USMENI ISPIT IZ MIKROBIOLOŠKE KONTROLE FRMACEUTSKIH I KOZMETIČKIH PROIZVODA I PROCESA

Pitanja:

1. OdreĊivanje broja mikroorganizama 2. Klostridije 3. Clostridium perfringens 4. Bacillus – Bacillus cereus 5. Listeria monocytogenes 6. Staphylococcus aureus 7. Enterococcus 8. E. coli 9. Salmonella 10. Shigella 11. Pseudomonas aeruginosa 12. Campylobacter 13. Candida albicans 14. Aspergillus fumigatus 15. Bakterije indikatori fekalnog zagaĊenja vode 16. Mikrobiološke analize vode za piće vode i prirodnih mineralnih voda 17. Industrijski znaĉaj biofilmova 18. Nastanak i razvoj biofilma 19. Mehanizmi delovanja biocida 20. Bakterijska rezistentnost na biocide 21. Faktori izbora delovanja antimikrobnog sredstva 22. HACCP – pojam, razvoj, prednosti i mane 23. Faze implementacije HACCP-a (1-5) 24. Principi HACCP-a.

Naĉin izazivanja zdravstvenih tegoba: Alimentarne infekcije – nastaju posle unosa ţivih mikroorganizama hranom, koji se u digestivnom

traktu umnoţavaju ili ga kolonizuju i na taj naĉin izazivaju invazivnu infekciju. Najĉešci uzroĉnici

alimentarnih obolenja kod nas i u svetu su Salmonella spp., Campylobacter spp., E. coli O157,

Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica.

Toksoinfekcije – nastaju nakon unošenja ţivih mikroorganizama putem hrane, koji se u digestivnom

traktu razmnoţavaju i stvaraju jedan ili više toksina, kojima oštećuju tkiva ili funkciju pojedinih

organa. Mikroorganizmi koji formiraju toksine u hrani pre unošenja u organizam najĉešće su

Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum i Bacillus cereus.

Alimentarne intoksikacije – nastaju kao posledica unošenja specifiĉnih toksina predhodno nastalih u

namirnici. Za njihovo nastajanje nije potrebno unošenje ţivih bakterijskih ćelija. Toksini koji se

formiraju u crevima ljudi nakon unošenja hrane poreklom su uglavnom od Clostridium perfringens i

Bacillus cereus (dijarejalni toksin).

Bolesti izazvane hranom postale su jedan od najvećih problema javnog zdravstva, razlog su: globalne promene i zagaĊenje ţivotne sredine

nove tehnologije proizvodnje i prerade hrane

industrijalizacija i povećana masovna proizvodnja

nov naĉin ţivota

svetski turizam i meĊunarodna trgovina

povećan broj osetljivih ljudi – opadanje imuniteta stanovništva

pojava novih uzroĉnika i mutiranje postojećih

ODREĐIVANJE BROJA MIKROORGANIZAMA OdreĊivanje brojnosti mikroorganizama moţe se vršiti na dva naĉina, direktnim i inderktnim metodama. Direktnim metodama se neposredno odredjuje ukupan broj mikroorganizama, ali je nedostatak metode nemogućnost razlikovanja ţivih i mrtvih ćelija. Indirektne metode (odgajivaĉke, optiĉke) podrazumevaju posredno posmatranje mikroorganizama metodama izolacije i gajenja u laboratoriji, pri tome se broje samo ţive ćelije. U direktne metode spadaju: Metoda po Breed-u; brojanje mikroorganizama na obojenom razmazu suspenzije na odredjenoj

površini predmetnice

Komore za brojanje; primenjuje se za brojanje mikroorganizama većih dimenzija (alge, kvasci,

krupnije bakterije spore gljiva i plesni) u uzorku vode odredjene zapremine. Sitniji mikroorganizmi

padaju na dno komore i teţe se uoĉavaju pod mikroskopom

Membranski filtri; metoda bakteriološke filtracije. Za kvantitativne analize koriste se nitrocelulozni

filtri sa veliĉinom pora 0,2 μm.

Indirektne odgajivaĉke metode: Bira se podloga i uslovi kultivacije (temperatura, vremenski period inkubacije) koji su selektivni za ţeljeni mikroorganizam a nepovoljni za ostale neţeljene mikroorganizme. Ipak ni jedna podloga nije potpuno selektivna. Strategija obogaćivanja kulture jeste da, što je više moguće, oponaša optimalne uslove koji postoje u sredini u kojoj se ţeljeni mikroorganizam nalazi, i na taj naĉin omogući njegovu izolaciju. Primenjuju se klasiĉne metode razreĊivanja i zasejavanja odgovarajućeg razreĊenja na teĉne ili ĉvrste podloge. Prema tome razlikujemo odreĊivanje broja mikroorganizama na ĉvrstim i teĉnim hranljivim podlogama. Na ĉvrstim podlogama odreĊuje se CFU (Colony Forming Unit), pri ĉemu je validan broj kolonija na petri ploĉi 30 do 300. Pripremi se sterilisana agarizovana hranljiva podloga i razlije se u petri ploĉe. Na podlogu se sterilnom pipetom nanosi 0,1 ml inokuluma iz odgovarajućeg razreĊenog uzorka (slika) i sterilnim stapićem razmaţe po površini podloge. To se radi se u 3-5 ponavljanja. Petri ploĉe se odlaţu u obrnutom poloţaju u termostat na inkubaciju, na temperaturi koja je propisana za svaki mikroorganizam. Nakon inkubacije vrši se brojanje. Raĉuna se proseĉan broj kolonija po petri ploĉi, a brojnost se izraţava u 1 ml uzorka (mnoţenjem proseĉnog broja kolonija sa primenjenim razredjenjem). Na teĉnim podlogama odreĊuje se MNP (Most Probable Number) a ĉitanje se vrši po Mac Credy-vim tablicama iz serije razredjenja. Zasejavanje se vrši iz serije razredjenja (iz svakog razredjenja u 3-5 ponavljanja) u teĉne hranljive podloge koje su razlivene i sterilisane u epruvetama. Nakon inkubacije vrši se oĉitavanje broja pozitivnih epruveta iz svakog korišćenog razredjenja (epruvete u kojima se uoĉava rast). Najverovatniji broj mikroorganizama se oĉitava pomoću tablica po Mac Credy-u. Indirektne optiĉke metode: Zasnivaju se na opštim principima merenja mutnoće optiĉkim aparatima kao što su kolorimetar, nefelometar, turbidometar, spektrofotometar... Najĉešće se primenjuju za odredjivanje broja mikroorganizama u ĉistim kulturama. Ove metode se ne mogu primenjivati za odredjivanje brojnosti u supstratima koji se boje, koji pored mikroorganizama sadrţe i druge suspendovane materije, niti za odreĊivanje broja mikroorganizama koji imaju nehomogen rast. Pre nego što se pristupi odredjivanju brojnosti neophodno je napraviti kalibracionu krivu za svaki aparat, odnosno soj mikroorganizama ĉija se

brojnost odredjuje. Kalibraciona kriva pokazuje zavisnost izmeĊu gustine mikroorganizama i procenta apsorpcije svetlosti. Do kalibracione krive se dolazi na taj naĉin što se napravi serija razredjenja ispitivane kulture, izmeri % apsorpcije svetla (ili ekstinkcija kod nekih aparata) i odredjuje brojnost direktnom ili odgajivaĉkom metodom. Rezultati merenja i brojnost se unesu u koordinatni sistem, a zatim konstruiše kalibraciona kriva. Kriva omogućuje brzo odredjivanje brojnosti na osnovu izmerene apsorpcije svetlosti datog uzorka.

KLOSTRIDIJE Sulfitoredukujuće klostridije su sporogene, obligatno anaerobne, štapićaste, G(+) bakterije. Nalaze se u zemljištu, prašini, organskom Ċubrivu, digestivnom traktu ljudi i ţivotinja, kliniĉkim uzorcima, vodi, biljkama, insektima... tj. ubikvitarne su prirode. Većina vrsta je pokretna. Fermentativno usvajaju ugljene hidrate, daju negativne biohemijske katalaza i oksidaza testove. Sporulacija omogućuje preţivljavanje mikroorganizama u prirodnoj sredini i nepovoljnim uslovima. Dugoveĉnost bakterijskih spora je zapanjujuća, prema nekim podacima one preţivljavaju i preko 50 godina. Zdravstveni znaĉaj klostridija: od ukupnog broja vrsta Clostridium (preko 100) manje od 20 je patogeno.

Patogene Clostridium spp.

I II III IV

neurotoksiĉne klostridije

histotoksiĉne klostridije

enteropatogene i enterotoksin

produkujuće klostridije

ostale klostridije

C. tetani C. botulinum (tipovi A-G)

C. chauvoei C. septicum C. novyi (tip A) C.perfringens (tip A) C. sordellii C. haemolyticum C. novyi (tip B)

C. perfringens (tipovi A-E)

C.colinum C.difficile C.piliforme C.spiroforme

Neurotoksiĉne klostridije deluju na neuromuskularnu funkciju organizma bez uoĉljivog oštećenja tkiva, a histotoksiĉne vrste izazivaju relativno lokalizovane lezije tkiva (mišića i jetre). toksigeni sojeve C. perfringens izazivaju inflamatornu leziju gastrointestinalnog trakta sa enterotoksemijom, dok su klostridije ĉetvrte grupe u vezi sa sporadiĉnim individualnim oboljenjima. Sve patogene vrste klostridija se u organizam unose pasivno. Kod uzroĉnika alimentarnih intoksikacija za izazivanje oboljenja odgovoran je toksin osloboĊen u namirnici. Sinteza veoma aktivnih toksina klostridija je u direktnoj vezi sa niskim oksido-redukcionim potencijalom sredine i sporulacijom vegetativnih ćelija. Ĉesto brojnost vegetativnih ćelija nije od odluĉujućeg znaĉaja za toxigenost vrsta. Vrste koje se nalaze u intestinalnom traktu ljudi i ţivotinja, kao što su C. perfringens i C. sporogenes, prodiru u krv i tkiva i zajedno sa fakultativno anaerobnim bakterijama (Proteus spp.) neposredno pre ili ubrzo nakon smrti domaćina, izazivaju truljenje i dekompoziciju leševa. C. botulinum je vrsta koja ukljuĉuje sedam toksiĉnih tipova: A, B, C, D, E, F i G. Svi sojevi produkuju neurotoksine sa sliĉnim efektima, ali se toksini pojedinih tipova serološki razlikuju. Toksin C. botulinum je najjaĉi bakterijski toksin, proteinske je prirode i termolabilan (uništava ga relativno kratkotrajno zagrevanje – za 30 minuta na 80 oC, odn. za 10 minuta na 100 oC). Toksin je otporan prema ţeludaĉnom soku i jedini je bakterijski egzotoksin koji izaziva trovanje kada se unese oralnim ili parenteralnim putem. Botulinski toksin je prema svom afinitetu neurotropan, sliĉan tetanusnom, a donekle i difteriĉnom. Patološko stanje: botulizam nastaje konzumiranjem namirnica u kojima se nalazi botulinski toksin. Sindrom botulinske intoksikacije sastoji se od neuroparalitiĉkih poremećaja koji se manifestuju paralizom. Spore odn. vegetativne ćelije C. botulinum se nalaze se u zemljištu, slatkim i slanim vodama, u crevima ĉoveka, sisara i riba. Same spore C. botulinum nisu patogene za ĉoveka jer prolaze bez ikakvih posledica kroz probavni trakt. Ljudi se intoksiciraju preko suvog mesa, kobasica, a naroĉito preko nesterilnih konzervi povrća i mesa u koje je C. botulinum izluĉio toksin.

C. tetani je specifiĉan po tome što su ćelije mlade kulture G(+), ali nakon 24 sata inkubiranja postaju G(–). C. tetani izluĉuje pravi egzotoksin (sastavom ĉist i homogen protein) koji se sastoji iz dva razliĉita rastvorljiva antigena: hemolizina (tetanolizina) i neurotoksina (tetanospazmina). Iako se tetanusni toksin vezuje gotovo za sva tkiva, najveći afinitet ima prema sivoj masi nervnog tkiva, za nju se vezuje tetanospazmin. Tetanolizin ima afinitet prema eritricitima koje hemolizuje. Toksin je neaktivan ako se unese oralnim putem jer ga razgraĊuje HCl ţeluca. TakoĊe je neaktivan i ako se unese konjuktivalnim ili rektalnim putem. Delovanje toksina se ispoljava delimiĉno na nervno tkivo kiĉmene moţdine - povećanjem refleksne nadraţajnosti, a delimiĉno na periferne nerve - izaziva mišićne spazme. Spore C. tetani se nalaze u zemljištu, intestinalnom traktu konja, svinja, krava i drugih ţivotinja, ponekad i ĉoveka. Rezervoar i najveći izvor spora je zemljište iz koga se, direktno putem ozleda na koţi, unose u organizam. C. perfringens ("perfringens" - probiti) je ranije imao naziv C. welchii. Spada meĊu najrasprostranjenije anaerobne mikroorganizme u zemljištu, vodi, fekalnim masama... Njegov toksin je odgovoran za moinekroze (gasne gangrene) kod ljudi i ţivotinja, kao i alimentarne toksikoinfekcije. Raspolaţe veoma aktivnim i raznovrsnim enzimima, produkuje znatne koliĉine lecitinaze od kojih je lecitinaza C. perfringens-a tipa A toksiĉna. C. perfringens je bakterijska vrsta koja produkuje najveći broj toksina, 5 egzotoksina su odgovorni za oboljenja ljudi i ţivotinja. Ovi egzotoksini su osnova toksikološke podele vrste na tipove: A, B, C, D i E. Osim ovih letalnih toksina, sojevi C. perfringens produkuju i nekoliko enzima koji mogu da imaju ulogu u patologiji. Sojevi tipa A i neki sojevi tipa C i D produkuju i enterotoksin koji je odgovoran za alimentarne toksikoinfekcije ljudi. Vegetativne ćelije stvaraju enterotoksin samo tokom sporulacije, spore prisutne u namirnicama koje preţive kuvanje (obiĉno u mesu i mesnim proizvodima) klijaju dajući veliki broj vegetativnih ćelija. Tako unete u organizam ćelije sporulišu oslobaĊajući enterotoksin. Pored patogenih vrsta klostridija postoji veliki broj onih koje nemaju zdravstveni znaĉaj. Ove nepatogene (netoksigene) vrste svojom fiziološkom aktivnošću tj. fermentacijom ugljenih hidrata i proteina, izazivaju promene senzornih i nutritivnih svojstava namirnica i njihovo kvarenje. Takve su: C. aceticum, C. acetobutylicum, C. baratii, C. beijerinckii, C. bifermentans, C. butyricum, C. cadaveris, C. pasterianum, C. polysaccharolitycum, C. propionicum, C. putrefaciens, C. putrificum, C. saccharolyticum, C. sporogenes, C. thermosaccharolyticum, C. tyrobutyricum. Uzevši u obzir rezervoare klostridija, izvesno je da su glavni izvori kontaminacije prehrambenih proizvoda ovim bakterijama, upravo sirovine koje sadrţi njihove spore. Dokazano je njihovo prisustvo u zemljištu, konzervama povrća, zaĉinima, medu, ĉajevima, mesu, ribljim konzervama, sušenom ribljem mesu, siru (epidemija botulizma u Italiji 1996), biofilmovima.

