Modelo bioinformático para predecir la resistencia a

Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir

del genoma de una Bacteria

Hermes Pérez Cardona

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería de Sistemas e Industrial

Bogotá D.C., Colombia

2017

Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir

del genoma de una Bacteria

Hermes Pérez Cardona

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de:

Magister en Bioinformática

Director (a):

PhD., Emiliano Barreto Hernández

Línea de Investigación:

Tecnologías computacionales en Bioinformática

Grupo de Investigación:

Bioinformática Instituto de Biotecnología

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería de Sistemas e Industrial

Bogotá D.C., Colombia

2017

Resumen y Abstract V

Resumen

La OMS publicó este año un estudio multicriterio con un grupo de expertos

multidisciplinario para obtener una lista de patógenos de prioridad global resistentes a

antibióticos, situando a Acinetobacter baumannii en un nivel crítico. Dentro de las

estrategias en las ciencias de la computación se necesitan avances en cuanto al

diagnóstico, detección y reporte de la resistencia a antibióticos. En el presente proyecto

de grado se diseñó e implemento un sistema de información para la identificación de

elementos genómicos asociados a los mecanismos de resistencia, permitiendo la

predicción de un perfil de resistencia obtenido por WGS para A. baumannii, estableciendo

un modelo de correlación entre los elementos genómicos asociados a la resistencia y el

perfil fenotípico de resistencia. El Instituto Nacional de Salud suministró 89 muestras

positivamente identificadas de A. baumannii, con sus respectivos antibiogramas, obtenidos

por el método Kirby Bauer para las clases de antibióticos principales, adicionalmente se

realizó algunos antibiogramas con los sistemas automatizados Vitek2 y Phoenix100. El

sistema facilitó la información para depuración de las incongruencias en los perfiles

fenotípicos. El sistema hace uso de MySQL como motor de base de datos, scripts en

lenguaje Python y visualización de perfiles en tecnología D3.js. Este sistema requiere una

anotación del genoma, utilizando una modificación propia del software Prokka. La base de

datos actualmente posee 2317 genes, 297 son de A. baumannii o el complejo

Acinetobacter, también posee 170 modelos ocultos de Markov con función de resistencia

a antibióticos. Se definieron 5 principales reglas de negocio para obtener los perfiles

genómicos de resistencia a antibióticos. El sistema luego de algunos ajustes dados por las

comparaciones entre perfiles tiene el potencial para predecir con una buena aproximación

la resistencia a los antibióticos en A. baumannii, con la facilidad de ser escalable y

extrapolable a otras especies.

Palabras clave: Acinetobacter baumannii, perfiles de resistencia, modelo

bioinformático, mecanismos de resistencia, genes de resistencia.

VI Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del genoma

de una Bacteria

Abstract

WHO published this year a multicriteria study with a group of multidisciplinary experts in

order to obtain a list of antibiotic-resistant global priority pathogens, placing Acinetobacter

baumannii at a critical level. Within the strategies in the computer sciences advances are

needed in the diagnosis, detection and reporting of antibiotic resistance. In the present

project, an information system was designed and implemented for the identification of

genomic elements associated to the resistance mechanisms, allowing the prediction of a

resistance profile obtained by WGS for A. baumannii, establishing a model of correlation

between the Genomic elements associated with resistance and the phenotypic profile of

resistance. The National Health Institute supplied 89 positively identified isolates of A.

baumannii, with their respective antibiograms, obtained by Kirby Bauer method for the main

antibiotic classes, some antibiograms were also performed with Vitek2 and Phoenix100

automated systems. The system provided information in order to remove of the

incongruities in the phenotypic profiles. The system uses MySQL as a database engine,

Python scripts and profile visualization in D3.js technology. This system requires a genome

annotation, using a proprietary modification of Prokka software. The database currently has

2317 genes, 297 are of A. baumannii or the Acinetobacter complex, it also has 170 hidden

Markov models with antibiotic resistance function. Five main business rules were defined

in order to get the genomic profiles of antibiotic resistance. The system after some

adjustments given by the comparisons between profiles has the potential to predict with a

good approximation antibiotic resistance in A. baumannii, with the ease of being scalable

and extrapolable to other species.

Keywords: Acinetobacter baumannii, resistance profiles, bioinformatic model,

resistance mechanisms, resistance genes

Contenido VII

Contenido

Pág.

Resumen .............................................................................................................................. V

Lista de figuras ................................................................................................................... X

Lista de tablas .................................................................................................................... XI

Lista de Símbolos y abreviaturas .................................................................................. XIII

Introducción ........................................................................................................................ 1

1. Estado del arte ............................................................................................................. 5 1.1 Resistencia ............................................................................................................. 5

1.1.1 El problema y un camino .................................................................................... 6 1.2 Acinetobacter baumanni ........................................................................................ 7

1.2.1 Importancia Clínica ............................................................................................. 8 1.2.2 Plasticidad del genoma ...................................................................................... 9 1.2.3 Tratamiento ....................................................................................................... 10

1.3 Mecanismos de resistencia .................................................................................. 11 1.3.1 Modificación genética de genes endógenos o Mutación genética .................. 11 1.3.2 Transferencia horizontal de genes ................................................................... 12 1.3.3 Otros mecanismos de HGT .............................................................................. 13

1.4 Mecanismos de resistencia en A. baumannii ...................................................... 13 1.4.1 Mecanismos de resistencia intrínsecos ........................................................... 14 1.4.2 Mecanismos de resistencia adquiridos ............................................................ 14

1.5 Perfiles fenotípicos de resistencia – Antibiograma .............................................. 18 1.5.1 Métodos de difusión ......................................................................................... 18 1.5.2 Métodos de dilución .......................................................................................... 20 1.5.3 Otros métodos .................................................................................................. 20 1.5.4 Los sistemas automatizados ............................................................................ 24 1.5.5 Microarreglos y técnicas moleculares .............................................................. 26 1.5.6 Secuenciación del genoma completo .............................................................. 27

1.6 Aplicaciones y bases de datos sobre resistencia a antibióticos ......................... 28 1.6.1 Bases de datos Activas .................................................................................... 29 1.6.2 Bases de datos No Activas .............................................................................. 33 1.6.3 Otras herramientas ........................................................................................... 36

2. Objetivos .................................................................................................................... 38 2.1 General ................................................................................................................. 38 2.2 Específicos ........................................................................................................... 38

VIII Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del

genoma de una Bacteria

3. Metodología ................................................................................................................ 39

3.1 Obtención de los datos ........................................................................................ 39 3.1.1 Clasificación de los antibióticos ....................................................................... 40 3.1.2 Extracción de ADN ........................................................................................... 41 3.1.3 Secuenciación .................................................................................................. 42 3.1.4 Análisis de calidad, Ajuste de calidad y Ensamblaje ....................................... 42 3.1.5 Anotación .......................................................................................................... 43

3.2 Documentación de la base de datos ................................................................... 45 3.2.1 Perfiles de Resistencia Fenotípica ................................................................... 45 3.2.2 Datos moleculares sumistrados por el INS ...................................................... 52 3.2.3 Reglas pasivas de resistencia y Perfil de resistencia genómica. .................... 54 3.2.4 Metadatos de la base de datos CARD y Resfams .......................................... 69 3.2.5 Persistencia datos bibliográficos ...................................................................... 72 3.2.6 Lectura de los genomas ensamblados ............................................................ 73

3.3 Clasificación de β-lactamasas orientada a la resistencia.................................... 75 3.4 Reglas de negocio para la obtención teórica de la resistencia genómica .......... 82

3.4.1 Primera Regla ................................................................................................... 83 3.4.2 Segunda Regla ................................................................................................. 86 3.4.3 Tercera regla .................................................................................................... 87 3.4.4 Cuarta Regla ..................................................................................................... 89 3.4.5 Quinta Regla ..................................................................................................... 90

3.5 Determinación a los perfiles de resistencia Fenotípicos ..................................... 92 3.6 Desarrollo de la aplicación ................................................................................... 93

3.6.1 Scripts adicionales ............................................................................................ 97

4. Resultados y Discusión ............................................................................................ 99 4.1 Resultados............................................................................................................ 99

4.1.1 Datos en la tecera regla ................................................................................... 99 4.1.2 Datos en la tecera regla ................................................................................. 101 4.1.3 Perfiles fenotípicos de resistencia .................................................................. 101 4.1.4 Perfiles genotípicos de resistencia................................................................. 103 4.1.5 Comparación de los perfiles genómicos y fenotípicos .................................. 107 4.1.6 Visulización de la comparación de los perfiles genotípicos y fenotípicos ..... 112 4.1.7 Calculo de precisión y análisis del perfil genómico de resistencia ................ 115

4.2 Discusión de resultados ..................................................................................... 116 4.2.1 Monobactams ................................................................................................. 116 4.2.2 Aminoglycosides ............................................................................................. 117 4.2.3 Carbapenem ................................................................................................... 119 4.2.4 Polymyxins ...................................................................................................... 120 4.2.5 Cephalosporin Ic ............................................................................................. 121 4.2.6 Cephalosporin IIIc ........................................................................................... 122 4.2.7 Cephalosporin IVc .......................................................................................... 123 4.2.8 Fluoroquinolone .............................................................................................. 124 4.2.9 Folate pathway inhibitors ................................................................................ 125 4.2.10 Glycylcyclines ................................................................................................. 126 4.2.11 b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations ............................................... 126 4.2.12 Precisión del perfil genotípico ........................................................................ 127

5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 131 5.1 Conclusiones ...................................................................................................... 131

Contenido IX

5.2 Recomendaciones ............................................................................................. 131

Bibliografía ........................................................................................................................ 133

Contenido X

Lista de figuras

Pág.

Figura 3-1: Diagrama E-R sobre resistencia fenotípica .............................................. 47

Figura 3-2: Diagrama E-R para genes identificados por PCR .................................... 52

Figura 3-3: Diagrama E-R para el perfil genómico de resistencia .............................. 55

Figura 3-4: Diagrama E-R para Metadatos de la base de datos CARD y ResFams. 69

Figura 3-5: Diagrama E-R para la bibliografía ............................................................ 72

Figura 3-6: Diagrama E-R para aplicación “LecturaEnsamblados” V.2.0.1 ............... 75

Figura 3-7: Tablas que asocian los genes con la resistencia a los antibióticos ......... 76

Figura 3-8: Tablas que asocian los genes que codifican β-lactamasas con la

resistencia a antibióticos. .................................................................................................... 77

Figura 3-9: Algunas bombas eflujo tipo RND para A. baumannii ............................... 88

Figura 3-10: Diagrama de flujo global del pipeline de la aplicación ............................. 94

Figura 3-11: Diagrama de flujo macro Bombas Eflujo tipo RND .................................. 97

Figura 4-1: Comparación perfiles de resistencia para RA121 ...................................... 114

Figura 4-2: Comparación perfiles de resistencia para RB67 ........................................ 114

Contenido XI

Lista de tablas

Pág.

Tabla 3-1: Descripción del catálogo antibiotico ............................................................. 47

Tabla 3-2: Descripción del catálogo clsi-antibiotico....................................................... 48

Tabla 3-3: Descripción del catálogo sigla_antibiotico ................................................... 48

Tabla 3-4: Descripción del catálogo equipo................................................................... 49

Tabla 3-5: Descripción del catálogo interpretacion ....................................................... 49

Tabla 3-6: Descripción del catálogo nivel_antiobiotico ................................................. 49

Tabla 3-7: Descripción del catálogo relacion_orden ..................................................... 50

Tabla 3-8: Descripción de la tabla resistencia_fenotipica ............................................. 50

Tabla 3-9: Descripción del catálogo mdrxdrpdr_antibiotico .......................................... 51

Tabla 3-10: Descripción de la tabla resistencia_fenotipica_consolidado .................... 51

Tabla 3-11: Descripción del catálogo estado_edta_pcr ............................................... 53

Tabla 3-12: Descripción del catálogo estado_edta_pcr ............................................... 53

Tabla 3-13: Descripción de la tabla gen_fenotipico ..................................................... 53

Tabla 3-14: Descripción del catálogo mecanismo_resistencia .................................... 56

Tabla 3-15: Descripción de la tabla gen_mecanismo_resistencia .............................. 56

Tabla 3-16: Descripción del catálogo gen_resistencia ................................................ 57

Tabla 3-17: Descripción de la tabla resistencia_genomica1 ....................................... 58

Tabla 3-18: Descripción de la tabla gen_antibiotico_resistencia................................. 59

Tabla 3-19: Descripción del catálogo correspondencia_antibiotico ............................ 60

Tabla 3-20: Decripción de la tabla gen_operon_resistencia ....................................... 61

Tabla 3-21: Descripción del catálogo operon_resistencia ........................................... 61

Tabla 3-22: Descripción de la tabla bombas_rnd_antibiotico ...................................... 62

Tabla 3-23: Descripción de la tabla bombas_rnd ........................................................ 62

Tabla 3-24: Descripción de la tabla mutación_gen_resistencia .................................. 63

Tabla 3-25: Descripción de la tabla mutación_resistencia .......................................... 64

Tabla 3-26: Descripción del catalogo blactam_clase .................................................. 64

Tabla 3-27: Descripción del catálogo blactam_grupo .................................................. 65

Tabla 3-28: Descripción de la tabla blactam_grupo_gen ............................................ 65

Tabla 3-29: Descripción de la tabla blactam_grupo_antibiotico .................................. 66

Tabla 3-30: Descripción del catálogo fuente ................................................................ 67

Tabla 3-31: Descripción de la tabla perfil_resistencia_genomica1 ............................. 67

Tabla 3-32: Descripción de la tabla perfil_genomico ................................................... 68

Tabla 3-33: Descripción tabla metadata CARD, aro_categories ................................. 70

Tabla 3-34: Descripción tabla resfams_metadata ....................................................... 70

XII Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del


Tabla 3-35: Descripción del catálogo bibliografia ........................................................ 72

Tabla 3-36: Descripción de la tabla bibliografia_tablas ............................................... 73

Tabla 3-37: Agrupación Consolidada para β-lactamasas ............................................ 78

