Minor Variant Finder ソフトウェア v1 - Thermo Fisher Scientific...Finder Software User Guide (Pub. no. MAN0014835) も併せてご参照ください。本ソフトウェアは以下のスペックを満たすコンピューターでご利用が可能です。

Minor Variant Finder Software Quick Reference

1 For Research Use Only. Not for use in diagnostic pr ocedures.

Minor Variant Finder ソフトウェア v1.0 Catalog Number A31100 Pub. No. A31786JP

製品情報製品情報製品情報製品情報

Minor Variant Finder ソフトウェアは簡単で使いやすいデスクトップソフトウェアです。サン

ガーシークエンスにより得られた配列情報からマイナーバリアント(



1.1.1.1. ソフトウェアのソフトウェアのソフトウェアのソフトウェアのスタートスタートスタートスタート

スタートを選択し、 �All Programs �Applied Biosystems �MVF�MVF 、または、

デスクトップ上のをダブルクリックします。

以下の２つのウィンドウが開きます。

� Apache™ Tomcat™ウィンドウ：バックグラウンドで開いたままにしてください。

重要！重要！重要！重要！：このウィンドウは絶対に閉じないで下さい。閉じてしまうとソフトウェアが正常に

機能しない場合があります。

� Minor Variant Finderソフトウェアのブラウザウィンドウ：デフォルトではGoogle™

Chrome™が使用されますが、前のページの表1-1に記載されているブラウザもご使用い

ただけます。

注：注：注：注：ブラウザの拡張機能により、ソフトウェアが正常に機能しない場合があります。そのた

めご使用の際は、シークレットモードシークレットモードシークレットモードシークレットモードでのでのでのでのごごごご使用使用使用使用を推奨いたします。ソフトウェア起動時の

ブラウザのURLをコピーし、シークレットウィンドウを開いて、URLを貼り付けてください。

Apache™ Tomcat™ウィンドウ

Minor Variant Finder ソフトウェアのブラウザウィンドウ

図図図図1-1：：：：ソフトウェアウィンドウソフトウェアウィンドウソフトウェアウィンドウソフトウェアウィンドウ

図図図図 1-2：：：：Google™ Chrome™ シークレットモードシークレットモードシークレットモードシークレットモード



2. プロジェクトプロジェクトプロジェクトプロジェクトの作成と解析の作成と解析の作成と解析の作成と解析

新たに解析を行うためには、Project Listより新規プロジェクトを作成します。

2.1 プロジェクトの作成プロジェクトの作成プロジェクトの作成プロジェクトの作成 1. Create Projectをクリックします。

2. Create New Projectダイアログボックスにプロジェクト名を入力します。

① プロジェクトリスト:ダブルクリックで開きます。

② プロジェクト名、アンプリコン名、検体名で検索ができます。

③ プロジェクトを作成します。

④ プロジェクトの詳細情報を表示します。

⑤ プロジェクトのインポート、エクスポート、削除が行えます。

⑥ ページを切り替えます。

図図図図2-2：：：：Project の作成の作成の作成の作成

図図図図2-1：：：：Project List

図図図図2-3：：：：Create New Project ダイアログボックスダイアログボックスダイアログボックスダイアログボックス



① データ表示を切り替えます。

② クオリティーインジケーター：波形データのクオリティーを表示します。クオリティーの設定は

Action � Quality Flag Settings より変更することができます。各クオリティステータスバーをクリ

ックすると指定のクオリティーのデータをソートできます。

③ 波形データの詳細情報、エクスポート、削除、クオリティーの設定を変更できます。

④ 波形データの選択時にチェックします。Ctrl や Shift キーを押したままチェックすると複数同時に選

択できます。

⑤ コメントを記入できます。

3. Import Tracesをクリックし、サンプルデータを読み込みます。

4. 解析に使用するサンプルデータ(.ab1ファイル)をすべて選択し、読み込みます。

5. サンプルデータを読み込むとデータのクオリティサマリーが表示されます。

図図図図2-4：：：：サンプルデータのインポートサンプルデータのインポートサンプルデータのインポートサンプルデータのインポート

図図図図2-5：：：：サンプルデータの読み込みサンプルデータの読み込みサンプルデータの読み込みサンプルデータの読み込み

⑤



6. 必要に応じてサンプルのチェックボックスを選択し、Actions中のView Detailよりサンプ

ルの波形データやRawデータ等を確認してください。

図図図図2-6：：：：Tracesスクリーンスクリーンスクリーンスクリーン

図図図図2-7：：：：波形データの確認波形データの確認波形データの確認波形データの確認



2.2. Reference の設定の設定の設定の設定(オプションオプションオプションオプション)

染色体情報や次世代シーケンサ(NGS)のデータをリファレンスとして指定できます。リ

ファレンスを設定しない場合は、ワークフローバーのReferenceのUse control sequence.

