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MIDI SHERLOCK® MICROBIAL
IDENTIFICATION SYSTEM
MARIA C. VELÁZQUEZ RIVAS
INEZA M. RODRÍGUEZ DÍAZ
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MIDI SHERLOCK® MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM
Myron Sasser, Ph.D.
• Fundador de MIDI inc.
• Desarrollador del MIDI SHERLOCK® MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM
• Director de R&D
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TEMAS• Identificación microbial por ácidos grasos
• FAMEs ¿qué son?
• Técnicas principales para identificación bacteriana
• Análisis por FAMEs
• Ventajas del MIDI SHERLOCK
• Banco de datos de FAMEs
• Banco de datos: especies importantes
• Metodología
• Interpretación de resultados
• Resumen
• Nuevos Productos
• Referencias
• Sección de preguntas
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OBJETIVOS
1. Explicar como funciona la identificación de microorganismos utilizando análisis de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs)
2. Describir como funciona el sistema de identificación microbial MIDI SHERLOCK®
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IDENTIFICACIÓN MICROBIAL POR ÁCIDOS GRASOS
La composición de ácidos grasos microbiales• Son únicos por especie y sumamente
conservados por nicho ecológico.
• Conservados genéticamente entre cepas.
• Mutaciones afectan ADN, no los ácidos grasos de la membrana.
• Intercambio de plásmidos entre bacterias no afecta el perfil de ácidos grasos.
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FAMEs ¿QUÉ SON?FAMEs
• Fatty Acid Methyl Esters – ésteres metílicos de ácidos grasos
Ácidos Grasos FAMEs
Transesterificación de grasas con
metanol
Se forma un producto volátil (FAMEs) más adecuado para cromatografía de gas.
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TÉCNICAS PRINCIPALES PARA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
• Pruebas Bioquímicas• Requiere conocimiento y pruebas dirigidas.• Conocimiento y uso adecuado de materiales.
• Secuenciación de ADN• Requiere ciertas destrezas o conocimientos.• Base de datos no incluye cepas variantes.
• Perfiles de ácidos grasos (FAMEs)• Sencillez• No requiere pre-pruebas.• Preparación simple estándar.
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ANÁLISIS POR FAMEsMIDI SHERLOCK® MICROBIAL IDENTIFICATION SYSTEM:
• Identificación de microorganismos por la composición de ácidos grasos en la membrana
• Identificación por cromatografía de gas (CG) Agilent® Gas Chromatograph Software
• Posee un estándar de calibración:
• Mezcla de calibración: ácidos grasos saturados de cadena lineal (9-20 C) y cinco hidroxiácidos.
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ANÁLISIS POR FAMEs• No es necesario hacer tinción gram
Identificación bacterias gram +/-
• Gram (+) predominan ácidos grasos ramificados• Gram (-) predominan ácidos grasos en cadenas sencillas
• Lipopolizacáridos(LPS) promueven ácidos grasos hidroxilados
Gram (+) Gram (-)
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VENTAJAS DEL MIDI SHERLOCK• Identificaciones precisas, más de 2,000 especies.
• Amplias bibliotecas microbianas y ambientales.
• Capacidad de realizar "tracking” por cepa presuntiva (para encontrar la fuente de un contaminante).
• Alto rendimiento
• 200 muestras por día• Corto tiempo
• Bajo costo por muestra: $3 por muestra
• Todos los organismos son analizados utilizando el mismo procedimiento, sin necesidad de tinción Gram o pruebas bioquímicas.
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BANCO DE DATOS DE FAMEs
MIDI SHERLOCK LIBRARIES
• Catálogos de perfiles microbianos
• 1500 especies bacterianas• 200 especies de levadura
• Cepas obtenidas de diferentes fuentes y nichos ecológicos.
• Colaboración con una red de investigadores• Adición de organismos/cepas
nuevas
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Las entradas más grandes le pertenecen al género de Bacillus.
• 42 especies catalogadas
• Aceptado como un método oficial para la confirmación de B. anthracis
BANCO DE DATOS: ESPECIES IMPORTANTES
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METODOLOGÍA
• Se crecen bacterias en agar• Se selecciona colonias purasInoculación• Extracción de células a partir de medios de
cultivoRecolección• Lisis de las células para liberar los ácidos grasos
de los lípidos celulares • (Bacterias Mueren)
Saponificación
•Formación de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs)Metilación•Transferencia de FAMEs de la fase acuosa a la fase orgánicaExtracción• Lavado acuoso de la extracción orgánica antes del análisis cromatográficoLavado Base
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METODOLOGÍA
Cultivo
Saponificación y metilación
Extracción Análisis por CG y comparación de
resultados con bancos de datos de perfiles
microbianos
Reporte de identificación
bacteriana por índice de
similaridad
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LECTURA DE RESULTADOS: EJEMPLO
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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Índice de similaridad
- Valor numérico que expresa cuan cerca está la composición de FAMEs de un desconocido con la media de la composición de cepas dentro del banco de datos.
- No es un por ciento, es una expresión de la distancia relativa de la muestra desconocida a partir de la media poblacional.
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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
• 1.00 identificación perfecta
• 1.00-0.500 comparación buena
• 0.500-0.300 puede ser una cepa atípica
• 0.300 o menor, no es de la especie
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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
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NUEVOS PRODUCTOS
MIDI Sherlock Instant FAMETM
• Muestras de aerobios ambientales y levaduras
MIDI Sherlock Instant AnaerobeTM
• Muestras de anaerobios clínicos
MIDI Sherlock Q-FAMETM
• Muestras de aerobios clínicos
MIDI Sherlock DNA Software• Analiza muestras de secuencias de ADN de especies de bacterias, hongos y
levadura.
Todos tardan entre 15-25 minutos para la identificación de cultivo puro
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RESUMEN
• El MIDI SHERLOCK identifica microbios a base de su composición de ácidos grasos.
• Utiliza una base de datos sumamente amplia de FAMEs, incluyendo para muestras ambientales y diferentes nichos ecológicos.
• Es un sistema automatizado, fácil de utilizar, y de bajo costo por muestra.
• Se ha utilizado en diferentes áreas de investigación por los últimos 20 años ya que provee resultados constantes y precisos, en un tiempo razonable.
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REFERENCIAS1. MIDI Recuperado de http://www.midi-inc.com/
2. Products: Sherlock® Microbial ID System (MIS) Recuperado de http://www.midi-inc.com/pages/microbial_id.html
3. Kunitsky, C., Osterhout, G. and Sasser, M. Identification of microorganisms using fatty acid methyl ester (FAME) analysis and the MIDI Sherlock® Microbial Identification system Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Recuperado de https://store.pda.org/TableOfContents/ERMM_V3_Ch01.pdf
4. Sherlock® Microbial Identification system Automated Microbiology solutions. Recuperado de http://www.learneasy.ch/MIDI-GC-Full-Brochure.pdf
5. Sasser, M. (2001) Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical Note #101Recuperado de http://www.microbialid.com/PDF/TechNote_101.pdf
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¿PREGUNTAS?