Tabla 3-38: Asignación de genes a los grupos de β-lactamasas por excepción. ....... 81

Tabla 3-39: Jerarquía de los antibióticos base para A.baumannii dada por el INS .... 84

Tabla 3-40: β-lactamasas que pertenecen a la agrupación en segundo nivel. ........... 85

Tabla 4-1: Categorías y agentes antimicrobianos usados para definir MDR, XDR y

PDR en Acinetobacter spp. En las 89 muestras del proyecto ......................................... 101

Tabla 4-2: Agrupación de la cantidad de muestras según antibiograma consolidado 103

Tabla 4-3: Cantidad total de genes encontrados en las 89 muestras según el

mecanismo de resistencia ................................................................................................ 104

Tabla 4-4: Antibióticos y clases por tipos de Bomba eflujo RND ................................ 105

Tabla 4-5: Cantidad de genes por antibiótico y clases ................................................ 106

Tabla 4-6: Relación entre clases y sub clases de los perfiles Fenotípicos y Genómicos

109

Tabla 4-7: Muestras con Incongruencias por clase en el perfil fenotípico .................. 110

Tabla 4-8: Detalle de incongruencias y ajustes. .......................................................... 110

Tabla 4-9: Porcentaje de correspondencia entre perfiles por cada muestra .............. 128

Contenido XIII

Lista de Símbolos y abreviaturas

Abreviaturas Abreviatura Término

ADC Acinetobacter-derived cephalosporinase ESAC extended-spectrum AmpC HGT horizontal gene transfer OMPs outer membrane proteins PBPs penicillin binding protein ABC ATP-binding cassette SMR small multidrug resistance MATE multidrug and toxic compound extrusion MFS major facilitator superfamily RND resistance-nodulation-cell division CraA chloramphenicol resistance Acinetobacter AMR antimicrobial resistance ARO Antibiotic Resistance Ontology MLST Multilocus sequence typing HMMs Hidden Markov Models IDSA Infectious Diseases Society of America UCI unidades de cuidado intensivo IS secuencias de inserción CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CMI Concentración inhibitoria minima CMB Concentración minima bactericida

EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

ATP adenosín trifosfato WGS Whole genome sequencing MLST Multilocus sequence typing SNP Nucleotide Polymorphism MDR Multiple drug resistance XDR Extensively drug-resistant PDR pandrug-resistant INS Instituto Nacional de Salud RND resistance-nodulation-cell division HTML HyperText Markup Language SVG Scalable Vector Graphics CSS Cascading Style Sheets DOM Document Object Model HTML HyperText Markup Language SVG Scalable Vector Graphics CSS Cascading Style Sheets DOM Document Object Model

Introducción

Las infecciones son la mayor causa de enfermedades humanas, de perdida de cultivos y

de perdidas sobre las poblaciones de animales, por lo tanto, causan un inmenso daño a la

economía mundial, además se espera que las enfermedades infecciosas se incrementen

conectadas con el calentamiento global. (MCDERMOTT et al., 2012). Se estima que a

menos que se tomen medidas, las infecciones por resistencia a los medicamentos podrían

causar la muerte de más de 10 millones de personas por año para el 2050 y que, de esta

manera, se produciría un aumento tangencial del valor de los tratamientos. (Review on

Antimicrobial Resistance, 2014)

Acinetobacter baumannii es un cocobacilo gram negativo, patógeno oportunista que es

responsable entre un 2 al 10% de todas las infecciones en hospitales. Esta bacteria es

clasificada por la sociedad americana de enfermedades infecciosas, como una de los seis

microorganismos más importantes alrededor del mundo en cuanto a resistencia a múltiples

medicamentos. Las infecciones más comunes ocasionadas por Acinetobacter incluyen

neumonías, infecciones en tejidos blandos, tracto urinario, meningitis secundarias y

bacteremia; generalmente asociadas a ventiladores, uso de catéteres y heridas (Antunes

et al., 2014)

Aún existen causas para el optimismo tales como los avances en genética, genómica y

ciencias de la computación que cambiarán la forma en que las infecciones y nuevos tipos

de resistencia son diagnosticados, detectados y reportados en todo el mundo (Review on

Antimicrobial Resistance, 2014), Esta es precisamente el área de aplicación del presente

proyecto de grado.

El presente proyecto brinda la posibilidad de aprovechar la oportunidad actual en la

genómica clínica personalizada, para interactuar con las tecnologías recientemente

existentes, en la identificación de objetivos importantes para el diagnóstico.

2 Introducción

El enfoque de este proyecto según lo extraído en la literatura sobre los elementos

genómicos asociados a los mecanismos de resistencia a antibióticos. Permite desarrollar

un modelo teórico encontrando la forma de relacionar y unificar toda esta información que

se encuentra en muchos casos descrita y evaluada de diferentes formas según cada autor.

Se debe crear entonces un modelo de convergencia para la extensa cantidad de datos que

actualmente se puede encontrar.

El sistema construido se basa en la hipótesis que con toda esta información genómica de

resistencia seleccionada, evaluada e implementada según lo extraído de la literatura, es

posible construir un modelo bioinformático que permita predecir la resistencia a los

antibióticos, adicionalmente comparando los perfiles genómicos de resistencia contra los

perfiles fenotípicos de resistencia, debe ser posible afinar, corregir y posteriormente

actualizar el modelo para que sus resultados lleguen a tener una buena aproximación al

comportamiento real sobre la resistencia antimicrobial.

El presente proyecto nos aporta una base teórica actualizada sobre algunos de los

elementos genómicos que están involucrados en los mecanismos de resistencia, además

de proveer una base de datos, robusta, escalable y extrapolable a otras futuras

investigaciones relacionadas con este tema. Potencialmente también sugiere formas de

visualización de los datos que va de la mano con los avances de la tecnología.

Para desarrollar el presente proyecto se inicia haciendo la evaluación de los elementos

genómicos de resistencia desde el nivel de los aminoácidos que conforman un elemento

genómico (no desde los nucleótidos), por lo cual se requieren un máximo control en los

procesos de ensamblaje y anotación, pero aún más en proceso de anotación de los

genomas, este paso es de suma importancia. Para luego pasar a evaluarlo teóricamente

bajo un completo análisis de la literatura sobre este tema, y así diseñar por capas un

producto que permita satisfacer las aspiraciones y pretensiones de este proyecto.

Este proyecto requirió un esfuerzo entre el instituto nacional de salud y los grupos de

Bioinformática y epidemiología molecular del instituto de Biotecnología de la universidad

Nacional de Colombia - sede Bogotá, para inicialmente aislar muestras hospitalarias en

Colombia de Acinetobacter baumannii, extraer su genoma y secuenciarlo. Además,

proveyendo los perfiles fenotípicos de resistencia bajo el método de difusión Kirby Bouer y

Introducción 3

2 sistemas automatizados, para posteriormente depurar las incongruencias, generando así

datos de buena calidad como insumos para este proyecto.

Luego de los análisis sobre las comparaciones entre perfiles este proyecto y su posterior

actualización, el sistema está en la capacidad de proveer información confiable en un

tiempo reducido, sobre la resistencia a antibióticos, especialmente para las clases y

subclases de antibióticos que fue posible comparar. Adicionalmente la información que

genera servirá para el posterior seguimiento y control sobre este patógeno en Colombia y

alrededor del mundo.

1. Estado del arte

1.1 Resistencia

¿Qué es resistencia? dentro del contexto de la salud. El centro de prevención y control de

la enfermedades (siglas en inglés, CDC, Centers for Disease Control and Prevention)

define resistencia como “la habilidad de las bacterias u otros microorganismos a resistir los

efectos de un antibiótico, La resistencia a antibióticos ocurre cuando la bacteria cambia de

alguna forma que reduce o elimina la efectividad del medicamento, la bacteria sobrevive y

continúa multiplicando causando más daño” (International Federation of Pharmaceutical

Manufacturers & Associations, 2015).

La introducción de los fármacos antimicrobianos en la medicina proporcionó la esperanza

para un futuro en el cual todas las enfermedades infecciosas pudieran ser controladas.

Décadas más tarde se tuvo la certeza que este no iba a ser el caso (Fernández et al.,

2011).

El fenómeno de la resistencia a los antibióticos precede al uso de estos compuestos en un

contexto clínico, este no es sorprendente considerando que los compuestos son

omnipresentes en la naturaleza. Por ejemplo, los estudios filogenéticos indican que las β-

lactamasas, el principal mecanismo de resistencia a los antibióticos β-lactámicos, se

originaron hace más de 2 mil millones de años. Sin embargo, sólo después de la

introducción de los antimicrobianos como terapia contra las enfermedades infecciosas, fue

que las bacterias comenzaron a experimentar una evolución acelerada que condujo a la

aparición y la transferencia de mecanismos de resistencia que afectan a la mayoría, si no

es que a todos los antibióticos disponibles en la actualidad (Fernández et al., 2011).

6 Modelo bioinformático para predecir la resistencia a antibióticos a partir del


1.1.1 El problema y un camino

Se estimó en un primer informe, publicado en diciembre de 2014, que en total unas 700.000

personas mueren cada año a partir de cepas resistentes a los fármacos por infecciones

bacterianas comunes, el VIH, la tuberculosis y la malaria. Este número es probable que

este subestimado debido a la mala información y vigilancia. Casi 200.000 personas mueren

cada año de tuberculosis multirresistente y extremadamente resistente. En la India, las

infecciones neonatales resistentes a los antibióticos causan cada año la muerte de casi

60.000 recién nacidos. El número total de muertes según esta escala es más de un millón

de personas que han perdido la vida por infecciones resistentes a los medicamentos en

los 19 meses desde la publicación del primer informe (Review on Antimicrobial Resistance,

2016).

Sobre la base de los escenarios de aumento de la resistencia a los medicamentos para

seis patógenos a 2050, se estima que a menos que se tomen medidas, la carga de muertes

por AMR (antimicrobial resistance, o resistencia a antibióticos) podría elevarse a 10

millones de vidas cada año en 2050, a un costo acumulado en la economía mundial de

100 billones de USD. Sobre esta base, en 2050, el número de muertos podría ser una

persona cada tres segundos (Review on Antimicrobial Resistance, 2016).

La organización mundial de la salud definió una lista que se desarrolló en colaboración con

la División de Enfermedades Infecciosas de la Universidad de Tübingen, Alemania,

utilizando una técnica de análisis de decisiones multicriterio, examinada por un grupo

multidisciplinario de expertos internacionales. Los criterios para la selección de patógenos

en la lista son: que tan mortales son las infecciones que causan; si su tratamiento requiere

largas estancias en el hospital; con qué frecuencia son resistentes a los antibióticos

existentes cuando las personas en las comunidades los capturan; la facilidad con que se

propagan entre animales, de animales a humanos y de persona a persona; si pueden

prevenirse (por ejemplo, mediante una buena higiene y vacunación); cuántas opciones de

tratamiento continúan funcionando; y si los nuevos antibióticos para tratarlos ya están en

el conducto de investigación y desarrollo (World Health Organization, 2017).

Capitulo 1 7

Los expertos acordaron agrupar los patógenos según las especies y el tipo de resistencia

y luego estratificar los resultados en tres niveles de prioridad: crítico, alto y medio.

Patógenos prioridad 1, nivel crítico: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa,

Enterobacteriaceae; Patógenos prioridad 2, nivel alto: Enterococcus faecium,

Staphylococcus aureus, Helicobacter pylori, Campylobacter, Salmonella spp., Neisseria

gonorrhoeae; Patógenos prioridad 2, nivel medio: Streptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenzae, Shigella spp (World Health Organization, 2017).

Aún existen causas para el optimismo tales como los avances en genética, genómica y

ciencias de la computación que cambiarán la forma en que las infecciones y nuevos tipos

de resistencia son diagnosticados, detectados y reportados en todo el mundo, para que

podamos luchar más rápido cuando las bacterias evolucionan resistiendo a los

medicamentos. Estos mismos avances tecnológicos ofrecerán en el futuro herramientas

diagnósticas rápidas que mejorarán con el tiempo el uso de antibióticos. Por lo tanto, se

tendrá en el mercado nuevos y más rápidos puntos de diagnóstico (Review on

Antimicrobial Resistance, 2014). Esta es precisamente el área de aplicación de la presente

tesis de maestría.

1.2 Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii es un cocobacilo gram negativo, no fermentador, aerobio estricto,

catalasa positivo y oxidasa negativo. Es una bacteria patógena oportunista que es

responsable entre un 2 al 10% de todas las infecciones en hospitales causadas por

bacterias gram negativas. Acinetobacter baumannii es clasificada por la sociedad

americana de enfermedades infecciosas (siglas en inglés, IDSA. Infectious Diseases

Society of America) como uno de los seis microorganismos más importantes alrededor del

mundo en cuanto a resistencia a múltiples medicamentos (MDR, por sus siglas en inglés

Multidrug resistant) (Antunes et al., 2014).

La especie Acinetobacter baumannii no fue designada formalmente sino hasta el año 1986

(Bouvet and Grimont, 1986). Por consecuencia la interpretación en la literatura médica

científica de las infecciones que fueron causadas por este microorganismo en tiempos

anteriores es difícil de identificar. Aparentemente las infecciones causadas por organismos

ahora clasificados como A. baumannii se convirtieron en un problema significativo durante



la década de los 70’s (Bergogne-Bérézin and Towner, 1996), ya que desde entonces, A.

baumannii gradualmente ha incrementado su importancia como organismo patógeno,

principalmente pero no exclusivamente en los ambientes hospitalarios.

Se debe considerar que la naturaleza del huésped (pacientes humanos) ha jugado un

importante rol en el resultado de las infecciones causadas por A. baumannii y el incremento

en la resistencia a los antibióticos, asociado a los avances en la medicina que han

involucrado un mayor uso de antibióticos altamente selectivos. (Antunes et al., 2014)

1.2.1 Importancia Clínica

Acinetobacter baumannii coloniza e infecta pacientes hospitalizados en estado crítico o

debilitados por sus comorbilidades, siendo una bacteria común en unidades de cuidado

intensivo (UCI) y unidades de quemados.