Skip to the Organize moduleを選択し、次のステップ(Organize)へ進むか、ワークフロー

バーのOrganizeを直接選択してください。

1. ワークフローバーのReferenceを選択します。

2. Create reference sequence and optionally upload NGS Variants File (vcf)を選択し、

Create referenceのNameに名前を記入します。

図図図図2-9：：：：ワークフローバーワークフローバーワークフローバーワークフローバー

図図図図2-8：：：：Create Reference の選択の選択の選択の選択

図図図図2-10：：：：Create reference の設定の設定の設定の設定



3. Regions of interest Select one：の項目より１つを選択し、リファレンスを設定します。

� Assay IDs：Primer Designer™ Toolで設計したプライマーをご使用の場合、プライマーの

Assay IDを記入し、リファレンスを指定できます(現在日本ではPrimer Designer™ Toolは

対応しておりません。Primer Designer™のリンクはデザインサイトへ繋がりません)。

� Enter Chromosome Position：染色体番号を選択し、位置情報を記入してください。ヒト

ゲノムの位置情報はNCBI GRCh37/hg19が指定されています。

� Enter Sequence：配列情報をSequence欄に直接コピーペーストします(A,G,T,C,Nのみ使

用できます)。次のステップで.vcfファイル(NGSデータ)をインポートする場合のみ染色体

番号とスタートポジションを記入してください。次のステップで.vcfファイルを使用しな

い場合は、染色体番号とスタートポジションの記入は必要ありません。

4. .vcfファイルを使用する場合は、Setup NGS Variants FileよりChoose fileをクリック

し、.vcfファイルを選択します。

5. リファレンスを設定したらSaveボタンをクリックします。

図図図図2-13：：：：vcf ファイルのファイルのファイルのファイルの読み込み読み込み読み込み読み込み

図図図図2-11：：：：Chromosome Position の設定の設定の設定の設定

図図図図2-12：：：：Sequence の設定の設定の設定の設定



6. ファイルを読み込んだらSaveボタンをクリックします。

セーブしたリファレンス情報は、次回以降Select reference from projectsより読み出すこ

とができます。

セーブしたリファレンスの情報はActions �Export Reference よりエクスポートし、保

存することができます。

図図図図2-15：：：：リファレンスのエクリファレンスのエクリファレンスのエクリファレンスのエクスポートスポートスポートスポート

図図図図2-14：：：：リファレンスの読み出しリファレンスの読み出しリファレンスの読み出しリファレンスの読み出し



2.3. Organize の設定の設定の設定の設定

Organizeでは、各PCR増幅産物(Amplicon)のコントロール(Control)の波形データの指定

やそれに対する検体(Test Specimen)の波形データの分類をします。

1. ワークフローバーのOrganizeを選択します。

2. Organizeスクリーンが表示され、インポートした波形データを振り分けます。

自動で振り分ける方法と、マニュアルで振り分ける方法があります。

図図図図2-16：：：：Organize の選択の選択の選択の選択

① Amplicon 名が表示されます。リファレンスの設定を行っている場合はリファレンスファイルより

Amplicon 名が表示されます。新たに作成する場合は、をクリックします。名前をダブルクリ

ックすると名前の変更ができます。

② Amplicon の削除、追加、検索を行います。

③ Control を指定するボックス

④ 各 Specimen に振り分けられた波形データが表示されます。

⑤ インポートされた振り分け前の波形データが表示されます。

⑥ Organize スクリーンの切り替え、検索をします。

⑦ 自動の振り分け機能を使用します。

⑧ Specimen 名が表示されます。新たに作成する場合は、をクリックします。名前をダブルクリ

ックすると名前の変更ができます。

図図図図2-17：：：：Organize スクリーンスクリーンスクリーンスクリーン



2.3.1 自動自動自動自動ででででControl 、、、、Amplicon 、、、、Specimen のののの設定設定設定設定を行う場合を行う場合を行う場合を行う場合サンプルファイル名に含まれる文字を指定して、自動でControl、Amplicon、Specimenの設定