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS C. perfringens ("perfringens" - probiti) je ranije imao naziv C. welchii. Spada meĊu najrasprostranjenije anaerobne mikroorganizme u zemljištu, vodi, fekalnim masama... Njegov toksin je odgovoran za moinekroze (gasne gangrene) kod ljudi i ţivotinja, kao i alimentarne toksikoinfekcije. Raspolaţe veoma aktivnim i raznovrsnim enzimima, produkuje znatne koliĉine lecitinaze od kojih je lecitinaza C. perfringens-a tipa A toksiĉna. C. perfringens je bakterijska vrsta koja produkuje najveći broj toksina, 5 egzotoksina su odgovorni za oboljenja ljudi i ţivotinja. Ovi egzotoksini su osnova toksikološke podele vrste na tipove: A, B, C, D i E. Osim ovih letalnih toksina, sojevi C. perfringens produkuju i nekoliko enzima koji mogu da imaju ulogu u patologiji. Sojevi tipa A i neki sojevi tipa C i D produkuju i enterotoksin koji je odgovoran za alimentarne toksikoinfekcije ljudi. Vegetativne ćelije stvaraju enterotoksin samo tokom sporulacije, spore prisutne u namirnicama koje preţive kuvanje (obiĉno u mesu i mesnim proizvodima) klijaju dajući veliki broj vegetativnih ćelija. Tako unete u organizam ćelije sporulišu oslobaĊajući enterotoksin. Postupak izolovanja i identifikacije klostridija sastoji se iz dva dela. Prvi deo ĉini prethodni ogled koji podrazumeva termiĉku obradu odgovarajućeg razreĊenja uzorka i inkubaciju na sulfitnom agaru na temperaturi 37 oC u toku 3-5 dana. Drugi deo se sastoji od potvrdnog i završnog ogleda. Procedura

izolovanja, identifikacije i kvantifikacije sulfitoredukujućih klostridija, odnosno vrste C. perfringens prema

EU metodi podrazumeva zasejavanje u duplom sloju TSC (triptoza – sulfit – cikloserin) agara (slika ). Podloga se inkubira anaerobno na 37 oC tokom 20±2 h, nakon inkubiranja prebroje se crne kolonije u podlozi. Najmanje pet crnih kolonija sa TSC-a se gaji na dva krvna agara – jedan se inkubira aerobno, a drugi anaerobno na 37 °C 18-24 h (McIntosh lonac i Anaerocult®). Odsustvo rasta kulture pod aerobnim uslovima je potvrda nalaza sulfitoredukujućih klostridija. Identitet se potvrĊuje ispitivanjem redukcije nitrata, pokretljivosti ćelija, usvajanja laktoze i likvefakcije ţelatina. Bakterije koje daju crne kolonije na TSC agaru, nepokretne su, redukuju nitrat, produkuju kiselinu i gas iz laktoze i razlaţu ţelatin u toku 48 h se smatraju vrstom C. perfringens.

BACILLUS – BACILLUS CEREUS Bacillus vrste su meĊu najrasprostranjenijim bakterijama u prirodi, nalaze se u zemljištu, prašini, prirodnim i otpadnim vodama, na biljkama, organskim materijalima, u namirnicama, naroĉito cerealijama, sušenim proizvodima biljnog porekla, zaĉinima... Izolovan je iz stolice 15% zdravih ljudi. Bacillus sp. su sporogene aerobne i fakultativno anaerobne, štapićaste, G(+) bakterije. Štapići su krupni, neki su i meĊu najvećim bakterijama uopšte. Većina vrsta je pokretna, snabdevena peritrihijalnim flagelama, dok su samo neke vrste nepokretne. Tipiĉni nepokretni predstavnik je B. anthracis. Sve Bacillus vrste su katalaza pozitivne bakterije, ali oksidaza varijabilne. Endospore su centralne ili subterminalne, po obliku ovalne ili okrugle, ne deformišu ćelije, mada u nekih vrsta spore mogu biti većeg dijametra od širine ćelija. Do produkcije endospora dolazi samo u prisustvu kiseonika. Spore karakteriše termorezistentnost koja je razliĉita kod pojedinih vrsta. Najvišu rezistentnost imaju spore B. stearothermophilus, koje opstaju više minuta na 121 °C. Jedini pravi patogeni predstavnik roda Bacillus za ĉoveka je B. anthracis, uzroĉnik antraksa. Ostale Bacillus vrste su generalno saprofiti. Usled proteolitiĉke, saharolitiĉke ili lipolitiĉke aktivnosti pojedine vrste su veoma frekventni uzroĉnici kvarenja razliĉitih proizvoda, posebno od mesa, mleka, mlinskih i pekarskih proizvoda. B. cereus, B. subtilis, B. licheniformis su uslovno patogene vrste i mogu biti uzroĉnici alimentarnih toksikoinfekcija. B. subtilis, osim alimentarnih toksikoinfekcija, uzrokuje infekcije koţe i sluzokoţe (naroĉito oĉiju). Oĉna oboljenja najĉešće su profesionalnog karaktera (osoba koje su u kontaktu sa prašinom, biljnim materijalima, slamom i senom). Intersantna je grupa B. subtilis–mesentericus koje izazivaju karakteristiĉno kvarenje unutrašnjosti hleba (konĉavost ili krompirovu bolest hleba). Zdravstveni znaĉaj imaju toksikogeni sojevi Bacillus cereus. Postoje dve vrste enterotoksina koje mogu da produkuju sojevi i koji izazivaju dva razliĉita oblika oboljenja. Dijarejalni enterotoksin i emetiĉni enterotoksin. Zabeleţena su trovanja kuvanim pirinĉem, ţitaricama, pudingom, supama, jelima od povrća, mesa, posebno gde su korišćeni zaĉini za njihovu pripremu. U MaĊarskoj se masovne alimentarne toksikoinfekcije izazvane ovom bakterijom povezuju sa obilnim korišćenjem zaĉina u pripremi hrane. Optimalna temperatura rasta je 28-35 oC, minimalna je 5 oC a maksimalna 45-55 oC. Osetljivost na pH: min. 4,35 max. 9,3. Prema osetljivosti na aktivnost vode, (aw) min. 0,95. Izolovanje i identifikacija B. cereus vrši se na sledeći naĉin. Odgovarajuće razreĊenje uzorka se prvo termiĉki tretira, zatim površinski zaseje na MYP agar (manitol – ţumance – polimiksin B) i inkubira na temperaturi 30 oC tokom 24-48 h pod aerobnim uslovima. Uoĉava se rast krupnih (d=3–7 mm), ruţiĉastih kolonija neravnih ivica, koje su okruţene prosvetljenom zonom usled lecitinazne aktivnosti, što ukazuje na prisustvo B. cereus. Većina ostalih Bacillus vrsta su manitol pozitivni, pa su im kolonije ţute boje i bez zone prosvetljenja jer ne produkuju lecitinazu. Najmanje pet karakteristiĉnih kolonija preseje se na krvni agar i inkubira na temperaturi 30 °C tokom 18-24 h pod aerobnim uslovima. B. Cereus daje pozitivnu reakciju hemolize (β hemoliza). Oko kolonija na krvnom agaru javlja se potpuno ĉista zona. Potvrdni test dobija se fiziološkim ispitivanjima redukcije nitrata, fermentacije glukoze, likvefakcije ţelatina i katalaza testom. Bacillus cereus je katalaza pozitivan, redukuje nitrate, anaerobnom razgradnjom glukoze menja boju podloge u ţutu, ne oslobaĊa gas i otapa ţelatin.

LISTERIA MONOCYTOGENES Fakultativno anaerobni, asporogeni, G(+) kratki štapići. Flagelarno pokretni na 22 oC, nepokretni na 37 oC. Rod Listeria obuhvata 6 vrsta od koji je zdravstvo znaĉajna samo jedna. Listeria (u ĉast lorda Listera, engleskog hirurga); monocytogenes znaĉi produkcija monocita tj. sposobnost inficiranja krvnih ćelija. 1-10% ljudi mogu sadrţati u crevima L. monocytogenes. Bakterija je otkrivena kod sisara, ptica, nekih vrsta riba i ljuskara. Moţe se izolovati iz zemljišta, silaţe i drugih prirodnih okruţenja i industrijskog bilja. Prema mestima izolovanja povezana je sa sirovim i pasterizovanim mlekom, sirom, sladoledom, sveţim povrćem, fermentisanim sirovim kobasicama, sirovim i kuvanim ţivinskim mesom, sirovim mesom i sirovom i dimljenom ribom. L. monocytogenes je dovoljno rezistentna na efekte zamrzavanja, sušenja i zagrevanja, iznad granica oĉekivanja za asporogene bakterije. Moţe da raste na temperaturi niţoj od 0 oC, što dopušta umnoţavanje u hrani iz friţidera. L. monocytogenes se razmnoţava na temperaturama izmeĊu 0 i 45 ºC. Skladištenje smrznute hrane na –18 ºC tokom 6 meseci, ne dovodi do znaĉajne redukcije broja vijabilnih ćelija. Prisustvo L. monocytogenes na trupovima ţivotinja najĉešće se pripisuje fekalnoj kontaminaciji. Kontaminacija mleka preko facesa ili vimena obolele ţivotinje. Ostaci hrane na opremi, biofilmovi, radnici, vazduh, insekti i glodari mogu biti izvor kontaminacije u pogonu. Smatra se da naroĉito veliki rizik nosi organski proizvedeno voće i povrće. L. monocytogenes izaziva listeriozu, koja se manifestuje kao septikemija, meningitis, encefalitis i intrauterina infekcija ili infekcija grlića materice kod trudnica, koja moţe rezultovati u spontani abortus ili mrtvoroĊenje. Prvi znaci ove bolesti obiĉno prethode simptomima koji su sliĉni influenci, što ukljuĉuje istrajnu temperaturu. Gastrointestinalni simptomi mogu prethoditi ozbiljnijim oblicima ili mogu biti jedini ispoljeni simptomi. Ukupno gledano mortalitet od listerioze je od 20-30% zbog ĉega listerioze predstavljaju sve veći problem. Ciljna populacija za listeriozu su trudnice, imunokomporomitovane i starije osobe, osobito kada je hrana jako kontaminirana ovim organizmom. Opstaje u kiseloj sredini na pH < 4,3 ali se ne razmnoţava. Sirćetna, limunska i mleĉna kiselina u koncentracijama od 0,1% kao konzervirajuća sredstva mogu da inhibiraju rast ove bakterije. Dugo opstaje u srednje vlaţnoj hrani sa aw=0,83. Tolerantna je na 6,5% NaCl, neki sojevi se razmnoţavaju u prisustvu 10-12% NaCl. Vakuum pakovani proizvodi i proizvodi pakovani u modifikovanoj atmosferi nisu zdravstveno bezbedni po pitanju L. monocytogenes. Podaci o toplotnoj izdrţljivosti su razliĉiti. U sluĉajevima kada se u proizvodnji kombinuju niske vrednosti aw i toplotna obrada, otpornost na toplotu se povećava, što moţe da predstavlja problem. WHO je objavila da je pasterizacija siguran proces koji smanjuje brojnost L. monocytogenes u sirovom mleku, do nivoa koji neće predstavljati rizik po zdravlje ljudi. L. monocytogenes moţe formirati biofilmove na površini materijala koji su prisutni u industriji, kao što su ĉelik, staklo, liveno gvoţĊe i plastika. Njen biofilm je najviše izuĉavan u statiĉnoj kulturi (batch system), kao i inhibicija ili poboljšanje rasta L. monocytogenes u biofilmu mešane kulture. Ćelije L. monocytogenes biofilma su rezistentnije na 4o amonijumova jedinjenja (quats), anjonske kiseline, hipohlorite, jod, peroksisirćetnu kiselinu i fenol, nego planktonske ćelije. Uz pomoć mutanta za flagelin dokazano je da je flagelama olakšano rano stanje priljubljivanja na ĉelik. Analiza proteina pokazuje da ih je nekoliko više ekspresovanih u biofilmu nego u planktonskim ćelijama. Ovi proteini su ukljuĉeni u globalni metabolizam ugljenika, (oksidativni) stres odgovor, DNK oporavak i zaštitu, i ćelijsku deobu. U mikrobiološkim zahtevima traţi se odsustvo u 25 g uzorka hrane, uz prethodno obogaćenje. Postupak izolovanja i identifikacije L. monocytogenes se izvodi tako što se prvo vrši homogenizacija 25 g uzorka sa 225 ml „half Fraser broth“. Inkubira se na 30 oC tokom 24 h. Nakon toga se 1 ml obogaćenog „half Fraser broth“-a prenese u 10 ml Fraser broth-a i inkubira se na 37 oC tokom 48 h. Ostatak iz „half Fraser broth“-a se zasejava na selektivne podloge, Oxford agar (aerobno) ili Palcam agar (mikroaerofilno) i inkubira na 30 ili 37 oC tokom 48 h. Isto tako se vrši i zasejavanje sa Fraser broth-a. Podloge se pregledaju nakon 24 h na prisustvo karakteristiĉnih kolonija. Listeria spp. hidrolizuje eskulin u eskuletin i daje crnu zonu oko kolonija. Nakon 48 h inkubiranja sivo-zelene kolonije su preĉnika 2-3 mm sa centralnim udubljenjem.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Rod Staphylococcus pripada familiji Micrococcaceae,a obuhvata vrste S. aureus, S. epidermidis,S. intermedius, S. saprophyticus... To su G(+) koki bakterije, nepokretne, formiraju grozdove (ali sa ĉvrstih podloga), fakultativni su anaerobi. Na krvnom agaru daju zonu hemolize (β), katalaza su pozitivne. Naziv izveden od grĉke reĉi "staphyle" što znaĉi groţĊe i "coccus" što znaĉi zrno ili bobica. Ime roda oznaĉava klastere koji liĉe na groţĊe i formiraju se tokom rasta; aureus znaĉi zlatan što oznaĉava ţutu boju kolonija S. aureus na ĉvrstim podlogama. Jedan je od najĉešćih uzroĉnika alimentarnih toksikoinfekcija. Nalazi se u prašini, vazduhu, vodi, mesu, mleku i mleĉnim proizvodima, peškirima, odeći, opremi i alatima. Hrana koja je uĉestalo kontaminirana stafilokokama i ĉest je uzroĉnik trovanja ukljuĉuje mesne proizvode, ţivinske i proizvode od jaja, salate, pekarske proizvode, punjenja za sendviĉe, mleko i mleĉne proizvode. Ĉesto je izvor stafilokoknog trovanja hrana koja zahteva znaĉajni ruĉni rad tokom pripreme i nestruĉna manipulacija hranom, nepravilno hlaĊenje i podregavanje ranije pripremljene hrane, ĉuvanje više sati pri temperaturama iznad 20 oC. Ljudi koji rukuju hranom su obiĉno glavni izvori kontaminacije namirnica i izbijanja trovanja, ali i oprema i radne površine mogu takoĊe biti izvori kontaminacije sa S. aureus. Ljudi i ţivotinje su primarni rezervoari stafolokoka. Stanovnik je gornjih respiratornih organa i koţe. U ljudskoj populaciji svaka treća osoba ima S. aureus asimptomatski u nosu, kao zdrav kliconoša. Upravo je ĉest izvor zaraze nos i nazofaringealni sekret. Ĉovek je glavni izvor kontaminacije ţivotnih namirnica enteropatogenim S. aureus. S. aureus se razmnoţava na temperaturama izmeĊu 6 – 46 oC (optimalna je 30 – 37 oC), a toksine stvara izmeĊu 10 i 45 oC (maksimalno izmeĊu 35 i 37 oC). Pod aerobni uslovima min. pH za razmnoţavanje i sintezu toksina je 4,2 a minimalna aw je 0,83–0,86. Ova bakterija je otporna na povišene temperature, na 60 ºC opstaje 1 h. NaĊena je na odmrznutoj hrani, što znaĉi da moţe da ostane dugo vijabilna u uslovima skladištenja smrznutih proizvoda -18 ºC. Pokazuje veliku toleranciju prema NaCl i šećeru (halofilan i osmofilan), zbog ove osobine vrlo brzo se razmnoţava u slanim i slatkim proizvodima. Otporna je i na isušivanje. S. aureus proizvodi niz endotoksina i egzotoksina od kojih su najznaĉajniji enterotoksini (oznaĉeni sa A–F). 70 – 80% stafilokoknih trovanja vezano je za enterotoksin A. Izazivaju povraćanje, bolove u stomaku, groznicu. Enterotoksini su termostabilni, otporni prema temperaturi od 100 ºC a ostaju neoštećeni 20 min. na 120 ºC. Ostaju u hrani nakon tretmana toplotom iako su ćelije uništene. Prisustvo toksina utvrĊuje se ELISA testom. Riskantne koliĉine toksina S. aureus nastaju kada je broj prisutnih ćelija u hrani ≥ 105