A. baumannii es una de las bacterias más frecuentes en brotes de infección

intrahospitalaria por su capacidad de adherencia y persistencia en equipos biomédicos,

teclados, cortinas e incluso teléfonos celulares de los trabajadores de salud, siendo

resistente a agentes antimicrobianos, incluso a desinfectantes (Morgan et al., 2010).

Adicionalmente, su alta capacidad para desarrollar resistencia a los antibióticos, hace de

esta genoespecie un agente causal de diversas infecciones intrahospitalarias y elevadas

tasas de mortalidad (Torres et al., 2010).

Un estudio realizado en la unidad de cuidados intensivos del centro medio de la universidad

de Maryland en 2008, reveló que después de 199 interacciones entre personal de la salud

y pacientes colonizados o infectados con A. baumannii multirresistente, 38,7% de los

guantes o batas del personal de la salud resultaron contaminados y 4,5% de ellos

presentaron contaminación en sus manos después de la remoción de los guantes

desechables (Morgan et al., 2010). Estos porcentajes son elevados si se comparan con

otros microorganismos de importancia clínica como Pseudomonas aeruginosa que solo se

presentó en el 8,2% de las batas y guantes del personal de salud. Otro estudio en la

Universidad de Buenos Aires, realizado durante un brote, encontró que A. baumannii podía

Capitulo 1 9

ser recuperado de la cama de pacientes infectados hasta nueve días después del alta

hospitalaria, lo que demuestra la habilidad de esta bacteria para sobrevivir por largo tiempo

en superficies inanimadas (Catalano et al., 1999).

En el medio hospitalario A. baumannii origina diversidad de cuadros clínicos, incluyendo

infecciones en la piel y tejidos blandos, tracto urinario y meningitis secundaria. Sin

embargo, los tipos de infecciones más importantes con la mayor tasa de mortalidad son la

neumonía asociada a ventilador e infecciones del torrente sanguíneo. Esta bacteria puede

entrar fácilmente al cuerpo a través de heridas abiertas, catéteres intravasculares y

ventiladores mecánicos. Las infecciones causadas por A. baumannii son particularmente

asociadas con periodos extendidos de hospitalización, principalmente en adultos mayores

del género masculino (Antunes et al., 2014).

Un fenómeno relativamente reciente ha sido asociado con A. baumannii por infecciones

posteriores a lesiones en zonas de conflicto por ejemplo en Iraq y Afganistán, o tras

desastres naturales tal como el terremoto de Marmara en Turquía. Hay evidencia de que

el uso de morfina, la cual se administra después de las lesiones en el campo de batalla o

en lesiones por aplastamiento, podría potencializar las infecciones por A. baumannii, tal

vez como resultado de su efecto inmunosupresor (Antunes et al., 2014).

1.2.2 Plasticidad del genoma

Probablemente una de las características más intrigantes de A. baumannii es su capacidad

para adquirir, retener y diseminar múltiples mecanismos de resistencia que, combinados

con su capacidad para sobrevivir a la desecación, así como, a la mayoría de los

desinfectantes, explica la supervivencia prolongada de las cepas de esta bacteria en el

entorno clínico y hace que este microorganismo sea casi imposible de erradicar (Roca et

al., 2012).

La adquisición y diseminación de los determinantes de la resistencia a los antimicrobianos

en A. baumannii se consiguen combinando genes de resistencia con una serie de

elementos móviles que median el intercambio de material genético y reorganizan los

genomas bacterianos dando lugar a múltiples combinaciones genéticas y proporcionando

una fuente inagotable de adaptabilidad genética. Dicha matriz incluye secuencias de



inserción (IS), transposones, integrones, plásmidos y, en última instancia, islas de

resistencia (Roca et al., 2012).

1.2.3 Tratamiento

Con respecto al tratamiento para infecciones causadas por A. baumannii, es importante

tener en cuenta el perfil de resistencia involucrado para de este modo considerar las

diferentes opciones de tratamiento disponibles. A. baumannii es actualmente resistente a

múltiples agentes antibacterianos, incluyendo carbapenémicos y, ocasionalmente,

colistina. Por lo tanto, en muchos casos, el tratamiento óptimo para infecciones

nosocomiales causadas por este microorganismo a veces no está disponible. Hace una

década, se utilizó sulbactam, que tiene actividad intrínseca contra A. baumannii y muestra

eficacia para tratar infecciones causadas por aislados clínicos resistentes a

carbapenemasas. Sin embargo, hoy en día el porcentaje de resistencia al sulbactam ha

alcanzado un nivel tan alto que su uso como agente antimicrobiano contra las infecciones

causadas por A. baumannii ha sido invalidado (Roca et al., 2012).

Por otra parte, los resultados con la rifampicina han sido consistentes en relación con la

eficacia in vivo en modelos experimentales de infección y en algunos estudios clínicos de

infecciones humanas, especialmente cuando se combina con colistina. La respuesta

clínica y microbiológica sugiere que la combinación de colistina y rifampicina parece ser un

tratamiento eficaz y seguro para las infecciones graves debidas a A. baumannii

multirresistente (Roca et al., 2012).

Existe cierta heterogeneidad con respecto a los datos clínicos para determinar la utilidad

de la tigeciclina en el tratamiento de las infecciones nosocomiales causadas por A.

baumannii. El posible desarrollo de resistencia durante el tratamiento con tigeciclina

sugiere que sólo debe usarse en regímenes combinados con otros antimicrobianos. Dos

estudios han reportado la combinación de tigeciclina con otros agentes antimicrobianos.

Estos encontraron que la tigeciclina mostró sinergismo con levofloxacina, amicacina,

imipenem y colistina, mientras que se observó antagonismo para la combinación tigeciclina

/ piperacilina-tazobactam. Mientras que, la tetracliclina mostró sinergia con la levofloxacina,

amicacina, imipenem y colistina. El sinergismo se detectó sólo entre cepas no susceptibles

Capitulo 1 11

a tigeciclina. Los ensayos confirmaron la interacción sinérgica entre tigeciclina y

levofloxacina, amicacina, imipenem y colistina en cinco de los siete aislamientos

seleccionados. En seis aislamientos de cepas de A. baumannii resistentes a meropenem

se observó la sinergia de tigeciclina / colistina y tigeciclina / levofloxacina (Roca et al.,

2012).

Otras combinaciones también han sido descritas en la literatura científica. De 14

aislamientos de cepas de A. baumannii extremadamente resistentes a fármacos (XDR) en

pacientes ingresados en las unidades de cuidados intensivos de un hospital chino. La

mayoría de las cepas eran resistentes a todos los antimicrobianos excepto la colistina y la

minociclina, los resultados combinatorios por curvas de muerte mostraron un efecto

sinérgico entre colistina / meropenem, colistina / rifampicina, meropenem / minociclina y

colistina / minociclina. La combinación de meropenem / minociclina podría ser una

alternativa posible cuando la colistina no está disponible como en China (Roca et al., 2012).

Es preocupante que las infecciones causadas por aislamientos de A. baumannii pan

resistentes (pan-resistente se puede definir cuando una bacteria se hace resistente a todos

los antibacterianos de utilidad clínica), aumentan constantemente en varias regiones del

mundo. Es por ello que es necesario desarrollar nuevas estrategias terapéuticas debido a

la existencia de aislamientos reportados resistentes a todos los agentes antibacterianos,

incluyendo la colistina (Leite et al., 2016)

1.3 Mecanismos de resistencia

En general, la resistencia antimicrobiana se puede lograr mediante dos mecanismos

principales: la adquisición de información genética a través de la transferencia horizontal

de genes y la modificación genética de genes endógenos.

1.3.1 Modificación genética de genes endógenos o Mutación genética

▪ Bombas de eflujo: Las Bacterias bombean los antibióticos antes de que estos las

puedan a atacar. Estas bombas tienen la capacidad de expulsar del medio interno

celular, compuestos tóxicos para la bacteria (Coyne et al., 2011).



▪ Modificación del sitio blanco: Las bacterias cambian la forma del objetivo o blanco

de manera que el antibiótico no puede atacar. La modificación del sitio del blanco es el

principal mecanismo de resistencia, por ejemplo, a los β-lactámicos y las

fluroquinolonas (Higuchi et al., 2014).

▪ Destrucción: Las bacterias desarrollan la capacidad de neutralizar el antibiótico antes

de que pueda hacer daño, por ejemplo, cambiando la forma del antibiótico (Wright,

2005). (Wright, 2005)

▪ Modificación de porinas: Disminución de la permeabilidad de la membrana externa,

o disminución en la cantidad de porinas de transporte (Siroy et al., 2005).

▪ Biopelículas: es un ecosistema microbiano organizado, conformado por uno o varios

microorganismos asociados a una superficie viva o inerte, con características

funcionales y estructuras complejas. Formando una comunidad, que se caracteriza por

la excreción de una matriz extracelular adhesiva protectora. Esta forma de desarrollo

confiere a los microorganismos una gran resistencia a los agentes antimicrobianos (Del

Pozo and Cantón, 2016).

1.3.2 Transferencia horizontal de genes

La transferencia horizontal de genes (por sus siglas en inglés, HGT, Horizontal Gene

Transfer).

▪ La Conjugación: requiere contacto físico entre un donante y una célula receptora a

través de un pilus de conjugación, por el cual se transfiere material genético. La

conjugación es canónicamente restringida a las células bacterianas con donante y

receptor, sin embargo, Agrobacterium spp. es una excepción y utiliza su maquinaria de

conjugación para la transferencia horizontal de genes en las células vegetales.

▪ La transformación: es la captación de ADN exógeno desde el medio ambiente y se

ha informado tanto en bacterias como en arqueas.

▪ La transducción: es la entrega de material genético a través del uso de un fago debido

a la integración de material genético de un huésped exógeno dentro del genoma del

fago. Este fenómeno se ha observado tanto en bacterias como en arqueas. Hay dos

tipos de transducción:

o Generalizada: en el que se incorpora una pieza aleatoria de ADN del huésped

durante la lisis celular

Capitulo 1 13

o Especializada: en la que un profago de forma imprecisa se divide a sí mismo a

partir del genoma huésped e incorpora algún ADN del huésped que lo rodea.

(Soucy et al., 2015)

1.3.3 Otros mecanismos de HGT

▪ Agentes de transferencia de genes (GTA): son sistemas de suministro de genes que

se integran en un cromosoma del huésped y están a veces bajo el control regulatorio

del huésped. Estos agentes llevan pequeños trozos aleatorios del genoma del huésped

en cápsides para su entrega a otras bacterias cercanas. Este mecanismo se encuentra

tanto en las bacterias como en arqueas, otros estudios muestran que no todas las

bacterias son capaces de recibir donaciones de ADN por esta vía.

▪ La fusión celular: la fusión celular se ha observado en medios sólidos donde Haloferax

volcanii (y en otras especies) forma agregados y las células se unen físicamente por

varios pequeños puentes de membrana de la célula ya fusionada. La bidireccionalidad

de este método de intercambio de genes significa que es más similar a la reproducción

sexual en eucariotas de lo que es la conjugación en procariotas.

▪ La transferencia de genes de acuerdo a la teoría endosimbiótica: Es una forma

estable de asociación física conduce a la presencia de genes foráneos en genomas de

las eucariotas, como es el caso de la mitocondria y los plastidios, que son organelos

en las eucariotas que evolucionaron de endosimbiontes bacterianos.

▪ Introgresión: Es el flujo de genes debido a la hibridación entre especies, seguido de

retrocruzamientos repetidos a una de las especies parentales, Este mecanismo es una

preocupación importante en los cultivos transgénicos que se cultivan en la proximidad

de los parientes no domesticados. pero no se limita a las plantas.

(Soucy et al., 2015)

1.4 Mecanismos de resistencia en A. baumannii

A. baumannii ha desarrollado diversos mecanismos de resistencia, entre los cuales se

incluyen: β-lactamasas, sobreexpresión de bombas de eflujo, pérdida de porinas y

modificación del sitio blanco de acción de los antibióticos.

La adquisición de nuevos determinantes genéticos en A. baumannii se produce por el

efecto combinado de elementos genéticos móviles (secuencias de inserción, IS y



transposones), integrones y plásmidos transferibles, mientras que la modificación genética

de genes endógenos implica mutaciones espontáneas que modifican los objetivos del

fármaco o la inserción / deleción de elementos móviles que alteran la expresión de

mecanismos de resistencia endógena o modifican la permeabilidad de la membrana (Roca

et al., 2012).

1.4.1 Mecanismos de resistencia intrínsecos

A. baumannii posee una cefalosporinasa tipo AmpC no inducible denominada ADC (del

inglés: Acinetobacter-derived cephalosporinase), siendo éste el mecanismo de resistencia

más frecuente de esta bacteria a los β-lactámicos (6). La sobreexpresión de ADC está

mediada por la presencia de secuencias de inserción que contienen promotores que

favorecen la transcripción del gen, como la ISAba1 e ISAba125 (Lopes and Amyes, 2012).

Se estima que aprozamente 50 % de las cepas de A. baumannii tienen hiperproducción de

ADC (Peleg et al., 2008). Cuando esta enzima se expresa en bajo nivel confiere resistencia

a ampicilina; sin embargo, cuando está sobre expresada produce resistencia a cefalotina,

piperacilina, cefotaxima, ceftazidima y aztreonam, sin afectar a los carbapenémicos, ni al

cefepime (Lopes and Amyes, 2012). Algunas de estas enzimas (ADC-33 y ADC-56) han

sido consideradas como AmpC de espectro extendido o ESAC (del inglés: extended-

spectrum AmpC), por lo que pueden hidrolizar también cefepime (G.-B. Tian et al., 2011).

Otro mecanismo de resistencia intrínseco en A. baumannii es la presencia de la oxacilinasa

OXA-51, cuya expresión basal hidroliza débilmente penicilinas y carbapenémicos; su

sobreexpresión también es mediada por la secuencia de inserción ISAba1 en un

mecanismo similar a la AmpC cromosómica (Gordon and Wareham, 2010).

