Lersø Parkallé 105 • 2100 København ØTlf.: 39 16 52 00 • fax: 39 16 52 01e-post: ami@ami.dk • www.ami.dk

Mikrobiologiske Insektbekæmpelsesmidler

AAMI RAPPORT 53Arbejdsmiljøinstituttet ønsker med denne serie afdokumentationsrapporter at gøre resultatet af insti-tuttets dokumentationsopgaver tilgængelige for arbe-jdsmiljøprofessionelle (BST, ansatte i arbejds-tilsynetmv.) læger, teknikere, branchefolk med særlig behovfor detaljeret viden om afgrænsede arbejdsmiljøom-råder.

Dokumentationsopgaverne vil ofte være rekvireret afArbejdstilsynet, men de fremsatte synspunkter i rap-porterne afspejler ikke nødvendigvis Arbejdstilsynetsofficielle holdning.

Dokumentationsrapporterne er underkastet Arbejds-miljøinstituttets lektørordning for at sikre høj fagligkvalitet.

Arbejdsmiljøinstituttet betragter i øvrigt dokumenta-tionsarbejdet som en vigtigt element i instituttetsegen opbygning og udvikling af viden inden forkendte og nye områder.

AMI RAPPORT 53 Mikrobiologiske Insektbekæmpelsesmidler – forekomst af Bacillus thuringiensis i tarmfloraen hos væksthusarbejdere Gert Bolander Jensen, Arbejdsmiljøinstituttet Lars Andrup, Arbejdsmiljøinstituttet Bodil L. Jacobsen, Institut for Fødevaresikkerhed og Toksikologi, Fødevaredirektoratet Preben Larsen, Arbejds- og Miljømedicinsk Klinik, Odense Universitetshospital

Arbejdsmiljøinstituttet København, september 2001

AMI Rapport 53 Mikrobiologiske Insektbekæmpelsesmidler – forekomst af Bacillus thuringiensis i tarmfloraen hos væksthusarbejdere Gert Bolander Jensen, Arbejdsmiljøinstituttet Lars Andrup, Arbejdsmiljøinstituttet Bodil L. Jacobsen, Institut for Fødevaresikkerhed og Toksikologi, Fødevaredirektoratet Preben Larsen, Arbejds- og Miljømedicinsk Klinik, Odense Universitetshospital Tryk: DTK kommunikation ISBN 87-7904-070-5 København Arbejdsmiljøinstituttet Lersø Parkallé 105 2100 København Ø Tel.: (+45) 39 16 52 00 Fax: (+45) 39 16 52 01 e-mail: ami@ami.dk homepage: www.ami.dk

FORORD

Anvendelsen af biopesticider, specielt mikrobiologiske insektbekæmpe lses-midler, har været stigende i de sidste år i Danmark. Mere end 95% af disse bekæmpelsesmidler er baseret på bakterien Bacillus thuringiensis, der er i stand til at slå visse insektlarver ihjel. Som ved enhver anden introduktion af nye produkter og produktionsformer er det af stor vigtighed, at undersøge om man også introducerer nye problemer for miljø eller arbejdsmiljø.

Formålet med denne rapport er at formidle de undersøgelsesresultater, der er fremkommet ved et samarbejdsprojekt mellem Arbejds- og Miljømedi-cinsk Klinik ved Odense Universitetshospital, Institut for Fødevaresikkerhed og Toksikologi ved Fødevaredirektoratet og Arbejdsmiljø instituttet. Under-søgelsen omhandler forekomst af B. thuringiensis i tarmfloraen hos vækst-husarbejdere, som arbejder med mikrobiologiske bekæmpelsesmidler baseret på B. thuringiensis. Yderligere gennemgår vi den nuværende viden om po-tentielle risici ved B. thuringiensis, herunder problemstillingen ved det nære slægtskab mellem B. thuringiensis og madforgiftningsbakterien Bacillus cereus.

Undersøgelsen blev finansieret af Arbejdstilsynet og Arbejdsmiljørådets Servicecenter. I forbindelse med projektet blev der nedsat en følgegruppe bestående af Kristine Jensen, BAR Jord til Bord samt Dorte Harning og Flemming Lander, begge Arbejdstilsynet. Følgegruppen takkes for konstruk-tivt samarbejde. Vi vil gerne takke de involverede gartnerier på Fyn for op-bakning og entusiasme omkring undersøgelserne. En særlig tak til de mange frivillige forsøgspersoner på gartnerierne, der gjorde det muligt at gennemfø-re denne undersøgelse. Tak til ekstern lektør forsker Bja rne Munk Hansen ved Danmarks Miljøundersøgelser for værdifulde kommentarer og forslag, der er indarbejdet i rapporten. Gert Bolander Jensen Forsker August 2001

INDHOLD

FORORD............................................................................................. 3

INDHOLD............................................................................................ 5

RESUME............................................................................................. 9

Formål ..................................................................................................9

Resultater & konklusion.....................................................................9

Anbefalinger til forholdsregler i arbejdsmiljøet ............................10

SUMMARY.......................................................................................13

Objective ............................................................................................13

Results and conclusion......................................................................13

Recommendations for measures in the working environment ......14

INDLEDNING...................................................................................15

Baggrund for rapporten ...................................................................15

Historien om B. thuringiensis som pesticid .....................................16

Slægtskabsforhold .............................................................................22 Plasmider .........................................................................................23 Transposoner ...................................................................................23

Slægtskab med B. cereus & B. anthracis.........................................24

B. thuringiensis toksiner ...................................................................25 Delta-endotoksiner ..........................................................................25 Cyt toksiner .....................................................................................29 Vegetative insekticidal proteiner.....................................................29 Immun inhibitor A...........................................................................29

Resistensudvikling .............................................................................29 Begrænset anvendelse .....................................................................31

Andre toksiner & virulensfaktorer..................................................32 Phospolipase C ................................................................................32 Sphingomyelinase ...........................................................................32 Beta-exotoksin.................................................................................33 Hæmolysin BL (HBL) og Non-hæmolytisk toksin (NHE) .............33 Enterotoksin T.................................................................................34 plcR regulon ....................................................................................35 Thuringiolysin O .............................................................................35 Andre hæmolysiner .........................................................................35 Forekomst af emetisk toksin hos B. thuringiensis?.........................36

Toksicitet overfor vertebrater (pattedyr/mennesker) ....................36

Bacillus thuringiensis & infektioner ................................................38

Risikovurdering .................................................................................41

Karakterisering & identifikationsmetoder.....................................42 Serotypning .....................................................................................43 Fag typning......................................................................................44 DNA analysemetoder ......................................................................44 Multilokus enzym elektroforese (MEE)..........................................44 Ribotypning.....................................................................................45 Plasmidprofiler................................................................................45 Substratforgæring ............................................................................46

PCR-baseret identifikation..............................................................46 RAPD..............................................................................................47 Mikroskopering ...............................................................................47 Andre analysemetoder .....................................................................47 Specifikke substrater og sporeberigelse ..........................................48

FORSØGSRESULTATER.............................................................49

Formål – fase 1...................................................................................49

Metoder..............................................................................................49 Isolering af B.cereus- lignende bakterier fra fæces ..........................50 Plasmidoprensninger .......................................................................50 Verifikation af taksonomisk tilhørsforhold .....................................52 Krystaltoksiner ................................................................................52 Enterotoksiner .................................................................................52 Slægtskab med kommercielle stammer...........................................53

Resultater – fase 1 .............................................................................54

Metodeudvikling ................................................................................54 Genfindingsprocenter......................................................................54 Taksonomi og krystaltoksiner .........................................................54 Enterotoksiner .................................................................................55 Slægtskab med kommercielle stammer...........................................56

Konklusion .........................................................................................57

Fase 2..................................................................................................59

Formål – fase 2...................................................................................59

Metode ................................................................................................59 Isolering af B. cereus- lignende bakterier fra luft ............................60

Resultater – fase 2 .............................................................................61

DISKUSSION & KONKLUSION...................................................69 Naturlig forekomst af B. cereus ......................................................69 Eksponeringsvej ..............................................................................69 Infektiv dosis/symptomer fra mave-tarmkanalen............................69 Anbefalinger ....................................................................................70

LITTERATURLISTE.......................................................................71

BILAG ...............................................................................................85

9

RESUME

FORMÅL

Formålet med denne rapport er at formidle de undersøgelsesresultater, der er fremkommet ved et samarbejdsprojekt mellem Arbejds- og Miljømedicinsk Klinik ved Odense Universitetshospital, Institut for Fødevaresikkerhed og Toksikologi ved Fødevaredirektoratet og Arbejdsmiljø instituttet. Under-søgelsen omhandler forekomst af bakterien Bacillus thuringiensis i tarmflo-raen hos væksthusarbejdere, der arbejder med biologiske bekæmpel-sesmidler baseret på B. thuringiensis, som anvendes til insektbekæmpe l-se. Yderligere vil vi i denne rapport redegøre for problemstillingen ved det nære slægtskab mellem det mikrobiologiske bekæmpelsesmiddel B. thurin-giensis og madforgiftningsbakterien Bacillus cereus.

RESULTATER & KONKLUSION

I den første fase blev der udviklet en metode til at isolere B. cereus-lignende bakteriestammer fra human fæces, samt molekylærbiologiske teknikker til at identificere og karakterisere disse. Der blev indsamlet prøver fra syv B. thu-ringiensis-eksponerede og fem ikke eksponerede væksthusarbejdere. To af prøverne indeholdt B. cereus-lignende bakterier (begge fra den B. thurin-giensis-eksponerede gruppe). Den molekylærbiologiske karakterisering af disse isolater viste, at det ene isolat, med meget stor sandsynlighed, er iden-tisk med den aktive bakterie i det kommercielle insekticid Dipel® (B. thu-ringiensis subsp. kurstaki HD-1). Samtlige isolater blev endvidere undersøgt for tilstedeværelsen af generne for tre forskellige enterotoksiner, beskrevet som værende af betydning for B. cereus's evne til at forårsage gastroenteritis. Alle isolaterne indeholdt mindst et af disse enterotoksin-gener. Bakterier isoleret fra de tre kommercielle produkter Dipel®, Bactimos® og Vecto-bac® (de to sidstnævnte begge med B. thuringiensis subsp. israelensis) samt

10

det andet isolat fra fæces-prøverne indeholdt også generne for alle de under-søgte enterotoksiner.

I den anden fase af projektet, der forløb i foråret 2001, blev tyve gartneri-arbejdere udstyret med personbåret udstyr med filtre til opsamling af mikro-organismer fra luften i løbet af en enkelt arbejdsdag som mål for ekspone-ring. Desuden blev deres arbejdsprocesser beskrevet og et helbreds-spørgeskema udfyldt med henblik på afrapportering af selvoplevede mave-problemer. Forsøgspersonerne afleverede fæcesprøver en til fem dage efter indsamling af luftprøver, og B. cereus-lignende bakterier blev oprenset her-fra. Traditionelle mikrobiologiske metoder samt molekylærbiologiske meto-der optimeret i fase 1 af projektet blev anvendt ved karakteriseringen af de isolerede bakterier. I denne del af projektet blev der fundet B. thuringiensis subsp. israelensis i fæces-prøverne, der ikke kunne skelnes fra de anvendte kommercielle produkter – i dette tilfælde Bactimos® og Vectobac®.

ANBEFALINGER TIL FORHOLDSREGLER I ARBEJDSMILJØET

Det var muligt, selv med begrænset statistisk materiale, at se en korrelation mellem arbejdsproces og fundet af B. thuringiensis i fæces. Yderligere var det muligt at se en sammenhæng mellem eksponering målt på filtre og fun-det af B. thuringiensis i fæces. Der var dog ingen umiddelbar sammenhæng mellem selvoplevede maveproblemer og fundet af B. thuringiensis i fæces. At B. thuringiensis fra kommercielle biopesticider indeholder gener for ente-rotoksiner indikerer, at disse biopesticider udgør en potentiel sundhedsrisiko for væksthusarbejderne. Det er derfor anbefalelsesværdigt, i forbindelse med oplæring og uddannelse af landbrugsarbejdere, gartneria rbejdere og andre, der anvender mikrobiologiske bekæmpelsesmidler, at gøre opmærksom på de potentielle problemer, der er ved anvendelsen af B. thuringiensis-baserede biopesticider. Det skal understreges, at kommercie lle biopesticider baseret på B. thuringiensis verden over har haft en lang og uproblematisk karriere i landbrug, skovbrug, gartneri, bekæmpelse af malariamyg og i rekreative områder og med kun meget få rapporterede komplikationer. På grund af det nære slægtskab med B. cereus er det dog anbefalelsesværdigt, at brugeren af B. thuringiensis-baserede biopesticider anvender maske under håndtering og udbringning af produktet og i øvrigt iagttager almindelige hygiejniske for-holdsregler (håndvask) efter udbringning. Der kan yderligere være helbreds-

11

mæssige problemer knyttet til anvendelsen af B. thuringiensis-baserede bio-pesticider, hvis brugeren eller andre, der kan komme i forbindelse med bio-pesticiderne har svækket immunforsvar.

12

13

SUMMARY

OBJECTIVE

The purpose of this report is to disseminate the results of a joint project be-tween the Department of Occupational and Environmental Medicine, Odense University Hospital; Institute of Food Safety and Toxicology, The Danish Veterinary and Food Administration; and the National Institute of Occupa-tional Health. The study deals with the occurrence of Bacillus thuringiensis in the intestine of greenhouse workers working with biopesticides based on B. thuringiensis. Furthermore, this report gives details on the problem of the close relationship between the microbial insecticide B. thuringiensis and the food poisoning bacterium Bacillus cereus.

RESULTS AND CONCLUSION

During the first phase of the project a method was developed to isolate B. cereus-like bacteria from human faeces. Furthermore, the molecular biology techniques to identify and characterize these bacteria were improved. Seven samples from exposed and five samples from non-exposed greenhouse workers were collected. Two of the samples contained B. cereus-like bacte-ria (both came from the B. thuringiensis-exposed group). Molecular biology characterization of these isolates showed, with a high degree of probability, that they were identical to the active bacterium in the commercial insecticide Dipel® (i.e. B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1). Additionally, all isolates were examined for the presence of the genes for three different enterotoxins, all known from B. cereus to be of importance for the ability to cause gastro-enteritis. At least one of these genes was found in all isolates. Bacteria iso-lated from the commercial products Dipel®, Bactimos®, and Vectobac® (the latter two contains B. thuringiensis subsp. israelensis as the active in-

14

gredient) and one isolate from the faecal samples all contained the genes for every enterotoxin examined.

In the second phase of the project, carried out in the spring 2001, twenty greenhouse workers were individually fitted out with equipment for sam-pling of microorganisms during one workday as a measurement of exposure. Additionally, the work processes were described and a health questionnaire completed in order to report personally experienced gastric disorders. The persons handed in faecal samples one to five days after personal sampling and B. cereus-like bacteria were isolated from these samples. Classical microbiological methods along with molecular biology techniques were used in the characterization of the isolated bacteria. In the faecal samples B. thur-ingiensis subsp. israelensis were found that could not be distinguished from the commercial products used (in this case Bactimos® and Vectobac®).

RECOMMENDATIONS FOR MEASURES IN THE WORKING ENVIRONMENT

It was possible, even with limited statistical data, to see a correlation be-tween work processes and the occurrence of B. thuringiensis in the faeces. Additionally, it was possible to see a correlation between the number of bac-teria found on the individually exposed filters and the presence of B. thur-ingiensis in faeces. However, there was no correlation between personally experienced gastric disorders and the presence of B. thuringiensis in faeces.

The fact that B. thuringiensis isolated from commercial sources contain enterotoxin genes indicates that these biopesticides pose a potential health risk for the greenhouse workers. It is therefore appropriate to stress the po-tential problems related to the use of B. thuringiensis-based biopesticides. However, it must be emphasized that biopesticides based on B. thuringiensis have had a long and unproblematic career as a biopesticide and only spo-radic clinical case reports involving B. thuringiensis have been published. However, because of the close relationship with B. cereus it is advisable for the user of B. thuringiensis-based products to use a mask during handling of the product and to observe general hygienically precautions after handling (i.e. hand washing) of the biopetsicide. Finally, there might be health related problems associated with the use of B. thuringie nsis-based products, if the individuals that come in to contact with the product have weak or impaired microbe-clearance capacities and/or immune response systems.

15

INDLEDNING

BAGGRUND FOR RAPPORTEN

Denne rapport tager udgangspunkt i bakterien Bacillus thuringiensis (Bt) som mikrobiologisk bekæmpelsesmiddel til insektbekæmpelse. Et mikro-biologisk bekæmpelsesmiddel er ifølge dansk lovgivning blandt andet ”en mikrobiologisk enhed, der er i stand til at udveksle genetisk materiale eller reproducere sig selv.” Bakterien B. thuringiensis, der i øvrigt udmærker sig ved at kunne begge dele, er det hyppigst anvendte biopesticid og udgør 95% af markedet for mikrobielle insekticider.

B. thuringiensis er meget tæt beslægtet med blandt andet madforgift-ningsbakterien B. cereus. På basis af litteraturgennemgang redegør denne rapport for blandt andet slægtsforhold, identifikationsmetoder, virulensfakto-rer og den specifikke funktion af B. thuringiensis overfor insekter. Yderlige-re indeholder rapporten resultater af forsøgsdata indsamlet i foråret 2001, hvor personale på fire danske gartnerier beredvilligt har stillet sig til rådig-hed for denne undersøgelse.

Formålet med undersøgelsen er at se, om brug af B. thuringiensis som bi-ologisk bekæmpelsesmiddel kan give mave-tarm problemer. B. thuringien-sis-baserede transgene planter vil ikke blive behandlet i rapporten. B. thurin-giensis indgår blandt andet i produkterne Bactimos®, Vectobac® og Dipel®. Man ved, at i nogle arbejdsprocesser f.eks. ved affalds-håndtering kan en massiv udsættelse for selv naturligt forekommende mikroorganismer i for-bindelse med bestemte arbejdsfunktioner give risiko for udvikling af blandt andet mave-tarm problemer (Ivens et al. 1999).

Rapporten er resultatet af et samarbejdsprojekt mellem Arbejds- og Mil-jømedicinsk Klinik ved Odense Universitetshospital, Institut for Fødevare-sikkerhed og Toksikologi ved Fødevaredirektoratet samt Arbejdsmiljø-instituttet.

16

HISTORIEN OM B. THURINGIENSIS SOM PESTICID

Hvad er Bacillus thuringiensis? Det er et spørgsmål, der har beskæftiget mange forskere, der har arbejdet med denne specielle bakterie. B. thurin-giensis hører til Bacillus-slægten, og er karakteriseret ved at være en stav-formet, fakultativ aerob, bevægelig, Gram-positiv bakterie. Bakterie -slægten Bacillus er yderligere kendetegnet ved at kunne danne endosporer. Endospo-rer er hvile stadier af bakterien, der er meget modstandsdygtige overfor ud-tørring og andre ydre miljøpåvirkninger. Man har fundet eksempler på, at Bacillus-sporer kunne genoplives fra materiale, der blev kulstof-14 dateret til at være ca. 200 år gammelt (Smith et al. 2000). Sporespiring kan ske når de rette ernæringsrige forhold opstår omkring dem (se figur 1).

Historien om Bacillus thuringiensis startede for et hundrede år siden da den japanske bakteriolog S. Ishiwata i 1901 isolerede bakterien fra døde silke-sommerfugle-larver (Bombyx mori). Ishiwata navngav bakterien B. sotto, og beskrev i 1905 sygdommen som bakterien forårsagede i larverne. Blandt andet bemærkede Ishiwata, at larverne døde, før bakterierne nåede at gro, og han konkluderede at et giftstof muligvis var årsagen. Nogle år senere, i 1911, isolerede Ernst Berliner en lignende bakterie fra melmøl-larver (Ephestia

Figur 1. Sporulerings -spiringsforløb for Bacillus

17

kuhniella) fundet i et nedlagt kornmagasin i Thüringen i Tyskland. Berliner var i stand til at vise, at bakterien kunne slå larver ihjel, og da Ishiwata tidli-gere ikke havde beskrevet bakterien detaljeret nok, var det Berliner, der op-kaldte bakterien Bacillus thuringiensis.

To andre japanske forskere, Aoki og Chigasaki, fortsatte Ishiwatas studi-er og kunne i 1916 rapportere at toksiciteten skyldtes et protein, der var knyttet til bakterie cellerne i gamle bakterie -kulturer fyldt med sporer. Unge kulturer med vegetative (voksende) celler var ikke toksiske.

Herefter var forskningen indenfor dette område forsvindende lille. Dette skyldtes dels, at man i Japan ikke havde de store problemer med infektioner af silkesommerfugle -larver med B. thuringiensis, samt at forskningen inden-for disse områder var sat i bero i Europa på grund af 1. verdenskrig. Berli-ners isolat gik tabt, men interessen for B. thuringiensis blev genfødt, da Mat-tes (i 1927) gentog Berliners forsøg, og reisolerede bakterien fra den samme vært. Mattes observerede, ligesom Berliner havde gjort det tidligere, at ud-over sporen, fandtes et yderligere legeme som de benævnte Restkörper. I dag ved vi, at det er proteinudfældninger, såkaldte krystal-proteiner, som Mattes dengang observerede. Det er disse krystal-proteiner, der er ansvarlige for den insekticidale effekt af B. thuringiensis. Mattes isolat er det hyppigst fore-kommende i de tidlige kommercielle B. thuringiensis-baserede produkter. Det første produkt baseret på B. thuringiensis kom på markedet i Frankrig i 1938, under navnet Sporeine (Beegle and Yamamoto 1992).