ćelija/g. Postoje okolnosti gde je nemoguće izbeći prisustvo toksin produkujućih bakterija S. aureus (neke vrste sireva i fermentisana mesa) i Bacillus cereus (pirinaĉ, skrobovi, ţitarice) gde je onda potrebno spreĉiti umnoţavanje ćelija i produkciju toksina podešavanjem temperature i vremena ĉuvanja. Ostala oboljenja – gnojne infekcije: apscesi (lokalna gnojna upala koja se moţe razviti u potkoţnom tkivu, ali i u dubokim tkivima i organima, ĉirevi, stafilokokna angina, mastitis... Radnici koji su bolesni (respiratorna infekcija), ili imaju ĉireve, ili apscese na koţi ne smeju da budu u kontaktu sa hranom. Vrste roda Staphylococcus brzo stiĉu rezistenciju na brojne antibiotike. Zbog toga je terapiju bolje sprovoditi prema rezultatima antibiograma nego prema doktrinarnim stavovima. Ukoliko zbog hitnosti ne moţe da se saĉeka rezultat antibiograma, u terapiji stafilokoka se preporuĉuju penicilinaza-rezistentni antibiotici: meticilin, nafcilin i izoksazolil penicilini. Kako se, meĊutim, u poslednje dve dekade pojavljuju sojevi rezistentni na navedene lekove, kao lek rezerve preporuĉuje se vankomicin ili neki preparat iz grupe makrolidnih antibiotika. Methicillin-resistentni sojevi Staphylococcus aureus (MRSA) su odgovorni za teške infekcije. MRSA se definiše kao svaki soj Staphylococcus aureus koji je razvio rezistenciju na beta-laktamske antibiotike u kojespadaju penicilinski preparati (meticilin, dikloksacilin, nafcilin, oksacilin...) i cefalosporini. MRSA predstavljaju poseban problem u bolnicama gde su pacijenti izloţeni operativnim zahvatima, invazivnim dijagnostiĉkim metodama, sa otvorenim ranama i oslabljenim imunim sistemom jer su tako izloţeni većem riziku nego opšta populacija. Većina studija o formiranju biofilma sa S. aureus je uraĊena sa površina predmeta koji se koriste u medicini. S. aureus jedna od glavnih bakterija koja formira biofilmove na protezama, u tim sluĉajevima izaziva infekcije koje su vrlo teške da se tretiraju antibioticima. Formira

biofilmove na razliĉitim površinama, kao što su hidroksiapatit, ĉelik, staklo, i sve vrste plastike kao što su polistiren, polipropilen i silikon. U šarţnoj kulturi, u formiranom biofilmu je broj ćelija 5 x 106 do 8 x 107 CFU/cm2 posle 24 – 48 sati; S. aureus formira biofilm u hemostatu, brojnost varira od 3 x 106 CFU/cm2 posle 4 dana, do 2 x 108 CFU/cm2 posle 13 dana. Ćelije S. aureus-a iz biofilma su rezistentnije na antibiotike, dezinficijense i enzime. Spekuliše se da rezistencija prema enzimima moţe zavisiti od debljine biofilma. Postojanje rezistencije prema antibioticima moţda je zato što je promenjen fiziološki status ćelija, kao što je promena permeabilnosti membrane, promene u molekulskom cilju antibiotika, indukciji enzima koji degradiraju antibiotike, produkciji egzopolisaharida i sporijem rastu. Prihvaćeno je da je sposobnost koagulisanja plazme pouzdan pokazatelj potencijalne patogenosti izolovanog soja. Većina sojeva Staphylococcus aureus prodikuje koagulazu, kao i nekoliko vrsta samog roda Staphylococcus koji mogu koagulisati krvnu plazmu. Postupak izolovanja i identifikacije koagulaza(+) stafilokoka: iz odgovarajućeg razreĊenja uzme se 1 ml inokuluma i zaseje na slani bujon koji sadrţi 10% NaCl. Inkubira se na temperaturi od 37 oC tokom 24 sata. Nakon toga se vrši površinsko presejavanje na Ĉapman i/ili Baird-Parker agar na kojem se inkubacija vrši na temperaturi od 37 oC tokom 24–48 h. Karakteristiĉne kolonije se ispituju na sposobnost koagulisanja plazme na 2, 4, 6 i 24 h. Na slici je prikazan izgled ćelija na podlogama za izolovanje: Baird–Parker agar sadrţi još i LiCl i K-telurit radi inhibicije rasta pratećih mikroba. Kolonije na ovoj podlozi su crne, konveksne i sjajne, a oko kolonije se obrazuje prozirna zona usled lipolitiĉke i proteolitiĉke aktivnosti. Na podlozi po Ĉapmanu, koja je inaĉe crvene boje, kolonije su ţute i okruţene su ţutom zonom.

ENTEROCOCCUS G(+), fakultativno anaerobne koki bakterije koje se nalaze pojedinaĉno, u parovima ili kratkim lancima. Većina sojeva raste na temperaturi 10–45 °C, optimum je 35 °C. Rastu na podlozi sa dodatkom 6,5 % NaCl. Skoro svi sojevi su homofermentativni, bez produkcije gasa. Enterokoke dobro preţivljavaju u nepovoljnim uslovima sredine. ,,Fekalni streptokoki” upućuje na one streptokoke koje su obiĉno prisutne u izmetu ljudi i ţivotinja. Svi poseduju grupni D antigen, tj. ćelijski zid sadrţi antigen za glicerol-tejhojnu kiselinu (antigen streptokokne D grupe). Taksonomski rodovi Enterococcus: E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. durans, E. casseliflavus, E. malodoratus, E. avium... i Streptococcus: S. bovisi, S. equinus. Enterokoke su normalni stanovnici intestinalnog trakta sisara i prisutni su u fecesu, ali su takoĊe sposobni da preţive i rastu u velikom varijetetu razliĉitih okruţenja, tako da njihovo prisustvo u hrani nije obavezno indikator direktne fekalne kontaminacije. Prisustvo enterokoka kao indikatora fekalnog zagaĊenja u vodi je opšteprihvaćeno, dok za njihovo prisustvo u hrani ne vlada isto mišljenje. Znaĉaj kao agenasa u humanim oboljenjima je u porastu uglavnom zbog njihove rezistencije na antimikrobne agense na koje su druge streptokoke uglavnom osetljive. Testovi in vitro sa enterokokama su pokazali da ovi organizmi imaju MIC vrednosti za penicilin koje su 10–100 puta veće nego kod drugih streptokoka. Enterokoke su vaţni uzroĉnici nazokomijalnih (bolniĉkih) infekcija u SAD (treći po uĉestalosti). E. faecalis je najraširenija vrsta povezana sa 80–90 % humanih enterokoknih infekcija. E. faecium je drugi po uĉestalosti izolacije iz 10 –15 % infekcija. Ostale vrste enterokoka, ukljuĉujući E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E. gallinarum, E. raffinosus, E. hirae, E. malodoratus i E. mundtiisu retko izolovani kod humanih infekcija. Ostale vrste su retke kod humanih kliniĉkih uzoraka ili su primarno naĊene u gastrointestinalnom traktu razliĉitih ţivotinja. Enterokokne vrste uzroĉnici su komplikovanih infekcija urinarnog trakta, bakteriemije, endokarditisa, intraabdominalnih infekcija, infekcija rana i mekih tkiva, neonatalne sepse i reĊe meningitisa. Faktori koji determinišu patogenost enterokoka nisu najbolje razjašnjeni. Neki sojevi E. faecalis i E. faecium produkuju citolizin koji deluje kao hemolizin na eritrocite ljudi, zaĉeva, konja i goveda, ali ne i na ovĉije eritrocite. Ovaj citolizin toksiĉan je za izvesne tipove eukariotskih ćelija. Agregaciona supstanca je na površinski sa plazmidom vezani kodirani protein koji pomaţe grupisanje ovih organizama kako bi se olakšalo izmenjivanje plazmida. Za ovu supstancu takoĊe se veruje da ima funkciju u adherenciji na intestinalne i renalne epitelne ćelije i u srĉanoj vegetaciji kod eksperimentalnog modela endokarditisa. Sojevi E. facalis takoĊe produkuju feromone (mali peptidi) - konjugativni transfer plazmidske

DNK izmeĊu sojeva. Neki sojevi E. faecalis produkuju plazmidom kodirani 7,4 kDa bakteriocin, nazvan AS–48, koji ima litiĉku aktivnost za široki spektar G(+) i G(–) bakterija. Neki sojevi E. faecalis produkuju razliĉite ekstracelularne enzime kao npr. ţelatinazu i hijaluronidazu. E. faecalis – najĉešće je izolovan iz humanih kliniĉkih uzoraka i iz humanog gastrointestinalnog trakta. TakoĊe naĊen je i u gastrointestinalnom traktu ţivine, stoke, svinja, pasa, konja, ovaca i gusaka. E. faecium – naĊen je najĉešće kod humanih kliniĉkih uzoraka. Uglavnom je više rezistentan na antimikrobna sredstva u odnosu na E. faecalis. NaĊen je u gastrointestinalnom traktu razliĉitih vrsta ţivotinja. E. avium – izolovan je iz ptica, pasa i humanog gastrointestinalnog trakta. E. durans – retki su kliniĉki izolati, a ĉešće se mogu naći u mleku i mleĉnim proizvodima. E. casseliflavus – otkriven je na biljkama, u zemljištu i retko u fecesu pilića, a klasifikovan je kao podvrsta E. faecium. Produkuje ţuti pigment, ćelije su pokretne, oportunistiĉki je agens u humanim infekcijama. E. galinarum – izolovan je iz fecesa pilića, jedan je od dva pokretna enterokoka. TakoĊe je naĊen i kod pacijenata na hemodijalizi. E. malodoratus – izolovan je iz gauda sira i nepasterizovanih mleĉnih proizvoda. Ime znaĉi ,,miris na bolest“. E. mundtii – ţuto pigmentisane kolonije. Izolovan je iz biljaka, zemlje, gastrointestinalnog trakta stoke, svinja i konja. E. hirae – uzrokuje smanjenje rasta kod pilića. Izolovan je iz guše i fecesa pilića, iz gastrointestinalnog trakta stoke, svinja, pasa, konja, ovaca, gusaka i zeĉeva. Tipski soj (E. hirae ATTC 8043) ima kompleksne nutritivne zahteve i koristi se u industriji hrane kao organizam za biološki ogled za aminokiseline i vitamine.

