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MICROSCOPIA A FLUORESCENZA
Microscopia a fluorescenza
FluorescenzaCapacità di assorbire radiazioni elettromagnetiche di una certa lunghezza d'onda e di emettere una frazione dell’energia assorbita con radiazione elettromagnetiche di una lunghezza d’onda differente e superiore a quella assorbita.
Microscopia a fluorescenza Usa la luce ultravioletta, a una lunghezza d’onda 200-400 nanometri le strutture sono analizzate in base alla fluorescenza che emettono nello spettro visibile.
AUTOFLUORESCENZA Prodotta da sostanze normalmente presenti nel tessuto. Es: citoplasma (debole luce bluastra), i granuli (intensa luce giallognola), e i mitocondri (forte emissione fluorescente). Il nucleo, al contrario, non è autofluorecente. FLUORESCENZA SECONDARIAIndotta da una colorazione con sostanze fluorescenti, dette fluorocromi (fluoresceina o rodamina).
Microscopia a fluorescenza
Studio morfologia nucleare: COLORAZIONE CON HOECHST
Il colorante HOECHST fa parte della famiglia di coloranti che evidenziano il DNA al microscopio a fluorescenza.
Pertanto è utilizzato per visualizzare i nuclei e i mitocondri.
Microscopia a fluorescenza
Studio morfologia nucleare: COLORAZIONE CON ARANCIO DI ACRIDINA
L’arancio di acridina è un colorante fluorescente per gli acidi nucleici. In particolare colora in verde il DNA e in rosso l’ RNA
Immunofluorescenza
UTILIZZO DI ANTICORPI MARCATI CON UNA SOSTANZA FLUORESCENTE
TRATTAMENTO DELLE SEZIONI ISTOLOGICHE CON GLI ANTICORPI MARCATI
OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA
METODO DIRETTOLa sostanza fluorescente è legata direttamente all’anticorpo prodotto
contro l‘antigene cercato.
METODO INDIRETTOAnticorpo primario che riconosce l’antigene cercato.Antcorpo secondario, a cui è legata la sostanza fluorescente, che
riconosce l’anticoro primario
Immunofluorescenza MODELLO DI MEMBRANAA MOSAICO FLUIDO
- ESTRAZIONE proteine di membrana (cellule di topo e cellule di uomo)
- INOCULAZIONE in conigli diversi
- ESTRAZIONE anticorpi (anti-topo e anti-uomo)
- MARCATURA differenziale anticorpi
- FUSIONE CELLULARE (Virus Sendai)
- TRATTAMENTO con i due anticorpi
- OSSERVAZIONE della marcatura al microscopio a fluorescenza
Topo Uomo
FUSIONE
Immunofluorescenza
MICROSCOPIA ELETTRONICA
Microscopia elettronica
Limite di risoluzione molto più grande di quello ottico
Non viene utilizzata la luce per rivelare il preparato, ma un fascio di elettroni accelerato fortemente
Immagini ultrastrutturali del preparato in bianco e nero, e non colorate come nella microscopia ottica
1) MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONEIl preparato è sezionato e sono visualizzate le strutture
interne
2) MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONEIl preparato NON è sezionato e sono visualizzate le
strutture esterne, quindi la struttura tridimensionale del campione
Microscopia elettronica a trasmissione
Microscopio elettronicoa trasmissione
filamento(catodo)
anodo
condensatore
preparatoobiettivo
proiettore
schermofluorescente
Microscopia elettronica
PrelievoLavaggio in tampone fisiologico Taglio in frammenti molto piccoli (1mm diametro)
FissazioneGlutaraldeidelavaggi in tamponeTetrossido di osmio (OsO4)
DisidratazioneEtanolo, simile alla microscopia ottica
InclusioneResine liquide che solidificano a 70°C Piccoli contenitori cilindrici
Microscopia elettronica a trasmissione
SezionamentoUltramicrotomo
- Lama di diamante- Sezioni ultrafini (50-70 nm) - Retini dotati di griglia.
ColorazioneSali di metalli pesanti
- URANIO (acetato di uranile)- Lavaggi in acqua distillata- PIOMBO (citrato di piombo)
Microscopia elettronica a trasmissione
Microfotografia al microscopio elettronico di un linfocita B umano
Microscopia elettronica a trasmissione
Mitocondrio
Mitocondrio Lisosomi
Apparato di Golgi RER
Microscopia elettronica a scansione
Mentre nel MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE, gli elettroni accelerati attraversano la sezione del campione e producono un’immagine fortemente ingrandita su uno schermo fluorescente, col risultato di un’immagine in bianco e nero dell’ultrastuttura interna del campione, nel MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE gli elettroni colpiscono il campione non sezionato, che produce elettroni secondari che vengono raccolti da uno schermo che, integrando gli impulsi provenienti da tutte le direzioni, producono un’immagine in bianco e nero della struttura esterna tridimensionale del campione
Microscopia elettronica a scansioneOsservazione particolareggiata della superficie dei campioni
- Prelievo, lavaggio, fissazione- Essiccamento (essiccatore)- Ricopertura con oro o argento (metallizzatore)
- Il fascio elettronico urta il campione. Produzione di elettroni secondari raccolti da un sensore ed integrati in un monitor a formare l’immagine tridimensionale della struttura esterna
Microscopio elettronico a scansione
Microscopia elettronica a scansione
Microscopia elettronica
Immunolocalizzazione al microscopio elettronico: Tecnica dell’immunogold
• Particelle sferoidali di oro colloidale (5-30 nanometri) coniugate con anticorpi specifici per l’antigene cercato
• Oro è opaco agli elettroni
• Possibilità di doppie localizzazioni
Trasmissione Scansione