Den amerikanske professor Edward A. Steinhaus satte for alvor gang i kommercialiseringen af B. thuringiensis som biopesticid med sin publikati-on i tidskriftet Scientific American i 1956 med titlen ”Living Insectic ides”, og i 1957 kom så det første amerikanske produkt Thuricide på markedet gennem Pacific Yeast Products. Det var imidlertid først efter man fandt den meget effektive B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 i 1967, at kommercia-liseringen tog fart (Milner 1994). Indtil midten af 1970’erne mente man, at der kun fandtes B. thuringiensis, der var aktive overfor Lepidoptera (som-merfugle og møl), men i 1976 fandt man i Negev-ørknen i Israel en B. thu-ringiensis art, der var aktiv overfor myg og fluer. Dette isolat fik navnet B. thuringiensis subsp. israelensis (Goldberg and Margalit 1977). I 1983 fandt Huger en B. thuringiensis i en død puppe fra melbillen Tenebrio molitor. Denne B. thuringiensis viste sig at være aktiv overfor insektlarver fra ordnen Coleoptera (biller og snudebiller) og fik navnet B. thuringiensis subsp. te-nebrionis (Keller and Langenbruch 1993; Krieg et al. 1983). Disse fund

18

ansporede til, at screeningsprogrammer i søgningen efter nye, kommercielt interessante isolater blev iværksat, og i dag er den årlige produktion vurderet til 13000 tons, svarende til en handelsværdi på 100 – 150 mio. USD (1999;Ronchin 1998). Interessen for B. thuringiensis afspejles også i antal-let af videnskabelige publikationer der omhandler denne bakterie. Figur 2 illustrerer, hvorledes bevågenheden omkring B. thuringiensis øges efter op-dagelsen af B. thuringensis subsp. tenebrionis. Efter fremkomsten af gene-tisk modificerede planter i starten af 1990’erne (Ananda Kumar et al. 1996) (ofte med et indsat B. thuringiensis insektic idal toksin-gen), øges andelen af denne type publikationer af den samlede B. thuringiensis litteratur.

Arten B. thuringiensis består således i dag af talr ige stammer, eller under-arter, med vidt forskellige indhold af krystaltoksingener. Tabel 1 viser ud-valget af kommercielle B. thuringiensis-produkter (USA og Europa, foråret 2001) til bekæmpelse af sommerfugle -, mygge- og billelarver. Herudover er der fundet B. thuringiensis stammer, som udviser giftighed indenfor Nema-toder (rundorme), Protozoer, Trematoder, Acari (mider) and Hymenoptera (bier og hvepse) (Feitelson 1993). I Danmark anvendes B. thuringiensis

Bt tenebrionis

Bt planter

Antal -artikler af samtlige -artikler

thuringiensisBacillus

Antal GMO-artikler af samtlige -artiklerthuringiensis

Figur 2. Væksten af thuringiensis litteratur ud af den samlede Bacillus -litteratur. (grafen er fremkommet ved afsøgning af databasen MEDLINE med kombinationer af ordene "Bacillus", "thuringiensis" og "transgenic").

19

overvejende i drivhuse til bekæmpelse af sørgemyg, og i mindre grad på friland til bekæmpelse af kålsommerfugles larver. I takt med kravet om re-duceret anvendelse af kemiske midler, må det forventes at anvendelsen af mikrobielle bekæmpelses midler, som B. thuringiensis, finder øget anvendel-se, fx ved anvendelse af integreret pest management (IPM), der er en kombi-nation af makrobielle, kemiske og mikrobielle bekæmpelsesmidler. På denne måde kan mikrobielle og makrobielle midler indgå i en strategi til at reduce-re de kemiske bekæmpelsesmidler. En svaghed ved IPM er, at der kræves indgående viden om de enkelte virkemidlers øko-toksicitet, idet mange bio-logiske bekæmpelsesmidler kan påvirkes af de kemiske midler.

20

Tabel 1. Produkter aktiv komponent mål-insekt sektor Produktnavn Producent/forhandler

BMP 144 (2X/3X/200G), BMP 123 (Primary, 2XWP, 2X, WDG, 48LC, 64ES)

Becker Microbial Prod-ucts, Inc - USA

Wormender Monterey

Biobit (HP, XL), Dipel (10G, 2X, 4L, 6AF, 8AF, ES, ES-CPI, ES-NT, SG), Foray (48B/48F/76B)

Valent BioSciences (tidligere Abbott)

CoStar, Thuricide (HPC, 48LV, 76LV, 96LV), Javelin WG (Delfin)

Certis USA (tidliger-eThermo Trilogy Corpo-ration)

Bt Caterpillar Killer Pan Britannica Indus-tries (PBI) Limited - UK

Condor (OF, WP, XL), Cutlass, CRYMAX, Lepi-nox (G, WPG), Raven

Ecogen

HALT WP Wockhardt Limited Bio-Agro Division - INDIA

Bt var kurstaki Arizona Biological Control Inc ARBICO

Bacillus Thuringiensis Insecticide

CMI Ltd. United House - UK

Bactospeine WP/XLV Koppert B.V. - NETHERLANDS

B. thuringiensis subsp. kurstaki

Lepidoptera: sommerfugle, møl, kålorme

landbrug, skovbrug, gartnerier

Caterpillar Control Chase Organics - UNITED

21

Tabel 1. - fortsat Produkter aktiv komponent mål-insekt sektor Produktnavn Producent/forhandler B. thuringiensis subsp. israelen-sis H-14

Diptera: Stikmyg, kvægmyg, svampemyg/ sørgemyg, pukkelfluer

sygdoms-vektorer, gartnerier, rekreative områder

Bactimos, Vectobac (12AS, CG, G), Gnatrol

Valent BioSciences (tidligere Abbott)

Teknar HPD Certis USA (tidligere Thermo Trilogy Corpo-ration)

Skeetal Killgerm Chemicals - UK

Aquabac Lobel Chemical Corpo-ration

Aquabac (DF/xt/200G) Becker Microbial Prod-ucts, Inc - USA

Bt var san diego tenebri-onis

Arizona Biological Control Inc ARBICO - USA

B. thuringiensis subsp. sandiego, B. thuringiensis subsp. tenebri-onis

Coleoptera: Coloradobille, elmeløvbille?

landbrug, haver, gartnerier, rekreative områder

Novodor Valent BioSciences (tidligere Abbott)

Xentari Valent BioSciences (tidligere Abbott)

Agree – Turex, Design Certis USA (tid- ligereThermo Trilogy Corporation)

B. thuringiensis subsp. aizawai

Lepidoptera: sommerfugle, møl, kålorme voksmøl

landbrug, gartnerier, biavl

Certan Steele & Brodie Ltd. Beehive Works - UK

22

SLÆGTSKABSFORHOLD

B. thuringiensis tilhører den såkaldte B. cereus gruppe, som ud over B. thu-ringiensis indeholder B. cereus, B. anthracis, B. weihenstephanensis, B. mycoides og B. pseudomycoides. De seks arter kan skelnes på nogle enkelte karakteristika, men ellers har de så mange karakteristika fælles (Hansen et al. 2001) at nogle mener, de skulle betragtes som én art (Helgason et al. 2000b). De karakteristika, der adskiller disse seks arter, er næsten udeluk-kende plasmid-kodede. Plasmider er ekstrakromosomale cirkulære DNA-molekyler, der replikerer (gendanner sig) uafhængigt af bakteriens kromo-som.

Figur 3. Illustration af slægtskabet i B. cereus-familien (efter Gordon 1977). Kun plasmidindholdet adskiller de enkelte arter. F.eks. hvis B. anthracis taber sine to virulens -plasmider, bliver den til B. cereus. Eller optager B. cereus insekttoksin-plasmidet, bliver den til B. thuringiensis.

Plasmid, som indeholderde insekttoksiske gener

to plasmider, som indeholderde humantoksiske gener

Bacillus cereus

Bacillus anthracisBacillus thuringiensis

23

Plasmider

Det har været kendt siden 1980’erne, at generne for krystal-toksinerne næ-sten udelukkende findes på plasmider. Der kan være flere plasmider i en enkelt B. thuringiensis stamme, som kan bære generne for forskellige insekt-toksiner. Plasmiderne kan udveksles mellem B. thuringiensis stammerne ved en såkaldt konjugations-lignende proces (González, Jr. and Carlton 1984) , og konjugation er observeret i steril jord og indeni insektlarver (Thomas et al. 2000). Toksiciteten af B. anthracis skyldes ligeledes store plasmider, kaldet pXO1 og pXO2. Både krystaltoksin-plasmiderne fra B. thuringiensis og virulens-plasmiderne fra B. anthracis har vist sig at kunne overføres mel-lem arterne af B. cereus familien, hvorved en B. cereus kan blive til en B. thuringiensis eller en B. anthracis. Ligeledes kan B. thuringiensis og B. anthracis tabe deres virulens-plasmider, hvorved de praktisk talt bliver umu-lig at skelne fra B. cereus (se tegning på figur 3). På Arbejdsmiljøinstituttet har vi fundet en del konjugative plasmider fra B. thuringiensis, som kan overføres til B. cereus (Andrup et al. 1993; Andrup et al. 1996; Andrup 1998; Jensen et al. 1996; Wilcks et al. 1998).

Det har vist sig, at et replikon (et område på plasmidet, der er ansvarlig for dets autonome replikation) fra et B. thuringiens-plasmid har stor lighed med replikonnet fra pXO2 fra B. anthracis, hvilket underbygger det nære slægtskab mellem disse bakterier og sandsynliggør, at DNA-udveksling rent faktisk kan foregå i naturen (Wilcks et al. 1999).

Transposoner

Som nævnt adskilles B. thuringiensis og B. cereus på tilstedeværelsen af krystaltoksin-plasmiderne, som udviser stor variabilitet med forskellige kombinationer af krystaltoksin-gener. Udover disse plasmider, indeholder B. thuringiensis transposoner (Baum 1994; Mahillon et al. 1994). Transposoner er flytbare genetiske elementer som ved hjælp af enzymer kan bortskæres fra en del af genomet og indsættes et andet sted. Ofte finder man, at krystaltok-sin-generne sidder i områder, der har stor lighed med transposoner. Samlet set øger disse egenskaber mangfoldigheden af krystaltoksiner, der produce-res naturligt af B. thuringiensis. Dette skaber også baggrunden for, at firmaer kan skabe genetisk modificerede stammer med nye krystaltoksin-kombinationer. Et af de første gensple jsede produkter, der blev markedsført i

24

USA, var Foil (Ecogen Inc). Dette produkt, der ikke længere er på markedet, var forløberen for Raven® (Ecogen Inc) til bekæmpelse af Colorado-kartoffelbillelarver samt bille -larver, der angriber tomatplanter, kartoffel-planter og aubergineplanter. Raven® indeholder to forskellige bille -aktive cry3-proteiner samt to larve-aktive cry1-proteiner. Denne tilgang, med for-skellige toksin-kombinationer (også kaldet ”gene-pyramiding”) har til hen-sigt at forsinke udviklingen af resistens i mål-insekterne, idet resistensen overfor flere toksiner nødvendigvis må opstå samtidigt i sådanne tilfælde. Sandsynligheden for at dette sker mindskes, når der er flere toksiner tilstede. Et andet eksempel på gene-pyramiding er produktet Agree™ (Bt aiza-wai/kurstaki) fra Certis USA.

SLÆGTSKAB MED B. CEREUS & B. ANTHRACIS

B. thuringiensis betragtes i det daglige som en harmløs og nyttig bakterie, der ofte markedsføres som et naturligt, miljøvenligt og grønt biopesticid, men dens nære slægtskab med to sygdomsfremkaldende bakterier B. cereus (fødevareforgiftninger) og B. anthracis (miltbrand), stiller krav om en nær-mere undersøgelse af virulensen af denne bakterie. Disse tre arter er som tidligere nævnt tæt beslægtede, og det har derfor været foreslået, at B. thu-ringiensis og B. anthracis skal betragtes som varianter af B. cereus (Ash et al. 1991; Baumann et al. 1984; Carlson et al. 1994; Gordon 1977). B. thu-ringiensis adskilles som nævnt fra B. cereus ved sin produktion af krystal-toksiner, hvis gener sidder på store plasmider.

25

B. THURINGIENSIS TOKSINER

Delta-endotoksiner

Figur 4. virkningsmekanisme af B. thuringiensis efter Lambert og Peferoen (1992). B. thuringiensis kan danne to slags insekticidale krystalproteiner; Cyt-proteiner (cytolysiner) og Cry-proteiner (de lta-endotoksiner, d-endotoksiner). Delta-endotoksiner fra forskellige stammer udviser samme principielle virkningsmekanisme. Efter at delta-endotoksinerne er ædt af insektlarven, bliver de opløst i insektlarvens mave, oftest på grund af det meget basiske miljø, der findes her (hos Lepidoptera og Diptera (tovingede insekter; fluer og myg), men ikke Coleoptera). De opløste pro-toksiner bliver derefter spaltet af fordøjelsesenzymer (proteaser) i insektets mavetarmkanal og bliver herved omdannet til aktive toksiner, der kan binde til specifikke receptorer (oftest aminopeptidase-N) på mavetarmkanalens epitelceller. Det-te ødelægger den osmotiske balance i disse epitelceller ved at der dannes

26

porer i cellemembranen. Dette får cellerne til at sprænges (lysere) (Aronson and Shai 2001). Mavetarmkanalen bliver paralyseret, og insektlarven ophø-rer med at spise. Mange larver dør indenfor et par timer efter at have indtaget delta-endotoksinerne (Entwistle et al. 1993) (se figur 4). Lyseringen af tarm-epitelcellerne medfører, på grund af udflydende cellevæsker, en reduktion af mave-tarmkanalens pH-værdi, hvilket giver mulighed for spiring af sporen, hurtig vegetativ vækst, gennemtrængning til krophulen (også kaldet haemo-coel, der indeholder insekternes indvolde samt haemolymfen, der svarer til en blod/lymfe-væske). Insektlarven bliver således yderligere offer for en kraftig blodforgiftning som yderligere øger effekten overfor larven. I forbin-delse med aktiviteten af delta-endotoksinerne, har man således fundet, at sporen i nogle tilfælde har en synergistisk effekt på toksiciteten, uden selv at være synderlig toksisk (Johnson et al. 1998; Johnson and McGaughey 1996). Effekten menes netop at skyldes de optimale spiringsvilkår, der opstår, når pH-værdien i insektet falder. Herved udsættes insektet for kombinationen af den toksiske effekt af delta-endotoksinet samt blodforgiftning med vege-tative celler.

De enkelte delta-endotoksiner har et veldefineret spektrum af insektic idal aktivitet, oftest afgrænset til nogle få arter indenfor én insektorden. Der er fundet B. thuringiensis toksiner, der er virksomme overfor insektordnen Lepidoptera (sommerfugle og møl), Diptera (tovingede insekter; fluer og myg), Coleoptera (biller og snudebiller) samt Hymenoptera (Årevingede insekter; hvepse og bier) (de Maagd et al. 2001). Yderligere er et mindre antal krystaltoksiner fundet aktive mod ikke-insekter såsom nematoder (Feitelson 1993). Få toksiner har en insekticial effekt, der spænder over flere insekt-ordner (f.eks. Cry1Ba, der er aktiv overfor møl, biller og fluer) (de Maagd et al. 2001).

I en oversigtsartikel fra 1989, definerede Höfte og Whiteley fire klasser af cry-gener (der koder for Cry-proteiner/delta-endotoksiner) samt to kla sser af cyt-gener (der koder for Cyt-proteiner/cytolysiner). CryI og CryII toksiner er aktive overfor Lepidoptera. CryII og CryIV er toksiske overfor Diptera og CryIII er toksisk overfor Coleoptera (Höfte and Whiteley 1989). Krystal-proteinerne fra B. thuringiensis er genstand for intense studier på grund af deres insekticidale egenskaber samt deres høje (intra)cellulære koncentratio-ner. Næsten hver eneste måned opdages nye krystalprotein-gener i søgen efter nye insekticidale egenskaber. Dette har resulteret i, at den gamle no-menklatur foreslået af Höfte og Whiteley (Höfte and Whiteley 1989) , der baserede sig på insekticidal aktivitet ikke længere er tidssvarende. Oprinde-

27

lig havde man ikke forestillet sig, at man blot et ti-år senere skulle have 73 holotype protein-sekvenser (holotype-sekvens: en original sekvens, udfra hvilken nye proteinsekvenser defineres) i modsætning til de 13 man havde i 1989. På denne baggrund valgte man i 1998, at omdefinere nomenklaturen, således at den blev baseret på sammenligning af aminosyresammensætnin-gen i de enkelte proteiner (Crickmore et al. 1998). Figur 5 illustrerer således et såkaldt dendogram, der viser slægtskabet mellem de enkelte delta-endotoksiner (dendogrammet aflæses ved at følge stregerne mellem de en-kelte proteiner – jo kortere streg, jo tættere slægtskab. Således er slægtskabet mellem Cry1Aa og Cry1Ag større end slægtskabet mellem Cry1Ac og Cry1Ah).

28

Cry1AaCry1AgCry1AdCry1AeCry1AbCry1AfCry1AcCry1AhCry1DaCry1DbCry1HaCry1HbCry1FaCry1FbCry1GaCry1GbCry1CaCry1CbCry1EaCry1EbCry1JaCry1JbCry1JcCry1BbCry1BcCry1BdCry1BaCry1BeCry1KaCry1IbCry1IcCry1IaCry7AaCry7AbCry9CaCry9DaCry9EaCry9BaCry9AaCry8AaCry8BaCry8CaCry26AaCry28AaCry4AaCry4BaCry32AaCry3AaCry3CaCry3BaCry3BbCry19BaCry19AaCry10AaCry30AaCry24AaCry25AaCry20AaCry27AaCry17AaCry29AaCry16AaCry5AaCry5AcCry5AbCry5BaCry12AaCry21AaCry14AaCry13AaCry2AbCry2AdCry2AaCry2AcCry18BaCry18CaCry18AaCry11BaCry11BbCry11AaCry31AaCry23AaCry15AaCry6AaCry6BaCry22Aa

1. orden 2. orden 3. orden

Cry holotype sekvenser

Figur 5. Illustration af cry holotype-sekvenser og deres inbyrdes relationer, efter Crickmore et. al (1998)

29

Cyt toksiner

Nogle B. thuringiensis stammer producerer som nævnt også cytolysiner. Disse toksiner genkender ikke, i modsætning til delta-endotoksiner, speci-fikke receptorer (Entwistle et al. 1993). Cytolysiner er aktive overfor Diptera og Coleoptera, men har også vist effekt overfor Hemiptera (halvvinger) og Dictyoptera (kakerlakker og knælere).

Vegetative insekticidal proteiner

Udover delta-endotoksiner, er der også isoleret såkaldte vegetative insektic i-dale proteiner (VIPs), fra vækstmediet under vegetativ vækst af Bacillus spp. B. thuringiensis producerer blandt andet VIP3A, der er giftig overfor Lepi-doptera (Estruch et al. 1996), men også B. cereus har vist sig at producere VIP. Disse er fundet giftige overfor Western- og Northern corn rootworm (VIP1 og VIP2). Den akutte toksicitet er sammenlignelig med delta-endotoksinerne, og VIP har også en tilsvarende virkemåde. Mave-tarmkanalen på insektet paralyseres efterfulgt af lysis af tarm-epitelcellerne, hvorefter larven dør. Tidsmæssigt er reaktionen dog forsinket i forhold til delta-endotoksinerne (Yu et al. 1997). I en undersøgelse af forskellige stammer af B. thuringiensis fandt man, at 15% indeholdt VIP-homologe gener (Estruch et al. 1996).

Immun inhibitor A

Udover førnævnte insekticidale toksiner, har man også isoleret immun inhi-bitor A, der er en protease, der specifikt nedbryder forskellige larvers anti-bakterielle proteiner (Lövgren et al. 1998). Oprenset Immun inhibitor A har blandt andet vist sig toksisk overfor Trichoplusia ni larver samt Drosophila .

RESISTENSUDVIKLING

Traditionelle kemiske pesticider har generelt hurtigt resulteret i udvikling af resistens. Der findes i dag mere end 500 arter af insekter og mider, der er resistente overfor kemiske insekticider (McGaughey and Whalon 1992). Også indenfor mikrobiologiske insekticider kan en vedvarende selektion medføre resistensudvikling. I 1985 blev de første resistente insekter mod

30

delta-endotoksiner fundet. Svag resistens blev fundet i Plodia interpuncte lla (Tofarvet frømøl) i kornsiloer med B. thuringiensis-behandlet korn. Dette ansporede til et laboratoriestudie, hvor man fandt, at opbevaringsbetingelser som kornsiloer, hvorfra udvandring af insekter sjældent finder sted, kunne skabe resistente Plodia interpunctella indenfor én opbevaringssæson (McGaughey and Whalon 1992). Før disse studier, havde man ikke set resi-stensudvikling i marken eller i laboratoriet. Kålmøl, Plutella xylostella, er det foreløbigt eneste insekt, hvor man har observeret resistensudvikling efter intens brug af B. thuringiensis-baserede insekticider.

Siden resistens overfor B. thuringiensis er fundet i Plodia interpuncte lla i 1985, har man i årene efter fundet resistens i 13 insekt-arter. Elleve af disse arter har dog kun udviklet resistens i laboratoriet, og ikke i naturen. Det skal understreges, at mange andre arter er blevet testet i forskellige laboratorier, men er fortsat følsomme overforB. thuringiensis (McGaughey and Whalon 1992).

Figur 6. Illustration af de forskellige trin, der kræves for aktivering af delta-endotoksiner i mavetarmkanalen på insekter.

pH>9 protease

receptor

tarmepitel-celler

protoksin

protoksinopløses

aktiveret toksin

lysis af tarmepitel-celler

31

Baggrunden for insekt- larvernes resistensudvikling er kompleks og involverer flere faktorer. Som det fremgår af figur 6, er der flere trin involveret i delta-endotoksinets virkemåde. Ved pH >9, vil protoksinet opløses, hvilket er forudsætningen for at proteaser senere kan aktivere protoksinet. Biller, der hører ind under insektordnen Coleoptera har generelt neutral til sur pH i mavetarmkanalen samt andre peptidaser i mave-tarmkanalen, hvilket er en af forklaringerne på, at denne insekt-orden ikke er følsom overfor samme toksiner som Lepidoptera og Diptera.

I visse insekter er receptoren for det aktiverede delta-endotoksin et essen-tielt enzym, aminopeptidase-N. En forandring i denne receptor, der vil kunne gøre insektlarven resistent er oftest også skadelig for insektlarven, idet det muligvis reducerer den generelle overlevelsesevne af insekt-larven (Aronson and Shai 2001). De resistente insektarter, man har studeret, har enten haft reduceret bindingsaffinitet af toxinet til de specifikke receptorer, med nedsat følsomhed til følge eller også er antallet af receptorer fundet at være reduce-ret (van Rie et al. 1990). Udover disse resistensmekanismer, har man fundet, at resistente Plodia interpunctella (tofarvet frømøl) mangler en protease i mavetarmkanalen, der menes at være ansvarlig for aktiveringen af B. thurin-giensis toksinet (Oppert et al. 1994). Endelig udviser, Choristoneura fumif e-rana, spruce budworm, en helt anden resistensmekanisme, her udfældes og inaktiveres toksinet med et proteinkompleks i mavetarmkanalen (Michaud, 1997).