ESCHERICHIA COLI Theodor Escherich je prvi opisao E. coli (1885. god.) kao Bacterium coli commune, a izolovao ju je iz fecesa bebe. Dugo vremena je ova vrsta smatrana kao komensalni organizam debelog creva ("enteriĉna bakterija”). Do 1935. godine nije izolovan soj koji izaziva dijareju, osim kod beba. Najviše i najbolje ispitana enteriĉna bakterija mada su, po zdravstvenom znaĉaju, meĊu njima mnogo vaţnije vrste roda Salmonella – izazivaĉi tifusne groznice i Shigella vrste – izazivaĉi dizenterije. E. coli pripada familiji Enterobacteriaceae, to su G(–), asporogene, štapićaste, flagelarno pokretne bakterije. Većina sojeva dobro raste u laboratorijskim uslovima, u prisustvu/odsustvu kiseonika što znaĉi da im je metabolizam prilagoĊen na respiraciju ili fermentaciju. Komensalni E. coli sojevi debelog creva ljudi i toplokrvnih ţivotinja ĉine oko 1% ukupne bakterijske mase u toj sredini. Ove populacije E. coli odrţavaju konstantan fluks. Najĉešći izvor novih serotipova je preko oralnog unošenja. Ugljene hidrate razlaţe uz stvaranje gasa i kiseline, ima lipolitiĉku aktivnost, a ponekad i proteolitiĉku (truleţnu). Optimalna temperatura razmnoţavanja je 37º C, mada se razmnoţava i na 45º C, i na niţim od 4o C. Lako se uništava toplotnim tretmanima koji se koriste u prehrambenoj industriji, na 60o C uništava se za 15 min, a na 90o C za 4 min. Minimalan pH za rast je 4,3. Umereno je osetljiva prema NaCl. E. coli O157 se uništava kuvanjem ukoliko se u svim delovima hrane postigne temperatura 70o C i više. Identifikovano je više od 700 serotipova na osnovu O (somatski) i N (flagelarni) antigena. Crevna oboljenja su uzrokovana alimentarnim toksikoinfekcijama, dok piogena oboljenja izazivaju sojevi koji ţive u digestivnom traktu (infekcije urogenitalnog trakta, ţuĉne kese i vodova, ţuĉni kamenac...). Patogeni serotipovi produkuju verotoksin (ili šigatoksin) koji predstavlja jedan od najjaĉih toxina za ĉoveka. CDC (Centar za kontrolu i prevenciju bolesti) ga je proglasio za potencijalno biološko oruţje. Serološki tipovi E. coli koji izazivaju oboljenja dele se u 5 grupa u zavisnosti od virulentnosti: enterotoksigene (ETEC) – sintetišu enterotoksin

enteropatogene (EPEC)

enteroinvazivne (EIEC)

enterohemoragiĉne (EHEC) – O157:H7

enteropatogene (EPEC)

enteroagregatne (EAggEC).

Samo prve 4 se prenose vodom i hranom, meĊusobno se razlikuju po patogenosti. Patogeni E. coli sojevi odgovorni su za tri tipa infekcija kod ljudi: infekcije urinarnog trakta, neonatalni meningitis i intestinalna oboljenja. Uropatogene E. coli izazivaju 90% UTI kod anatomski obiĉnih ljudi, preko fecesa i perinealnog regiona; 14 puta ĉešće kod odraslih ţena. Znaĉajan je izazivaĉ dijareja kod beba i putnika u nerazvijene zemlje i krajeve sa lošim sanitarnim uslovima. Simptomi mogu biti od minornih do problema sliĉnog sindromu kolere. Dobija se unošenjem kontaminirane hrane i/ili vode, nakon ĉega dolazi do kolonizacije i nastajanja jednog ili više plazmidno kodiranih enterotoksina. Produkovani enterotoksini mogu biti termolabilni (LT) ili termostabilni (ST), što je takoĊe opet plazmidno zavisno. LT je sliĉan kolera toksinu po strukturi i naĉinu delovanja. ST je mali peptid (molekulske mase oko 2.000 Da). Dijareja bez groznice se javlja usled kolonizacije bakterija u GIT-u, sa fimbrijalnim adhezinom, i produkcije toksina. Enteroinvazivne E. coli (EIEC) blisko povezane sa Shigella vrstama u smislu mehanizma patogenosti i ispoljavanju bolesti. Prodiru i umnoţavaju se u epitelnim ćelijama kolona izazivajući njihovu široku destrukciju, ali ne produkuju nikakav toksin. Sindrom kod dizenterije tog tipa je dijareja sa groznicom. Enteropatogene E. coli (EPEC) indukuju vodenastu dijareju sliĉnu ETEC, ali one nemaju kolonizujući faktor. Ne produkuju LT ni ST toksine, njihov adhezin je oznaĉen kao intimin – protein spoljašnje membrane koji uĉestvuje u završnoj fazi adhezije. Mogu da produkuju enterotoksin sliĉan šigeloznom. Adhezija EPEC je specifiĉan i sloţen proces, pa je ĉak po tome izvedena podela sojeva meĊu najĉešćim putniĉkim dijarejama u Meksiku i severnoj Americi. Enteroagregatne E. coli (EAggEC) sojevi su sposobni da napadaju tkiva, izazivaju dugotrajne dijareje kod dece. Adheruju se na intestinalnu mukozu, mogu da produkuju HLT. Produkuju i hemolizin koji je svojstven sojevima koji izazivaju urinarne infekcije. Enterohemoragiĉne E. coli (EHEC) reprezentuje jedan soj (serotip O157:H7) koji izaziva sindrom dijareje razliĉit od EIEC i Shigella vrsta. Razlika je u tome što je obilno krvava, ali bez temperature i u duţem vremenu izaziva toksiĉne efekte na bubrege (hemolitiĉna uremija). EHEC se smatra uzroĉnikom ozbiljnog oboljenja koje je najĉešće povezano sa unošenjem nedovoljno termiĉki tretiranim jelima tipa hamburgera. Kod dece moţe biti fatalna (zbog bubrega). Smatra se umereno invazivnom. Produkuje toksin identiĉan šigeloznom. Terapija podrazumeva lizis ćelija E. coli koje su u procesu deobe u prisustvu β-laktamskog antibiotika. Poznato je da su neki β-laktamski antibiotici (npr. ampicilin i cefalosporin) efikasni u tretmanu meningitisa izazvanog sa E. coli. β-laktamski antibiotici ometaju sintezu ćelijskog zida, koji tako postaje sve slabiji i dovodi do rupture ili lizisa.

SALMONELLA

Salmonella vrste su G(+), fakultativno anaerobne, štapićaste bakterije. Pripadaju istoj familije kao Escherichia coli, tj. pripadaju familiji Enterobacteriaceae, trivijalnog naziva "enteriĉne" bakterije. Salmonele su skoro isto ispitivane kao E. coli po pitanju strukture, biohemije i na molekulskom nivou, ali su još oskudna znanja o ekologiji. Ţive u intestinalnom traktu ţivotinja. Neke vrste su ubikvitarne, dok su ostale specijalizovane, tj. adaptirane na posebnog domaćina. Salmoneloze koje izazivaju su: enteriĉna groznica (tifus, paratifus), izazivaju je invazivni sojevi koji prodiru u krv, i akutni gastroenteritis koji nastaje unošenjem inficirane/intoksicirane hrane. Klasifikacija salmonela zasnovana je njihovom antigenom sastavu. Postupak odreĊivanja antigena naziva se serotipizacija. Salmonella vrste imaju ĉetiri vrste antigena, od kojih su treći i ĉetvrti retko zastupljeni: Somatski O antigen je glikolipidopolisaharid koji je sastavni deo ćelijskog zida i istovremeno

termostabilan endotoksin.

Flagelarni H antigeni su termolabilni jer su proteinske prirode, predstavljaju specifiĉne antigene

salmonela.

Antigen Vi ili ovojni antigen (Vi potiĉe od virulencije) se uništava dvoĉasovnim kuvanjem.

Fimbrijalni antigeni su veoma retki.

U praksi se ne koriste zvaniĉni nazivi za vrste i podvrste, nego se imena serotipova koriste kao imena vrsta. Salmoneloze izaziva preko 2200 serotipova salmonela. Manifestuju se poremećajima u GIT-u, simptomi mogu biti opšti, kao što su abdominalni bol, groznica, muka, povraćanje i dijareja; i posebni poput dehidratacija organizma, glavobolja i pojava krvi u stolici. Bojenje flagela Salmonella typhi je sliĉno kao kod

E. coli. Salmonella vrste su pokretne peritrihnim flagelama, vrlo su sliĉne Shigella vrstama jer izazivaju enteriĉne infekcije. Rod Salmonella prema najnovijoj taksonomiji sadrţi samo dve vrste: S. enterica (6 podvrsta) i S. bongori. Sa zdravstvenog aspekta najznaĉajniji su serotipovi S. enterica: typhi, paratyphi A i C, enteritidis, typyhimurium, newport i stanley. Otporne su na niske temperature i isušivanje, opstaju i u smrznutoj hrani, ali su manje otporne na visoke temperature od E. coli. 3-4% NaCl deluje inhibitorno, a koncentracije iznad 9% baktericidno. Minimalan pH za opstanak je 4,5. Imaju bogat ugljenohidratni metabolizam, saharolitiĉke su bakterije. Produkuju H2S. Jedan od najvaţnijih rezervoara salmonela je ţivina, odakle dospevaju u meso i jaja. Najĉešće se povezuju sa kontaminacijom jaja: 1994. godine obolelo je više od 224.000 ljudi u velikoj epidemiji salmoneloze, ĉiji je uzroĉnik bila S. enteritidis poreklom iz sladoleda proizvedenog od mleka koje je transportovano vozilom u kojem se prethodno nalazio melanţ. Za razne kremove i namaze koriste se sveţa jaja, termiĉki neobraĊena jaja su siguran put za unos ovih bakterija. Izolovane su i iz ĉokolada u kojima je izvor kontaminacije bio kakao zrno, zatim iz sušenog kokosa i pudinga. Poslednjih godina beleţi se sve veći broj sluĉajeva trovanja preko kontaminiranog voća i povrća. Šećer i so ne predstavljaju pogodnu sredinu za razmnoţavanje salmonela, ali se one mogu pasivno odrţavati dok se ne steknu odreĊeni uslovi. Poĉetkom XIX veka je sa kliniĉkim znacima i simptomima definisan tifus, iz tog vremena se enteriĉna groznica definiše kao tifusna. 1880. godine Eberth je prvi zapazio i opisao tifoidni štapić. Robert Koch je potvrdio to otkriće i zajedno sa Gaffky uspešno kultivisao ćelije 1881. godine ali dalja ispitivanja nisu bila moguća. 1896. godine pokazano je da se serum iz ţivotinje, koja je imunizovana sa ovakvom bakterijom, aglutinira odn. spaja sa bakterijskim ćelijama. To je posredan dokaz za pacijenta, odn. poĉetak serološke dijagnoze za salmonele. DNK sastav je 50-52 mol% G+C, što je vrlo sliĉno sa rodovima Escherichia, Shigella i Citrobacter, a velika sliĉnost je potvrĊena i numeriĉkom taksonomijom kao i 16S ssRNK analizama. Nomenkaltura salmonela je kontroverzna u odnosu na originalni taksonomski pristup, nazivi vrsta i meĊusobna veza nisu na bazi DNK sliĉnosti već na osnovu kliniĉkih ispoljavanja: Salmonella typhi, Salmonella cholerae-suis, Salmonella abortus-ovis... U Kauffmann-White šemu su ugraĊene serološke analize (1946 god.) pa su vrste specifiĉno opisane, tako da su serovari su postali vrste. S. typhi-murium, S. cholerae-suis su u suštini ubikvitarni. Ĉesto su nazivi davani po geografskoj odrednici gde su prvi put izolovani: S. london, S. panama, S. stanleyville.

