mirkobiologi øv

Øvelsesvejledning Medicinsk mikrobiologi

Institut for International Sundhed, Immunologiog Mikrobiologi (ISIM)

Københavns Universitet

Øvelsesvejledning i Klinisk Mikrobiologi

Copyright© ISIM-forlag • Undervisningsudvalget

Mekanisk eller anden gengivelse af denne bog eller dele deraf er kun tilladt i over-

ensstemmelse med overenskomst mellem Undervisningsministeriet og Copy-Dan.

Enhver anden udnyttelse er uden forlagets skriftlige samtykke forbudt ifølge gæl-

dende dansk lov om ophavsret.

Nyt layout til nettet • 24. oplag 03.02.2011

Grafisk tilrettelægning og sats: Britt Winkel

ISBN 87-985110-0-9

Indholdsfortegnelse

Forord II

Generelle arbejdsregler III-IV

Delkursus 1: Bakteriologi 23

Delkursus 2: Virologi og immunologi 1

Delkursus 3: Parasitologi 109

IIII

Forord

Kursus i medicinsk mikrobiologi består af følgende delkurser:

Delkursus 1: (1 x 5 og 1 x 4 halve dage) omfa er bakteriologiske øvelser (i de e forløb er inkluderet malariadiagnostik).

Delkursus 2: (3 halve dage) omfa er virologiske/immunologiske øvelser.

Formålene med disse øvelser:

Vedr.: Delkursus 1: disse øvelser udgør - med indførelsen af den nye studieplan og den begræns ning i tilbudte forelæsningsemner der gennem årene har fundet sted indenfor 1986 studieplanen - undervisningen i basal bakteriologi. Denne undervisning bliver derved en blanding af praktisk bakteriologisk arbejde (klinisk mikrobiologisk diagnostik) og teoretisk undervisning a oldt af 2 lærere i øvelseslokaler med plads til 24 studerende. Det overord-nede formål med disse øvelser er at bibringe deltagerne et godt grundlag for det lægelige samarbejde med klinisk mikrobiologiske laboratorier.

De e formål søges opnået gennem én uge med praktisk indføring i basal bakte-riologi og arbejde med basale principper for diagnostik. Når de grundlæggende færdighe-der er opnået udleveres prøver fra udvalgte patientsituationer (24 sygehistorier indenfor 5 hovedgrupper af infektioner) for nærmere udredning og resistensundersøgelser. Øvelserne afslu es med en “konference” hvor hver deltager gennemgår sin patient. Desuden vil der være undervisning og demonstration indenfor håndhygiejne og sterilisation/desinfektions problematik.

Vedr.: Delkursus 2: disse øvelser omfa er praktisk arbejde med udvalgte diagnostisk virolo-giske principper. Det overordnede formål med disse øvelser er som beskrevet for Delkursus1. I de e delkursus arbejdes med basale principielle problemstillinger idet avanceret virolo-gisk diagnostik ikke er velegnet til studenterarbejde. De e gennemgås i en speciel forelæs-ning.

Institut for International Sundhed, Immunologi og Mikrobiologi • Kbh's Universitet

Delkurserne er udarbejdet af lærere ved ISIM.

IIIIII

Generelle regler for arbejde ved kursus i mikrobiologi

For at forebygge laboratorieinfektioner opstået p.g.a. fejlagtig eller uforsigtig be-handling af prøvemateriale skal følgende forholdsregler overholdes af alle studenter.

I: Kitler, tasker m.m.Under arbejde i laboratoriearealet skal kittel anvendes og ringe og ure aftages. Labora toriekitlen skal aftages inden man forlader kursussalen. Tasker, tøj o.a. per-sonlige rekvisitter holdes uden for laboratoriet i garderoben. Husk at fjerne værdi-genstande og penge. Kun kursusheftet medbringes i laboratoriet.

II: HåndhygiejneStudenterne skal vaske hænderne med Sterisol; i tilfælde af forurening af hænderne med virusholdigt prøvemateriale anvendes 2% kloramin. Hænderne skal således desin ceres efter at man har arbejdet med infektiøst materiale, efter at man har fået hænderne forurenet med infektiøst materiale, og før man forlader laboratoriet.

III: Mad, drikkevarer m.m. Spisning, drikning, rygning, opbevaring af mad, påsmøring af kosmetika, pilning af næse, mund og øjne, sutning på blyant, og ngerslikning ved bladvending er forbudt i laboratoriearealet.

IV: Pipettering Mundpipettering er strengt forbudt.

V: Aerosol Alle procedurer udføres m.h.p. at undgå aerosoldannelse (se punkt XI), som giver risiko for infektion.

VI: InsektbebekæmpelseFluer og andre insekter skal, når de optræder, bekæmpes med insektdræbende spray f.eks.. Radar Universal.

VII: UheldVed uheld i laboratoriet skal disse straks bekæmpes eller udbedres med mod for an-stalt ninger og meddeles til lægerne. Alle uheld i laboratoriet registreres i instituttet ved et notat om uheldets art og hvem, der er involveret på tidspunktet for uheldet. Notatet opbevares i speciel ringbog mærket "UHELD".Modforanstaltninger i uheld består i1) "afspærring" af det involverede område, 2) desinfekion med påfølgende rengøring: der anvendes 2% TREF (kloraminholdig sæbe), som skal efterlades i mindst 4 min. før optørring med cellstof. Iøvrigt suges eventuelt ydende materiale op med rigelige mængder cellstof, som senere autokla-veres.

Er der tale om personskade, henvender man sig straks til en af instituttets læger. Er der tale om infektiøst materiale i et øje, skal dette skylles med rigelige mængder sterilt isotonisk saltvand og dryppes med chloramphenicol-øjendråber. Er der tale om infektiøst prøvemateriale, som er kommet ind i munden, skal munden ligele-des skylles med rigelige mængder vand, som spyttes ud (pas på aerosoldannelse og sprøjt til omgivelserne), og en af instituttets læger skal tage stilling til eventuel antibiotikabehand ling. Er der tale om stik-eller snitsår med inokulation af infektiøst materiale, skal såret renses ved vask med sæbe og bagefter desin ceres med 2 % kloramin i mindst 2 minutter, og siden skal der tages stilling til eventuel antibiotika-behandling m.m. Er der tale om ætsningsskader eller forbrændinger fjernes eventuelt tøj på det pågældende område, og der skylles med rigeligt koldt vand så længe der stadig er en sviende eller brændende fornemmelse i huden, og lægen tager stilling til videre behandling. Ved skadestuekrævende behandling anvendes RH's traume-center.

IVIV

VIII: Brugte udsånings redskaberAlt instrumentarium, der anvendes til udsåning af såningsprøver, rendyrkning o.s.v. (engangspodenåle, engangsredskaberøser, pipetter o.s.v.) anbringes efter brug i 2 % TREF (kloraminholdig sæbe).

IX: AffaldAffald anbringes i de fremsatte beholdere.

X: OprydningAlle arbejdsborde, arbejdsskabe og lign. fugtes med 2 % TREF efter dagens arbejde og efter at samtlige borde er ryddet.

XI: Risiko-situationerEksempler på risikosituationer: a) prøver og kulturer, der væltes eller tabes,

b) prøver der viser tegn på udvendig kontamination,

c) forekomst af større mængder kondensvand i inkuberede plader,

d) våde vatpropper,

e) spildte bloddråber fra prøver, der stammer fra patienter med hepatitis,

f) sprøjt eller stænk af kultur eller prøvemateriale i ansigtet (mund, næse, øjne),

g) stik- eller snitsår,

h) åbning af prøveglas,

j) udsåning og omsåning af prøver, hvorved prøvematerialet eller kulturmaterialet kan tabes, der kan fremkaldes aerosoldannelse, der kan afsættes prøvemateriale eller kultur på randen af glas og plader, hvor det senere kan komme på ngrene m.m.,

k) brug af øjenål eller ligenål, som siden glødes; hvis dette gøres uforsigtigt, kan der dannes aerosol,

l) brug af Pasteurpipette,hvorved der kan tabes dråber eller fremkaldes skum, som kan medføre aerosoldannelse og vattet kan blive in ceret og dermed tutten,

m) fremstilling af og undersøgelse af fugtige præparater til mikroskopi,

n) udførelse af objektglasagglutination,

o) tilsåning af plader ved flydning,

p) høst af større mængder af kultur fra fast substrat f.eks. til antigenfremstiling,

q) rystning og centrifugering af prøver og kulturer,

r) brug af filtrerpapir til aftrykning af farvede præparater og til udførelse af oxidase- reaktion,

s) udførelse af katalasereaktionen,

t) åbning af ampuller med frysetørret kultur.

11

Delkursus 2

Virologi og immunologi

22

Kursusoversigt virologi og immunologi

Dag 1

Alment om virus (teori)

Prøvetagning og transport af prøver til diagnostik af virusinfektioner 17(teori)

Diagnostiske metoder ved virusinfektioner (teori)

Mikroskopisk påvisning af virus i patientmateriale (teori)

Påvisning og kvantitering af virus ved dyrkning i cellekulturer 5

Virusbetingede forandringer i cellekulturer (teori)

Plaque-titrering (øvelse) 6-8

Endpoint-titrering (øvelse) 16

Undersøgelse af patientprøver for virus og

antivirale antistoffer (øvelse)

A.1. Dyrkning af virus fra svælgskylle-vand i befrugtede hønseæg (øvelse) 10

Alment om immunsystemet og immunsystemets reaktion på virusinfektion (teori)

Dag 2

Mikroskopisk påvisning af virus i patientmateriale (teori)

Påvisning og kvantitering af virus ved dyrkning i cellekulturer

(fortsat fra dag 1)

Plaque-titrering (vitalfarvning)

Påvisning og kvantificering af virus ved kvantitativ PCR (regneøvelse) 6-7

Undersøgelser af patientprøver for virusantigen og antistof

Hurtigdiagnosstik af influenza (øvelse) 14.1

Hurtigdiagnostik af HBV med ELISA-teknik (øvelse) 15-16

33

Dag 3

Undersøgelser af patientprøver for virus og antivirale antistoffer

(fortsat fra dag 1og 2)

A.2. Hæmagglutinations-reaktion (HA) Titrering af virus dyrket i befrugtet hønseæg 11-12

A.3. Identifi kation af dyrket virus med hæmagglutinations- hæmningsreaktion (HI) 12-13

A.4. Påvisning og kvantitering af antistoffer i patientserum med HI reaktion 13-14

B. Plaque-titrering (afl æsning) 8

C. Endpoint-titrering (afl æsning) 16.1

Plaque-neutralisation til påvisning og identifi kation af virus samt antistofmåling (teori)

44

DAG 1 Påvisning og kvantitering af virus ved dyrkning i cellekulturer.

Formål:

At demonstrere to metoder til påvisning og kvantitering af virus i cellekulturer. Dette indgår i det praktiske arbejde med at studere og karakterisere t virus.

Teori:

Når man ønsker at påvise og studere et virus og dets interaktion med værtens celler, er det ofte nødvendigt at opformere virus ved dyrkning. Virus er obligatoriske intracellulære mikroorganismer. Celler fås som levende forsøgsdyr, befrugtede hønseæg eller som celle-kulturer. Normalt anvendes cellekulturer, hvor dette overhovedet er muligt. Disse stammer oprindeligt enten fra normalt væv eller fra transformerede celler. Mens normale celler (fra frisk udtaget væv) kun kan vedligeholdes i kultur i en begrænset periode, kan transformerede celler, hvad enten disse oprindeligt kommer fra tumorvæv eller er blevet transformeret in vitro, passeres in vitro i uendelighed som etablerede cellelinier. Så vidt det er muligt arbejder man helst med cellelinier, så man undgår at være afhængig af tilgængeligheden af friskt væv. I visse tilfælde er virus dog så kræsent, at kun friske celler fra bestemt væv eller egentlige organkulturer kan anvendes. Til vores øvelser anvendes L-celler, der er fi broblast-lignende celler fra mus; disse er ikke transformerede, men kan ikke desto mindre vedligeholdes per-manent in vitro. Virus er submikroskopiske, hvorfor vi normalt påviser deres tilstedeværelse ved de foran-dringer, de inducerer i infi cerede celler. Samlet betegnes de virusfremkaldte forandringer CPE=cytopatogen effekt. Denne kan være karakterisktisk for det enkelte virus, men som oftest opnås defi nitiv identifi kation først ved f.eks. at neutralisere virus med antistoffer af kendt specifi citet. Det antistof som ophæver det inducerede CPE svarer til det tilstedevæ-rende virus. Inden en sådan analysere kan foretages må man imidlertid bestemme koncen-trationen af virus, idet de anvendte antistoffer kun kan neutralisere op til en vis mængde af det pågældende virus. Kvantitering (titrering) af virus kan derfor være et led i den endelige identifi kation af et isoleret virus.

Tabel 1. Eagle’s Minimum Essential Medium (MEM)

Komponenter mg/ml Komponenter mg/ml

L-Arginin HCl 105 Folinsyre 1.0L-Cystin 24 i-Inositol 2.0L-Glutamin 292 Niacinamid 1.0L-Histidin 31 Pyridoxal HCl 1.0L-Isoleucin 52 Ribofl avin 0.1L-Leucin 52 Tiamin HCl 1.0L-Lysin 58 Glukose 1000L-Methionin 15 Fenolrødt 20L-Fenylalanin 32 NaCl 6800L-Treonin 48 KCl 400L-Tryptofan 10 CaCl

2 200

L-Tyrosin 36 MgCl2, 6H

2O 200

L-Valin 46 NaH2PO

4, H

2O 140

Ca-Pantotenat 1.0 NaHCO3 2200

Cholinklorid 1.0

55

DAG 1

66

B. Plaque-titrering

Teori:

D’Herelle’s metode til styrkebestemmelse (titrering) af suspensioner af bakteriofager (bakte-rievirus) blev i 1952 bragt i anvendelse af Dulbecco til titrering af animale virus. Et konstant volumen af seriefortyndinger af virus tilsættes cellekulturer, hvorfra det ovenstående me-dium er fjernet. Kulturerne inkuberes i passende tid med virusblandingen (adsorptionsfasen), hvorefter cellerne overhældes med medium indeholdende agar eller andet viskøst materiale. Agar er fl ydende ved 400 C, men vil stivne ved afkøling til under 380 C. Dette bevirker at frigjort virus ikke spredes diffust via mediestrømninger, men kun direkte til nabocellerne. Efter en passende tid, vil der for hver oprindelig infi ceret celle, være små lokale områder i cellelaget, hvor cellerne enten er døde, døende eller udviser andre tegn på virusinfektion. Et sådant område benævnes en plaque. De synligøres normalt ved vital farvning f.eks. med neutralrødt. Plaquene ses som ufarvede områder på baggrund af det røde cellelag. Visse virus, f.eks. varicella-zoster og cytomegalovirus, kan danne plaques selv i fl ydende medier fordi nydannet virus kun frigøres i meget ringe udstrækning; virus er cellebundet. Virus, der ikke fremkalder CPE ved deres formering, kan titreres på principielt samme måde, men foci af infi cerede celler synliggøres indirekte, f.eks. med enzymkoblet antistof rettet mod virus, der giver farvede områder lige som ved immunhistokemisk farvning af snit.

Titeren (antallet af infektiøse enheder) i den oprindelige virussuspension beregnes ud fra an-tallet af plaques talt ved en given fortynding: f.eks. der er talt125 plaques på pladen, der blev infi ceret med 0,25 ml af 2-folds fortyndingen 1:8. Der er så125 x 4 x 8 PFU (plaque forming unit) pr ml i den koncentrerede udgangsopløsning.

Antal PFU/ml beregnes ud fra antallet af plaques på den plade, hvor der forekommer ca.100plaques, idet et større antal forøger risikoen for en eventuel overlapning, og færre plaques gi-ver en ringere statistisk sikkerhed. Hvis der tælles 100 plaques (=N) er sikkerheden 100 +/-2√N. Dette gælder, hvis der kun tælles plaques på én plade. Hvis plaquetal fra fl ere pladerfalder på en ret linie, kan en hvilken som helst fortynding anvendes til udregning af PFU/ml.

Materiale:

a) en seks-brønds titerplade med udvoksede cellekulturer af L-celler.

b) et rør med Semliki Forest Virus mrk. SFV*. PLAQUE

c) fortyndingsmedium (PBS tilsat 0.5 % kalveserum)

d) agarmedium (MEM, jfr. Tabel 1, tilsat 5% kalveserum og 1 % agar) e) agarmedium tilsat 50 mg/l neutralrødt

f) stativ med 6 reagensglas

g) 1 måleglas

* SFV er et ”apatogent” virus

DAG 1

77

Teknik:1. 6 WR-glas mærkes 1-5 og K. I hvert glas afpipetteres først 1 ml fortyndingsmedi-

um, hvorpå der laves 2-folds fortyndinger af den udleverede virussuspension, som vist på tegningen. Fra den oprindelige virus-suspension tages med pipette 1 ml,

som overføres til glas 1. Pipettespidsen må ikke komme ned i fortyndingsmediet. Med en ny pipette blandes derpå grundigt ved at suge op og ned med pipetten 4-5 gange, før der udtages 1 ml til næste glas. Det er vigtigt at skifte pipette ved hver fortynding, fordi hver infektiøs viruspartikel, der sidder på ydersiden af pipetten tælles med som en plaque ved afl æsningen. Man samarbejder to og to.

2. Cellelaget iagttages i et invert-mikroskop eller i et alm. mikroskop ved lav forstørrelse (10 x objektiv). Mediet hældes fra cellekulturerne, og brøndene mærkes med 1-5 og K. Pladen mærkes tillige med pladsnummer.

3. Fra hver virusfortynding overføres 0,25 ml (inokulum) til en petriskål. Opløsningen tilsættes forsigtigt i kanten af skålen (en kraftig stråle med pipetten kan løsne cellelaget).

4. Virussuspensionen fordeles over cellelaget ved vipning af pladen straks og derefter hver tiende minut.

5. Efter 30 minutters adsorption overhældes cellelaget i hver petriskål med ca. 2,5 ml agarmedium. Det står i skruelågsfl asker i vandbadet ved ca. 40°C. Brug måleglas. Påhældning skal ske forsigtigt i kanten af skålen, der samtidigt holdes lettere skråt. Når alle brøndene har fået agar, rettes pladen op til vandret stilling og sættes ned på bordet, hvor pladen lades urørt, indtil agaren er stivnet. Derefter inkuberes pladen i CO

2-termostat ved 37°C til næste dag.

6. Vitalfarvning (dag 2):

Til disse cellekulturer tilsættes nu yderligere 2,5 ml agarmedium tilsat neutralrødt, på sam me måde som dagen før. Vitalfarven kan ikke tilsættes straks, da dette reducerer plaquedannelsen.

7. Afl æsning (dag 3):

Tælling af plaques sker lettest ved at markere hver talt plaque med en spids ”speed marker”. Hvis der er mange plaques på en plade, kan denne deles i 1/

2, 1/

3

eller 1/4, og tælling af en del af pladen er tilstrækkeligt. Antallet af plaques for hver

fortynding indføres i nedenstående skema og koordinatsystem, og relationen mellem antal plaques og fortyndingsgrad afbildes grafi sk.

DAG 1

88

Fortynding Antal plaques

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

antal plaquesTiter: —————————————— = ______ PFU/ml

DAG 3

Kvantitativ PCR

Kvantitativ PCR (Q-PCR også kaldet ’real-time’ PCR) benyttes i dag til at detektere tilste-

deværelsen af virus under diverse virusinfektioner (eksempler: Infl uenza, HSV, RSV, adeno-

virus og HIV). Metoden er på mange punkter både mere effektiv, hurtigere og håndterings-

mæssig lettere end både almindelig PCR og dyrkning i cellekulturer.

Blandt fordelene ved at benytte Q-PCR til virus-detektion kan bl.a. nævnes:

• høj specifi citet (der kan skelnes mellem forskellige serotyper og mute

rede genotyper).

• høj sensitivitet (detektion af ned til 1-10 kopier af et virusgen pr. prøve).

• billig, hurtig og nem at håndtere (kan automatiseres),

• lav risiko for falsk-positive eller -negative resultater.

• Stor spændevidde, idet resultaterne kan detekterer fra 1 - 106 kopier.

Q-PCR fungerer grundlæggende som en almindelig PCR med virusgen-specifi kke primere,

men i stedet for semikvantitativ endepunkts-detektion på en agarosegel detekteres mængden

af nyt amplifi ceret DNA efter hver PCR cyklus vha. fl uorescerende stoffer, der frigiver en gi-

ven mængde lys for hver ny DNA-kopi, der dannes. Intensiteten af fl uorescensen er således

positivt korreleret med mængden af PCR-produkt i prøven.

For at bestemme det absolutte antal af kopier i en prøve, medtages en fortyndingsrække

med kendte antal af genkopier i hvert fortyndingstrin (standardrække). I fi gur 1 ses fl uore-

scens-intensitet som funktion af antal cykler. Ct-værdien bestemmes for hver fortynding som

den cykel hvor fl uorescensen overstiger grænsen for baggrundsfl uorescensen (threshold).

Ct-værdierne plottes som funktion af logaritmen til det initielle antal genkopier i fortyn-

dingsrækken, dette plot kaldes standardkurven (fi gur 2). Standardkurven benyttes dernæst til

at bestemme start-antallet af genkopier i de ukendte prøver ud fra deres Ct-værdier. Denne

udregning er normalt automatiseret og foregår i et analyse-program.

DAG 2

9.19.1

9.2

DAG 2

9.2

Figur 1: Q-PCR resultater af en fortyndingsrække (duplikater). Den angivne

lineære fase er den fase af PCR’en, hvor kopiantallet af det amplifi cerede gen stiger

eksponentielt, dvs. PCR’en kører optimalt (100 % effektivitet). Ct er den cykel hvor

fl uorescensen krydser ’threshold’ (grænsen for baggrundsfl uorescensen), og den

benyttes til at bestemme antallet af startkopier i prøven. Plateau: Her er PCR ikke

længere lineær pga. mangel på reagenser som dNTP og polymeraseinaktivitet.

Figur 2: Standardkurve. Ct værdierne fra fi gur 1 som funktion af log(kopiantal) i

standard-rækken. Ct er således omvendt proportionel med koncentrationen af vi-

rusgenet. Dvs. jo højere startkoncentration af virusgenet i prøven, jo færre cykler er

nødvendig før fl uorescensintensiteten overstiger ’threshold’.

Ligningen for linjen er: Y = -3,319 x log(X) + 38,73

9.39.3

Figur 3: Q-PCR kørt på 3 patientprøver benævnt A, B og C.

Opgave: RNA oprenset fra svælgprøver fra tre patienter som mistænkes at være

smittet med H1N1 Infl uenza A blev analyseret vha. Q-PCR med H1N1-specifi kke

primere. Sammen med prøverne kørte man også en fortyndingsrække med kendt

kopiantal (fi gur 1), som benyttes til at lave en standardkurve (fi gur 2).

Som det ses på fi gur 3, er Ct-værdierne for patientprøverne:

A: Ct >40, B: Ct = 18 og C: Ct = 22,5.

1. Hvilken af de tre patienter har det højeste kopiantal i svælgprøven?

2. Udregn eller estimer ud fra standardkurven, hvor mange kopier af det amplifi ce-

rede infl uenzagen der var i hver prøve.

DAG 2

1010

fortynding x inokulumvolumen

Undersøgelse af patientprøver for virus og antivirale antistoffer

Formål:

At isolere hæmagglutinerende virus fra patientmateriale ved dyrkning på embryonerede høn-seæg (A.1), at kvantitere (A.2) og identifi cere (A.3) det isolerede virus, samt at kvantitere antistoffer mod det isolerede virus i serumprøver fra patienten (A.4). Ved disse procedurer sikres det, at det isolerede virus (infl uenza virus) er årsag til patientens aktuelle sygdom (ætiologisk diagnose).

Sygehistorie:

En 19-årig rekrut bliver få dage efter sin tilbagekomst til kasernen efter jule orlov pludselig syg med kulderystelser, hovedpine, svimmelhed, smerter bag øjnene og generelt i musku-laturen. Temperaturen stiger allerede første sygedag til 40°C. Patienten klager endvidere over moderate forkølelsessymptomer med tør hoste og smerter bag ster num. Den objektive undersøgelse viser en lettere konjunktivitis, stærk rødme svarende til fauces, der er uden belægninger, samt moderat lymphadenitis på halsen. Ved lungestetoskopi fi ndes kun spredte ronchi. Endvidere fi ndes leukopeni med relativ lymfocy tose, samt normal SR.

Ved indlæggelsen tages prøve af svælgsekretet, ved at patienten gurgler hals med lidt saltvand tilsat bouillon. Med ønske om virologisk diagnostik sendes prøven hurtigt til labo-ratoriet, hvor der tilsættes antibiotika inden podning. Samtidig sendes akut serum (serum 1) og 10 døgn senere rekonvalescentserum (serum 2) til undersøgelse for virusantistoffer.

A.1. Dyrkning af virus fra svælgskyllevand i befrugtede hønseæg

Teori:

Befrugtede hønseæg har siden 1930 været anvendt til isolation og dyrkning af visse virus. I dag anvendes befrugtede æg hovedsagelig til isolation og dyrkning af MYXO-virus og POX-virus. Det befrugtede æg udgør et naturligt ” sterilt” (mange retrovirus overføres verti-kalt gennem det befrugtede hønseæg) embryonalt miljø med ingen eller kun ringe immuno-logisk aktivitet. Systemet består af celler fra alle tre kimblade. Efter inkubation af æggene i 6-12 dage ved 37°C podes patientmaterialet enten i fosteret, i amnionhulen, i allantoishulen, på chorioallantois membranen eller i blommesækken. Efter yderligere 2-5 dages inkubation kan virusformeringen konstateres ved patologiske forandringer i fosteret (mors, dværgvækst, blødninger o.l.), i fosterhinderne (blødninger eller focale nekroser (pocks) eller ved påvis-ning af virus i fostervæskerne, f.eks. ved en hæmagglutinationsreaktion.

Materiale:

a) Befrugtet hønseæg med 9-11 dage gammelt foster

b) pincet

c) engangssprøjte og tilhørende kanyle

d) PBS

e) klar tape

f) glas med patientprøve (svælgskyllevand tilsat antibiotika).