Begrænset anvendelse

Bt-baserede produkter har yderligere den svaghed, at de er påvirkelige for UV-lys. Det er hovedsagelig sporerne, der er følsomme overfor sollys (Benoit et al. 1990). Der er kun få data, der tyder på, at toksinerne i Bt-produkterne også er lyssensitive. Der arbejdes til stadighed på at imødegå dette problem, for eksempel ved at tilsætte additiver i formuleringerne, der skal absorbere UV-lyset, og udskyde nedbrydningen af sporerne (Liu et al. 1993). På baggrund af den relativt langsomme virkningsmekanisme og spo-rernes lysfølsomhed, vil B. thuringiensis ikke kunne yde optimal effekt på veletablerede insekt-populationer.

En yderligere begrænsning er målgruppen af insekter. Sugende insekter (fx bladlus) samt insekter, der på larvestadiet befinder sig i jorden eller inde i planten, kan kun meget vanskeligt bekæmpes af Bt-baserede produkter.

32

Smal-spektrede mikrobiologiske insekticider er, ud fra et økonomisk syns-punkt, ikke optimale. Udviklings-, produktions- og registrerings-omkostninger kan således kun afskrives over et forholdsvis lille markedsom-råde og dermed produktionsvolumen. Konkurrerende kemiske pestic ider har større markeder i kraft af deres bredere insekticid-spektrum og har således bedre konkurrencevilkår.

ANDRE TOKSINER & VIRULENSFAKTORER

Blandt B. thuringiensis findes også stammer, der producerer andre toksiner, end de insekticidale (Hansen and Salamitou 2000). Som tidligere nævnt og som det fremgår af tabel 2, er nogle af disse enterotoksiner. Der er dog en række andre toksiner og virulensfaktorer, der er fundet i B. thuringiensis, og blandt disse toksiner er f.eks.:

Phospolipase C

Phospholipase C er et cytolytisk toksin, der angriber den phospholip iderne i den eukaryote cellemembran. B. cereus phospholipase C er en phosphat-idylcholin-foretrækkende phospholipase, og kaldes derfor ofte for PC-PLC (phosphatidylcholine-preferring phospholipase C). B. cereus PC-PLC bliver posttranslationelt aktiveret ved fraspaltning af et peptid på 26 aminosyrer (Titball 1993) og er i øvrigt svagt hæmolytisk.

Sphingomyelinase

Ligesom phospholipiderne er en del af den eukaryote cellemembran, er sphingomyelin også et membran-lipid. Dette kan nedbrydes af sphingo-myelinase. Sphingomyelinase er varmestabil og sandsynligvis ansvarlig for den hæmolytiske aktivitet af en varmebehandlet kultur af B. cereus. Der er fundet fire sphingomyelinase gener (sph) i B. cereus. På denne baggrund har en thailandsk gruppe designet PCR-primere og fundet, at disse giver et pro-dukt med blandt andet ti lokale B. thuringiensis-isolater, hvilket antyder, at også sphingomyelinase kan findes i B. thuringiensis (Hsieh et al. 1999).

33

Beta-exotoksin

Kaldes også flue-toksinet (samt ß-exotoksin eller thuringiensin) og er et varmestabilt toksin, der blandt andet er giftigt overfor insekter fra ordnerne Lepidoptera, Diptera og Coleoptera. Dette indebærer, at det også er giftigt overfor fluelarver, og et assay, der involverer husfluer (Musca domestica) bruges til at screene for tilstedeværelsen af dette toksin. Toksinet er en nu-kleotid-ATP-analog, der dannes i bakteriens vegetative vækstfase, og virker ved at inhibere RNA-polymerase, idet beta-exotoksinet her fungerer som kompetitivt analog til ATP (Melin and Cozzi 1989). I subletale doser har det vist sig at fremkalde misdannelser på insekterne, men er ikke fundet at være DNA-skadende (Carlberg et al. 1995; Linnainmaa et al. 1977). Udover at være giftigt overfor insekter, er det også giftigt overfor pattedyr og det er derfor et myndighedskrav i USA, Canada og Europa, at B. thuringiensis-baserede biopesticider ikke må indeholde beta-exotoksiner. En enkelt refe-rence angiver dog, at beta-exotoksiner deaktiveres i mammale systemer ved kombinationen af lav pH og tilstedeværelsen af phosphatase (Mersie and Singh 1989). Beta-exotoksiner findes ofte i naturlige isolater, i mange tilfæl-de mere end halvdelen af de fundne stammer (Perani et al. 1998), og er i visse tilfælde fundet at være plasmidkodede, endda på samme plasmid, der bærer generne for delta-endotoksinerne. Det har yderligere været muligt at overføre disse plasmider mellem forskellige stammer af B. thuringiensis alene ved hjælp af naturlig konjugation (Levinson et al. 1990;Ozawa and Iwahana 1986). Der er i dag fundet to forskellige beta-exotoksiner, og selv-om man kan bruge HPLC (high-performance liquid chromatography) til at identificere disse med, benytter man det biologiske assay (med husfluela r-ver), da det er mere følsomt (Hernandez et al. 2001).

Hæmolysin BL (HBL) og Non-hæmolytisk toksin (NHE)

Der er adskillige rapporter om enterotoksiner, der oprindeligt er identific eret som virulensfaktorer i B. cereus, men som senere er fundet i B. thuringiensis (Gaviria Rivera et al. 2000; Hansen and Hendriksen 2001).

De to bedst undersøgte enterotoksiner, som har været involveret i lev-nedsmiddelforgiftninger, er hæmolysin BL (HBL) (Beecher et al. 1995b) og non-hæmolytisk enterotoksin (NHE) (Lund and Granum 1997).

Toksinet hæmolysin BL (HBL) består, ligesom det non-hæmolytiske en-terotoksin, af mindst tre komponenter, og det er vist, at alle tre proteiner skal

34

være til stede for fuld biologisk aktivitet (Beecher et al. 1995b). HBL består af bindingskomponenten B, der binder til cellen, og de to lytiske proteiner L1 og L2, som lyserer cellen. En anden model foreslår at de tre komponenter binder uafhængig til mål-celler og der dannes et kompleks, som resulterer i osmotisk lysis (Granum and Lund 1997).

Man har vist, at B. cereus NHE er involveret i diarre som følge af mad-forgiftning samt vævsødelæggende infektioner i f. eks. hornhinden (Beecher et al. 1995a; Beecher et al. 2000). NHE er for nylig blevet sekvenseret (Granum et al. 1999), og et af de tre proteiner i NHE-komplekset er identif i-ceret som værende en collagenase (Lund and Granum 1999). Samlet set er der lighed til proteinerne fra HBL, så NHE har sandsynligvis den samme virkningsmekanisme som HBL. Forgiftninger forårsaget af enterotoksiner skyldes formentlig ikke indtagelse af toksinerne, da disse inaktiveres i det sure miljø i maven, men derimod optagelse af sporer og vegetative celler, som efterfølgende spirer og gror i tyndtarmen og dér producerer enterotok-sin(er) (Granum 1994). Et endnu ikke publiceret forsøg har vist, at et kom-mercielt B. thuringiensis-baseret biopesticid er i stand til at kolonisere tar-men på kimfri (gnotobiotiske) rotter (B.L. Jacobsen, Institut for Fødevare-sikkerhed og Toksikologi, Fødevaredirektoratet).

Enterotoksin T

Et tredje enterotoksin, der er beskrevet i litteraturen, er enterotoksin T, hvis genetiske basis betegnes bceT (Agata et al. 1995a). Det klonede toksin består af et enkelt protein på 40 kDa, som er blevet sekvenseret. Det har celledræ-bende effekt på Vero-celler og er positiv i vaskulær permeabilitets forsøg, men dets rolle i levnedsmiddelforgiftninger er stadig uklar. Nyere, endnu ikke publicerede, resultater tyder på at den klonede sekvens af dette BceT gen ikke svarer til sekvensen i B. thuringiensis og B. cereus stammer (disse resultater tyder på, at der er sket en fejl i laboratoriet, der har klonet ”BceT genet”). Det er heller ikke vist, at det tilsvarende protein i B. thuringiensis og B. cereus har enterotoksisk aktivitet (B.M. Hansen, Danmarks Miljøunder-søgelser).

Endelig er der beskrevet kloning af tre nye enterotoksingener fra både B. cereus og B. thuringiensis (entFM , entS og entI) (Asano et al. 1997). Disse tre toksiner har stor lighed med hinanden og er hver på ca. 45 kDa.

35

plcR regulon

Dette regulon, koder for en regulator af ekstracellulære faktorer (et såkaldt pleiotropisk gen, dvs et gen, hvis produkt har indflydelse på flere af cellens egenskaber), og har vist sig at bidrage til virulensen af både B. cereus og B. thuringiensis i forbindelse med toksiciteten overfor insekter (Agaisse et al. 1999;Lereclus et al. 2000). Sporer med et fungerende plcR-regulon bidrog med en 10-faktor til dødeligheden af insektlarven Galleria mellonella , i for-hold til sporer uden et fungerende plcR-regulon (Salamitou et al. 2000). Yderligere bidrog et fungerende plcR-regulon væsentligt til de cytolytiske egenskaber af henholdsvis B. cereus og B. thuringiensis. Immunosupressere-de (BALB/v) mus døde alle efter inddrypning af 108 sporer i næsen. Ved anvendelse af stammer uden et fungerende plcR-regulon døde ingen eller kun få mus. Det menes, at plcR genet regulerer udtrykkelsen af blandt andet enterotoksiner, phospholipaser og andre virulensfaktorer. En ødelæggelse af plcR genet vil således forhindre udtrykkelsen af mange af disse virulensfak-torer (Gominet et al. 2001).

Thuringiolysin O

Thuringiolysin O er et cholesterol-bindende hæmolysin (også kaldet et thiol-afhængigt hæmolysin), der har vist sig at kunne lysere erytrocytter fra får. Dette vises ofte ved, at der dannes opklaringszoner omkring bakteriekoloni-erne på agarsubstratplader, der indeholder omkring 5% (v/v) fåreblod. Det er muligt at lave in vitro inaktivering af cholesterolbindende hæmolysiner ved tilsætning af cholesterol til substratet. Thiol-afhængige hæmolysiner er sand-synligvis involveret i patogeniciteten af B. thuringiensis serotyperne H34, 3a3b samt H14 (Hernandez et al. 1999).

Andre hæmolysiner

Udover førnævnte thiol-afhængige hæmolysin, findes der andre hæmolys i-ner, der ikke inhiberes af cholesterol. Et af disse, det såkaldte hæmolysin II, findes oftere i B. thuringiensis end i B. cereus. Tretten ud af fjorten under-søgte B. thuringiensis stammer producerede hæmolysin II (Budarina et al. 1994). En anden hæmolytisk faktor består af den forenede effekt af sphin-gomyelinase og phospholipase C (se disse). Disse to toksiner kaldes også samlet for cereolysin AB.

36

Forekomst af emetisk toksin hos B. thuringiensis?

Det emetiske toksin, også kaldet cereulide (Agata et al. 1995b), er kun fun-det i B. cereus, og det er uvist, hvorvidt B. thuringiensis er i stand til at dan-ne et emetisk toksin. Endnu har man ikke fundet beviser for dette, men i forbindelse med udbrud af ”emetisk syndrom” madforgiftning har man un-dersøgt fordelingen af serotyper blandt isolerede B. cereus og fundet at stør-stedelen af de isolerede stammer (63, 5%) har serotypen H-1 (Kramer and Gilbert 1989). En senere undersøgelse i Japan har bekræftet associationen mellem dannelsen af cereulide og serotypen H-1 (Agata et al. 1996). Seroty-pen H-1 findes også blandt B. thuringiensis, og det er ikke undersøgt, hvor-vidt de sero-typede stammer også kunne danne krystalinklusioner.

TOKSICITET OVERFOR VERTEBRATER (PATTEDYR/MENNESKER)

B. thuringiensis-baserede produkter har som nævnt været anvendt kommer-cielt siden 1938 (Sporeine i Frankrig) og i større skala siden begyndelsen af 1980’erne. I denne periode har der ikke været rapporteret nævneværdige komplikationer og som tidligere nævnt, er det et myndighedskrav i USA, Canada og Europa, at B. thuringiensis-baserede biopesticider ikke må inde-holde beta-exotoksiner, der som beskrevet også er giftig overfor pattedyr. De komplikationer, der har været beskrevet i relation til B. thuringiensis er få:

?? En landbrugsarbejder udviklede hornhinde-betændelse (corneal ul-cer) i et øje, efter tilfældigt at være blevet sprøjtet med et kommerci-elt B. thuringiensis produkt (Samples and Buettner 1983).

?? En anden landbrugsarbejder, der sprayede med et B. thuringiensis subsp. kurstaki-baseret produkt, udviklede hudirritation, hævelse og rødmen i forbindelse med et sprøjt i øjet. B. thuringiensis blev isole-ret fra øjet (Green et al. 1990).

?? En forsker udviklede en lokal reaktion og betændelse i en lymfekir-tel efter et nålestik i forbindelse med håndteringen af en blanding af B. thuringiensis og Acinetobacter (Warren et al. 1984). Det var kombinationen af disse mikroorganismer, der viste sig at være farlig. Hver for sig blev der ikke fundet skadelige virkninger af de enkelte mikroorganismer.

37

?? Stammer af B. thuringiensis (ikke kommerciel) er blevet isoleret fra brandsår (Damgaard et al. 1997)

?? Sårinfektion med B. thuringiensis serotype H34 (ikke kommerciel) hos en fransk soldat i Jugoslavien efter udløsning af en landmine (Hernandez et al. 1998)

?? En efterfølgende undersøgelse viste at H34 foruden at være vævs-ødelæggende også kunne føre til død hos immuno-suppresserede mus udsat for eksperimentel aerosol-eksponering med denne bakte-rie (lungeinfektion) (Hernandez et al. 1998). En kombination af in-fluenzavirus og B. thuringiensis H34 viste sig dødelig overfor mus i halvdelen af de eksponerede tilfælde (Hernandez et al. 2000).

?? En tilsvarende undersøgelse med en krystal-negativ mutant af B. thuringiensis i immuno-suppresserede (BALB/c) mus viste samme resultat. Ved fjernelse af plcR-regulon (se dette), døde kun få mus (Salamitou et al. 2000).

?? B. thuringiensis er fundet at være årsagen til et tilfælde af dødelig bovin fastitis (yverinfektion hos køer) (Gordon 1977).

?? Et overvågningsprogram i Canada viste, at blandt folk, som var be-skæftiget med at spraye med Foray 48B ved jordhøjde, var der en overhyppighed af klager over symptomer som irritation i øjne, næse, hals og svælg (Noble et al. 1992). Det var fortrinsvis folk med for-udgående helbredsproblemer, der klagede over symptomer. Det skal bemærkes, at der i denne undersøgelse ikke var skelnet mellem den aktive ingrediens (B. thuringiensis) og selve formuleringsmidlet.

?? Den medicinske praksis skelner ikke i identifikationen mellem B. thuringiensis og B. cereus i forbindelse med årsagssammenhæng og sygdomsudbrud (Shinagawa 1990). Derfor er det korrekte antal B. thuringiensis i "B. cereus" forårsagede mavetilfælde ikke kendt. Der er dog et enkelt studie, hvor B. thuringiensis var involveret i et gastroenteritis udbrud, hvor fire personer var implicerede (Jackson et al. 1995). Også i denne undersøgelse, blev bakterierne umidde lbart identificeret som B. cereus, men nogle af bakterierne blev senere fundet at være B. thuringiensis.

En undersøgelse gennemført i 1999, kunne ikke påvise arbejdsbetingede sygdomme forårsaget af B. thuringiensis, selvom der blev fundet immun-respons i landbrugsarbejdere, der var udsat for B. thuringiensis-baserede

38

biopesticider (Bernstein et al. 1999). I de forløbne år er det tætte slægtskab mellem B. thuringiensis og B. cereus blevet bekræftet og underbygget (Carlson et al. 1994;Helgason et al. 2000b;Helgason et al. 2000a; Wunschel et al. 1998). I praksis er det kun den insekt-toksiske effekt, der adskiller de to arter. Hvis et sporeholdigt B. thuringiensis-baseret produkt skal kunne påvirke kroppen alvorligt, skal udsættelsen for sporerne resultere i en ukontrolleret infektion grundet optagelsen af Bti/Btk sporer. Det vil være en yderst sjælden situation, som skulle skyldes en uheldig kombination af store sporekoncentrationer og individer med svækket eller nedsat immunforsvar (Tayabali and Seligy 2000). Fra undersøgelser med B. cereus ved man, at den infektive dosis typisk er mere end 105 CFU per gram fødevare (Rusul and Yaacob 1995). Alternativt diskuterer Hernandez et al. at landbrugsarbej-dere, der sprayer B. thuringiensis-baserede insekticider under en influenza-epidemi, muligvis kan udgøre en risikogruppe (Hernandez et al. 2000).

BACILLUS THURINGIENSIS & INFEKTIONER

B. cereus associeres med to typer fødevareforgiftninger: den ene er kende-tegnet ved opkastninger (den emetiske) og den anden, den enterotoksiske, er primært kendetegnet ved mavesmerter og vandig diarré, der typisk opstår 10-12 timer efter indtagelse af B. cereus. Symptomerne er oftest overstået in-denfor et døgn. Det emetiske sygdomsbillede skyldes et varmestabilt toksin (cereulide), hvorimod flere varmelabile enterotoksiner er beskrevet at være ansvarlige for det enterotoksiske sygdomsbillede. Forgiftninger på grund af enterotoksiner skyldes formentlig ikke indtagelse af toksinerne, da disse inaktiveres i det sure miljø i maven, men derimod indtagelse af sporer og vegetative celler, som efterfølgende spirer og gror i tyndtarmen og der pro-ducerer enterotoksin(er) (Granum 1994).

Det har vist sig, at mange B. thuringiensis-stammer producerer de samme enterotoksiner som B. cereus, og enterotoksinerne er fundet i både kommer-cielle B. thuringiensis-stammer, stammer isoleret fra fødevarer og naturligt forekommende B. thuringiensis isolater (Damgaard et al. 1996; Hansen and Hendriksen 2001; Mikami et al. 1995) (se tabel 2 for en fortegnelse over B. thuringiensis subspecies, der danner enterotoksiner). Det er derfor vigtigt at evaluere B. thuringiensis-biopesticiders evne til at producere enterotoksiner, da disse udgør en potentiel sundhedsrisiko. Det kan overvejes, hvorvidt der

39

bør stilles krav om, at kommercielle biopesticider ikke skal være i stand til at danne enterotoksiner.

40

Tabel 2 enterotoksin-gener i B. thuringiensis

Stamme HBL Kompleks NHE kompleks BceT

B.t. kurstaki HD 1 + + + B.t. kurstaki HD 73 + + + B.t. kurstaki HD 263 + + + B.t. israelensis Bta2 + + + B.t. israelensis HD 567 + + + B.t. israelensis 4Q2-72 + + + B.t. aizawai HD 131 + + + B.t. aizawai HD 137 + + + B.t. aizawai HD 11 + + + B.t. aizawai HD 112 + + + B.t. aizawai HD 283 + + + B.t. finitimus HD 3 + + - B.t. alesti HD4 + + + B.t. dendrolimus HD 7 + + + B.t. dendrolimus HD 106 + + + B.t. sotto HD 770 + + - B.t. galleriae HD 29 + + + B.t. galleriae HD 234 + + + B.t. canadensis HD 224 + - + B.t. entomocidus HD 9 + + + B.t. entomocidus HD 110 + + + B.t. entomocidus HD 198 + + + B.t. morrisoni HD 12 - + + B.t. ostriniae HD 501 + + - B.t. tolworthi HD 537 + + + B.t. tolworthi HD 125 + + + B.t. darmstadiensis HD 146 + + + B.t. darmstadiensis HD 601 + + + B.t. toumanoffi HD 201 + + + B.t. kyushuensis HD 541 - + + B.t. thompsoni HD 542 + + + B.t. pakistani HD 395 + + + B.t. indiana HD 521 + + +

41

Tabel 2 - fortsat enterotoksin-gener i B. thuringiensis

Stamme HBL Kompleks NHE kompleks BceT

B.t. dakota HD 932 + + + B.t. tohokuensis HD 866 - - - B.t. kuamotoensis HD 867 + + + B.t. tochigiensis HD 868 + + - B.t. colmeri HD 847 + + + B.t. shandogiensis HD 1012 - + + B.t. thuringiensis HD 22 + + - B.t. kenyae HD 136 + + + B.t. fukuokaensis + - + B.t. amagiensis + + + B.t. amagiensis + + + B.t. cameroun + + - B.t. seoulensis + + + B.t. andalousiensis + + + B.t. brasiliensis + + - B.t. yunnanensis + + + B.t. mexicanensis + + +

Indhold af enterotoksin gener i B. thuringiensis baseret på Gaviria Rivera et al (2000) og Hansen and Hendriksen (2001). B. cereus kan også give anledning til ikke-gastrointestinale infektioner, både lokale (oftest øjeninfektioner) og systemiske i mere følsomme personer, f.eks. immunosupprimerende patienter. Hæmolysiner, phospholipase C og formodentlig andre virulensfaktorer er ansvarlige for disse infektioner (Drobniewski 1993).

RISIKOVURDERING

Kravene til biologiske pesticider er ikke umiddelbart sammenlignelige med de kemiske sikkerhedstests som insekticider underkastes. I en sundheds-mæssig vurdering af plantebeskyttelsesmidler er det derfor på flere punkter vigtigt at skelne mellem datakrav til kemiske stoffer og mikroorganismer. Således vil visse aspekter af et mikrobiologisk plantebeskyttelsesmiddel,

42

eksempelvis infektionsevne, afvige fra undersøgelse af et kemisk stof. Om-vendt vil det være muligt at teste specifikke metabolitter på samme vis som kemiske stoffer testes. I undersøgelse af et mikrobiologisk stof er det vigtigt at inddrage viden omkring mikroorganismens naturlige værtsforhold (Jacobsen et al. 1994). Der er for nylig offentliggjort et nyt EU-direktiv (2001/36/EC 16 may 2001), vedrørende markedsføring af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler. I dette direktiv er der angivet datakrav til de mi-krobiologiske plantebeskyttelsesmidler. Vurderingen af et mikrobiologisk plantebeskyttelsesmiddel foregår typisk ved en case-by-case vurdering af det pågældende isolat, der indgår som aktivstof.