を行うことができます。

自動で設定を行う場合以下の条件を満たしている必要があります。

� Organizeスクリーンに設定されているAmplicon名とサンプルファイル内で指定する

Amplicon名は一致している必要があります(リファレンスの設定をしている場合はあら

かじめ設定されているAmpliconの名前を変更してサンプルファイルと一致させてくださ

い)。

� サンプルファイル名にはフォワード配列、リバース配列を区別するための"forward"、"fwd"、

"f"または"reverse"、"rev"、"r"が含まれている必要があります。これらの文字は区切り文字

(-_$.%)によって区別されている必要があります。

1. Organizeをクリックし、Organizeダイアログボックスを開きます。

2. Specimenとコントロールを指定する文字が同じ部位にある場合は、Specimen and Control

identifier at the same locationにチェックを入れてください。

3. ▲Ampliconをクリックし、Organizeダイアログボックス中に表示されているサンプル名

からAmpliconを示す文字をクリックして指定してください。

図図図図2-18：：：：Organize ダイアログボックスダイアログボックスダイアログボックスダイアログボックス

① Control と Specimen を指定する文字がサンプル名の同じ部位にある時にチェックします。

② Amplicon、Specimen、Control を指定するときにクリックします。

③ Un-Grouped traces list に表示されている最初のファイル名が表示されます。

④ Control を指定する文字を記入します。

図図図図2-19：：：：Amplicon の指定の指定の指定の指定



4. ■Specimenをクリックし、同様にSpecimenを示す文字をクリックし、指定してくださ

い(Specimen and Control Identifier at the same locationにチェックを入れている場合はスキ

ップします)。

5. ●Controlをクリックし、同様にControlを示す文字をクリックし、指定してください。

6. Organizeをクリックしてください。ダイアログボックスが閉じControl、Amplicon、

Specimen、が自動で振り分けられます。

7. Un-Grouped Tracesに波形データが残っている場合は、マニュアルで指定をしてくださ

い(次ページ参照)。

注：注：注：注：振り分けを解除する場合は、Ampliconを削除してください。

図図図図2-20：：：：Specimen の指定の指定の指定の指定

図図図図2-21：：：：コントロールの指定コントロールの指定コントロールの指定コントロールの指定

図図図図2-22：：：：振り分け後の振り分け後の振り分け後の振り分け後のOrganize スクリーンスクリーンスクリーンスクリーン

① Amplicon

② 作成された Specimen

③ 各 Specimen に振り分けられた波形データ



2.3.2. マニュアルマニュアルマニュアルマニュアルででででControl 、、、、Amplicon 、、、、Specimen の設定を行う場合の設定を行う場合の設定を行う場合の設定を行う場合 1. Ampliconのをクリックし、PCR増幅産物名を記入します。既にAmplicon名が表示さ