DAG 1

1111

Teknik:

1. Et område af skallen over luftsækken er jodet, og der laves her et hul på ca. cm2, med en steril pincet.

2. Med en pasteurpipette dryppes nogle dråber sterilt PBS på den indre skalhinde, der dækker chorioallantois membranen, hvorved denne bliver gennemsigtig, således at de store karstammer kan lokaliseres.

3. Med en steril engangssprøjte podes 0,2 ml af prøven ind i allan toiska vi teten,idet man går 1-2 mm ned gennem chorioallantois membranen et passende sted mod sat fostret, idet man undgår at lædere de store karstammer. Undgå også at pode i blomme sækken.

4. Hullet i skallen lukkes omhyggeligt med tape. æggene mærkes og inkuberes i 2 døgn ved 37°C.

A.2. Hæmagglutinations-reaktion (HA). Titrering af virus dyrket i befrugtet hønseæg

Teori:

Erythrocytter fra mennesker, pattedyr og fugle kan agglutineres af virus høren de til fl ere forskellige virusgrupper, således af MYXO- og PARAMYXO-virus, POX-virus, ADENO-virus, TOGA-virus, REO-virus og ENTERO-virus. Hæ mag glutininet kan enten være hele viruspartiklen (visse Togavirus), eller en del af viruspartiklens ”enve lope” (Myxo- og Para-myxovirus), eller et lipid-protein kompleks, der kan adskilles fra selve viruspartiklen (Pox-virus). Hæmag glu ti na tionsreaktionen (HA) hæmmes specifi kt af antistoffer rettet mod virus (hæmag glutinations-inhibition, HI). Denne specifi citet kan udnyttes til identifi kation af et ukendt virusisolat, når der rådes over kendte anti sera. HI- reaktionen forudsætter anvendelse af en passende mængde virus i hver reaktion (i reglen 4 HA-enheder virus). Kvantitering af virus er derfor nødvendig, inden den egentlige identifi kation af virus med hæmagglutinati-onshæmning (HI) kan ud føres.

Materiale:

a) Allantoisvæske høstet fra det podede æg

b) reagensglas

c) PBS

d) pipettespidser

e) pasteurpipetter

f) microtiterplade

g) suspension af vaskede erythrocytter.

DAG 1

DAG 3

1212

Teknik:

1. Tapen fjernes og hullet i skallen på det podede æg gøres større med en fl amberet pincet. Den indre skalhinde løsnes forsigtigt fra chorionallantois membranen, idet man undgår at rive store kar over.

2. Med en pasteurpipette høstes 1-2 ml allantois-væske, som anbringes i et regens- glas. Der fremstilles en 1:10 fortynding (en del virus + 9 dele PBS).

3. I hvert af 10 huller i microtiterpladen afpipetteres 50 µl PBS.

4. 50µl allantoisvæske, fortyndet 1:10, afpipetteres i det første hul, og der blandes, hvorpå 50 µl overføres til næste hul o.s.v. Resultat: en 2-folds fortynding med fortyndinger fra 1:20 til 1:10240.

5. Til alle 10 huller sættes 50 µl PBS, og i et 11. hul (erythrocyt-kontrollen) sættes 2 x 50 µl PBS. Denne tilsætning har udelukkende det formål at justere det ende lige volumen så forsøg A2, A3 og A4 umiddelbart kan sammenlignes.

6. Den udleverede erythrocyt-suspension vendes fl ere gange, og 50 µl af denne sættes til hvert af de 11 huller, hvorefter der blandes.

7. Afl æsning efter henstand i 60 minutter. Anfør i skemaet nedenfor hæmag glu tina tionen i de enkelte virusfortyndinger med + eller o (o svarer til sænk nings mønstret i brønden når der ikke er hæmagglutination). Titeren angives i antal HA enheder pr. volumenen hed (50µl eller pr ml). 1 HA er den mængde virus materiale, der fi ndes i den højeste fortynding, som giver 100% hæmagglutination. Titeren (antal HA/50 µl) er den reciprokke værdi af den højeste fortynding, der giver 100 % hæmagglutination.

Virusfortyndinger:1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240 K

Hæmagglutination (+/o):

Titer: ___________________ HA/50µl

A.3. Hæmagglutinationshæmnings-reaktion (HI). Identifi kation af virus dyrket i befrugtet hønseæg

Teori: Se A.2 (s. 11)

Materiale:a) Allantoisvæske udleveres indstillet til 4 HA/50µl (fremstil 2 ml)

b) PBS

c) pipettespidser

d) microtiterplade

e) erythrocytter

f) antisera mod Infl uenza A virus og Infl uenza B virus.

DAG 3

1313

Teknik:

1. 50 µl virusfortynding med 4 HA af det ukendte virus overføres til 2 brønde i microtiterpladen.

2. Til to andre brønde overføres 50 µl PBS (serumkontroller).

3. Til en ”virus”-brønd og en ”PBS”-brønd sættes 50 µl anti-Infl uenza A virus antiserum (anti A) og til den anden virus-brønd og PBS-brønd sættes 50 µl anti- Infl uenza B virus antiserum (anti B).

4. Disse blandinger henstår i 30 minutter i laboratoriet, hvorefter 50 µl erythrocyt- suspension tilsættes.

5. Afl æsning (dag 4):

Hæmagglutinations-reaktionerne kan afl æses efter 60 minutter (pga tidsnød stilles pladen i køleskab straks efter tilsætning af erythrocytter og afl æses næste dag). Hæmagglutinationsreaktionerne indføres i nedenstående skema. Det ukendte virus kan derefter identifi ceres på basis af reaktionerne for serum anti A og serum anti B, hvis serumkontrollernes reaktion er OK (”+” eller ”o”?).

Anti A Anti B

4 HA ukendt virusHæmagglutination (+/o):

PBS (serumkontroller)Hæmagglutination(+/o):

Det isolerede virus var Infl uenza ________

A.4. Hæmagglutinationshæmnings-reaktion (HI). Påvisning og kvantitering af antistoffer i patientserum

Teori:

Virushæmagglutinationen hæmmes som nævnt (A.2, side 11) af specifi kke antistoffer, et for-hold der også benyttes til påvisning af antistoffer i ukendte sera. En bestemt mængde virus (4 HA/50 µl) inkuberes i 30 minutter med 50 µl fortyndinger af det ukendte serum, hvorpå der tilsættes erythrocytter. Er der intet antistof i serumfor tyndingen, fås hæmagglutination (+) (sammenlign med virus kontrollen); er der antistof tilstede, vil dette forhindre hæmag-glutina tion en, og reaktionen bliver som i erythrocyt-kontrollen (o).

Materiale:

a) Allantoisvæske fra det podede æg indstillet til 4 HA/50 µl

b) en ”akut” og en ”rekonvalescens” serumprøve (mrk. S1 og S2) fra patienten (jfr. s.14)

c) glas med erythrocytter

d) glas med PBS

e) pipettespidser

f) microtiterplade

DAG 3

1414

Teknik:

1. Patientsera (SI og SII) seriefortyndes tofold i microtiterpladen. 7 brønde i en række tilsættes 50 µl PBS. 50 µl SI afpipetteres i første hul. Der blandes, hvorpå 50 µl ml overføres til næste hul o.s.v. (samme pipette kan benyttes). Den samme procedure for SII. Den sidste fortynding bliver 1280, idet serum er fortyndet 1:10 inden udleveringen.

2. 50 µl allantoisvæske indeholdende 4 HA/50 µl tilsættes hver brønd med serumfortynding. Der blandes og pladen henstår 30 minutter i laboratoriet, hvorefter

3. Der tilsættes 50 µl oprystet erythrocytsuspension. Der opsættes samtidig følgende kontroller: Erythrocyt-kontrol (2 x 50 µl PBS + 50 µl erythrocyt-suspension), viruskontrol (50 µl virus + 50 µl PBS + 50 µl erythrocyt-suspension), serum kontroller for SI og SII(50 µl serum + 50 µl PBS + 50 µl erythrocyt-suspension).

4. Pladen henstår i 60 minutter (eller i køleskab til næste dag).

5. Afl æsning (dag 4): Hæmagglutinations-reaktionerne (+/o) anføres i neden- stående skema og serums titer (HI/50 µl) angives.

En HI (hæmagglutinations-hæmmende enhed) defi neres som den mængde antistof, der fore-kommer i den højeste serumfortynding, der fuldstændigt forhindrer hæmag glutination af 4 HA enheder virus. Serums titer (antallet af HI/50 µl) er den reciprokke værdi af den serum-fortynding, der indeholder 1 HI.

En 4-fold eller større stigning i HI-titeren under infektionsforløbet, dvs. fra akutserum til reconvalescensserum (2 trin eller mere i fortyndingsrækkerne) betragtes som diagnostisk signifi kant.

Akut serum (mrk. SI)

Fortyndinger af serum I1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 Serum 1 Erythrcyt. kontrol kontrol

4 HA/serumfortyndingHæmagglutination (+o)

HI-titer serum I: ________ HI/50 µl

Rekonvalescent serum (mrk. SII)

Fortyndinger af serum II1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 Serum 2 Virus kontrol kontrol4 HA/serumfortyndingHæmagglutination (+/o)

HI-titer serum II: _________ HI/50 µl

DAG 3

Hurtig screening af patientprøver for infl uenza A og B

Formål:

At demonstrere en bed-side screeningsmetode til påvisning af infl uenza A og B direkte fra

svælgskyllevand fra patienter. Resultatet foreligger indenfor 10-15 minutter.

Denne test tillader en hurtig kvalitativ detektion af infl uenza A og B antigener direkte fra

svælg,- og nasal podning samt fra svælgskyllevand og nasalsekreter.

Testen er ment som en hjælp til hurtig differentiel diagnose af akut infl uenza A og B. Meto-

den er langt mindre sensitiv end påvisning ved dyrkning i æg og efterfølgende hæmaggluti-

nations-reaktion og hæmagglutinationsinhibitions-reaktion, hvorfor et negativt testresultat

bør konfi rmeres ved brug af disse metoder.

Testprincip:

Testen er et immunoassay, bestående af en teststrimmel indeholdende monoklonale antistof-

fer mod infl uenza A og B antigener. En patientprøve blandes med en ekstraktionsbuffer der

frigør eventuelle virale antigener, heriblandt internaliserede virale nucleoproteiner. Herefter

placeres teststrimlen i opløsningen, hvorved de frigjorte nucleoproteiner vil kunne reagere

med reagenserne i teststrimlen.

Materiale:

QuickVue infl uenza A+B test indeholdende:

a) Teststrimmel

b) Ekstraktionsrør indeholdende frysetørret detergent- og reduktionsbuffer

c) Engangspipetter

Herudover:

d) Patientprøve (svælgskyllevand tilsat antibiotika)

Fremgangsmåde:

1. Fyld engangspipetten med patientprøve til den øverste knop, og overfør den opsu

gede væske til ekstraktionsrøret. Bland forsigtigt ved at banke på røret med fi ngeren.

2. Placer teststrimlen i ekstraktionsrøret således at pilene på teststrimlen peger nedad

og lad den stå uberørt.

3. Afl æs resultatet efter 10 minutter.

Afl æsning:

Testen er positiv for infl uenza A hvis der fremkommer en rød linje eller skyggen af en rød

linje ovenover den blå kontrollinje.

Testen er positiv for infl uenza B hvis der fremkommer en rød linje eller skyggen af en rød

linje under den blå kontrollinje

Testen er negativ hvis der kun fremkommer en blå kontrollinje

Testen er ugyldig hvis der ikke fremkommer en blå kontrollinje, - også selvom der

DAG 2

14.114.1

DAG 2

14.214.2

fremkommer en rød linje. Testen er ligeledes ugyldig hvis baggrundsfarven ikke er forsvun-

det efter de 10 minutter, således at det forstyrrer afl æsningen af testen. En ugyldig test skal

laves om med ny patientprøve og ny teststrimmel.

Resultat:_____________________________

1515

DAG 2

Formål:

At demonstrere påvisning af virusantigen direkte i prøvemateriale fra patienter med en mo-derne hurtigdiagnostisk (resultatet af undersøgelsen foreligger inden for 24 timer) metode: ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

Hepatitis betyder leverbetændelse og forårsages hyppigt af virus (mindre hyppigt af bakte-rier f.eks. Leptospira, eller andre mikroorganismer). Følgende virus regnes til de egentlige hepatitisvirus: Hepatitis A Virus, (HAV et Picornavirus), Hepatitis B Virus (HBV, et He-padnavirus), Hepatitis C Virus (HCV, et Flavivirus), Hepatitis D Virus (HDV, ”deltavirus”, uklassifi ceret), Hepatitis E Virus (HEV, uklassifi ceret) og Hepatitis G Virus (HGV, et Flavi-virus). Sygdommen varierer fra almindeligt ubhag, anorexi og kvalme til akut livstruende leverinsuffi ciens, som dog er sjældent. Mere end 50% af leveren skal være beskadiget før leverfunktionen er kompromitteret. Leverceller regenererer hurtigt, men fi brøs reparation specielt ved persisterende infektion, kan medføre levercirrhose. Der er ingen effektive be-handlingsmetoder udover at Inter-feroner kan anvendes til behandling af HBV og HCV be-tinget hepatitis. Der fi ndes effektive vacciner mod hepatitis A og B.

Klinisk kan der ikke skelnes mellem de forskellige virus som årsag til hepatitis. Karakteristisk for akut viral hepatitis er en dramatisk forhøjelse af serum koncentra tionen af leverenzymer (ALT; AST). Virus hepatitis diagnosticeres ved påvisning af antigener, anti-stoffer eller af nukleinsyrer for de respektive virus.

I de udleverede serumprøver påvises følgende tre parametre

(HBV markører; jfr. kurven over forløbet af en HBV infektion):

Hepatitis-s antigen (HBsAg), som er tilstede i serum i en periode på ca. 3-4 måneder ved akut hepatitis B fra 1 måned før symptomerne begynder til 1 måned efter de er holdt op.

Antistof mod s-antigen (anti HBs), som først kan påvises ca. en måned efter at HBsAg er forsvundet fra serum. Derefter persisterer det i fl ere år.

Antistof mod core antigen (anti HBc), som i reglen kan påvises i serum allerede når syg-doms symptomerne begynder. Derefter persisterer det i mange år. Evt. kan det have diag-nostisk værdi at påvise IgM antistof imod core antigen i en tidlig syg-domsfase. Ved denne aktuelle ELISA påvises såvel IgM- som IgG antistoffer, en såkaldt anti-total test.

De udleverede serumprøver er præparerede på en sådan måde, at de ikke udgør nogen som helst smittefare.

Organisation af øvelsen:

Der arbejdes i hold af 6 studenter. Hvert hold undersøger serum fra en af de på side 15.2 nævnte patienter (1-4) for de tre ovennævnte parametre. Indenfor hvert hold undersøger 2 studenter serum fra den pågældende patient for HBsAg; 2 andre studenter undersøger det samme serum for anti-HBs og de sidste 2 studenter på holdet undersøger det samme serum for anti HBc.

Påvisning af Hepatitis B Virus antigen og antistoffer ved Elisa

15.1

DAG 2

Overfladeprotein (HBsAg) Kærne (HBcAg)

DNA-polymerase DNA-genom

42 nm

Overfladeantigenpartikler(HBsAg)

22 nm

Hepatitis B Virus

Viruspartikler (Dane-partikkel)

Forløbet af akut Hepatitis B Virus infektion

1 2 3 4 5 6 7 8

Level OfDetection

Months AfterExposure

SGPT (ALT)Symptoms

RealativeConcentrationOf Reactants

DNA polymerese

HBV particlesAnti-HBc

Anti-HBs

Anti-HBe

HBsAg

HBeAg

1 2 3 4 5 6 7 8

ImportantDiagnostic Tests

HBsAg HBsAg (anti-HBc) Anti-HBc

Anti-HBs (anti-HBc)

IncubationPeriod

ProdromeAcute Disease

ConvalescenceEarly Late

15.2

DAG 2Materiale:serumprøver fra 4 patienter:

Patient 1 har akut hepatitis B. Patienten har haft gulsot i et par uger.

Patient 2 befi nder sig i rekonvalescensfasen efter en akut hepatitis B, der viste symptomer ca. to måneder tidligere.

Patient 3 har haft hepatitis nogle år tidligere, men har ikke udviklet kronisk hepatitis.

Patient 4 er for nyligt blevet vaccineret med HBV vaccine og er i øvrigt rask.

Opgave:Hvert hold af 6 studenter får udleveret en kodet serumprøve fra en af de 4 patienter. Efter at serumprøven er blevet undersøgt for de pågældende tre parametre, fi nder man efter konsultation af efterfølgende tabel frem til hvilken af de fi re patienter serumprø-ven efter al sandsynlighed stammer fra.

HBsAg anti-HBs anti-HBc tydning

pos neg neg tidlig akut hepatitis B. Patient 1.

neg neg pos rekonvalescensfase efter akut hepatitis B. I ”vinduet”. Patient 2.

neg pos pos tidligere hepatitis B. Patient 3.

neg pos neg vaccinationsreaktion. Patient 4.

15.3

DAG 2

Testprincippet Dette foregår i 3 trin og fremgår af ovenstående tegning.

1. Polystyren mikro-ELISA moduler, coated’ med hepatitis B antigen, HBsAg, (solid-fase) inkuberes med patientserum. Evt. tilstedeværende anti-HBs antistof i prøven vil bindes til HBsAg i bunden af den pågældende brønd.

2. Efter vask med fosfatbuffer, hvor ikke bundet materiale fjernes, tilsættes konjugat, der består af HBsAg mærket med peroxidase. Under den påfølgende inkubation, vil det mærkede antigen bindes til anti-HBs antistof, bundet solid-fase i det foregå - ende trin.

3. Efter yderligere vask, tilsættes en substratopløsning, bestående af TMB (tetramethylbenzidin) tilsat hydrogenperoxid. Ved reaktion imellem peroxidase og substrat dannes en blå forbindelse, der skifter farve til gul når reaktionen stoppes med svovlsyre.

Materialer:

Et mikro-ELISA-modul bestående af 8 brønde coated’ med HBsAg, subtype ay (mærket S)Glas med positiv kontrolserum, højt indhold af antistof, (mærket H-PK)Glas med positiv kontrolserum, lavt indhold af antistof, (mærket L-PK)Glas med negativ kontrolserum, (mærket NK)Glas med serumprøve fra patient (mærket PS) Glas med færdigfremstillet konjugatopløsningGlas med færdigfremstillet TMB-substratGlas med svolvsyre

Påvisning af ANTI-HBs ved ELISA. Kvalitativ bestemmelse

HBsAg

subtype ay

30 min. 20-25 °C

HBsAg-HRP

subtype ad

30 min. 20-25 °C

TMB

substrat

30 min. 20-25 °C

H2SO

4

Stop og afl æs reaktionen

Patient-

prøve

15.4

DAG 2Testprocedure:

H-PK H-PK L-PK L-PK NK NK PS PS

A B C D E F G H

1. Brøndene tømmes og vaskes (anvend Nunc IMMUNOWASH) med fosfatbuffer 2 gange.

2. Til hver 2 brønde tilsættes, som angivet på tegningen,100 l af henholdsvis positiv kontrolserum, såvel H-PK som L-PK, negativ kontrolserum, NK og det ukendte patientserum, PS.

3. Brøndene tildækkes og inkuberes 30 min. ved stuetemperatur.

4. Vask med fosfatbuffer. Brøndene tømmes først helt, hvorefter de fyldes og tømmes i alt 2 gange.

5. Tilsæt 100 l konjugatopløsning til alle brønde.


7. Vask med fosfatbuffer som før i alt 2 gange.

8. Tilsæt 100 l TMB-substrat til alle brønde.

9. Brøndene tildækkes og inkuberes præcis 30 min. ved stuetemperatur i mørke; modulet stilles ned i skuffen.

10. Stop reaktionen ved at tilsætte 100 l svovlsyre til hver brønd og afl æs inden 15 minutter på fotometer ved 450 nm.

Vedrørende aflæsning:Bestem følgende værdier:

N: gennemsnit af NK,

P: gennemsnit af L-PK,

HP: gennemsnit af H-PK,

S: gennemsnit af patientserum, PS.

Testforløb er kun gyldigt hvis N < 0.400, P > 1.4N og HP-P > 0.300, Cut-off = (N+P)/2

Vedrørende resultat: En prøve er positiv når S > cut-off ; en prøve er negativ når S < cut-off.

15.5

DAG 2

TestprincipDe 3 trin i denne test fremgår af ovenstående tegning.

1. Der anvendes en såkaldt sandwich inhibitions ELISA. Mikro-ELISA-moduler, coated’ med rekombinant hepatitis B core-antigen, inkuberes med serum fra en patient. Indeholder serum antistoffer imod HBc antigen, vil core-antigen (solid-fase) blive helt eller delvist blokeret.

2. Efter vask, hvor ikke-bundet materiale fjernes, inkuberes med konjugat, der består af humane HBc-antistoffer konjugeret med peroxidase. Dette konjugat vil da bindes til frie solid-fase antigener.

3. Efter yderligere vask, inkuberes med substrat, bestående af TMB (tetramethylbenzidin) tilsat peroxid. Ved reaktion imellem peroxidase og substrat dannes en blå forbindelse, der skifter til gul, når reaktionen stoppes med svovlsyre. Der afl æses i fotometer ved 450 nm.

Farveintensiteten afhænger naturligvis af mængden af bundet peroxidase-konjugeret anti-stof, og farveintensiteten er altså i dette assay omvendt proportional med mængden af

anti-HBc-antistof i patientprøven. En patientprøve, der er fri for anti-HBc, vil give en

intens farvereaktion, hvorimod en patientprøve med anti-HBc, vil reducere farveinten-

siteten.

Materialer:

Et mikro-Elisa-modul med 8 brønde, coated’ med HBc-antigen (mærket c)Glas med positiv kontrolserum, (mærket PK)Glas med negativ kontrolserum, (mærket NK)Glas med patientserum, (mærket PS)Glas med fosfatbuffer, (mærket FB)Glas med færdigfremstillet konjugatopløsningGlas med færdigfremstillet TMB-substratGlas med svovlsyre

Påvisning af anti-HBc (antistof mod hepatitis B core antigen). Kvalitativ bestemmelse.

HBcAg

recombinant

(solid-fase)

30 min. 20-25 °C

h-anti-HBc/HRP

konjugat

30 min. 20-25 °C

TMB

substrat

30 min. 20-25 °C

H2SO

4


Patient-

prøve

(h-IgG)

15.6

DAG 2Testprocedure:

1. Brøndene tømmes og vaskes (anvend Nunc IMMUNOWASH) med fosfatbuffer 2 gange.

2. Til hver 2 brønde tilsættes 100 l af følgende reagenser, PK, NK, PS og FB som angivet på tegningen:


4. Vask med fosfatbuffer. Brøndene tømmes helt, hvorefter de fyldes og tømmes 2 gange i alt.

5. Tilsæt 100 l Konjungatopløsning til alle brønde.


7. Vask med fosfatbuffer som før i alt 2 gange.

8. Tilsæt 100 l TMB-substrat til alle brøndene.

9. Brøndene tildækkes og inkuberes præcis 30 min. ved stuetemperatur i mørke; modulet stilles ned i skuffen.

10. Stop reaktionen ved at tilsætte 100 l svovlsyre til hver brønd og afl æs inden 15 minutter på fotometer ved 450 nm.


P: gennemsnit af PK,


S: gennemsnit af PS.

Testforløbet er kun gyldigt, hvis P < 0.500 og N-P > 0.250. Cut-off = (N+P)/2

En patientprøve er positiv for anti-HBc-antistof hvis S < cut-off værdienEn patientprøve er negativ for anti-HBc-antistof hvis S > cut-off værdien

PK PK NK NK PS PS FB FB

A B C D E F G H

15.7

DAG 2

Testprincip: Dette fremgår af fi guren.

1. Brøndene i mikro-ELISA-modulet er coated' med antistof imod HBsAg.

2. Konjugat bestående af antistof imod HBsAg konjugeret med peroxidase tilsættes. Indeholder serumprøven HBsAg, dannes komplekset: antistof/HBsAg/enzym - mærket antistof.

3. Substrat tilsættes og der fremkommer en blå farve, der bliver gul ved tilsætning af svovlsyre. Indeholder serumprøven ikke HBsAg, bindes der ikke konjugat, og der fremkommer kun en svag baggrundsfarve.

Materialer:

Et mikro-Elisa-modul med 8 brønde (mærket Ag), coated’ med monoklonalt antistof.Glas med konjugatGlas med positiv kontrolserum, (mærket PK)Glas med negativ kontrolserum, (mærket NK)Glas med patientserum, (mærket PS)Glas med fosfatbuffer, (mærket FB)Glas med færdigfremstillet TMB-substrat (tetramethylbenzidin tilsat brintperoxid)Glas med svovlsyre

Påvisning af HBsAg ved ELISA

Solid-fase

monoclonal

anti-HBs

60 min. 20-25 °C

HRP-mærket får

anti-HBs konjugat

TMB

substrat

30 min. 20-25 °C

H2SO

4


HBsAg i prøve

DAG 2

15.8

1. Brøndene tømmes og vaskes (anvend Nunc-IMMUNOWASH) med fosfatbuffer 2 gange.

2. Til alle brøndene tilsættes 50 l konjugat.

3. Til hver 2 brønde tilsættes 100 l af følgende reagenser PK, NK, PS og FB som angivet på tegningen.

4. Brøndene tildækkes og inkuberes ved stuetemperatur 1 time.

5. Brøndene tømmes helt og vaskes 2 gange med fosfatbuffer.

6. Tilsæt 100 l TMB-substrat til hver brønd.

7. Brøndene tildækkes og inkuberes præcis 30 min. ved stuetemperatur i mørke (modulet stilles ned i skuffen).

8. Stop reaktionen ved at tilsætte 100 l svovlsyre til hver brønd og afl æs inden 15 minutter i fotometer ved 450 nm.


P: gennemsnit af PK,


S: gennemsnit af patientserum.

Testforløbet er kun gyldigt, hvis P-N >0.400. Cut-off = N+0.1

Vedrørende resultat:En prøve er positiv, hvis S > cut-off værdienEn prøve er negativ, hvis S < cut-off værdien

Testprocedure:

PK PK NK NK PS PS FB FB

A B C D E F G H

Endpoint-titrering

Formål med øvelsen:

At bestemme virustiter (TCID50) af en udleveret virusopløsning via afl æsning af den "Cyto Patogene Effekt" (CPE).