Gennem årene er der foretaget en række toksikologiske undersøgelser af B. thuringiensis herunder indgivelse via forskellige eksponeringsveje af mi-kroorganismen (McClintock et al. 1995). Endvidere har man undersøgt me-tabolitter fra B. thuringiensis eksempelvis delta-endotoksinet. Undersøgelser har fundet, at alkalisk aktiverede delta-endotoksiner fra B. thuringiensis subsp. israelensis er dødelige når de bliver injiceret i mus. Alkalisk aktivere-de delta-endotoksiner er endvidere fundet cytolytiske overfor erythrocytter fra mennesker, fibroblaster fra mus samt primær grise-lymphocyt-kulturer. Det bør dog understreges, at aktivering af delta-endotoksiner ikke kan foregå i pattedyr, da forholdene i mave-tarm-systemet ikke er alkaliske (Armstrong et al. 1985; Gill et al. 1987; Gill and Hornung 1987; Thomas and Ellar 1983).

Yderligere kan mikrobiologiske insekticider besidde evnen til at mang-foldiggøre sig og kolonisere, hvorfor også langtidsstudier af disse forhold er nødvendige.

Sluttelig benytter man ofte ligheder i kemisk struktur og andre fysisk-kemiske data til at foretage analogi-slutninger vedrørende et stofs potentielle toksicitet. De samme analogi-slutninger kan ikke anvendes indenfor mikro-organismers patogenicitet og værtsspektrum. Eksempelvis er B. thuringien-sis toksisk overfor f. eks. Lepidoptera (sommerfugle og møl), hvorimod B. anthracis er toksisk overfor drøvtyggere og mennesker (Shadduck 1983).

KARAKTERISERING & IDENTIFIKATIONSMETODER

Som tidligere nævnt, er slægtskabet mellem B. thuringiensis og B. cereus tæt. DNA og biokemiske analyser mere end antyder, at disse bakterier er en

43

og samme art (species), eftersom forskellene mellem disse er små og ude-lukkende plasmid-kodede. Delta-endotoksinerne er som nævnt plasmid-kodede, hvilket indikerer, at denne egenskab kan tabes og overføres til be-slægtede arter, inklusive B. cereus. Forskellen mellem disse arter er således stadig uklar, og er genstand for en stadig debat blandt taksonomer. Skal B. thuringiensis enten benævnes varianter eller underarter (subspecies) af B. anthracis eller af B. cereus? Fortalere for at navngive udfra B. anthracis, nævner at dette var den første Bacillus i B. cereus-familien, der blev navngi-vet og karakteriseret og således taksonomisk er stamfaderen til de øvrige medlemmer i B. cereus-familien. Alternativt foreslås B. cereus som arts-betegnelse, idet denne plasmid løse bakterie vil kunne opnå egenskaber, der karakteriserer den som thuringiensis eller anthracis ved optag af de rette plasmider.

Det har dog en rent praktisk betydning at vedligeholde B. thuringiensis som en selvstændig art, alene på baggrund af dens insekttoksiske egenska-ber.

Mikroorganismer kan identificeres på mange måder. Flere af disse base-res på nærmest retsgenetiske analysemetoder. Nedenfor er nævnt nogle af de metoder, der er blevet anvendt i forsøget på at karakterisere B. thuringiensis, B. cereus og til dels også B. anthracis.

Serotypning

Serotypning er den mest almindelige metode, der anvendes til at skelne grupper indenfor B. thuringiensis, men serovarer siger ikke nødvendigvis noget om den specifikke insekticidale effekt. I dag findes 82 serovarer, men ikke alle B. thuringiensis kan serotypes (Lecadet et al. 1999). Serotypning er baseret på en antistof-reaktion mod bakteriens flageller, hvorved en klump-ningsreaktion kan iagttages. Der findes dog B. thuringiensis, der ikke har flagel, og dermed ikke giver anledning til reaktioner (fx B. thuringiensis subsp. wuhanensis). Derudover kan antistof-flagelreaktionen kompliceres af en uafhængig klumpning af bakteriekulturen. Yderligere findes der B. ce-reus, der krydsreagerer med disse antistoffer, hvilket igen understreger det tætte slægtskab mellem disse species (Lecadet et al. 1999; Murakami et al. 1993).

44

Fag typning

Fager, eller bakteriofager, er virus, der angriber bakterier. Fager er meget specifikke med hensyn til overfladereceptorer, der kan tjene til vedhæftelses-steder (attachment sites). Det er derfor muligt at udnytte et bibliotek af fager, til at identificere bakterier indenfor f.eks. B. cereus-gruppen og opdele disse i grupper af såkaldte phagovarer (Ackermann et al. 1995). Fag-typning har været anvendt til identifikationsformål i forbindelse med udbrud af levneds-middelforgiftninger af B. cereus (Ahmed et al. 1995).

DNA analysemetoder

Ved hjælp af restriktionsensymer kan ekstraheret DNA skæres og størrelses-fraktioneres ved hjælp af agarosegelelektroforese. Dette giver ofte et karak-teristisk mønster og har blandt andet været anvendt som et led i differentie-ringen af B. anthracis fra medlemmer af B. cereus-gruppen (Henderson et al. 1994). Når man opnår et entydigt, karakteristisk mønster for et bakterieiso-lat, kaldes det ofte et DNA-fingeraftryk (DNA fingerprint).

Teknikken udbygges ved at overføre DNA-fragmenterne fra agarosegelen til en membran, hvorefter en DNA-probe hybridiserer til homologe sekven-ser, som derved identificeres. Den generelle metode blev opfundet af Southern, og kaldes derfor oftest for Southern-blot (Southern 1975). Southern-blotteknikken i forbindelse med restriktionsskæring og specifikke DNA-prober har været brugt til at udskille de enkelte medlemmer i B. ce-reus-gruppen enten alene (Miteva et al. 1991) eller i kombination med andre teknikker, som f.eks. multilokus enzym elektroforese (MEE) (Carlson et al. 1994).

Multilokus enzym elektroforese (MEE)

MEE er en teknik, hvor enzymer fra de enkelte bakterieisolater adskilles ved elektroforese på en stivelsesgel, hvorefter særlige farvereaktioner visualise-rer de enkelte specifikke enzymer. Udover således at angive funktionelle proteiner enzymatiske egenskaber, registreres også deres størrelse, hvilket kan give indirekte genetiske informationer. MEE har også været anvendt som eneste taksonomiske redskab i separeringen af B. cereus og B. thurin-giensis, herved blev de enkelte isolater inddelt i såkaldte zymovarer (Zahner

45

et al. 1989). Analyser ved hjælp af MEE har vist sig at kunne korreleres med resultater fra RAPD (se dette) (Bart et al. 1998).

Ribotypning

Når der anvendes DNA-prober baseret på bakterielle ribosomale gener (f. eks. 16S rRNA) i forbindelse med restriktionsskæring og Southern-blotteknik kaldes det for ribotypning eller Restriktions Fragment-længde Polymorfisme (RFLP). Dette har blandt andet også været anvendt til at skille de enkelte medlemmer af B. cereus-gruppen (Priest et al. 1994) samt til phy-logenetisk analyse af B. thuringiensis (Joung and Cote 2001). I områderne mellem de enkelte ribosomale gener (16S og 23S rRNA) er det ofte muligt at finde variation, selv indenfor nært beslægtede arter. Det har derfor også væ-ret interessant at analysere sekvensen i disse områder, det såkaldte 16S til 23S ribosomal intergenetisk spacer. Ud fra sekvenseringen af 16S til 23S ribosomal intergenetisk spacer fra 24 B. thuringiensis stammer, blev det fundet, at B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 afveg fra de øvrige subspe-cies, men ikke nok til at designe specifikke PCR-primere til identifikation (Bourque et al. 1995). Størrelsen af 16S til 23S ribosomal intergenetisk spacer har også været brugt til identifikationsformål indenfor B. cereus-gruppen. Det var muligt at adskille B. subtilis fra B. cereus-gruppen. Inden-for gruppen gav både B. cereus, B. thuringiensis og B. anthracis identiske størrelser (Wunschel et al. 1995).

DNA-reassociering samt DNA-DNA hybridiseringseksperimenter med total genomisk DNA som probe understreger også det nære slægtskab ime l-lem de enkelte medlemmer af B. cereus-gruppen (Kaneko et al. 1978; Na-kamura 1994).

Plasmidprofiler

Alle hidtil undersøgte B. thuringiensis indeholder plasmider, ofte flere end blot krystaltoksin-plasmidet, og det er derfor muligt at bruge plasmidprof iler til identifikationsformål, og til at afgøre, hvorvidt to stammer er identiske eller ikke. Plasmider kan dog tabes og udbyttet af plasmider i forbindelse med plasmidoprensning kan variere (Afkhami et al. 1993; Kamdar and Jaya-raman 1983; Rady and Younis 1996; Ward and Ellar 1983).

46

Substratforgæring

Udover MME, er det også muligt at identificere de forskellige substrater mikroorganismer kan udnytte, og på den måde forsøge at differentiere disse. I en større undersøgelse, der involverede 137 B. thuringiensis stammer og 35 B. cereus stammer, blev disse undersøgt for substratforgæring af 47 forske l-lige substrater samt produktion af ekstracellulære enzymer m.m. Det var ikke muligt at skelne mellem B. thuringiensis og B. cereus bortset fra dan-nelsen af de parasporale krystaller (delta-endotoksiner) (Baumann et al. 1984).

PCR-baseret identifikation

Ved hjælp af PCR (polymerase chain reaction), er det muligt at opformere specifikke områder af en organismes DNA i så store mængder, at det kan analyseres ved elektroforese teknikker. På basis af kendte DNA sekvenser er det muligt at lave primere, der passer til f.eks. et enkelt delta-endotoksin-gen. Herved er det muligt at skelne B. thuringiensis fra B. cereus, da delta-endotoksinerne er det eneste anerkendte karakteristikum, der adskiller disse to bakteriearter. Metoder baseret på PCR ved hjælp af mere eller mindre specifikke Cry-primere har været anvendt til screenings- og identifikations-formål (Daffonchio et al. 1999; Iriarte et al. 2000; Ogunjimi et al. 2000; Shevelev et al. 1998).

PCR med primere for rRNA 16S-23S spacer regionen (Jensen et al. 1993) har været anvendt til at diskriminere mellem stammer af B. cereus-gruppen og andre Bacillus arter. Daffonchio et al. (Daffonchio et al. 1998) har vist, at medlemmer af B. cereus-gruppen giver fire distinkte bånd, som er forskellige fra de størrelser, der opnås fra andre arter af Bacillus-slægten. Denne metode udmærker sig ved at være hurtigere end de konventionelle metoder, såsom dyrkning, biokemisk identifikation og serotypning.

47

RAPD

I forbindelse med PCR analyser for specifikke gener anvendes, som nævnt, specifikke primere. Hvis der i stedet anvendes korte (8-12 baser lange) pri-mere vil der være tilfældige homologier til disse rundt omkring i genomet. Ved PCR med sådanne korte primere fås ved en efterfølgende agarosegele-lektroforese et mønster, der er karakteristisk for det enkelte isolat. Denne teknik kaldes for RAPD (Randomly amplified polymophic DNA), og er blevet anvendt til B. cereus-differentiering (Brousseau et al. 1993) og B. thuringiensis differentiering (Ankarloo et al. 2000; Hansen et al. 1998).

Mikroskopering

Som tidligere nævnt er det kun tilstedeværelsen af delta-endo-toksiner, der adskiller B. thuringi-ensis fra B. cereus, og det er der-for muligt at iagttage disse pa-rasporale inklusioner ved såkaldt fasekontrast-mikroskopering. De stærkest lysende områder er spo-ren, og et mindre intenst område karakteriserer krystaltoksinet (se fig. 7)

Andre analysemetoder

Gas Chromatography – Mass Sepctrometry (GC-MS) har været anvendt til analyse af fedtsyre-sammensætningen for at differentiere forskellige B. thu-ringiensis isolater. Det viste sig muligt at udskille en af seks isolater ved denne metode (Esnard et al. 1994). Også kulhydrat-sammensætningen er blevet analyseret ved hjælp af GC-MS. Her var det muligt at differentiere mellem B. anthracis og de øvrige medlemmer af B. cereus-gruppen. Det var i dette tilfælde ikke muligt at adskille B. cereus og B. thuringiensis (Wunschel et al. 1995).

Figur 7. Fasekontrast-mikros kopi af B. thuringiensis med markering af spore og krystal krystal.

krystal

spore

48

Specifikke substrater og sporeberigelse

Naturlige isolater af B. thuringiensis er ligesom B. cereus resistente overfor polymoxin, hvilket blandt andet udnyttes med et B. cereus selektivt substrat kaldet MYP-substrat (mannitol-egg yolk-polymyxin). Her er, foruden andre kulstofkilder, også tilsat mannitol. B. thuringiensis og B. cereus er ikke mannitol-forgærende, og kolonierne giver derfor ikke anledning til en pH-ændring som følge af mannitol-forgæring. Andre mannitol-positive stammer vil ved forgæring af mannitol ændre pH-værdien omkring kolonien, hvilket giver anledning til en farveændring. Æggeblomme (egg yolk) i substratet giver udfældningszoner, der er udtryk for lichitinase, hvilket igen er specifikt for B. thuringiensis og B. cereus. Sluttelig er B. thuringiensis og B. cereus resistente overfor polymyxin, hvilket udnyttes ved tilsætning af dette til sub-stratet. Udover disse karakteristika, har man fundet, at mange B. cereus og B. thuringiensis sporer ikke kan spire (germinere), hvis der er 0, 25 M Natri-umacetat tilstede i vækstmediet (Travers et al. 1987). Det er således muligt at berige en prøve for B. cereus/B. thuringiensis sporer ved at lade andre mikroorganismer spire i et rigt substrat med 0, 25 M Natriumacetat, hvoref-ter der plades ud på ovennævnte selektive substrat. Variationer af disse me-toder har været anvendt i forbindelse med screening efter B. thuringiensis stammer (Martin and Travers 1989).

49

FORSØGSRESULTATER

Projektet forløb i to faser, hvor fase 1 blev anvendt som et pilot-projekt for fase 2. Formålet med dette kapitel er at afrapportere resultaterne af fase 1 af samarbejdsprojektet mellem Arbejds- og Miljømedicinsk Klinik ved Odense Universitetshospital, Institut for Fødevaresikkerhed og Toksikologi ved Fø-devaredirektoratet og Arbejdsmiljøinstituttet. Fase 1 blev udført i perioden august-december 2000, og fase 2 blev udført i perioden februar-juni, 2001.

FORMÅL – FASE 1

Det overordnede formål med projektet er at belyse, om der er sammenhæng mellem eksponering, helbredseffekter og tilstedeværelse af B. thuringiensis i fæces. Formålet med fase 1 af projektet er primært at vurdere de anvendte metoders egnethed og undersøge, i hvilket omfang det er muligt at finde bakterier af B. cereus-gruppen i fæcesprøver fra gartneriarbejdere og evt. karakterisere disse isolater.

METODER

På Fyn (Arbejds- og Miljømedicinsk Klinik, Odense) er der fra slutningen af 1998 foregået en større undersøgelse af sundhedsmæssige problemer ved brug af biologiske bekæmpelsesmidler i væksthuse (BioGart-projektet, se bilag 1). Formålet med denne undersøgelse er at belyse, om brugen af mikro-biologiske bekæmpelsesmidler i væksthuse har betydning for udvikling af allergi eller astma hos gartneriansatte. Undersøgelsen består af både hel-bredsundersøgelse (primært med fokus på luftvejslidelser) og spørgeskema-undersøgelse af de ansatte (kohorte: 350 eksponerede gartneriansatte og 150 ikke-eksponerede). Resultaterne af Biogart-projektet afrapporteres separat under Det Strategiske Miljøforskningsprogram. Personer til afgivelse af fæ-cesprøver blev udvalgt fra denne kohorte som beskrevet i bilag 2.

50

Der blev udviklet en procedure til at isolere B. cereus-lignende bakterie-stammer fra human fæces, samt molekylærbiologiske teknikker til at identi-ficere og karakterisere disse. Der blev indsamlet prøver fra syv eksponerede og fem ikke-eksponerede væksthusarbejdere. De tolv personer blev, inden forsøgets start, informeret om forsøgets indhold (se bilag 3) samt metode til afgivelse af fæcesprøver (se bilag 4), og forsøget godkendt af den regionale videnskabsetiske komite for Fyn og Vejle amter.

Isolering af B.cereus-lignende bakterier fra fæces

De indsendte fæcesprøver blev behandlet og nedfrosset som beskrevet i bilag 5. B. thuringiensis/B. cereus blev isoleret fra fæces ved hjælp af metoden beskrevet i bilag 7. For at kontrollere genfindings-effektiviteten blev B. ce-reus-fri fæces inokuleret med et kendt antal B. thuringiensis-bakterier. For at undersøge, hvorvidt B. thuringiensis forekom i fæces som sporer, blev 1 ml af 10 x fortynding varmebehandlet (80°C i 15 min), hvorefter den blev udpladet på B. cereus specifik agar (se bilag 7).

Isolater fra kommercielle B. thuringiensis-produkter og isolater fra fæ-cesprøver er listet i tabel 3. I denne del af projektet anvendte de involverede gartnerier blandt andet det B. thuringiensis subsp. kurstaki-baserede bio-pesticid Dipel®.

Plasmidoprensninger

Plasmidoprensninger blev gennemført som beskrevet i bilagene 10 og 11.

Tabel 3 – isolater fra kommercielle biopesticider og fra fæcesprøver (fase1)

Stamme Species Kilde Enterotoxin entFM

Enterotoxin HBL Enterotoxin NHE B. cereus RAPD

endotoxins

AND2019 Btk Dipel®. + +++ ++ 1 cry1

AND2025 Btk Dipel®. + +++ ++ 1 cry1

902-6 fæces + +++ ++ 1 cry1

AW113 Btk HD1 BGSC ND ND ++ 1 cry1

AND879 Bc 879 ATCC10987 - - +++ 1 ND

AND880 Bc 880 ATCC10876 + ++ ++ 1 ND

AND882 Bc 882 ATCC14579 + ++ ++ 1 ND

AND2020 Bti Vectobac® + +++ ++ 2 cry11, cyt

AND2021 Bti Bactimos® + +++ ++ 2 cry11, cyt

AND657 Bti 4Q2 BGSC + +++ +++ 2 cry11, cyt

902-3, 902-4,

902-7, 902-8

4 isolater fra fæces-prøver

- - - 3 -

913-1 til 913-19 19 isolater fra fæces-prøver

- + ++ 4 -

ATTC – American Type Culture Collection, BGSC – Bacillus Genetic Stock Centr

52

Verifikation af taksonomisk tilhørsforhold

For at bestemme hvorvidt stammerne tilhører B. cereus-gruppen, blev isola-terne dyrket på agarplader, og undersøgt ved hjælp af fasekontrastmikrosko-pi for udseende og tilstedeværelse af sporer og krystaller (for B. thuringinsis) – se foto på figur 7. PCR med primere for rRNA 16S-23S spacer regionen (Jensen et al. 1993) blev anvendt til at udskille stammer af B. cereus-gruppen fra andre Bacillus arter (se bilag 8). Som kontroller medtages refe-rencestammer samt B. thuringiensis isoleret fra de kommercielle produkter. Ved hjælp af denne metode kan isolaterne placeres entydigt i B. cereus gruppen.

Krystaltoksiner

Foruden fasekontrastmikroskopisk analyse for tilstedeværelsen af intracellu-lære krystaller, blev eventuelle cry-gener opformeret ved PCR (bilag 8). Specifikke primere til detektion af følgende cry-gener blev udvalgt: cry1, som primært findes i B. thuringiensis subsp. kurstaki, cry3 og cry8, som koder for insekttoksiner, der er toksiske overfor insekter indenfor ordenen Coleoptera. Cry11, som primært findes i B. thuringiensis subsp. israelensis. Endvidere blev medtaget primere for cyt-toksiner samt primere mod gener for toksiner overfor nematoder (Bravo et al. 1998; Ceron et al. 1994). Meto-den blev evalueret på referencestammer med kendte toksingener. Som kon-troller medtages disse referencestammer samt isolaterne fra de kommercielle produkter.

Enterotoksiner

Til identifikation af gener for enterotoksiner blev PCR-teknikken benyttet. Følgende enterotoksin-primere til PCR screening blev benyttet: Primer-par til detektion af hblA-genet, der koder for B-komponenten fra HBL, bceT-primer par til detektion af enterotoksin T (Wencheng 1998), primere til de-tektion af entFM -lignende enterotoksin-gener (Asano et al. 1997). Endvidere har vi afprøvet hblA og bceT primer fra (Mantynen and Lindstrom 1998). Endelig blev tilstedeværelsen af entFM genet undersøgt ved hjælp af TY-primerne, der er beskrevet i bilag 8. Genet entFM, skulle ifølge Asano et al. kode for yderligere et enterotoksin (Asano et al. 1997).

53

PCR-screening for enterotoksin-gener siger ikke noget om, hvorvidt generne reelt bliver udtrykt, så derfor blev der yderligere benyttet to kommercielle immunoassays, som detekterer produktionen af enterotoksiner: the Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin (BDE) Visual Immunoassay (Tecra Diagnostics, Reading, UK) og the Bacillus cereus Enterotoxin-Reversed Passive Latex Agglutination kit (Oxoid, Unipath Ltd, Hamshire, UK). Tecra-kittet detekte-rer et 45 kDa protein fra det non-hæmolytiske enterotoksin (NHE) (Lund and Granum 1996) , hvorimod Oxoid kittet detekterer L2 komponenten fra hæmo-lysin BL (HBL) (Beecher and Wong 1994). Supernatant fra eksponentielt voksende kulturer blev underkastet de to enterotoksin immunoassays efter producenternes anvisninger.

Erfaring fra dyreforsøg viser, at kits er vanskelige at anvende direkte på fæcesprøver. (B.L. Jacobsen, Institut for Fødevaresikkerhed og Toksikologi, Fødevaredirektoratet).

