ENTEROBACTERIACEAE

ENTEROBACTERIACEAE

TUJUAN:

Memahami prosedur beberapa uji primer sederhana untuk identifikasi famili Enterobacteriaceae.

BAHAN PRAKTIKUM :1.Biakan: E.Coli, Klebsiella spp. , Proteus spp. , Pseudomonas spp. , pada agar McConkey dan EMB.

2.Reagensia untuk pewarnaan gram

3.Reaksi biokimia beberapa spesies Enterobacteriaceae dalam media uji : IMViC,urease,TSI,seri gula-gula dan uji motilitas.

YANG DIKERJAKAN:

1.Perhatikan koloni yang tumbuh pada media diferensial,koloni yang bewarna adalah koloni yang non-patogen,kaloni yang tidak bewarna kemungkinan besar koloni yang patogen.

2.Lakukan pewarnaan Gram atas koloni yang tumbuh pada media diferensial

3.Perhatikan hasil reaksi biokimia dari uji : IMVIC,Urease,TSI,seri gula-gula dan uji motilitas

4.Identifikasi spesies bakteri dengan membaca hasil reaksi biokimia.

PENDAHULUAN:

Famili Enterobacteriaceae. Terdiri dari berbagai grup bakteri batang Gram-negatif non-spora yang habitat alamiahnya usus manusia dan hewan.Tumbuh aerob atau anaerob fakultatif.Ada yang motile dan ada yang non-motile.Spesies yang motile memiliki flagela peritrik berbeda dengan Pseudomonadaceae yang memiliki flagela polar.Beberapa diantaranya seperti E.colo merupakan bagian dari flora normal,yang lainnya seperti Salmonella spp. Dan Shigella spp. Adalah patogen bagi manusia(bakteri usus patogen).

Beberapa uji sederhana dapat digunakan untuk mengidentifikasi Enterobacteriaceae. Anggota famili Enterobacteriaceae. Diklasifikasikan sebagai lactose fermenter dan non-lactose fermenter. Kultur pada media diferensial misalnya agar eosin-methylene blue(EMB),agar McConkey atau agar desoxycholate dapat membedakan koloni yang lactose fermenter(bewarna) dengan lactose non-fermenter(tak bewarna) dan dapat digunakan untuk identifikasi presumtif cepat(rapid presumptive identification). Perbedaan tersebut berdasarkan fakta bahwa organisasi E.Coli menghasilkan asam kuat dari fermentasi gula-gula. Asam mengubah indikator pH yang terdapat dalam media agar seperti agar McConkey,menjadi merah gelap sehingga koloni bakteri beserta agar juga berubah warna menjadi gelap. Bakteri yang non-lactose fermenter,seperti Shigella spp,tidak menghasilkan asam kuat sehingga warna koloninya tidak berubah.Identifikasi presumtif cepat bakteri enterik Gram-negatif

Lactose Fermenter (cepat)

Escherihia coli: kolonina metallic sheen pada media diferensial motile,datar,nonviscous

Enterobacter aerogenes : koloninya timbul,non-metallic sheen,sering motile,lebih viscous

Klebsiella pneumoniae :sangat viscous,mucoid,non-motile

Lactose Fermenter (lambat)

Edwardsiella,Serratia,Citrobacter,Arizona,Providencia,ErwiniaNon-Lactose Fermenter

Shigella sp : non-motile,tidak menghasilkan gas dari dextroseSalmonella sp : motile,menghasilkan asam dan biasanya gas dari dextroseProteus sp : swarming pada agar,urea cepat dihidrolisis(berbau amonia)Pseudomonas sp : pigmen hijau-biru dan berfluoresensi,larut ke dalam media,berbau manisIDENTIFIKASI ENTEROBACTERIACEAE

A.Uji Indol

Uji indol dilakukan untuk melihat kemampuan suatu organisme menghasilkan indole dari degradasi asam amino triptofan. Triptofan dihidrolisis oleh triptofanase untuk menghasilkan tiga produk akhir, salah satunya adalah indole. Dengan kata lain dengan uji indole dapat di deteksi produksi enzim triptofanase. Oleh karena itu pada uji ini digunakan medium yang mengandung Triptofan.