Teori:

Virus optages via en specifi k receptor på sin værtscelle og trænger via denne ind i cellen, hvor replikationen foregår. Efter ca. 20 timer vil der være dannet talrige nye virus partikler (10.-50.000) og disse vil hyppigt blive frigjort samtidigt med, at cellen degenererer og lyse-rer (celledrab). Denne proces kan iagttages i et omvendt mikroskop, hvor man kan se, at det oprindelige cellelag gradvist ødelægges under dannelse af afrundede (pykniske) celler samt celledebris (infi cerede celler); der ses altså en tydelig Cyto Patogen Effekt (+CPE); uinfi ce-rede celler bevarer derimod monolag strukturen, og der ses ingen cytopatogene forandringer (-CPE). Det er således muligt at styrkebestemme en virusopløsning ved at udtitrere opløs-ningen og bestemme, hvor langt ud i fortyndingsrækken man kan iagttage en +CPE; ud fra dette kan man beregne en TCID50, idet TCID50 defi neres som den fortynding, der bevirker at 50% af cellekulturerne infi ceres. Ved øvelsen anvendes en murin cellelinie.

Materialer:

a) 1 Microtiterplade tilsået med 10.000 L-celler (i 100 µl medium) dagen før i brøn dene B - G, kolonne 3 - 5 (se skema A side 16.2). OBS.: Hold microtiterpladen vandret hele tiden.

b) 7,5 ml medium (Eagle's MEM med Earle's salt + 5% føtal kalveserum).

c) 1 eppendorfrør med 500 µl EMC-virus ( står i køleskab og tages først frem umiddelbart før brug; husk handsker!). Encephalo Myocarditis Virus er et murint virus.

d) 6 sterile eppendorfrør ( á 2 ml).

e) Pipettespidser.

Udførelse:

Fremstilling af virusfortyndingerne. NB.: Brug handsker.

1) 6 eppendorfrør til virusfortyndinger mærkes 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 og der overføres 900 µl medium til hvert rør.

2) 100 µl EMC-virus overføres til røret mærket 10-1; der skiftes spids og blandes med pipetten 10 gange (undgå luft i plastspidserne - skumning og aerosoler!). Med en ny spids overføres 100 µl fra 10-1 til røret mærket 10-2, der skiftes spids, blandes 10 gange, etc.

3) Til de uinfi cerede cellekontrol kulturer (CK) tilsættes 50 µl medium (uden virus) (se skema A kolonne 5). Vigtigt: Undgå at berøre cellelaget i bunden af brøndene med pipettespidsen!

4) Virusfortyndingerne overføres forsigtigt til de respektive brønde i microtiterpladen med cellekulturerne (se skema A, side 16.2):

DAG 1

1616

DAG 1

16.116.1

Til kolonne 3 og 4 overføres 50 µl af virusfortyndingerne 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1 til rækkerne G (10-6), F (10-5), E (10-4), D (10-3), C (10-2), B (10-1). Microtiterbakken in-kuberes i en CO2-termostat ved 37oC til næste dag.

Afl æsning:

Materialer:

Microtiterplade fra dag 1, tilsat farveopløsning (MTS (tetrazoliumsalt)/PMS (co-oxidator)) 2 timer før øvelsens start samt invertmikroskop.

Udførelse (afl æsning) - jvf. skema A:

Samtlige brønde med cellekulturer afl æses i det omvendte mikroskop, idet uinfi cerede kultu-rer markeres med et "-" i skema A; infi cerede markeres med et "+". Herefter kan TCID50 af den udleverede virus bestemmes (sammen med læreren).

I stedet for at afl æse alle brøndene under mikroskop anvendes ofte en farvemetode, som "måler" mitochondriefunktionen, idet fl ertallet af de virus, som giver en positiv CPE også giver en markant depression af mitochondrieaktiviteten. En uinfi ceret celle har således en relativ høj mitochondrieaktivitet (via en høj dehydrogenase-aktivitet), hvilket indebærer et betydeligt oxidationspotentiale. Dette kan måles efter tilsætning af et kunstigt substrat (MTS/PMS), som skifter farve til stærkt mørkerødt, når det er blevet oxideret. Virusinfi ce-rede celler (med+CPE) har en stærk nedsat mitochondriefunk-tion (med et tilsvarende nedsat oxidationspotentiale) og farver derfor ikke substratet (som forbliver svagt lyserødt).

Mikrotiterpladen afl æses i en scanner ved 492 nm (laboranten foretager afl æsningen) og re-sultaterne, som indføres i skema B, sammenlignes med CPE-afl æsning-erne (og diskuteres efterfølgende med læreren).

DAG 3

DAG 3

16.216.2

DAG 2

1717

Prøvetagning og transport af prøver til diag-nostik af virusinfektioner (teori)

Formål:

At gøre deltagerne fortrolige med prøvetagningsteknik og forsendelse af patientprøver til virusdiagnostik, herunder forsigtighedsregler ved udtagning og forsendelse, specielt med henblik på tilstedeværende HIV, HBV og HBC i prøvematerialet.

DAG 1

1818

2323

Delkursus 1

Bakteriologi

2424

Kursusoversigt bakteriologi

Før hver dag er angivet læseliste i "Klinisk Mikrobiologi og Infektionsmedicin", FADL 2008.

Dag 1 Bakteriecytologi 26

Mikroskopisk karakterisering af bakterier, A 28

Overførsel af infektion 29

Spørgsmål til selvtestning 32

Dag 2 Overførsel af infektion 33

Mikroskopisk karakterisering af bakterier, B 33

Bakteriemetabolisme, -vækst og -dyrkning 34

Rendyrkning af bakterier 34

Udsåning til identifi kation af Gram-positive kokker 36


Dag 3 Rendyrkning af bakterier 38

Gram-positive sporedannende stave 38

Gram-positive non-sporogene stave 38

Corynebacterium og Listeria 38

Mycobacterium 39

Gram-positive kokker 39


Dag 4 Gram-positive kokker 43

Penicillinase påvisning 43

Bakteriegenetik, infektiøs kemoresistens 44

Gram-negative kokker 45

Små Gram-negative stave 45

Podning på plader til identifi kation (større Gram-negative stave) 45-46

Podning af ukendt bakterie til biokemisk identifi kation 46


2525

Dag 5 Infektiøs kemoresistens 48

Gram-negative stave 48

Biokemisk identifi kation af Gram-negative stave 49 og 51

Serologisk identifi kation af Gram-negative stave 49

Bakterieklassifi kation 50


Dag 6 Undersøgelser af prøver med ukendt indhold (1)

udsåning samt afgivelse af mikroskopisvar 52

Urinprøver 54

Blodprøver 55

Spinalvæsker 56

Podninger 58

Ekspektorater 59


identifi kation og følsomhedsbestemmelse 60-64


afslutning og rapport 65

Sterilisation og desinfektion (øvelser) 65-67

Normal fl ora 68-69


afl evering af rapport 70

Sterilisation og desinfektion (fortsat) 70

Normal fl ora (fortsat) 71

Undersøgelse af blodprøve for malaria 71

Dag 10 Undersøgelser af pr med ukendt indhold (5)

gennemgang af rapporter 72

Bakteriologisk appendix 73

Håndvask, genopfriskning fra dag 1 72

2626

Bakteriecytologi

Læseliste side: 1-8, 21-42, 230-237, 251-254.

Formål:

At karakterisere bakteriecellen med særligt henblik på forskelle mellem bakterier og men-neskeceller.

Gennemgang:

Mikroorganismernes indbyrdes placering og deres relation til dyre- og planteriget.

Deltagerantal:

Øvelsen udføres enkeltvis, men det anbefales, at man diskuterer besvarelserne med andre deltagere.

Materiale:

Lærebøger.

Øvelse:

Angiv i skemaet på næste side navnet på de nummererede strukturer i den efterfølgende skematiske tegning af en bakterie, anfør tillige den kemiske sammensætning og strukturens funktion. Besvar til sidst de efterfølgende spørgsmål.

DAG 1

2727

Strukturens Kemisk Funktion nr. navn sammensætning

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

Angiv på hvilke punkter bakteriecellen adskiller sig fra den humane celle, samt hvor ledes man i antibakteriel kemoterapi kan udnytte disse forskelle.

Nævn, hvilke forskelle, der må anses for nemmest at udnytte.

Hvilke af de i skemaet omtalte strukturer fi ndes ikke hos alle bakterier?

DAG 1

2828

DAG 1 Mikroskopisk karakterisering af bakterier, AFormål:

At indøve mikroskopering med immersionsolie; at demonstrere forskellige bakterieformer; at give indtryk af bakteriers størrelse og lejring; at demonstrere andre mikroskopiske bakte-riestrukturer af betydning for den mikrobiologiske diagnostik.

Gennemgang:

Brugen af det almindelige lysmikroskop i bakteriologisk arbejde

Deltagerantal:

Øvelsen udføres af hver enkelt deltager.

Materiale:

a) Æske med præparater i skuffen

b) mikroskop

c) immersionsolie

d) linsepapir.

Nr. Bakterieart Mikroskopi med henblik på

1. Staphylococcus aureus kok, diameter 1 m, lejring i hobe, Gram-positiv (blå)2. Escherichia coli alm.stav, 1/

2 x 3 m, tilfældig lejring, Gram-negativ

(rød)3. Streptococcus pyogenes kok, 1 m, lejring i kæder, Gram-positiv4. Streptococcus pneumoniae kok/lanceolat, 1 m, diplo (end-to-end), Gram-positiv5. Haemophilus inß uenzae lille stav (0,2-0,3 x 0,5-0,8 m), pleomorf, Gram-nega tiv6. Escherichia coli involutionsformer, Gram-negativ7. Clostridium tetani stor stav (1 x 2-8 m), spore-danner, Gram-positiv

Procedure:

Præparat 1-7 mikroskoperes, idet man noterer sig de nævnte former og strukturer, samt Gram-farvbarheden. Betydningen af de nævnte bakterier diskuteres. Præparaterne aftørres i Kleenex inden de anbringes i æsken igen.

2929

DAG 1Overførsel af infektionFormål:

At påvise forekomsten af den normale bakteriefl ora på den menneskelige organisme; at vise, hvor let bakterier kan overføres; at demonstrere på hvilke måder infektioner kan spredes.

1. Håndvask (se side 32)

Formål:

At demonstrere effekten af håndvask m.h.p. kontaktinfektion.

Deltagerantal:

Man arbejder sammen i hold på 2 deltagere.

Materiale:

11 almindelige agarplader pr. hold.

Procedure:

1. Mærk agarpladerne 1 til 11 på bunden; husk pladsnummer på hver plade.

2. Den ene deltager afsætter den ene hånds fi ngeraftryk på overfl aden af plade 1 med en let berøring.

3. Samme deltager vasker derpå hænderne grundigt i 30 sekunder, ryster vandet af hænderne (de skal stadig være våde), og afsætter de samme fi ngeraftryk på plade 2.

4. Derefter tørres hænderne grundigt med et papirhåndklæde, og de samme fi n geraftryk afsættes på plade 3.

5. Gentag vask (fi ngeraftryk på plade 4) og aftørring (fi ngeraftryk på plade 5).

6. Med samme hånds fi ngerspidser berører samme deltager ganske let overfl aden af en agarplade tilsået med Serratia marcescens, og afsætter derefter fi ngeraftryk kene på overfl aden af plade 6.

7. Fingeraftryk, som under pkt. 3, afsættes på plade 7.

8. Fingeraftryk, som under pkt. 4, afsættes på plade 8.

9. Fingeraftryk, som under pkt. 5, afsættes på plade 9 og 10.

10. Indgnid hænderne med et desinfektionsmiddel i 1/2 minut. Først, når det er

tørret ind, afsættes fi ngeraftryk på plade 11.

11. Pladerne sættes med bunden opad til inkubering ved 37°C. Afl æsning næste dag.

3030

DAG 1 2. Operationsmasker og kitler

Formål:

At give indtryk af bakterieindholdet på kitler og i operationsmasker.

Deltagerantal:Man arbejder sammen i hold på 2 deltagere.

Materialer:

a) to operationsmaskerb) fi re små blodagarpladerc) fi re glasstave

Procedure:

1. Mærk operationsmaskerne A (kontrol) og B. Blodagarpladerne mærkes A, By (= ydersiden), Bi (= indersiden) og C.

2. Den ene deltager tager operationsmaske B på i ca. 20 minutter. Efter 20 min.'s forløb strammes hver af de to masker ud over en blodagarplade, og der foretages aftryk på de respektivt mærkede plader, idet man med en glasstav gnider hen over masken fl ere gange til den er fugtig. (Ny glasstav til hver blodagarplade). Maske A gnides kun, så ydersiden berører blodpladen..Maske B gnides først med ydersi den på plade By, og derefter med indersiden på plade Bi.

3. Blodagarplade C anvendes til på samme måde at pode fra deltagerens egen kittel.

4. Pladerne inkuberes ved 37°C og afl æses næste dag.

3. Kontaktinfektion

Formål:

At demonstrere kontaktinfektion.

Deltagerantal:

2 hold med 2 deltagere arbejder sammen, deltagerne nummereres 1, 2, 3 og 4.

Materialer:

a) Sterile podepindeb) 4 agarplader (én pr deltager)c) Sterilt saltvandd) 1 stk. chokolade overfl adekontamineret med Serratia marcescens, der udleveres af læreren

Procedure:

1. Hver deltager mærker sin agarplade med pladsnummer og opdeler den i to halvdele, der mærkes a og b.

2. For at undersøge, hvad der var tilstede på hænderne forud for forsøget, poder deltager 2 med en vatpodepind vædet i sterilt saltvand fra højre håndfl ade og

fi ngre på deltager 1, podningen udsås på plade 1a. Deltager 1 poder på samme måde fra deltager 2 og udsår på plade 2a. Deltager 3 og 4 poder på tilsvarende måde fra hinandens hænder og tilsår pladerne mrk. 3a og 4a.

3. 1 stk. chokolade gives af læreren i hånden på deltager 1, som holder det 1/2-1

minut, hvorpå det returneres til læreren.

4. Deltager 1 trykker nu deltager 2 i hånden, deltager 2 trykker trykker derpå del tager 3 i hånden og endelig trykker deltager 3 deltager 4 i hånden.

3131

DAG 15. Der podes nu atter fra højre hånd, som angivet under pkt. 2, og segmenterne mrk. b tilsås.6. Pladerne inkuberes ved 37°C og afl æses 1 døgn senere.

7. Vask og hånddesinfektion som under punkt 10 (side 29)

4. Toiletpapir.

Formål:

At vise effektiviteten af forskellige former for toiletpapir.

Deltagerantal:


Materialer:

a) en agarplade tilsået med Escherichia coli

b) toiletpapir: A: 1 lag B: 2 lag C: 3 lag D: desinfektionsserviet

c) en MacConkey agarplade

Procedure:

1. Opdel en MacConkey agarplade i 6 lige store felter og mærk disse A, B, C, D og K

1 og K

2 (kontroller).

2. Vask hænderne grundigt og tør dem omhyggeligt.

3. Højre hånds pegefi nger berører let pladen tilsået med E.coli, og derefter afsættes samme fi ngers aftryk i felt K1 på MacConkey pladen.

4. Med venstre hånd holdes papiret mærket A over den tilsåede E.coli plade, og med en anden af højre hånds fi ngre presses papiret let mod den tilsåede agar overfl ade i 2-3 sekunder, hvorpå fi ngerens aftryk sættes i felt A på MacConkey pladen.

5. Der fortsættes med papir mærket B, C og D, idet der anvendes andre af højre hånds fi ngre.

6. Vask igen hænderne grundigt (undgå at røre vandhanerne med højre hånd), og tør derefter omhyggeligt hænderne.

7. Afsæt et fi ngeraftryk i felt K2 (med samme fi nger som blev anvendt i K

1, men

efter vask).

8. Pladen inkuberes. Afl æsning næste dag.

9. Hånddesinfektion som under punkt 10 (side 29)

3232

Spørgsmål til selvtestning:

1. Hvilken cellestruktur er afgørende for, om en celle er Gram-positiv eller Gram- negativ?

2. Hvorledes kan man eksperimentelt påvise dette?

3. Hvad er lysmikroskopets opløsningsevne?

4. Hvilke bakteriestrukturer er synlige i lysmikroskopet uden brug af specielle teknikker.

5. Hvad er betingelsen for, at en bakterie uden cellevæg ikke lyserer?

6. Hvilke cellestrukturer har varierende antigene egenskaber, som kan udnyttes til arts- eller typeinddeling?

7. På hvilke punkter adskiller cellevæggen i en Gram-positiv bakterie sig fra en Gram-negativ bakteries cellevæg?

DAG 1

Hvordan vaskes hænderne? 1) Vask hænderne i lunkent vand i mindst 15 sekunder:2) Kom sæben på de våde hænder3) Sæben fordeles og indgnides: - på hver fi nger

- mellem fi ngrene

- på håndryggen

- på håndfl aden

- omkring håndleddene

4) Skyl sæben grundigt af5) Anvend engangshåndklæde6) Luk vandhanen med albue/håndled eller med engangshåndklæde ved håndbetjente vandhaner7) Håndcreme anvendes på rene og tørre hånder

OBS! Hænderne gøres våde inden sæben påføres. Vaskeaktive stoffer kan give hudirrita-tion/eksem hvis den koncentrerede sæbe kommer direkte på tør hud. Brug fl ydende sæbe i engangsbeholder eller sæbe ophængt i magnet.

Hvordan desinficeres hænderne?

1) Der benyttes håndsprit (70-86 pct. alkohol) med hudplejemiddel2) Brug mindst 2 ml3) Spritten påføres og indgnides på samme måde som sæben4) Spritten indgnides til tørhed

OBS! Før pleje og behandling af patienter der er særligt modtagelige over for infektioner, udføres først håndvask og dernæst hånddesinfektion. Hvis hænderne forurenes med blod, sekreter, ekskreter ol., foretages håndvask inden hånddesinfektion.

3333

Overførsel af infektion (fortsat fra dag 1)

Læseliste side: 27-37, 43-44, 68-79, 109-126, 230-237.

Agarpladerne fra forsøgene dag 1 afl æses og resultaterne diskuteres in plenum.

Mikroskopisk karakterisering af bakterier, BFormål:

At udføre hurtig bakteriediagnostik ved hjælp af mikroskopi af et fugtigt og et farvet, tørt præparat.

Deltagerantal:

Øvelsen udføres af hver enkelt deltager.

Materiale:

a) 4 affedtede objektglas og 2 dækglas

b) en kultur (A) af Staphylococcus aureus

c) en kultur (B) af Proteus mirabilis

d) et glas sterilt saltvand

Procedure:

Fugtigt præparat: (se appendix side 78)1. På et objektglas afsættes med en øje-podenål et par dråber saltvand.

2. Med øje-podenål udtages fra kultur A lidt materiale, der opslemmes i dråben til svag, uklar suspension.

3. Dækglas lægges over og på dækglasset lægges en dråbe immersionsolie.

4. Pkt. 1-3 gentages for kultur B.

5. Husk at blænde ned på kondensorens irisblænde før mikroskopering. Iagttag bevægelighed, skeln mellem Brown'ske bevægelser, strømninger i præparatet og sand bevægelighed. Angiv, hvilken af de 2 bakterier, der er bevægelig.

Tørt præparat: Gram-farvning (se appendix side 78-79)1. På to affedtede objektglas afsættes med øje-podenål et par dråber saltvand.

2. Med øje-podenål udtages lidt materiale henholdsvis fra kultur A og B. Materia let opslemmes først i dråben, hvorpå det (opslemningen) spredes over et større sammenhængende område på glasset (ca. 10 x 10 mm).

3. Opslemningen skal herefter lufttørre (tørring må ikke ske over åben ild).

4. Præparatet fl ammefi kseres ved at føre det roligt 3 gange gennem gasfl ammen med præparatsiden opad (vendt væk fra fl ammen). Herefter afkøles præparatet.

5. Præparatet farves a.m. Gram (se appendix side 79).

6. Herefter mikroskoperes præparatet uden dækglas med immersionsolie direkte på præparatet. Bakteriernes form, farve og lejring iagttages. Husk at blænde op for kondensorens irisblænde. Resultatet diskuteres, og Gram-farvningens an vendelse i det diagnostiske arbejde gennemgås.

DAG 2

3434

DAG 2Tørt præparat: Methylenblåt-farvning (valgfri øvelse)1. Objektglasset inddeles med fedtstift i 2 felter.

2. På hvert felt afsættes med øje-podenål en dråbe saltvand.

3. Med en øje-podenål udtages lidt materiale fra kultur A og B. Materialet opslemmes først i dråben, hvorpå der spredes over et større sammenhængende felt (ca 10 x 10 mm).

4. Præparatet lufttørres.

5. Præparatet fl ammefi kseres ved at blive ført roligt 3 gange gennem gasfl ammen med præparatsiden opad (vendt væk fra fl ammen). Herefter afkøles præparatet.

6. Præparatet farves med methylenblåt (se appendix side 79).

Bakteriers metabolisme, vækst og dyrkningFormål:

At gøre kursusdeltagerne fortrolige med de substrater og dyrkningsmetoder, der anvendes i det bakteriologiske laboratorium.

Gennemgang:

Formålet med dyrkningen; bakteriernes vækstkrav og -betingelser; substratsam men sætning; bakterievækstens afhængighed af temperatur, pH og ilt; anaerob dyrkning af bakterier; indi-kative og selektive substrater; rendyrkning; demonstration af forskellige substrater.

Rendyrkning af bakterierFormål:

At bedømme effektiviteten af forskellige rendyrkningsmetoder.

Teori:

I en renkultur af bakterier er alle bakterier efterkommere af en enkelt bakteriecelle. En renkultur (dvs. rendyrkning) er ofte nødvendig, når man vil undersøge én bakteriestam-mes egenskaber. Primære isolater er ofte en blanding af forskellige bakterier (blandings-kulturer), og fra sådanne kan man fremstille renkulturer på forskellige måder, f.eks. ved (1) trinvis spredning på fast substrat (se appendix side 78), hvorved der opnås en stor sandsyn-lighed for, at den enkelte koloni kun indeholder efterkommere af én bakterie; ved (2) udså-ning på selektive substrater, f.eks. plader med højt NaCl-indhold (koncentration 8-10%) til rendyrkning af stafylokokker, eller plader med kry stal violet, til rendyrkning af Gram-nega-tive bakterier, idet Gram-positive bakterier hæmmes i væksten; for at opnå større sikkerhed for rendyrkningen kan man gentage spredningen fra én koloni til plader, der udvælges efter andre principper; ved (3) kogning af blandingskulturer, hvilket anvendes til rendyrkning af sporedannende bakterier. Her udnyttes bakteriesporers store termoresistens.

Deltagerantal:


3535

Materiale:

a) Blandingskultur bestående af Staphylococcus epidermidis

Escherichia coli

Bacillus subtilis

b) 3 små agarplader

c) 1 NaCl-plade

d) 1 laktose-plade

e) vandbad 100°C

Procedure:

1. På den ene agarplade udsås kulturmaterialet tæt, idet man med øje-podenål poder en streg diagonalt over midten af pladen, og derpå spreder vinkelret ud

fl ere gange (se nedenfor eller appendix side 78).

2. Det samme gøres på laktose-pladen og NaCl-pladen.

3. På den anden agar-plade spredes trinvis (se appendix side 78).

4. Blandingskulturen anbringes på vandbad ved 100°C i 5 min., hvorpå materiale fra kulturen udsås tæt på den tredje agarplade.

5. Pladerne stilles til inkubering ved 37°C og afl æses næste dag.

6. Afl æsning: Anfør v.h.a. de viste symboler for kolonimorfologien, hvorledes pladerne ser ud efter 1 døgns inkubering ved 37°C.

° Staphylococcus epidermidis (de mindste helt hvide kolonier)

Escherichia coli (de gråhvide, mellemstore kolonier)

* Bacillus subtilis (store, fl ade, ru kolonier)

DAG 2

3636

Udsåning til identifi kation af Gram-positive kokkerFormål:

At fremstille materiale til illustration af identifi kation og principiel inddeling af Gram-posi-tive kokker (se dag 3).

Deltagerantal:


Materiale:

a) Kulturer af A: Staphylococcus aureus b) 1 stor blodplade B: Staphylococcus epidermidis c) 1 lille blodplade C: Staphylococcus saprophyticus d) 1 telluritplade D: Streptococcus pyogenes e) 1 MacConkey-plade E: Streptococcus pneumoniae F: Enterococcus faecalis

Procedure:

Den ene deltager:

1. Den store blodplade inddeles i 6 lige store segmenter med speedmarker på bun den. Segmenterne mærkes A-F. De små plader inddeles i 3 segmenter.

2. De 6 kulturer (A-F) udsås på den store blodagarplade i de tilsvarende mærkede segmenter. Udsåningen foretages som en modifi ceret trinvis spredning (se tegningen), idet første udsåning (depot) placeres ud mod skålens periferi. Derpå

fl amberes øje-podenålen, og efter afkøling af øje-podenålen spredes på resten af segmentet i en lang streng, idet der først krydses over de 2-3 sidste streger af 1. depot. I 1. depot på segment D, E og F anbringes med pincet en papir-disk inde holdende Optokin®. I de tilsåede segmenter A, B og C anbringes på samme måde en papir-disk indeholdende Novobiocin®.

Den anden deltager:

3. Der udsås materiale fra kulturerne D, E og F på den lille blodplades tre tilsvarende mærkede segmenter ved at stikke lodret ned i agaren med lige-pode- nålen, som antydet i fi guren nedenfor.

4. Der udsås materiale fra kulturerne D, E og F på telluritplade og MacConkey- plade med tæt udsåning (jfr. fi guren).

6. Inkubering ved 37°C; afl æsning næste dag.

DAG 2

2

3737


1. Hvorfor må man rendyrke?

2. Hvilke fejlkilder er der ved rendyrkning på fast substrat?

3. Hvordan kontrollerer man, at en renkultur virkelig er en renkultur?

4. Hvorfor er det vigtigt at opbevare prototyper af bakterier?

5. Hvad er fordelen ved at kunne lave en direkte mikroskopi af et patientprøve- materiale?

6. Anfør et eksempel på et indikativt substrat.

7. Anfør et eksempel på et selektivt substrat.

DAG 2

3838

Rendyrkning af bakterier (fortsat)

Læseliste: Side 76-81, 109-111, 127-131, 135-152.