Slægtskab med kommercielle stammer

For at sammenligne de fundne isolater med de anvendte kommercielle stammer blev RAPD (random amplified polymorphic DNA) teknikken an-vendt hvor der benyttes tilfældige primere til PCR. RAPD er, som tidligere nævnt, en hurtig og informativ metode, der giver et fingeraftryk af komplek-se genomer uden nødvendigvis at have kendskab til sekvensen.

Til RAPD anvendtes OPA-02, -03, -06 og -09 primere fra Operon Tech-nologies og 0940-12 (Brousseau et al. 1993), som er oligonukleotider prime-re og tidligere brugt af andre til at klassificere B. thuringiensis stammer (Hansen et al. 1998). PCR med OPA-02 giver de samme to bånd for alle de undersøgte B. thuringiensis og B. cereus referencestammer. PCR med OPA-09 giver det største antal bånd og kan diskriminere mellem B. thuringiensis og B. cereus stammer og mellem subsp. kurstaki og subsp. israelensis. Et sammenfald af RAPD-mønstre med tre eller flere primere vil være en stærk indikation for, at den fundne bakterie i fæces er identisk med en kommerciel stamme. Ved gentagne forsøg, viste der sig variation i resultaterne indenfor den enkelte stamme, hvilket kunne skyldes forskelle i kvaliteten af det op-rensede DNA, der blev brugt som template.

54

RESULTATER – FASE 1

Ud af de tolv forsøgspersoner, blev der fundet B. cereus-lignende bakterier i fæces fra to personer. Der blev udvalgt i alt 24 B. cereus-lignende isolater fra disse to fæcesprøver til nærmere karakterisering. Efter at analyserne var gennemført, viste det sig, at begge personer var med i gruppen af biopesti-cid-eksponerede forsøgspersoner med maveproblemer.

METODEUDVIKLING

Genfindingsprocenter

For at kontrollere genfindings-effektiviteten blev B. cereus-fri fæces inoku-leret med et kendt antal B. thuringiensis-bakterier. Det blev fundet, at mere end 80% af de tilsatte bakterier kunne genfindes efter fæces havde været opbevaret ved –80°C i ca. seks uger. Tilsvarende blev der fundet, at genfin-dingsprocenten uden mellemliggende nedfrysning var omkring 90%.

De forskellige molekylærbiologiske-teknikker blev afprøvet på kendte re-ferencestammer, samt isolater fra de tre kommercielle produkter. Forskellige parametre blev optimeret og teknikkernes reproducerbarhed blev verificeret.

Taksonomi og krystaltoksiner

De 24 isolater blev mikroskoperet, og i et af isolaterne (902-6) samt i tre isolater fra kommercielle produkter blev der fundet entydige intracellulære inklusioner karakteristiske for B. thuringiensis. PCR med primere for 16S-23S rRNA spacer regionen viste, at alle isolaterne samt de tre isolater fra de kommercielle produkter alle tilhører B. cereus-gruppen.

Samtlige isolater blev analyseret for tilstedeværelsen af gener som koder for insekttoksiner. Forinden var metoden blev evalueret på referencestammer med kendte toksingener og fundet brugbar til identifikation. Kun det før-nævnte isolat (902-6) viste sig at indeholde insekttoksin-kodende gener. Reference-stammer og isolaterne fra de kommercielle produkter, som inde-holdt gener for insekt-toksiner var naturligvis positive for de respektive in-sekttoksin-gener. De to kommercielle præparater (Bactimos? og Vectobac? ), der indeholder B. thuringiensis subsp. israelensis som den aktive kompo-

55

nent, er positive for cyt og cry11, som forventet. Ligeledes er B. thuringien-sis subsp. kurstaki-stammen, isoleret fra Dipel? , positiv for cry1.

Enterotoksiner

Alle isolaterne blev undersøgt for tilstedevæ-relsen af gener for de tre nævnte entero-toksiner, der alle er beskrevet som værende af betydning for evnen til at forårsage gastroen-teritis. Samtlige isolater indeholdt mindst ét af disse enterotoksin-gener og som den eneste af isolaterne fra fæcesprøverne indeholdte isola-tet 902-6 alle tre. Isolaterne fra de kommerci-elle produkter Dipel® , Bactimos® og Vecto-bac® indeholdt også generne for alle tre ente-rotoksiner.

Primere til detektion af hblA og bceT som oplyst af Mantynen (Mantynen and Lindstrom 1998) viste sig at være uegnede, idet bceT primer-parret amplificerer i samme retning, og giver dermed ikke anledning til noget pro-dukt (er enten fejlagtigt designet eller fejlag-tigt beskrevet i artiklen), og hblA primer-parret giver varierende resultater.

Figur 8. Agarosegel-elektro-forese af B. thuringiensissubsp. kurstaki HD-1 plasmider fra en offentlig stammesamling (bane 1), et fæces -isolat (bane 2) og fra Dipel (bane 3 og 4).

56

Slægtskab med kommercielle stammer

RAPD-analysen (bilag 8) viste, at dette isolat, 902-6, med meget stor sand-synlighed, er identisk med den bakterie (B. thuringiensis subsp. kurstaki HD1) man kan isolere fra det kommercielle insekticid Dipel®.

Endvidere kunne vi på baggrund af DNA-fingeraftryk inddele fæces-iso-laterne i 3 grupper af nært beslægtede isolater. En gruppe, bestående af 19 isolater, kom fra den samme fæcesprøve. Der blev dog fundet variationer i RAPD-analyserne, der derfor blev udbygget med en plasmidprofil (plasmid-præparation – se bilag 10 og 11). Som det fremgår af figur 8, er der en for-skel i plasmid indholdet i to isolater fra den samme batch af Dipel® (figur 8, bane 3 og 4).

Bane 1 indeholder plasmid fra en B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 fra en offentlig tilgængelig stammesamling, og bane 2 indeholder plasmid fra isolat 902-6. Som det fremgår, er plasmidprofilen af isolat 902-6 ikke identisk med de to profiler fra Dipel®.

Figur 9. Illustration af variationen af RAPD-analyserne med primer OPA3. Banerne c & d (Gel1, 2 & 3) er hhv AND508 og AND657. Banerne e & f (Gel 1, 2 & 3) er hhv. AW005 og AW113 (interne B. thuringiensis subsp kurstaki kontrolstammer). Bane g (Gel 1 & 3) samt bane l (Gel 2) er fæces -isolat 902-6. Banerne h, i & j (Gel 1 & 3) samt banerne i, j & k (Gel 2) er hhv AND2019, AND2020 og AND2021. For nærmere be-skrivelse af stammerne se Tabel 3 .

57

KONKLUSION

I denne fase af projektet har vi udviklet og evalueret metoder til at isolere og karakterisere B. cereus-lignende bakterier fra humane fæcesprøver. Endvide-re har vi fundet, at der for to ud af tolv væksthus arbejdere kunne isoleres B. cereus-lignende bakterier fra pågældendes fæces.

Et isolat blev fundet, med meget stor sandsynlighed, at være identisk med den bakteriestamme, som anvendes i insektbekæmpelsesmidlet Dipel® , i fæcesprøver fra en væksthusarbejder. Dette isolat har med stor sandsynlig-hed evnen til at forårsage maveproblemer, idet det viste sig, at indeholde generne for mindst tre beskrevne enterotoksiner samt at udtrykke mindst to af disse. Plasmidprofilen af isolatet er dog ikke identisk med de to profiler fra Dipel®. Dette kan skyldes, at plasmider som tidligere nævnt kan rekom-binere eller tabes og derved skabe nye plasmidprofiler. Det bør her nævnes, at forudsætningen for rekombination af plasmider er, at sporerne har spiret og vokset vegetativt. Hvorvidt dette er sket i laboratoriet eller i forbindelse med passagen i mave-tarmkanalen er ikke klarlagt, og kræver uderligere undersøgelser.

Endvidere fandt vi, at RAPD – i vores hænder – ikke gav reproducerbare resultater, hvorfor denne metode ikke vil blive anvendt i anden fase af pro-jektet.

Den person, i hvis fæces isolatet blev fundet, oplyser at have arbejdet med Dipel® inden for 3-4 uger før prøvetagningen. Dette kan muligvis for-klares ved kolonisering eller mere sandsynligt en anden eksponering. Dette fænomen vil ikke blive analyseret yderligere i denne rapport, men der vil efterfølgende blive udført yderligere analyser for at belyse dette.

58

59

FASE 2

Som tidligere nævnt, forløb projektet i to faser, hvor fase 1 blev anvendt som et pilot-projekt for fase 2. Formålet med dette kapitel er at afrapportere resul-taterne af anden del af samarbejdsprojektet, der blev gennemført i perioden februar-juni 2001.

FORMÅL – FASE 2

Det er formålet at belyse, hvorvidt der er sammenhæng mellem eksponering, helbredseffekter og tilstedeværelse af B. thuringiensis i fæces. Ved at under-søge fæcesprøver fra tyve biopesticid-eksponerede personer med mavesymp-tomer og sammenholde dette med helbredsoplysninger, arbejdsproces samt biomoniteringsdata, søges en eventuel sammenhæng belyst.

METODE

Metoderne fra fase 1 tages i anvendelse til isolering og karakterisering af B. cereus-lignende bakterier fra fæcesprøverne. I forbin-delse med PCR-screening for virulensfaktorer, udbygges disse med primere rettet mod sphin-gomyelinase, phospholipase C samt nheAI (se sidste tabel i bilag 8). I denne del af projektet anvendte de involverede gartnerier B. thurin-giensis subsp. israelensis-baserede bio-pesticider, Vectobac® eller Bactimos®. De tyve gartneriarbejdere udstyres med person-båret udstyr, der ved hjælp af filterkassetter opsamler luftbårne mikroorganismer i ind-åndingszonen (se figur 10). Filtrene vaskes som beskrevet i bilag 12, og bakterierne fra disse karakteriseres ligeledes efter metoderne

Figur 10. Foto af biomoniteringsapparat, med bæresele og sampleren i indåndingszonen. Pumpe bæres i bælte på ryggen.

60

der er gennemprøvet og beskrevet i fase 1. Inden forsøgets start blev de tyve forsøgspersoner informeret om for-

søgets indhold (se bilag 3), og forsøget blev godkendt af den regionale vi-denskabsetiske komite for Fyn og Vejle amter.

Hvor det var muligt, blev der opsamlet ti B. cereus-lignende bakterier fra hver biomonitering; fem fra filteret og fem fra den såkaldte foam-plug (se billede af IOM-sampleren, figur 10). I forbindelse med valget af sampler til biomonitering, var det ikke kritisk at anvende en sampler, der er designet til at opsamle levedygtige celler uden samtidig at udtørre eller rent mekanisk slide på cellerne (Jensen et al. 1992). Dette skyldes, at Bacillus-sporer er meget hårdføre, jævnfør tidligere beskrivelse. Disse bakterier blev karakteri-seret på samme måde som fæces-isolaterne:

?? taksonomisk ved vækst på MYP-agar og koloni-morfologi ?? mikroskopering efter intracellulære krystal-inklusioner ?? plasmidprofiler ?? PCR med primere for rRNA 16S-23S spacer regionen ?? PCR med specifikke primere for et udvalg af cry-gener ?? PCR med primere for enterotoksin-genet hblA, der koder for B-

komponenten fra HBL, mod sphingomyelinase (Hsieh et al. 1999), phospholipase C (GenBank Accession nr. X12854), nheA-genet fra NHE-komplekset (GenBank accession nr. Y19005) samt primere mod BceT-genet.

?? detektion af dannede enterotoksiner ved hjælp af kommercielle kits (Tecra & Oxoid), som beskrevet i afsnittet om enterotoksiner i fase 1.

RAPD blev, som tidligere nævnt, ikke anvendt i denne fase af projektet, idet erfaringen fra fase 1 af projektet viste, at plasmidprofiler er mere reprodu-cerbare. De immunologiske assays til detektion af enterotoksiner (Tecra og Oxoid) blev kun anvendt til fæces-isolaterne, men ikke til de ca. 200 isolater fra biomoniteringen.

Isolering af B. cereus-lignende bakterier fra luft

Samtlige tyve gartneriarbejdere blev udstyret med en IOM-biosampler med tilhørende pumpe (se figur 9), og der blev moniteret i løbet af en arbejdsdag. Der blev benyttet filtre med en porestørrelse på 4µm, og en luftgennem-strømning på 2, 0 l/min. IOM sampleren blev forsynet med et forfilter, en

61

såkaldt foam-plug, der også blev brugt til opsamling af partikler. Filtrene blev efter sampling bragt til laboratoriet samme dag, hvor afvaskning af mikroorganismer fandt sted (se bilag 12 for metodebeskrivelse). Sampleren kan ses afbildet på figur 10.

Personernes arbejdsprocesser blev beskrevet, og samtidigt blev de bedt om at opgøre selvoplevede mavesymptomer dagen før moniteringen, på selve da-gen, og dagen efter (se spørgeskema; bilag 6).

RESULTATER – FASE 2

Af de tyve forsøgspersoner, blev der fundet B. cereus-lignende bakterier i fæces fra otte personer (mellem en og syv CFU per mg fæces) Der blev iso-leret i alt 29 B. cereus-lignende isolater fra disse til nærmere karakterisering. Resultaterne af screening for tilstedeværelse af enterotoksin-gener og cry-gener fremgår af tabel 3. Isolater fra fæcesprøver og filtre er listet i tabel 4. I tabellen er også arbejds-processerne beskrevet samt selvoplevede mavesymptomer før, under og efter moniteringen.

Figur 11. Tegning af biomoniterings -apparat. Prøver til bakterieiden-tifikation blev isoleret fra filter og den såkaldte ”foam plug” (et grovfi l-ter, der optager større partikler).

62

Ved mikroskoperingen fandtes inklusioner i samtlige fæces-isolater med undtagelse af to fra samme person. Disse to isolater, der i øvrigt adskilte sig morfologisk (koloni-udseende) fra de øvrige, gav kun signal med primere for rRNA 16S-23S spacer regionen, hvor de udviste samme karakteristiske mønster som B. cereus/B. thuringiensis kontrol-stammerne og de øvrige fæces-isolater (Daffonchio et al. 1998). Alle øvrige gav alle produkt med bceT-primerne og hblA-primerne.

Tabel 3 karakterisering af fæces-isolater

navn/løbenr. cry11ab cytab hblA Oxiod +

PCR

bceT Enterotoksin NHE Tecra + PCR (nheA)

phospho-lipase C

sphingo-myelinase

Vectobac® + + + + + + - Bactimos® + + + + + + - 457-1 + + + + + + - 457-2 + + + + + + - 457-3 + + + + + + - 457-4 + + + + + + - 457-5 + + + + + + - 457-6 + + + + + + - 457-7 + + + + + + - 302-1 + + + + + + - 302-2 + + + + + + - 302-3 + + + + + + - 302-4 + + + + + + - 302-5 - - + + + + - 302-6 + + + + + + - 171-1 + + + + + + + 171-2 + + + + + + - 171-3 + + + + + + + 171-4 + + + + + + - 171-5 + + + + + + - 421-1 + + + + + + - 421-2 + + + + + + - 421-3 - - - - + + + 421-4 - - - - + + + 459-1 + + + + + + - 459-2 + + + + + + - 459-3 + + + + + + - 573-1 + + + + + + + 573-2 + + + + + + + 507-1 + + + + + + + 244-1 + + + + + + -

Tabel 4 Resultater af biomonitering, spørgeskema samt arbejdsfunktionsbeskrivelse

løbenr arbejdsfunktion/beskrivelse CFU* (svampe)

CFU (bakterier)

CFU (Bacillus)

CFU (fæces)

symptomer før symptomer på dagen

symptomer dagen efter

171 Vander med VectoBac/blander 2, 1E5 6, 0E3

3, 4E5 2, 1E6

8, 5E3 6, 5E3

5

166 pakker/binder op 5, 5E4 6, 0E3

9, 8E3 7, 0E4

0 8, 0E3

507 pakker/binder op 2, 5E4 8, 3E3

0 3, 5E3

0 0

1 + + +

Blindprøve 2, 5E3 1, 6E4 0 565 vander med VectoBac m.m. 1, 0E4

2, 0E3 2, 3E4 1, 3E5

2, 3E4 2, 7E4

302 pakker (arbejder i Vectobac -sprøjtet område – sprøjtet dagen før)

1, 8E4 5, 0E3

1, 9E4 2, 2E4

1, 9E4 2, 2E4

6

blindprøve <1, 0E3 2, 5E4 0 410 brækker kaktus ned 0

1, 1E4 4, 0E3 6, 1E4

<1, 0E3 1, 9E4

+

412 stikker kaktus 5, 5E3 9, 0E3

1, 4E4 2, 9E4

2, 4E4 8, 3E3

+ + +

413 stiklinger <1, 0E3 <1, 0E3

7, 0E3 6, 0E3

1, 0E3 <1, 0E3

+ + +

Tabel 4 – fortsat Resultater af biomonitering, spørgeskema samt arbejdsfunktionsbeskrivelse

løbenr arbejdsfunktion/beskrivelse CFU (svampe)

CFU (bakterier)

CFU (Bacillus)

CFU (fæces)

symptomer før symptomer på dagen

symptomer dagen efter

419 deler stiklinger/brækker <1, 0E3 1, 0E3

3, 0E3 1, 7E4

3, 5E3 <1, 0E3

+ + +

421 Vander med VectoBac + diverse funktioner

1, 0E3 1, 0E3

3, 6E4 3, 0E4

4, 0E4 5, 5E3

4 + + +

429 klipper/flytter planter 3, 3E4 3, 9E4

4, 0E3 5, 0E3

<1, 0E3 <1, 0E3

+ + +

457 vander/blander VectoBac, samt med nematoder (Nemasys®)

3, 3E4 <1, 0E3

5, 6E4 1, 5E4

1, 1E4 2, 2E4

7

459 mange forskellige funktioner (van-der, flytter, sprøjter)

3, 0E4 3, 8E4

6, 8E4 1, 3E4

2, 5E4 1, 9E4

3

223

stiklinger 1, 1E4 1, 8E4

0 2, 5E4

0 5, 3E3

blindprøve 1, 0E3 <1, 0E3 0

573 klipper, flytter 5, 6E4 3, 8E3

2, 0E3 7, 1E4

5, 8E3 0

2 + + +

blindprøve 1, 0E3 0 0 526

spreder biologisk bekæmpelse –

(Bactimos) 4, 0E5 1, 4E4

1, 5E5 8, 7E4

1, 5E5 1, 4E4

Tabel 4 – fortsat Resultater af biomonitering, spørgeskema samt arbejdsfunktionsbeskrivelse

løbenr arbejdsfunktion/beskrivelse CFU (svampe)

CFU (bakterier)

CFU (Bacillus)

CFU (fæces)

symptomer før symptomer på dagen

symptomer dagen efter

244

arbejder i hele gartneriet + med biologisk bekæmpelse

1, 5E6 1, 4E5

1, 1E4 8, 1E4

1, 5E3 2, 5E3

1

246

pakker 2, 1E5 1, 1E5

<1, 0E3 2, 7E4

<1, 0E3 2, 5E3

525

klipper+pakker roser 1, 0E7 7, 9E5

1, 2E4 1, 6E4

2, 0E3 2, 5E3

524

klipper+pakker roser 3, 3E4 9, 3E4

7, 0E3 4, 0E4

0 1, 6E4

*) De to rækker CFU-data udfor hvert løbenr. repræsenterer hhv filter og ”foam plug” (se beskrivelse af IOM-sampler fig. 10)

67

Med forbehold for det lille prøveantal (20 personer), er der gennemført en ? 2 (chi i anden) test. Flere parametre er afprøvet i forbindelse med fund af B. thuringiensis i fæces, men der er ikke fundet nogen sammenhæng (blandt andet selvoplevede mave-problemer, Bacillus CFU fra foam-plugs, total CFU). Kun nedenstående to relationer gav en signif ikans med en p-værdi på 0,05, hvilket betyder, at der er 95% sandsynlighed for at sammenhængen mellem f. eks. arbejdsfunktion og fund af B. thuringiensis i fæces ikke er tilfældig. Tilsvarende ser det ud til, at en simpel monitering med opsamling på filter og efterfølgende optælling af B. cereus-lignende bakterier også kan give en ide om, hvorvidt den eksponerede person kan have B. cereus-lignende bakterier i fæces (findes der mere end 3x103 B. cereus-lignende bakterier på filtret, er der 95% sandsynlighed for at finde Bacillus i fæces). arbejdsfunktion Bt i fæces ingen Bt i

fæces Filter Bt i fæces ingen Bt i

fæces Sprayer/vander med B. thuringiensis

5 2 Høj Bacillus CFU

(>3x103) 6 3

andre arbejds-processer

3 10 Lav Bacillus CFU

(<3x103) 2 9

?2 = 4.4322 p er mindre end eller lig med 0.05. Fordelingen er signifikant.

?2 = 4, 8484 p er mindre end eller lig med 0.05. Fordelingen er signifikant.

68

69

DISKUSSION & KONKLUSION

Naturlig forekomst af B. cereus

Prævalensen af naturlig forekomst af B. cereus hos raske mennesker er 8-14% og af forbigående natur (Ghosh 1978;Yea et al. 1994). Desuden for-modes forekomsten af B. cereus, i visse tilfælde, at reflektere indtagelse med føden og er således ofte af forbigående natur (Turnbull and Kramer 1985).

Eksponeringsvej

Det er sandsynligt, at en del af bakterierne som personerne udsættes for via luften, vil være at finde i mave-tarmkanalen. Her vil de typisk finde vej via ophostning af slim fra luftveje. Det er en problemstilling som tidligere har været diskuteret i forbindelse med andre bakterier (George et al. 1991).

Infektiv dosis/symptomer fra mave-tarmkanalen

At B. thuringiensis fra kommercielle biopesticider indeholder gener for ente-rotoksiner, indikerer at disse biopesticider udgør en potentiel sundhedsrisiko for væksthusarbejderne. I denne undersøgelse har det ikke været muligt at se en sammenhæng mellem selvoplevede maveproblemer og fundet af B. thu-ringiensis i fæces-prøver. Antagelig skal bakterien "indtages" i høje koncen-trationer for at kunne kolonisere tarmen og resultere i et mavetilfælde. Den minimale infektive dosis for B. cereus ligger i størrelsesorden 105 til 107 celler (Granum and Lund 1997) , en størrelsesorden, der kun i et enkelt til-fælde blev målt ved biomoniteringen (her blev målt 1, 5 105 ). Herudover er det vigtigt at anføre, at man ved kliniske undersøgelser af fæcesprøver anta-ger, at der for at bekræfte B. cereus som en sandsynlig årsag til sygdom skal være mindst 105 CFU/g fæces (Pedler and Orr 1990). Disse forhold kan for-klare hvorfor det ikke - i denne undersøgelse - har været muligt at korrelere symptomer med eksponering. Imidlertid kan eksponeringsvejen relateres via luftvej til fæces ved ovennævnte forklaring.