れている場合は、次のステップに進んでください。

2. Test Specimenのをクリックし、検体名を記入します。同様の操作を繰り返し、

Ampliconに対するSpecimenを必要数作成します。

3. Controlとして使用する波形データをUn-Grouped Tracesより選択します。フォワード配

列を選択し（青いハイライトになります）、ドラッグしてControlボックスのForwardへド

ラッグしてください。同様にリバース配列を選択し、Reverseにドラッグしてください。

4. それぞれのTest Specimenに波形データを振り分けます。作成したSpecimen名をクリッ

クします（青くハイライトになります）。振り分ける波形データをリバース、フォワード

両方選択します。選択したサンプルデータをGrouped Tracesにドラッグします。それぞ

れのTest Specimenに対して同様の操作を繰り返します。

図図図図2-23：：：：Amplicon の新規作成の新規作成の新規作成の新規作成

図図図図2-24：：：：Specimen の新規作成の新規作成の新規作成の新規作成

図図図図2-25：：：：Control の指定の指定の指定の指定



注：注：注：注：振り分けを解除する場合は、Ampliconを削除してください。

2.4. データのデータのデータのデータの解析解析解析解析

サンプルデータは予めKB Basecaller v1.4以上のベースコーラーによって解析されている必

要があります。

解析には、Controlのフォワード、リバースのサンプルデータ、Test Specimenのフォワード、

リバースのサンプルデータについて、15 bp以上のオーバーラップが必要です。

バリアントの情報は上記4つのデータのオーバーラップしている場所のみレポートされます。

1. ワークフローバーのAnalysisを選択し、Run Analysisをクリックします。

図図図図2-26：：：：Test Specimen への波形データの振り分けへの波形データの振り分けへの波形データの振り分けへの波形データの振り分け

図図図図2-27：：：：データの解析の開始データの解析の開始データの解析の開始データの解析の開始



3. データの閲覧データの閲覧データの閲覧データの閲覧

解析が完了するとワークフローバーがResultsに移動し、結果が表示されます。

Resultsスクリーンは5つのデータ確認方法があります。

Overview：シークエンスとバリアント情報を表示します。

Variant：バリアントのリストを表示します。Annotated Variantの既知バリアント名

をクリックするとNCBIのバリアント情報にリンクします。

Electropherogram：波形データを表示します。

Summary：バリアント情報と解析結果のエラーや警告情報を表示します。

NGS Confirmation：NGSとの比較データを表示します。

3.1. データ閲覧のワークフローデータ閲覧のワークフローデータ閲覧のワークフローデータ閲覧のワークフロー以下の順にデータの確認を行っていきます。

1. Summaryを選択し解析エラーや警告が生じているか確認します。

正常に解析されたSpecimenデータ中に、バリアントが1つもない場合は、このSpecimen

はTraces with Analysis Errors Warningsに表示されます。

2. Overviewを選択し、バリアントの位置情報を確認します。必要に応じてOverview画面

の表示、情報の変更をします。

図図図図3-1：：：：Results スクリーンバースクリーンバースクリーンバースクリーンバー

図図図図3-2：：：：Summary の確認の確認の確認の確認



3. Variantを選択し検出されたバリアントの詳細情報を確認します。それぞれのサンプル

の列をダブルクリックすると波形データを確認できます。

図図図図3-4：：：：Variant スクリーンの確認スクリーンの確認スクリーンの確認スクリーンの確認

① 拡大・縮小を行います。

② Reference Overview バー：表示されている配列情報の領域が赤枠で表示されます。リ

ファレンスを設定している場合、exon やバリアント情報が表示されます。

サンガーシークエンスで検出されたバリアント

NGS で検出されたバリアント

サンガーシークエンスと NGS で検出されたバリアント

③ 染色体位置情報が表示されます。

④ コントロールまたはレファレンスの配列情報が表示されます。

⑤ NGS とサンガーシークエンスのバリアント情報が表示されます。バリアントをクリッ

クすると詳細情報を確認できます。

⑥ サンプルのシークエンス領域を表示します。フォワードがピンク。リバースが青で表

示されます。

⑦ サンプル配列上のバリアント情報が表示されます。

⑧ サンプル情報を色分けして表示します。

⑨ データを.pdf ファイルや.vcf/.csv ファイルとしてエクスポートできます。

図図図図3-3：：：：Overview の確認の確認の確認の確認



4. Electropherogramを選択し波形データを確認します。矢印キー(←、→)を押すと、次の

バリアント情報を確認することができます。必要に応じてElectropherogram画面の表示、

情報の変更をします。

① バックグラウンドノイズを最小限にしたサンプル波形データ。ピークをダブルクリック

すると塩基の変更やコメントを記入できます。

② サンプルデータとコントロールの波形データ

③ View Options：図 3-6 を参照してください。

④ 表示させる Amplicon、Specimen を切り換えます。

⑤ バリアントの採用(Accept)、不採用(Reject)を決定します。

⑥ メインピークに対するバリアントのピーク高の割合を表示します

バリアントピーク高の割合：100x バリアントピーク高/(メインピーク高＋バリアントピ

ーク高)