SHIGELLA Pripada familija Enterobacteriaceae. Rod Shigella podrazumeva G(–), fakultativno anaerobne, nepokretne, asporogene bakterije. Serološki su sliĉne E.coli, serotipizacija se vrši na osnovu njihovih somatskih O antigena. Sve ĉetiri vrste roda Shigella: S. flexneri, S. boydii, S. sonnei (najblaţa forma) i S. dysenteriae (tip 1) produkuje šigelozni toksin, izazivaju dizenteriju ili šigelozu (krvav feces sa intestinalnim bolovima). Ćelije napadaju epitelni sloj ali ne penetriraju u njega, obiĉno posle 2-3 dana dolazi do dizenterije kao rezultata oštećenja sloja, ĉesto sa oslobaĊanjem mukoze i krvi uz leukocite. MeĊutim vodenasta dijareja se ĉesto javlja bez ostalih znakova. Šigelozni toksin je hromozomski kodiran, pripada neurotoksinima, kao i entero- i citotoksinima. Inhibira sintezu proteina delujući na 70S ribozome i lizirajući 28S rRNK. Njegova uloga u patogenezi je nesigurna jer toksinski negativni mutanti i dalje izazivaju bolest. Šigeloza je primarno deĉija bolest koja se dobija fekalno-oralnim kontaktom. Odrasli ih mogu dobiti od dece, mada se moţe dobiti i inficiranjem hrane od strane kliconoša (ĉistoća ruku). Ljudi i šimpanze su jedini rezervoari. Bakterije roda Shigella su rasprostranjene širom sveta, šigele se prenose sa osobe na osobu, ali ne smeju se zaboraviti mogući kanali preko kontamirane vode i hrane. Epidemije šigeloze se javljuju u prenaseljenim sredinama, gde osobe prenosioci postoje u odreĊenim okolnostima. Pošto je bolest uĉestalija u periodu godine kada su najbrojniji leteći insekti, smatra se da se infekcija moţe širiti i tim putem. Mali inokulum S. sonei ili flexneri (do 100 mikroorganizama) je dovoljan da uzrokuje infekciju. Oko 10 ćelija S. dysenteriae mogu uzrokovati kliniĉki manifestnu bolest. Oko 14.000 laboratorijski potvrĊenih sluĉajeva šigeloze i procenjenih 448.240 (većina S. sonei) se javljaju u SAD svake godine; zbog mnogih lakših sluĉajeva koji nisu dijagnostikovani i prijavljeni, aktuelni broj infekcija moţe biti i 20 veći. U zemljama u

razvoju S. flexneri predominira, epidemije izazvane sa S. dysenteriae (tip 1) javljaju se u Africi i Centralnoj Americi sa stepenom smrtnosti 5-15%. Shigella dysenteriae su odgovorne za 60% svih sluĉajeva akutne dijareje kod dece u Indoneziji i Indiji

PSEUDOMONAS AERUGINOSA Rod Pseudomonas spada u familiju Pseudomondaceae i obuhvata 30 vrsta. Pseudomonas aeruginosa je G(–), aerobna, asporogena, pokretna, štapićasta bakterija. Javlja se pojedinaĉno, u paru ili kratkim lancima. Premda su vrste roda Pseudomonas većinom striktni aerobi, P. aeruginosa je fakultativno anaerobna bakterija. Katalaza i oksidaza je pozitivna, produkuje dva pigmenta: piomicin i fluorescin. P. aeruginosa ţivi u vlaţnom zemljištu, na biljkama, otpadnim i površinskim vodama, u vodama bazena, na vlaţnim predmetima i namirnicama. Najviše je izolovan kao kontaminant iz mleka i mleĉnih proizvoda. Moţe se pronaći i na sapunima, u slabim antiseptiĉkim rastvorima, ureĊajima za vlaţenje vazduha, ventilaciju i klimatizaciju, na vlaţnim instrumentima i moţe predstavljati veliki problem u medicinskim ustanovama i pogonima prehrambene industrije. Usled velike rasprostranjenosti u prirodi i rezistentnosti prema hloru, P. aeruginosa veoma lako moţe dospeti i opstati u vodovodnoj mreţi i u vodi za piće. Brojne pseudomonade su biljni patogeni, sa 2 vrste koje su reklasifikovane u rod Burkholderia ĉini grupu humano patogenih. U higijeni ţivotnih namirnica mnoge vrste pseudomonada su znaĉajne kao uzroĉnici kvarenja namirnica, sirovog mesa, jaja, mleka, maslaca i sireva. MeĊu njima se istiĉu P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putrefaciens i dr. Ove bakterije su lipolitiĉne i proteolitiĉne, stvaraju sluzavost, izazivaju proteolizu i uţeglost masnog tkiva i pigmentaciju na površini namirnica. P. aeruginosa uzrokuje širok spektar raznih infekcija (pseudomonijaze) koja posebno dobijaju znaĉaj u poslednje vreme, kao posledica široke upotrebe antibiotika u terapiji i pojave sve rezistentnijih sojeva. Pseudomonas aeruginosa je oportunistiĉki patogen koji izaziva infekcije urinarnog i respiratornog, gastrointestinalnog trakta, dermatitis... Izrazito rezistentan na brojne antibiotike. Izaziva infekcije rana, srednjeg uha, zapaljenja korneje oka i neke piogene infekcije (meningitis, endokarditis). Naroĉito se povećao znaĉaj ove bakterije kao uzroĉnika intrahospitalnih infekcija. U leĉenju infekcija se koriste toksiĉni antibiotici, karbenicilin, gentamicin, polimiksin B ili kombinacija ovih antibiotika. Moţe uzrokovati alimentarne toksikoinfekcije, gastroenteritise i enteritise koji liĉe na dizenteriju i enteritise izazvane salmonelama (najĉešće u odojĉadi i male dece), ĉeste su epidemije u tropskim predelima. Izolovanje i identifikacija Pseudomonas aeruginosa se vrši tako što se 1 ml odgovarajućeg razreĊenja zaseje na Cetrimid agar i inkubira na temperaturi od 25 oC tokom 48 h. Nakon toga se izvodi oksidaza test, pri kojem se oksidaza (+) kolonije ubodom zasejavaju u duboki glukozni agar i inkubiraju na 25 oC tokom 24 h. Bez promene boje podloge ili mala promena boje po površini agara je potvrda Pseudomonas spp.

CAMPYLOBACTER Postaje glavni zdravstveni problem koji potiĉe od mikroorganizama iz hrane. U tehnološki razvijenoj zemlji kao što je Kanada, prijavljeno je do sada oko 2,2 miliona sluĉajeva i procena je da je to trošak (izgubljeni radni sati, troškovi leĉenja) na nivou drţave od oko 1-2 milijarde dolara. U SAD je registrovano preko 89 miliona sluĉajeva, a ĉak se 9.000 smrti povezuje sa ovim uzroĉnikom. Bakterije roda Campylobacter (15 vrsta) pripadaju porodici Campylobacteriaceae to su tanki, asporogeni, G(–) savijeni štapići, S-oblika ili spiralno zakrivljeni. Većina bakterija roda Campylobacter je adaptirana na crevni trakt toplokrvnih ţivotinja. Veruje se da su galebovi glavni nosioci Campylobacter spp. Pored toga, znaĉajno stanište su ţivotinje, naroĉito perad, pa su verovatno oni krajnji izvor većine infekcija kod ljudi. Campylobacter vrste se javljaju u mnogim okruţenjima, dokazano je da su sposobne da preĊu u odrţivo, ali umrtvljeno stanje, da bi izdrţale nepovoljne uslove. U poslednjih 20 godina Campylobacter jejuni je prevazišao Salmonella spp. i postao najĉešći izazivaĉ oboljenja dobijenih preko hrane. C. jejuni izaziva gastroenteritis koji dovodi do Guillian-Barre sindroma i reaktivnog artritisa. Ţivina i sirovo mleko su njegovi glavni izvori.

C. enteritis je najĉešći oblik infektivne dijareje u najrazvijenim zemljama sveta. Veruje se da C. jejuni stvara crevni toksin sliĉan koleriĉnom toksinu, najsimptomatiĉnije infekcije javljaju se kod beba i u ranom detinjstvu. Kliniĉki simptomi C. jejuni infekcije karakterišu grĉevi, abdominalni bol, dijareja, drhtavica i groznica, koji su samoograniĉeni i nestaju za 3 do 7 dana. Većina kampilobakterioznih infekcija zahteva tretman, upotrebom antibiotika skraćuje se period u kom oboleli izbacuju bakterije putem stolice. U prenošenju C. jejuni sa ţivotinja na ljude posebnu ulogu imaju namirnice animalnog porekla. Glavni izvor infekcje ljudi predstavljaju nedovoljno termiĉki obraĊene namirnice ili namirnice spremne za konzumiranje kontaminirane sa sirovim sastojcima. Oko 1/3 ţivinskog mesa u prometu kontaminirana je ovim bakterijama. Svinje su ĉešće rezervoar C. coli nego C. jejuni. Sirove kobasice mogu biti kontaminirane ako se za punjenje koriste sveţa, nedovoljno pripremljena creva. Kontaminacija svinjskih polutki je mnogo ĉešća od kontaminacije trupova goveda ili ovaca. Campylobacter jejuni/coli kod ljudi izaziva akutne enteritise sa razliĉitom kliniĉkom slikom od blagih dijareja do profuznih krvavih dijareja i bolova u abdomenu. Kod ovaca i krava izaziva abortuse, a nastanjuje se u crevima vidljivo zdravih krava, ovaca, peradi i drugih domaćih ţivotinja. Kontaminacija mleka kampilobakterom nastaje indirektno od inficiranih krava koje fekalnim putem izluĉuju ovaj mikroorganizam, ali kontaminacija moţe nastati i direktnim putem u sluĉaju asimptomatskog mastitisa uzrokovanog ovim mikroorganizmom. Većina istraţivaĉa navodi da se kampilobakter retko izoluje iz mleka, a da je glavni put kontaminacije fekalni put od inficiranih krava. Kampilobakterioze nastale nakon konzumiranja sirovog mleka opisane su u SAD, Engleskoj, Velsu, Škotskoj i Kanadi. Kampilobakterije mogu prouzrokovati i upalu slepog creva ili inficirati abdominalnu šupljinu (peritonitis), srce (carditis), centralni nervni sistem (meningitis), ţuĉni mehur (holecistis), urinarni trakt i krvotok. Moţe prouzrokovati i sepsu opasnu po ţivot kod osoba sa kompromitovanim imunim sistemom. Druge kliniĉke manifestacije C. jejuni infekcije kod ljudi ukljuĉuju septiĉni artritis i meningitis. Smrtni sluĉajevi zbog C. jejuni uglavnom se javljaju kod beba i starijih osoba. Infekcija se javlja kao posledica konzumiranja mesa ili vode zagaĊene telesnim izluĉevinama inficiranih ţivotinja. Zabeleţen je fekalno-oralni prenos i prenos C. jejuni sa osobe na osobu. Poĉetno mesto kolonizacije bakterija je gornji deo tankog creva. C. jejuni se razmnoţava u ljudskoj ţuĉi. Bakterija se kolonizuje u jejunumu, ileumu i kolonu. Humane volonterske studije su pokazale da je infektivna doza sadrţi izmeĊu 500 i 1000 mikroorganizma, iako najprirodnije infekcije najverovatnije zahtevaju najmanje 104 mikroorganizama.

CANDIDA ALBICANS Oportunistiĉki fungalni patogen koji je prisutan u uobiĉajenim mikrobnim populacijama ljudskog tela; normalna flora gastrointestinalnog trakta i ĉesto se moţe naći na koţi i sluzokoţi usta i vagine. Imunološki sistem normalno kontroliše aktivnost kandide. Moţe da izazove bolest u sluĉaju pada odbrambenih snaga domaćina ili u sluĉaju disbioze, na primer zbog dugotrajne antibiotske terapije. Najĉešći oblici su kandidijaze sluzokoţe usta, vaginitis, onihomikoza i dermatitis. Antibiotska i/ili imunosupresivna terapija, kao i imunosupresivna oboljenja (dijabetes, leukemija i AIDS) mogu dovesti do ozbiljnih sistemskih infekcija koje zahvataju koţu, pluća, srce i druge organe. Kandidi se pripisuje 10% od svih sluĉajeva septikemije. Sojevi ispoljavaju razliĉite virulentne faktore koji pomaţu kolonizaciju i perzistenciju u telu. MeĊu najznaĉajnijim faktorima je sposobnost da se adheruje na ljudska tkiva koristeći razliĉite mehanizme (znaĉaj toga se moţe ilustrovati sposobnošću da adheruje razne mukozne površine sa izdrţljivom silom što ne dovodi do uklanjanja iz tela sa delovanjem tkivnih teĉnosti. Najĉešći etiološki agensi kandidioza (C. albicans i C. tropicalis) se bolje adheruju in vitro na naša tkiva nego C. krusei i C. gulliermondii. Adherovanje na tkiva je potpomognuto kombinacijom specifiĉnih i nespecifiĉnih mehanizama. Specifiĉna je interakcija ligand-receptor, a nespecifiĉne su elektrostatiĉke sile, agregacija i hidrofobnost površine. Nespecifiĉne interakcije su primarno (dešavaju se na većim razdaljinama) ukljuĉene u adherencu i reverzibilne su; meĊutim, mogu se smatrati i ireverzibilnim jer odmah deluju i specifiĉni mehanizmi koji ukljuĉuju sposobnost kvasca da prepozna razlike u receptorima ćelije domaćina. C. albicans se javlja u dve morfološki razliĉite forme – pupajuće blastospore ili hife; moguć prelazak i obiĉno se zapaţaju obe forme u

tkivima. Hife imaju sposobnost tigmotrofizma (osetljivosti na kontakt) što im moţe pomoći u otkrivanju putanja sa najmanjim otporom izmeĊu slojeva ćelija u tkivu. Produkuje neke ekstracelularne enzime koji olakšavaju adherencu i/ili prodiranje u tkivo; fosfolipaze (A, B i C) i lizofosfolipaze mogu uĉestvovati u oštećenju membrana ćelija domaćina i olakšavati invaziju. Morfologija Candida albicans: A – blastospore B – hife C – prelaz u hifu D – prelaz u pseudohifu Produkuje neke kisele proteinaze koji pomaţu adherencu i invaziju, a takoĊe su znaĉajni u degradaciji imunoglobulina IgG i IgA. Sa niskim su pH optimumom i mogu pomagati u kolonizovanju npr. vagine. Dokazano je da produkuju hemolizin koji dovodi do oslobaĊanja Fe iz oštećenih eritrocita, koji je esencijalan za njihov rast. Znaĉajna taktika imunog izbegavanja je sposobnost da se veţu u platele (povezane ćelije u grupice) preko fibrinogen-vezujućih liganada. Sposobni su da daju razliĉite interizmenljive fenotipove za koje se smatra da su vaţni u obezbeĊivanju velikog broja virulentnih faktora. Posle adherence moguća je transformacija u hife koje prodiru. Njegove endotelijalne ćelije su bogate enzimima koji potpomaţu degradaciju tkiva i dospevaju do krvotoka, gde se fenotipski prebacuju uz moguće prevlaĉenje u platele – moguće je da se koriste za izbegavanje imunog sistema. “Beţanje” iz krvotoka ukljuĉuje adherencu na zidove kapilara i prolazak kroz njih.