70

Anbefalinger

I forbindelse med oplæring og uddannelse af landbrugsarbejdere, gartneri-arbejdere og andre, der anvender mikrobiologiske bekæmpelsesmidler, er det anbefalelsesværdig t, at der gøres opmærksom på de potentielle problemer, der er ved anvendelsen af B. thuringiensis-baserede biopesticider specielt med henblik på det nære slægtskab med B. cereus (1999). Vi kan således konkludere, at der kan være helbredsmæssige problemer knyttet til anven-delsen af B. thuringiensis-baserede biopesticider. Dette gør sig især gælden-de, hvis brugeren eller andre, der kan komme i forbindelse med biopestic i-derne, har svækket immunforsvar (Hernandez et al. 2000). Det er derfor under alle omstændigheder anbefalelsesværdigt, at brugeren af B. thurin-giensis-baserede biopesticider anvender maske under håndtering og udbring-ning af produktet og i øvrigt iagttager almindelige hygiejniske forholdsregler (håndvask) efter udbringning.

For at nedbringe den potentielle risiko, kan det overvejes, om der bør stil-les krav til producenterne om, at kommercielle biopesticider ikke må være i stand til at producere enterotoksiner.

71

LITTERATURLISTE

1. Environmental Health Criteria, No. 217 - Bacillus thuringiensis. 217. 1999. Geneva, World Health Organization. IPCS - International Programme on Chemical Safety.

2. Ackermann, H. W., Azizbekyan, R. R., Bernier, R. L. , de Barjac, H., Saindoux, S., Valéro, J. R., and Yu, M. X. (1995). Phage typing of Bacillus subtilis and B. thuringiensis. Res Microbiol 146, 643-657.

3. Afkhami, P., Ozcengiz, G., and Alaeddinoglu, N. G. (1993). Plasmid patterns of Bacillus thuringiensis 81 and its crystal- negative mutants. Biotechnology Let-ters 15, 1247-1252.

4. Agaisse, H., Gominet, M., Okstad, O. A., Kolsto, A. B., and Lereclus, D. (1999). PlcR is a pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene ex-pression in Bacillus thuringiensis. Mol.Microbiol 32, 1043-1053.

5. Agata, N., Ohta, M., Arakawa, Y., and Mori, M. (1995a). The bceT gene of Bacillus cereus encodes an enterotoxic protein. Microbiology-Uk 141, 983-988.

6. Agata, N., Ohta, M., and Mori, M. (1996). Production of an emetic toxin, cereulide, is associated with a specific class of Bacillus cereus. Current Micro-biology 33, 67-69.

7. Agata, N., Ohta, M., Mori, M., and Isobe, M. (1995b). A novel dodecadepsipep-tide, cereulide, is an emetic toxin of Bacillus cereus. FEMS Microbiol Lett. 129, 17-20.

8. Ahmed, R., Sankar Mistry, P. , Jackson, S., Ackermann, H. W., and Kasatiya, S. S. (1995). Bacillus cereus phage typing as an epidemiological tool in outbreaks of food poisoning. Journal of Clinical Microbiology 33, 636-640.

9. Ananda Kumar, P., Sharma, R. P., and Malik, V. S. (1996). The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis. Advances in Applied Microbiology 42, 1-43.

10. Andrup, L. (1998). Conjugation in Gram-positive bacteria and kinetics of plas-mid transfer. APMIS 106:47-55, 47-55.

72

11. Andrup, L., Damgaard, J. , and Wassermann, K. (1993). Mobilization of small plasmids in Bacillus thuringiensis subsp. israelensis is accompanied by specific aggregation. Journal of Bacteriology 175, 6530-6536.

12. Andrup, L., Jørgensen, O., Wilcks, A., Smidt, L. , and Jensen, G. B. (1996). Mobilization of "non-mobilizable" plasmids by the aggregation-mediated con-jugation system of Bacillus thuringiensis. Plasmid 36, 75-85.

13. Ankarloo, J., Caugant, D. A., Hansen, B. M., Berg, A., Kolsto, A. B., and Lov-gren, A. (2000). Genome stability of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis isolates. Curr.Microbiol 2000.Jan.; 40.(1.):51.-6. 40, 51-56.

14. Armstrong, J. L., Rohrmann, G. F., and Beaudreau, G. S. (1985). Delta en-dotoxin of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Journal of Bacteriology 161, 39-46.

15. Aronson, A. I. and Shai, Y. (2001). Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action. FEMS Microbi-ology Letters 195, 1-8.

16. Asano, S.-I., Nukumizu, Y., Bando, H., Iizuka, T., and Yamamoto, T. (1997). Cloning of novel enterotoxin genes from Bacillus cereus and Bacillus thur-ingiensis. Applied and Environmental Microbiology 63, 1054-1057.

17. Ash, C., Farrow, J. A. E., Dorsch, M., Stackebrandt, E. , and Collins, M. D. (1991). Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. Interna-tional Journal of Systematic Bacteriology 41(3), 343-346.

18. Bart, A., Schuurman, I. G., Achtman, M., Caugant, D. A., Dankert, J., and van der, Ende A. (1998). Randomly amplified polymorphic DNA genotyping of se-rogroup A meningococci yields results similar to those obtained by mu ltilocus enzyme electrophoresis and reveals new genotypes . J Clin Microbiol 36, 1746-1749.

19. Baum, J. A. (1994). Tn5401, a new class II transposable ele ment from Bacillus thuringiensis. Journal of Bacteriology 176, 2835-2845.

20. Baumann, L. , Okamoto, K., Unterman, B. M., Lynch, M. J., and Baumann, P. (1984). Phenotypic characterization of Bacillus thuringiensis and Bacillus cer-eus. Journal of Invertebrate Pathology 44, 329-341.

21. Beecher, D. J., Olsen, T. W., Somers, E. B., and Wong, A. C. (2000). Evidence for contribution of tripartite hemolysin BL, phosphatidylcholine-preferring

73

phospholipase C, and collagenase to virulence of Bacillus cereus endophthalmitis . Infection and Immunity 68, 5269-5276.

22. Beecher, D. J., Pulido, J. S., Barney, N. P., and Wong, A. C. (1995a). Extracel-lular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: methods and implica-tion of involvement of hemolysin BL. Infect Immun. 63, 632-639.

23. Beecher, D. J., Schoeni, J. L., and Wong, A. C. L. (1995b). Enterotoxic activity of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infection and Immunity 63, 4423-4428.

24. Beecher, D. J. and Wong, A. C. L. (1994). Identification and analysis of the antigens detected by two commercial Bacillus cereus diarrheal enterotoxin im-munoassay kits. Applied and Environmental Microbiology 60, 4614-4616.

25. Beegle, C. C. and Yamamoto, T. (1992). History of Bacillus thuringiensis ber-liner research and development. The Canadian Entomologist 124, 587-615.

26. Benoit, T. G., Wilson, G. R., Bull, D. L., and Aronson, A. I. (1990). Plasmid -associated sensitivity of Bacillus thuringiensis to UV light. Applied and Envi-ronmental Microbiology 56, 2282-2286.

27. Bernstein, I. L. , Bernstein, J. A., Miller, M., Bernstein, D. I., Lummus, Z., Sel-grade, M. K., Doerfler, D. L., and Seligy, V. L. (1999). Immune responses in farm workers after exposure to Bacillus thuringiensis pesticides. Envi-ron.Health Perspect. 107, 575-582.

28. Bourque, S. N., Valero, J. R., Lavoie, M. C., and Levesque, R. C. (1995). Com-parative analysis of the 16s to 23s ribosomal intergenic spacer sequences of Ba-cillus thuringiensis strains and subspecies and of closely related species. Ap-plied and Environmental Microbiology 61, 1623-1626.

29. Bravo, A., Sarabia, S., Lopez, L. , Ontiveros, H., Abarca, C., Ortiz, A., Ortiz, M., Lina, L. , Villalobos, F. J., Pena, G., NunezValdez, M. E. , Soberon, M., and Quintero, R. (1998). Characterization of cry genes in a Mexican Bacillus thur-ingiensis strain collection. Applied and Environmental Microbiology 64, 4965-4972.

30. Brousseau, R., Saintonge, A., Prefontaine, G., Masson, L. , and Cabana, J. (1993). Arbitrary primer polymerase chain reaction, a powerful method to iden-tify Bacillus thuringiensis serovars and strains. Applied and Environmental Mi-crobiology 59, 114-119.

74

31. Budarina, Z. I., Sinev, M. A., Mayorov, S. G., Tomashevski, A. Y., Shmelev, I. V., and Kuzmin, N. P. (1994). Hemolysin II is more characteristic of Bacillus thuringiensis than Bacillus cereus. Archives of Microbiology 161, 252-257.

32. Carlberg, G., Tikkanen, L., and Abdel-Hameed, A. (1995). Safety testing of Bacillus thuringiensis preparations, including thuringiensin, using the Salmo-nella Assay. Journ al of Invertebrate Pathology 66, 68-71.

33. Carlson, C. R., Caugant, D. A., and Kolstø, A.-B. (1994). Genotypic diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains. Applied and Envi-ronmental Microbiology 60, 1719-1725.

34. Ceron, J., Covarrubias, L., Quintero, R., Ortiz, A., Ortiz, M., Aranda, E. , Lina, L., and Bravo, A. (1994). PCR analysis of the cryI insecticidal crystal family genes from Bacillus thuringiensis. Applied and Environmental Microbiology 60, 353-356.

35. Ceron, J., Ortiz, A., Quintero, R., Guereca, L., and Bravo, A. (1995). Specific PCR primers directed to identify cryI and cryIII genes within a Bacillus thur-ingiensis strain collection. Applied and Environmental Microbiology 61, 3826-3831.

36. Crickmore, N., Zeigler, D. R., Feitelson, J., Schnepf, E. , VanRie, J., Lereclus, D., Baum, J., and Dean, D. H. (1998). Revision of the nomenclature for the Ba-cillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol.Mol.Biol.Rev. 62, 807-813.

37. Daffonchio, D., Borin, S., Consolandi, A., Mora, D., Manachini, P. L., and Sorlini, C. (1998). 16S-23S rRNA internal transcribed spacers as molecular markers for the species of the 16S rRNA group I of the genus Bacillus. FEMS Microbiology Letters 163, 229-236.

38. Daffonchio, D., Borin, S., Consolandi, A., and Sorlini, C. (1999). Restriction site insertion-PCR (RSI-PCR) for rapid discrimination and typing of closely re-lated microbial strains. FEMS Microbiol Lett. 180, 77-83.

39. Damgaard, P. H., Granum, P. E., Bresciani, J., Torregrossa, M. V., Eilenberg, J., and Valentino, L. (1997). Characterization of Bacillus thuringiensis isolated from infections in burn wounds. FEMS Immunology and Medical Microbiology 18, 47-53.

40. Damgaard, P. H., Larsen, H. D., Hansen, B. M., Bresciani, J., and Jørgensen, K. (1996). Enterotoxin-producing strains of Bacillus thuringiensis isolated from food. Letters in Applied Microbiology 23, 146-150.

75

41. de Maagd, R. A., Bravo, A., and Crickmore, N. (2001). How Bacillus thur-ingiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world. Trends Genet. 17, 193-199.

42. Drobniewski, F. A. (1993). Bacillus cereus and related species. Clinical Micro-biology Reviews 6, 324-338.

43. Entwistle, P. F., Cory, J. S., Bailey, M. J., and Higgs, S. (1993). Bacillus thur-ingiensis, an environmental biopesticide: theory and practice. (John Wiley & Sons Ltd.: West Sussex.)

44. Esnard, J., Potter, T. L., and Zuckerman, B. M. (1994). Differentiation of six strains of Bacillus thuringiensis by hydrolyzable fatty acid composition. Jour-nal of Agriculturel and Food Chemistry 42, 1251-1255.

45. Estruch, J. J., Warren, G. W., Mullins, M. A., Nye, G. J., Craig, J. A., and Koziel, M. G. (1996). Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecti-cidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects. Proc Natl Acad Sci U S.A 93, 5389-5394.

46. Feitelson, J. (1993). The Bacillus thuringiensis family tree. In 'Advanced engi-neered pesticides'. (Ed. L. Kim.) pp. 63-71. (Marcel Dekker: New York.)

47. Gaviria Rivera, A. M., Granum, P. E., and Priest, F. G. (2000). Common occur-rence of enterotoxin genes and enterotoxicity in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiology Letters 190, 151-155.

48. George, S. E. , Kohan, M. J. , Whitehouse, D. A., Creason, J. P., Kawanishi, C. Y., Sherwood, R. L. , and Claxton, L. D. (1991). Distribution, clearance, and mortality of environmental pseudomonads in mice upon intranasal exposure. Appl Environ Microbiol 57, 2420-2425.

49. Ghosh, A. C. (1978). Prevalence of Bacillus cereus in the faeces of healthy adults. Journal of Hygiene 80, 233-236.

50. Gill, S. S. and Hornung, J. M. (1987). Cytolytic activity of Bacillus thuringien-sis proteins to insect and mammalian cell lines. J Invertebr.Pathol 50 , 16-25.

51. Gill, S. S., Singh, G. J., and Hornung, J. M. (1987). Cell membrane interaction of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis cytolytic toxins. Infect Immun. 55, 1300-1308.

76

52. Goldberg, L. H. and Margalit, J. (1977). A Bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univittatus, Aedes aegypti and Culex pipiens. Mosquito News 37, 355-358.

53. Gominet, M., Slamti, L. , Gilois, N., Rose, M. , and Lereclus, D. (2001). Oli-gopeptide permease is required for expression of the Bacillus thuringiensis plcR regulon and for virulence. Mol.Microbiol 40, 963-975.

54. González, J. M., Jr. and Carlton, B. C. (1984). A large transmissible plasmid is required for crystal toxin production in Bacillus thuringiensis variety israelen-sis. Plasmid 11, 28-38.

55. Gordon, R. E. (1977). Some taxonomic observations on the genus Bacillus. In 'Biological Regulations of Vectors: The saprophytic and aerobic bacteria and fungi'. (Ed. J. B. Briggs.) pp. 67-82. (US Dept. of Health, Education and Wel-fare: Washington.)

56. Granum, P. E. (1994). Bacillus cereus and its toxins. Journal of Applied Bacte-riology 76, S61-S66.

57. Granum, P. E. and Lund, T. (1997). Bacillus cereus and its food poisoning tox-ins. FEMS Microbiology Letters 157, 223-228.

58. Granum, P. E., O'Sullivan, K., and Lund, T. (1999). The sequence of the non-haemolytic enterotoxin operon from Bacillus cereus. FEMS Microbiol Lett. 177, 225-229.

59. Green, M., Heumann, M., Sokolow, R., Foster, L. R., Bryant, R., and Skeels, M. (1990). Public health implications of the microbial pesticide Bacillus thur-ingiensis: an epidemiological study, Oregon, 1985-86. Am J Public Health 80, 848-852.

60. Hansen, B. M., Damgaard, P. H., Eilenberg, J., and Pedersen, J. C. (1998). Mo-lecular and phenotypic characterization of Bacillus thuringiensis isolated from leaves and insects. Journal of Invertebrate Pathology 71, 106-114.

61. Hansen, B. M. and Hendriksen, N. B. (2001). Detection of enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis . Appl Environ Micro-biol. 67, 185-189.

62. Hansen, B. M., Leser, T. D., and Hendriksen, N. B. (2001). Polymerase chain reaction assay for the detection of Bacillus cereus group cells . FEMS Microbiol Lett. 202, 209-213.

77

63. Hansen, B. M. and Salamitou, S. (2000). Virulence of Bacillus thuringiensis. In 'Entomopathogenic Bacteria: From Laboratory to Field Application'. (J.-F. Charles, A. Delecluse, and C. Nielsen-LeRoux Eds. ) pp. 41-64. (Kluwer Aca-demic Publishers: Dordrecht, the Netherlands.)

64. Helgason, E., Caugant, D. A., Ols en, I., and Kolsto, A. B. (2000a). Genetic structure of population of Bacillus cereus and B. thuringiensis isolates associ-ated with periodontitis and other human infections. J Clin.Microbiol. 38, 1615-1622.

65. Helgason, E., Okstad, O. A., Caugant, D. A., Johansen, H. A., Fouet, A., Mock, M., Hegna, I., and Kolsto (2000b). Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Ba-cillus thuringiensis--one species on the basis of genetic evidence. Appl Environ Microbiol. 66, 2627-2630.

66. Henderson, I., Duggleby, C. J. , and Turnbull, P. C. B. (1994). Differentiation of Bacillus anthracis from other Bacillus cereus group bacteria with the PCR. In-ternational Journal of Systematic Bacteriology 44, 99-105.

67. Hernandez, C. S., Ferre, J., and Larget-Thiery, I. (2001). Update on the detec-tion of beta-exotoxin in Bacillus thuringiensis strains by HPLC analysis . J Appl Microbiol 90, 643-647.

68. Hernandez, E., Ramisse, F., Cruel, T., le Vagueresse, R., and Cavallo, J. D. (1999). Bacillus thuringiensis serotype H34 isolated from human and insecti-cidal strains serotypes 3a3b and H14 can lead to death of immunocompetent mice after pulmonary infection. FEMS Immunol Med Microbiol 24, 43-47.

69. Hernandez, E., Ramisse, F., Ducoureau, J. P., Cruel, T., and Cavallo, J. D. (1998). Bacillus thuringiensis subsp. konkukian (serotype H34) superinfection: Case report and experimental evidence of pathogenicity in immunosuppressed mice. Journal of Clinical Microbiology 36, 2138-2139.

70. Hernandez, E., Ramisse, F., Gros, P., and Cavallo, J. (2000). Super-infection by Bacillus thuringiensis H34 or 3a3b can lead to death in mice infected with the influenza A virus. FEMS Immunol.Med Microbiol. 29, 177-181.

71. Hsieh, Y. M., Sheu, S. J., Chen, Y. L. , and Tsen, H. Y. (1999). Enterotoxigenic profiles and polymerase chain reaction detection of Bacillus cereus group cells and B. cereus strains from foods and food-borne outbreaks. J Appl Microbiol 87, 481-490.

72. Höfte, H. and Whiteley, H. R. (1989). Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiological Reviews 53, 242-255.

78

73. Iriarte, J., Porcar, M., Lecadet, M., and Caballero, P. (2000). Isolation and char-acterization of Bacillus thuringiensis strains from aquatic environments in Spain. Curr.Microbiol 40 , 402-408.

74. Ivens, U. I., Breum, N. O., Ebbehoj, N., Nielsen, B. H., Poulsen, O. M., and Wurtz, H. (1999). Exposure-response relationship between gastrointestinal problems among waste collectors and bioaerosol exposure. Scand J Work Envi-ron Health 25, 238-245.

75. Jackson, S. G., Goodbrand, R. B., Ahmed, R., and Kasatiya, S. (1995). Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis isolated in a gastroenteritis outbreak investigation. Letters in Applied Microbiology 21, 103-105.

76. Jacobsen, B. L., Meyer, O., and Schlundt, J. Health assessment of microbial plant protection products - Survey of test methods. 23. 1994. Miljøstyrelsen, Miljøministeriet. Arbejdsrapport . Ref Type: Report

77. Jensen, G. B., Andrup, L. , Wilcks, A., Smidt, L., and Poulsen, O. M. (1996). The aggregation-mediated conjugation system of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis: host range and kinetics. Current Microbiology 33, 228-236.

78. Jensen, M. A., Webster, J. A., and Straus, N. (1993). Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms . Applied and Environmental Microbiology 59, 945-952.

79. Jensen, P. A., Todd, W. F., Davis, G. N., and Scarpino, P. V. (1992). Evaluation of eight bioaerosol samplers challenged with aerosols of free bacteria. Am Ind Hyg Assoc J 53, 660-667.

80. Johnson, D. E. and McGaughey, W. H. (1996). Contribution of Bacillus thur-ingiensis spores to toxicity of purified cry proteins towards indianmeal moth larvae. Current Microbiology 33, 54-59.

81. Johnson, D. E. , Oppert, B., and McGaughey, W. H. (1998). Spore coat protein synergizes Bacillus thuringiensis crystal toxicity for the indianmeal moth (Plo-dia interpunctella). Current Microbiology 36, 278-282.

82. Joung, K. B. and Cote, J. C. (2001). Phylogenetic analysis of Bacillus thur-ingiensis serovars based on 16S rRNA gene restriction fragment length poly-morphisms . J Appl Microbiol 90, 115-122.

79

83. Kamdar, H. and Jayaraman, K. (1983). Spontaneous loss of a high molecular weight plasmid and the biocide of Bacillus thuringiensis var. israelensis. Bio-chemical and Biophysical Research Communication 110, 477-482.

84. Kaneko, T., Nozaki, R., and Aizawa, K. (1978). Deoxyribonucleic acid related-ness between Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. Microbiology and Immunology 22, 639-641.

85. Keller, B. and Langenbruch, G. A. (1993). Control of coleopteran pests by Ba-cillus thuringiensis. In 'Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: theory and practice'. (P. F. Entwistle, J. S. Cory, M. J. Bailey, and S. HiggsEds. ) pp. 171-192. (John Wiley & Sons: Chichester.)

86. Kramer, J. M. and Gilbert, R. J. (1989). Bacillus cereus and other Bacillus spe-cies. In 'Foodborne bacterial pathogens'. (Ed. M. P. Doyles.) pp. 21-70. (Marcel Dekker, Inc.: New York.)

87. Krieg, A., Huger, A. M., Langenbruch, G. A., and Schnetter, W. (1983). Bacil-lus thuringiensis var. tenebrionis: ein neuer gegenuber Larven von Coleopteren wirksamer Pathotyp. Z.Angew Entomol 96, 500-508.

88. Lecadet, M. M., Frachon, E., Dumanoir, V. C., Ripouteau, H., Hamon, S., Laurent, P., and Thiery, I. (1999). Updating the H-antigen classification of Ba-cillus thuringiensis. J Appl Microbiol 86, 660-672.