Resultaterne af rendyrkningsforsøget (dag 2, side 34) afl æses og diskuteres.

Gram-positive sporedannende staveBacillus og Clostridium

Formål:

At gøre deltagerne fortrolige med bakterier hørende til slægterne Bacillus og Clo stri dium,samt give baggrunden for de særlige forholdsregler man bør tage, ved prøve tagning og for-sendelse samt dyrkning af disse bakterier.

Gennemgang:

Bakteriernes morfologi, forekomst og patogene egenskaber.

Deltagerantal:

Man arbejder enkeltvis.

Materiale:

Gram-farvede præparater i æsken

Præparat nr. Bakterie-art 9. Bacillus subtilis

7. Clostridium tetani

11. Clostridium perfringens

Procedure:

Præparaterne mikroskoperes; notér form, lejring og farve.

Gram-positive ikke-sporedannende staveCorynebacterium og Listeria

Formål:

At gøre deltagerne fortrolige med bakterier hørende til slægterne Corynebacterium og Liste-

ria.

Gennemgang:

Bakteriernes morfologi, forekomst, patogene egenskaber

Deltagerantal:


DAG 3

3939

Materiale:

Gram-farvede præparater i æsken

Præparat nr. Bakterie-art12a Corynebacterium difteriae

12b Corynebacterium pseudodiftericum

13 Listeria monocytogenes

Procedure:

Præparaterne mikroskoperes; notér form, lejring og farve.

Mycobacterium

Formål:

At illustrere, hvorledes man påviser Mycobacterium tuberculosis.

Gennemgang:

Bakteriens morfologi og syrestabilitet. Forekomst og patogene egenskaber. De diagnostiske problemer specielt i relation til bakteriernes væksthastighed.

Deltagerantal:


Materiale:

Ziehl-Neelsen/malakitgrønt farvet og Ziehl-Neelsen/pikrinsyre farvet præparat i æsken.

Præparat nr. Bakterie-art 14 Mycobacterium tuberculosis

Procedure:

Præparatet mikroskoperes; notér form, lejring og farve.

Gram-positive kokkerFormål:

At give deltagerne et overblik over de vigtigste bakterier hørende til slægterne Strep to-coccus, Enterococcus og Staphylococcus. Gøre deltagerne fortrolige med disse bakteriers mikroskopiske udseende og forekomst samt illustrere principper efter hvilke man inddeler de Gram-positive kokker.

Deltagerantal:


DAG 3

4040

Materiale:

a) Gram-farvede præparater i æsken:

Præparat nr. Bakteria-art 1 A. Staphylococcus aureus

15 B. Staphylococcus epidermidis

15 C. Staphylococcus saprophyticus

3 D. Streptococcus pyogenes

4 E. Streptococcus pneumoniae

16 F. Enterococcus faecalis

b) Pladekulturer af de 6 nævnte bakterier.

c) Brintoverilte-opløsning til katalase-reaktion (se appendix side 81).

d) Plasma til koagulase-reaktion (se appendix side 82).

e) Reagenser til identifi kation af Streptococcus (gr. A, B, C og G) med co-agglutination (appendix side 88).

Procedure:

1. Man starter med at mikroskopere de 5 præparater, idet man noterer sig bakteriernes form, farve og lejring (for kokker kun når materialet er taget fra en fl ydende kultur - f.eks. serumbouillon). Desuden noterer man sig de udsåede bakteriearters kolonimorfologi. Forskelle og ligheder noteres.

2. Med baggrund i identifi kations-nøglen for Gram-positive kokker (se næste side) foretages herefter følgende undersøgelser til identifi kation af de enkelte arter.

3. Alle 6 bakteriearter undersøges for katalaseaktivitet.

4. De 3 stafylokokker undersøges for koagulaseaktivitet og Novobiocin®-følsomhed.

5. På MacConkey-pladen undersøges for vækst af kultur D, E og F (se appendix side 83).

6. Det undersøges om bakterier, der vokser på MacConkey-pladen, kan vokse på telluritpladen (se appendix side 83).

7. På den lille blodplade afl æses de hæmolytiske pladeforandringer for bakterierne D, E og F (se appendix side 83).

8. På den store blodplade afl æses Optochin®-følsomheden for bakterier med -hæmolyse.

9. Endelig identifi ceres -hæmolytiske kolonier ved hjælp af co-agglutination.

DAG 3

4141

Gram-positiv kok

Katalase

+ -

stafylokokker streptokokker/enterokokker

Koagulase Vækst på MacConkey agar

+ - - +

Staph.aureus Streptococcus Enterococcus

(fagtypning)

Novobiocin® Tellurit

resistent følsom + -

Staph.saprophyticus Staph.epidermidis Enterococcus faecalis andre (Lancefi eld gr. D) ”enterokokker”

Pladeforandring

Optochin® co-agglutination

følsom resistent A B C G

Strep. Orale Strep.

pneumoniae streptokokker pyogenes

DAG 3Identifi kations-nøgle for Gram-positive kokker

4242

DAG 3


1. I hvilke befolkningsgrupper forekommer miltbrand hyppigst og hvorfor?

2. Er clostridier invasive bakterier?

3. Angiv nogle årsager til clostridiers patogenicitet?

4. Hvilke stave er Gram-positive?

5. Hvorfor kan mykobakterier ikke Gram-farves?

6. Hvad er princippet i Ziehl-Neelsen's farvning?

7. Hvordan ser Listeria monocytogenes ud i et Gram-farvet præparat?

8. Hvad er princippet i co-agglutinationen til identifi kation af streptokokker?.

9. Hvilken pladeforandring udviser kolonier af Streptococcus pneumoniae på blod agar?

4343

Gram-positive kokker (fortsat fra dag 3)

Fagtypen afl æses for den udsåede Staphylococcus aureus, og anvendelse af resultatet i klini-

ske relationer drøftes.

Gennemgang:

Der gives en oversigt over arter hørende til slægterne Staphylococcus og Streptococcus og

grundlaget for deres inddeling demonstreres. Arternes forekomst, mikroskopisk og makro-

skopisk morfologi gennemgås i relation til den udførte øvelse, og der gives en oversigt over

bakteriernes patogenetiske egenskaber.

Penicillinase-påvisningFormål:

At demonstrere forekomst af hydrolytiske enzymer hos Gram-positive kokker, en af meka-

nismerne bag bakteriel resistens overfor antibiotika.

Teori:

Bakteriers resistens imod penicillin kan skyldes, at bakterierne producerer enzymer (angivet

ved pile i tegningen), som spalter penicillin til biologisk inaktive produkter.

Penicillinresistens hos stafylokokker skyldes oftest dannelsen af β-lactamase.

Deltagerantal:


Materiale:

a) et glas (A) med en frisk fremstillet blanding af I2-KI og G-penicillin

b) et glas (B) med I2-KI og ampicillin

c) et glas (C) med I2-KI og dicloxacillin

d) 3 små agarplader indeholdende stivelse og tilsået med 2 forskellige

Staphylococcus aureus stammer.

Procedure:

1. Pladerne mærkes A, B og C og overhældes med de 3 tilsvarende opløsninger.

Pladerne vugges omhyggeligt, således at opløsningerne fordeles over hele pla

dens areal. Henstand ved stuetemperatur i 2-5 minutter.

2. Afl æsning efter 2-5 minutter. Pladerne farves blå, idet jodet reagerer med stivel

sen. Omkring de kolonier, der danner β-lactamase, vil penicillin-nedbrydnings

produktet binde jodet, dvs. at den blå farve forsvinder, de βlactamase-produce

rende kolonier omgives altså af en lys ring.

3. Den kliniske betydning af det påviste fænomen diskuteres in plenum.

DAG 4

4444

BakteriegenetikFormål:

At rekapitulere genetiske mekanismer af særlig betydning i den medicinske mikro biologi.

Gennemgang:

Det teoretiske grundlag for udvikling af kemoresistens hos bakterier (mutation, transforma-tion, transduction, conjugation og plasmider), idet der lægges særlig vægt på selektionstryk-kets betydning (brug af antibiotika).

Infektiøs kemoresistens

Formål:

At demonstrere overførelse af kemoresistens fra en Gram-negativ bakterie (donor) til en an-den Gram-negativ bakterie (recipient).

Deltagerantal:

øvelsen udføres af hold på 2 deltagere.

Materiale:

a) Donor: 1 ml af en 18-timers bouillonkultur af en laktoseforgærende Escherichia

coli stamme, der er resistent for tetracyclin, men følsom for nalidixan

b) Recipient: 9 ml af en 18-timers bouillonkultur af en laktose-negativ Gram-nega tiv stav, der er følsom for tetracyclin, men resistent for nalidixan

c) 2 laktoseplader

d) 5 laktose-plader, hvorpå der i centrum har været anbragt en papirlap (20 mm i diameter), som er blevet pådryppet tetracyclin. Papirlappen er fjernet inden forsøgets start

e) Sterile vatpodepinde.

Procedure:

1. De 2 ubehandlede laktoseplader mærkes D og R og tilsås ved hjælp af vatpode pind (tæt udsåning) med henholdsvis donor- og recipientbakterie.

2. I centrum af pladerne anbringes derpå med pincet en nalidixan tablet.

3. 2 laktoseplader med tetracyclin mærkes D og R og tilsås som nævnt under pkt. 1, dog pålægges der ikke en nalidixan tablet.

4. Recipientkulturen hældes derpå over i donorkulturen, og glasset rystes godt (pas på ikke at få bakterier rystet op på papirproppen)

5. Fra blandingen udsås tæt på en laktoseplade med tetracyclin. Pladen mærkes ”0”, og der, hvor papirlappen med tetracyclin har ligget, anbringes nu en nalidixan-tablet i centrum.

6. Glasset med blandingen af donor- og recipientbakterier stilles i vandbad ved 37°C.

7. 30 minutter senere podes fra blandingen, som under pkt. 5. Pladen mærkes ”30”. Blandingen stilles igen i vandbadet.

8. Efter yderligere 30 minutter podes igen fra blandingen som under pkt. 5. Pladen mærkes ”60”.

9. Alle plader mærkes med pladsnummer og inkuberes ved 37°C natten over.

DAG 4

4545

Gram-negative kokkerFormål:

At gøre deltagerne fortrolige med bakterier tilhørende slægten Neisseria.

Deltagerantal:

Der arbejdes enkeltvis.

Gennemgang:

Bakteriernes mikroskopiske udseende, forekomst, smittekilder og smitteveje samt særlige forhold vedrørende diagnostik og forsendelse af prøvemateriale til diagnostik.

Demonstration:

Stuart's transportmedium. Diagnostik v.h.a. immunfl uorescens.

Øvelse:

Mikroskopi af Gram-farvede og methylenblåt-farvede præparater af ure thral sekret og spinal-væske med henblik på diagnostik af gonorré og meningokok meningitis. Præparat nr. 17, 18, 19 og 20 mikroskoperes.

Små gram-negative staveFormål:

At gøre deltagerne fortrolige med bakterier hørende til slægterne Haemophilus og Borde-

tella.

Deltagerantal:Der arbejdes enkeltvis.

Gennemgang:

Bakteriernes mikroskopiske morfologi, specielle vækstkrav samt forholdsregler ved forsen-delse af prøvemateriale til diagnostik.

Øvelse:

Mikroskopi af spinalvæske med Haemophilus infl uenzae. Præparat nr. 21.

Gram-negative stave1. Udsåning på plader til identifi kation af Gram-negative bakterierFormål:

At fremstille materiale til næste dag (se denne).

Deltagerantal:

DAG 4


4646

DAG 4Materiale:1) 5 laktoseplader

2) Følgende bakteriekulturer: a) Escherichia coli

b) Klebsiella pneumoniaeoniae

c) Pseudomonas aeruginosa

d) Salmonella serovar. paratyphi A

e) Proteus mirabilis

Procedure:

1. Fra kultur a), b), c) og d) udsås med trinvis spredning på laktosepladen (se appendix side 78).

2. Kultur e) udsås ved, at man stikker lige-podenålen med bakteriekultur ned i agaren et sted i kanten af laktosepladen.

3. Pladerne inkuberes ved 37°C og afl æses næste dag.

2. Udsåning til biokemisk identifi kation af ukendt Gram-negativ bakterie.

Formål:

At illustrere, hvorledes man når frem til en artsbestemmelse ved hjælp af biokemiske reak-tioner.

Deltagerantal:


Materiale:

a) 1 kultur med ukendt bakterie (mrk. med et nummer)

b) 1 laktoseplade

c) forgæringsrække indeholdende følgende glas:

1) halvfl ydende agar

2) glucose og Durham-rør

3) mannitol og Durham-rør

4) indolreaktion

5) Voges-Proskauer (VP) reaktion

6) ornithin decarboxylase

7) lysin decarboxylase

8) arginin decareboxylase

9) decarboxylase-kontro 10) ureaglas

11) gelatine

12) jernagar.

4747

Procedure:

Substraterne (beskrevne i appendix side 80-81) tilsås med den ukendte bakterie på følgende måde:

1. Laktosepladen udsås trinvis.

2. Forgæringsglassene tilsås:

3. Halvfl ydende agar, gelatine og jernagar: et lige stik ned gennem agaren med den lige-podenål.

4. Indol-, VP- & ureaglas: tilsås med et stort inokulum (øjenål fyldt).

5. De øvrige glas tilsås med et lille inokulum (lige-podenål).

6. Laktosepladen og første glas i forgæringsrækken mærkes med bakteriens nummer og deltagernes pladsnummer.

DAG 4


1. Er en negativ dyrkning for Bordetella pertussis ensbetydende med, at patienten ikke har kighoste? Begrund svaret.

2. Angiv en fælles virulensfaktor for Haemophilus infl uenzae og Streptococcus

pneumoniae.

3. Hvilke bakterielt betingede komplikationer kan opstå i forbindelse med peroral anvendelse af antibiotika?

4. Hvilke er de nødvendige og tilstrækkelige kriterier for diagnosen: gonorré?

5. Hvorfor er specielle transportmedier nødvendige ved forsendelse af prøver til undersøgelse for Neisseria gonorrhoea?

6. Hvilken reaktion adskiller stafylokokker og streptokokker.

7. Hvordan kan væksten af Haemophilus infl uenzae fremmes?

4848

Læseliste: Side 51-57, 76-81, 168-171, 174-196.

Infektiøs kemoresistens (fortsat fra side 44)10. Pladerne afl æses og resultaterne diskuteres under følgende punkter: 1. Kan resistensforholdene for donor og recipient bekræftes? 2. Forklar på basis af resultaterne, hvad der er sket i forsøget. 3. Hvad er den kliniske konsekvens af infektiøs kemoresistens? 4. Hvordan kan man forebygge resistensudvikling?

Gram-negative staveFormål:

At give deltagerne et kendskab til de vigtigste bakterier hørende til familierne Entero-

bacteriaceae og Pseudomonadaceae, herunder deres makroskopiske og mikroskopiske udseende og deres forekomst, samt at give deltagerne et kendskab til de principper efter hvilke, man differentierer de Gram-negative stave.

Udsåning på plader til identifikation af Gram-negative stave(fortsat).

Formål:

At demonstrere, hvordan vækst på blodagar og laktoseplader kan differentiere nogle Gram-negative bakterier.

Deltagerantal:Man arbejder sammen i hold på 2 deltagere.

Materiale:

a) Gram-farvede præparater af:Escherichia coli (præparat nr. 2) Klebsiella pneumoniae (præparat nr. 22) Vibrio cholerae (præparat nr. 23)

b) Pladekulturer fremstillede dagen før af:E. coli

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeruginosa

Salmonella serovar. paratyphi A

Proteus mirabilis

Procedure:

1. Præparat nr. 2, 22 og 23 mikroskoperes. Notér form størrelse, lejring og farve.

2. På laktosepladerne observeres om bakterierne forgærer laktose under syre dannelse (gule kolonier) eller ikke forgærer laktose (grå-blå kolonier).

3. Resultaterne diskuteres i relation til diagnostikken.

DAG 5

4949

Aflæsning og identifikation af ukendt bakterie (fortsat)

Formål:

At illustrere, hvorledes man når frem til en artsbestemmelse ved hjælp af bio kemiske reak-tioner.

Deltagerantal:


Materiale:

a) en tilsået laktoseplade

b) en forgæringsrække tilsået dagen før med en ukendt Gram-negativ stav.

Procedure:

5. Efter inkubering ved 37°C i 18-20 timer afl æses de tilsåede glas og laktosepladen (om reaktioner og substrater, henvises til appendix side 80-87). Bemærk, at der er tilsat reagenser til indol og VP-glas). Reaktionerne kan sammenholdes med utilsåede kontrol glas, hvis man er i tvivl.

6. Resultaterne indføres nederst i omstående forgæringsskema (side 51), og man forsøger ved hjælp af reaktionerne i skemaet at identifi cere den ukendte bakte rie. Såfremt tiden tillader det, kan der byttes forgæringsrække med et andet hold. Hvert hold bør gennemføre identifi kation af mindst to ukendte bakterier.

Gennemgang:

De vigtigste slægter og arter inden for familierne Enterobacteriaceae og Pseudomonadaceae

fremhæves. Deres forekomst og patogenicitet omtales. Grundlaget for deres biokemiske dif-ferentiering gennemgås, og specialmedier til isolation af patogene tarmbakterier omtales, herunder demonstreres nyere typer af forgæringsrækker tilsået med Gram-negative stave.

Serologisk identifikation af Gram-negative stave (fortsat)

Formål:

At illustrere, hvorledes man kan identifi cere bakterier (her Salmonella bakterier) ved hjælp af serologiske reaktioner (agglutinationer).

Deltagerantal:


Materiale:

a) Serum med antistof mod O-antigen: 4, 5, 12 (mrk. A)

b) Serum med antistof mod O-antigen: 6, 7 (mrk.B)

c) Laktoseplade tilsået dag 4 med Salmonella bakterier

d) 2 objektglas.

DAG 5

5050

Procedure:På de to objektglas afsættes på midten en dråbe af henholdsvis serum A og serum B. Med en lige plasticpodenål opslemmes lidt bakteriekultur i serumdråbe A; derpå med en ny po-denål det samme i serumdråbe B. Der blandes, og begge glas vugges forsigtigt (undgå at få suspension på fi ngrene) i 2 minutter, hvorefter man i skråt gennemfalden de lys mod en mørk baggrund kan afl æse, om der er sket en agglutination (suspensionen bliver kornet).

Diskussion:

Resultatet fortolkes, og man diskuterer serologisk identifi kation af Gram-negative stave. Det gennemgås, hvorledes man i praksis når frem til en helt nøjagtig diagnose af Salmonella bakterier v.h.a. sådanne serologiske reaktioner, samt formålet hermed. Kaufmann-White's skema omtales.

Bakterieklassifi kationFormål:

At give deltagerne et indblik i systematisk bakteriologi.

Gennemgang:

Hvorledes man laver et bakteriologisk klassifi kationssystem, herunder anvendelse af ”gam-le” klassifi kationsegenskaber og nyere teknikker med analyser af bakteriernes gener. Identi-fi kationssystemer, skema- og nøglemetoder. Nomenklatur og taxonomi.


1. Hvilke kriterier ligger til grund for arts- og typeinddeling inden for de store Gram- negative stave og hvorfor er det vanskeligt at foretage en sådan inddeling.

2. Hvilke slægter inden for de store Gram-negative stave betegnes som ”patogene tarmbakterier”, og hvorfor har ikke alle store Gram-negative stave denne beteg- nelse?

3. Hvad forstås ved O-, H-, K- og Vi-antigen. Forstår du disse forkortelser? Angiv nogle typiske anvendelser af disse antigener.

4. Hvordan ser kolerabakterier ud i et Gram-farvet præparat. Er disse bakterier bevægelige?

DAG 5

5151

Forgæringsskema for nogle udvalgte Gram-negative stave Lactose- O

2- bevæge- oxidase glucose mannitol indol VP decarboxylaser urease gelatine svovl-

plade krav lighed syre luft syre luft ornithin lysin arginin brinte

+ gul a,an,f +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-

- blå

Salmonella enterica,

subgr. enterica

serovar. typhi - f + - + - + - - - - + + - - +

paratyphi - f + - + + + + - - d+ + + - - +

typhimurium - f + - + + + + - - + + + - - +

enteritidis - f + - + + + + - - + + + - - +

Salmonella enterica,

subgr. arizonae

d f + - + + + + - - + + + - + +

Citrobacter freundii d f + - + + + + - - d- - + - - +

diversus + f + - + + + + + - + - + (+) - -

amalonaticus + f + - + + + + + - + - + (+) - -

Proteus vulgaris - f +(sv) - + + - - + - - - - + + +

mirabilis - f +(sv) - + + - - - d- + - - + + +

Morganella morganii - f d+ - + + - - + - + - - + - -(+)

Providencia rettgeri - f + - + d+ - - + - - - - - - -

Escherichia coli + f d+ - + + + + + - d d+ d- - - -

Shigella sonnei (+) f - - + - + - - - + (+) + - - -

Klebsiella pneumoniae + f - - + + + + - + - d+ - + - -

rhinoscleromatis - f - - + - + - - - - - - - - -

ozaenae d f - - + d + d - - - - - d - -

oxytoca + f - - + + + + + + - + - + + -

Enterobacter cloacae + f + - + + + + - + + - + d + -

aerogenes + f + - + + + + - + + + - d + -

Serratia marcescens - f + - + d + - - + + + - - + -

rubidaea + f + - + d + - - + - d+ - - + -

kiliensis + f + - + + + + - d - - - - + -

alba - f + - + + + + - + + + - - + -

Hafnia alvei - f +22° - + +22° + +22° - d+22° + + d- - - -

fl ava - f +22° - + - + - - +35° - - - - + -

Yersinia pestis - f - - + - + - - - - - - - - -

pseudotuberculosis - f +22° - + - + - - - - - - + - -

enterocolitica +sent f +22° - + - + - d - + - - + - -

Pseudomonas aeruginosa - a + + + - d- - - - - - + - + -

d+ = 75-89% positive

d = 26-74% positive

d- = 11-25% positive

- = mindre end 10% positive

(d = different, deriverende)

sv = sværmning

+ = over 90% positive

(+) = svag +

+22° = positiv reaktion ved 22°C

til brug

for egne

undersøgelser

5252

Undersøgelse af prøver med ukendt indhold - 1Læseliste: Side 223-231, 254-263.

Udsåning, samt afgivelse af mikroskopisvar

Formål:

At kunne udfylde en rekvisition m.h.p. bakteriologisk undersøgelse af en patientprøve, at gøre den medicinske student fortrolig med arbejdsgangen i et klinisk bakteriologisk labora-torium, at demonstrere og forelægge arbejds gangen ved behandling af udvalgte, klinisk vig-tige prøvekategorier v.h.a. egne undersøgelser. At vurdere forskellige bakteriologiske meto-der, der kan komme i anvendelse i forskellige laboratorier, særlig med henblik på fejlkilder; ref. side 89-98.

Deltagere:

Deltagerne inddeles så vidt muligt i hold à 4 studenter.

Gruppearbejde:

Hver deltager i gruppen får udleveret 2 prøver indsendt til et klinisk bakterio logisk laboratorium. Den ene prøve er en hovedopgave. Alle holdets 4 deltagere har hoved opgave inden for samme prøvekategori, f.eks. urin. Hovedopgaven skal løses dels ved udfyldelse af rekvisitionssedlen, dels ved at holdet sammen udarbejder en rapport med besvarelse af de på næste side angivne spørgsmål, med oplysning om de i prøverne fundne bakterier og deres kemo resistens forhold, og med forslag til behandling. Holdets rapport skal sammenskrives på et A4-ark og afl everes senest dag 9 ved kursusdagens begyndelse. Laboranten vil derpå sørge for, at alle besvarelserne bliver mangfoldiggjort, således at hver deltager kan få et eksemplar af besvarelserne på alle 5 prøve kategorier med hjem dag 9.

Besvarelserne fremlægges dag 10 af holdets deltagere individuelt eller af en ordfører for deltagerne og diskuteres in plenum.

Biopgaven løses principielt som hovedopgaven. Biopgaven ligger ikke inden for samme prøvekategori for hele holdet og skal ikke besvares holdvis. Rekvi sitionen udfyldes og labo-ratorieundersøgelser laves m.h.p. diagnostik. Rekvisitionen på den pågældende prøve påfø-res de relevante oplysninger. Spørgsmålene på næste side skal ikke besvares for biopgavens vedkommende. Derimod er der en deltager på et andet hold, som har den tilsvarende prøve som hovedopgave. Hoved- og biopgaver er fordelt således:

Hovedopgave: Biopgave:

Urin 1 Spinalvæske 4Urin 2 Spinalvæske 2Urin 3 Pus 1Urin 4 Pus 4

Blod 1 Pus 1Blod 2 Pus 3Blod 3 Pus 2Blod 4 Spinalvæske 2

DAG 6

5353

Hovedopgave: Biopgave:

Spinalvæske 1 Ekspektorat 1Spinalvæske 2 Pus 3Spinalvæske 3 Urin 2Spinalvæske 4 Urin 1

Pus 1 Urin 1Pus 2 Urin 2Pus 3 Ekspektorat 4Pus 4 Urin 4

Ekspektorat 1 Pus 2Ekspektorat 2 Urin 1Ekspektorat 3 Blod 1Ekspektorat 4 Blod 3

Skitse til rapport angående hovedopgaven (1 A-4 side):

Prøvekategori: ..........

Prøvetagning:

Diskuter, hvorledes prøven bør tages. Overvej fordele og ulemper, hvis fl ere metoder fi ndes. Angiv mulige fordele.

Transport:

Diskuter, hvorledes prøven bør transporteres. Overvej fordele og ulemper, hvis fl ere mulig-heder fi ndes. Angiv eventuelle fordele.

Direkte mikroskopi og resistensbestemmelse:

1. Har direkte mikroskopering og direkte udsåning til resistensbestemmelse kunnet give væsentlige oplysninger i relation til patientens behandling?