1.4.2 Mecanismos de resistencia adquiridos

Con el paso del tiempo, Acinetobacter baumannii ha adquirido diferentes mecanismos de

resistencia a los antibióticos y en la actualidad se reporta resistencia a carbapenémicos,

aminoglicósidos, quinolonas, polimixinas, etc., lo que ha complicado el manejo de las

infecciones ocasionadas por esta bacteria. En Colombia se han descrito altos porcentajes

de resistencia a los carbapenémicos, lo que ha limitado las opciones terapéuticas y hace

Capitulo 1 15

necesario el conocimiento de la epidemiología local para establecer medidas de control

más certeras (Martínez and Mattar, 2012).

β-lactámicos: Es poco frecuente encontrar cepas de A. baumannii sensibles a todos los

β-lactámicos y en especial a las penicilinas y cefalosporinas. Los mecanismos de

resistencia a este grupo de antibióticos comprenden mecanismos enzimáticos y no

enzimáticos.

Los mecanismos enzimáticos Estos consisten en la degradación del anillo β-lactámico

mediada por diferentes tipos de β-lactamasas, dentro de las cuales se encuentran las β-

lactamasas de clase A, B o D, de acuerdo con la clasificación de Ambler (Ambler, 1980).

Muchas de estas β-lactamasas pueden estar en elementos genéticos móviles como en

integrones, plásmidos y transposones, por lo que el uso repetitivo de un antibiótico puede

llevar a la expresión de múltiples mecanismos de resistencia que pueden fácilmente

diseminarse hacia otras bacterias (Peleg et al., 2008).

Dentro de las β-lactamasas de clase A, se encuentran las de amplio espectro relacionadas

con resistencia a penicilinas (TEM-1, TEM-2 y la carbenicilinasa CARB-5), las β-

lactamasas de espectro extendido (BLEE) como VEB-1, PER-1, TEM-92 y CTX-M-2 y las

de tipo KPC. (Vila and Marco, 2010). Esta última β-lactamasa fue reportada inicialmente

en el 2001 en cepas de Klebsiella pneumoniae (Yigit et al., 2001), pero en la actualidad se

ha diseminado no solo a otras enterobacterias como Enterobacter spp, Citrobacter freundii,

Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella enterica y Serratia marcescens, sino

también a bacilos gram negativos no fermentadores como Pseudomonas aeuruginosa y

Acinetobacter baumannii (Arnold et al., 2011).

Las β-lactamasas de clase B o metalo-β- lactamasas comprenden un grupo de enzimas

que no son inhibidas por el ácido clavulánico ni por el tazobactam, pero son sensibles a la

inhibición por agentes quelantes como el EDTA. De los seis grupos descritos hasta la

fecha, cinco han sido identificados en A. baumannii incluyendo IMP, VIM, SIM, SPM y NDM

(Karthikeyan et al., 2010; Rai et al., 2013; Shahcheraghi et al., 2011). La mayoría de estas

enzimas han sido encontradas en integrones con determinantes de resistencia a

aminoglicósidos (Peleg et al., 2008).



Las β-lactamasas de clase D u oxacilinasas son las que se describen con mayor frecuencia

en cepas de A. baumannii, siendo las principales OXA-24, OXA-23, OXA-51 y OXA-58,

estas tres últimas asociadas con el elemento de inserción ISAba1 que aumenta su

expresión. Estas enzimas pueden estar codificadas en plásmidos, excepto OXA-51,

codificada en el cromosoma bacteriano y ha sido usada como marcador de especie

(Gordon and Wareham, 2010). Sin embargo, esta oxacilinasa, junto con la OXA-58, han

sido reportadas en enterobacterias, lo que evidencia la capacidad de diseminación a

bacterias de otro género (Leski et al., 2013).

Los mecanismos no enzimáticos: Estos mecanismos de resistencia a β-lactámicos

incluyen la alteración de las proteínas de membrana externa denominadas OMPs (del

inglés: outer membrane proteins), que conducen a una disminución de la permeabilidad de

la membrana, bombas de eflujo que, como su nombre lo indica, expulsan el antibiótico y

alteración de las proteínas de unión a penicilina o PBPs (del inglés: penicillin binding

protein), cuando son blanco de este tipo de fármacos (Tiwari et al., 2012).

Con relación a los cambios en las OMPs se han descrito alteraciones en proteínas como

la CarO asociada con resistencia a meropenem e imipenem (Mussi et al., 2007) y la OmpW,

la cual es homóloga a las OmpW encontradas en E. coli y P. aeruginosa, que disminuye la

entrada de colistina y de los β-lactámicos al interior de la bacteria (Peleg et al., 2008; Tiwari

et al., 2012). También se ha descrito una OMP de 43 kDa perteneciente a la familia de las

OprD (OprD-like), relacionada con cierre de porinas para imipenem.

Dentro de las bombas de eflujo, la más estudiada es el sistema AdeABC, que puede

expulsar β-lactámicos (incluyendo carbapenémicos), aminoglicósidos, macrólidos,

cloranfenicol, tigeciclina, tetraciclinas, fluoroquinolonas y trimetoprim. A. baumannii puede

llegar a poseer bombas de eflujo de las cinco superfamilias como: ABC, SMR, MATE, MFS

y RND esta última a la cual pertenecen los sistemas adeABC, adeIJK, adeFGH, adeXYZ,

adeDE (Coyne et al., 2011)

Aminoglicósidos: existen diferentes enzimas modificantes de aminoglicósidos y bombas

de eflujo que confieren resistencia a este grupo de antibióticos (Lee et al., 2011). Las

enzimas modificantes (acetiltransferasas -AAC-, nucleotiltransferasas -ANT- y

Capitulo 1 17

fosfotransferasas -APH-) producen diferentes fenotipos de resistencia selectiva en los

aminoglicósidos (Akers et al., 2010).

Sin embargo, cuando estas enzimas se combinan con bombas de eflujo como la AdeABC

pueden conferir resistencia a todos los aminoglicósidos (Vila and Marco, 2010). La

metilación de la subunidad 16S del rRNA mediada por el gen armA también ha sido

descrita en A. baumannii y al actuar sobre el blanco de acción de los aminoglicósidos

también confiere resistencia a todos ellos (Akers et al., 2010). La gentamicina y la

kanamicina también son sustratos para la bomba AbeM (Peleg et al., 2008).

Quinolonas: la resistencia a quinolonas está mediada por mutaciones en los genes gyrA

y parC que codifican para las subunidades A del ADN girasa y la topoisomerasa IV,

respectivamente (Lee et al., 2011). Las quinolonas son sustratos de las bombas AdeABC

y la AbeM (Peleg et al., 2008)

Tetraciclinas y glicilciclinas: la resistencia de A. baumannii a este grupo de antibióticos

está mediada por bombas de expulsión y proteínas de protección ribosomal. Las bombas

de expulsión incluyen TetA y TetB, codificadas por los genes tet(A) y tet(B); la primera

confiere resistencia solo a tetraciclina, mientras que la segunda expulsa tetraciclina y

minociclina (Coyne et al., 2011). La codificación de las proteínas de protección ribosomal

está mediada por el gen tet(M), en un mecanismo idéntico al descrito en Staphylococcus

aureus, pero que se encuentra poco en A. baumannii (Peleg et al., 2008). La bomba

expulsión AdeABC también puede expulsar tetraciclinas y la tigecilina.

Colistina: la resistencia a colistina ha sido asociada con los genes pmrA y pmrB que

originan cambios en genes relacionados con la modificación del lípido A, con la pérdida o

deficiencia de la producción de lipopolisacárido y con la modificación de la porina OmpW

(Adams et al., 2009) (Moffatt et al., 2010).

Trimetoprim, sulfonamidas y cloranfenicol: la resistencia a sulfonamida está mediada

por el gen sul que se encuentran en la región 3´de un integrón (Peleg et al., 2008). El gen

dhfr confiere resistencia a trimetoprim, mientras que la bomba de eflujo CraA (del inglés:

chloramphenicol resistance Acinetobacter) confiere resistencia a cloranfenicol. La bomba



AdeABC también confiere resistencia a estos dos últimos antibióticos (Akers et al., 2010;

Peleg et al., 2008)

1.5 Perfiles fenotípicos de resistencia – Antibiograma

El estudio de la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos es una de las

funciones más importantes de los laboratorios de microbiología clínica. Su realización se

desarrolla mediante las pruebas de sensibilidad o antibiograma, cuyo principal objetivo es

evaluar en el laboratorio la respuesta de un microorganismo a uno o varios

antimicrobianos, traduciendo, en una primera aproximación, su resultado como factor

predictivo de la eficacia clínica. El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico

frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento

de una bacteria o población bacteriana. Se obtiene como resultado, la farmacología del

antimicrobiano, en particular en el lugar de la infección, y los aspectos clínicos del paciente

y de su infección, sustentan la elección de los antimicrobianos en el tratamiento de las

enfermedades infecciosas (Cantón et al., 2000).

Los métodos más frecuentemente utilizados en Microbiología Clínica para la determinación

de la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos se basan en un estudio fenotípico.

Estos métodos requieren normalmente un tiempo de unas 24 h para la obtención de

resultados, es importante entender que para la interpretación del antibiograma es

indispensable conocer la especie bacteriana que se está estudiando (March Rosselló and

Bratos Pérez, 2016). A continuación, se describen brevemente algunos métodos básicos

utilizados y aceptados para el estudio de la sensibilidad.

1.5.1 Métodos de difusión

▪ Método del antibiograma disco-placa

El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno

de los métodos que el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) antes llamado

National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda para la

determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos. El antibiograma disco-

placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de Petri previamente

Capitulo 1 19

inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes

antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la

superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El

antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose

un gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos

aparecen rodeados por una zona de inhibición. La concentración de antibiótico en la

interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como

concentración crítica (Cantón et al., 2000).

Las ventajas de este método de disco-placa son: fácil de realizar, rápido y barato. Es una

metodología aplicable a una amplia variedad de bacterias, fundamentalmente bacterias

aerobias no exigentes de crecimiento rápido como Enterobacteriaceae, Pseudomonas

spp., Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Acinetobacter spp.,

Staphylococcus spp. y Enterococcus spp. Además, con ligeras modificaciones, puede ser

aplicado a Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y

Streptococcus spp (Cantón et al., 2000).

▪ Método del Epsilon test

El principio de este método es una expansión de la técnica de difusión en disco. En el

método E-test (AB Biodisk, Suecia) podemos, mediante lectura directa, determinar la

concentración mínima inhibitoria (CMI). Consiste en una tira de plástico no poroso de 6 cm

de largo por 5 mm de ancho que incorpora un gradiente predefinido de antimicrobiano

equivalente a 15 diluciones. El protocolo para preparar el inóculo es el mismo que para la

difusión en disco. Siguiendo el método de difusión, una vez inoculado la placa de agar con

el microorganismo, se coloca la tira de Etest sobre su superficie, produciéndose de forma

inmediata una difusión del antibiótico desde el soporte hasta el agar, creándose de este

modo a lo largo de la tira un gradiente exponencial de las concentraciones del

antimicrobiano. Tras la incubación de las placas, se puede observar una zona de inhibición

elipsoidal y simétrica. Después de la incubación la CMI será el valor obtenido en el punto

en el que el extremo de inhibición intersecciona con la tira (Cantón et al., 2000).

Desventajas con respecto al método anterior si se coloca la tira al revés no se observa

elipse de inhibición ya que el gradiente de concentraciones se sitúa solo sobre una de las

caras de la tira. Además, en algunos casos como la prueba de la vancomicina con S.



pneumoniae, la CMI es más alta utilizando el E-test que la obtenida por los métodos de

microdilución, produciendo resultados que se encuentran en el rango superior de

aislamientos susceptibles y con resultados de control de calidad por encima de los límites

aceptables. Por otro lado, este método es muy útil para determinar la CMI de diversos

antibióticos en una amplia gama de bacterias, incluyendo Helicobacter pylori,

Corynebacterium spp., estreptococos nutricionalmente deficientes, enterococos con

resistencia elevada a aminoglicósidos (Cantón et al., 2000).

1.5.2 Métodos de dilución

Estos métodos se basan en la determinación del crecimiento del microorganismo en

presencia de concentraciones crecientes del antimicrobiano, que se encuentra diluido en

el medio de cultivo (caldo o agar). Tradicionalmente estos métodos se han venido usando

para la determinación de la CMI y la concentración mínima bactericida (CMB) de los

antimicrobianos. En la mayoría de los casos se preparan diluciones del antimicrobiano en

fase logarítmica utilizando un medio de cultivo adecuado; posteriormente se inocula dicho

medio y tras la correspondiente incubación para permitir el crecimiento del microorganismo

se realiza la lectura, determinando qué concentración causa la inhibición del crecimiento

del microorganismo (Cantón et al., 2000).

Las primeras determinaciones se realizaron empleando una cantidad considerable de

tubos con caldo de cultivo, a los cuales se le colocaban diluciones crecientes de

antibióticos con el mismo fundamento que el descrito para el método de dilución en agar.

Este procedimiento se denominó macrodilución en caldo. Esta metodología es muy

engorrosa, por la cantidad de material y de manipulaciones necesarias para su realización.

La utilización de micropipetas y de placas de microtitulación facilitó la utilización del método

de microdilución en caldo; en la actualidad se han popularizado los métodos automatizados

comerciales de microdilución en caldo, fácilmente integrables en sistemas

semiautomáticos de lectura e interpretación de resultados, pero con el grave inconveniente

del incremento de su costo (Cantón et al., 2000).

1.5.3 Otros métodos

▪ Citometría de flujo

Capitulo 1 21

La citometría de flujo es un proceso que permite que las partículas (generalmente células)

pasen en fila dentro de un flujo a través del aparato con una intensidad de 500-4.000

partículas/s. Cuando esto sucede, es posible realizar la medición simultánea de múltiples

características de una sola célula, de tal forma que es posible caracterizar, separar y

cuantificar las diferentes subpoblaciones celulares que se engloban en un conjunto. A

principios de la década de los ochenta aparecen los primeros estudios en los que se

demuestra la aplicación de la citometría de flujo fluorescente en la determinación de la

sensibilidad de bacterias. Posteriormente se han utilizado otros fluorocromos con el fin de

obtener información sobre diversos parámetros bacterianos, como el potencial de

membrana, el tamaño celular, la cantidad de ADN o la actividad enzimática (March

Rosselló and Bratos Pérez, 2016).

