MIN – Untersuchungen beim sporadischen MIN – Untersuchungen beim sporadischen NierenzellkarzinomNierenzellkarzinomZwischenergebnisseZwischenergebnisse

• Was ist Mikrosatelliteninstabilität (MIN) ?• Was ist Alu/AP - PCR ?• Methoden/ Materialien• Ergebnisse• Ausblicke

Was ist Was ist MMikrosatellitenikrosatellitenininstabilität ( MIN ) ?stabilität ( MIN ) ?

Mikrosatelliten: kurze polymorphe Tandemrepeats,1% des GenomsMono-,Di-,Tri-,Tetra - Nukleotidsequenzen

10-50 Kopien von 1-6 Basenpaarmotiven ( Cunningham et al. IOS Press, 1999) treten ungefähr aller 100000 Basenpaaren einmal auf

fungieren vermutlich als Promotoren, Bindungsstellen für Topoisomerasen

Relativ konstant übers Genom verteilt, zu 90 % heterozygot, Brauch et al.

Vorwiegend in intronischen DNA - Abschnitten gelegen

Längenveränderungen dieser DNA – Abschnitte (MIN/ Replication Error Phänotyp) verweisen auf genetische Instabilität

Expansionen/ Kontraktionen während Replikation

ReplikationReplikation

ExpansionExpansion

KontraktionKontraktion

Fehlpaarungen

(Mismatches)

Fehlpaarungen

(Mismatches)

Historie von MINHistorie von MIN

MIN wird ursprünglich 1993 beim HNPCC - Syndrom (hereditäres nicht polypöses Kolonkarzinom) beschrieben (Aaltonen et al. Science 260; Ionov et al.Nature 363, Thibodeau et al. Science 260)

HNPCC assoziierte Tumore weisen zu 80 - 90% MIN auf

Physiologisches Auftreten von Fehlpaarungen (Mismatches) im Bereich einfach - repetitiver Sequenzen während der DNA - Replikation bei Bakterien/ Hefen

Mismatch-Reparaturenzyme korrigieren Replikationsfehler

6 DNA - (mismatch) Reparaturgene 3 homolog zum bakteriellen MutS: hMSH2hMSH2, hMSH3, hMSH6

3 homolog zum bakteriellen MutL: hMLH1hMLH1, hPMS1, hPMS2

Historie von MINHistorie von MIN

1993 Klonierung des ersten Mismatch-Repairgen hMSH2 hMSH2 (Fishel

et al) aus Kolonkarzinom - DNA Keimbahnmutation ist wesentlicher Faktor für HNPCC - Syndrom

Voraussetzung für MIN - positive Karzinome ist Inaktivierung beider Allele eines Mismatch-Repairgens (“two – hit” Modell nach

Knudson, PNAS 68)

Diagnostik bei HNPCC mittels MIN - Analyse mit immunhistochemischer Repairgen - Expressionsbestimmung (anti - hMSH2, anti - hMLH1 am Tumor) : positiv Sequenzierung von hMSH2, hMLH1 in Normal - DNA

5 Mikrosatelliten: BAT 25, BAT 26, D5S346, D17S250, D2S123

MIN in Nicht - HNPCC assoziierten sporadischen MIN in Nicht - HNPCC assoziierten sporadischen TumorenTumoren

Tumortyp Anzahl anTumoren

Anzahl anMarkern

% an Tumorenmit MIN

Referenz

Prostata 66 8 12 Egawa et al. Cancer Res 55

Blase 73 1 1,3 Orlow et al. Cancer Res 54

Niere 36 7 11,1 Uchida et al. Cancer Res 54

Hoden 86 7 0 Peltomäki et al.Cancer Res 53

Modifiziert nach Cunnigham et al. IOS Press 1999Modifiziert nach Cunnigham et al. IOS Press 1999

AP - PCR:

Unterschied zu gewöhnlicher PCR: Generierung einer reproduzierbaren Schar von Produkten (genomischer DNA- Fingerabdruck) mit einem Primer

Voraussetzung: Alu- Verdau, ~ 450 bp große Fragmente

AluAlu - Sequenz: 5% des Genoms, assoziiert mit 50 - 80% bestimmter Mikrosatelitten am 3 ‘ Ende auf

somatische Mutationen von Di- und Trinukleotiden treten mit veränderten AluAlu - Sequenzen auf Sood und Buller (Oncogene 13): 36 von 68 Ovarialtumoren mit MIN

weisen veränderte Alu/ AP - PCR Bandenmuster

Methoden und MaterialienMethoden und Materialien

Blut - DNA

Methoden und MaterialienMethoden und Materialien

Ablauf: DNA - Isolation aus Gefriermaterial mittels Salzextraktion (Tumor-, Normalgewebe)