2. Hvilken betydning må de i prøverne fundne bakterier tillægges i relation til prøve- tagning og patientens tilstand?

Prøve fundne bakterier Bakteriernes følsomhed angivet som Terapi-forslagnr. 0, 1, 2 eller 3 for alle de i undersøgelsen inkluderede antibiotika

1

2

3

4

DAG 6

5454

Sygehistorier og udsåningsteknik for de for-skellige patientprøver.Undersøgelse af urin

Baggrund:

Urinvejsinfektioner er en af de hyppigste infektionssygdomme i såvel almen praksis som på sygehusafdelinger. Ca. halvdelen af de prøver, der daglig under søges i det klinisk-bakterio-logiske laboratorium er urinprøver. Urinprøver kan p.g.a. den normale forekomst af bakterier i og omkring urethra let forurenes under opsamlingen. Disse forureningsbakterier kan selv ved stuetemperatur formere sig i urin, da denne er et fortræffeligt substrat. For at kunne skelne mellem denne mulige forurening og reel infektion må der udføres en kvantitativ bakteriedyrkning. Kvantitering kan ske enten ved hjælp af en række kemiske metoder (ikke pålidelige) eller ved fortynding af urinprøven (for besværlig og dyr) eller ved kvantitering af bakterieindholdet i urin ved hjælp af kalibrerede øskner. Kvantiteringen kan også ske ved brug af en række stan dard medier og sammenligning med standarder.

Sygehistorier:

Urinprøve nr. 1:

En 22-årig gravid kvinde, der har klaget over svien og skæren ved vandladningen. Tidligere 3 lign. tilfælde. Hendes alment praktiserende læge har nu indledt behandling med sulfa. Med ønske om diagnose og forslag til evt. ændring af behandling har han indsendt vedlagte midt-stråleurin udsået på Uricult®, der har været inkuberet ved 35°C i 1 døgn før afsendelse.Urinprøve nr. 2:

En 6-årig pige, der ved undersøgelsen hos skolelægen for 2. gang har fået påvist bak teriuri. Inden videre urologisk undersøgelse iværksættes, ønskes en diagnose af den isolerede bak-terieart og dennes følsomhed. Vedlagte Uricult® er efter inkubation fremsendt.Urinprøve nr. 3:

En 45-årig mand med nyrestensanfald. Før patienten skal gennemgå cystoskopi ønsker afde-lingen at undersøge, om der foreligger en urinvejsinfektion.Urinprøve nr. 4:

En 70-årig mand med vandladningsbesvær p.g.a. prostatahypertrofi er indlagt med urinreten-tion. Ved kateterisation udtømmes 1000 ml urin. En prøve er sendt til bakteriologisk under-søgelse.

Procedure:

1. De udleverede rekvisitioner udfyldes. De fundne resultater noteres på arbejdskortet, også de følgende dage. Overvej om der er grund til at udsende et forelø bigt svar?

For nr. 1 og 2 gælder:

2. Vurder antallet af bakterier på Uriculten.

3. Udtag materiale fra Uriculten og opslem dette i et lille glas med saltvand.

4. Herfra udtages med den store plastik-øjenål (den blå) 1 dråbe (inokulum), der af sættes midt på en resistensplade. Inokulum spredes med en glasstav jævnt over hele pladen, hvorefter der pålægges papirlapper med antibiotika, som an givet på side 62. Desuden foretager man en udsåning af opslemningen på 1 blodplade og 1 laktoseplade. Denne udsåning skal ske ved trinvis spredning (se appendix side 78).

DAG 6

5555

For nr. 3 og 4 gælder:

2. Lav et fugtigt præparat og bedøm det i mikroskopet.

3. Fra prøven udtages med den store plastik-øjenål (den blå) 1 dråbe (inokulum), der afsættes midt på en resistensplade. Inokulum spredes med en glasstav jævnt over hele pladen, hvorefter der pålægges papirlapper med antibiotika, som angivet på side 62.

4. Urinprøverne udsås derpå på en blodplade og en laktoseplade på fl g. måde: Pladerne inddeles i 2 halvdele. På den ene halvdel udsås urinprøve med en stor plastik-øjenål (den blå, der rummer 0,01 ml); på den anden halvdel udsås med en lille plastick-øjenål (den hvide, der rummer 0,001 ml). Udsåning foregår så jævnt glat som muligt over den markerede halvdel af pladen.

5. Pladerne mærkes og inkuberes ved 37°C natten over. Se øvelse dag 7.

Undersøgelse af blod

Baggrund:

Blod er ursterilt, men selv ved mindre traumer - f.eks. tandbørstning - kan der komme bakterier i blodet (bakteriæmi). Denne tilstand er hos sunde normalpersoner transitær. Hos svækkede eller syge - f.eks. patienter i immunsup pres siv behandling - kan bak te riæmien progrediere til sepsis (bakterierne trænger fra blodbanen ud i vævene) eller udløse et bakte-riæmisk shock. Bloddyrkninger er altid akutte og kræver hurtig undersøgelse, specielt m.h.p. følsomhedsbestemmelse.

Sygehistorier:

Blodprøve nr. 1:

En 35-årig mand, der er blevet urethral-kateteriseret på skadestuen, udvikler pludselig bak-teriæmisk shock. Før bredspektret kombinationsbehandling ind ledes, tages en blodprøve, der overføres til en bloddyrkningskolbe. Kolben har inden ankomsten til laboratoriet været inkuberet i 12 timer ved 37°C.

Blodprøve nr. 2:

En 45-årig kvinde med tidligere febris rheumatica udvikler efter tandekstrak tion pludselig høj feber. På mistanke om bakteriæmi/sepsis tages en blodprøve, der overføres til en blod-dyrkningskolbe. Kolben har inden ankomsten til laboratoriet været inkuberet i 12 timer ved 37°C.

Blodprøve nr. 3:

En 4 dage gammel præmatur dreng udvikler pludselig tegn på sepsis. Der tages blod fra en cranievene. Dette er overført til en dyrkningskolbe, der fremsendes m.h.p. under søgelse. Kolben har inden ankomsten til laboratoriet været inku be ret på afdelingen i 12 timer ved 37°C.

Blodprøve nr. 4:

En 18-årig dreng, der tidligere har været rask, er netop vendt hjem fra et ferieophold i Kenya. Symptomer: feber og diarré. Idet patientens symptomer begyndte for 4 dage siden, er blodprøve på mistanke om tyfus/paratyfus taget og overført til vedlagte bloddyrkningskolbe. Den har inden ankomsten til laboratoriet været inkuberet på afdelingen i 12 timer ved 37°C.

DAG 6

5656

Procedure:

1. De udleverede rekvisitioner udfyldes. De fundne resultater noteres på arbejdskortet i de følgende dage. Vurder, om der er grund til at udsende et foreløbigt svar.

2. Med sprøjte + kanyle eller ventilationskanyle udtages ca. ½ ml materiale fra dyrknings- kolben til et sterilt plastrør, hvorfra materiale til farvning og dyrkning tages. Kanyle og

sprøjte anbringes straks i kanylebøtten, (undlad at sætte hætten på kanylen).

3. Gramfarvet præparat fremsstilles.

4. Materialet fra plastrøret udsås med trinvis spredning (se appendix side 78) på 1 blodplade og 1 laktoseplade.

5. Af materialet fra plastrøret overføres 1 dråbe (inokulum) til en resistensplade. Inokulum spredes med glasstav jævnt over hele pladen, hvorefter man pålægger papirlapper med antibiotika som angivet på side 62.

6. Alle pladerne inkuberes ved 37°C natten over.

7. Afl æsning næste dag: se dag 7.

Diagnostik og resistensbestemmelse af gærVed fund af gærsvampe (Gram-positive meget store, ovale celler, evt. med begyndende pseudomyceliedannelse), udsås på 1) blodagar, der inkuberes 1 døgn ved 37°C og 2) på CHROMagar, som inkuberes 2 døgn ved 37°C, Candida albicans giver grønne kolonier, og 3) der udføres fi lamentationstest ved næste dag fra en fremvokset gærkoloni at inkubere et inokulum i humant plasma ved 37°C i 2 timer og derefter mikroskopere fugtigt præparat. Candida albicans giver spiring af fi lamenter. 4) en resistensplade tilsås med gærcellerne og der pålægges 2 resistens tabletter med henholdsvis Amfotericin B og Fluconazol og inkube-res ved 37°C i 1 døgn.Følsomhedsområder for svampe-antibiotika i relation til målt mm hæmningszone (s. 64).

Præparat 3 2 1-0

Diameter mm mm mm

Amfotericin B 15 14-10 ingen zone

Fluconazol 22 21-15 <14

Undersøgelse af spinalvæsker

Baggrund:

Spinalvæsken (SPV) fi ndes i subarachnoidalrummet omkring centralnervesystemet. Normal SPV er steril og indeholder mindre end 3 leucocytter/ l, ingen erythrocytter og lave koncen-trationer af glucose og protein. Ved betændelsestilstande ændres disse værdier som angivet i nedenstående skema:

DAG 6

Candida arter på CHROMagar medium.

C. krusei (stor, ru, lyserød), C. glabrata (glat, gammelrosa), C. albicans (glat, grøn) ogC. tropicalis (glat, blå).

5757

Spinalvæske Leucocytter Art Glukose Protein

og diagnose pr. l mmol/l g/l

voksne:

normal <3 2,2-3,9 0,2-0,4

børn:

3,9-5,1 0,2-0,4

purulent, bakteriel 87% >103 >80% polymorfa- lav,

meningitis 12% 102-103 nukleære <1/2 af 1-20

Hyppigst: 1% <102 blodsukker

meningokokker, (af 152)

pneumokokker og

H.infl uenzae

tuberkuløs - og 10-103 >>20% mono- lav, 1-5

svampemeningitis nukleære <1/2 af

blodsukker

virusmeningitis 10-102 >>20% mono- normal 0,4-1

(f.eks. poliomyelitis) (103) nukleære

hjerneabsces,

epidural absces 3-103 ? normal 0,2-10

polyradikulitis >>20% mono-

(Guillain-Barré) 3-102 nukleære normal 4-11

Modifi ceret efter Bodansky M, Bodansky O: Biochemistry of Disease, 2. ed. 1952, p. 1110.

Sygehistorier:

Spinalvæske nr. 1:

En 57 årig kvindelig alkoholiker bliver indlagt akut med hovedpine, opkastning og høj fe-ber (39,8 °C). Ved den objektive undersøgelse fi ndes hun nakkestiv, og lumbalpunktur viser purulent spinalvæske.

Spinalvæske nr. 2:

En 5 år gammel dreng med hydrocephalus, opereret herfor for 1 år siden, er nu menin-gealpræget og har sepsis. Prøven er tappet fra ventilen.Spinalvæske nr. 3:

En 20-årig kvinde, altid tidligere rask, bliver pludselig sløj med træthed, kulderystelser og feber. Bliver i løbet af et døgn tiltagende nakkestiv. Indlægges til observation for meningitis.

Spinalvæske nr. 4:

En 12-årig dreng, der igennem en årrække har haft talrige tilfælde af mellemørebetændelse. Bliver under et akut tilfælde af ”ondt i øret” pludselig højfebril og omtåget. Indlæggende læge har fundet patienten tvivlsom nakkestiv.

Procedure:

1. De med prøverne udleverede rekvisitioner udfyldes. De fundne resultater noteres på arbejdskortet - også de følgende dage.

2. Notér, om spinalvæsken er klar eller uklar, og om den er blodtilblandet.

DAG 6

5858

3. Spinalvæsken centrifugeres (3000 rpm i 10 minutter). Supernatanten hældes fra så nær som 0,5 ml. Bundfaldet rystes op i de 0,5 ml.

4. Der fremstilles et methylenblåt-farvet og Gram-farvet præparat af det oprystede bundfald.

5. Bundfaldet udsås med trinvis spredning (se appendix side 78) på en blodplade.

6. En øjefuld af bundfaldet (inokulum) overføres med en stor (blå) plastik-øjenål til en resistensplade. Inokulum, der placeres midt på substratoverfl aden, spre des med glasstav, hvorefter man pålægger papirlapper med antibiotika som angivet på side 62.

7. Alle pladerne inkuberes ved 37°C og afl æses næste dag.

Undersøgelse af pus, sekreter og ”podninger”

Baggrund:

Bakterielle infektioner kan udover at være generaliserede (vækst i blodet) også være lokaliserede (udover urin og CSV) som abscesser, furunkler, empyemer etc.. For at stille den ætiologiske diagnose - og dermed kunne iværksætte en rationel kemoterapi - må man sikre sig materiale til bakteriologisk under søgel se. Dette kan ske mest simpelt ved at sikre sig ma-teriale med en podepind, der anbringes i Stuarts transportmedium, eller ved at udtage pusset med sprøjte og kanyle.

Sygehistorier:

Podning nr. 1:

En 16-årig dreng med akut opstået halsonde. På begge tonsiller fi ndes grå-hvide belægnin-ger. Der er podet fra svælg og tonsiller.

Podning nr. 2:

En 22-årig mand med akut opståede rygsmerter. Røntgen-undersøgelse har vist, at det drejer sig om osteomyelitis i en cervikal hvirvel. Biopsi er udtaget. Materiale herfra er overført til en podepind, som fremsendes til dyrkning.

Podning nr. 3:

En 65-årig mand opereret for prostatahyperplasi transvesikalt. Abdo minal ci ca tricen er nu hævet, rød og varm. Der er rigelig sekretion omkring drænet. Podning herfra er fremsendt til dyrkning.

Podning nr. 4:

En 40-årig kvinde nyretransplanteret for 2 uger siden. Er behandlet med mange forskellige kemoterapeutika, bl.a. ampicillin, samt steroider. Der er rigelig sekretion fra et dræn fra gamle nyreleje. Podning herfra foreligger.

Procedure:

1. De med prøven udleverede rekvisitioner udfyldes. De fundne resultater noteres på arbejdskortet - også de følgende dage. Vurder, om der er grund til at ud sende et foreløbigt svar.

2. Med vatpodepinden fra Stuarts transportmedium udsås på en blodplade og en laktoseplade trinvis, (se appendix side 78), idet vatpodepinden bruges til udsåning i 1. felt (primær depotet), og der efter anvendes øje-podenål.

3. Med vatpodepinden udsås også en resistensplade helt tæt og jævnt. Derefter pålægges papirlapper med antibiotika, som angivet på side 62.

4. Alle plader inkuberes ved 37°C natten over og afl æses næste dag, se dag 7.

DAG 6

5959

Undersøgelse af ekspektorater

Baggrund:

Øvre- og nedre respirationsvejsinfektioner er de hyppigste infektioner, vi støder på her-hjemme - langt de fl este af disse er formentlig forårsaget af virus. Med henblik på ætiologisk diagnose af disse infektioner fremsendes ekspek to rat, bl.a. til bakteriologisk undersøgelse.

Det er vanskeligt at opnå en repræsentativ prøve af sekret fra bronchierne, og en af de væsentligste årsager hertil er muligheden for en samtidig tilbland ing af spyt. Der må derfor foretages en vurdering af ekspektoratprøvens repræsentative værdi ved mikroskopi af det opsamlede materiale. Forekomsten af såvel pladeepithelceller og ciliebærende celler vur-deres og man bedømmer hvilke bakterier, der forekommer i strøg med de respektive celler. Kontamination med spyt og svælgfl ora kan reduceres ved at opsamle sekret ved sug.

Sygehistorier:

Ekspektorat nr. 1:

En 65-årig mand med mangeårig bronchitis har på grund af forværring været indlagt ca. 1 måned på hospital, heraf de sidste 2 uger i respirator. Fra tra che al sug fremsendes materiale til undersøgelse.Ekspektorat nr. 2:

En 60-årig kvinde, der igennem fl ere år har lidt af kronisk bronchitis. Har nu en akut forvær-ring i lidelsen med sej, purulent ekspektoration. Afdelingen ønsker en ætiologisk diagnose samt behandlingsforslag.Ekspektorat nr. 3:

En 40-årig subsistensløs mand, der igennem en årrække har lidt af kronisk bronchitis med hoste og ekspektoration. De sidste dage febril med nattesved. Indlagt til obs. for lungecancer p.g.a. blodtingeret ekspektorat. Dette er sammen med et fl ammefi xeret mikroskopisk præpa-rat fremsendt til undersøgelse.Ekspektorat nr. 4:

En 3 dage gammel dreng, der i kuvøsen udvikler ”respiratory distress syn dro me.” Der tages sekret ved sug igennem trachea m.h.p. bakteriologisk dyrkning.

Procedure:

1. De med prøven udleverede rekvisitioner udfyldes. De fundne resultater noteres på arbejdskortet - også de følgende dage. Vurdér, om der er grund til at ud sende et foreløbigt svar. Den til laboratoriet fremsendte prøve er forud for udlevering til kursus deltage ren be handlet således, at evt. tilblandet spyt er vasket bort, samtidig med at der er fremstillet 2 mikroskopi-præparater. 1 til Gram-farvning og 1 der er Ziehl- Neelsen-farvet.

2. Det ufarvede præparat farves ad modum Gram (se appendix side 79). Begge præparater mikroskoperes, og der stilles en tentativ diagnose.

3. Med en stor plastik-øjenål (blå) udtages et øjefuld mål af ekspektoratet (inokulum), som placeres midt på overfl aden af en resistensplade. Inokulum spredes jævnt over hele pladen med en glasstav, hvorefter der pålægges papir lapper med antibiotika, som angivet side 62.

4. Ekspektoratet udsås herefter på en laktoseplade samt to blodplader og spredes trinvis (se appendix side 78). På den ene af blodpladerne stikpodes desuden en mikrokok i det tættest udsåede felt (primær depotet).

5. Alle plader inkuberes ved 37°C i 1 døgn og afl æses næste dag, se dag 7.

DAG 6

6060

Undersøgelse af prøver med ukendt indhold - 2Læseliste: Side 76-99, 109-128, 154-157, 162-165, 168-171, 174-189, 223-230, 438-448.

Identi kation og følsomhedsbestemmelse

Formål:

At give den teoretiske baggrund for bestemmelse af bakteriers følsomhed over for antibio-tika; at give et indtryk af fejlkilderne ved disse bestemmelser; at sætte studenten i stand til at omsætte det opnåede resultat til praktisk klinisk formål.

Gennemgang:

Antibiotikas selektive toksisitet og deres principielt forskellige angrebspunkter i bakteriecel-len. Den teoretiske baggrund for resistensbestemmelsen.

Metoder til resistensbestemmelseBakteriers følsomhed over for antibiotika kan bestemmes med to principielt forskellige me-toder: Fortyndingsmetoden og diffusionsmetoden.

Fortyndingsmetoden:

Her udsås bakterierne på plader eller i glas med stigende antibiotikumkon cen tration. Efter et døgns inkubation afl æses plader og glas for vækst. Antibioti kum kon centra tionen i den sidste plade eller det sidste glas uden bakterievækst er den mindste hæmmende koncentration og kaldes for bakteriens MIC-værdi (minimal inhibitory concen tration) over for det pågæl-dende antibiotikum. For at kunne fastslå, om en bakterie er følsom for et antibiotikum, er det nødvendigt at vide, hvilken koncentration af stoffet, der farmakologisk kan opnås i den men neskelige organisme, uden at denne belastes af ikke-acceptable bivirkninger. En bakte-rie er følsom, hvis dens MIC-værdi er mindre end den terapeutisk opnåelige koncentration. Normalt tilstræbes en terapeutisk koncentration på 5 gange MIC-værdien i patientens serum, idet koncentrationen i løbet af et døgn svinger afhængigt af doseringstidspunkt, og fordi koncentrationen i organer og væv kan være en del lavere end i serum.

Diffusionsmetoden:

I den daglige rutine anvender man normalt ikke den arbejds- og tidskrævende fortyn d-ingsmetode, men i stedet anvendes diffusionsmetoden. Det var denne metode der blev an-vendt dag 6, hvor der på en tilsået plade blev anbragt papirlapper med antibiotika (se side 62). Fra disse lapper diffunderede antibiotika ud i agaren, således at den højeste koncentra-tion fi ndes, hvor lappen er placeret, og faldende koncentrationer radiært ud derfra. Efter et døgns inkubation vil der ikke være vækst i de områder, hvor koncentrationen af antibiotikum er højere end bakteriens MIC-værdi. Hæmningszonens diameter er således direkte afhængig af bakteriens MIC-værdi over for det pågældende antibiotikum. For hvert antibiotikum kan der tegnes en kurve, der viser sammenhængen mellem forskellige bakteriers MIC-værdi og deres hæmningszone (regressionskurve). En sådan kurve fremstilles hver gang et nyt anti-biotikum tages i brug. MIC-værdi og tilhørende hæmningszone bestemmes for et stort antal forskellige og repræsentative bakterier, hvorefter kurven kan fastlægges. Ved hjælp af regres-sionskurven kan hæm ningszonens diameter omsættes til MIC-værdier, og disse kan så igen omsættes til følsomhedsområder til brug for klinikeren. Føl som heds områderne defi neres ved at sammenholde med de koncentrationer, der kan opnås i den menneskelige organisme ud fra et farmakologisk synspunkt og så korrelere følsomhedsområderne til MIC-værdien, som igen er direkte relateret hæmningszonens diameter.

DAG 7

6161

I Danmark opererer vi normalt med 4 følsomhedsområder:

3 = normal følsomhed: der kan behandles med almindelige doser = ca 5 x MIC.

2 = nedsat følsomhed: der kan behandles med alm.dosis, hvis stoffet koncentreres på infektionsstedet, f.eks.. urin/urinvejsinfektion, eller der kan eventuelt behandles med forhøjet dosis, hvis stoffets toxicitet (toxisk index) tillader det.

1 = relativ resistens: bakteriens MIC-værdi > toksisk grænseværdi, dvs. almen behandling kan ikke forventes at have effekt. Stoffet kan eventuelt anvendes til lokalbehandling.

0 = total resistens: ingen målelig MIC-værdi stoffet uden behandlingsmæssig værdi.

I tabellen på side 64 er hæmningszonens størrelse målt for forskellige antibiotika og angivet for de 4 følsomhedsområder.

Nogel mikrobiologer anvender 3 følsomhedsområder: S=3, I=2, R=1-0.

Papirlapper med antibiotika pålægges med et doseringsapparat, der automatisk doserer en lap af hvert valgt antibiotikum. Der er et apparat for urinprøver og et for

DAG 7

andre prøver, som vist på næste side

6262

Antibiotika kombination ved resistensbestemmelse af bakterier i

urin

Antibiotika kombination ved resistensbestemmelse af bakterier i

andre prøver

Alternative antibiotika anvendes efter behov.

DAG 7

Ampicillin

Cefuroxime Mecillinam

Sulfamethoxazole Trimethoprim

Nitrofurantoin Gentamicin

Ciprofl oxacin

Penicillin

Gentamicin Vancomycin

Ampicillin Piperacillin

Ciprofl oxacin Cefoxitin

Cefuroxime

6363

DAG 7Procedure:

Alle 5 grupper vurderer deres dyrkningsresultater fra foregående dag. Resultaterne indføres på arbejdskortet.

1. Afl æs alle plader. Observér, om der er mere end en bakteriestamme.

2. Fremstil et Gram-farvet præparat af de forskellige fundne bakteriestammer.

3. Identifi kation. En sikker og korrekt bakteriediagnose på artsplan ønskes af hen syn til den korrekte behandling af patienten, bl.a. belysning af, om det drejer sig om et recidiv og/eller en reinfektion samt oplysning om eventuel kemoresistens. Ligeså er det et essentielt led i den epidemiologiske udredning af f.eks. en hospitalsinfektion. Ved identifi kationen gør man brug af den viden, der blev opnået på dag 1-5.

Generelt gælder det for dem, der har:

Gram-positive kokker:

Anvend identifi kationsnøgle fra dag 3 (side 41). Findes der i prøven katalase-positive, koa-gulase-negative, Novobiocin®-følsomme bakterier, vil disse ifølge skemaet på side 41 være en Staphylococcus epidermidis. Denne diagnose er imidlertid ikke 100% sikker på baggrund af de foretagne undersøgelser. Bakterien bør yderligere podes på 3 for gærings glas med hen-holdsvis sakkarose, trehalose og mannitol. Forgærer bakterien sakkarose, men ikke trehalose og mannitol, er det en Staphylococcus epidermidis.

Gram-negative stave:

Anvend skemaet fra dag 5 (side 51).

Gram-positive stave:

Der udføres katalase test, der undersøges for hæmolyse på blodplade, der mikroskoperes for bevægelighed i fugtigt præparat, og der tilsås et halvfl ydende agar glas, som inkuberes ved stuetemperatur.

Identifi kationsskema for Gram positive stave: se appendix side 88.

Gram-negative kokker og små Gram-negative stave:Diskutér yderligere muligheder med underviserne.

Resultaterne noteres på arbejdskortet.

4. Brug det udleverede stykke millimeterpapir til afl æsning af hæmningszonernes diameter på resistenspladen. De forskellige antibiotikas identitet er angivet på

tabletterne.

5. Omsæt de målte mm til følsomhedsområder (0-1-2-3) ved hjælp af tabellen på side 64 og indfør disse på arbejdskortet.

6. Afgiv evt. et foreløbigt svar om de fundne bakterier.

7. Diskutér ønsket om resistensbestemmelse overfor andre antibiotika, hvis dette relevant.

Spørgsmål og diskussionsemner:

Fejlkilder ved følsomhedsbestemmelse udført med tabletmetoden?

De foreløbige diagnoser og behandlingsforslag.

6464

DAG 7Følsomhedsområder for antibiotika i relation til målt mm hæmningszone

Præparat 3 2 1 0

DIAMETER mm mm mm mm

Penicillin (P) ≥28 27-11 10-6 0

Ampicillin (AMP) ≥25 24-11 10-6 0

Cefoxitin 10 µg (FOX) ≥22 - - <22

Piperacillin (PRL) ≥19 18-14 - <14

Mecillinam (MEL) ≥25 24-16 15-6 0

Cefuroxime (CXM) ≥29 28-20 - <20

Gentamicin (CN) ≥23 22-17 16-10 <10

Sulfamethoxazole (RL) Føls. - - Res.