▪ Quimioluminiscencia

La quimioluminiscencia es un proceso de relajación radiante que tiene lugar cuando en

una reacción química se genera una especie excitada electrónicamente. La

bioluminiscencia es una forma de quimioluminiscencia que aparece como consecuencia

de una reacción química que tiene lugar en los organismos vivos, como por ejemplo

luciérnagas (insectos de la familia Lampyridae). En esta reacción química, la sustancia

luminiscente luciferina es oxidada, en presencia de adenosín trifosfato (ATP), por la acción

catalítica de la enzima luciferasa. El sistema bioluminiscente de las luciérnagas tiene

muchas aplicaciones analíticas, dado que la enzima luciferasa posee una gran

especificidad por determinados sustratos y, además, la cantidad de luz producida es

directamente proporcional a la cantidad de ATP de la reacción. Los trabajos realizados

sobre la determinación de la sensibilidad bacteriana mediante bioluminiscencia se

fundamentan en la medida de los niveles de ATP bacteriano de origen intracelular,

extracelular o total. Para calcular la CMI mediante bioluminiscencia se compara la señal

de ATP obtenida a partir de microorganismos incubados sin la presencia de antibiótico

(grupo control) con la señal obtenida a partir de microorganismos incubados en presencia

de antibiótico a diferentes tiempos, formulando así diferentes criterios de sensibilidad. Con

respecto al grupo control, si se mide el ATP intracelular las cepas sensibles al antibiótico

estudiado van a proporcionar una disminución de la señal de bioluminiscencia; si se mide

el ATP extracelular las cepas sensibles van a producir un aumento de la señal, y si se mide

el ATP total las cepas sensibles van a proporcionar una disminución de la señal de ATP.

En cambio, si el microorganismo es resistente al antibiótico las medidas del grupo control



serán prácticamente iguales que las obtenidas a partir de las cepas a estudiar (March


▪ Espectrometría de masas

La espectrometría de masas (MALDI-TOF) es una herramienta basada en espectrometría

de masas que permite obtener en unos minutos la identificación de microorganismos tales

como bacterias (incluyendo micobacterias), levaduras y hongos filamentosos. La

denominación «MALDI» proviene de Matrix-Assisted Laser Desorp-tion/Ionization, y

«TOF» alude al analizador de iones que se acopla al MALDI, que es del tipo de tiempo de

vuelo (time of flight). Para realizar el análisis mediante MALDI-TOF es necesario que las

proteínas de los microorganismos se ionicen. Para ello, las colonias de microorganismos

se depositan sobre la placa portamuestras y a continuación sobre esa muestra se deposita

una disolución matriz. A continuación, la placa es introducida en la cámara de alto vacío,

donde la superficie cristalina de la muestra es expuesta a disparos de un láser de longitud

de onda en la zona ultravioleta del espectro, con lo que la matriz absorbe la energía del

láser produciendo se la sublimación del analito y de la matriz. Ya en fase gaseosa, la

estabilización de la matriz tiene lugar mediante la liberación de protones que, en parte, son

captados por las proteínas de las bacterias, generándose fragmentos de proteínas con

carga positiva. Mediante un electrodo se genera un campo eléctrico que acelera los iones

formados desde las proximidades de la muestra hacia el analizador de masas. De esta

forma, los iones entran en un tubo (de 1 a 4 m de longitud) con la misma energía cinética

y siguiendo una trayectoria lineal. Así, el tiempo que tardan los iones en recorrer el tubo es

proporcional a la relación masa/carga (m/z) de los mismos. En última instancia está el

detector de los iones previamente separados (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016).

En referencia al antibiograma rápido, el sistema MALDI-TOF permite predecir en unas

horas si las bacterias poseen enzimas que degradan los antibióticos. Para ello, los

microorganismos previamente aislados en las placas de cultivo deben ser incubados

durante un tiempo con el antibiótico. Posteriormente, con el análisis realizado mediante el

sistema MALDI-TOF se observa, en caso de que el microorganismo posea la enzima

responsable de la degradación del antibiótico, la desaparición del pico correspondiente al

antibiótico y la aparición de nuevos picos que corresponden a los metabolitos resultantes

Capitulo 1 23

de la rotura del antibiótico. En caso de que la bacteria no hidrolice el antibiótico, se observa

únicamente el pico correspondiente al antibiótico (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016).

▪ Métodos colorimétricos

Las diferentes metodologías basadas en procedimientos colorimétricos requieren unas 6

horas para poder informar la sensibilidad de las bacterias a los antibióticos y han mostrado

muy buenos resultados. La resazurina es un compuesto que, cuando se añade a un cultivo

bacteriano en medio líquido resistente al antibiótico con el que es incubado, es reducida

por la actividad metabólica de la bacteria. En cambio, si la bacteria es sensible al antibiótico

se detiene su metabolismo, con lo que la resazurina permanece en su forma oxidada. Dado

que la forma reducida de resazurina es estable y de color azul, y fotométricamente

distinguible de la forma oxidada, que es de color rojo, la viabilidad celular puede ser

monitorizada mediante espectrofotometría, colorimetría o fluorometría (March Rosselló

and Bratos Pérez, 2016).

Otro método colorimétrico consiste en la medición de la actividad de la enzima bacteriana

nitrato reductasa. Cuando se incuba la bacteria en presencia de iones NO3 y antibiótico,

si la bacteria es resistente al antibiótico se van a generar iones NO2 que, con los reactivos

de Gries, originan un compuesto de color rojo (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016).

▪ Nefelometría

La nefelometría es otra técnica analítica basada en la dispersión de luz que permite realizar

un antibiograma rápido. El sistema UroQuick o HBandL™(Alifax, Padua, Italia), diseñado

para realizar un cribado de muestras de orina, detecta la presencia de microorganismos

en un tubo que contiene un medio de enriquecimiento dado que el crecimiento de estos

causa una desviación de la luz medible mediante los correspondientes detectores. Las

señales obtenidas son procesadas por un software que monitoriza las curvas de

crecimiento. De este modo, este sistema es capaz de informar la concentración microbiana

de la muestra. Este equipo ha sido aplicado con éxito para realizar la detección fenotípica

de diversos mecanismos de resistencia de cepas caracterizadas genéticamente o

fenotípicamente, requiriendo 24 horas para bacterias grampositivas y 8 horas para

bacterias gramnegativas (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016).

▪ Microfluidos



Los avances en nanotecnología han posibilitado la miniaturización de los diferentes

ensayos usados para la detección de las resistencias a los antibióticos desarrollando

plataformas o chips que utilizan volúmenes muy pequeños de muestra y de reactivos, y

que además pueden albergar múltiples ensayos como cultivo bacteriano, hibridación y

amplificación de ácidos nucleicos y rotura celular, entre otros. De este modo, los métodos

de detección varían ampliamente, dependiendo del ensayo realizado. Entre las diferentes

posibilidades se tiene por ejemplo que para realizar de un antibiograma directamente a

partir de muestras de orina utilizando un sistema de microfluidos que incorpora un sensor

electroquímico para la cuantificación del ARN ribosómico16S. Este grupo obtiene, en 3 h

y media, un 94% de concordancia con la sensibilidad obtenida mediante microdilución en

caldo (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016).

▪ Métodos de lisis bacteriana

Otra metodología para la determinación de la sensibilidad consiste en la detección de la

lisis bacteriana. Para ello, la bacteria es incubada con la presencia del antibiótico a la

concentración deseada; seguidamente la bacteria se inmoviliza en un microgel de agarosa

y es expuesta a una solución de lisis que produce la liberación del ADN. Posteriormente,

la preparación es incubada con el fluorocromo SYBR Gold y mediante observación al

microscopio de fluorescencia es posible estudiar la integridad del ADN. Esta metodología

requiere menos de 2 horas y ha sido aplicada tanto a bacterias gramnegativas como

grampositivas (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016).

1.5.4 Los sistemas automatizados

La micro dilución en caldo es la técnica utilizada por los diversos sistemas automatizados

comerciales como el MicroScan Walkaway (Siemens, Nueva York, EE. UU.), Phoenix (BD

Diagnostics, Sparks, MD, EE. UU.) o VITEK (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia). Para la

interpretación de los resultados de sensibilidad obtenidos mediante las técnicas

anteriormente citadas se siguen las normas del antibiograma publicadas por diversos

organismos, como el CLSI y el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

(EUCAST). En el trabajo de rutina, todas estas técnicas se aplican a partir de las colonias

crecidas en las placas de aislamiento; los métodos Phoenix y VITEK, que son los más

Capitulo 1 25

rápidos, requieren un tiempo medio mínimo de 9 h para obtener los resultados (March


Entre las ventajas de estos sistemas tenemos: El Impacto clínico dada por la rapidez en el

informe de resultado (3-10 horas vs 16-24 horas con los métodos manuales) adicional a la

reducción de costos por concepto de menos días de hospitalización y menos exámenes

de laboratorio junto con la posibilidad de dar inicio o cambiar precozmente el antibiótico.

La estandarización y control de calidad debido al aumento de la reproducibilidad intra e

inter laboratorio. La disminución de la carga de trabajo porque requiere menos personal en

métodos que determinen CMI. La disminución de errores post-analíticos al evitar la

transcripción errónea de resultados por disponer de programas de comunicación

bidireccional. La identificación de patrones fenotípicos de resistencia además de la

posibilidad de indicar la sospecha de presencia de β lactamasas de espectro extendido y

otras β-lactamasas. La facilidad de obtención de estadísticas junto con la capacidad de

almacenar y procesar la información para un análisis de tendencias anuales de

susceptibilidad. Por último, también se facilita el control en el uso de antimicrobianos por

la posibilidad de generar un informe con los resultados en línea con farmacia (García C.,

2002).

Entre las desventajas de estos sistemas automatizados tenemos: el alto costo dado porque

el equipamiento y los insumos (paneles o tarjetas) son de alto costo. Se requiere de un

método de respaldo frente a falla en el equipo por lo tanto es necesario disponer de un

equipo de respaldo o de una metodología manual de respaldo. No existen normas CLSI

para sistemas automatizados, sin embargo, deben considerarse en los métodos

empleados (puntos de corte o CIM). La poca flexibilidad en los antimicrobianos ensayados

porque los paneles o tarjetas estás determinadas por el fabricante. Se presentan

discrepancias con los métodos convencionales o están aún en evaluación, esto es válido

para bacterias fastidiosas como Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, para

algunos bacilos Gramnegativos no fermentadores, para anaerobios y para algunos

antimicrobianos específicos como cefepime en Pseudomonas aeruginosa falsas

resistencias o falsas susceptibilidades a imipenem en Pseudomonas aeruginosa y

Acinetobacter baumannii o Enterococcus de susceptibilidad intermedia a vancomicina. Es

conocido también que algunas β-lactamasas inducibles en bacilos Gram negativos

requieren una incubación más prolongada para expresar la resistencia (García C., 2002).



Otro estudio llevado a cabo con 112 aislamientos de A. baumannii sugiere que el sistema

Vitek2 y Phoenix llevó a cabo confiablemente pruebas de susceptibilidad para imipenem

contra A. baumannii. El sistema MicroScan WalkAway no logró detectar con precisión la

resistencia a imipenem en la colección de aislamientos de A. baumannii resistentes a

carbapenemasas (Kulah et al., 2009).

1.5.5 Microarreglos y técnicas moleculares

▪ Microarreglos

La metodología de los microarreglos consiste en el uso de un sustrato sólido que contiene

un gran número de moléculas de ácido nucleico de una sola cadena. Fragmentos de ácido

nucleico a los que se les denomina normalmente sondas. Los ácidos nucleicos de las

muestras a analizar suelen ir marcadas mediante diversos métodos (enzimáticos,

fluorocromos, etc.) y se incuban en contacto con las sondas, permitiendo así la hibridación

a las sondas complementarias. Finalmente, mediante las herramientas informáticas es

posible determinar en las muestras la secuencia de los ácidos nucleicos, detectar

pequeñas variaciones en la secuencia de los genes o estudiar la expresión de genes. De

este modo, para el estudio de la sensibilidad, los microarreglos permiten la detección de

un gran número de genes de resistencia en un solo ensayo, caso contrario de lo que ocurre

en la reacción en cadena de la polimerasa PCR. En bacterias gramnegativas es posible

detectar, en unas horas, un gran número de genes que codifican para diferentes β-

lactamasas (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016).

▪ Las técnicas moleculares

Las técnicas moleculares permiten la detección de material genético, tanto ácido

desoxirribonucleico (ADN) como ácido ribo-nucleico (ARN). De entre todas las técnicas

moleculares utilizadas, PCR es la que ha adquirido un mayor valor diagnóstico, permitiendo

la detección de agentes infecciosos, además de caracterizar sus genotipos de virulencia y

de resistencia. El primer paso de la PCR consiste en una extracción del material genético,

seguido de la desnaturalización térmica del ADN que se va a usar como molde, el

anillamiento de cebadores sintéticos y la extensión catalizada por el ADN polimerasa de

Capitulo 1 27

los oliogonucleótidos anillados que actúan como cebadores. Este proceso de 3 pasos se

repite un número determinado de veces (de 25 a 35), duplicándose cada vez el número de

moléculas de producto. Esta amplificación exponencial tiene como resultado un gran

número de copias de la secuencia de ADN, lo que le confiere una elevada sensibilidad

(March Rosselló and Bratos Pérez, 2016).

Los importantes avances en el conocimiento de las bases genéticas de la resistencia a

antibióticos han permitido que distintas PCR puedan detectar, en unas horas, la presencia

de genes de resistencia a una gran variedad de antibióticos para un gran número de

especies bacterianas. Además, la PCR a tiempo real ha sido utilizada para monitorizar el

crecimiento bacteriano mediante la detección de los genes de resistencia cuando las

bacterias han sido incubadas en presencia del antibiótico a ensayar (March Rosselló and

Bratos Pérez, 2016).

