Gema Malet

Migrating Flocks of Cancer Cells

IFOM, Milan

Regeneración Tisular

La Migración Celular es un ProcesoClave en Biología

Invasión Tumoral

Desarrollo Embrionario

Inmunovigilancia

Migración Celular

Mecanismos de Migración Celular

Molecular Cell Biology, WH Freeman 2008

Translocation

1

Retracción del polo posterior4

Adhesión antigua

Translocación Movimiento del CuerpoCelular

3

Adhesión2

ExtensiónLamellipodium

Nueva Adhesion

Direccion del Movimiento

Focal

Adhesión

Del Movimiento Aleatorio a la Migración Celular Dirigida: Quimiotaxis

GradientesExtracelulares(Interacciones

Ligando-Receptor )

SeñalesBioquímicas

ProcesosBiofísicos

(y ComportamientosCelulares)

Trayectoria 1

Trayetoria 2θ

Des

plaz

amie

nto

Trayectoria 1

Trayectoria 2

θ

La Unión de Quimioquinas a sus Receptoresactiva la Migración Dirigida

QUIMIOTAXIS(Migración Celular Dirigida)

VELOCIDADMIGRATORIA

p38 ERK1/2 Rho

CCR7 Receptor

Quimioquinas

G13β

Giϒ

CCL19CCL21

Rutas Quimiotácticas

Zlotnik et at Nature Rev Immun 2011

Las células Tumorales Encuentran Microambientesde Diversa Composición al Diseminarse

matrigel Colagen Tipo IPoincloux R, Lizárraga F, Chavrier P.J Cell Sci. 2009 Sep 1;122(Pt 17):3015-24.

Las Células Tumorales se Diseminan Adoptando Múltiples Modos de Migración Celular

Filas de celulasMesenquimales

MonocapasCoordinadas

Grupos/CohortesAmoeboide

Yilmaz et al. Trends in Moleular Medicine 2007

Inva

sión

Ind

ivid

ual

Migración C

elularC

olectiva

Alexander S. et al. Histochem Cell Biol. 2008

Visualización de tejidosvivos a escala microscópica:

microscopía intravital

Células de fibrosarcoma de ratón en una cámara dorsal cutánea

Visualización Dinámica del Crecimiento y la Invasión Tumoral: Migración Celular Colectiva

Dia 1 Dia 3 Dia 7 Dia 9

Agregados de Células Tumorales tienen mayor Potencial Metastático que Células Solitarias

Tumor Primario

Metástasis

Célula tumoral expresando Plakoglobulin

Cluster

Célula solitaria

Cuales son las VentajasMigratorias de Moverse en Grupo ?

Microcámaras de Quimiotaxis

Células Leucémicas de BCLL Migran Quimiotacticamentecomo Células Individuales y como Agregados

CCL19

0 ng/ml

0 ng/ml

100 ng/ml

CCL19 Gradiente

Cámara 1 Cámara 2

JVM3 Células

1 m

m

CCL19

1 m

m

Malet-Engra et al. Curr Biol (2015)

Los Agregados de Células tienen unaMayor Sensibilidad Quimiotáctica

CCL19

FMI

0 ng/ml

25 ng/mlyFMI

distancia acumuladaFMI-Y=

yFMI

FMI (Forward Migration Index)Indice Quimiotáctico

Punto Final (x,y)

Punto Inicial (0,0)

Trayectoriacelular/distanciaacumulada

FM

I-Y

Los Clusters Resisten la Quimiorepulsión inducida en Células Individuales en Gradientes de Alta Pendiente

de CCL19

CCL19

0 ng/ml

500 ng/ml

***

(+/+) (-/-) 25 100 500

x axis (µm)

Clusters

Células

Individuales

FM

I-Y

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

n.s. ******n.s.