Trimethoprim (W) ≥17 - - <17

Vancomycin (VA) ≥10 - - 0

Nitrofurantoin (F) ≥16 - - <16 Urin

Ciprofl oxacin (CIP) ≥14 - - <14

6565

DAG 8Undersøgelse af prøver med ukendt indhold - 3Læseliste: side 99-107, 218-220, 264-298.

Afslutning og rapport

Gennemgang:

Det rationelle grundlag for antibakteriel kemoterapi.

Procedure:

1. Undersøgelserne foretaget 6. og 7. dag afsluttes.

2. Den endelige diagnose samt foretrukne kemoterapeutikum noteres ved alle sygeh istorier og diskuteres i relation hertil.

3. Spørgsmålene fra dag 6. besvares endeligt. Grupperne sammenskriver deres resultater af hovedopgaven på én A4-side, der afl everes til læreren i dag eller senest torsdag ved øvelsernes begyndelse. Resultaterne mangfoldiggøres. Hver deltager får et sæt af alle besvarelser.

Sterilisation og desinfektionFormål:

At gøre deltagerne fortrolige med begreberne sterilisation, desinfektion samt metoder til ste-rilisation og desinfektion.

Øvelser:

Metoder til sterilisation og desinfektion

Formål:

At demonstrere forskellige sterilisations- og desinfektionsmetoders effekt på bakterier og bakteriesporer.

Deltagerantal:

Der arbejdes sammen i hold på to.

A. Virkning af et fenol-holdigt desinfektionsmiddel på bakterier og sporer.

Materiale:

a) 5 ml 18 h bouillonkultur af en E. coli-stamme (mrk A)

b) 5 ml af 72 h bouillonkultur af en B. subtilis-stamme (mrk B)

c) to agarplader

d) 10% opløsning af Rodalon® (Benzalkoniumklorid)

e) en steril pipette

f) 10 kalibrerede plastik-øjenåle, der rummer 0,001 ml (hvide)

6666

DAG 8Procedure:

1. De 2 agarplader mærkes A og B og inddeles hver i 5 lige store segmenter, der nummereres 1-5.

2. Segment 1 på begge plader tilsås med hver sin bakterie v.h.a. de kalibrerede øjenåle.

3. Til hver af de 2 bouillonkulturer sættes 1 ml af 10% opløsning af Rodalon® (brug steril pipette).

4. Desinfektionsmidlet og bakteriekulturen blandes grundigt ved at slå glasset mod håndfl aden.

5. Derefter tilsås de angivne segmenter med de kalibrerede øjenåle som følger: segment 2 5 min. efter tilsætning af desinfektionsmiddel segment 3 15 min. efter segment 4 30 min. efter segment 5 60 min. efter

6. Pladerne inkuberes ved 37°C i 24 Timer.

B. Virkning af varme på bakterier og sporer

Materiale:

a) 5 ml 18 h bouillonkultur af en E. coli-stamme (mrk A)

b) 5 ml 72 h bouillonkultur af en B. subtilis-stamme (mrk B)

c) 2 agarplader

d) vandbad 100°C

e) 8 kalibrerede plastik-øjenåle, der rummer 0,001 ml (hvide)

Procedure:

1. De 2 agarplader mærkes A og B og inddeles hver i 4 segmenter, der nummere res 1-4.

2. Et øjefuld af hver bakteriestamme udsås i felterne mrk. 1

3. Anbring glassene med bakteriekultur i kogende vand.

4. Fra hver kultur udtages 1 minut, 5 minutter og 15 minutter efter varmebehand lingens start et øjefuld suspension som spredes på de respektive mærkede felter, som beskrevet nedenfor. Efter udtagningen sættes kulturglasset straks tilbage i det kogende vand. kulturmateriale udtaget efter 1 min. varmebehandling udsås på segment 2 kulturmateriale udtaget efter 5 min. varmebehandling udsås på segment 3 kulturmateriale udtaget efter 15 min. varmebehandling udsås på segment 4

5. Pladerne inkuberes ved 37°C og afl æses næste dag. Diskuter fundet.

C. Virkning af ultraviolet bestråling på bakterier og sporer

Materiale:

a) 5 ml 18 timers bouillonkultur af en E. coli stamme mrk. A.

b) 5 ml 72 timers bouillonkultur af en B. subtilis stamme mrk. B.

c) 2 agarplader

d) Sterile vatpodepinde.

6767

DAG 8Procedure:

1. De to agarplader mærkes A og B. Udså med sterile vatpodepinde E.coli på agarplade A og B.subtilis på agarplade B.

2. Tag låget af petriskål A og læg et objektglas på kanten af skålen; anbring heref ter skålen under en UV-lampe i 90 sekunder. UV-lampen skal placeres så tæt som muligt over pladen.

3. Drej derpå lampen ud til siden (eller træk skålen ud), læg et andet objektglas vinkelret ud fra det første til agarpladens kant, således at der dannes et T. Drej lampen ind over agarpladen (eller skub igen skålen ind under UV-lampen) og eksponer pladen i yderligere 90 sekunder.

4. Gentag trin 2 og 3 med agarplade B.

5. Inkuber ved 37°C og afl æs næste dag. Diskuter resultatet.

D. Filtrering

Materiale:

a) en 18 timers bouillonkultur af E.coli

b) en agarplade

c) en plast-sprøjte

d) et 0.22 m Millipore-fi lter

e) 2 kalibrerede plastik-øjenåle, der rummer 0,001 ml (hvide)

Procedure:

1. Agarpladen deles i to felter, der mærkes I og II

2. 1-2 ml E.coli-bouillonkultur suges op i sprøjten.

3. Fra sprøjten dryppes en dråbe af kulturen ned på agarpladens felt mrk. I. Drå- ben spredes over feltet med en plastik-øjenål.

4. Filtret monteres nu på sprøjten og bouillonkulturen presses meget langsomt gennem fi lteret. Det er vigtigt, at det gøres langsomt, fordi man ellers risikerer, at fi lteret går i stykker eller trykkes af sprøjten. Der går et lille øjeblik fra man begynder at trykke på stemplet til der kommer væske gennem fi lteret, fordi rummet over fi lteret skal fyldes, inden der kommer væske igennem. Der anbrin ges en dråbe på agarpladens felt mrk. II, og dråben spredes i felt II med en plastik-øjenål.

5. Agarpladen inkuberes ved 37°C og afl æses næste dag. Resultatet diskuteres.

6868

DAG 8 Normal fl oraFormål:

At gøre deltagerne fortrolige med begrebet normal fl ora, og at demonstrere de bakterier, der forekommer normalt i næse og svælg.

Deltagerantal:

Der arbejdes sammen i hold på 2 deltagere.

Materiale:

a) 4 sterile vatpodepinde

b) 2 spatler (tungedepressorer)

c) 4 små blodagarplader

Procedure:

1. Deltager 1 poder fra deltager 2 og vice versa

2. Svælgpodning foretages med vatpodepind fra forreste fl ade af den ene tonsil, lige bag forreste ganebue efter at spidsen af tungen er trykket ned med en træ spatel. Er tonsillen fjernet, så podes der fra det sted den ville have siddet. Undgå berøring af tunge og kinder med vatpodepinden. Materialet udstryges i slangelinier direkte med vatpodepinden på ca. 1/

3 af blodagarpladen. Fra dette

depot spredes trinvis med øje-podenål på resten af pladen.

3. Næsepodning foretages fra Vestibulum nasi med en vatpodepind. Materialet udstryges i slangelinier direkte med vatpodepinden på hele blodagarpladen.

4. Blodagarpladerne inkuberes ved 37°C og afl æses næste dag.

6969

Den mikrobielle flora i og på den normale menneskelige organisme

hud Staphylococcus Corynebacterium Propionibacterium Micrococcus Candida

conjunctiva Staphylococcus

næse/nasopharynx Staphylococcus Streptococcus

mund/oropharynx Staphylococcus Streptococcus Neisseria Haemophilus Veionella Bacteroides Fusobacterium Treponema (Borrelia) Lactobacillus Candida

tyndtarm Lactobacillus Streptococcus Veionella Actinomyces Candida

tyktarm Bacteroides Clostridium Fusobacterium Bifi dobacterium Eubacterium Lactobacillus Peptostreptococcus Enterococcus Enterobacteriaceae

urin/kønsveje Corynebacterium Streptococcus Staphylococcus Enterococcus Lactobacillus Mycobacterium Enterobacteriaceae Bacteroides Fusobacterium

blod og CSV sterile

blære/uterus/fallopian/

mellemøre/paranasale

sinus sterile

DAG 8

7070

DAG 9 Undersøgelse af prøver med ukendt indhold - 4

Læseliste: Side 99-107, 218-220, 493-502.

A evering af rapport

Hvis rapporten ikke er afl everet dag 8, afl everes den i dag ved øvelsesdagens begyndelse, således, at den kan nå at blive fotokopieret. Inden kursusdagens afslutning får alle deltagere udleveret et eksemplar af hver af gruppernes besvarelse til gennemlæsning inden gennem-gangen af resultaterne dag 10.

Sterilisation og desinfektion (forsat)

Gennemgang:

Princippet i vitaltælling, sterilisation og sterilisationsmetoder, desinfektion og desinfektions-midler samt disses virkemåde, bakterielle spektrum og inaktiveringsfaktorer.

Procedure:

Resultaterne af forsøgene A-D (dag 8) afl æses og diskuteres i relation til ovenstående gen-nemgang. I diskussion inddrages 1) rengøring af materiel i praksis, herunder injektionssprøjter, kanyler, tragte, specula, bronchoskoper o.lign.

2) offi cielle regler for sterilitetskontrol (DS, dansk standard).

3) krav til desinfektionsmidler (det ideelle desinfektionsmiddel!)

4) muligheder for fejl ved autoklavering, kontrolforanstaltninger.

5) sterilisering af medicin.

Spørgsmål:

1. Er medicin steril?

2. Hvilke problemer kan der være ved sterilisering (autoklavering) af infusionsvæsker i fl asker?

3. Hvordan bør hætteglas opbevares (perforerede og ikke-perforerede)?

4. Hvordan bør gummimembranen desinfi ceres?

5. Hvilke problemer kan der opstå ved ”udsmidning” af brugte sprøjter og kanyler?

6. Sterilisering af tandlægeinstrumenter (AIDS).

7171

DAG 9Normal flora (fortsat)

Gennemgang:

Begrebet den normale mikrobielle fl ora, dens betydning for sundhed og sygdom, herunder opportunistiske mikroorganismer. Eksempler på den humane normalfl ora gennemgås i rela-tion til øvelsen.

Procedure:

5. Pladerne fra dag 8 afl æses. Forskellige bakterier lokaliseres på størrelse og pigmentering af kolonierne samt pladeforandringer omkring kolonierne.

6. Materiale fra forskellige kolonier opsamles til Gram-farvning med henblik på tentativ diagnostik. Resultaterne diskuteres.

Undersøgelse af blodprøve for malariaFormål:

At gøre deltagerne fortrolige med malaria-diagnostik. (Se side 110-113).

Teori:

Malaria er den mest betydningsfulde parasitsygdom hos mennesket. Der infi ce res fl ere mil-lioner mennesker årligt, og 2/

3 af klodens befolkning lever i risiko-områder. Det er den hyp-

pigst anmeldte tropesygdom i Danmark. Malaria fremkaldes af en mikroskopisk parasit, der bl.a. lever i de røde blodlegemer og den giver anledning til feber- anfald. Der er 4 arter, men kun en art, Plasmodium falciparum giver livstruende infektion, hvis den ikke behandles. Dette faktum betinger, at alle febrile patienter, der har været i troperne, bør mistænkes for at have malaria, indtil undersøgelse(r) har afkræftet denne diagnose. Diagnosen bør ligeledes haves in mente af den kliniske mikrobiolog, hvis anamnesen antyder feber og ophold i tro-perne, sådan som det er antydet i sygehistorien til blodprøve 4, side 55.

Deltagerantal:

Der arbejdes enkeltvis, og alle deltagere fremstiller et dråbepræparat og et udstryg nings-præparat.

Materiale:

Frisk blod fra punktur af patientens fi ngerpulpa eller ørefl ip. Til kursusdeltag er ne udleveres blod med in vitro dyrkede P.falciparum parasitter.

Procedure:

Dråbepræparat:

En dråbe blod placeres på et objektglas og spredes på et areal ca. 1,5 x 1,5 cm2 stort. Efter lufttørring farves med 8% Giemsa 1/

15 M fosfatbuffer [pH 7,2] i 15 minutter.

Udstrygningspræparat:

En lille dråbe blod udstryges og lufttørres. Der fi kseres 10-15 sekunder med methanol (den tid, det tager metanolen at fugte præparatet!). Methanolen hældes af, og der pålægges 8% Giemsa i 1/

15 M fosfatbuffer [pH 7,2] i 15 minutter. Forsigtig skylning med hanevand (lad

vandet løbe ned på bagsiden af glasset) ellers går præparatet af.(PLASMODIUM FALCIPARUM - præp. 24 i præp.kassen)

7272

Undersøgelse af prøver med ukendt indhold - 5Læseliste: Alle rapporter læses kritisk og spørgsmål og kommentarer forberedes.

Gennemgang af rapporter

Formål:

At illustrere hvad klinisk mikrobiologi egentlig er; at demonstrere samspillet mellem klinik og det mikrobiologiske laboratorium med henblik på at kunne behandle patienterne optimalt på et rationelt grundlag.

Procedure:

Deltagerne fremlægger deres rapporter gruppevis for plenum og motiverer deres valg af be-handling. Resultaterne diskuteres.

I forbindelse hermed omtales:

1) Fordele og ulemper ved forskellige metoder til prøvetagning og transport af prøver til bakteriologisk undersøgelse

2) Indikationer for kombinationsterapi

3) Antagonisme og synergisme mellem forskellige antibiotika

4) Koncentrationsbestemmelse af antibiotika i serum og vævsvæsker

5) Antibiotikabehandling i relation til sygehistorierne

DAG 10

Håndvask - genopfriskning

1) Hænderne indgnides grundigt i håndcreme indeholdende et fl uorescerende stof.

2) Hænderne eksamineres under UV-lys.

3) Der foretages en grundig hygiejnisk håndvask.

4) Hænderne eksamineres under UV-lys.

5) Punkt 3 og 4 gentages

Håndryg Håndfl ade

7373

Appendix

Bakteriologi

7474

Håndtering af podenål og podeøsken

1. sterilisering ved fl ambering før og efter brug

1.Podenålen holdes som en blyant.

2.Podenålen holdes skråt ind i gasfl ammen (lige over fl ammens blå kegle) indtil nålen glø-der. Skal der podes fra glas, føres så meget af skaftet, som forventes indført i kultur-glasset, roligt gennem fl ammen 3 gange. Efter afkøling er pode nålen klar til brug.

3.Efter brugen fl amberes podenålen igen, som nævnt under pkt. 2.

4.og stilles tilbage i stativet som vist.

7575

2. tilsåning af glas

1.Efter at have løsnet alle propper i de glas, der skal tilsås, fattes podenålen

2.som fl amberes; også skaftet svarende til kultur-glassets længde.

3.Kulturglasset holdes om bunden med den frie hånd tre første fi ngre og holdes i skråstilling (næsten horisontalt), således at indføring af pode-nålen lettes.

4.Proppen tages af og holdes under hele procedu-ren med lillefi ngeren på den hånd, der holder podenålen.

7676

5.Glassets munding fl amberes

6.Den fl amberede podenål afkøles ved, at man stikker den 4 cm ned i substratet helt uden ved glasvæggen. Derefter udtages materiale på spidsen af podenålen. Denne føres ud uden at berøre glassets inderside.

7.Kulturglassets munding fl amberes igen.

8.Proppen sættes i glasset, og dette stilles tilbage i stativet.

7777

9.Glasset med sterilt substrat fattes om bunden.

10.Proppen tages af og holdes med lillefi ngeren som nævnt under pkt. 4.

11.Substratglassets munding fl amberes

12.Podenål med materiale føres ned i substratet. Ef-ter at podenålen atter er ført ud af glasset (uden at berøre glassets inderside), fl amberes glas sets munding, proppen sættes i, glasset sættes i stati-vet og pode nålen fl am beres.

7878

3. tilsåning af agarpladerPå faste substrater stræber man i reglen efter at få spredte, enkeltliggende kolonier. Dette kan opnås ved at fortynde det oprindelige kulturmateriale under selve udså ning en (trinsvis spred-ning). Man tilsår først et felt (I til II) med en 5-6 strøg tværs over agaren. Tilsåningen startes 3-4 mm fra skålens kant. Derpå fl amberes podenålen, og før videre spredning afkøles den, og så spredes over II til III, således at alle strøg lapper over I-II; efter endnu en fl ambering spredes over feltet III til IV, alle strøg skal overlappe II-III. Hele agarfl aden skal udnyttes.

Trinvis udsåning Tæt udsåning

Ønsker man at få tæt bakterievækst på en plade, tilsås den massivt fra en renkultur enten med en øsken, som vist på fi guren, eller ved at placere en dråbe bakteriekultur på agaren og derpå sprede med en steril bøjet glasstav.

Fremstilling af præparater til mikroskopiFugtigt præparat:På objektglasset anbringes med øsken eller fi nger en dråbe hanevand. Fra en fast eller fl y-dende kultur tages bakteriemateriale med den lige podenål eller øskenen. Dette blandes grundigt op i vanddråben til en svagt uklar suspension. Blandingen dækkes med dækglas, og iagttages i mikroskopet med brug af immer sionsolie og 100 x objektiv. Under disse forhold har bakterierne nogenlunde deres naturlige udseende, og bevægelighed kan iagttages. Under mikroskoperingen af det fugtige præparat må man ikke køre objektivet ud over dækglassets kanter, da bakterieopslemningen derved kan suges ud på objektivet.

Tørt præparat:Med øsken tages en lille dråbe vand, der placeres på et objektglas. Heri opslemmes ganske lidt bakteriekultur. Efter opslemningen øges arealet hurtigt til ca. det dobbelte. Præparatet lufttørres til det er helt tørt, og fl ammefi kseres. Objektglasset fattes med en klemme og føres roligt 3 gange gennem gasblusset med præparatsiden vendende væk fra ilden.Gram-farvning 1. Lufttøring.

2. Flammefi ksering.

3. Farvning med krystalviolet i 1 minut.

7979

4. Afhældning af farven og grundig afskylning af krystalviolet med jod-kaliumjodid.

5. Bejdsning med jod-kaliumjodid i 1 minut.

6. Afhældning af jod-kaliumjodid, hurtig afskylning med 96% ethanol.

7. Affarvning i 20 sekunder med 96% ethanol.

8. Afskylning med vand. Alkoholen må ikke blandes med vandet,således at en fortyndet alkohol står over præparatet, idet fortyndet lkohol affarver de Gram-positive bakterier. Objektglasset holdes skråt og alkoholen skylles hurtigt af på begge sider af objektglasset med vandstrålen.

9. Afskylning af vandet med vandig fuchsin.

10. Farvning med vandig fuchsin i 30 sekunder.

11. Afskylning med vand.

12. Lufttørring (evt. aftrykning med fi ltrerpapir).

Methylenblåt-farvning 1. Lufttørring.


3. Farvning med methylenblåt i 1 minut.

4. Afskylning med vand (ved at variere skylletiden, kan farvningen differentieres).

5. Lufttørring.

Ziehl-Neelsen-farvning 1. Lufttørring.


3. Dækning af præparat med fi ltrerpapir.

4. Filtrerpapiret pådryppes rigeligt Ziehl-Neelsens carbolfuchsin.

5. Opvarmning over vågeblus til svag dampning og henlægning i 5 minutter.

6. Grundig skylning med vand.

7. Affarvning med saltsyre-alkohol til der ikke afgives mere farve.

8. Grundig skylning med vand.

9. Kontrastfarvning med malakitgrønt i 15 sekunder.

10. Afskylning med vand.

11. Aftrykning med fi ltrerpapir.

8080

SubstraterBouillon (kødvands-pepton) fremstilles ved kogning af hakket oksekød. Fedtet skummes af og der tilsættes pepton, som består af aminosyrer og peptider. Desuden tilsættes glukose, NaCl og Na

2HPO

4; pH indstilles til 7,4-7,8, og substratet autoklaveres.

Serumbouillon (5%) fremstilles ud fra bouillon ved at sætte 50 ml sterilt hesteserum til 950 ml bouillon.

Halvfl ydende agar (0,2%) fremstilles ved at sætte 2 g Agar agar (et polysak ka rid) til 1 liter bouillon.

Bouillon-agarplader fremstilles ved at sætte 12 g Agar til 1 liter bouillon (1,2%). Der opvarmes til 95°C og afkøles til 40-45°C, hvorpå bouillon-agar’en fordeles i petriskåle. Blandingen størkner ved temperaturer under 40°C og bliver først fl ydende efter fornyet op-varmning til 95°C.

Blod-agarplader fremstilles ved at sætte 50 ml defi brineret hesteblod og 15 ml gær-ekstrakt til 1 liter bouillon-agar, når denne er afkølet til ca. 45-50°C. Blandingen ophældes derpå i passende mængder i petriskåle.

Chocolade-agarplader fremstilles som blodagarplader, men blodet tilsættes medens bouil-lon agaren er 80°C varm. Erythrocytterne sprænger og det opvarmede blodfarvestof bliver brunligt. Ophældning i petriskåle som blodagar.

NaCl-agarplader fremstilles af bouillon-agar, der tilsættes yderligere 72 g NaCl per liter bouillon-agar. Ophældning i petriskåle. Substratet hæmmer væksten af de fl este bakte-rie-arter men ikke stafylokokkers.

Laktose-agarplader fremstilles af kødekstrakt og pepton, og der tilsættes 12 g agar pr liter. Blandingen er sukkerfri, idet kødekstrakten under fremstillingen bliver sukkerfri, og pepton indeholder ikke sukker. Der tilsættes 15 g laktose pr liter. Desuden tilsættes bromthymolblåt, en indikator, der er gul ved lavt pH og blå ved basisk pH, samt krystal violet, som hæmmer Gram-positive bakteriers vækst.

Tellurit-agarplader fremstilles af blod agar, hvortil sættes 2% K2TeO

3.

Forgæringssubstrater (Hugh Leifson) fremstilles ved at blande 2 g pepton, 5 g NaCl, 0,3 g K

2HPO

4, bromthymolblåt og 900 ml destilleret vand. Hertil sættes 100 ml af en 10% opløs-

ning af den sukkerart, man ønsker at undersøge for.

Peptonvand til indolreaktion fremstilles ved at blande 1 g pepton i 1 liter vand.

Citratmedium fremstilles ved at blande 2 g citronsyre i 1 liter vand. Hertil sættes NaCl, MgSO

4, NH

4H

2PO

4 og K

2HPO

4.

Ureasemedium indeholder 10 g urinstof pr liter vand samt KH2HPO

4, K

2HPO

4, NaCl og

fenolrødt.

Gelatine er et fast substrat ved temperaturer under 30°C. Det fremstilles ved at tilsætte vand proteinstoffet gelatine (husblas). Dette substrat er imidlertid fl ydende ved 30°C, hvorfor det er uegnet som medium til dyrkning af bakterier ved 37°C. Det anven-des en del som diagnostisk medium, idet visse bakterier danner et proteolytisk enzym, der ”smelter” substratet.

8181

Løwenstein-Jensens substrat (til dyrkning af mykobakterier) inderholder KH2PO

4, MgSO

4,

Mg-citrat, asparagin og glycerol. Hertil sættes stivelse, æg og malakitgrønt.

Thioglycholat-substrat fremstilles ud fra peptonvand, hvortil sættes gær-ekstrakt, glukose, NaCl samt reducerende stoffer som cystin og thioglycholat, der sikrer anaerobe forhold i mediet. Der til endvidere tilsat reazurin som ilt-indikator.

Macconkey agar fremstilles ud fra peptonvands agar, der er tilsat laktose, Natauro cho lat, NaCl og neutralrødt.

Sabouraud’s agar er en agar med lavt pH og højt sukkerindhold. En selektiv agarplade til primær isolation af svampe fra klinisk materiale.

Cled’s agar fremstilles ud fra kødekstrakt-peptonvand agar. Der tilsættes case in hy dro lysat, laktose og cystein, pH 7,3. Bromthymolblåt er tilsat som indikator. Substratet anvendes i Uriculten.

Stuarts transportmedium indeholder agar, thioglycholat, Na-glycerofosfat, NaOH, CaCl2

og methylenblåt som indikator.

Jernagar indeholder bl.a. Ferricitrat. Hvis bakterier danner svovlbrinte vil der dannes tungt-opløseligt, sortfarvet jernsulfi d.

Koloni-morfologiPå faste substrater (agarplader) registreres:

størrelse: lille (<1 mm), middel (1-2mm), stor (>2 mm)

form: fl ad, hvælvet, kuplet

overfl ade: glat, ru, hamret, spejlende, mat, farvet

periferi: jævn, ujævn, uafgrænset

konsistens: pasta-agtig, slimet, tør (prøves med podenål)

farve: hvid, grålig, gul, rød, blålig, sort, fl uorescerende (kræver UV-lys)

substratets farve omkring kolonien: rød, grøn, sort (opløselige pigmenter)

Katalase - reaktionenKatalase er et enzym, der dannes af mange bakterier. Det katalyserer processen:

2 H2O

2 ----> O

2 + 2 H

2O

Den fri ilt bobler væk gennem væsken.

Da blodlegemer indeholder katalase, bør bakterier til undersøgelsen dyrkes på en agar-plade. Er det nødvendigt, at tage bakterier fra en blodplade, skal man ved udtagningen undgå at be-røre blodagaren.

Udførelse:

En dråbe 3% brintoverilte anbringes på et rent objektglas. Lidt bakteriemateriale udtages med en steril plastikpodepind, som derpå drejes forsigtigt i dråben. Hold låget fra en petri-skål over objektglasset for at undgå aerosol i omgivelserne. Ved positiv reaktion ses luftud-vikling (”kogning”).

8282

Koagulase - reaktionenKoagulase er et enzym, som dannes af visse bakterier. Det omdanner det opløse lige fi brino-gen til uopløseligt fi brin.

Koagulase-reaktionen anvendes diagnostisk til opdeling af stafylokokker i: Staphylococ-cus aureus med positiv reaktion og andre koagulase-negative stafylokokker.