Las ventajas de estos métodos están representadas por tiempos de respuesta más cortos

en comparación con otros métodos nombrados anteriormente. Una mayor sensibilidad,

especialmente con pacientes que ya han recibido agentes antimicrobianos antes de las

pruebas microbiológicas, situación particularmente común entre los pacientes pediátricos.

La posibilidad de realizar pruebas también con muestras polimicrobianas; una mayor

fiabilidad en la detección de algunos fenotipos de resistencia. Las desventajas de estas

técnicas moleculares están representadas por los altos costos y por el riesgo de subestimar

la resistencia. De hecho, estos sistemas solo son capaces de detectar los genes de

resistencia dirigidos por las sondas y no detectarán otros determinantes de resistencia.

Además, utilizando estos sistemas, existe también la posibilidad de sobrestimar la

resistencia porque la presencia de un gen de resistencia no está necesariamente asociada

con la expresión de un fenotipo de resistencia (el gen podría estar inactivado o no

expresado) (Arena et al., 2015).

1.5.6 Secuenciación del genoma completo

Otra técnica molecular disponible para realizar un antibiograma rápido es la secuenciación

del genoma completo (WGS). Los avances en la secuenciación del ADN han posibilitado

secuenciar un genoma bacteriano completo en horas. Una vez obtenida esta gran cantidad

de datos, los programas bioinformáticos se encargan de su procesamiento y análisis. De

este modo, esta técnica puede utilizarse para el estudio de determinantes genéticos de



resistencias antibióticos (March Rosselló and Bratos Pérez, 2016), como en el estudio

realizado por Zankari et al. 2013, donde utilizan la secuenciación del genoma completo

para caracterizar los perfiles de resistencia de 200 aislados bacterianos pertenecientes a

4 especies bacterianas. Cuando se comparan los resultados obtenidos mediante

secuenciación con los obtenidos mediante métodos fenotípicos obtienen un 99,74% de

concordancia, demostrando así que la sensibilidad obtenida mediante secuenciación

puede correlacionar bien con la sensibilidad obtenida mediante métodos fenotípicos. Para

la secuenciación del genoma completo se usó la plataforma Illumina paired-end y para

identificar los genes de resistencia a los antimicrobianos se usó el servicio web ResFinder

(que se contemplara más adelante).

Tras las mejoras recientes en las tecnologías de secuenciación, la WGS se posiciona como

una herramienta que puede ser esencial en el control de la resistencia a los antibióticos,

una amenaza importante en la salud moderna. La WGS ya ha encontrado numerosas

aplicaciones en esta área, desde el desarrollo de nuevos antibióticos y pruebas

diagnósticas hasta la administración antibiótica de los fármacos actualmente disponibles a

través de la vigilancia y la elucidación de los factores que permiten la aparición y

persistencia de la resistencia. Numerosos estudios de prueba de principio también han

puesto de relieve el valor de la WGS como una herramienta para el control diario de la

infección y, para algunos patógenos, como una herramienta de diagnóstico primaria para

detectar la resistencia a los antibióticos. Sin embargo, las plataformas de análisis de datos

apropiadas deberán ser desarrolladas y/o mejoradas antes de que la WGS de rutina pueda

ser introducida a gran escala (Köser et al., 2014, p.).

1.6 Aplicaciones y bases de datos sobre resistencia a antibióticos

Es importante resaltar que la presente Tesis de Maestría no pretender hacer una

evaluación comparativa (benchmarking) sobre las diferentes aplicaciones o bases de datos

que se nombran para identificar la resistencia a antibióticos.

Capitulo 1 29

Existen algunas bases de datos sobre genes asociados a la resistencia a antibióticos que

solo sé que quedan hasta allí es decir solo poseen el repositorio, hay otras que además

proveen una aplicación para obtener alguna aproximación a un perfil genómico de

resistencia a antibióticos basado en diferentes métodos que se presentan a continuación.

1.6.1 Bases de datos Activas

▪ CARD (The comprehensive antibiotic resistance database)

La base de datos CARD es un recurso curado manualmente que contiene datos de

referencia de alta calidad sobre la base molecular de la resistencia antimicrobiana (siglas

en inglés AMR), con énfasis en los genes, proteínas y mutaciones involucradas en AMR.

CARD está estructurado ontológicamente, centrado en el modelo, abarca una amplitud de

las diferentes clases de fármacos y los mecanismos de resistencia, incluyendo la

resistencia intrínseca, dada por las por mutaciones y resistencia adquirida. Se basa en la

Ontología de Resistencia a los Antibióticos (siglas en ingles ARO, Antibiotic Resistance

Ontology), una construcción personalizada y un vocabulario contralado jerárquicamente

que permite compartir datos. Su diseño permite el desarrollo de herramientas de análisis

del genoma novedoso, como el identificador de genes de resistencia (RGI, Resistance

Gene Identifier) para la predicción de resistomas a partir de la secuencia del genoma sin

procesar. Las mejoras recientes incluyen una extensa curación de las secuencias de

referencia y secuencias mutadas, el desarrollo de un modelo ontológico único,

acompañado de un modelo de detección de AMR que mejora el análisis de secuencias,

nuevas herramientas de visualización y la expansión del RGI para la detección de

amenazas emergentes de AMR. CARD curada se actualiza mensualmente sobre la base

de una interacción de la recuperación manual de la literatura, la minería de texto

computacional y análisis de genoma (Jia et al., 2017).

Es más que una simple base de datos, porque posee una aplicación que le permite la

aproximación a un perfil genómico de resistencia, y la forma de visualizar vía web.

Este sistema se encuentra alojado por: A Canada–UK joint health research programme on

antibiotic resistance. En la siguiente url: https://card.mcmaster.ca/

▪ ResFINDER

https://card.mcmaster.ca/



La base de datos ResFINDER posee un repositorio de genes adquiridos que son capaces

de conferir resistencia a los antibióticos (secuencias completas o parciales, así como

genomas completos y secuencias de plásmidos)

No se hace distinción entre genes adquiridos y genes mutados

ResFinder posee una aplicación basado en la web, que utiliza BLAST para la identificación

de los genes de resistencia a los antimicrobianos adquiridos en los datos del genoma

completo. Como entrada, el método puede usar genomas pre-ensamblados, completos o

parciales, y lecturas de secuencias cortas de cuatro plataformas de secuenciación

diferentes tales como: 454, Illumina, Ion Torrent y SOLiD. La versión inicial del método fue

evaluado en 1862 archivos en el GenBank, que contenían 1411 diferentes genes de

resistencia, así como en 23 secuencias de aislamientos de novo (Zankari et al., 2012).

También posee una herramienta Web para identificar los replicones de plásmidos llamada

Plasmid Finder y la identificación de especies basadas en alelos MLST (por sus siglas en

inglés, Multilocus sequence typing).

Adicionalmente vía Web se puede visualizar un perfil de resistencia genómico, además la

base de datos esta curada y se actualiza periódicamente.

Este sistema se encuentra alojado en: Center for Genomic Epidemiology, Denmark.

University, Denmark. En la siguiente url: https://cge.cbs.dtu.dk//services/ResFinder/

▪ Lahey Clinic website

La base de datos Lahey, es un repositorio de referencias a fuentes para información de

secuencias de β-lactamasas, con grupos de enzimas tales como: TEM, SHV, OXA-, CTX-

M-, CMY, AmpC, CARB-, IMP-, VIM-, KPC, GES-, PER- y VEB-, entre otros, además

Quinolonas (genes qnr).

https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/

Capitulo 1 31

Surgió como un intento por estandarizar la nomenclatura para el número creciente de ß-

lactamasas TEM. El objetivo de esta base de datos estaba orientado en hacer más fácil a

los investigadores la identificación de sustituciones de aminoácidos de acuerdo a las

secuencias reportadas (Bush and Jacoby, 1997).

Principalmente este repositorio se fundamenta en la nomenclatura y en un esquema de

numeración propuesto con el fin de evitar duplicaciones. Es de aclarar, que no usa

herramienta BLAST.

Es curada por Karen Bush y George Jacoby y Actualizada por la comunidad científica.

Esta base de datos se encuentra alojada en: Lahey Clinic, USA. En la siguiente url:

http://www.lahey.org/Studies/

▪ LacED (The lactamase engineering database)

Esta base de datos actualmente posee únicamente genes que codifican para las β-

lactamasas de tipo TEM y SHV. Proporcionando información sobre las secuencias de

mutaciones y estructuras de estas.

Se centra en la nomenclatura y en la identificación de variantes conocidas y desconocidas

y de esta forma asignar nuevas ß-lactamasas, identificar inconsistencias en bases de datos

públicas y facilitar la ingeniería de proteínas.

La última vez que se actualizó el grupo SHV fue el 6 de abril de 2010, esta sección no

recibe mantenimiento. Mientras que el grupo TEM hace parte de la base de datos del

sistema BioCatNet y se encuentra actualizado

Esta base de datos se encuentra alojada en: Institute of Technical Biochemistry, University

of Stuttgart, Germany. En la siguiente url: http://www.laced.uni-stuttgart.de/

▪ OXY, OKP, LEN beta-lactamase protein variation Home Page

http://www.lahey.org/Studies/

http://www.laced.uni-stuttgart.de/



Inicialmente es una base de datos que aloja los alelos de los tipos de β-lactamasas: OXY,

OKP y LEN (sin genes de resistencia a antibióticos adquiridos). Se centra en la

armonización de la nomenclatura de genes. No hay una herramienta BLAST en esta base

de datos

La nomenclatura de beta-lactamasas OKP, LEN y OXY está curada y se mantiene dentro

de esta base de datos. La curación de datos se realiza de forma voluntaria y se basa en

un esfuerzo comunitario.

Estos datos hacen parte de un compendio de datos mucho más grande del Instituto

Pasteur, como los datos genotípicos de los aislados de K. pneumoniae basados en MLST,

core genome MLST (cgMLST), ribosomal MLST (rMLST), tipificación capsular

(secuenciación wzc y wzi), genes de resistencia a los antimicrobianos y genes de

virulencia.

La base de datos se encuentra alojada en: Institut Pasteur, France. En la siguiente url:

http://bigsdb.pasteur.fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public&page

=downloadAlleles. Bajo la sección “Beta-lactamase genes”.

▪ MARILYN C. ROBERTS, Ph. D personal website

Es una base de datos que se centra en la armonización de la nomenclatura de los genes

resistentes a Macrolides y tetracyclines principalmente. No usa la herramienta BLAST.

Se encuentra alojado en: University of Washington, USA. En la siguiente url:

http://faculty.washington.edu/marilynr/

▪ Attaca-RAC (Repository of antibiotic resistance cassettes)

Es un repositorio de Cassettes de genes de resistencia a antibióticos en integrones de

resistencia a múltiples fármacos.

http://bigsdb.pasteur.fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public&page=downloadAlleles

http://bigsdb.pasteur.fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public&page=downloadAlleles

http://faculty.washington.edu/marilynr/

Capitulo 1 33

Posee un archivo de cassettes de genes que incluye nombres de genes alternativos de

múltiples sistemas de nomenclatura, además permite la anotación y el nombre constantes

de los cassettes en las secuencias presentadas

Este sistema es una aplicación en línea que permite a los usuarios: Navegar y explorar el

depósito de cassettes de genes. Anotar las secuencias de cassettes utilizando una base

propia de conocimientos y el motor de anotación Attacca. Finalmente, puede aportar

nuevos cassettes que aún no están en la base de datos y obtener nombres únicos para

ellos (Tsafnat et al., 2011).

Esta base de datos se encuentra alojada en: Centre for Health Informatics at UNSW,

Australia, in collaboration with the Centre for Infectious Diseases and Microbiology,

Westmead, UK. En la siguiente url: http://rac.aihi.mq.edu.au/rac/

▪ INTEGRALL (Repository of antibiotic resistance cassettes)

Es un repositorio de acceso libre, que posee un sistema de búsqueda basado en texto,

desarrollado con el objetivo de recolectar y organizar información sobre integrones en una

sola base de datos. Proporciona un repositorio genético público para la secuencia de datos

y nomenclatura, ofreciendo acceso a las secuencias de ADN de los integrones, sus

arreglos moleculares, así como sus contextos genéticos (Moura et al., 2009).

A la fecha posee 1509 Genes integrasa, 8561 Cassettes de genes, en 167 Géneros y 375

Especies.

Esta base de datos se encuentra alojada en: Universidade de Aveiro, Portugal. En la

siguiente url: http://integrall.bio.ua.pt/

1.6.2 Bases de datos No Activas

▪ ARG-ANOTT (Antibiotic resistance gene-annotation)

Esta base de datos posee un repositorio de genes adquiridos que son capaces de conferir

resistencia a los antibióticos (completa o parcialmente secuenciados) Se hace una

distinción entre los genes adquiridos y los genes mutados

http://rac.aihi.mq.edu.au/rac/

http://integrall.bio.ua.pt/



Es una herramienta bioinformática capaz de detectar genes existentes y posibles nuevos

genes de resistencia a los antibióticos.

Se basa en un programa que usa BLAST local con un software llamado Bio-Edit que

permite el análisis de secuencias por línea de comando entre otras características (Gupta

et al., 2014).

Este programa funciona en Windows 95/98/NT/2000/XP/7. La versión actual es la 7.2.5,

actualizada por última vez el 12/11/2013, ya no se le hace mantenimiento.

Este sistema se encuentra alojado en: The Méditerranée Infection Foundation, France. En

la siguiente URL: http://en.mediterranee-infection.com/article.php?laref=283%26titre=arg-

annot

▪ RED DB (Resistance determinants database)

Esta base de datos posee un repositorio de genes adquiridos que son capaces de conferir

resistencia a los antibióticos (completa o parcialmente secuenciados)

No se hace distinción entre genes adquiridos y genes mutados

Es una herramienta bioinformática que es capaz de detectar genes de resistencia a

antibióticos existentes y putativos. Los datos que tiene no son curados. El sitio esta

deshabilitado.

