� ���� ��� ��������� �+����� ������������ �� ������� ��� �� ��� ��������� ������������ �������� � ����� ������ ��� ��� �� ��� ����� ������� ������� ������� ���� ��� ��� �� � ���&��� ������ �� ��� �� �� ��������� )������* 9"!:"<;�>�����% ��� �� ��� ����� ������ ���������� ��������%

)����������� '� 6���� '� �����% ������������ (����&�� ����� 2� �����% (��� ���� CB&?B% 1���� 5������� 5�&������ 2� �����% 1�D� E�+ ???% 6������% 7� ??" <% 8��*���� � �F�����G���������+� H !?&"3$&<"!"

,���������� -*.% ������������ ������������

������������ <!!!% � % #?#:#?3 #?#

I 7�2�J&A=> A���� K� >% $?4 # 7�������% <!!! !#3"&!B" 0!!0!#!#&!#?# L#3� !H� !0!

/���

��� ����� �� �� ��� ������ �� ����� ����&����������� �������� �� �������� ��� ���� �� ��� � ������� ����&�� �� � ������ �� ���� ����� �� ��� ���������� ��)���� ������* ��� ��� ���������� �� ��������� ,�������'��� ������������ ��� ������ ������ ����� ���&�������� ������� ��� ���� ��� ������ 9"";% �� ���&������ � ��� �� ��������� �� ����� ����� �����&���� ������ �� ���� ��������� �������� �� ���������������� 7� ���� � ����� ����� ����� ���&������ ��� ����� �� ����� ��� � ������ ��� ��������� ����������� �����,���� ��� ��������� �������� �������� ����� ���� ������ ��������� ��������� ������ ������� ��������� ������ )���*�������� �� ������ ��� ���� ���� ����� ����� ������ ����� �� ��������� ��� ��������� ��� �������� ������ ����� �� ���&���&(� ��� ����� ����� ����� ��&��� ���� ��� ����������� ����� �� ���&��� ���� ���&������ ���� ������� ������ ��+�����

0 ����� � ��� �����

0"' ����� � ��� ���� �

��� ��������� ��� ������ ���� ��������� ���� �5���&��� �� ������M E�������% '� �,��% ���% ��� ��� ���&���� ������ � !�< �� �����&$$ ��� ��� ������ ������=���&1��� ���������% A����% �2�� ������� �������%�������� ������ �� ����� �����% � ��� ��������� ����� ����������% ��� ������� �� �������% ��� ��&����� ��� ����� ���� 2����% (D� ��� ��� ���� ��������� =��� ��������������% 1�������� ":#!% ���

� ������ ��� 1������ �8������% �������� D����������% �������� ���� ���% �������� ����+������ ������ ��� � ������ ��� ����� �������� ����2���% 5N�� � ������� ����� ��� ��� ���� �� ������������ ������� ��� ��� ��� ������ =���������K�����% =���

0"0 )��������� �� � ������������� (*�����

����� # ����� � ��������� �� ��� ������ ������ �� ������ ����� ����� ��������� �� ���� �����O �������� �� #!! � "! � $ �� ���- ����� ����� ��� ������� �� ������������ ������������ �1��� ������ �������� � ����&�������� �������� �< � ���- �������� �� �������� 1���� ����� ��� ���� �� ��� ��� ������� ����� �� �� ������ ������� ����� ��� �������������� 8A ���� �������� �������� �� ��� ��� ��������� ������ ��� ����� ��� �� � ���� ��� ������ �� �������� �� �� ������ �������� �� ���� ���������� �������� ���������� ��� �������� ��� ������� ��� �� ��� ����� ��&��� ��� ��� ���������� ������� ���� ��� ��� �����& ����� ����� ������ �������� 7��� ��������% ������ �������� ���� �� ��� ���&������ ������ ��� �����&���� ��������� ������ � ! �� ����% "! �� ����% #$ ������ ��� ������� ������ ���� ��� ����� ����� ��� � ����� � 1����� 2(�&4!!! �+��� ���� ����&��������������� ������ �1����� 1�������% 2�����%('� ���� �������� ������� ���� ������% ��� ����+�&������ #! �� ����� ��� ����� �� ��� ������ ��� ��&������ � �������� ��� ��������� ���� ��������� ���

#?< N� 7�� �� ��� ������������ <!!!% � � #?#:#?3

����� '" �2���� 1����&���� �� ��� ������ �������� � ����� ����� ��������� �6����� �+���������� ������� ����������� ��� ������

�# ->�� ��� �������� ���� ��� � ��0��� �� ��� �������� ������ �����-% � 1�� ��� ����� ��� �������� ����� ���� ��� ����� �� ��� ��� ��������� ��� ���&���% ��� �-�� ���� ��� ����� ����� ����� ����% ������� �� ���� #� ��� ����� ������� ��� ����&����������������% ���� ������ �������� �# � # ��� �� ������%������ ���% ��� ������ ��,��� ��@�����% ��� ��� ����������� �< � < ��� ������� �� ���� ���������� ���&����� �8���� ��������% D�- >� �% 7��� ��� ����������� ������� ��� ���������� ������� ���� ��� �-���� �� ��� ��� ��������� ��� ��������� ������ ��� ��������� ��� ������ ���� ��� 1�� �����

0"1 ������������� (*��*&( ��� ��� �&

� �������� 2=P ,�������� ���&��� ���� ������������������ (��% ��� N���% =�� ��� ���� �� ��� �+���&������ � ���� ������ �� ��� ��� �� ����� ��&��������� ���������� �� ��� ��� ������� ��� ��� ��� �������� �������� �� ��� ��������� �� ��� ���������������� ����� �������� �������� ������ �� ��� ���� ���&����� �������� ��� ��������� �� ��� ������� ��� ���&����� ��� ��� ������ �� ��� ��������� ������ � ����&��� ����� ��� ����% ���� ��� ������ ������� ��� ������ �� ��� ������� � ����� D&���� �# �� D'����� �� ���� ���� ���������� ���������

� ������� �� ��� ��� ����� �� ��� ��� ��������� �� �������� ����� ��� �� ����� �� ���� <� �� ��� ��� ��&���% ������� �� ������ ��+���� ��������� #�!/ 1��&������ ��� ":#!� ��� ��@���� ���� ��� ������ �� ��&���� # ���� � ������ ����� � #!/ ���� ��� ����������> "�!� �� ������ < ��� ���� �� ��� �������% ��� �!�"/ �������� ����+��� �������� ��> #!� ��� ���� �������� " �� ��� �������� �� ��� ��� �+��������� ������ ������� � ����������� � ������� ������� �:B -A�

������ ������� < ��� " �� ����+������� #! ��� �� ������� ���� ������ ����������� �� !�! ��0�2� '������� ������� ����� ��� ����� ���� ������ ���.#< �� .# ��� ����������� ��������� ��� ������� ����%�������� ��� �� ������ ���� ��� ��� ���� � ������&���� �� ���������� �������� �!�"/ 5>4D>� ���� ��� ���&������ ����� ������� ������� #�� '���� ���� ��������% �H <�! -A ��������� ��� ������� �� ������ <% ��� ������������ �� ������ " ��� ��@����� �� :$ -A �� ����������� ���� �� ��� �������� ������ ��,��� �>D�0><D0(�D>�#O4?O !� ��� ���� ��� �5<� ������ ���� ����������� ����� �� ��� ����� ������ ������ ������� "��� 4 ����� ��� �� ���������0��������� �����

��� ��������� ������ ��� ���������� ����+�������<:" �� ��� ��� ������ �<!!�=� ������� ����� �� ������� ���������� ��� ��� ������� �� ��� �������� ������� ���� � ��� ���� �� <!!:<!!! ���� ��� ����������� � <!! �� ��@����� ���� ���� �������� ���� �������K=� ��� �������� �� ��� ��������

1 $�� � ��� ����������

� ���� ����� �� �������� ��������� ���&���&(��������� �� ��� �������� ��� ���������� �� � ��� ������������ ��� ��� ����� ������� �� � ��� � �� ��&���% �������� ��� ���� ���% ����� �������% ��� �����+��������� ���������� � ���� ��� )���* �����% �������������� ��� ����� ���� ����� ����� ������ �� ������������ ����� ������� ��,���� ������� �� ���������� �� ���&�� ��-���� ������ �����% ���� ���������� �� �� ����-���� ���� � ���� � ���� ������� ��� �� ������� ����������� �� � ��� �� ��������� ����� ���������� �������� ����� �� ������� ��-���� ���������� �� ������� ���� ��,��� ����� ������� ����� �� � ���� ����� �� ������� �� ����� ���� ���� �,���� �� �������� �� � ���& �� ��������� 9"4;� ������ ����� �������� �� ��� ���&������ ���� 9" ; �� ���� ���� ������ � ��� �� �����&�����

�� �+����� ��� �������� �� �� ��������� ��� ���&������0��� ������ ���% ��� ������ ��� ��� ������� ������� ����� �� �� ���&��� ���� ��������� ���� �� QJR���������� �� ��� ������� ���� �������� �������% ��� ��������� �������� ������ ��� ��� �� � ���� ��� �� !�< �20���� ����� ��� ��������� ��� ������ �� � ��� ����� ������ �� ���� ��� �� ���� ������0��� ������ 9<?%"$;�� (����� �� ���� � ���������� �� !� ��0�2 ������� �� ��� ���� �������� � ��������� �� ��� ���� �� #�B:"�! -A ��� ��� �� ������ < �� ��� ��������� �������� ������� ��������� ��������� ��� ����� �� � .< -A���� ��� ������� ������ ��� ������ ��� ��� ��� �������� <:" ��� 7������ ����� ������ ��� � ������ ��,���%��� ��������� ��� ���� ��� ��% ����� ������� �������&

������������ <!!!% � % #?#:#?3 (���� ����� �������� ������� ������ �� ���&(� #?"

����� 0" � ������� ������������ �� ��� ����� �� ������������ �� � ��������� ���&���&(��

�� ���� �������� 7��� ������ ��� ��� ����� �� ������������ �� ������ 4% ��� ���� ����� � �������� ������ �� ������� ��-���� �� ,������ ����� "��7��� ��� ������ �� ������ ��� ��� ���� ���� !�< ���%��� ��������� ���� ����� ��� ����� ���� �����&� ��� (������ �������� �� ������ ��� ������ �� ���� ����� ��� �� ���������% �� ���� ������ ��� �������������� (� ������������ � !�< ��� ������ ��� ������� ������ � ������ �� �������� ������ ��� ��� ���&�� ��� (� ������������ 8���� � !�< ��� ������ ��� ���&���% � ��� �� ��������� ���� � ���������� �� ���" � ���� � ������� ������� ��������� �� ��� ������ �����&���� �� ���� ���� S /�

��� ����� �� ������ ������ ��,��� ��� ���� �+������ ������� ����� �� �������� ��� ���� ����� � ������ �� ��&�����% �� ����� �� ���� 4� ����� ������ ��������� ���� ��������� ��,��� �� ������ ��� ��� �����% ����� �� ����+����� �� �������� ����� (� ������������ � ����&���� ������ ��� ��� ����� ��� (� ����������� ��� � &������ ����� � ������ ��,��� ���� ��� �� !�< �20���� ������������� =��� ���������� ����� �����&����� ������&

���% ������ ����������� �� ��� ������� ����� �� ����&� �� �� ����� ��� ����������� ���� ��D�� ��� �� ����&���� ��� ��������� ������ ���������� ��� ���������� ����� ��� �D� ��� ��� �+������ �� ��� ����&� ����� ������� ����� � ������ ������� ����&���� �� ������ �> ��������� ��> 4�!:#!�% ��� ��� ������� � ���� ���&����� �� ���&���� ���� �� � �� �����&����� ��������

��� �������� �� ��� ��������� ���&���&(� �������������� �� � ������ ��+��� ��������� !�! ��0�2 �� ��� ������ ����� �� ��� �������� ��� ���� ���&�� �� ���-� < ��� " �� ��� �������� ������ �� ������� ���� $� ��� ������ ������� ���� ��������� ������������ ��� ����� ����� ������� ������ �������������� �� � ���������� �������� ���� ��� �����&������ �� �� ������% ��� ��������� ���&��� �������������� ������ ������ ������� ���� ���� ������&����� ��� ������ ����� �����&����� ���������� E��������� ��� ��������� ������ ���� ��� ��- �����������% ������ ��� ��� ����� ������ �� � ������������� ������� ���� �������� D� ��� ������ �����% ���

#?4 N� 7�� �� ��� ������������ <!!!% � � #?#:#?3

����� 1" ����� �� ������ ��� �� ���&(� ������������ 1������� ��� ���� ����� �� ������ �� �!� ��0�2� �� ������� ��� �� !�< �20��� ���� ������� ��� ���������� ��� ������ �� ������� ���O ��� !�< ���M �E� !� ���M �=� #�!����

������ �� ��� ������ ��� �� ���������� �� �� ����� ��4 � ������� �� ��� ��������� ������% �� ����� �� ���� <���� �� ���� ����� ��� ��� ������� � �- ���� �� ������������ ������ ���� ������ ��� ��� �������� ����� ������ �� ��� ���� �� !�# �� #! ���� ��� ��� �� ����&��� ����� ��� ���� �� ������� ��� �������� ��� �������� ������ ������� ��� ������� ��������� �� ����� ������� ����� ����� ���� ���� �������� �� � �������� �� ��� 1� �������� ��� ������� ��� ����������������

�������� ��� ��������� �������� � ������ ���� ��� �&��� ������ �� ���� ���� =���&���&(� � ������ ���������� ��������� 9"3;% ���������� ����� ����������������� � ����� ��� ���� �� ������ ������ ���� �� ��������� �� ��� �� ������ ��� ��������� ,�����������% ��� ���� �������� ������� ���� �� ����� ������������ �� ��� ���� ����� ��� � ����&���� ���&���� ���� �,���� ���� ��� ��������� ��� ������ � ����� �������� ������� ������ �� ��� ���� ���� =��&��,������% ��� ����� �� ��� ��������� ��� ���������

������������ <!!!% � % #?#:#?3 (���� ����� �������� ������� ������ �� ���&(� #?

����� 2" ������������ �� ����� ����� ���&���&(� �� ������ �� � � ��� �������� ��� �? ���$�B� ��� ������ �� ��� 3�<� ��+��� ��������� !�! ��0�2 �� ��� ������% � ������ �� !�! �20��� ���� !� ���������� ��� !�< �20��� ������ ��,��� ����������

����� 3" ����� �� ������ ��,��� �� ���&(� ������������ 1������� ��� ���� ����� �� ������ �� �!� ��0�2� �� ������� ��� �� !�! �20��� ���� !� ��� ������� ��� ������ ��,��� ���������� ��� ���� ��� �� ������ ��,���O ��� #� �20���M �E� #�! �20���M �=� !� �20���M �'� !�< �20����

����� ��� �������� �� ��� ����� ��� ��������������� �� ������� ��� ������ ��� ��������� ,�������7� ���� ������ �,���� � ��� ���� ����������������� �6��������% 5�����% 5>� ���� � ���-&����������� ����� ���� ���� ����� ������&���� ����������������� �� ������� ��� ������ ��� ������� ������������ ������ ���� ����� ������ � �������� ����������� =������ ����� �� ��� ������ ����� ���� ��������� ������ ������ ����� ��- ���� ����������� ��� ��� ���������� ������ �������� �� ��� �� ������ �� �������� �� ��������� �� ������ <% ��� ����� ������ ���&��- �� ��� ����� ����� ��� ��� ����� � �������� ������ � 1�� ��� ����� ���� ��� ����� �� ��� ���&���� 7� �� ������� �� �� ��� ����� �� ��� �������������� �� ��� ��������� �������� ��� �� �+���������������� �������� �� ������� ����&����� ��������

=������ ���� =���&���&(� �� ��� ����� ���������9"3;% ��������� ���&��� �� ��� ��� ����� ���� ���% ��� �� � ��������� ���� ���� ��������������� ������ ������% ��� �� ��� ����&����������������� �� ���� ������ ���� �� 9"B;� ��� ���������� ��� ����� ����������� ��� ����� ����� �� � ���&���% � ���% ����� ��������� ��������� ���&���&(������� ���� �� ����&���� ��������% �� ������ ��&����� ��� �� ��@����� ������� �� � ���� �� ��������&���% ������� �� ������ ���� �� ���&���&(��

3 )��� ����� ����4�

��� �� ���������� ���� ��� ���� ������ ������ ������������ ��� ������ ���������� ��� )�������*���� �� ������ �� ��� ������� ��� ������� �����&��� ������� ��������� �� ������ �������� ���

������ ������� � �������� ���� ����� ��� �����&���� �� � ������% ���� ����� ����� ����� ���������������� ��� ��� �� ������� �������� ���������� ��������� ��� ������ ���������� � ������% ��� � ���%��� �����&��&��� ������ �� ���&���&(�� �������� ���������� ��� ��������� ,������ ����� ����� ����� ���&���� ��� ����� �� � ���� ���� �� ���������% ��� ��������� ������ ���������� � ������ ��% ��� ������ ������ ������ �� ���� ����� ���&(� ���������

�� ���� ��� ���� �� ����� ��� ������ � !�� ���!��������� �� �� "���� #� ������ "� �������� $%�������� &�$������% �������� '(� �� )���!�� ����"���������� &�$������% *)��&+� ��� �� ��������� ,!!��� �!���������� ��� ��-���������� '������ .�/� �����������! �����%� )��& � �������� $% �������� 0������� ����1���� !�� �� .�/� ���������� �! �����%� ����� ����������12345165'&, 784�

6������ (�� < % #???

2 $�����

9#; ���������% '�% �������% ��% C�����% 2�% R�����% 2�% (��&������% 1�% �����% '�% 2���� 3��� #??B% 64% <"!":<"#!�

9<; 7����% 2� =�% N�� ���% �� =�% C���������% 5�% C�����&���% N�% �����% 6� ��% 6�����% N� (�% 2���� 3��� #??B% 64% #3<: #3$�

9"; >���% N� N�% 7����% 7� K�% ������������ #??B% 9%<4"<:<4"?�

94; D��-% K�% ����% ��% >�����% '� N�% 2���%� #??B% �8%#4<?:#4"4�

9 ; Q�% 5� Q�% 2��% J� >�% >��������% �� ��% (�����% '�% =���%=� N�% �����% 6� '�% 2���� 3��� #??B% 64% " ":" $�

9$; =����% 5�% >�����% '� N�% 2���� 3��� #??3% 59% "3":"3B�

#?$ N� 7�� �� ��� ������������ <!!!% � � #?#:#?3

����� 5" 1������� ��� ���� ����� ����� � ��� �������� ��� �E� ���&��� �� ��� ���-� # ��� " �� ���� �D��� ��������� �� �� ���� �

93; =����% N�% 7����% 2� =�% ������% 1�% >�����% K�% N�� ���%�� =�% 6�����% N� (�% C�-�% 2� N�% 7������% 1�% 2���� ���1���� #??B% �:6% #!#:#!$�

9B; A����������% N� 5�% 1����% >�% ����% >� =�% 2���� 3���#??3% 59% 4<<!:4<< �

9?; N�� ���% �� =�% =�� �����% =� ��% '���% N� ��% 6�����%N� (�% 2���� 3��� #??B% 64% "43$:"4B!�

9#!; �����% N� =�% N�� ���% �� =�% '����% 2� (�% 6�����% N� (�%2���� 3��� #??B% 64% 4"#:4"3�

9##; 1�����% ��% 7�������% �� N�% ���% >�% �����% �� 1�% C��% 1�%E�����% A�% >����% >� >�% ;)3�<99 3��!������% 1���������% =�% N����� <":<B% #???% ��� ������������

9#<; D��-% K�% (����% (�% ����% ��% >�����% '� N�% ;)3�<993��!������% � 1���� 4"4�

9#"; J���% 2� J�% 2��% =� ��% >��������% �� ��% �����% 6� '�%2���� 3��� #??B% 64% 4?4 :4? !�

9#4; 2�� ��-���% J� A�% =�% �� ��% '���������% '�% 1�����%7� 1�% �����% �� (�% ����� ���% �� 6�% N����% =� ��%C���% E� 2�% 2���� 3��� #??B% 64% 43$#:433!�

9# ; J���% 2� J�% 2��% =� ��% >��������% �� ��% 1���&����% 2�%�����% 6� '�% 2���� 3��� #??B% 64% "<" :"<4#�

9#$; 7��% N�% J���% 2� J�% >����% �� C�% 2��% =� ��% �����������1� #??B% 9% <" $:<"$!�

9#3; >������% (� 2�% C���-�% =�% ������% (�% ����% =�%�� 3��������� 2 #??B% 7 5% 4?: B�

9#B; (����-�% E�% ������% 1�% �� 3��������� 2 #??B% 746%3#:B!�

9#?; 2�����% (� >�% A����������% 6� �� (�% �@����% 8� 6�%A��������% N�% �� 0� /�������� #??B% 88% 4 ":4$!�

9<!; >������% D�% =���% '�% =��-����-% C� ��% (T���% 8� 6�%2���� 3��� #???% 6 % $3B:$B$�

9<#; N�� ���% �� =�% 6�����% N� (�% 2���� 3��� #??$% 57%3<!:3<"�

9<<; >����% �� A�% A������% ��% (���% ��% �������% 7�%2���� 3��� #??$% 57% <!44:<! "�

9<"; (�����% =�% A����% Q�% �������� 2���� 3��� #??B% 85 %B#:B �

9<4; C����% N� 1�% N�� ���% �� =�% (���� ��% 5�% 6�����%N� (�% 2���� 3��� #??B% 64% "<?#:"<?3�

9< ; =����% 5� >�% >�����% '� N�% ������������ #??B% 9%"!4!:"!44�

9<$; 7���-����% (�% =������% C�% �����% (�% 6������% 6�%/���� 2������� �13������ #??3% =4% 3?:B4�

9<3; E�����% 5�% C�������% E�% '������% �� N�% '����@% 5� ��%(���% ��% 2���%� #??B% �8% #44":#443�

9<B; 7��-�% 1� ��% (���% (� '�% E���% (� ��% N������% E� 5�%2���� 3��� #??B% 64% "3$$:"3$?�

9<?; Q��% P�% ����% ��% '�������-��% J� (�% R���-�% 1� (�%(K��% 5� ��% C���% E� 2�% 2���� 3��� #??3% 59%4<$:4"!�

9"!; ������% '�% D�������% �� A�% '���% ��% �� �����% 6�% 2����3��� #??$% 57% #B<<:#B<B�

9"#; ������% '�% �� �����% 6�% 2���� 3��� #??B% 64%"3<#:"3<3�

9"<; ������% '�% K���% �� 1�% (C�����% K�% �� �����% 6�% 2����3��� #??B% 64% "3<B:"3"4�

9""; 6�����% 6� ��% 6�����% N� (�% 2���� 3��� #??3% 59%##34:##3B�

9"4; �����% '� 1� >�% ���� #���� ���� 2���� #?B$% �21��% <3�

9" ; A��������% C�% A�� '�����% 7�% ������% �� 2�% '���� 3��1���� 0� /�������� #??B% �% # �

9"$; �����% '�% 5���% J�% �� �����% 6�% 2���� 3��� #??3% 59%"# ":"#$!�

9"3; J���% 2�% 2��% =� ��% >��������% �� ��% 1���&����% 2�% �����%6� '�% 2���� 3��� #??B% 64% "<" :"<4#�

9"B; Q����% ��% 2��% J�% 7��% N�% (�����% '� 7�% �����% 6� '�%2���� 3��� #???% 6 % #4B :#4?!�

������������ <!!!% � % #?#:#?3 (���� ����� �������� ������� ������ �� ���&(� #?3