89. Lereclus, D., Agaisse, H., Grandvalet, C., Salamitou, S., and Gominet, M. (2000). Regulation of toxin and virulence gene transcription in Bacillus thur-ingiensis . Int J Med Microbiol 290, 295-299.

90. Levinson, B. L. , Kasyan, K. J., Chiu, S. S., Currier, T. C., and González, J. M., Jr. (1990). Identification of ? -exotoxin production, plasmids encoding ? -exotoxin, and a new exotoxin in Bacillus thuringiensis by using a high-performance liquid chromatography. Journal of Bacteriology 172, 3172-3179.

91. Linnainmaa, K., Sorsa, M., Carlberg, G., Gripenberg, U., and Meretoja, T. (1977). Mutagenicity of Bacillus thuringiensis exotoxin II. Submammalian tests . Hereditas 85, 113-122.

92. Liu, Y. T., Sui, M. J. , Ji, D. D., Wu, I. H., Chou, C. C., and Chen, C. C. (1993). Protection from ultraviolet irradiation by melanin of mosquitocidal activity of Bacillus thuringiensis var. israelensis. J Invertebr.Pathol 62, 131-136.

80

93. Lund, T. and Granum, P. E. (1996). Characterisation of a non-haemolytic en-terotoxin complex from Bacillus cereus isolated after a foodborne outbreak. FEMS Microbiol Lett. 141, 151-156.

94. Lund, T. and Granum, P. E. (1997). Comparison of biological effect of the two different enterotoxin complexes isolated from three different strains of Bacillus cereus. Microbiology-Uk 143, 3329-3336.

95. Lund, T. and Granum, P. E. (1999). The 105-kDa protein component of Bacil-lus cereus non-haemolytic enterotoxin (NHE) is a metalloprotease with gelati-nolytic and collagenolytic activity. FEMS Microbiol Lett. 178, 355-361.

96. Lövgren, A., Carlson, C. R., Eskils, K., and Kolstø, A.-B. (1998). Localization of putative virulence genes on a physical map of the Bacillus thuringiensis subsp. gelechiae chromosome. Current Microbiology 37, 245-250.

97. Mahillon, J., Rezsöhazy, R., Hallet, B., and Delcour, J. (1994). IS231 and other Bacillus thuringiensis transposable elements: a review. Genetica 93, 13-26.

98. Mantynen, V. and Lindstrom, K. (1998). A rapid PCR-based DNA test for en-terotoxic Bacillus cereus. Applied and Environmental Microbiology 64, 1634-1639.

99. Martin, P. A. W. and Travers, R. S. (1989). Worldwide abundance and distribu-tion of Bacillus thuringiensis isolates. Applied and Environmental Microbiology 55(10), 2437-2442.

100. McClintock, J. T., Schaffer, C. R., and Sjoblad, R. D. (1995). A comparative review of the mammalian toxicity of Bacillus thuringiensis-based pesticides. Pesticide Science 45, 95-105.

101. McGaughey, W. H. and Whalon, M. E. (1992). Managing insect resistance to Bacillus thuringiensis toxins. Science 258, 1451-1455.

102. Melin, B. E. and Cozzi, E. M. (1989). Safety to nontarget invertebrates of Lepi-topteran species of Bacillus thuringiensis. In 'Safety of microbial insecticides'. (M. Laird, L. A. Lacey, and E. W. DavidsonEds. ) pp. 149-168. (CRC Press Inc.: Boca Ratoon, Florida USA.)

103. Mersie, W and Singh, M. (1989). Uptake, translocation, and metabolism of 14-C-thuringiensin (ß-exotoxin) in corn. Journal of Agriculturel and Food Chemis-try 37, 481-483.

81

104. Mikami, T., Horikawa, T., Murakami, T. , Sato, N., Ono, Y., Matsumoto, T., Yamakawa, A., Murayama, S., Katagiri, S., and Suzuki, M. (1995). Examina-tion of toxin production from environmental Bacillus cereus and Bacillus thur-ingiensis. Yakugaku Zasshi-J Pharm Soc J 115, 742-748.

105. Milner, R. J. (1994). History of Bacillus thuringiensis. Agriculture, Ecosystems and Enviroment 49, 9-13.

106. Miteva, V. , Abadjieva, A., and Grigorova, R. (1991). Differentiation among strains and serotypes of Bacillus thuringiensis by M13 DNA fingerprinting. Journal of General Microbiology 137, 593-600.

107. Murakami, T., Hiraoka, K., Mikami, T., Matsumoto, T., Katagiri, S., Shina-gawa, K., and Suzuki, M. (1993). Analysis of common antigen of flagella in Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiology Letters 107, 179-183.

108. Nakamura, L. K. (1994). DNA relatedness among Bacillus thuringiensis se-rovars. International Journal of Systematic Bacteriology 44, 125-129.

109. Noble, M. A, Riben, P. D., and Cook, G. J. Microbial and epipdemiological surveillance programme to monitor the health effects of Foray 48B BTK spray. 30-9-1992. Ref Type: Report

110. Obeidat, M., al Momani, F. , and Saadoun, I. (2000). Diversity of Bacillus thur-ingiensis in different habitats of Northern Jordan. J Basic Microbiol 40, 385-388.

111. Ogunjimi, A. A., Gbenle, G. O., Olukoya, D. K., and Akinrimisi, E. O. (2000). PCR-based identification of Bacillus thuringiensis isolated from soil samples in Nigeria. Z Naturforsch.[C.] 55, 987-990.

112. Oppert, B., Kramer, K. J., Johnson, D. E., MacIntosh, S. C., and McGaughey, W. H. (1994). Altered protoxin activation by midgut enzymes from a Bacillus thuringiensis resistant strain of Plodia interpunctella. Biochemical and Bio-physical Research Communication 198, 940-947.

113. Ozawa, K. and Iwahana, H. (1986). Involvement of a transmissible plasmid in heat-stable exotoxin and delta-endotoxin in Bacillus thuringiensis subspecies darmstadiensis. Current Microbiology 13, 337-340.

114. Pedler, S. J. and Orr, K. E. (1990). ACP Broadsheet 124: May 1990. Examina-tion of faeces for bacterial pathogens. J Clin Pathol 43, 410-415.

82

115. Perani, M., Bishop, A. H., and Vaid, A. (1998). Prevalence of beta-exotoxin, diarrhoeal toxin and specific delta- endotoxin in natural isolates of Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiology Letters 160, 55-60.

116. Priest, F. G., Kaji, D. A., Rosato, Y. B., and Canhos, V. P. (1994). Characteriza-tion of Bacillus thuringiensis and related bacteria by ribosomal RNA gene re -striction fragment length polymo rphisms . Microbiology-Uk 140, 1015-1022.

117. Rady, M. H. and Younis, T. A. (1996). Isolation and curing of plasmid DNA from Bacillus thuringiensis israelensis strains showing variable insecticidal ac-tivities. J.Egypt.Soc.Parasitol. 26, 423-432.

118. Ronchin, M. The WHO meeting on Bacillus thuringiensis. Pesticide Safety News 2[1], 6. 1998. Ref Type: Magazine Article

119. Rusul, G. and Yaacob, N. H. (1995). Prevalence of Bacillus cereus in selected foods and detection of enterotoxin using TECRA-VIA and BCET -RPLA. Int.J.Food Microbiol. 25, 131-139.

120. Salamitou, S., Ramisse, F., Brehelin, M., Bourguet, D., Gilois, N., Gominet, M., Hernandez, E., and Lereclus, D. (2000). The plcR regulon is involved in the op-portunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects . Microbiology-Uk 146, 2825-2832.

121. Samples, J. R. and Buettner, H. (1983). Ocular infection caused by a biological insecticide. Journal of Infectious Diseases 148, 614.

122. Shadduck, J. A. (1983). Some considerations on the safety evaluation of nonvi-ral microbial pesticides. Bull World Health Organ 61, 117-128.

123. Shevelev, A. B., Lewitin, E. , Novikova, S. I., Wojciechowska, Y. A., Usacheva, E. A., Chestukhina, G. G., and Stepanov, V. M. (1998). A new PCR-based ap-proach to a fast search of a wide spectrum of cry genes from Bacillus thur-ingiensis strains. Biochem.Mol.Biol.Int. 45, 1265-1271.

124. Shinagawa, K. (1990). Analytical methods for Bacillus cereus and other Bacil-lus species . Int J Food Microbiol. 10, 125-141.

125. Smith, K. L. , DeVos, V., Bryden, H., Price, L. B., Hugh-Jones, M. E., and Keim, P. (2000). Bacillus anthracis diversity in kruger national park. J Clin Mi-crobiol. 38, 3780-3784.

83

126. Southern, E. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis . Journal of Molecular Biology 98, 503-517.

127. Tayabali, A. F. and Seligy, V. L. (2000). Human cell exposure assays of Bacil-lus thuringiensis commercial insecticides: production of Bacillus cereus-like cytolytic effects from outgrowth of spores. Environ Health Perspect 108, 919-930.

128. Thomas, D. J. I., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., and Saunders, J. R. (2000). Plasmid transfer between the Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki and tenebrionis in laboratory culture and soil and in lepidopteran and coleopteran larvae. Applied and Environmental Microbiology 66, 118-124.

129. Thomas, W. E. and Ellar, D. J. (1983). Bacillus thuringiensis var israelensis crystal delta-endotoxin: effects on insect and mammalian cells in vitro and in vivo. J Cell Sci 60:181-97., 181-197.

130. Titball, R. W. (1993). Bacterial phospholipases C. Microbiological Reviews 57, 347-366.

131. Travers, R. S., Martin, P. A. W., and Reichelderfer, C. F. (1987). Selective process for efficient isolation of soil Bacillus spp. Applied and Environmental Microbiology 53(6), 1263-1266.

132. Turnbull, P. C. and Kramer, J. M. (1985). Intestinal carriage of Bacillus cereus: faecal isolation studies in three population groups. J Hyg (Lond.) 95, 629-638.

133. van Rie, J. , McGaughey, W. H., Johnson, D. E., Barnett, B. D., and van Mel-laert, H. (1990). Mechanism of Insect Resistance to the Microbial Insecticide Bacillus thuringensis . Science 247, 72-74.

134. Ward, E. S. and Ellar, D. J. (1983). Assignment of the ? -endotoxin gene of Bacillus thuringiensis var. israelensis to a specific plasmid by curing analysis . FEBS letters 158, 45-49.

135. Warren, R. E., Rubenstein, D., Ellar, D. J., Kramer, J. M., and Gilbert, R. J. (1984). Bacillus thuringiensis var. israelensis: protoxin activation and safety. The Lancet 1, 678-679.

136. Wencheng, Z. (1998). Study of the bceT and hblA genes and the hemolysin BL of Bacillus thuringiensis group. Chin.J.Microbiol.Immunol. 18, 428-433.

84

137. Wilcks, A., Jayaswal, N., Lereclus, D., and Andrup, L. (1998). Characterization of plasmid pAW63; a second self-transmissible plasmid in Bacillus thuringien-sis subspecies kurstaki HD-73. Microbiology-Uk 144, 1263-1270.

138. Wilcks, A., Smidt, L., Økstad, O. A., Kolstø, A.-B., Mahillon, J., and Andrup, L. (1999). Replication mechanism and sequence analysis of the replicon of pAW63, a conjugative plasmid from Bacillus thuringiensis. Journal of Bacteri-ology 181, 3193-3200.

139. Wunschel, D., Fox, K. F., Black, G. E. , and Fox, A. (1995). Discrimination among the B. cereus group, in comparison to B. subtilis, by structural carbohy-drate profiles and ribosomal RNA spacer region PCR. Systematic and Applied Microbiology 17, 625-635.

140. Wunschel, D. S., Muddiman, D. C., Fox, K. F., Fox, A., and Smith, R. D. (1998). Heterogeneity in Bacillus cereus PCR products detected by ESI- FTICR mass spectrometry. Analytical Chemistry 70, 1203-1207.

141. Yea, C. L. , Lee, C. L., Pan, T. M., and Horng, C. B. (1994). Isolation of Bacil-lus cereus in the feces of healthy adults in Taipei City. Chung.Hua.Min.Kuo.Wei.Sheng.Wu.Chi.Mien.I Hsueh.Tsa.Chih. 27, 148-151.

142. Yu, C. G., Mullins, M. A., Warren, G. W., Koziel, M. G., and Estruch, J. J. (1997). The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium cells of susceptible insects. Appl Environ Microbiol 63, 532-536.

143. Zahner, V. , Momen, H., Salles, C. A., and Rabinovitch, L. (1989). A compara-tive study of enzyme variation in Bacillus cereus and Bacillus thuringensis. Journal of Applied Bacteriology 67, 275-282.

85

BILAG

BILAG 1; RESUMÉ AF BIOGART-PROJEKTET

Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler i gartnerier - en mulig sundhedsrisiko?

FORMÅL: Vurdering af risiko for udvikling af Type I allergi og inflammatoriske lungelidelser i forbindelse med erhvervsmæssig udsættelse for mikrobiologiske bekæmpelsesmidler (MB). Samtidig ønskes risikofaktorer i arbejdet og hos personen for sensibilisering og udvikling af sygdom karakteriseret. BAGGRUND: Kemiske bekæmpelsesmidler forsøges i stigende grad erstattet med mere økologisk venlige midler for at bekæmpe skadevoldere. På fle re gartnerier er man i løbet af de senere år begyndt at anvende forskellige biologiske bekæmpelses-midler (skimmelsvampe og bakterier). Man kender fra industrier, arbejde på komp o-steringsanlæg og fra landbrug, hvor der har været udsættelse for mikroorganismer enten som fermenter eller som forurening, en lang række luftvejssygdomme, som er knyttet til udsættelse for mikro organismer og deres omsætningsprodukter. Desuden ved vi, at mange mennesker udvikler Type I allergi overfor visse mikroorganismer som findes i naturen, men forhold for gartneriansatte er ikke belyst. HYPOTESE: Erhvervsmæssig udsættelse for MB give risiko for udvikling af Type 1 allergi og astma. Risikoen øges med intensitet og varighed af eksponering. Perso-ner med atopi har øget risiko for Type 1 allergi og astma ved udsættelse for MB. MATERIALE: Kohorten er dannet ved, at gartnerier på Fyn blev kontaktet ud fra oplysninger af deres brug af de MB, såle des at der dannedes en passende fordeling af personer eksponeret for følgende tre typer mikrobiologiske bekæmpelsesmidler: Bacillus thuringiensis, Trichoderma harzianum og Verticillium lecanii og en gruppe uden eksponering. Der deltager ansatte fra 32 gartnerier. Disse gartnerier dyrker altovervejende prydplanter. Målet er mindst to års follow up af 450 personer. Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler i gartnerier – en mulig sundhedsrisiko?

Et delprojekt i Center for Miljø og Luftveje under Det Strategiske Miljøforskningprogram

86

METODE: En 3 års follow up kohorte-undersøgelse med følgende registreringer ved årlige undersøgelser: Spørgeskema/interview a) arbejdsforholdskema, b) selvadministrerede skemaer om arbejds- og helbredforhold (3.og 6.og 9. måned i hvert undersøgelses år), c) strukturerede interview om helbredsforhold. Lungefunktionsundersøgelser forceret ekspiratorisk volumen i første sekund (FEV-1) samt forceret vitalkapacitet (FVC). Der foretages bronkial provokation med histaminklorid til bestemmelse af PD20. Allergiudredning. Blodprøver tages med henblik på total IgE-bestemmelse og specifik IgE samt til histaminfrigørelse (HR-test) overfor 8 produkter. Hudpriktest (standard panel) udføres m.h.p. evt. Atopi, endvidere priktest med to MB. Peakflowmonitorering af de fra kohorten, der ved spørgeskema svarer bekræf-tende på nytilkomne symptomer fra luftveje tydende på astma, samtidig registreres arbejdsforhold, symptomer og eventuelt medicin forbrug Arbejds- og tidsplan for projekt :

År

kvartal

1998

3 4

1999

1 2 3 4

2000

1 2 3 4

2001

1 2 3 4

Planlægning Målinger

Analyser Rapportering

X X X X

X X X X X

X X X

X X X X

X X X

X X X

Projekt koordinator Læge Preben Larsen Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler i gartnerier – en mulig sundhedsrisiko?

Et delprojekt i Center for Miljø og Luftveje under Det Strategiske Miljøforskningprogram

87

BILAG 2; UDVÆLGELSE AF PERSONER

Udvælgelse af personer:

Mål var: 1) 10 personer der arbejder på gartneri som anvender Bacillus thurin-

giensis og på 6.mdr. spørgeark* havde anført “maveproblemer” uden samtidig forkølelse eller influenza.

2) 10 personer der arbejder på gartneri som ikke anvender Bacillus thuringiensis og et 6.mdr. spørgeark* uden anført “maveproble-mer”.

Antal deltagere:

Der var 13 personer som opfyldte krav anført under 1) . De fik alle tilsendt skriftlig oplæg & information 7 gav tilsagn om deltage lse. Ansatte på 2 gartneri som ikke anvender Bacillus thuringiensis i alt 16 personer fik ligeledes tilsendt skriftlig oplæg & information 5 gav tilsagn om deltagelse. Deltagere i undersøgelse Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler i gart-nerier - en mulig sundhedsrisiko? følges mellem de årlige undersøgel-ser med spørgeark hver 3.mdr.

88

BILAG 3; DELTAGERINFORMATION

Arbejds- og Miljømedicinsk Klinik, Odense.

Deltagerinformation om delprojektet:“ Bacillus thuringiensis - et biopesticid - en mulig sundhedsrisiko ”.

Vi vil spørge, om du vil deltage i en videnskabelig undersøgelse, der er et supplement til undersøgelsen: Sundhedsmæssige problemer ved brug af bio-logiske bekæmpelsesmidler i væksthuse.

“BIOGART” undersøger vi for luftvejssygdomme og allergi, men vi vil med denne videnskabelige undersøgelse se efter om brug af bakterier som biologiske bekæmpelsesmiddel, kan give mave-tarm problemer. Det er om-handler bakterien Bacillus thuringiensis der er indeholdt i produkterne Bac-timos®, Dipel® og Vectobac®.

I nogle erhverv som f.eks. affalds-håndtering / komposteringsanlæg har man erfaring for, at massiv udsættelse for selv naturligt forekommende mi-kroorganismer i forbindelse med bestemte arbejdsfunktioner kan give risiko for udvikling af luftvejssygdomme, mave-tarm-problemer og hudgener. I dag ved man ikke, om nogle af de bakterier, der indgår i de mikrobiologiske bekæmpelsesmidler, kan medføre tilsvarende gener.

Vi vil derfor invitere dig til at deltage i undersøgelsen. Dit bidrag vil be-stå i at fremsende en afføringsprøve til videre undersøgelse for bakterier. Hvordan du sender en prøve, fremgår af vedlagte vejledning. Deltagere i denne undersøgelse er dels personer, som arbejder i væksthuse, hvor der benyttes Bacillus thuringiensis og dels personer som arbejder i gartnerier, hvor der ikke anvendes Bacillus thuringiensis.

Resultaterne fra undersøgelsen vil danne baggrund for en bedre vejled-ning om, hvordan de biologiske bekæmpelsesmidler kan håndteres og an-vendes så hensigtsmæssigt som muligt for arbejdsmiljøet. Vi håber derfor, at du vil deltage og hermed hjælpe os med at belyse en væsentlig problemstil-ling.

Det er naturligvis frivilligt, om du vil deltage i undersøgelsen, og du kan på et hvert tidspunkt trække dig ud af undersøgelsen, også selvom du i første omgang har sagt ja til at deltage.

89

Undersøgelsen er et forskningsprojekt og alle informationer og resultater vil blive behandlet fortroligt i henhold til læge- og registerloven. Alle oplys-ninger behandles anonymt og resultaterne vil blive offentliggjort på en måde så den enkelte ikke kan genkendes. Du vil naturligvis blive tilbudt at få svar på dine egne undersøgelsesprøver.

Ønsker du at deltage i undersøgelsen, bedes du underskrive nedenstående kupon og sende den til os (frankeret svarkuvert vedlagt). Hvis du har spørgsmål til undersøgelsen, er du naturligvis velkommen til at kontakte os.

Med venlig hilsen

Preben Larsen Jesper Bælum

læge overlæge, dr.med.

Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler i gartnerier – en mulig sundhedsrisiko?

Et delprojekt i Center for Miljø og Luftveje under Det Strategiske Miljøforskningprogram

90

BILAG 4; PRØVEVEJLEDNING OG FØLGEBREV

Arbejds- og Miljømedicinsk Klinik Odense Universitetshospital Sdr. Boulevard 29 Dk-5000 Odensen C

BIOLOGISKE BEKÆMPELSESMIDLER I ARBEJDSMILJØET

Kære Tak fordi du vil deltage. Vedlagt er prøveopsamlings materialet og en revideret vejledning. Som nævnt i sidste brev vil du for indsatsen få tilsendt et par flasker vin. Med venlig hilsen Preben Larsen Læge Projektkoordinator Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler i gartnerier – en mulig sundhedsrisiko?

Et delprojekt i Center for Miljø og Luftveje under Det Strategiske Miljøforskningprogram

91

“ Bacillus thuringiensis - et biopesticid - en mulig sundhedsrisiko ”

VEJLEDNING TIL OPSAMLING AF AFFØRING’S PRØVE.

Du har fået udleveret en plastikpose, der indeholder materiale til prøvetag-ning og forsendelse. Posen indeholder:

?? en hvid plastbøtte ?? 2 prøveglas med brunt låg ?? 2 forsendelseshylstre ?? og en frankeret forsendelseskuvert.

PRØVEN SKAL TAGES PÅ EN MANDAG, TIRSDAG ELLER ONSDAG.

Sådan gør du:

1. Forret afføringen i den hvide plastbøtte. 2. Du skal nu udtage 2 prøver fra portionen. 3. I plastbeholderen ligger der et prøveglas med brunt låg. 4. Skriv dato på prøveglassene. 5. Skru det brune låg af glasset og brug den lille ske til at fylde lidt

afføring i bunden af glasset. Glasset skal fyldes op til stregmarke-ringen.

6. Skru det brune låg godt til og sæt prøveglasset fast i det hvide låg til forsendelseshylsteret, skru låget fast.

7. Læg de 2 forsendelseshylstre i kuverten. 8. Prøven sendes samme dag som den er taget. (En mandag, tirsdag

eller onsdag). Har du spørgsmål til ovenstående, kan du ringe ind til os på 6541 4990 Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler i gartnerier – en mulig sundhedsrisiko?