Prosedur :

Biakan kuman diambil menggunakan ose steril lalu di tanam pada tabung berisi medium cair yang kaya akan triptofan,di inkubasikan pada suhu 37 derajat celcius selama 24 jam. Kemudian tambahkan 3-5 tetes reagensia kovac pada tabung yang mengandung biakan kuman yang berumur 24 jam tersebut. Kocoklah tabung tersebut lalu diamkan beberapa saat.Reaksi yang positif untuk indole di tandai oleh terbentuknya cincin merah pada permukaan biakan.

Reaksi yang terjadi pada uji Indole diantaranya:

1.Tryptophan ( Indole + Pyruvic acid + Amonia

2.Indole + p dimethyl amino benzaldehide ( cincin berwarna merah

B. Uji Methyl Red

Methyl red adalah indikator pH antara 6,0(bewarna kuning0 hingga 4,4(merah).bakteri yang mampu mengahasilkan asam kuat (laktat,asetat,formik)dari glukosa melalui jalur fermentasi asam dapat dideteksi dengan uji methyl red. Sebagian besar Enterobacteriaceae mampu menghasilkan asam selama fase awal inkubasi, namun hanya bakteri yang mampu mempertahankan pH asam dalam jangka waktu lama (inkubasi 48-72 jam) yang dapat dikatakan uji methyl red-nya positif.

Prosedur:

Bakteri diinokulasikan pada medium MR/VP,kemudian diinkubasi pada suhu 35 derajat celcius selama 48-72 jam. Kemudian teteskan 5 tetes reagensia methyl red ke dalam medium. Bila terlihat warna merah pada media maka hasil dinyatakan positif.

C. Uji Voges-ProskauerBeberapa Enterobacteriaceae seperti Klebsiella dan Enterobacter, mampu menghasilkan asetoin dari jalur metabolisme glukosa. Asetoin yang dikonversi menjadi diasetil , ditambah reagensia potassium hydroxidase 40% dan -napthol 5% sebagai katalisator, akan mengahsilkan kompleks merah.

Prosedur:

Bakteri diinkulasikan ke medium MR/VP, diinkubasikan pada suhu 35 derajat celcius selama 24 jam,kemudian kedalam medium ditambahkan 0,6 mL -napthol 5% dan 0,2 mol KOH 40%, dikocok beberapa saat dan didiamkan selama 10-15 menit.Hasil positif bila dihasilkan warna merah pada medium setelah 15 menit di tetesi reagensia.

D. Uji Citrat

Uji Citrat menggunakan medium padat yang mengandung garam-garam amonium, natrium citrat,biru brom-thimol,dan agar.Citrat dalam medium ini digunakan sebagai sumber energi.Medium ini mengandung indikator pH bromthymol blue dimana pada suasana alkali akan berwarna biru. Citrat ini di ubah menjadi Pyruvic acid dan CO2. CO2 akan di ubah menjadi Na2CO3 yang menyebabkan suasan alkalis dan medium menjadi berwarna biruProsedur :

Tanamlah kuman yang berasal dari biakan TSI pada agar miring Simmons Citrate.inkubasikan (37 derajat celcius)selama 24 jam dan periksalah ada/tidaknya pertumbuhan dan terjadinya perubahan warna medium dari hijau menjadi warna biru tua,yang menunjukkan hasil positif.