La base de datos se encuentra alojada en: Università di Siena, Italy. En la siguiente url:

http://www.fibim.unisi.it/REDDB/

▪ Resfam

http://en.mediterranee-infection.com/article.php?laref=283%26titre=arg-annot

http://en.mediterranee-infection.com/article.php?laref=283%26titre=arg-annot

http://www.fibim.unisi.it/REDDB/

Capitulo 1 35

Es una base de datos curada de las familias de proteínas y perfiles asociados a modelos

ocultos de Markov (Por sus siglas en inglés HMMs, Hidden Markov Model), confirmados

para función de resistencia a antibióticos y organizados por ontología (Gibson et al., 2015).

La última versión fue la 1.2 y la última vez que fue actualizada fue el 27 de enero del año

2015. Esta base de datos no ha vuelto a tener mantenimiento.

La base de datos se encuentra alojada en: Center for Genome Sciences and Systems

Biology, Washington University in St. Louis School of Medicine, USA (Dantas’ laboratory).

En la siguiente url: http://www.dantaslab.org/resfams/

▪ ARDB (base de datos de genes de resistencia a antibióticos)

Es un repositorio de genes adquiridos que son capaces de conferir resistencia a los

antibióticos (completa o parcialmente secuenciadas). No se hace distinción entre genes

adquiridos y genes mutados

Es una herramienta bioinformática que es capaz de detectar genes de resistencia a

antibióticos existentes y putativos (Liu and Pop, 2009).

La última actualización que tuvo fue el 3 de julio de 2009, no recibe mantenimiento, pero

esta base de datos fue la base para CARD (The comprehensive antibiotic resistance

database)

La base de datos se encuentra alojada en: Center for Bioinformatics and Computational

Biology, University of Maryland, USA. En la siguiente url: http://ardb.cbcb.umd.edu/

▪ MBLED (Metallo-betalactamase engineering database)

Es una base de datos de Metallo-β-lactamasas que proporciona información sobre

mutaciones, secuencias y estructuras de las β-lactamasas clase B, subclases B1, B2 y B3.

Esta base de datos no hace uso de la herramienta BLAST.

http://www.dantaslab.org/resfams/

http://ardb.cbcb.umd.edu/



La última versión publicada fue la 1.0, y la última vez que se actualizó fue el 30 de abril de

2012. No recibe mantenimiento.

La base de datos se encuentra alojada en: Institute of Technical Biochemistry, University

of Stuttgart, Germany. En la siguiente url: http://www.mbled.uni-stuttgart.de/

1.6.3 Otras herramientas

Las siguientes herramientas computacionales proveen visualmente perfiles de resistencia

genómicos.

▪ ARIBA: Antimicrobial Resistance Identification by Assembly

Es una herramienta de Sanger Institute que identifica los genes de resistencia antibiótica

ejecutando alineamientos locales. También se puede utilizar para identificación por MLST.

La entrada es un archivo FASTA de secuencias de referencia (puede ser una mezcla de

genes y secuencias no codificantes) y lecturas de secuencias emparejadas. ARIBA informa

cuáles de las secuencias de referencia fueron encontradas, además de proveer

información detallada sobre la calidad de los ensamblajes y cualquier variante entre las

lecturas de secuenciación y las secuencias de referencia.

ARIBA a la fecha requiere las siguientes dependencias, preinstaladas: Python3 versión

3.3.2, Bowtie2 versión 2.1.0, CD-HIT versión 4.6 y MUMmer versión 3.23. Además, las

siguientes dependencias de varios paquetes de Python. Dendropy 4.2.0, matplotlib,

pyfastaq 3.12.0, pysam 0.9.1 y pymummer 0.10.1.

Se encuentra en la siguiente url: https://github.com/sanger-pathogens/ariba

▪ Mykrobe Predictor

Está diseñado para ser utilizado por microbiólogos y médicos, proporcionando la

información necesaria para elegir el mejor tratamiento. Analiza todo el genoma de una

http://www.mbled.uni-stuttgart.de/

https://github.com/sanger-pathogens/ariba

Capitulo 1 37

muestra bacteriana, en un par de minutos, y predice a qué fármacos es más resistente de

acuerdo al tipo de infección.

Funciona con una base de conocimiento curada de alelos resistentes y susceptibles,

ensamblados en un gráfico de Bruijn de acuerdo a diferentes antecedentes genéticos, junto

con muchos ejemplos de genes de resistencia. Esto forma un gráfico de referencia. Luego

compara directamente el gráfico de Bruijn de la muestra con el gráfico de referencia. Esto

da como resultado las pruebas estadísticas para la presencia de alelos de resistencia que

no son imparciales por elección de referencia o suposiciones de clonalidad (Bradley et al.,

2015).

Corre en los sistemas operativos: Windows, Mac OS X, Linux. Requiere más o menos

300Mb of RAM. El Tiempo de ejecución es entre 40 segundos y 3 minutos. Soporta

secuenciación por Illumina y Nanopore (en desarrollo)

De momento solo funciona para 2 bacterias, Staphylococcus aureus y Mycobacterium

tuberculosis, Sin embargo, este software aún no está certificado para uso clínico.

Se encuentra en la siguiente url: http://www.mykrobe.com/products/predictor/

http://www.mykrobe.com/products/predictor/



2. Objetivos

2.1 General

Diseñar e implementar un sistema de información para la identificación de los elementos

genómicos asociados a los mecanismos de resistencia que permitan predecir el perfil de

resistencia de una bacteria.

2.2 Específicos

▪ Identificar los elementos genómicos asociados a los mecanismos de resistencia en las

secuencias de los genomas de A. baumannii obtenidas por WGS

▪ Establecer un modelo de correlación entre los elementos genómicos asociados a los

mecanismos de resistencia y el perfil fenotípico de resistencia.

▪ Diseñar e implementar una herramienta informática que permita almacenar y

automatizar la Identificación de los elementos genómicos asociados a los mecanismos

de resistencia.

▪ Probar la lógica y funcionalidad de la herramienta con la colaboración de expertos y

usando datos reales.

3. Metodología

La presente tesis de maestría parte de la idea de solucionar el problema de identificar los

elementos genómicos de resistencia asociados a los mecanismos de resistencia para

obtener un perfil de resistencia a los antibióticos en Acinetobacter baumannii, haciendo la

evaluación de los elementos genómicos de resistencia desde el nivel de los aminoácidos

que están codificados en el elemento genómico (no comparando los elementos genómicos

desde nucleótidos como lo hace el programa ResFinder, este programa está mencionado

en el subcapítulo 1.6.1), por lo cual se requiere un proceso de anotación depurado y

específico que permita cumplir esta necesidad. De este modo el proceso de ensamblaje,

pero aún más el de anotación de los genomas es de suma importancia. Para luego pasar

a evaluarlo teóricamente bajo la dirección de la literatura en resistencia para A. baumannii.

Cada una de las tablas presentadas en este capítulo incluida las presentadas en los

Anexos (excepto las tablas del subcapítulo 3.2, y el Anexo Error! Reference source not

found.), son extraídas de a través de consultas a la base de datos de este proyecto de

grado.

3.1 Obtención de los datos

105 muestras fueron suministradas al Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional

de Colombia sede Bogotá, por parte del Instituto Nacional de Salud (INS), junto con los

datos sociodemográficos y clínicos asociados a las muestras, los perfiles fenotípicos de

resistencia y la identificación de algunos genes de resistencia sintetizados a través PCR.

89 muestras fueron identificadas positivamente A. baumannii, de los cuales fueron

obtenidos los perfiles de resistencia a antibióticos utilizados en el presente trabajo.



3.1.1 Clasificación de los antibióticos

Se debe plantear una clasificación base para los antibióticos, que sea completa y que

permita realizar las comparaciones adecuadas para los perfiles fenotípicos y genómicos

de resistencia.

Haciendo una búsqueda generalizada por internet, y preguntado a expertos en el tema, se

encuentra la dificultad de crear un consenso en las clasificaciones. La base de datos de

CARD (Jia et al., 2017). Posee su propia ontología de resistencia antibióticos, que aún

sigue en desarrollo y se puede extraer de sus metadatos, aunque la jerarquía es confusa.

Finalmente la repuesta a esta situación la poseen los documentos del CLSI, “Normas de

Desempeño para la Prueba de Susceptibilidad a los Antimicrobianos” (Patel et al., 2015),

dentro de los cuales el glosario 1 presenta la designación de clase, subclase y nombre

genérico para antibióticos β-lactámicos y no β-lactámicos. Estos datos son utilizados.

Como base para llenar el catálogo de antibióticos en la base de datos del presente estudio,

Tabla 3-1. adaptándolo al caso particular de este trabajo; por ejemplo: las Cephems orales

están agrupadas en una sección independiente a las Cephems parenterales en el

documento del CLSI, aunque para efectos de la abstracción de este trabajo es necesario

colocar las Cephems orales junto a las Cephems parenterales en una sola categoría, la

cual a su vez contiene categorías como la de las cefalosporinas de primera, segunda,

tercera o cuarta generación, esto con el propósito de agrupar con mejor precisión los

diferentes grupos de Clasificación de β-lactamasas, capitulo 3.3, Ya que sin importar que

sean o parenterales pertenecen a las agrupaciones de primera, segunda o tercera

generación que aplica para ambos grupos.

Por otro lado cuando se cruza la información de los metadatos de CARD, contra los

antibióticos (y los mecanismos de resistencia), se encuentran varios agentes

antimicrobianos adicionales a los que contiene la clasificación del CLSI, para los cuales se

asignó una clase o una subclase dentro de los antibióticos, como ocurre con los agentes

aminocumarin y nybomycin, que hacen parte de las clases de las Quinolinas, o con los que

no se pueden asignar a una clase o subclase, se clasifican como “sin asignación”.

Error! Reference source not found.apítulo 3 41

Toda la información sobre la clasificación de los antibióticos se presenta en el Anexo C.

3.1.2 Extracción de ADN

La siguiente información es relevante dentro este trabajo porque hace parte del principio

de la información de todo el proyecto global, pero es importante recalcar que todo el

contenido de este sub capítulo, fue realizado por el grupo de Epidemiologia Molecular del

Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Sede Bogotá.

La información resumida y compilada para las 89 muestras está en el Anexo A en la Tabla

1-1.

▪ Extracción con el kit comercial UltraClean® Microbial DNA Isolation

Para la extracción del DNA mediante el kit comercial UltraClean® Microbial DNA Isolation

Kit (Catálogo 12214-250, MOBIO, Laboratories Inc) se partió de un inóculo (5 colonias)

bacteriano a partir de aislamientos de Acinetobacter baumannii. El inóculo se incubó

durante 4 horas a 37°C, en caldo Luria Bertani (LB) en agitación rotacional a 200 rpm hasta

alcanzar una densidad óptica entre 0,6 – 0.7 (λ 600 nm). Posteriormente, el inóculo se

centrifugó por 7 minutos a 5000 rpm, a temperatura ambiente, después de los cual se

descartó el sobrenadante y el pellet se lavó con 2 ml de buffer TE. Una vez se eliminó el

sobrenadante, el pellet bacteriano se resuspendió en 300 L de la solución MicroBead y

luego se transfirió al tubo MicroBead. Inmediatamente se adicionó 50 L de la solución

MD1 al tubo con lisado bacteriano. El MicroBead con el lisado celular se colocó

horizontalmente sobre un vórtex y se colocó a máxima velocidad por 10 minutos. Después

de ello, se centrifugó a 12.000 rpm por 1 minuto a temperatura ambiente y el sobrenadante

se transfirió a un nuevo tubo. Luego, se adicionó 100 L de la solución MD2 al

sobrenadante e inmediatamente se mezcló con vórtex por 5 segundos y se incubó a 4°C

por 5 minutos. Después de la incubación a 4°C se centrifugó el tubo por 1 minuto a 12.000

rpm, temperatura ambiente y se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo.

Posteriormente, se agregó 900 L de la solución MD3 al sobrenadante y se mezcló con

vórtex por 5 segundos. De la mezcla obtenida se cargó cerca de 700 L a un tubo con

una columna de sílica gel y se centrifugó por 1 minuto a 12.000 rpm a temperatura



ambiente, se descartó la solución obtenida en el tubo y se cargó de nuevo el resto de la

solución centrifugándose nuevamente con las mismas condiciones. Posterior se adicionó

300 L de la solución MD4 y se centrifugó por 1 minuto a 12000 rpm temperatura ambiente.

Posteriormente, se descartó la solución obtenida y se centrifugó de nuevo el tubo por un

minuto a 12000 rpm a temperatura ambiente. Finalmente, se adiciono 50 L de agua HPLC

estéril en el centro de la columna para eluir el DNA y se centrifugó a 12000 rpm por 1

minuto temperatura ambiente.

El DNA purificado fue cuantificado a 260 nm con el espectrofotómetro Nanodrop ND-

2000C (Termo scientific) y mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % utilizando

marcador cuantitativo HyperLadderTM 1 kb Plus (Bioline), realizando comparaciones con

diferentes concentraciones del DNA Fago Lambda 0,446 µg/µL (Invitrogen).

3.1.3 Secuenciación

Esta se realizó usando Hiseq2000 system (Illumina), obteniendo lecturas pareadas con un

promedio de tamaño de 101 pares de bases.

La cantidad de lecturas por muestra está en el Anexo A en la Tabla 1-1.

3.1.4 Análisis de calidad, Ajuste de calidad y Ensamblaje

El análisis inicial de calidad de las lecturas se realiza usando FastQC (Andrews, 2014).

El ajuste de la calidad cuando es necesario se utiliza Sickle (Joshi and Fass, 2011). Este

programa se usa por la facilidad de utilizarlo automáticamente dentro de un pipeline.

Las primeras 79 muestras se ensamblaron con SPAdes versión 3.8 (de las anteriores 79

muestras 66 fueron identificadas positivamente como A. baumannii) y varios meses

después, 25 muestras adicionales fueron ensambladas con SPAdes versión 3.10 (de las

cuales 23 fueron identificadas positivamente como A. baumannii) (Bankevich et al., 2012).