Konzentrationsmessung a) 20 ng - Verdünnung für Mikrosatelitten - PCR b) DNA - Verdau mit ALU 1 für AP - PCR c) Kontrolle der PCR - Produkte im Agarose - Gel Denaturierung mittels Hitze und Formamid -

Puffer Auftragen der PCR - Produkte auf PAA - Gel mit anschließender Silberfärbung Vergleich des Bandenmusters von Normal- und Tumorgewebe

Probleme: nach absoluten Schwierigkeiten mit AP - PCR muß diese für die ersten 100 Patienten abgearbeitet werden

Name (locus) Chrom.Lokaisation

Repeat - Motiv Größe(bp)

Referenz

BAT 25 4q12 TTTT.T.TTTT.(T)7.A(T)25 ~ 90 Papadopoulos et al. Science 268

BAT 26 2p (T)5…….(A)26 ~ 80 – 100 Papadopoulos et al. Science 268

MYCL1 1p32 GAAAA(GAAA)2TAAA(A/G)10GAAAGA(GAA)14 140 – 209 Mazela et al. Hum Mol Genet 1

REN 1q32 ( TCTG )9 251 – 271 Edwards et al. Genomics 12

Tp53Alu 17p13.1 (AAAAT)8(A)7GAAAA ~ 400 Futureal et al. Nucleic Aids Res 19

RB 13q14 (CTTT)13CTTTT(CTTT)CTTTT(CTTT)4 CC(T)13 260 – 300 Huang et al Cancer Res.52

Methoden und MaterialienMethoden und Materialien

Einsatz von 6 Mikrosatellitenmarkern:

Dietmaier et al. Cancer Res 57, 1997Dietmaier et al. Cancer Res 57, 1997

40 Patienten mit 5 Markern untersucht BAT 25, Bat 26, REN, MYCL1, tp53Alu (RB wird

optimiert)

Patient 13 und 40 bei tp53Alu/ MYCL1 auffällig

ab Patient 41 nur noch: REN, MYCL1, tp53Alu

100 Patienten mit MYCL1 und tp53Alu untersucht nur noch Patient 41 bei tp53Alu/ MYCL1 auffällig

(REN steht bei Patient 72)AP – PCR:

PCR klappt nach größeren Problemen Auftragen der Proben auf PAA – Gel zeigt erwartetes Ergebnis

ErgebnisseErgebnisse

ErgebnisseErgebnisse

• MIN bei Pat. 13, 40, 41

• auffällige Marker: tp53Alu

MYCL 1

Vergleich +/ - MIN bei Pat.13/ 14Vergleich +/ - MIN bei Pat.13/ 14

LOH

MYCL1

T 13 N 13 T 14 N 14

Expansion

ErgebnisseErgebnisse

tp53ALU

T 41 N 41

MYCL1

T 41 N 41

LOH AP - PCR

N 13T 13

shift

ErgebnisseErgebnisse

sensitiver Nachweis von gemischten DNA - Mengen möglich (schwache PCR - Produkte sind nicht kritisch für MIN -

Nachweis)

Verdünnungsreihe der PCR - Produkte für tp53Alu (µl PCR - Produkt zur Fällung)

10 5 5 5 5 510 10 10 101 1 1 1 12 2 2 2 20,5 0,5 0,5 0,5 0,5

100 b

p

Leit

er

Standards 63

ng

12

5

ng

25

0 n

g5

00

ng

75

0 n

g

T 4

0

N 4

0

von 50 µl Gesamtansatz 10 µl auf Agarosegel

10 µl auf PAA - Gel

Einsatz eines alten PCR - Produktes als Template in neue AP - PCR altes PCR - Produkt wurde verdünnt: 1:101: 50 1: 00

jeweils 2 µl von Verdünnung eingesetzt

Resultat: reproduzierbares Bandenmuster unabhängig von Templatemenge stabile Nachweismethode genetischer Instabilität

ErgebnisseErgebnisse

1:1

0

1:5

0

1:1

00

AusblickeAusblicke

Verwendung neuer Marker im Bereich von Tumorsuppressorgenen des Chromosoms 3:

• 2 Marker der VHL - Region

D3S1560, D3S1317

• 2 Marker der FHiT - Region

D3S1300, D3S4260

AusblickeAusblicke

Auskunft über postoperative klinische Daten Rückantwortbrief an niedergelassenen Urologen/ Hausarzt(Korrelation zw. Patientenkarriere und MIN ?)

Immunhistochemie der Mismatch - Reparaturenzyme Zusammenarbeit mit Thomas

mRNA - Expressionsprofile: Wahrscheinlichkeit einer umfassenden genomischen Instabilität von bekannten Markern

anvisiertes Ende der Experimente: Ende 2002Ende 2002