E. Uji Urease

Enzim urease yang dimiliki pleh bakteri akan menghidrolisis urea menjadi amonia,air,dan karbondioksida.Enzim ini dapat dideteksi dengan menginokulasikan bakteri pada medium yang mengandung urea sebagai sumber karbon,kemudiandiinkubasikan pada suhu 35 derajat celcius dan dideteksi adanya amonia melalui perubahaan pH pada indikator pH (merah fenol) yang akan menimbulkan warna merah (suasana alkali) dalam waktu 15,30 atau 60 menit hingga 4 jam.F. Pergerakan Bakteri (Motalitas)

Dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri enterik yang akan diidentifikasi tersebut dapat aktif bergerak (motile).Biakan bakteri diambil dengan jarum penanam steril (loop) kemudian di tusukkan tegak lurus ke dlama medium uji motilitas yaitu media semisolid. Bila motile maka setelah 24 jam pengeraman pada suhu 37 derajat celcius akan terlihat adanya penyebaran pertumbuhan bakteri ke sekitar tempat tusukan,ditandai dengan bekas tusukan yang tidak jelas, yang berarti uji pergerakan bakteri positif. Sebaliknya apabila pertumbuhan bakteri yang terjadi hanya terbatas pada tempat tusukan,ditandai dengan bekas tusukan yang tampak jelas,maka uji motilitas adalah negatif.

G. Uji Triple Sugar Iron (TSI)

Uji TSI digunakan untuk membedakan bakteri enterik Gram-negatif yang memiliki kemampuan untuk memetabolisme laktosa dan sukrosa,menghasilkan asam dari fermentasi,memproduksi gas selama proses fermentasi dan menghasilkan H2S dengan bakteri yang tidak memiliki kemampuan tersebut.

Medium TSI mengandung 3 macam gula : laktosa 1% sukrosa 1% dan glukosa 0,1%.Jika hanya glukosa yang difermentasi maka produksi asam hanya pada dasar tabung (butt) dan menghasilkan warna kuning,sedang pada bagian agar miring (slant) akan berwarna merah akibat kurangnya produksi asam. Jika laktosa dan sukrosa difermentasi maka warna kuning akan dijumpai pada butt dan slant. Jika dihasilkan gas pada saat fermentasi maka akan terlihat adanya gelembung gas pada butt atau agar menjadi naik dari dasar tabung. Jika tidak terjadi fermentasi karbohidrat naka nedium TSI akan terlihat merah pada butt dan slant-nya.Jika bakteri menghasilkam H2S, maka pada dasar tabung akan terlihat warna hitam (balck butt).H. Fermentasi gula-gula

Fermentasi gula-gula dapat digunakan sebagai reaksi tambahan untuk identifikasi famili Enterobacteriaceae. Gula yang dimaksud di sini bisa : glukosa,sukrosa,fruktosa,laktosa,maltosa,manitol,dll. Setelah inkubasi 24 jam dapat terjadi fermentasi gula-gula positif,di tandai oleh perubahan warna media menjadi kunng. Bila tidak ada perubahan warna media,berarti uji fermentasi gula-gula hasilnya negatif.

HASIL PENGAMATAN :Indol bewarna kuning/acid bereaksi negatif (-)

Methyl red bewarna kuning/acid bereaksi negatif (-)

Voges-Proskauer bewarna merah/alkali bereaksi positif (+)Citrat bewarna merah/alkali bereaksi positif (+)

Dari hasil yang di dapatkan maka media yang digunakan dari famili Enterobacteriaceae yaitu Escherichia Coli

Motilitas bewarna kuning/acid bereaksi negatif (-)

Triple Sugar Iron (TSI) kuning/acid bereaksi positif (+)

Urase bewarna merah/alkali bereaksi negatif (-)Dari hasil yang di dapatkan maka media yang digunakan dari famili Enterobacteriaceae yaitu Klebsiella.\

DAFTAR PUSTAKA:

Dept.Mikrobiologi FK USU.Penuntun Buku Praktikum Mikrobiologi Medik.2006.FK USU Medan.

Brooks,Carroll,Butel,Morse.Jawetz,Melnick,and Adelbergs Medical Microbiology,24th Ed.2007.McGraw-Hill.

Health protection agency.Indole Test.2010.National Standard Method BSOP TP 19 Issue 2.