ASPERGILLUS FUMIGATUS Saprofitna plesan široko rasprostranjena, koja se ĉesto nalazi na vlaţnim površinama i biljkama koje trule. Moţe postati oportunistiĉki patogen – uobiĉajen etiološki agens plućne aspergiloze (80-90% sluĉajeva). Veći je nivo mortaliteta nego kod C. albicans (reĊe se javlja). Produkuje brojne ekstracelularne enzime koji omogućuju rast u plućima i rasipanje po telu. Kliniĉki izolati imaju fosfolipaze sa topt. 37 oC – kljuĉni u razgradnji tkiva i mogu olakšati prodiranje plesni iz pluća u krvotok. Proteaze su odgovorne za degradaciju tkiva i neutralizaciju imunog sistema i verovatno evoluiraju pri prelasku jedinke sa biljnog na ţivotinjski materijal. U plućnom tkivu elastin je sadrţan sa oko 30%, a plesan pokazuje elastinolitiĉku aktivnost, dok su izolati nesposobni da je ispoljavaju i pokazuju redukovanu virulenciju prema miševima. Produkuju dve elastinaze: serin proteazu i metaloproteinazu. Osim direktne uloge u degradaciji tkiva, proteaze (osobito serin proteaza) mogu imati ulogu alergena što je znaĉajno u zapoĉinjanju i odrţavanju alergijske aspergiloze. Lokalno zapaljenje zbog prisustva proteaza rezultuje u oštećenju prenosa vazduha. In vitro ispitivanja pokazuju da su proteaze sposobne da indukuju odvajanje epitelnih ćelija od bazalne membrane, indukuju oslobaĊanje proinflamatornih IL-6 i IL-8 citokina u ćelijske linije. Produkcija i sekrecija toksina u okolno tkivo je znaĉajna za virulencu i moţe potpomagati fungalni rast u plućima. Gliotoksin je glavni toksin koga produkuju, a pored njega i fumigatin. Smatra se da su toksini znaĉajni u olakšavanju kolonizacije, Aspergillus vrste koje ne produkuju toksine u istom nivou kao A. fumigatus su jako retko izolovani iz bolesniĉkog materijala.

BAKTERIJE INDIKATORI FEKALNOG ZAGAĐENJA VODE Mikroorganizmi koji se nalaze u vodi svrstani su po svom poreklu u dve grupe: saprofitni mikroorganizmi kojima je voda prirodno stanište kontaminanti vode (mikroorganizmi poreklom iz vazduha, zemlje i drugih izvora)

Na osnovu higijenskog znaĉaja, bakterije koje se najĉešće nalaze u vodi dele se na sledeće grupe: saprofitne bakterije uslovno patogene bakterije bakterije indikatori fekalnog zagaĊenja patogene bakterije

Bakterije indikatori fekalnog zagaĊenja – normalno je da se nalaze u fekalijama i Ċubretu. Za preciznije podatke o poreklu, karakteru i vremenu fekalnog zagaĊenja kao sanitarni pokazatelj se koriste bakterije indikatori fekalnog zagaĊenja, a prisustvo nekih od njih u vodi ukazuje na nedavno zagaĊenje. Indikatorima fekalnog zagaĊenja pripadaju Escherichia coli, Clostridium spp., Enterococcus spp., Proteus spp., Legionella ssp. Escherichia coli se najĉešće prenosi vodom, namirnicama, predmetima opšte upotrebe pa ĉak i vazduhom. Escherichia coli O157:H7, najznaĉajniji predstavnik enterohemoragiĉne grupe koji stvara toksin. Priliĉno su otporne - mesecima mogu da ţive u vodi, otporne su prema niskim temperaturama koje su znatno ispod 0 oC, temperatura od 60 oC ih ubija posle 15 min. Rod Legionella - tipska vrsta je L. pneumophila (prva vrsta koja je opisana). Broj vrsta, podvrsta i serotipova roda Legionella se stalno povećava, a trenutno se zna za preko 50 vrsta i 70 razliĉitih serotipova. Ĉak 16 serotipova je kod L. pneumophila, po dva kod L. bozemanii, L. longbeachae, L. feeleii, L. hackeliae, L. sainthelensi, L. spiritensis, L. erythra i L. quinlivanii dok je za ostale vrste poznat po jedan serotip. Izolovani iz prirodne sveţe vode (reka, potoka, jezera i termalnih izvora), zemlje, a ima je u aerosolima. L. pneumophila izaziva legionarsku bolest i pontiaĉnu groznicu. Legionele su veliĉine od 0,3-0,9 x 2-20 μm što zavisi od starosti kulture. U mladoj (sveţoj) kulturi su kokobacili dugi oko 2-6 μm, dok se u starijim kulturama mogu videti filamentozne forme duge do 20 μm. Legionele su gram-negativne bakterije sa tankim ćelijskim zidom. Kolonije L. pneumophila su karakteristiĉne pegavo-zelene ili roze-ljubiĉaste boje koja se preliva u druge boje. L. pneumophila ima ograniĉenu pokretljivost, a neki sojevi su nepokretni, mogu da imaju 1-2 polarne flagele. Za razliku od drugih bakterija u vodi, L. pneumophila zahteva soli gvoţĊa i aminokiselinu L-cistein za rast na laboratorijskim podlogama. L. pneumophila ne pokazuje veliku biohemijsku aktivnost. Moţe da proizvode više toksina (endotoksini, hemolizini, citotoksini, toksini koji oštećuju makrofage) koji oštećuju ćelije i dovode do nekroze tkiva. Voda ĉesto sadrţi brojne patogene mikroorganizme iz rodova Salmonella, Shigella, Campylobacter, kao i vrste Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae. Ne postoji idealan biološki indikator, ali neophodno je ispunjavanje odreĊenih zahteva: mora da se uvek u velikom broju javlja u fekalijama ĉoveka ne sme da ima drugi izvor sem creva ĉoveka treba da ţivi u vodi duţe nego patogene bakterije, ali ipak treba dosta brzo da prestaje da se

razmnoţava u vodi koliĉina indikatora u vodi treba da pokazuje kvantitativni odnos zagaĊenja indikator treba da ima neke konstantne karakteristike i ne sme da bude podloţan uslovima sredine

u kojoj se nalazi

MIKROBIOLOŠKE ANALIZE VODE ZA PIĆE VODE I PRIRODNIH MINERALNIH VODA Mikrobiološki pregled vode za piće ima tri cilja: da utvrdi da li je voda zagaĊena fekalijama da utvrdi kako je stanje zaštitnog vodonosnog sloja od spoljnog bakterijskog zagaĊenja da utvrdi efikasnost tehnološkog preĉišćavanja vode (hlorisanja)

Rutinska ispitivanja vode obuhvataju: odreĊivanje ukupnog broja bakterija u jednom mililitru i dokazivanje prisustva bakterija fekalnih indikatora u vodi

Specijalna ispitivanja vode izvode se prema Pravilniku o higijenskoj ispravnosti vode za piće SL SRJ br. 42/98 i 44/99,

INDUSTRIJSKI ZNAČAJ BIOFILMOVA Mikrobiolozi su tradicionalno bili fokusirani na slobodno-plivajuće bakterije odgajane iz ĉistih laboratorijskih kultura. Tek u skorije vreme prihvaćeno je da u prirodi većina bakterija ţivi sakupljena u biofilmove, u formi u kojoj je njihovo ponašanje u mnogome drugaĉije. Kao rezultat toga, biofilmovi su jedna od najsveţijih tema u mikrobiologiji. Razumevanje bakterija u biofilmovima je izuzetno vaţan korak u pripremi za budućnost. Sposobnost bakterija da se prilagode okolini i da izbegnu svim našim naporima da ih eliminišemo, vredna je divljenja. U automatskim sistemima za snabdevanje vodom, 99% bakterija se, kao i u svim ostalim vodenim sistemima, nalazi u biofilmu na unutrašnjoj strani cevi. Ovi biofilmovi predstavljaju izvor najvećeg broja slobodno-plivajućih bakterija u vodi za piće, od kojih neke mogu biti uzroĉnici infekcija i zaraza kod ljudi i ţivotinja. Jedna od najĉešćih bakterija biofilma, Pseudomonas aeruginosa, spada u uslovno patogene bakterije koje mogu izazvati oboljenja kod osoba sa oslabljenim imunitetom. Pored toga što predstavljaju rezervoar bakterija opasnih po zdravlje, biofilmovi, takoĊe, mogu izazvati i koroziju vodovodnih cevi, ĉak i ako se radi o nerĊajućem ĉeliku. Biofilmovi na raznim površinama dovode do ogromnih materijalnih gubitaka u industriji, kroz razna oštećenja opreme, koroziju cevovoda, gubitke energije, smanjenje prenosa toplote i hidrauliĉkog pritiska u industrijskim sistemima za hlaĊenje, kontaminaciju proizvoda i razne infekcije. Tradicionalne metode uništavanja bakterija, kao što su korišćenje antibiotika ili dezinficijenasa ĉesto su neefikasne protiv bakterija u biofilmu. Kako bi se uništile bakterije u biofilmu potrebne su ogromne doze ovih sredstava koje su, u tom sluĉaju, opasne po ţivotnu sredinu, ili ĉak, po propisima za zaštitu ţivotne sredine, nedozvoljene. U ţivoj sredini ove doze mogu biti ĉak i neprimenljive, jer one doze koje bi bile potrebne da unište bakterije u biofilmu, dovele bi i do smrti pacijenta. Zbog svega toga, neophodne su nove strategije koje se baziraju na boljem razumevanju procesa prianjanja, rasta i odvajanja bakterija od površine. Nasuprot tome, poznavanje mikrobioloških procesa na površinama nudi mogućnost za njihovo iskorišćenje u mnogim granama industrije i zaštite ţivotne sredine, kao što su bioremedijacija opasnog otpada, biofilteri za industrijsku vodu ili formiranje biobarijera za zaštitu zemljišta i površinskih voda od kontaminacije.

NASTANAK I RAZVOJ BIOFILMA Do poĉetka stvaranja biofilma dolazi ĉim se nova cev napuni vodom. Razvoj biofilma se moţe posmatrati kroz nekoliko osnovnih koraka: stvaranje povoljnih uslova na površini

adhezija bakterija-pionira formiranje ”sluzi” ili glikokaliksa sekundarna kolonizacija biofilm sa svim funkcijama

1. Stvaranje povoljnih uslova na površini

Prvo što se nakuplja na površini koja je u kontaktu sa vodom nisu mikroorganizmi, već tragovi organskih materija koje se u vodi nalaze. Skoro istog momenta kada se površina ĉiste cevi naĊe u kontaktu sa vodom, na dodirnoj površini cev-voda stvara se sloj organskog depozita. Ovaj sloj organskih materija na površini cevi neutrališe površinsko naelektrisanje i slobodnu površinsku energiju koji spreĉavaju bakterijsku ćeliju da priĊe dovoljno blizu zidu i ostvari inicijalno vezivanje. Dodatno, adsorbovani organski molekuli sluţe bakterijama kao izvor hrane. 2. Adhezija bakterija-pionira

Neke od slobodno-plivajućih planktonskih bakterija u tekućoj vodi u cevi prilaze dovoljno blizu zidu cevi i ostaju u graniĉnom sloju.Graniĉni sloj predstavlja nepokretnu zonu u neposrednoj blizini zida cevi u kojoj brzina protoka pada na nulu.Neke od ovih bakterija se privremeno adsorbuju, a zatim budu desorbovane. Ovo predstavlja reverzibilnu adsorpciju. Inicijalno vezivanje se bazira na elektrostatiĉkom privlaĉenju i fiziĉkim silama, a ne na hemijskom vezivanju. Neke od adsorbovanih ćelija poĉinju da se pripremaju za duţi

boravak na taj naĉin što formiraju strukture koje mogu trajno vezati ćeliju za površinu. Ove ćelije postaju ireverzibilno adsorbovane. 3. Formiranje ”sluzi” ili glikokaliksa

Bakterije biofilma luĉe vanćelijsku polimernu supstancu, ili lepljivi polimer koji odrţava biofilm u celini i vezuje ga za zid cevi. Dodatna uloga sloja glikokaliksa je da ”hvata” hranljive materije kojih ima malo u preĉišćenoj vodi, kao i da štiti bakteriju od biocida. Prema Mittelman-u (1985. god.), vezivanje se ostvaruje vanćelijskim polimernim materijama koje se izluĉuju iz ćelijskog zida bakterija i liĉe na strukturu paukove mreţe. Ovaj polimerni materijal sastoji se od naelektrisanih ili neutralnih polisaharidnih grupa koje, ne samo da ostvaruju vezivanje, već sluţe i kao jonoizmenjivaĉki sistem za hvatanje i koncentrisanje tragova organskih materija iz okolne vode. Glikokaliks predstavlja i zaštitni sloj vezanim ćelijama koji umanjuje efekte biocida i drugih toksiĉnih supstanci. Kao posledica nakupljanja organskih materija, ćelije-pioniri poĉinju da se razmnoţavaju. Kćerke-ćelije zatim proizvode sopstveni glikokaliks povećavajući na taj naĉin jonoizmenjivaĉku površinu. Ubrzo dolazi do formiranja nabujale kolonije bakterija. U zrelom biofilmu, 75-95% zapremine zauzima neureĊeni matriks glikokaliksa a samo 5-25% ĉine ćelije. Pošto matriks glikokaliksa sadrţi velike koliĉine vode, površina koja je prekrivena biofilmom postaje ţelatinozna i klizava. 4. Sekundarna kolonizacija

Pored hranljivih materija, u mreţu glikokaliksa hvataju se i ćelije mikroorganizama. Ovi sekundarni kolonizeri metabolizuju otpad primarnih kolonizera, a proizvode i svoje sopstvene otpadne materije, koje potom bivaju iskorišćene od strane drugih ćelija. Prema Borenstein-u (1994.), kolonizacija od strane ovih drugih bakterija i plesni, koje slede pionirske vrste, pitanje je dana. 5. Biofilm sa svim funkcijama