Der er to principielt forskellige metoder til påvisning af koagulase. Den ene, objekt-glasmetoden eller ”slide-test”, påviser tilstedeværelsen af ”clumping factor” (CF) eller bundet koagulase, som forekommer hos alle koagulase-positive stafylokokker. Den anden, reagensglasmetoden eller ”tube-test”, påviser udelukkende fri koagulase.

Der er 90-95% overensstemmelse mellem de to reaktioner. De få uoverensstemmelser, der er, skyldes dels de to forskellige koagulasetyper, idet fri koagu lase også betyder tilstede-værelse af bundet koagulase, men ikke altid omvendt, dels en vis teknisk usikkerhed, især på objektglasmetoden.

I praksis anvendes objektglasmetoden som hurtigmetode til brug ved fore løbige besvarelser, idet en positiv reaktion viser, at det drejer sig om Staphy lo coc cus aureus, og det er vigtigt, at kunne stille denne diagnose hurtigt af hensyn til patientbehandlingen. Således anvendt, er reaktionen at betragte som en ”screening”-metode, d.v.s. at den i langt de fl este tilfælde - men ikke alle - giver et positivt resultat, hvis den pågældende stafylokok er koagu-lase-positiv.

Reagensglasmetoden bør foretrækkes, hvis tiden ikke er knap, og den bør tillige anvendes til undersøgelse af de stafylokokker, som er koagulase-negative med objekt glasmetoden.

Materiale:

til begge reaktioner anvendes citrat-stabiliseret plasma opbevaret ved almindelig køle-skabstemperatur.

Objektglasmetoden

Udførelse:

En dråbe plasma anbringes på et oblektglas. Med steril podenål udtages bakteriemateriale som opslemmes i plasmadråben.

Positiv reaktion:

En grynet udfældning indenfor 5 sekunder.

Fejlkilder:

opslemningens tæthed er helt afgørende, idet en for tynd eller for tyk opslemning kan tilsløre reaktionen. Pladekulturen må ikke være mere end 3 døgn gammel. Enkelte kulturer giver udfældning allerede under opslemningen, og det kan være nvendigt, at kontrollere sådanne med reagensglasmetoden.

8383

Reagensglasmetoden

Udførelse:

Reaktionen kræver en 18-24 timers bouillon-kultur. I et reagensglas blandes 0,1 ml af en sådan kultur med 1,0 ml plasma, som er fortyndet 1:10 med fysiologisk saltvand. Der in-kuberes ved 37°C, og der afl æses efter 1, 4 og 24 timers forløb.

Positiv reaktion:

Glasset rystes forsigtigt ved afl æsningen, og en positiv reaktion vil vise sig som et koagel bestående af hvidlige membraner eller tråde.

Fejlkilder:

For gammelt plasma. Der bør altid være en positiv kontrol. Det dannede koagel går igen i opløsning, derfor de tre afl æsninger, der minimerer denne fejlkilde.

Pladeforandringer (”Pladehæmolyse”) Nogle bakterier giver anledning til farveforandringer omkring kolonierne på blodagarpladen. Forandringerne kan være betinget af opløselige pigmenter, stofskifteprodukter, eller bakteri-elle hæmolysiner. Man registrerer 2 former for pladeforandringer omkring kolonierne: α-forandring: en grønlig diffus zone uden opklaring.

β-forandring: en opklaret zone omkring kolonierne. Er der mange kolonier, kan opklarin-gen omfatte hele blodpladen. Opklaringen kan være en β-hæmolyse, så bliver blod agaren gul (agars farve før tilsætning af blod).

MacConkey AgarpladeMcConkey’s agar tillader stort set kun vækst af fækale bakterier, d.v.s. enterokokker og coli-forme Gram-negative bakterier. Hvis disse bakterier forgærer laktose (det gør enterokokker), vil den derved dannede syre uddrive den svage taurocholsyre af dennes Na-salt. Taurocho-lsyren er i modsætning til Na-saltet tungtopløselig, fælder ud og forbinder sig med neutral-rødt. Laktoseforgærende bakterier danner derfor røde kolonier med udfældning omkring kolonierne. Ikke-laktoseforgørende bakterier danner farveløse kolonier.

Enterokokker (fækale streptokokker) danner kolonier, der er <0,5 mm i diameter; coli-forme bakterier danner kolonier, der er >0,5 mm i diameter.

Tellurit-følsomhedDe fl este streptokokker kan ikke vokse på agarplader, der indeholder tellurit. Entero coc cus

faecalis kan imidlertid, og den reducerer herunder tellurit til frit tellur, som er sort. Man an-vender derfor udsåning på tellurit-plader til adskillelse af E. faecalis fra andre enterokokker.

Udførelse:

En tellurit-plade tilsås med den ukendte bakterie.

Positiv reaktion:

Vækst på plade af sorte (blåsorte) kolonier.

8484

Bevægelighed (Fugtigt præparat)Bakteriers bevægelighed kan undersøges mikroskopisk i et fugtigt præparat.

Udførelse:

På et rent objektglas anbringes en stor dråbe saltvand, hvori der udrøres lidt bakterie-mate-riale. Der pålægges dækglas og mikroskoperes med nedskruet kondensator-blænde.

Afl æsning:

Bevægelige bakterier bevæger sig i alle retninger, cirkler osv. Ubevægelige bakterier ligger stille. Bevægelse må ikke forveksles med bevægelse af alle bakterier i samme retning på grund af strømning i præparatets væske (f.eks. fordi bordet hælder) eller oscillerende bevæ-gelser (Brown’ske bevægelser), der kan forekomme ret markante, første gang de iagttages!

Halvfl ydende agar (bevægelighed og ilt-krav) Denne agar benyttes til undersøgelse af bakteriers bevægelighed og ilt-krav.

Udførelse:

Lidt bakteriemateriale på podenålen stikkes ned gennem agaren, og der inku be res 18-20 timer ved 37°C.

Afl æsning:

Vækst gennem hele substratet og diffus uklarhed: bakterien bevægelig og fakul tativ (angi-ves som f).

Vækst langs stikkanalen eller nedfaldende grene og det øvrige substrat klart: bakterien ubevægelig og fakultativ (angives som f)

Vækst på substratets overfl ade (knap-vækst, svag kegleform) eller i de øverste få mm af stikkanalen (som en tegnestift) og det øvrige substrat klart: bakterien obligat aerob (angives som a). Bevægelighed må undersøges i fugtigt præparat.

Vækst i stikkanalen nogle få mm under overfl aden: bakterien er mikro aerofi l (angives som ma), dvs. vokser bedst under lidt reduceret ilt-spænding (niveau-bakterier).

Vækst alene i bunden af glasset: (1) omkring stikkanalen: bakterien obligat anaerob

(angives som an) og sandsynligvis ubevægelig; (2) diffus vækst i bunden af glasset: obligat anaerob (angives som an) og sandsynligvis bevægelig. Bevægeligheden kontrolleres i et fugtigt præparat.

Oxidase - reaktionVed denne påviser man, om bakterierne indeholder stoffer, der kan oxidere tetra-methyl- p-pheny-lendiamin (oxidase-reagens). Ved iltning omdannes stoffet til en lilla forbindelse.

Udførelse:

Et fi ltrerpapir anbringes i en petriskål. Herpå dryppes 1-2 dråber oxidase-reagens. Med pode-nål afsættes lidt bakteriekultur i randen af det fugtige område, lidt udenfor (som kontrol!) og lidt indenfor i det fugtige område.

Afl æsning:

Positiv reaktion er en lilla farvereaktion i løbet af 10 sekunder.

Fejlkilder:

Det er vigtigt, at der kommer luft til reaktionen. Filtrerpapiret må ikke drukne i reagens. Er bakteriekulturen slimet, tages kun lidt materiale, og der gnides kraftigt og hurtigt for at få fjernet slimen fra bakterierne. En kultur, der har været opbevaret i mere end 24 timer ved stuetemperatur eller i varmeskab, kan ikke anvendes.

8585

Laktoseforgæring

Udførelse:

Der spredes trinvis på en laktoseagarplade som inkuberes natten over ved 37°C.

Afl æsning:

Laktoseforgærende bakterier nedbryder laktose til mælkesyre, hvorved pH falder og indika-toren - bromthymolblåt - slår om fra neutral/blå til sur/gul. Gram-positive bakterier vokser dårligt på pladen på grund af indholdet af krystalviolet. Store inokulater af Gram-positive kokker vil dog give svag vækst og omslag til gult. Laktoseforgæring kan også afl æses på MacConkey-plader.

Glucose- og mannitolforgæringVed forgæring af sukkerarter dannes sure nedbrydningsprodukter, som påvises med indikato-ren bromthymolblåt. Eventuelt samtidig dannet luft opsamles i et lille reagensglas (Durham-rør), der er stillet på hovedet inde i det store glas.

Udførelse:

Glasset tilsås med et lille inoculum (stik med podenål), og der inkuberes 18-20 timer ved 37°C.

Afl æsning:

Hvis farven er skiftet til gul angives syre+. Hvis der er fanget luft i bunden af Durham-røret angives luft+. En lille boble betragtes ikke som positiv reaktion. Der sammenlignes med utilsåede forgæringsglas.

Fejlkilde:

NB. Ved negativ reaktion kontrolleres om der er vækst i substratet. Hvis ikke skal prøven laves om.

Indol - reaktionenVisse bakterier spalter aminosyren tryptofan under dannelse af indol. Indol kan påvises med para-dimethyl-amino-benzaldehyd (indol-reagens), hvormed det danner et rødfarvet kom-pleks.

Udførelse:

Substrat-glasset podes med et stort inokulum (dvs. alt hvad der kan ”hænge” på øskenen) og inkuberes 18-20 timer ved 37°C.

Afl æsning:

Substratglasset holdes skråt. Med en pipette tages ca. 0,5 ml indol-reagens (paradi methyl-aminobenzaldehyd), som derpå dråbevis tilsættes substratet således, at det løber ned langs glassets inderside, så det lægger sig i et lag oven på substratet. Glasset henstilles derpå lodret i et par minutter.

Positiv reaktion:

Ses som en rød grænsefl ade mellem reagens og substrat. Man kan eventuelt ryste glasset kraftigt efter tilblandingen, hvorved glassets indhold vil blive svagt lyserødt ved positiv re-aktion.

8686

V og P - reaktionen (Voges og Proskauer reaktionen)Visse bakterier danner ud fra glukose ketoner og alkoholer. Disse omdanner kreatin til et guanin-kompleks, der ved reaktion med KOH bliver rødfarvet.

Udførelse:

Glasset tilsås med et stort inokulum og inkuberes 18-20 timer ved 37°C.

Afl æsning:

Til glasset sættes 2 dråber kreatin opløsning og 1 ml 40% KOH opløsning (brug handsker). Der blandes ved grundig rystning og glasset henstilles i skrå stilling i 20-30 minutter.

Positiv reaktion:

Blandingen farves rød.

Decarboxylase - reaktionI mange bakterier forekommer aminosyre-decarboxylaser, d.v.s. enzymer, der omdan ner aminosyrer til aminer. Aminosyre-decarboxylaser kan anvendes til identifi kation af bakterier, og følgende 3 har i denne sammenhæng interesse: ornithin-decarboxylase, lysin-decarbo-xylase og arginin-decarboxylase. Ved den kemiske reaktion ændres pH i substratet i basisk retning, og en tilsat indikator skifter farve fra svagt beige til violet.

Udførelse:

Hvert af 3 små glas med aminosyrene ornithin, lysin, arginin samt et kontrolglas podes med podenål (lille inokulum). Glassene inkuberes ved 37°C i op til 4 døgn.

Afl æsning:

Glassene undersøges dagligt.

Positiv reaktion:

Substratet bliver violet. Negativt svar afgives først efter 4 døgns observation.

Urease - reaktionVisse bakterier producerer enzymet urease, som katalyserer spaltning af urea efter ligningen:

NH2

C=O + H2O ----> 2 NH

3 + CO

2

NH2

Reaktionen medfører basisk pH og indikatoren fenolrødt slår om fra gul til rød.

Udførelse:

Glasset tilsås med et stort inokulum, og der inkuberes 18-20 timer ved 37°C.

Afl æsning:

Positiv reaktion = rød farve. Visse Klebsiella-arter spalter langsomt, og reaktionen bliver først positiv efter 2 døgns inkubation.

8787

GelatinesmeltningEn del bakterier spalter enzymatisk gelatine, som herved bliver fl ydende (substratet ”smel-ter”) ved en temperatur, der ligger under gelatinens normale smeltepunkt.

Udførelse:

Som substrat anvendes ferroklorid-gelatine. Med podenål stikkes ned gennem centrum af substratsøjlen. Der inkuberes ved 22°C. Der medtages kontrol i form af et ikke-ino ku leret glas.

Afl æsning:

Glassene undersøges dagligt i 3 døgn. Glasset lægges vandret og drejes hurtigt omkring om-kring dets længdeakse, medens substratsøjlens overfl ade betragtes. Glasset kan eventuelt slås et par gange mod hånden for at opdage evt. smeltning nede i sub stratsøjlen. Ved positiv re-aktion er den faste gelatine fl ydende (smeltet), enten hele substratet eller kun en del af dette (smeltekejle).

Svovlbrinte - dannelse

Visse bakterier danner svovlbrinte. Det kan påvises med ferroklorid, hvormed det danner sort jernsulfi d.

Udførelse:

Et glas med jernagar tilsås med et lille inokulum. Med podenålen laves et stik ned gennem centrum af substratsøjlen. Der inkuberes 18-20 timer ved 37°C.

Afl æsning:

Svovlbrinte-producerende bakterier giver en sortfarvning (sværtning).

Serologiske reaktionerKapselsvulst (Neufeld’s fænomen) og objektglasagglutination

Undersøgelse af spinalvæsker med serum mod pneumokokker (Streptococcus pneumo niae) og HiB (Haemophilus infl uenza B).

Udførelse:

På den ene halvdel af hver af to objektglas afsættes 1 dråbe saltvand (eller negativt kaninse-rum) samt 1 dråbe opslemmet spinalvæske-bundfald (centri fuge rings-pellet). Dråberne røres sammen og der pålægges dækglas. På den anden halvdel af det ene glas afsættes 1 dråbe pneumokok antiserum samt 1 dråbe opslemmet spinalvæske-bundfald på et andet glas en dråbe anti HiB og en dråbe spinalvæske-bundfald. Dråberne røres sammen og der pålægges dækglas.

Afl æsning:

foretages med mikroskop. Pneumokok-antiserum er tilsat tusch og methylen blåt. Pneumo-kokkens kapsel ses som en klar zone mellem den blå-farvede pneumokok og det omgivende grålige tusch. Positiv reaktion med pneumo kok ker ses som en betydelig forøget kapsel (kap-selsvulst). Der sammenlignes med pneumokokkernes kapsel i kontrolområdet på objektglas-sets anden halvdel.

8888

Positiv reaktion med HiB:

Ses som en sammenklumpning (agglutination) af bakterierne. Der sammen lignes med bakte-rierne i kontrolområdet på objektglassets anden halvdel.

Objektglasagglutination af Gram negative staveIdentifi kation af visse bakterier, f.eks. Salmonella og Escherichia, kan ske v.h.a. agglu-tination med kendte antisera. Der anvendes antisera mod forskellige antigener: kapsel-anti-gener (K og Vi), cellevægsantigener (O-antigener) og fl agel-antigener (H-antigener).

Udførelse:

En dråbe kendt antiserum (ved første identifi kationsforsøg ofte et serum indeholdende anti-stoffer mod fl ere antigener, senere forsøg foretages med sera indeholdende antistof mod kun et antigen) afsættes på et objektglas. Med podenål tages en god del bakteriemasse, som op-slemmes i dråben. Glasset holdes mod en mørk baggrund, og der vug ges konstant i 2 minut-ter.

Afl æsning:

Positiv reaktion er en agglutination i løbet af 2 minutter efter opslemning. Agglutinatet vil være fi nkornet, når der anvendes anti-O sera og mere grov kornet, når der anvendes anti-H sera.

Co-agglutination De fl este streptokokker har i cellevæggen kulhydrat-antigener (Lancefi eld antigen), der muliggør en inddeling af streptokokkerne i serologiske grupper (A, B, C, D, E ...). Co-agglutinationens reagens er en suspension af stafylokokker med protein-A på overfl aden. Til protein-A er koblet antistof (via Fc-delen) mod streptokok gruppe-antigen. Stafylokokkerne er farvet blå.

Udførelse:

På en pap-plade anbringes i 4 af de afmærkede felter en dråbe reagens med hen holds vis anti-A, anti-B, anti-C og anti-G. Med en podenål tages bakteriemasse fra suspekte kolonier (β-“hæmolytiske“), som udrøres grundigt i dråber ne. Der skal skiftes podenål for hver dråbe. Der vugges og afl æses indenfor 2 minutter.

Afl æsning:

Positiv reaktion viser sig ved en kornet udfældning, idet de blåfarvede stafy lokokker med påsiddende specifi kt antistof agglutineres, hvis der er korrespon derende antigen på strepto-kokkerne.

Fejlkilder:

Negativ reaktion, fordi der er taget for lidt bakteriemasse. Agglutinat-dannelse kræver en hel del bakterier. Hvis ikke der vugges, dannes agglutinaterne ikke eller kun langsomt. Små klumper af medtaget agar, kan uforvarende forveksles med agglutinater. Bak teriemasse, der ikke suspenderes omhyggeligt, kan ligeledes forveksles med agglutination.

Katalase 02-krav Bevægelighed

Listeria + F +

Corynebacterium + F ÷

Bacillus + A +/÷

Clostridium ÷ An +/÷

Identifi kation af Gram positive stave

8989

Samarbejde mellem de klinisk-mikro-biologiske laboratorier, kliniske afdelinger og praktiserende læger

Undersøgelsesresultatet er i høj grad afhængigt af prøven, herunder opsam lings pro ce dure og transportmetode samt de medfølgende oplysninger.

Hasteprøver, f.eks. spinalvæsker: Ved indsendelse af disse bør vagthavende læge på labo-ratoriet adviseres for sikre en hurtig undersøgelse.

RekvisitionssedlerAlle klinisk-mikrobiologiske laboratorier har specielt udformede rekvisitionssedler, der skal anvendes, og som kan rekvireres fra laboratorierne. Hver enkelt prøve skal ledsages af en rekvisitionsseddel. Sedlen skal udfyldes omhyggeligt og gennemskriften skal kontrolleres. Sedlen må normalt ikke rulles omkring prøven.

1. Prøvtagningstidspunkt (dato og klokkeslet) og prøvens art skal altid anføres.

2. Patientidentifi kation: navn, fødselsdato samt afdeling bør fremgå klart.

3. Den ønskede undersøgelse: f.eks. anføres resistensundersøgelse for specielle anti biotika.

4. Kliniske oplysninger: disse anføres af hensyn til den procedure, man i laboratoriet vil underkaste prøven.

5. Antibiotika givet inden for de sidste dage skal anføres på sedlen.

6. Mærkning af prøven: Prøverøret skal mærkes tydeligt enten med patientens fød sels-dato og -år eller med navn.

PrøvetagningsmaterielPrøver til mikrobiologisk undersøgelse er i reglen infektiøse og skal derfor opsamles og transporteres på en sådan måde, at risiko for smittespredning ikke forekommer. Det er vig-tigt, at prøvetagningsrørenes yderside ikke forurenes med smittefarligt materiale.

1. ”Transportsubstrat” (Stuart’s medium) og kulpodepinde.

2. Bloddyrkningskolber.

3. Sterilt sæt til opsugning af trachealsekret.

4. Sterilt sæt til opsamling af midtstråle urin.

5. Sterilt sæt med pipetterør til opsamling af ekspektorat.

6. Sterilt podesæt med kort podepind til almindelige podninger.

7. Sterilt rør med glycerin og ske til fæcesprøver, der ønskes undersøgt for patogene tarmbakterier.

8. Sterilt rør med ske uden glycerin til alm. fæces-dyrkning.

9090

PrøvetagningAlment

For at en bakteriologisk undersøgelse skal være meningsfuld, må man have et repræsentativt prøvemateriale, d.v.s. et materiale, der afspejler bakteriefore komsten i infek-tionsfokus på prøvetagningstidspunktet. For at dette kan være tilfældet, må der tages hensyn til følgende faktorer:

1. En etableret antibiotikaterapi bør anføres. Dette bør fremgå af rekvisitionssedlen.

2. Prøvematerialet bør være velvalgt, f.eks. nasopharynx-prøver bør foretrækkes ved luftvejsinfektioner fremfor svælgprøver eller ”næse”-podninger; fl oraen i nasopharynx er ofte bedst korreleret til det ætiologiske agens ved luftvejsinfektioner.

3. Kontamination med normalfl ora, f.eks. ekspektorater kontamineres af fl oraen i svælg og mundhule, urinprøver kontamineres af urethralfl oraen, blod, spinal væske og andre perkutane punktater forurenes af hudfl oraen.

4. Prøvtagningsteknik, f.eks. tilstrækkelig tid til, at sekret kan opsuges i bomulden ved nasopharynx-prøver, før podepinden ind under eventuelle belægninger. Pres og rul over tonsiller ved svælgpodninger, tag prøven fra de affi cerede sår rande og ikke midt i pusansamlingen. Undgå kontamination med vaginal fl oraen ved cervixpodninger.

5. Transportagar, som forhindrer overvækst af uvedkommende bakterier og holder de sygdomsfremkaldende bakterier i live (Stuart’s transportagar), bør anvendes ved gonokok-dyrkninger og andre podninger i forbindelse med „kulpode pinde“.

6. Nedkøling af urinprøver.

Afgivelse af svarNedenstående gælder ikke for alle laboratorier, idet individuelle forhold gør sig gældende.

Telefon-svar:

Svar på hasteprøver afgives altid telefonisk. Fund vedrørende bloddyrkninger og spinal-væsker afgives altid straks telefonisk, hvis prøven er positiv inden for de første 2 døgn. Alle disse svar afgives senere skriftligt.

Foreløbige svar:

Efter 1. døgn afgives et foreløbigt svar på de prøver, hvor undersøgelsen strækker sig over mere end 2 døgn. Disse foreløbige svar kan hæftes uden på journalen og skal bortkastes ved modtagelsen af det endelige svar. De foreløbige svar er mangelfulde, idet de kun angiver en grov karakteristik af de fundne mikro organismer og kun følsomheden for nogle enkelte anti-biotika.

Endeligt svar:

Fremkommer så snart identifi kation og følsomhedsbestemmelse er afsluttet, sædvanligvis inden for 2-3 døgn.

9191

Tolkning af svarDen mikrobiologiske undersøgelse omfatter almindeligvis en bedømmelse af 1) mængden af isolerede bakterier, 2) bestemmelse af disses art (identifi kation) og evt. 3) en følsomhedsbe-stemmelse.

1. Mængden vil enten blive betegnet ved et tal ved kvantitativ dyrkning eller semi- kvantitativt som: talrige: svarer til fl ere end 105 bakterier pr. ml en del: svarer til omkring 104-105 bakterier pr. ml enkelte: svarer til 102-103 bakterier pr. ml få: svarer til færre end 10 bakterier pr. ml Disse kvantitative forhold kan kun tillægges betydning, såfremt der ikke er sket en opformering af bakterierne efter prøvtagningen.

2. Artsbestemmelse foretages i den udstrækning, laboratoriet fi nder det klinisk og videnskabeligt relevant. Ved fund, der skønnes at være forurening, anføres kun de grove mikroskopiske og makroskopiske karakteristika.

3. Følsomheden for de enkelte antibiotika (”resistensen”) er hos visse bakterier (og svampe) en ret konstant egenskab, men resistente mutanter forekommer, så resistensbe stemmelse skal udføres. Der foretages ikke en fuldstændig resistensbestemmelse på bak terier isoleret fra prøver, som laboratoriet skønner er uegnede eller udtryk for forure ning. Dette er hyppigt tilfældet for uriner og ekspektorater. I sådanne tilfælde vil svaret være betegnet med ”formentlig forurening”, ”sandsynligvis svælg fl ora”, ”bedømt efter art og mængde må fundet skønnes at være forurening fra hud eller slimhinder”.

Følsomhed in vitro over for diverse antibiotika angives som:

3 = følsom (dvs. patienten kan behandles med alm. doser). (= sensitivx).

2 = nedsat følsomhed (dvs. patienten kan behandles med stoffer, der koncentreres på infektionestedet, fx urin, eller der kan evt. behandles med forøget dosis). (= Intermediærx).

1 = relativ resistent (dvs. almen behandling kan ikke forventes at have effekt, hvorimod evt. lokalbehandling kan anvendes). (= Resistentx).

0 = total resistent (dvs. stoffet kan ikke anvendes til behandling). (= Resistentx).

x) SIR-systemet anvendes nogle steder.

Laboratorierne anvender rutinemæssigt en række antibakterielle stoffer, der medtages i føl-somhedsbestemmelsen. ønskes en resistensbestemmelse for andre antibiotika, skal det anfø-res på rekvisitionen.

Enkelte af de nedenfor nævnte bakteriologiske undersøgelser vil næppe blive foretaget i almen praksis, men er medtaget for fuldstændighedens skyld.

9292

Bloddyrkning

Prøvetagningsmateriale:

Sterile bloddyrkningskolber (leveres fra den kliniske mikrobiologiske afdeling), indehol-dende koagulationshæmmende middel.

Prøvtagningsvejledning:

Utensilier: Desinfektionsserviet med 70% isopropanol og 0,5% klorhexidin eller vattampo-ner med 2,5% jod i 70% ethanol.

1. Staseslange.2. Kanyleholder (Venoject® eller Vacutainer®.3. Kanyle eller adapter med sommerfugl 21 G.4. Prøveseddel: Bakteriologisk undersøgelse.5. Beskyttelseshadsker.

Procedure

1. Bloddyrkningen skal ligesom øvrige mikrobiologiske prøver, helst tages før indgi velse af antibiotika. Hvis patienten alligevel får antibiotika skal bloddyrkningen helst tages lige før anti biotikaindgivelse, når antibiotikakoncentrationen i blodet er lavest. Husk at anføre klokkeslæt, klinisk problemstilling og antibiotikabehandling på prøvesedlen.

2. Bloddyrkningen bør være den første af en række blodprøver, da den indre nål let kan bøjes ved at perforere hårde gummipropper og derved gå skævt ned i de følgende gummipropper. Derved kan man fejlagtigt få det indtryk, at der ikke er undertryk i fl askerne.