CCL19 concentración (ng/ml)

Y a

xis

(µ

m)

0-

10

00

+ 1

00

00

-1

00

0+

10

00

0- 1000 + 10000- 1000 + 1000 0- 1000 + 10000- 1000 + 1000 0- 1000 + 1000

Los Clusters Muestran Sensibilidad Quimiotáctica hacia un Espectro mas amplio de Gradientes que las Células solas

(+/+) (-/-) 25 100 500

ContraCCL19

HaciaCCL19

Quimiorepulsion: Alejarse de la Quimioquina

Gradiente de Quimioquina

Quimiotaxis

Quimiorepulsión

The same chemokine binding the same receptor can elicit attraction or repulsion depending on the chemokine concentration

Actin Polimerization

Actin Polimerization

Ca++

Ca++

AMPc

AMPc

Cdc42/PKCζ

Cdc42/PKCζ

RhoA/ROCK

RhoA/ROCK

Akt

Akt

Poznansky MC, et al. Active movement of T cells away from a chemokine. Nat Med. 2000

Otros Parámetros de Migración de Células Individuales y Clusters

Clusters Células individuales

Velocidad (µm/m

in)

0

2

4

6

8

10

Direcc

iona

lidad

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1n.s.* **n.s. *

n.s.n.s.*n.s. *

CCL19 concentración (ng/ml)

(+/+) (-/-) 25 100 500

distancia euclidiana

distancia acumuladaDireccionalidad =

DistanciaEuclidiana/distanciaacumulada

Punto Inicial (0,0)

Punto Final (x,y)

La Quimiotaxis Colectiva es un fenómeno extendido a otros tipos de linfocitos B y T

CCL19

Células BCLL Primarias

Células derivadas del Linfoma del Manto

Granta

CCL19

Células T Jurkat

CXCL12

Quimiotaxis Colectiva de Células de Carcinoma EpitelialA431 hacia EGF (factor de crecimiento epidérmico)

EGF

0 ng/ml

10 ng/ml

Ensayo deQuimiotaxis

IbidiAusencia de Gradiente

+EGF

uniforme

CelulasSolas

FMI

Clusters

*

La Migracion Colectiva Ocurre Frecuentementeen Condiciones de Confinamiento en Canales y

Espacios Intersticiales

Invasión de células de melanoma B16F10 a lo largo de la interfase de tejidos epiteliales. Weigelin et al. IntraVital 2012

Dimensiones del Canal: 1mm largo, 20 µm alto, 50 µm ancho

Las Células BCLL Migran hacia CCL19 de forma Individual y Colectiva a través de Microcanales en

Condiciones de Confinamiento

CCL19 (0-100) ng/ml

FM

IVelocidad

CélulasAisladas

Clusters

Direcc

iona

lidad

(µm

/min

)

Qingsen Li & Marco Foiani

No CCL19

Porqué una mayor sensibilidad quimiotáctica de los Clusters?

Como los Clusters resisten la quimiorepulsión?

Solo las Células en la Periferia se PolarizanMayor Actividad Protrusiva en el Frente del Cluster

Rim

Front

Rim

Back

Core

CCR7-GFP

Borde

Frotal

Borde

Posterior

Centro

***

0

10

20

30

40

50

Pro

tru

sio

nlo

ngi

tud

(µ

m)

Frontal Posterior

0

200

400

600

800

1000

Pro

tru

sio

n

pe

rsis

ten

cia

(se

c) **

CCL19 g

radient

e

Frontal Posterior

-0.5

0.0

0.5

1.00/25 ng/ml

-0.5

0.0

0.5

FM

I

1.00/100 ng/ml

-0.5

0.0

0.5

0/500 ng/ml1.0

1500-

2500

500-

1500

2500-

3500

3500-

4500

Area Cluster (µm2)

La Quimiotaxis del Cluster depende de su Tamaño

CCL19

Gra

dient

eC

CL19 g

radie

nte

Time (min)

B

285252235231211350 5 23 30

4

42

1

6

4

4

2

7

46

7

116

17 2017

3

20

20

20

Tamano Crítico para activar Quimiotaxis : ~20 celulas

Un Modelo Físico basado en las Fuerzas de Tracción del Cluster indica que su organización resulta en una

Reducción de Ruido

Los Clusters son considerados como objetos planos circulares 2D, donde lascélulas periféricas dominan la respuesta a la quimioquina (de acuerdo con elanálisis microscópico morfológico de protrusiones los clusters que migran).

Supuestos

Migración

CCL19Gradiente

JVM3 células– GFP-actina

Fuerzas Protrusivas

Nir S. Gov - Rehovot –Israel Weizmann Institute of Science

Consideramos clusters bidimiensionales, donde solo lascelulas del exterior o periferia del estan expuestas a la quimioquina.