Zreo biofilm, sa svim svojim funkcijama, liĉi na ţivo tkivo na površini cevi. U pitanju je kompleksna, metaboliĉki kooperativna zajednica razliĉitih vrsta. Smatra se da u biofilmovima postoje i primitivni cirkulacioni sistemi. U ĉlanku ”Slime City” imaginarno je opisan zreo biofilm: “Razliĉite vrste ţive jedna uz drugu u sluzavim naseljima, pomaţući jedna drugoj u iskorišćavanju zaliha hrane i odupiranju antibioticima, što se ostvaruje kroz susedske interakcije. Toksiĉni otpad proizveden od strane jedne vrste moţe biti rado prihvaćen kao hrana od strane druge susedne vrste. Nekoliko vrsta bakterija, udruţenih u komunalni ”Slime City”, od kojih je svaka snabdevena razliĉitim enzimima, u stanju su da razgrade zalihe hrane koje ni jedna vrsta sama ne bi bila u stanju da upotrebi. Biofilmovi su na svim nivoima proţeti mreţom kanala kroz koje putuju voda, smeće, hranljive materije, enzimi, metaboliti i kiseonik.” (Coghlan, 1996.) Postoje dva vida širenja biofilma: obiĉna ćelijska deoba i povremeno otpuštanje bakterija-pionira koje mogu nizvodno naseliti neki drugi deo cevi. Vremenom dolazi do povećanja debljine biofilma, tako da njegova debljina poĉinje da prevazilazi debljinu laminarnog sloja i slojevi biofilma poĉinju prelaziti u slojeve sa većom brzinom teĉnosti i turbulentnim tokom. Zbog toga se dešava da neke ćelije budu ”smaknute”. Prema Mayette-u (1992.), ovim kasnijim pionirskim ćelijama je unekoliko olakšano prianjanje na zidove, u odnosu na njihove uzvodne pretke jer roditeljski biofilm otpušta organski otpad koji nizvodno formira inicijalni organski sloj na nekolonizovanim delovima cevi i ujedno predstavlja hranu za ostale ćelije. Prema Mittelman-u (1985.), za razvoj zrelog biofilma potrebno je nekoliko sati do nekoliko nedelja, u zavisnosti od sistema. Pseudomonas aeruginosa se ĉesto sreće kao bakterija-pionir i on je korišćen u mnogim istraţivanjima biofilmova. U jednom eksperimentu naĊeno je da je ćelijama pseudomonade potrebno oko 30 sekundi da se adheruju na nerĊajući ĉelik, ĉak i ako su u pitanju elektropolirane površine. Rodţer Anderson i njegove kolege iz Centra za kontrolu bolesti u Atlanti izveli su ogled u kome su plastiĉne cevi napunjene vodom koja je kontaminirana sa dve vrste roda Pseudomonas. Nakon inkubacije od osam nedelja cevi su ispraţnjene i napunjene hemikalijama sa dezinfekcionim svojstvima, ukljuĉujući hlor, i to je ostavljeno da stoji sedam dana. Nakon toga, cevi su ponovo napunjene sterilnom vodom i ”ĉista voda” je periodiĉno uzorkovana. Obe vrste pseudomonada su preţivele u tretiranim cevima i ponovo uspostavile kolonije.

MEHANIZMI DELOVANJA BIOCIDA Antiseptici, dezinficijensi i konzervansi – biocidi smatraju se neantibiotskim antibakterijskim sredstvima. Oni se ĉesto klasifikuju kao grupa nespecifiĉnih protoplazmatskih otrova, što u odreĊenom smislu i jesu. Antimikrobna aktivnost hemijskog sredstva dokazanog dejstva poĉinje njenim prodiranjem u ćeliju mikroorganizma. Sam put stizanja hemijskog sredstva do mesta delovanja u ćeliji zavisi od fiziĉko-hemijskih karakteristika hemijskog sredstva. Na antibiotsku aktivnost ĉesto snaţan uticaj ima afinitet biocidne strukture i molekulski sastav ćelijskog zida. Ciljnim dejstvom biocida smatraju se ćelijski zid, citoplazmatska membrana i citoplazma mikroorganizma. Biocidi deluju na ćelijski zid tako što ga razgraĊuju ili stvaraju neke nove ireverzibilne unakrsne veze sa nekom strukturom u njemu. Niske koncentracije odreĊenih dezinficijenasa deluju na enzime koji uĉestvuju u sintezi ćelijskog zida tako što ih usmeravaju na suprotnu reakciju – razgradnju. Dejstvo na citoplazmatsku membranu moţe se podeliti u tri kategorije: dejstvo na proteine membrane (inhibiraju aktivan transport kroz membranu) dejstvo na enzime membrane (inhibiraju enzime koji regulišu funkcionisanje membrane) dejstvo na membransku propustljivost (menjaju sastav membrane, a time i njenu permeabilnost)

U citoplazmi postoji veliki broj znaĉajnih struktura na koje deluju biocidi: koagulacija citoplazme (biocid je koagulaciono sredstvo), ribozomi (razdvajaju ribozome na dva dela), nukleinske kiseline (pokreću autolitiĉke procese u nukleinskim kiselinama), jedinjenja sa tio-grupom (oksiduju ili reaguju sa tio-grupama) i jedinjenja sa amino-grupom (reaguju sa amino grupama koje su neophodne za ţivot ćelije). Razliĉiti tipovi mikroorganizama pokazuju razliĉite reakcije na biocidno dejstvo, što je prikazano u tabeli:

Vrsta mikroorganizma

Biocidna osetljivost ili rezistentnost

Bakterije

Asporogene su najosetljivije, acidofilne bakterije su srednje osetljive, a spore su najotpornije. Gram-pozitivne bakterije (stafilokoke i streptokoke) generalno su osetljivije na biocide od gram-negativnih bakterija. Enterokoke su ĉesto rezistentne na antibiotike, ali ne i neophodno osetljivije na biocide od streptokoka. Mikobakterije su rezistentnije od drugih asporogenih bakterija na širok spektar biocida.

Gljivice Fungalne spore mogu biti rezistentne

Virusi Bez omotaĉa su više rezistentni nego sa omotaĉem

Paraziti Kokcidije mogu biti visoko rezistentne

Prioni Obiĉno su visoko rezistentni

BAKTERIJSKA REZISTENTNOST NA BIOCIDE Pod bakterijskom rezistentnošću na biocide mogu se razmatrati dva tipa rezistencije: prava (prirodna, uroĊena) rezistentnost – prirodna karakteristika organizma steĉena rezistentnost, ili hromozomska mutacija ili akvizicija plazmida ili premeštanje

Prirodna ili steĉena rezistentnost na biocide:

Karakteristika Prirodna

rezistentnost Stečena rezistentnost

Opšte svojstvo Prirodna karakteristika Ostvaruje se mutacijama ili dobijanjem plazmida ili transposona (Tn)

Promenljivost biocida (enzimska inaktivacija)

Posredno hromozomski, ali obiĉno nije znaĉajno

Plazmid/Tn-intermedijer, npr. ţivin

Umanjeno dejstvo Primećeno kod nekoliko biocida

Manje bitno

Prolazno Nije poznato Katjonski biocidi i antbiotski rezistenti stafilokoka

Proizvodnja biofilma Fenotipska adaptacija Moţe doći do transfera plazmida u biofilmu

Farmaceutski/kliniĉki znaĉaj

Visoka Moţe biti visoko u odreĊenim okolnostima

Kao što je već reĉeno, stafilokoke i streptokoke su generalno osetljivije na biocide od gram-negativnih bakterija. Mikroorganizmi u bofilmu, koji su vezani za površine, imaju sposobnost da se odupiru normalnim procesima dezinfekcije. Prema LeChevallier-u (1988. godine), bakterije biofilma pokazuju zadivljuću otpornost na biocide. Demonstracijom je dokazano da bakterije u biofilmu mogu biti 150-3000 puta otpornije na slobodni hlor i 2-100 puta otpornije na monohloramine, u odnosu na slobodno-plivajuće bakterije. Prema Andersonu iz 1990.-e, Pseudomonas vrste imaju ”pametan” naĉin odbrane, na taj naĉin što luĉi lepljivu sluz na unutrašnju površinu cevi. Baktericidno sredstvo kojim se ispira sistem za distribuciju vode ubija samo slobodno-plivajuće mikroorganizme, ali nije u stanju da dopre do bakterija uronjenih u lepljivi biofilm. Iz Borenstein-ovog istraţivanja (1994. godine), bakterije ĉesto proizvode više egzopolimera nakon tretiranja biocidima nego pre tretmana, kako bi se zaštitile.

Naĉini na koje biofilm obezbeĊuje zaštitu od dezinficijenasa: Zaštitni omotaĉ

Pre nego što dopre do bakterijske ćelije u biofilmu, sredstvo za dezinfekciju prvo mora da reaguje sa okolnom mreţom polisaharida. Znaĉi, nisu same ćelije u biofilmu otpornije na biocide od slobodnih ćelija, već su one zaštićene zaštitnim omotaĉem. Na taj naĉin, oksidaciona snaga dezinficijensa bude istrošena pre nego što on stigne do ćelije. Difuzijska ograniĉenja

Kada je ćelija vezana za zid cevi, sposobnost prodiranja dezinficijensa je ograniĉena stepenom difuzije smeše duţ graniĉnog sloja i kroz sam biofilm. Potrebna je veća koncentracija i duţe kontaktno vreme da dezinfekciono sredstvo dospe do bakterijske ćelije u biofilmu u odnosu na slobodno-plivajuće bakterije. Mehanizmi kojima se biofilmovi odupiru dejstvu antimikrobnih agenasa su: smanjenje koncentracije biocida u teĉnosti oko biofilma neuspeh biocida da prodre u biofilm prelazak bar jedne frakcije ćelija biofilma u stanje fiziološke otpornosti na biocid

Po prvom scenariju, antimikrobno sredstvo biva istrošeno do koncentracija koje su nedovoljne za uništavanje ćelija, pre nego što, uopšte, dopre do biofilma. Po drugom scenariju, antimikrobno sredstvo dolazi do površine biofilma, ali ne prelazi u dublje slojeve jer postoje ograniĉenja u transportu ovog sredstva u unutrašnjost biofilma. Do ovoga dolazi kada antimikrobno sredstvo reaguje sa površinskim slojevima biofilma i neutrališe se brţe nego što je u stanju da prodire u biofilm. S druge strane, ukoliko antimikrobno sredstvo ne reaguje sa sastojcima biofilma, lako dolazi do penetracije u biofilm.

Po trećem scenariju, antimikrobno sredstvo prodire u biofilm, ali nije u stanju da uništi ćelije mikroorganizama, jer je došlo do promene fenotipa ćelija i pokazuju smanjenu osetljivost na biocide. Do promene fenotipa ćelija dolazi iz dva razloga: Uslovi smanjene koliĉine hranljivih materija dovode do stvaranja regiona u biofilmu koji su izuzetno

siromašni hranom. Mikroorganizmi u tim regionima prelaze u fazu usporenog rasta, ili se rast u potpunosti zaustavlja. Ovakve bakterije su manje podloţne dejstvu biocida.

Kod nekih ćelija u biofilmu se pojavljuje ''prekidaĉ'' koji aktivira promenu fenotipa nezavisno od ograniĉene koliĉine hranljivih materija.

Ova tri mehanizma odupiranja biocidima nisu uzajamno iskljuĉivi. Naprotiv, najveća verovatnoća je da će sva tri mehanizma otpora biofilma biti ukljuĉena u njegovo odupiranje dejstvu biocida. Do smanjenja osetljivosti biofilmova na biocide ne dolazi usled mutacija ili genetskih promena, kao što je sluĉaj pri stvaranju otpornosti na antibiotike. To se dokazuje time što vrste koje su veoma osetljive na odreĊeni biocid stiĉu izuzetnu otpornost kada se nalaze u biofilmu. Ali, kada iz biofilma ponovo preĊu u suspendovano stanje, ponovo postaju osetljivi na dati biocid. Iz svega navedenog sledi da biofilmovi ne slede ista pravila za dezinfekciju kao planktonske bakterije. Jedna od uoĉljivih razlika je da je stepen uništavanja ćelija biofilma uvek niţi u odnosu na planktonske bakterije. Druga razlika je u tome što povećanje koncentracije hlora više utiĉe na stepen uništavanja ćelija u biofilmu, nego na planktonske bakterije. Sliĉan rezultat dobijen je i za druga antimikrobna sredstva, kao što su glutaraldehid, i kvaternerne amonijumove soli. Praktiĉno, iz ovog sledi da se biofilmovi bolje uklanjaju ukoliko se primeni relativno visoka koncentracija antimikrobnog sredstva. Ukratko, koncentrovanija doza je efektivnija nego produţeno dejstvo pri niţim koncentracijama. U sluĉaju tretmana vode za piće hlorom, naĊeno je da niske koncentracije hlora ĉak mogu dovesti do uvećanja broja heterotrofa biofilma, kao što su koliformne bakterije.

FAKTORI IZBORA DELOVANJA ANTIMIKROBNOG SREDSTVA Karakteristike hemijskog sredstva – proces uništavanja ili inhibicije rasta mikroorganizama hemijskim

sredstvom u osnovi je hemijska reakcija na ĉiju brzinu i stepen delovanja imaju uticaj koncentracija hemikalija, temperatura, pH i formulacija, odnosno hemijski sastav.

Mikrobiološke kontaminacije – prisutne vrste mikroorganizama i stepen kontaminacije (bioburden) imaju

znaĉajan efekat na rezultat antimikrobnog tretmana. Osetljivost mikroorganizama na hemijsko sredstvo se menja. Efikasnost antimikrobnog sredstva mora biti detaljno ispitana kako bi se osiguralo postizanje efekta koji je potreban za nameravanu upotrebu. Kako bi korisnici znali koji nivoa antimikrobske aktivnosti im je potreban u odreĊenoj situaciji, neophodno je kategorisati hemijska sredstva prema njihovoj antimikrobnoj aktivnosti.

Nameravane upotrebe sredstva – nameravana upotreba antimikrobnog sredstva, kao konzervansa,

antiseptika ili dezinfekcijensa, imaće uticaja na izbor hemijskog sredstva. Na primer: sastojci medicinskog preparata mogu neutralisati dejstvo konzervansa; za dezinfekcije instrumenata, hemijska sredstva ne smeju biti agresivna prema instrumentima, npr. ne smeju uzrokovati koroziju, menjati strukturu sintetskih polimera itd.