3. Tag snaphætterne af skruelåget og desinfi cer gummipropperne med desinfektionsserviet eller jodsprit. Lågene må ikke løsnes, da undertrykket derved udlignes og luftbårne bakterier kan suges ind.

4. Anlæg venestase og desinfi cer huden to gange.

5. Monter kanyleholderen med kanyle eller sommerfugt. Perforer derefter en perifer vene. Bloddyrkninger fra centrale venekatetre giver let anledning til en del positive svar der skyldes forurening og, ikke er udtryk for at der er bakterier i blodet. Hvis der tages bloddyrkninger gennem centrale venekatetre , skal blod og væske skylles ud før bloddyrkningen, ved anvendelse af tomt glas eller 10 ml sprøjte. Der suges 10 ml blod i hver fl aske eller en fuld 20 ml sprøjte fordeles i 2 kolber. Til svampekolben suges yderligere 10 ml blod. Bloddyrkningens effektivitet forøges med 50%, når volumen øges fra 10 til 30 ml blod per dyrkning, dvs. brug 2 sæt kolber til voksne.

6. Indfør den første fl aske i kanylebeholderen og perforer proppen. Det anbefales at fl asken holdes med bunden nedad, så man kan følge blodets indløb i fl asken. Ved frit indløb suger fl asken ca. 10 ml på ca. ½ minut.

9393

OBS! Til nyfødte og børn <1 år anvendes særlig pædiatrisk fl aske (1-3 ml blod). Efter skøn trækkes tilbage efter indløb af 1-2 ml blod. Dette tager, med frit indløb 5- 10 sek.

7. Vend fl askerne for at forhindre koagulation. Prøvesedlens 2 hvide etiketter med røde tal klistres på fl askerne. Der benyttes en separat prøveseddel og prøvenummer til svampekolben.

8. Flaskerne sættes i et varmeskab ved 35°C hurtigst muligt indenfor 2 timer.

9. Flaskerne transporteres fra varmeskabene til KMA fl ere gange dagligt.

10. Bloddyrkninger afl æses dagligt i 7 dage. Ved fund af vækst bliver dette straks med delt til afdelingen af en læge fra klinisk mikrobiologisk afdeling. Negative svar afsendes efter 7 dages inkubation. Positive svar foreligger oftest indenfor 2 døgn. Ved mistanke om endokarditis inkuberes bloddyrkningen 14 dage inden et evt. nega tivt svar afsendes.

11. Bloddyrkninger for kykobakterier udføres med specielle BACTEC-kolber, der sendes til Statens Serum Institut.

Svar:

Prøven afl æses dagligt gennem 7 døgn. Telefonsvar gives automatisk, hvis der er positivt fund. Negativ prøve bør besvares skriftligt efter 7 døgn. Identifi kation og føl som heds-bestemmelse foretages rutinemæssigt ved alle bakteriefund.

Bronchial- og trakealsekret


Sterilt prøverør til bakteriologiske undersøgelser eller sterilt trakealsugesæt.

Prøvetagningsteknik:

Sekret ophentes med kateter nedført nasalt eller ved bronkoskopi eller samtidig med sugning af trakeostomerede patienter. Bemærk at mange lokalanæstetika har anti bak teriel effekt. Der bør tages yderligere forsigtighedshensyn for at forhindre, at svælgfl ora føres ned i bronki-erne ved bronkoskopering eller kateterisering.

Svar:

Negative prøver efter 2 døgn. Identifi kation og følsomhedsbestemmelse udføres på alle iso-lerede bakterier, der formodes at have patogen betydning.

Cerebrospinal- og ventrikelvæske


Sterilt prøverør.


Aseptisk tages ca. 3 ml. Om aseptik gælder de samme forhold, som for bloddyrkning. Liquor opsamles i røret.

Transport:

Cerebrospinalvæsken indsendes hurtigst muligt.

9494

Svar:

Prøven tages i behandling straks ved modtagelsen, og resultatet af mikroskopi med deles te-lefonisk til afdelingen. Ved positivt dyrkningsfund gives umiddelbart telefonsvar til vagtha-vende læger. Negative prøver besvares skriftligt efter 2 døgn. Identifi kation og følsomheds-bestemmelse foretages rutinemæssigt ved alle bakteriefund.

Ekspektorater


Sterilt prøvetagningssæt til ekspektorat.


Prøven bør helst tages om morgenen før tandbørstning eller fødeindtagelse. Patienten skal skylle munden med vand og derefter hoste eller ”harke” ekspektoratet op i den sterile eks-pektoratkop. Hos nogle patienter kan en fysioterapeut være en hjælp ved ophost ning. Prøven må ikke være blandet med spyt eller sekret fra næse og svælg. Med ”pinden” isoleres en klat, som herefter suges op i pipetten. For at man kan få en oversigt over bakterieforekom-sten i de nedre luftveje, kan en prøve fra nasopharynx være af lige så stor værdi som et eks-pektorat. Prøver fra nasopharynx er særligt egnede, når det gælder børn.

Svar:

Negative prøver besvares efter 2 døgn. Ved bedømmelsen bør man vurdere ud fra mikrosko-pisvaret, om ekspektoratet har været blandet med svælgfl ora, og om det er velegnet ud fra cellemorfologien. Identifi kation og følsomhedsbestemmelse udføres på alle isolerede bakte-rier, der formodes at have patogen betydning.

Fæces


Sterilt prøverør (med prøvetagningsske) uden glycerintilsætning. Til undersøgelser for Sal-monella-Shigella anvendes prøvetagningsrør med glycerin. Sådanne prøver sendes til Sta-tens Seruminstituts diagnoseafdeling.


2-3 skefulde fæces overføres til prøvetagningsrøret, som lukkes godt. Hvis patienten ikke selv kan afl evere en prøve, kan prøven tages med en podepind, som føres ind i rectum og derefter ned i glasset. Er der tilsat glycerin, bør man sikre en god opblanding. NB: Prøven må ikke tages fra ”toiletfæces”.

Svar:

Negative prøver besvares efter 2 døgn, men dyrkningen fortsættes endnu 6 døgn. Identifi kation og følsomhedsbestemmelse foretages almindeligvis på alle prøver.

9595

Bestemmelse af antibiotikakoncentrationer i serum, spinalvæske el-ler anden vævsvæske


Sterilt prøverør uden tilsætning.


10 ml blod uden tilsætning eller 5 ml af anden vævsvæske føres ned i prøverøret. Til mi-kroprøver anvendes hæl- eller øreblod. På rekvisitionen skal angives dels hvilket antibioti-kum, der ønskes koncentrationsbestemt, dels den givne dosis, tidspunkt for det indgift samt tidspunktet for prøvetagningen. Desuden angives andre anti bakterielle midler, som patienten samtidigt behandles med. Uden disse oplysninger kan koncen tra tionsbestemmelse være uden mening, hvis biologisk metode anvendes. På rekvisitionen anføres tillige patientens vægt, det sidst bestemte serumkreatinin-tal og datoen for bestemmelsen.

Transport:

Prøven sendes snarest muligt til laboratoriet.

Svar:

Ringes ud og fremsendes skriftligt samme eller følgende døgn. NB: Enkelte laboratorier ud-fører analysen som hasteprøve, og svar afgives samme dag, såfremt prøven er fremme inden kl.12.

Mykologiske undersøgelserUdover undersøgelsen af gærsvampe bør det klinisk-bakteriologiske laboratoriums bruger-vejledning konfereres med henblik på prøvetagningsmateriale og prøvetagningsteknik.

Parasitologiske undersøgelserI hvert enkelt tilfælde bør man konferere det klinisk-bakteriologiske laboratoriums bruger-vejledning med henblik på prøvetagningsmateriale og prøvetagningsteknik.

malaria (Plasmodium falciparum, P.vivax, P.ovale, P.malariae)


Almindelige objektglas og kantslebne objektglas til udstrygningen. Præparater indsendes forsvarligt emballeret i objektglasæske eller plastikkapsel.


Der laves mindst 2 glas med ”tykt præparat”. En dråbe blod placeres midt på objektglasset og blodet spredes til et ca. 50-øre stort område, hvorefter præparatet lufttørres. Der fremstil-les tillige 2 almindelige blodudstrygninger, der lige ledes lufttørres. De 4 objektglas fremsendes herefter til det diagnostiske laboratorium.

Svar:

Telefonisk svar afgives samme dag.

9696

Punkturer: Pleuravæske, ascitesvæske, ledvæske etc.


Sterilt prøvetagninsrør.


Prøven tages ved punktur, hvor man skal sørge for aseptik på samme måde som ved prøven til bloddyrkning.

Svar:

Såfremt der ved straks-mikroskopi fi ndes bakterier meddeles dette telefonisk. Negative prø-ver besvares efter 2 døgn. Identifi kation og følsomhedsbestem melse foretages på alle prøver.

Pus og sårsekret


Sterilt podesæt til almindelig podning. Ved udtagning af større mængder anvendes et sterilt prøverør.


Pus eller sekret opsamles på en steril podepind, som derefter føres ned i prøve røret. Kontakt med hud og slimhinder bør videst muligt undgås. Såfremt des infi cerende midler er anvendt til lokalbehandling eller afvaskning, må prøven tages uden kontakt med disse områder. NB: Ved mistanke om Clostridium-infektion (tetanus, gasgang ræn) må dette anføres på rekvisi-tionen. Det samme gælder formodet infektion med Acti no myces.

Svar:

Negative prøver besvares efter 2 døgn. Speciel dyrkning for clostridier besvares negativt tid-ligst efter 6 døgn. Identifi kation og følsomhedsbestemmelse fore tages almindeligvis på alle prøver.

Podning fra svælg, næse og nasopharynxNB: Ved masseundersøgelser kontaktes det klinisk-bakteriologiske laboratorium inden un-dersøgelsen igangsættes.


Transportsubstrat og kulpodepinde.


Svælgprøver: Podepinden vendes og drejes mod tonsillerne specielt ind i kryp terne. Fore-kommer der belægninger, skal podepinden føres ind under disses kant.


Næseprøver: Podepinden føres ind langs næsehulens bund, hvor vattet vil opsuge slim og sekret.


Nasopharynxprøver: Tages bedst med en metalkulpodepind. Denne kan føres langs næsehu-lens bund til bageste svælgvæg, hvor den lades ligge et kort øjeblik. Indføring kan også ske gennem munden med en bøjet metalpodepind, der føres ”op” bag den bløde gane.

9797

Undersøgelser:

Ved almindelig dyrkning udføres rutinemæssig undersøgelse for potentielle patogener, fx. streptokokker incl. pneumokokker, staphylokokker, Haemophilus infl uenzae (Pfeif fer’s ba-cil) og coli-lignende bakterier, men ikke for fx Bordetella pertussis (kighoste). Såfremt der specielt ønskes undersøgt for Corynebacterium diphtheriae (difteri) etc. bedes dette anført på rekvisitionen.

Svar:

Til normal svælgfl ora regnes ved rutinemæssig undersøgelse α-streptokokker, non-hæmoly-tiske streptokokker, apatogene Gram-negative kokker, Staphy lococ cus epider midis og apato-gene Haemophilus-arter. Såfremt der er fundet svampe (Candida albicans), meddeles dette.

Urin

Prøvetagningemateriale:

Sterilt prøvetagningssæt til midtstråleurin. Ved kateterurin og ureterurin anvendes et sterilt prøverør til brug for bakteriologisk undersøgelse. Ladt urin og toileturin bør ikke anvendes til bakteriologisk undersøgelse.


Mænd: Efter aftørring af urinrørsmundingen med sterilt saltvand lades urinen, og den sidste del af strålen lades direkte ned i prøvetagningsglasset.


Kvinder: Efter aftørring af området omkring udmundingen af urethra påbegyndes vand-ladningen. Den sidste del af urinen lades direkte ned i det sterile plastikbæger. Ca. 5 ml hældes derefter over i det sterile prøverør. Der bør udvises forsigtighed for at for-hindre, at prøven blandes med fl uor vaginalis. Labia majora bør holdes adskilte medens urinen lades. Instruksen på prøve sættets indpakning læses omhyggeligt før prøve tag ning en. (Midtstråle urin = MS-urin). Kateterisation bør undgås, da man derved kan påføre patienten en urinvejs infektion.

Transport:

Prøven bør nedkøles omgående og sendes af sted snarest muligt. NB: prøven må ikke fryses. Urinen er normalt steril. Ved prøvetagningen kan der tilføres

uvedkommende bakterier, som ved længere transporttid kan resultere i høje bakterietal. Hvis transporten sker nedkølet kan en eventuel forurening bedømmes ved en kvantitativ dyrkning. Ved urinvejsinfektion overstiger bakterietallet i almindelighed 105 bakterier pr ml urin.

Undersøgelser:

Ved almindelig dyrkning udføres rutinemæssigt identifi kation og følsomhedsbestem melse af de fundne bakterier. Dette gælder for Gram-positive bakteriers vedkommende (stafylokokker og streptokokker), når der forekommer 105 bakterier pr. ml urin eller fl ere. For Gram-nega-

9898

tive stave (Escherichia, Klebsiella, Proteus og Pseudomonas), når der forekommer mere end 104 bakterier pr. ml urin. Hos patienter, der er i behandling, udføres altid følsomhedsbestem-melse uanset antallet af bakterier. Forekommer der fl ere forskellige bakteriearter, hvilket især ses efter dårlig opsamling og dårlig transport, skal man være opmærksom på, at det eventuelt kan skyldes forurening ved prøvetagningen. Undersøgelse for anaerobe bakterier og svampe udføres, hvis det er noteret på rekvisitionen.

Svar:

Ved negativt fund svares efter 1 døgn. Ved fund af bakterier svares efter 2 døgn. Forekomst af færre end 105 bakterier pr. ml urin fra patienter, som ikke bliver antibiotikabehandlede, er sædvanligvis udtryk for forurening.

Sekret fra øjne og ører


Sterilt podesæt til almindelig podning eller Stuart’s transportmedium.


Sekret eller pus opsamles med podepinden. Hvis prøven tages fra mellemøret i forbindelse med en paracentese, bør man undgå kontaminering af podepinden i den ydre øregang.

Svar:

Negative prøver besvares efter 2 døgn.

Specielle bakteriologiske undersøgelserSe brugervejledning fra den klinisk mikrobiologiske afdeling.

109109

Delkursus 3

Parasitologi

110110

Farvning af blod for malaria parasitter

Udtagning af blod

Der anvendes kapillærblod til fremstilling af blodudstrygniner. Der tages blod enten fra ørefl ip eller fi nger, f.eks. venstre langefi ngers yderside mod ringfi ngeren ud for negleroden. Efter desinfektion med alkoholvædet tampon tørres efter med ny, ren tampon for at fjerne alkoholen. Med en lancet prikkes på det udvalgte sted, og den første bloddråbe aftørres. Der laves i reglen 2 dråbepræ pa rater (tykke præparater) og 2 udstryg ningspræparater.

Dråbepræparater:

En dråbe blod fanges på et objektglas. Dråben spredes så den fylder ca. 1,5 x 1,5 cm (om-trent som en 50-øre). Undgå kraftig omrøring. Det kan udfælde fi brinet, hvilket vil genere ved den efterfølgende farvning. Præparatet lufttørres og farves uden metanol-fi xering.

Udstrygningspræparater:

På den ene halvdel af et objektglas placeres en lille dråbe blod. Et kantslebet objektglas (hjørnerne er slebet af) placeres med den korte kant på det første objektglas, foran blod-dråben i et vinkel på ca. 45°. Dette glas føres så forsigtigt tilbage mod bloddråben så dråben fanger det kantslebne glas. Herved fordeler blodet sig langt det kantslebne glas' korte kant og det kantslebne glas føres derpå i en jævn glidende bevægelse hen ad det andet objektglas. Der laves herved en fane af blod (en udstrygning), hvori tætheden af blodlegemer vil være aftagende udefter. Glasset med udstrygningen lufttørres. Tørring kan ske med hårtørre eller ved anbringelse i 37°C varmeskab. Blod tilsat antikoagulans og koaguleret fuldblod er ueg-net til præparatfremstilling. Efter lufttøring fi xeres få sekunder i metanol, hvorpå der farves.

Til desinfektion af udstrygningspræparater til malaria-diagnostik (Lassa og Ebola virus, hæmorrhagisk feber virus, hepatitis virus, HIV o.a.) kan anvendes følgende procedure: efter lufttørring og metanolfi xering anbringer præ pa ra ter ne i 10% formalin-fosfatbuffer [pH 7.2] i 15 minutter, hvorefter præparaterne neddyppes 3 gange i 1/

15 M fosfatbuffer [pH 7.2] og luft-

tørres. Præparaterne kan derefter håndteres risikofrit, herunder sendes til diagnostiske labo-ratorier.

Materialer:

a. Giemsa stamopløsning (Merck 9204)

b. Metanol analyseren

c. 1/15 M fosfatbuffer pH 7.2 KH

2PO

4 g 25.418

Na2HPO

4, 2 H

2O g 85,507

Aqua destil. ad l 10

d. formalin/fosfatbuffer pH 7.2 til desinfektion formaldehyd (Merck 3999) ml 100 1/15 M fosfatbuffer pH 7.2 ml 270

Farveprocedure:

Fixering:

Kun udstrygningspræparater fi xeres før farvning. Præparatglasset holdes skråt, og der påd-ryppes nogle få dråber ren metanol, 10 sekunders fi xering er tilstræk keligt.

111111

Fremstilling af Giemsa brugsopløsning:

Der anbringes 2 ml Giemsa-stamopl. i et 50 ml måleglas, hvorpå der fyldes op til 50 ml med 1/

15 M fosfatbuffer [pH 7.2.] Denne opløsning farver ery thro cyt ter ne lysegrå og parasit-

terne blå med rød kærne. Det er vigtigt at undgå, at der kommer vand i Giemsa-stamopl., fordi dette vil medføre en dissociering af farvestoffet og gøre opløsningen ubrugelig. Lav ny brugsopløsning dagligt. Der kan vælges fra 1% til 10% Giemsa i brugsopløsningen. Drå-bepræparater farvet med 2% Giemsa i 30 minutter giver klart røde og blå parasitter på hvid/grålig baggrund. Udstrygninger farvet med 8% Giemsa i 30 minutter giver grå erythrocytter med klart markederede Schüffner's dots og klart røde og blå parasitter. Den ovenfor nævnte 4% Giemsa brugsopløsning er udmærket til begge præparattyper. Der kan tilsættes lidt eosin til Giemsa'en (Romanowsky's farvning), det giver let orangefarvede erythro cytter. Efter henstand i farvevæsken i 30 minutter skylles forsigtigt med hanevand. Skyl på bagsiden af præparaterne for at undgå at skylle præparatet af. Der kan også skylles hanevand ned i farve-karret. Det giver ofte pænere præparater, idet småudfældninger i Giemsa opløsningen så ikke så nemt lægger sig over præparatet. Efter lufttørring kan præparatet mikroskoperes direkte med olie immersion. Gemmepræparater monteres med dækglas.

Mikroskopering:

Der mikroskoperes med 40 x og 100 x objektiver. Polarisationsudstyr letter mikro sko pe-ringen, idet pigmenter lettere kan ses. En slutforstørrelse på ca 600 x er tilstrækkeligt til at erkende parasitterne.

Morfologi i udstrygningspræparat Erythrocytter infi ceret med P.falciparum og P.malariae er ikke forstørrede og er ikke pig-menterede. Enkelte erythrocytter infi ceret med P.falciparum kan vise en svagt farvet fi n pigmentering (Maurer's clefts). Erythrocytter infi ceret med P.vivax og P.ovale er pigmente-rede (Schüffner's pletter) og er forstørrede og ofte deforme (P.vivax) eller ovale (P.ovale).Egentlige stromaforandringer i erythro cytterne forekommer ofte kun i ældre trophozoitter, schizonter og gametocytter. I blod fra patienter med P.falciparum malaria ses kun tidlige ringstadier og game tocytter.

Diagnostiske karakteristika for erythrocytter og de 4 humanpatogene Plasmodium ar-

ter i et udstrygningspræparat

P.f. P.v. P.o. P.m.

Erythrocytten

forstørret o + +/o o oval o o + o Schüffner's o + + o Maurer's + o o o multipel infektion + (+) o o

Parasitten

alle stadier i perifert blod o + + + store ringe o + + + dobbelt ringe + (+) o o accolé form + (+) o o bånd-form o o o + antal merozoitter i schizonter 8-24 12-24 8-12 8-12 gameter seglform + o o o

112112

Differentiering af P.falciparum fra de 3 øvrige arter (sml. tabel):

Kun små og spinkle ringformer observeres ved P.f.. Monofasisk parasitæmi (falciparum) er sjældent forekommende hos de 3 andre arter.

Mange ringformer pr synsfelt (mere end 5-10).Erythrocytter med 2 ringformer ses hyppigt hos P.f., men er sjældent forekommende hos de 3 andre arter.

Ældre trophozoitter (”fl eshy rings”) ses almindeligt ved P.falciparum infektioner, men er sjældent forekommende hos de 3 andre. Disse ældre trophozoitter kan forveksles med unge trophozoitter af de 3 andre arter. Med polariseret lys kan et eller fl ere fi ne pigmentkorn de-monstreres i parasittens cytoplasma. Ved P.falciparum infektioner kan erythrocytterne inde-holde Maurer's pletter. Det er 5-10 ret grove, mørke pletter i stro maet. De er lette at kende fra de mere talrige og mere farvbare Schüffner's pletter.

De efterfølgende stadier af P.falciparum i erythrocytterne kan ikke ses i det perifere blod (med undtagelse af de seglformede gameter). Disse stadier forekommer i erythrocytter i de centrale organers kapillærer (f.eks. hjerne, lunger, nyrer). Kun ved meget kraftig para sitæmi kan der observeres trophozoitter og schi zon ter i det perifere blod. Så er prog nosen yderst dårlig, og patienten formentlig døende.

Gametocytstadiet for P.falciparum er let genkendeligt. Gameterne er pølseformede, let krumme og er ca. 2 gange erythrocytterne diameter i længde. Der ligger ofte rester af ery-throcytten i parasittens konkavitet. Centralt i gameterne er der kromatinkorn til dels over-lejret af mørke, riskornslignende pigment granula, der lyser meget kraftigt i polariseret lys. Fund af gameter viser, at patienten har haft malaria i mindst 1 uge inden prøv tagningen. Ga-meterne påvirkes ikke af klorokin, så de kan være eneste parasitform i fl ere uger efter terapi med klorokin. De kræver ikke speciel behandling, idet de kun destruerer den erythrocyt, hvori de forekommer, og de dør ud af sig selv.

Morfologi i dråbepræparatErythrocytterne hæmolyseres under farveproceduren. Parasitterne er fritliggen de. Ved P.vivax og P.ovale infektioner kan man se parasitterne omgivet af små rødbrune punkter, rester af Schüffner's pletter. Deres tilstedeværelse dif fe ren tierer disse arter fra P.malariae.Maurer's pletter ses aldrig i dråbepræparater.

1. P. falciparum:

Tidlig trophozoit:

Små og mange ringe med enkel eller dobbel kærne, accolé-form, 1/2-mågeform (ofte den ene-

ste synlige form). Der kan være enkelte gameter.

Ældre trophozoit (pigment kan ses i polariseret lys):

Ses kun i det perifere blod ved svære infektioner.

Tidlig Schizonter (pre-segmenter cells):

Ses sjældent i det perifere blod, men er de tilstede ses ofte også talrige typiske ringformer. De er uregelmæssige, kompakte, mørktfarvede, og pigmentet er fusioneret til en enkelt masse.

113113

Moden Schizonter (segmenter cells):

Er meget sjældne i det perifere blod. De rummer 12-24 eller fl ere merozoitter, der ligger til-fældigt spredt eller samlet i en eller fl ere grupper. Pigmentet er samlet i en masse.

Gametocytter:

Seglformede. De hunlige gameter er længere og slankere end de hanlige gameter og har cen-tralt stillet kromatin og pigment. De hanlige gameter er blegere end de hunlig gameter og har spredt kromatin og pigment. De kan rumme grovere pigmentkorn.

OBS:

Er præparatet tørret langsomt, kan gameterne blive runde, og sådanne gameter kan ligne schizonter eller P.malaria gameter.

Ved svære infektioner med P.falciparum ses mononukleære celler med fagocyteret pig-ment fra schizonter. Sådanne kan tillige ses i udstrygningspræparater.

2. P. vivax og P. ovale:

Tidlige trophozoitter:

Ret mange ringformer med uregelmæssigt cytoplasma, og der er ofte andre stadier tillige.

Sene trophozoitter:

Med spredt og uregelmæssigt cytoplasma. Kromatinkorn ligger isoleret. Pigmentet er granu-leret og jævnt spredt. Schüffner's pletter ses som en lyserød granuleret halo.

Schizonter (tidlige, pre-segmenter cells):

Meget cytoplasma, kromatinet har påbegyndt segmentering. Pigmentgranula mest spredt men lettere koncentraring i et eller to områder. Schüffner's pletter perifert i erythrocytten.

Sene schizonter (segmenter cells):

Der er i reglen 12-14 (8-16) ret store merozoitter.

Gameter:

Runde eller ovale med ret ensartet cytoplasma. Der er meget kromatin, og det er mere diffust i hanlige gameter.

114114

3. P. malariae:

Tidlig trophozoit:

der er få, og der kan være segmenter cells samtidig. De kan ligge karakteristisk ”ækvatori-alt”, som såkaldte båndformer.

Sen trophozoit:

Der er få med et rundt og noget kompakt cytoplasma, der næsten skygger helt for kromati-net. Der er rigeligt med pigment, og det ligger spredt.

Tidlig schizont (pre-segmenter cells):

Små. Begyndende segmentering af kromatinet. Pigmentet samlet i små granula.

Sen schizont (segmenter cells):

Indeholder i reglen 8-12 merozoitter med kraftig, rødlig kromatin. Der er tidlig vaku ole-dannelse. Pigmentet er samlet i kompakte klumper af granula.

Gameter:

Runde og kompakte med rigeligt perifert pigment i runde granula. Kromatinet er ofte skjult, men er i hunlige gameter mere samlet end i hanlige gameter.

Documents

mirkobiologi øv