La señal inducida por la quimioquina se consideraproporcional a su concentración y es controladapor la internalización del receptor

La respuesta celular se asume que es la señalintegrada a lo largo de la membrana plasmáticaexpuesta y convertida en una fuerza protrusivaque actua en la dirección normal a la membrana.

Supuestos C0

Cm

Gra

die

nte

de Q

uim

ioqu

ina

Nir S. Gov - Rehovot –Israel Weizmann Institute of Science

L

θ

FMI Aumenta con el Tamaño del Cluster

Fy ~ R2 R = radio del cluster

Sumando las fuerzas protrusivas inducidas por la quimioquina en la periferia del cluster, encontramos que la fuerza total a lo largo del gradiente de quimioquina

aumenta con el area del cluster:

A mayor tamano del cluster mayor es la diferencia de concentraciones del gradiente que puede percibir y mas fuerzas se generan lo largo de su estructura

Fy ~ R2 R = radio del cluster

• La fuerza del cluster esta relacionada con la velocidad de migración en elgradiente por el coeficiente de fricción del cluster. A partir de unadeterminado masa o tamano crítico, la velocidad es independiente del tamanodel cluster, indicando que la fricción es uniforme en la interfase cluster-sustrato y por tanto aumenta como R2.

La velocidad del Cluster esIndependiente de su Tamaño

Area del Cluster µm2 x 104

Velo

cidad

(µm

/min

)

Fuerzas de Traccion Aleatorias

correlacionadas no-correlacionadas

perifericas

uniformes

Area Cluster (µm2)

Varianz

a V

elocidad

(µm/m

in)2

0 1 2 3 41

20

40

60

El movimiento Aleatorio se Reduce con el Tamaño del Cluster

La Varianza para la Velocidad ν decrece con el area del cluster como ⟨v2⟩∝ 1/ R2

Log

Varianz

a V

elocidad

(µm/m

in)2

R = radio del cluster

Como resumen, el modelo teorico predice que

• La velocidad del cluster a lo largo del gradiente es independente de su tamano,

• Su movimiento aleatorio se reduce con el tamaño del cluster.

Esas dos propiedades combinadas dan lugar a los mayores FMI observados para clusters grandes

Porque los Clusters son mas eficientes parallevar a cabo la quimiotaxis?

Como los Clusters resisten la quimiorepulsión?

La Unión de CCL19 al Receptor CCR7 Activa la Señalización Bioquímica y su Internalización

QUIMIOTAXISVELOCIDADMIGRACION

p38 ERK1/2

Rho

CCR7 Receptor

Quimioquina

G13β

Giϒ

CCL19

CCL19DegradaciónQuimioquina

RECICLAGERECEPTOR

INTERNALIZACIONRECEPTOR

CCL19

La Inhibición de la Endocytosis Convierte la Quimiorepulsión en Quimiotaxis en Celulas Solitarias

50

60

70

80

90

100

110

0 10 20 30

%CCR7 S

uperf

icial

Time (min)

Internalización de CCR7

inducida por CCL19

NT

Dynasore

CCL21

Dynamin

Clathrin

Dynamina

Tubulina

DYN2

LUC

Clatrina

TubulinaLUC

CLAT

x axis (µm)

Y a

xis

(µm

)

0-

100

0+

100

00

-10

00

+ 10

00

0- 1000 + 10000- 1000 + 1000 0- 1000 + 1000

Clust

ers

CONTROLLuciferasa Dynamina Clatrina

CONTROLDMSO Dynasore

(0/5

00) CCL19

gradient

e

0- 1000 + 1000 0- 1000 + 1000

n.s. n.s. *** ***n.s. n.s.

FMI Velocidad (nm/min)

Clust

ers

Células

Ind

ivid

uales

n.s.*** ****** *** ***

Células

Ind

ivid

uales

Dinámica del Cluster y Movimiento de Células Interno

PKH26PKH67

Dir

ec

tio

n o

f M

igra

tio

nC

CL1

9 (

50

0 n

g/m

l)

Las Células Leader Protrusivas se Reciclan Constantemente

ROTACION

0 ng/ml

500 ng/mlCCL19

Tinción Nuclear : DRAQ5™

Spinning-disk microscopyTime resolution: 15 sec

El Patrón Migratorio de los Clusters se Compone de Avances y Rotaciones

El Patrón Migratorio de los Clusters se Compone de Avances y Rotaciones

 

v k, t+1

dVector

Direccional :

