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Microscopia de Fluorescencia
Magaly Herrera GarcíaLuis Rolando Boza Peralta
IntroducciónDescubierto en
1908 por Köhler y Siedentopf
Se basa en que una sustancia natural o un colorante aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida
Introducción
Siendo pocas las moléculas
autofluorecentes, su aplicación
mas difundida es para revelar una
fluorescencia agregada como en la detección de antígenos y
anticuerpos
Anticuerpos Anti-ADN nativo por el método de Inmunofluorescencia Indirecta
Principio
El espécimen es iluminado con luz de una determinada longitud de onda que es absorbida por los fluoróforos haciendo que emitan luz de longitud de onda mayores. La luz de iluminación se separa de la fluorescencia mucho más débil emitida a través del uso de un filtro de emisión espectral
Constitución FundamentalFuente Luminosa:
Lámpara de mercurio o halógena
Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultravioleta
Filtros: Retienen la luz ultravioleta dejando pasar solo la visible. Hay diversos tipos de excitación y emisión
Constitución Fundamental Filtro de excitación: ubicado
entre la fuente de luz y el preparado Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.
Filtro de emisión: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico. Corta completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo.
Constitución FundamentalEspejo Dicroico:
Permite la separación de la luz de excitación y la fluorescencia.Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda más corta es reflejada y la longitud de onda más larga lo atraviesa.
Constitución Fundamental
Microscopios de Fluorescencia
Microscopio de Fluorescencia
Invertida AMG EVOS flMicroscopio de
Fluorescencia Nikon TE2000
Aplicaciones:1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por moléculas de la muestra misma.
2. Fluorescencia inducida: Partes específicas de la muestra pueden ser observadas selectivamente, mediante métodos de tinción.
3. Sobre objetos bastante más pequeños Que la limitación del poder de resolución,siempre que su emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molécula de DNA, un virus.
Técnicas de Tinción Fluorescente
1. DAPI: tiñe el DNA de color azul brillante. Permite enumerar microorganismos.
2. Tinción de Viabilidad: permite discriminar entre células vivas y muertas
3. Green Fluorescent Protein: Detección y rastreo de organismos introducidos en ambientes naturales.
Fluorescencia MúltipleEs posible combinar, sobre una misma muestra, dos o más colorantes siempre que emitan en diferente longitud de onda y nuestro sistema sea capaz de excitar a todos a la vez y discriminar los fotones emitidos por ellos.
Diferencias entre Microscopia Ultravioleta y Fluorescencia
Ultravioleta Fluorescencia
Utiliza una longitud de onda de 200 nm por lo tanto alcanza una resolución de 100nm.
No se puede observar directamente con un ocular porque la luz UV daña la retina.
Depende de la absorción de luz de las moléculas.
La lente que usualmente es de vidrio es sustituida por cuarzo y la iluminación es por lámparas de mercurio.
Usa filtros para detectar diversas absorciones de luz y la observación es directa por poseer otro filtro que retira la luz UV.
FOTOGRAFÍAS MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Título: Ya es primavera en el cerebeloAutor: Nagore PuenteDepartamento: NeurocienciasTécnica: Microscopía confocal
Cerebelo de un ratón transgénico fluorescente (en verde) junto a la localización de un receptor metabotrópico (en rojo)
Título: La noche estrelladaAutor: Mª Rocío Fernández SuárezDepartamento: Biología Celular e HistologíaTécnica: Microscopía de fluorescencia
En la imagen se muestran folículos pilosos de ratón recién nacido.
En medio de un universo de células cuyos núcleos vemos en azul,
por el marcaje con DAPI, encontramos unos puntos de color que
se corresponden al marcaje con nestina, proteína típica de las
células nerviosas y que es actualmente empleada como marcador
de células madre
Vástago de Alfalfa
Vegetal perenne profundamente arraigado en la región mediterránea cerca de Irán, crece también en América del Norte y Asia Occidental
Cultivo de células de riñón
de un mono verde africano
Se marco con anticuerpos primarios de ratón y anticuerpos secundarios conjugados con rodamina Red-X
Células de riñón de un mono
verde africano transformadas
con el virus Simian 40
Cultivo adherente de COS-7 de fibroblastos que fue marcado con Oregon Green 488 conjugado con aglutinina de soya
Tejido pulmonar humano.
Se marcó con aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugado con Texas Red-X. WGA, que se une selectivamente a N-acetilglucosamina y N-acetilneuramínico residuos (ácido siálico)
Tejido de un riñón de ratón.
La muestra fue marcada triplemente antes de tomar la imagen con Alexa Fluor 568 conjugada con faloidina y Alexa Fluor 488 conjugada con aglutinina de germen de trigo.
Tejido de lengua de oveja.
La muestra fue marcada con Alexa Fluor 350 conjugado con faloidina, Oregon Green 488 conjugado con aglutinina de germen de trigo. Los nucleos celulares se tiñeron con Steve Orange
Algodón.
Sección trasversal de algodón manchado con Rodamina B.
Células de Mamífero.
Fluorescencia de células de mamífero doblemente marcadas. El ADN en el núcleo de la célula es mostrado en azul. Las estructuras citoplasmicas (Micro filamentos) están mostrados en verde
Células endoteliales.
Triple tinción de fluorescencia de células endoteliales de una arteria de pulmón.
Cromosomas y núcleos.
Fluorescencia de tres niveles de células humanas. El ADN en la segunda interface del núcleo celular y los cromosomas de una tercera célula son mostrados en azul. Secuencias especificas del ADN fueron marcadas en verde y rojo
Cromosomas.
Tinción de doble fluorescencia de cromosomas.
Triple tinción de células humanas
Fluorescencia de triple tinción de células humanas. Los micro filamentos son mostrados en rojo , componentes del núcleo celular son mostrados en azul y verde.
Células epiteliales
Tinción de Inmunofluorescencia de una célula epitelial (Hep-2) Mitocondria.
Bibliografía MicroscopyU: The source for microscopy education
http://www.microscopyu.com/galleries/fluorescence/index.html http://www.microscopyu.com/galleries/confocal/index.html
Nobelprize.org: The Flourescence Microscope Photo Gallery http://www.nobelprize.org/educational/physics/microscopes/fluorescence/gallery/index.html
Microscopio de Fluorescencia http://morfoudec.blogspot.mx/2008/07/microscopa-de-fluorescencia.html
Wikipedia: The Free Encyclopedia - Fluorescence Microscope Article http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_microscope