Et delprojekt i Center for Miljø og Luftveje under Det Strategiske Miljøforskningprogram

92

BILAG 5; PROTOKOL FOR NEDFRYSNING AF FÆCESPRØVER

Nedfrysning af fæces prøver:

1. Før udsendelse af prøvetagningsmateriale afvejes rør til prøvetag-ning og vægten af det nummerede rør nedskrives.

2. Ved modtagelse af det fyldte rør vejes dette. Vægten noteres og fra-trækkes vægten af det tomme rør resulterende i beregning af vægt af fæces. Herefter tilsættes prøven en tilsvarende mængde nedfrys-ningsmedie afvejet i gram.

3. Prøven opblandes grundigt, brug whirlmixer. 4. Prøven nedfryses ved –80 ?C. 5. Når alle prøver er indsamlet og nedfrosset, sendes prøver samt veje-

skema til VFD efter nærmere aftale. Frysemedie bliver fremstillet af VFD og sendt til Odense efter nærmere afta-le.

Frysemedie:

BHI, 34 % glycerol ( ½ suspension + ½ medie =>17 % glycerol i den frosne opløs-ning).

Kontaktpersoner:

Odense: Hanne Albeck Tlf. 65 41 19 52/ Preben Larsen 65 41 49 90 Søborg: Bodil L. Jacobsen: Tlf. 33 95 61 86/ Hanne Rosenquist 33 95 61 89

93

BILAG 6; SPØRGESKEMA I FORBINDELSE MED AFFØRINGSPRØVE

Løbenr: Fornavn Efternavn I dagene omkring afføringsprøven havde jeg ingen mavesymptomer Hvis der var symptomer, bedes du sætte et eller flere X nedenfor. dagen før samme dag dagen efter Jeg havde ondt i maven Jeg følte maven oppustet Jeg havde diarre (flere gange tynd mave samme dag)

Jeg havde kvalme Jeg hav de opkastninger Jeg havde……………………………….. Jeg havde……………………………….. Mikrobiologiske bekæmpelsesmidler i gartnerier – en mulig sundhedsrisiko?

Et delprojekt i Center for Miljø og Luftveje under Det Strategiske Miljøforskningprogram

94

BILAG 7; METODE TIL BESTEMMELSE AF B. CEREUS-LIGNENDE BAKTERIER I HUMAN FÆCES

Projekt nr: 9768

Metode til bestemmelse af Bacillus thuringiensis i human fæces fra væksthusarbej-der.

Dato:12.11.99.BOM

Forbehandling:

12 fæces prøver modtages. 1 pos kontrol (har været i –80°C) 1 neg kontrol (har været i –80°C) ??10 g human fæces + 90 ml 0, 9% FKP stomacheres i pose med filter og

dobbelt pose (1 min)

(eksempel: g fæces 9, 221*9=(82, 9-9, 245frysemedie)=73, 7 g FKP tilsættes prøven). ??Overflade udsæd på B.C agar. (fortynding 10-2, 10-3 og 10-4) - dobbeltbe-

stemmelse, inkuberes ved 30°C og 37°C i 24 timer.

Varmbehandling for detektion af sporer:

??20 ml af 10–1 fortyndingen overføres til 50 ml rør. ??Varmbehandles ved 80°C i 15 min og udsåes på BC agar. For at finde B.

thuringiensis i lavt antal (1 ml fra 10–1 fortynding på 2 stk BC plader). Pladerne tørrer i laf bænk i 30 min. ??På PCA dybdeudsæd aerob og anaerob (fortynding 10–2 og 10-3) inkube-

res ved 30°C. BC agar inkuberes 1 dag PCA inkuberes 3 dage.

95

BILAG 8, MOLEKYLÆRBIOLOGISK KARAKTERISERING AF B. CEREUS-LIGNENDE ISOLATER MED PCR

Kommercielle stammer: Bactimos? og Vectobac? (B. thuringiensis subsp. israelensis), Dipel? (B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1). Kontrolstammer fra stammesamling (Arbejdsmiljøinstituttet).

Polymerase chain reaction (PCR)

Til alle PCR forsøg benyttes PCR SUPERMIX (GIBCO BRL). Amplifika-tionen udføres på en Programmable Thermal Controller (PTC-100TM) med opvarmet låg. Primere og PCR-betingelser for de enkelte forsøg fremgår af nedenstående. Primere syntetiseres af TAG Copenhagen og fortyndes til en koncentration på 20 ?M. Til en PCR reaktion bruges 24 ? l PCR SUPERMIX, 0, 4-0, 5 ? l primer, 1 ? l oprenset genomisk DNA (se bilag 9). Opformeringen afsluttes for alle primere med 5 min. ved 72?C, og derefter 4?C.

rRNA 16S-23S spacer region

Følgende primere til opformering af rRNA 16S-23S spacer regionen benyt-tes (Jensen et al. 1993): G1: 5’-GAA-GTC-GTA-ACA-AGG-3’ G2: 5’-CAA-GGC-ATC-CAC-CGT-3’ Opformeringsbetingelser: 5 min. ved 94?C, 35 cycler á: 1 min. ved 94?C 1 min. ved 55?C 3 min. ved 72?C Fragmentstørrelser for B. cereus familien (Daffonchio et al. 1998): Giver et kraftigt bånd på ca. 240 bp og tre svagere bånd på ca. 460, 530 og 650 bp.

96

Krystaltoksingener Følgende primere benyttes: Primer Sekvens

Fragment-størrelser (bp)

Reference

Cry1a Cry1b

5’-CTG-GAT-TTA-CAG-GTG-GGG-ATA-T-3’ 5’-TGA-GTC-GCT-TCG-CAT-ATT-TGA-CT-3’

543-594 (Bravo et al. 1998)

Cry3a Cry3b

5’-TTA-ACC-GTT-TTC-GCA-GAG-A-3’ 5’-TCC-GCA-CTT-CTA-TGT-GTC-CAA-G-3’

652-718 (Ceron et al. 1995)

Cry8a Cry8b

5’-ATG-AGT-CCA-AAT-AAT-CTA-AAT-G-3’ 5’-TTT-GAT-TAA-TGA-GTT-CTT-CCA-CTC-G-3’

373-376 (Bravo et al. 1998)

Cry11a Cry11b

5’-TTA-GAA-GAT-ACG-CCA-GAT-CAA-GC-3’ 5’-CAT-TTG-TAC-TTG-AAG-TTG-TAA-TCC-C-3’

305 (Bravo et al. 1998)

Nema Nemb

5’-TTA-CGT-AAA-TTG-GTC-AAT-CAA-GCA-AA-3’ 5’-AAG-ACC-AAA-TTC-AAT-ACC-AGG-GTT-3’

474-489 (Bravo et al. 1998)

Cyta Cytb

5’-AAC-CCC-TCA-ATC-AAC-AGC-AAG-G-3’ 5’-GGT-ACA-CAA-TAG-ATA-ACG-CCA-CC-3’

522-525 (Bravo et al. 1998)

Opformeringsbetingelser: 2 min. ved 96?C, 30 cycler á: 1 min. ved 95?C 1 min. ved 52?C 1 min. ved 72?C

97

Enterotoksingener Følgende primere benyttes: Primer Sekvens Fragment

størrelse (bp)

Reference

HblA3 HblA4

5’-ACG-AAC-AAT-GGA-GAT-ACG-GC-3’ 5’-ATT-TTT-GTG-GAG-TAA-CAG-TTT-CTA-C-3’

1017 (Wencheng 1998)

BceT3 BceT4

5’-TTA-CAT-TAC-CAG-GAC-GTG-CTT-3’ 5’-TGT-TTG-TGA-TTG-TAA-TTC-AGG-3’

427 (Wencheng 1998)

TY123 TY124

5’-GGT-TTA-GCA-GCA-GCT-TCT-GTA-GCT-GGC-G-3’ 5’-CTT-GTC-CAA-CTA-CTT-GTA-GCA-CTT-GGC-C-3’

261 (Asano et al. 1997)

TY123 TY125

5’-GGT-TTA-GCA-GCA-GCT-TCT-GTA-GCT-GGC-G-3’ 5’-GTT-TCG-TTA-GAT-ACA-GCA-GAA-CCA-CC-3’

581 (Asano et al. 1997)

TY123 TY126

5’-GGT-TTA-GCA-GCA-GCT-TCT-GTA-GCT-GGC-G-3’ 5’-GTA-ACG-TTA-TTG-TTA-TTG-TTA-TTG-TTA-ACG-3’

857 (Asano et al. 1997)

TY123 TY127

5’-GGT-TTA-GCA-GCA-GCT-TCT-GTA-GCT-GGC-G-3’ 5’-CAG-AAC-TAA-TAC-GTA-CAC-CAG-TTG-CAT-CTG-3’

1222 (Asano et al. 1997)

Opformerings-betingelser: 3 min. ved 96?C, 30 cycler á: 1 min. ved 94?C 1 min. ved 52?C 3 min. ved 72?C

98

10-mer oligo RAPD Oligo-primere: Primer Sekvens Reference OPA-02 5’-CAG-GCC-CTT-C-3’ (Operon Technologies Inc.) OPA-03 5’-AGT-CAG-CCA-C-3’ (Operon Technologies Inc.) OPA-06 5’-GGT-CCC-TGA-C-3’ (Operon Technologies Inc.) OPA-09: 5’-GGG-TAA-CGC-C-3’ (Operon Technologies Inc.) 0940-12 5’-ACG-CGC-CCT-3’ (Brousseau et al. 1993) Opformerings-betingelser: 45 cycler á: 1 min. ved 94?C 1 min. ved 32?C 2 min. ved 72?C

99

Sphingomyelinase – phospolipase C - nheA følgende primere benyttes: Primer Sekvens Fragment

størrelse (bp)

Reference

236-Ph1 5’-CGTGCCGATTTAATTGGGGC-3’ 237-Ph2 5’-CAATGTTTTAAACATGGATGCG-3’

558 (Hsieh et al. 1999)

238-plC1

5’- TGAATGGCGTACGGAGTTAGA-3’ 415

Dette studie (accession #X12854)

239-plC2

5’- CCGCTCCATGAATCCACTC-3’

234-nheA1S

5’- ATTAAGGTAAATGCGATGAG-3’

235-nheA1A

5’- GCTTCAGTTTGTGATAACTT-3’

671

Dette studie (accession #Y19005)

Opformeringsbetingelser: 2 min. ved 96?C, 30 cycler á: 1 min. ved 95?C 1 min. ved 52?C 1 min. ved 72?C Gelelektroforese12 ? l PCR-produkt loades på 2% agarosegel med 3 ? l loa-ding-buffer, og kører ved 100 V, 16 ?C i 2½ timer.

100

BILAG 9; METODE TIL OPRENSNING AF TOTAL DNA FRA B. THURINGIENSIS

AMI’s kvalitetshåndbog for metoder og administr. procedurer specielle del Materiale- og forureningsundersøgelser Standardforskrift nr. SFMF-075-LS-m Dokumentansvarlig: LS i kraft: 2001-07-15

Godkendt: GBJ erstatter: 1995-10-03

Total DNA ekstraktion Bacillus thuringiensisfra minipræparation

------ooOOOoo------

Sikkerhed : Der følges "Sikkerhedsregler for arbejde i genteknologiske laboratorier" Fil: t:\AMI

Metoder\aktuelle metoder\materiale- og forureningsundersøgelser\standard forskrifter\SFMF-083-LS-

m.doc

1. Gro kultur i 7 ml LB + antibiotika afhængig af stammen natten over ved 30?C med 200 rpm ryst på

rystebord i inkubatorhætten i 2.29.

2. Fortynd ON-kulturen 100 gange i 7 ml LB medie og lad kulturen vokse til OD600 = 0.7-0.8 ved 30?C

med ryst.

3. Høst 2 ml kultur i Epp.rør ved 8.000 G i 7 min. ved 20?C. Sug supernatanten fra ved hjælp af

vaccuumopstillingen i 2.29.

4. Resuspender pellet i frisklavet samme dag 100?l TEG-buffer (står i køleskab i 2.29) med lysozym (fra -

20?C fryser i 2.26) til slutkonc. 15mg/ml.

5. Inkuber ved 37?C i 20 min i vandbad i 2.26.

6. Tilsæt frisklavet samme dag 300?l 1% (w/v) SDS-TEG opløsning.

7. Inkuberes ved 60?C i vandbad i varmeskab i 2.26 indtil klar opløsning (ca. 1 time).

8. Tilsæt 1000? l fenol:cloroform:isoamylalkohol (foregår i stinkskab med handsker) og ryst kraftigt.

101

9. Centrifugér ved 8.000 G, 20? i 7 min .

10. Overfør øverste fase til et nyt Epp.rør (foregår i stinkskab med handsker).

11. Gentag trin 8, 9 og 10.

12. Tilsæt 2 X vol af køleskabskold 96% ETOH (ca. 600? l).

13. Lad stå ved -20?C i 10 min.

14. Centrifugér 20.000 G i 15 min ved 4?C.

15. Hæld forsigtigt supernatanten ud.

16. Vask pellet med 70% ETOH forsigtigt for at pellet ikke forsvinder, og centrifugér ved 20.000 G i

5 min.

17. Tør pellet i vacuumovn i 5-10 min.

18. Resuspender pellet i 75?l TE-buffer med RNase ( slutkonc. 10?g/ml).

RNase - stamopløsning (10mg/ml), står i -20?C fryser i 2.26

TEG-buffer :

TRIS-HCl (10mM) 500? l 1M TRIS, pH:8.0

EDTA (50mM) 5.0 ml 0.5M EDTA, pH:8.0

Glucose (1% w/v) 2.5 ml glucose 20%

H2Ord 42.0 ml sterilt H2Ord

Opløsningerne udtages sterilt ned i en steril flaske.

102

TE-buffer (10:1) : TRIS-HCl (10mM) 5.0 ml 1M TRIS, pH:8.0

EDTA (1mM) 1.0 ml 1M EDTA, pH:8.0

H2Ord ad 500 ml med H2Ord

Opløsningen autoklaveres ved 121?C i 15 min.

Arbejdsmiljøinstituttet

AKA (Afdeling for Kemisk arbejdsmiljø)

Lersø Parkallé 105

DK-2100 København Ø

Email. AMI@AMI.dk

tlf. 39 16 52 00

fax. 39 16 52 01

103

BILAG 10; METODE TIL PLASMIDOPRENSNING FRA B. THURINGIENSIS – PRÆFERENTIELT SMÅ PLASMIDER

AMI’s kvalitetshåndbog for metoder og administr. procedurer specielle del Materiale- og forureningsundersøgelser Standardforskrift nr. SFMF-079-LS-m Dokumentansvarlig: LS i kraft: 2001-03-29

Godkendt: GBJ erstatter: 2000-07-15

Mini-Lysat, Bacillus thuringiensis

------ooOOOoo------

Sikkerhed : Der følges "Sikkerhedsregler for arbejde i genteknologiske laboratorier" Fil: t:\AMI

Metoder\aktuelle metoder\materiale- og forureningsundersøgels er\standard forskrifter\SFMF-083-

LS-m.doc

Materialer :

KAc 3M

TE (10:1 pH 8.0), se "SFMF-154-LS-m"

70% ETOH i -20?C fryser i 2.26

Isopropanol, i køleskabet i 2.29

Phenol/chloroform/isoamylalkohol, i køleskabet i 2.29

RNase (10mg/ml), i -20?C fryser i 2.26

Lysozym, i -20?C fryser i 2.26

GET-buffer, se nederst

Lytic -mix, se nederst

Vandbad + isbad

Bordcentrifuge + vacuumcentrifuge i 2.27

1. Høst 2ml over-nats kultur fra 30?C (incl stammeafhængig antibiotica) ved 10.000G, 4?C i 5 min.

2. Resusp. i 200?l GET + lysozym - frisklavet samme dag

Præf. store plasmider : 2.5 mg/ml lysozym

Præf. små plasmider : 20 mg/ml lysozym

104

3. Inkubér i 90 min. i vandbad ved 37?C, mix af og til!

4. Tilsæt 400? l lytic-mix frisklavet samme dag. (røret vendes 10 gange!)

5. Sæt på 10 min. på is.

6 Tilsæt 300? l 3M KAc (pH 4.8), mix!

7. Inkubér i 45 min. ved 0?C(vand- og isbad)

8. Spin 15 min. ved 20.000G, 4?C.

9. Overfør supernatanten til nyt Epp.rør.

10. Tilsæt 800? l Phenol/chloroform/isoamylalkohol i stinkskab med handsker, mix, spind i 3 min.

ved 8.000G ved stuetemp. og overfør overfasen til et nyt Epp.rør.

11. Tilsæt 700? l isopropanol (køleskabskold).

12. 10 min. i -80?C fryser i 2.25.

13. Spind 15 min. ved 20.000G, 4?C, og hæld supernatanten fra

14. Vask pellet forsigtigt med 1000?l 70% ETOH, og spin igen 5 min. ved 20.000G 4?C

15. Tør i vaccuum centrifuge i 5 - ? min., se til det hvert 5'te minut.

16. Resusp. i 50 ?l TE + 5?l RNase (slutkonc.1 mg/ml).

GET: 0.5 ml 1M glucose Lytic-mix: X ml 0.4M NaOH

2.5 ml 0.1M tris X ml 4% SDS

1.0 ml 0.1M EDTA 2X ml 6.0 ml H2Ord

Arbejdsmiljøinstituttet

AKA (Afdeling for Kemisk arbejdsmiljø)

Lersø Parkallé 105

DK-2100 København Ø

Email. AMI@AMI.dk

tlf. 39 16 52 00

fax. 39 16 52 01

105

BILAG 11; METODE TIL PLASMIDOPRENSNING FRA B. THURINGIENSIS – PRÆFERENTIELT STORE PLASMIDER

AMI’s kvalitetshåndbog for metoder og administr. procedurer specielle del Materiale- og forureningsundersøgelser Standardforskrift nr. SFMF-071-LS-m Dokumentansvarlig: LS i kraft: 2001-02-13

Godkendt: GBJ erstatter: 2000-07-15

Plasmid-DNA præparation fraBacillus thuringiensis(præferentielt store plasmider)

(modifikation af metode fra Kado & Liu samt Battisti et al. (#662, #20))

------ooOOOoo------

1. 2, 0 ml LB overnatskultur (OD600 10-15) høstes i eppendorfrør (8.000 rpm, 7 min. 20?C).

2. Pellet suspenderes i 100?l E-buffer ved gentagen pippetering.

3. 200? l lysisbuffer tilsættes, vendes 20 X.

4. Inkuberes i 30 min. ved 60?C (opvarmet vandbad i varmeskab i 2.26).

5. Tilsæt 20?l proteinase K (18mg/ml opl.står i -20? fryser i 2.26), vendes 20 X.

6. Inkubér 90 min. ved 37?C (i vandbad).

7. 1000?l phenol/chloroform/isoamylolkohol tilsættes (står i køleskab i2.29), vendes 40 X

(stinkskab/handsker). Centrifugér ved 8.000 rpm, 7 min. 20?C.

8. 200? l af overfasen overføres til nye epp.rør (foregår i stinkskab med handsker). (Forsigtig -

Undgå precipitatet i mellemfasen!).

OBS ! Undgå at suge/vortex da de store plasmider er ret skrøbelige!

Sikkerhed : Der følges "Sikkerhedsregler for arbejde i genteknologiske laboratorier"

Fil::t:\AMImetoder\aktuellemetoder\materialeogforureningsundersøgelser\standardforskrifter\SFMF

-083-LS-m.doc

106

E-buffer: 40 mM Tris-hydroxide, 2 mM EDTA, 15%(w/v) sucrose, pH=7.9

Lysis-opløsning: 3, 0 g SDS + 1, 50 ml 10 N NaOH i 100 ml 15%(w/v) sucrose, 50 mM Tris.

Sterilfiltreres.

Arbejdsmiljøinstituttet

AKA (Afdeling for Kemisk arbejdsmiljø)

Lersø Parkallé 105

DK-2100 København Ø

Email. AMI@AMI.dk

tlf. 39 16 52 00

fax. 39 16 52 01

107

BILAG 12; METODE TIL VASKNING AF FILTRE FRA IOM-SAMPLER

AMI’s kvalitetshåndbog for metoder og administr. procedurer specielle del Materiale- og forureningsundersøgelser Standardforskrift nr. SFMF-120-MSI-m Dokumentansvarlig: MSI i kraft: 2001-05-22

Godkendt: erstatter: 1995-09-25

Håndtering af iom kassetten.

Der følges "Sikkerhedsregler for arbejde med mikroorg. SFMF – 123 -MSI"

Kassetten bruges til opsamling af luft prøver efter montering med et 25 mm filter (f.eks

polycarbonat eller Teflon )

1. Toppen af kassetten skrues af og indsatsen tages ud.

2. Toppen af indsatsen lægges sterilt til side og filteret løftes op ved hjælp af en speciel metal

stykke med pigge, som anbringes forsigtigt nedenunder den del af kassetten som filteret hviler på

op gennem hullerne.

3. Filteret overføres forsigtigt ved hjælp af en ren pincet til en 50 ml steril kolbe og indersiden af

indsatsen skylles med 7 ml ekstraktionsvæske ned i kolben (OBS! Hvis Teflonfilter benyttes skal

den eksponerede side vende nedad i kolben, da filteret er hydrofobt).

4. Kolben placeres på et rystebord. Rystes 15 min ved 500 rpm.

5. Væsken fra kolberne fordeles til planlagte analyser.

108

Ekstrationsvæske til udvaskning af filtre

Indhold pr. liter: 0.05 g Tween 80 (P-1754; Sigma)

3 ml NaCl stamopløsning

sterilt vand ad 100 ml

Arbejdsmiljøinstituttet

AKA (Afdeling for Kemisk arbejdsmiljø)

Lersø Parkallé 105

DK-2100 København Ø

Email. AMI@AMI.dk

tlf. 39 16 52 00

fax. 39 16 52 01

Lersø Parkallé 105 • 2100 København ØTlf.: 39 16 52 00 • fax: 39 16 52 01e-post: ami@ami.dk • www.ami.dk

Kvalitetskrav for rengøringi kontorer, skoler ogdaginstitutioner

AAMMII DOKUMENTATION 5