⑦ コメントを記入できます。

⑧ 検証者の名前を記入できます。

⑨ データを.pdf ファイルや.vcf/.csv ファイルとしてエクスポートできます。

⑩ リバース配列が相補配列の情報へ変換されます。

⑪ すべての波形データの拡大・縮小ができます。

⑫ 個別の波形データの拡大・縮小ができます。

図図図図3-5：：：：Electropherogram スクリーンの確認スクリーンの確認スクリーンの確認スクリーンの確認



5. 確認したいAmpliconとSpecimenを選択します。

6. ノイズが最小化された波形データ(一番上の波形データ)よりバリアントピークの評価と

ピーク高の割合(下図赤枠)を確認します

バリアントピークのピーク高の割合は、フォワードとリバースの波形データで異なるこ

とがあります。極端にピーク高の割合が異なるバリアントは、十分に注意し、場合によ

り候補から除外します。

重要重要重要重要！！！！：サンガーシークエンスに定量性はありません。ピーク高の割合とDNA中の変異

率は一致するものではありませんのでご注意ください。

7. 選択したバリアントの採用、不採用を決定します。

8. キーボードの矢印キー(←,→)を押して、他のバリアントについて同様に評価します。

図図図図3-7：：：：Amplicon ととととSpecimen を選択を選択を選択を選択

図図図図3-8：：：：バリアントピークの評価バリアントピークの評価バリアントピークの評価バリアントピークの評価

赤枠：矢印キー(←、→)で表示させるバリアント情報を変更

できます。チェックを入れた情報へ移動するように設定でき

ます。

Base Calls：各塩基の波形の表示/非表示の設定ができます。

Show Reference：リファレンスの配列情報の表示/非表示の

設定ができます。

Show Overview：波形データの概要の表示/表示の設定がで

きます。

図図図図3-6：：：：View Options



注注注注：Variantスクリーン、Electropherogramスクリーンに見られるデータの色分けは、評

価時のリスクの高さを示しています。緑→黄色→赤の順にリスクが高くなります。

ハイリスクの指標が示される原因として以下が考えられます。

� KB Basecallerによって決定されたQuality Valueの値が低い。

� KB Basecallerによって決定されたミックスベースがフォワード側とリバース側で一

致しない。

� バリアントピークのSignal-to-noise比が高い。

� コントロールサンプルとテストサンプルでメインピークの配列情報が異なる。

9. 再度Summaryを確認しすべてのバリアントが検証されているか確認します。

図図図図3-9：：：：Variant スクリーンのインジケータースクリーンのインジケータースクリーンのインジケータースクリーンのインジケーター

図図図図3-10：：：：Electropherogram スクリーンのインジケータースクリーンのインジケータースクリーンのインジケータースクリーンのインジケーター

図図図図3-11：：：：検証済みデータ数の確認検証済みデータ数の確認検証済みデータ数の確認検証済みデータ数の確認



10. Reference設定時にNGSデータ(.vcf ファイル)をインポートしている場合は、 NGS

ConfirmationでNGSデータとサンガーシークエンスデータの比較を行うことができます。

これまでのResultデータはActionメニューより.pdfファイルまたは.vcf/.csvファイルとしてエ

クスポートすることができます。

The information in this guide is subject to change without notice.

図図図図3-13：：：：データのエクスポートデータのエクスポートデータのエクスポートデータのエクスポート

図図図図3-12：：：：Confirmation スクリーンスクリーンスクリーンスクリーン

① バリアントベンダイアグラム：NGS データとサンガーシークエンスのバリアント数を表

示します。

② 染色体番号

③ アノテーションされたバリアント情報

④ バリアント部位の塩基情報

⑤ Electropherogram スクリーンで評価した検証結果を表示します。



DISCLAIMER

TO THE EXTENT ALLOWED BY LAW, LIFE TECHNOLOGIES AND/OR ITS AFFILIATE(S) WILL NOT BE LIABLE FOR

SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE, OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH

OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING YOUR USE OF IT.

Limited Use Label License No. 358: Research Use Onl y

Notice to Purchaser: The purchase of this product conveys to the purchaser the limited, non-transferable right to use the

purchased amount of the product only to perform internal research for the sole benefit of the purchaser. No right to resell

this product or any of its components is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. This product is for internal

research purposes only and is not for use in commercial applications of any kind, including, without limitation, quality control

and commercial services such as reporting the results of purchaser's activities for a fee or other form of consideration. For

information on obtaining additional rights, please contact [email protected] or Out Licensing, Life Technologies

Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008.

Limited Use Label License No. 481: Sequencing or Fr agment Analysis Intellectual Property

Notice to Purchaser: This product is optimized for use in the DNA sequencing or fragment analysis methods covered by

patents owned and/or controlled by Life Technologies Corporation ("LTC"). LTC does not convey any right or license under

these patents, whether expressly, by implication, by estoppels, or otherwise, to the purchaser by the purchase of this

product to use the DNA sequencing or fragment analysis methods. Notwithstanding the foregoing, a limited license to use

the DNA sequencing or fragment analysis methods covered by such patents can be obtained for certain research and

development activities (a) through the purchase of certain LTC reagents when such reagents are used in conjunction with

an authorized LTC instrument, or (b) directly from LTC. For information on obtaining additional rights to practice the DNA

sequencing or fragment analysis methods, please contact [email protected] or Out Licensing, Life Technologies

Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008.

Corporate entity

Life Technologies | Carlsbad, CA 92008 USA | Toll Free in USA 1.800.955.6288

TRADEMARKS

All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. Apache and

Tomcat are trademarks of the Apache Software Foundation. Google and Chrome are trademarks of Google Inc. Microsoft

and Internet Explorer are trademarks of Microsoft Corporation. Mozilla and Firefox are trademarks of the Mozilla

Foundation.

©2016 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved.

Documents

Minor Variant Finder ソフトウェア v1 - Thermo Fisher Scientific...Finder Software User Guide (Pub. no. MAN0014835) も併せてご参照ください。 本ソフトウェアは以下のスペックを満たすコンピューターでご利用が可能です。

Minor Variant Finder ソフトウェア v1 - Thermo Fisher Scientific...Finder Software User Guide (Pub. no. MAN0014835) も併せてご参照ください。本ソフトウェアは以下のスペックを満たすコンピューターでご利用が可能です。