20 μm

tt+1

CC

L19

(50

0 n

g/m

l)

Weimiao Yu

La Locomoción del Cluster Alterna Fases de Avance, Rotación y Pausa

Momento Angular; grado de rotación del grupo con respecto al centro del cluster

Polarización del Grupo; grado de alineamiento entre individuos dentro del grupo

 

P( t) =

v k, t

d

kå

K

Cluster Polarization

where K is total number

of

 

v k, t+1

d

 

M(t) =1

K

r i (t)´

v i

d(t)1

K

å

Angular Momentum

with

corresponding to nuclei vector relative to the cluster center C

 

r i (t) =

ci (t)-C(t)

ci (t)-C(t)

Patrón Migratorio del Cluster: Oscilación de 3 Fases distintasPatrón Migratorio del Cluster: Oscilación de 3 Fases distintas

Time

Parameter definition:

Run-directed Random-breathing Pause-tumbling

t=1 t=61t=17

Weimiao Yu

Velo

cidad

(µm

/min

)

Tiempo (min)

Velocidad de las Células dentro del Clusterdurante las Fases de Avance, Rotación y Pausa

Análisis de los Niveles Superficiales de Receptor en el Cluster : Relación CCR7-GFP/Membrana

GFP-CCR7/CellMask TMGFP-CCR7 CellMask TM

No

CCL19

50

0 n

g/m

l

CCL19

Control (-/-) Gradiente Control (+/+)

CCL19Alexa 647

0 100

GF

P-C

CR

7/C

ellM

ask

TM

GFP

-CC

R7

/Cel

lMas

kTM

Leaders Non-Leaders

*

LA Relacion CCR7-GFP/Membrana es mayor en el Frente del Cluster

Análisis Dinámico de la Relación CCR7-GFP/Membrana en Células dentro del Cluster

0

1

2

3

4

0 20 40 60 80 100 120GFP

-CC

R7

/Cel

lMas

kTM

1 mm

Pasar a ser célula leader se correlaciona con un aumento en la

relación CCR7/membrana

0

0,5

1

1,5

2

2,5

45 50 55 60 65 70 75 80

GFP

-CC

R7

/Cel

lMas

kTM

Becoming leader

Time (min)

1

1,5

2

90 95 100 105 110 115

GFP

-CC

R7

/Cel

lMas

kTM

Loosing Leader Position Rotational Movement

La pérdida de la posición de leader se correlaciona con un descenso en la

relación CCR7/membrana

Time (min)

Clusters de células linfoides tienen mayor capacidad quimoiotáctica que células aisladas.

A altas concentraciones de quimioquina, los clusters resisten el cambio direccional que llevan a cabo las células solitarias en el proceso de quimiorepulsión y que es mediado por la endocitosis del receptor.

Un modelo físico basado en las fuerzas de tracción del cluster indica que su organización resulta en una reducción de ruido

El análisis microscópico revela que existe una coordinación celular compleja y dinámica dentro del cluster, con alternancia periódica de fases de avance, rotación y pausa.

El bloqueo de la endocytosis evita la quimiorepulsión de las células individuales

El reciclaje dinámico de células dentro del cluster permite exponer células con mayores niveles superficiales de CCR7 en su parte frontal.

Conclusiones

Futuro…

Estudio de las rutas de señalización que gobiernan la quimiotaxis colectiva

- Estudio de quimiotaxis colectiva en presencia de inhibidores- Uso de Sensores FRET para el estudio de la activación de kinasas y GTPasas en

durante la quimiotaxis colectiva.

Identificación de las “células leaders mecánicas” de los clusters.

- Microscopia de Tracción de Fuerzas en colaboración con Xavier Trepat (IBEC, Barcelona) y Aldo Ferrari (ETH Zurich).

Screening para identificar quimiotaxis colectiva en otros modelos tumorales

Loic DupreToulouse – France

Inserm Unite 1053

Weimiao Yu – Singapore

A*Star Institute of Molecular and Cell Biology

Giorgio Scita

Milan – Italy

IFOM Fondazione IstitutoFirc di Oncologia Moleculare

Nir S. Gov - Rehovot – Israel

Weizmann Institute of Science

IFOM Imaging platformAmanda OldaniSara Barozzi

Rocco d’Antuono

Gracias

Los Agregados de Células Tumoralestienen un gran Potencial Metastático