Faktori sredine – organska materija (krv, telesne teĉnosti, gnoj, mleko, ostaci hrane ili koloidni proteini)

moţe imati znaĉajne efekte na antimikrobni kapacitet, na adsorpciju ili hemijsku inaktivaciju, moţe izazivati redukciju koncentracije aktivne supstance u rastvoru ili se ponašati kao prepreka prodoru dezinficijensa (osušene organske naslage).

Toksiĉnost jedinjenja – pri izboru antimikrobnog sredstva za odreĊenu namenu mora se uzeti u obzir i

njegova toksiĉnost.

HACCP – POJAM, RAZVOJ, PREDNOSTI I MANE Akronim HACCP predstavlja skraćenicu engleskih reĉi Hazard Analysis and Critical Control Point (Analiza opasnosti i kritiĉne kontrolne taĉke). HACCP se pojavljuje 60-ih godina prošlog veka kao rezultat zajedniĉkog razvoja kompanije Pillsbury, Armije SAD i NASA-e sa ciljem proizvodnje bezbedne hrane namenjene svemirskom programu (NASA je ţelela da ima program kako bi se garantovala bezbednost kosmonauta u pogledu hrane koju će konzumirati u svemiru). Javno je prezentovan 1971. god. na Ameriĉkoj konferenciji o bezbednosti hrane. Od 1991. godine je preporuĉen od Komiteta Codex Alimentarius (FAO/WHO). Od 1995. godine je obavezna primena u EU. Od 1997. godine je u SAD obavezna primena u proizvodnji hrane ţivotinjskog porekla.

HACCP bi se mogao nazvati konceptom ili sistemom obezbeĊenja proizvodnje zdravstveno bezbedne hrane. HACCP je metod za procenu opasnosti i uspostavljanja sistema kontrole, koji je u prvom redu fokusiran na preventivu, nego što se oslanja na ispitivanje gotovog proizvoda. Prednosti: povećava zdravstvenu bezbednost hrane (smanjenje potencijalnih bolesti, ţalbi kupaca, gubitka

poslovnog ugleda) veće fokusiranje na identifikaciju i prevenciju opasnosti od kontaminacije hrane omogućava efikasniji i efektivniji nadzora od strane inspekcije jasno definasana odgovornosti proizvoĊaĉa ili distributera za proizvodnju i promet bezbedne unapreĊenje meĊunarodne trgovine hrane

HACCP je primenjiv kroz ceo lanac hrane – “od njive do trpeze”. Svaki HACCP sistem je prilagodljiv promenama – unapreĊenju opreme, tehnologije, razvoju... Primena HACCP-a je kompatibilna sa sistemima upravljanja kvalitetom, kao što su sistemi menadţmenta kvalitetom po seriji ISO 9000. Mane: razvoj, implementacija i odrţavanje sistema zahtevaju dodatne resurse u pogledu vremena,

struĉnosti i angaţovanja osoblja, što u poĉetku povećava troškove subjekta koji se bavi hranom postoje poteškoće sa primenom HACCP sistema u malim subjektima koji posluju hranom i/ili u onim

koji proizvode veliki broj razliĉitih proizvoda HACCP je kako proces-specifiĉan tako i proizvod-specifiĉan, što ĉini praktiĉno nemogućim da se

direktno prenese sa jednog na drugog proizvoĊaĉa bez većih, znaĉajnijih i odgovarajućih modifikacija.

FAZE IMPLEMENTACIJE HACCP-A (1-5)

1) FORMIRANJE TIMA ĉiji je zadatak da razvije HACCP sistem u konkretnom preduzeću Potpuno razumevanje ciljeva primene HACCP sistema u preduzeću i dobijanje odgovarajuće podrške od najvišeg rukovodstva. Multidisciplinaran tim sa odgovarajućim specifiĉnim znanjima i iskustima iz svih faza proizvodnje i prometa (najĉešće 4-5 ĉlanova). Kompetentnost ĉlanova tima (sa znanjima iz oblasti sistema upravljanja kvalitetom i higijene hrane-mikrobiologija, dezinfekcija, deratizacija, hemija, mašinski sektor...). Interni i eksterni deo tima, obuka ĉlanova tima. Glavne odgovornosti rukovodstva subjekta koji posluje hranom su da: donosi i sprovodi strategiju i politiku za ostvarivanje bezbednosti hrane imenuje HACCP tim i odredi njegovog voĊu definiše okvir, obim rada tima i rokove obezbedi resurse

Glavni zadaci voĊe HACCP tima su da: vodi razvoj i uspostavljanje HACCP plana vodi evidenciju i dokumentaciju planira i organizuje validaciju i verifikaciju HACCP plana obaveštava rukovodstvo o aktivnostima koje tim sprovodi

Glavni zadaci ostalih ĉlanova HACCP tima su da: pomaţu razvoj i primenu HACCP plana; doprinose radu tima u skladu sa svojim znanjem, radnim odgovornostima i iskustvom, a naroĉito u

oblastima identifikacije opasnosti i utvrĊivanju kontrolnih mera; redovno sprovode aktivnosti za koje su zaduţeni HACCP planom uĉestvuju u validaciji i verifikaciji HACCP plana

2) OPISIVANJE PROIZVODA Za svaki proizvod posebno (od znaĉaja za naknadnu identifikaciju opasnosti) naziv proizvoda sastav

Procena svih faktora koji utiĉu na bezbednost proizvoda: unutrašnji faktori – pH, aw spoljašnji faktori – temperatura u procesu prerade, pakovanja, skladištenja pakovanje, rok upotrebe i uslovi skladištenja naĉin distribucije naĉin upotrebe – sa aspekta zdravstvene bezbednosti

Detaljan opis svih sirovina koje se koriste tokom proizvodnje: biološke, fiziĉke i hemijske, karakteristike, sastav, ukljuĉujući aditive i pomoćne materije, naĉin upotrebe poreklo naĉin proizvodnje, naĉin pakovanja i transporta naĉin skladištenja i rok upotrebe priprema i/ili tretman pre prerade kriterijume prihvatljivosti nabavljenih komponenti

3) PLANIRANA UPOTREBA PROIZVODA Pri kojim uslovima upotrebe namirnica nije opasna po zdravlje potrošaĉa – temperatura i vre,e ĉuvanja. Identifikovati na koji naĉin krajnji potrošaĉ upotrebljava namirnicu (jesti bez naknadnog kuvanja, prokuvati pre upotrebe i sl.). Identifikacija grupa potrošaka kojima je (ili nije) namenjen – riziĉne grupe (alergiĉne osobe, deca, dijabetiĉari...). 4) IZRADA DIJAGRAMA TOKA PROCESA Na najjednostavniji naĉin opisati i prikazati sve korake koji su ukljuĉeni u proizvodnju, preradu i distribuciju proizvoda (ukljuĉene su i faze pripreme i skladištenja pojedinaĉnih sastojaka proizvoda). Prikazuje: redosled i meĊuzavisnost aktivnosti ulaz sirovina, aditiva i pomoćnih materijala u proces ponovna obrada/prerada materijala otpremanje gotovih proizvoda, poluproizvoda i otpada

Prilikom izrade dijagrama toka procesa, HACCP tim, kad je to potrebno i moguće, treba da naznaĉi procesnu kategoriju u koju proizvod moţe da se svrsta. To znaĉi, da kod jednog subjekta mogu da postoje više procesnih kategorija, od kojih svaka moţe da ukljuĉuje više proizvoda. Na primer, subjekti koji posluje hranom (naroĉito oni mali) mogu da proizvode više razliĉitih proizvoda na istoj proizvodnoj liniji. Ako se ti proizvodi razlikuju samo u karakteristikama koje ne utiĉu na njihovu bezbednost (na primer, razlikuju se samo u koliĉini i vrsti zaĉina koji se dodaju), jasno je da spadaju u istu procesnu kategoriju. U tom sluĉaju, svi proizvodi iz jedne procesne

kategorije mogu da se ukljuĉe u jedan HACCP plan. Ovo olakšava primenu HACCP sistema time što se omogućava jedinstvena kontrola razliĉitih proizvoda koji su svrstani u jednu procesnu grupu, korišćenjem jednog HACCP plana. Ukupno gledano, dozvoljeno je grupisanje u istu procesnu kategoriju samo onih proizvoda kod kojih su prisutne iste opasnosti koje mogu da utiĉu na njihovu bezbednost. Svaki korak u okviru proizvodnog procesa je potrebno opisati u formi standardne radne procedure/operacije (SOP).

5) VERIFIKACIJA DIJAGRAMA TOKA PROCESA Verifikacija verodostojnosti dijagrama toka na licu mesta. Potvrdu dijagrama toka mora raditi osoba ili osobe sa dovoljnim poznavanjem proizvodnog procesa. Sve korekcije moraju biti dokumentovane.

PRINCIPI HACCP-A. PRINCIP 1 = Analiza opasnosti Nabrajanje svih potencijalnih opasnosti tokom proizvodnje i distribucije namirnica Izvršiti analizu opasnosti (analizu teţine tih opasnosti)

Proceniti nivo rizika (verovatnoća pojave, moguće posledice, mogućnost spreĉavanja)

Definisanje mera za kontrolu identifikovanih opasnosti

Kod identifikacije opasnosti treba imati u vidu uticaj prethodnog i narednog koraka: uticaj opreme, infrastrukturu, radnu okolinu, prethodne i naredne uĉesnike u “lancu hrane”. Odrediti prihvatljiv nivo zagaĊenja (u skladu sa vaţećim propisima) da bi se ocenilo da li je neophodna posebna mera za spreĉavanje, elimimaciju ili smanjenje opasnosti po zdravstvenu bezbednost proizvoda. Metodologija mora biti dokumentovana i rezultati ocene moraju biti zapisani. Preventivne aktivnosti: izbor takvih aktivnosti, metoda i sredstava koje će onemogućiti pojavu opasnosti ili će verovatnoću njihovog pojavljivanja svesti na minimalnu meru. Moţe se desiti da za kontrolu neke odreĊene opasnosti potrebno preduzeti više razliĉitih kontrolnih mera, ali ponekad jedna kontrolna mera moţe da bude pogodna za kontrolu više opasnosti.

PRINCIP 2 = Identifikacija CCP Kritiĉna kontrolna taĉka (CCP) je korak (taĉka/postupak/operacija) u kome se moţe uticati na opasnost kako bi se spreĉio ili eliminisao rizik po bezbednost hrane ili redukovao na prihvatljiv nivo. Broj CCP zavisi od vrste proizvoda i konkretnog tehnološkog procesa. Na nekim od CCP se uz stalnu kontrolu opasnost moţe eliminisati, dok se na drugim potencijalne opasnosti mogu samo ublaţiti. Primeri najĉešćih CCP: pasterizacija

kuvanje

sušenje

dozairanje hemijskih sredstava

korekcija pH

kontrola ambalaţe

pranje i dezinfekcija

PRINCIP 3 = OdreĊivanje kritiĉnih graniĉnih vrednosti Kritiĉne graniĉne vrednosti su vrednosti karakteristiĉne veliĉine koje se ne smeju preći ukoliko se ţeli postići bezbednost proizvoda. Kao graniĉne vrednosti se definišu neke fiziĉke, hemijske ili biološke veliĉine. PRINCIP 4 – Uspostavljenje nadzora CCP Nadzor je planirano merenje ili promatranje CCP o odnosu na kritiĉne graniĉne vrednosti. Omogućuje otkrivanje gubitka nad CCP. Gde god je moguće, poţeljno je primeniti on-line metod (kontinuirano) jer omogućava nadzor u realnom vremenu. Ako nadzor nije kontinuiran obim i uĉestalost nadzora mora garantovati kontrolu nad CCP. Fiziĉka i hemijska merenja su pogodnija od mikrobioloških jer mogu biti brţe izvedena. PRINCIP 5 – OdreĊivanje korektivnih mera za sluĉaj prekoraĉenja kritiĉnih graniĉnih vrednosti Korektivne mere su definisane i propisane za svaku CCP i odgovornost sprovoĊenja. Aktivnosti koje se preduzimaju kada nadzor nad CCP ukazuje na odstupanja od krit. gran. vred. Definiše: šta uraditi sa proizvodom (vraćanje u proces, uništavanje, promena namene)

ustanoviti uzrok neusaglašenosti

mere za vraćanje procesa pod kontrolu

spreĉavanje ponavljanja neusaglašenosti

PRINCIP 6 – Verifikacija HACCP sistema Uspostavljanje postupaka verifikacije – provere delotvornosti HACCP sistema. Uĉestalost verifikacije treba biti dovoljna da potvrdi da li je sistem delotvoran. Verifikaciju obavljaju osobe koje su nezavisne od zaduţenja za nadzor i korektivne akcije. Kada nije moguće sprovesti je interno onda to u ime organizacije ĉine spoljni struĉnjaci ili kvalifikovana treća lica. Gde je moguće validacija aktivnosti treba da ukljuĉi odgovarajuće mere u cilju potvrĊivanja delotvornosti svih elemenata HACCP sistema. Verifikacione aktivnosti: preispitivanje HACCP sistema i plana i njihovih zapisa

preispitivanja odstupanja i neusaglašenih proizvoda

potvrĊivanje da li su CCP pod kontrolom

PRINCIP 7 – Dokumentovanje sistema Kvalitetno i taĉno voĊenje zapisa je neophodno za delotvornost HACCP sistema. Dokumentacija se po potrebi predstavlja potrošaĉima ili kontrolnim organima. Dokumentacija sadrţi: spisak tima za razvoj HACCP sa definisanim odgovornostima

opis proizvoda

verifikovani dijagram toka

opasnosti koje postoje u vezi sa svakom CCP i odgovarajuće preventivne mere

kritiĉne graniĉne vrednosti

planovi korektivnih mera

procedure za voĊenje zapisa

procedure za verifikaciju HACCP sistema

Marina Rajic