Los resultados indicaron que la diferencia de versiones de Spades no afectó la anotación

de los elementos genómicos de resistencia.


Cabe resaltar que también se realizaron pruebas de ensamblaje con Soap Denovo V.2.4

(Luo et al., 2012), y se realizaron algunas pruebas con Edena V.3 (Hernandez et al., 2014).

Pero finalmente luego de los análisis para escoger los mejores ensambles se utilizaron los

resultados obtenidos con el programa SPAdes.

La información resumida de las muestras está en el Anexo A, tabla 1-1 y 1-2.

3.1.5 Anotación

Este paso es de suma importancia dentro del proceso, aquí es donde se debe hacer la

identificación de los diferentes genes involucrados en los distintos mecanismos de

resistencia para luego poder evaluar el perfil genómico de resistencia. En el Anexo B, tabla

1-3, se encuentra un resumen de datos de anotación para las 89 muestras.

Por sugerencia de expertos se usa el programa bioinformático para anotación de

procariotas, llamado Prokka desarrollado inicialmente por Victorian Bioinformatics

Consortium, mantenido actualmente por el Torsten Seemann. (Seemann, 2014). Las

primeras 66 muestras se anotan con la versión 1.1, y las ultimas 23 con la versión 1.12.

De nuevo el cambio de versión se da por la diferencia en los meses en que se llevaron a

cabo estos procesos. Esta diferencia de versiones no tiene ningún efecto en cuanto a la

anotación de elementos genómicos de resistencia.

Prokka tiene la posibilidad de agregar más bases de datos para mejorar la anotación,

básicamente en 2 formas: uno o varios archivos en formato HMM, y un solo archivo en

formato multifasta.

Para anotar los genomas ensamblados de las muestras de este proyecto, a este programa

se le adicionaron las siguientes bases de datos: Un archivo multiFasta con 2285 proteínas

de resistencia que posee la base de datos de CARD (formateado para proyecto) (Jia et al.,

2017), complementado con 32 proteínas adicionales de resistencia encontradas en la

revisión bibliográfica especialmente dirigida a los elementos de resistencia reportados para

Acinetobacter baumannii, no incluidas en CARD. Se adicionó además la base de datos

“Resfams-full.hmm” con 170 HMM especializados para encontrar genes de resistencia



(Gibson et al., 2015). Aunque Prokka viene con una versión reducida de Pfam, esta se

reemplazó por la versión actualizada que existe en línea para los HMM de Pfam. (Bateman,

2004).

Adicionalmente, se incluyeron en el procesamiento de Prokka 3 bases de datos, la primera

es una base de datos con 57 HMM para detectar genes (factores) de virulencia VFDB

(Chen et al., 2016); la segunda corresponde a 60 HMM para encontrar transposasas

llamada Gipsy (Soares et al., 2016); la tercera se trata de 30 HMM adicionales de

transposasas reportados por Choumouss Kamoun (Kamoun et al., 2013). Esta última base

de datos fue extraída y unificada para que Prokka las pudiera usar en un solo archivo.

En el Anexo Error! Reference source not found. se presentan tablas con algunos genes

de resistencia de la siguiente forma: tabla 1-9 tiene 219 genes de resistencia identificados

para A. baumannii. La tabla 1-10 tiene 18 genes de resistencia, aunque no han sido

etiquetados explícitamente para A. baumannii son de importancia de acuerdo con la

literatura, algunos hacen parte del complejo Acinetobacter calcoaceticus-baumanii, otros

fueron identificados por primera vez en otras especies diferentes a A. Baumannii. La tabla

1-11 muestra los 170 HMM de Resfams cruzados con los Mecanismos de resistencia.

Finalmente se tiene otros 2060 genes de resistencia que hacen parte de CARD estos se

encuentran en la tabla 1-12 del mismo Anexo D.

Nota: El siguiente comando permite encontrar cualquier gen dentro del complejo

Acinetobacter al filtrar por taxonomía, en la página del NCBI, es muy útil cuando se tiene

un nombre de algún gen de resistencia, para lo cual en el espacio entre paréntesis gen

(NombreGen) de la línea, debe ir al nombre del gen:

((NombreGen) AND "g-proteobacteria"[porgn:__txid1236]) AND

"Moraxellaceae"[porgn:__txid468]

Como parte de las reglas para obtener el perfil teórico de resistencia genómica (ver 3.4),

fue necesario hacer una modificación al script principal de Prokka para que cuando se

ejecutará el programa Blast dentro del proceso de anotación, se pudiera obtener el

porcentaje de identidad, e-value y Q-cover en el tag "Product". Para esto se utilizó la librería


SearchIO de bioPerl y se adicionaron las siguientes líneas de código luego de la línea 1050

del script de Prokka versión 1.12 (que se encuentra en la carpeta bin):

my $hsps = $hit->next_hsp or next;

$cleanprod = $cleanprod . "|identity:" . $hsps->percent_identity . "|e-

value:" . $hsps->evalue . "|qcover:" . $hit->frac_aligned_query;

3.2 Documentación de la base de datos

El software que se utiliza para este trabajo, se eligió bajo algunos criterios tales como,

facilidad en el uso para todo el equipo, software libre, benchmarking comercial.

La primera parte del diseño de la base de datos se basa en la información que fue enviada

por el Instituto Nacional de salud (INS) sobre el estudio para Acinetobacter baumannii

realizado en los años 2012 a 2015 y otros documentos que permiten completar la

información sobre la resistencia Fenotípica.

La segunda parte del diseño se basa en la obtención de los perfiles de resistencia

genómica como un modelo teórico construido según la literatura sobre mecanismos y

genes de resistencia para A. baumannii principalmente. Además, se presta atención a la

correlación que estos perfiles genómicos deben tener con los perfiles resistencia

Fenotípica.

La base de datos está construida sobre MySQL Community Server 5.6.30 con la instalación

standard, en un servidor Dell, con sistema operativo OpenSuse Leap 42.1. El acceso a los

datos se realiza mediante una interfaz cliente-servidor llamada MySQL Workbech

Community Edition 6.3

3.2.1 Perfiles de Resistencia Fenotípica

La razón de esta sección es permitir la definición de los perfiles fenotípicos de resistencia

a antibióticos, proveyendo la información consolidada, además crea la base para un

sistema de fácil escalabilidad.



A continuación, se presentan las tablas implementadas para almacenar e integrar los datos

relacionados con la norma CLSI y sus modificaciones a través de los años 2012-2015 y los

datos de resistencia fenotípica obtenidos utilizando los métodos Kirby Bauer, Vitek2 y

Phoenix 100, junto con los de pruebas moleculares suministrados por el INS.

Es de destacar que la tabla clsi_antibiotico Tabla 3-2, es importante para establecer cuáles

fueron los antibióticos válidos para realizar el antibiograma para A. baumannii, los cuales

fueron definidos anualmente por el CLSI, entre 2012 y el 2015 (período que corresponde

a la fecha de recepción de las muestras por parte del Instituto Nacional de Salud).

Inicialmente la tabla relacion_orden Tabla 3-7, junto con la columna valor de la tabla

resistencia_fenotipica Tabla 3-8, por antibiótico CLSI según el año, tenía la intención de

permitir la comparación fácil contra la Concentración mínima inhibitoria (MIC) definida para

ese antibiótico en ese año en particular ( es importante recordar que cada año la MIC, para

cada micro organismo puede variar un poco).

Las tablas son las siguientes:


Figura 3-1: Diagrama E-R sobre resistencia fenotípica

Tabla 3-1: Descripción del catálogo antibiotico

Nombre de la tabla: antibiotico

Descripción de la tabla: Catalogo que guarda la información de todos los antibióticos definidos por el CLSI 2015 y todos los niveles del árbol que agrupan a los antibióticos.



Columna Tipo Rangos Validos

Permite Nulos Descripción

Id_antibiotico int(11) AI PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

Nombre varchar(100) Ascii hasta 100 No

Nombre del antibiótico genérico (como describe el CLSI 2015) o nombre del grupo, clase o subclase.

Id_padre int(11) Entre 1 y 2147483647 Si

Llave foránea a la llave primaria de esta misma tabla, Sirve para crear las agrupaciones y dependencias en un árbol lógico.

Activo bit(1) True o False No

Señala si este registro se encuentra activo o no

origen varchar(50) Ascii hasta

50 No

Inicialmente la ontología de antibióticos se tomó del CLSI año 2015 y luego se sumaron algunos más de la base de

resistencia a antibióticos CardDB

id_nivel_antibiotico int(11) Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo nivel_antibiotico

Tabla 3-2: Descripción del catálogo clsi-antibiotico

Nombre de la tabla: clsi_antibiotico

Descripción de la tabla: Es un catálogo que cruza la información de los antibióticos válidos para un organismo dado según el documento del CLSI 2015



id_clsi_antibiotico int(11) AI PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

ano int(11) Entre 2012 a 2016 No

id_organismo int(11) Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador del catálogo tabla organismo

id_antibiotico int(11) Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador del catálogo tabla antibiotico, siempre señala el nivel del antibiótico, nunca el grupo

Tabla 3-3: Descripción del catálogo sigla_antibiotico

Nombre de la tabla: sigla_antibiotico


Descripción de la tabla: Es un catálogo de la sigla o siglas usadas para cada uno de los antibióticos (algunas siglas son iguales para diferentes antibióticos) este catálogo también es tomado del documento CLSI 2015.



id_sigla_antibiotico int(11) AI PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

sigla varchar(15)

Ascii hasta 15 No

los caracteres que componen la Sigla, teniendo en cuenta si son mayúscula o minúsculas


Llave foránea al identificador de la tabla catálogo antibiótico, siempre al nivel del nombre genérico

Tabla 3-4: Descripción del catálogo equipo

Nombre de la tabla: equipo

Descripción de la tabla: Catalogo que guarda los equipos o técnicas válidas para realizar los antibiogramas



Id_Equipo int(11) PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

Nombre varchar(45) Ascii hasta 45 No

Nombre de la técnica o tecnología usada para hacer el antibiograma: Kirby Bauer, Vitek2, Phoenix 100

Tabla 3-5: Descripción del catálogo interpretacion

Nombre de la tabla: interpretacion

Descripción de la tabla: Catalogo para calificar la resistencia a los antibióticos, en una escala discreta.



Id_Interpretacion int(11) PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

Descripcion varchar(45) Ascii hasta 45 No

Se tienen 4 opciones, 3 de estas hacen la calificación discreta de la resistencia así: Resistente, Intermedio, Susceptible, No se realizó

Tabla 3-6: Descripción del catálogo nivel_antiobiotico

Nombre de la tabla: nivel_antobiotico



Descripción de la tabla: Catalogo que describe el nivel dentro del árbol de agrupación de los antibióticos.



Id_nivel_antobiotico int(11) PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

nivel varchar(45) Ascii hasta 45 No

Actualmente hay 5 niveles, definidos así: Grupo, Clase, Subclase1, Subclase2, Nombre Genérico

Tabla 3-7: Descripción del catálogo relacion_orden

Nombre de la tabla: relacion_orden

Descripción de la tabla:

Catálogo que define las relaciones de orden que permiten comparar con números la resistencia antibióticos según los antibiogramas. Puede servir de ser necesario, para obtener un reporte particular sobre la relación orden en la resistencia fenotípica, especialmente para la técnica Kirby bauer.



Id_Relacion_orden int(11) PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

Simbolo varchar(10) Ascii hasta 10 No

Tenemos los siguientes 5 símbolos separados por coma: = , < , <= , > , >=

Descripcion varchar(20) Ascii hasta 20 No

Es solo la descripción en palabras de los símbolos definidos

Tabla 3-8: Descripción de la tabla resistencia_fenotipica

Nombre de la tabla: resistencia_fenotipica

Descripción de la tabla: Esta tabla permite relacionar las tablas catálogos de este sub-modulo, para guardar los resultados de todos los antibiogramas realizados a cada una de las muestras.



Id_Resistencia_Fenotipica int(11) AI PK

Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

Id_muestra int(11) Entre 1 y 2147483648 No

Llave foránea al identificador de la tabla muestra

Id_antibiotico int(11) Entre 1 y 2147483649 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico, siempre al nivel del nombre genérico

Id_interpretacion int(11) Entre 1 y 2147483650 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo interpretación


Id_equipo int(11) Entre 1 y 2147483651 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo equipo

Id_relacion_orden int(11) Entre 1 y 2147483652 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo relacion_orden

valor varchar(10) Ascii hasta 10 No

El valor que le corresponde a la muestra dada para este antibiótico particular, según el equipo usado.

Tabla 3-9: Descripción del catálogo mdrxdrpdr_antibiotico

Nombre de la tabla: mdrxdrpdr_antibiotico


Es un catálogo con 2 niveles, que define según el organismo las categorías y agentes antimicrobianos usados que definen MDR (Multiple drug resistance), XDR(Extensively drug-resistant) y PDR (pandrug-resistant).



id_mdrxdrpdr_antibiotico int(11) AI PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

id_antibiotico int(11)

Entre 1 y 2147483649 si

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico, siempre al nivel del nombre genérico cuando se trata de un agente, cuando es una categoría esta en NULL


Llave foránea al identificador de la tabla catalogo organismo

categoria varchar(100) Ascii hasta 100 No

Se guarda el nombre de la categoría que difiere de las categorías que usa el CLSI, cuando es un agente se guarda el nombre de este

id_padre int(11) Entre 1 y 2147483652 si

Llave foránea a la llave primaria de esta misma tabla, sirve para saber cuál categoría le corresponden que agentes.

Tabla 3-10: Descripción de la tabla resistencia_fenotipica_consolidado

Nombre de la tabla: resistencia_fenotipica_consolidado


Esta tabla es una sub agrupación de la tabla "resistencia_fenotipica" donde se hace un consolidado según equipo de la siguiente forma: se toma los datos de Kirby Bauer como prioritarios, luego los que no estén allí y existan en Vytek y finalmente lo que no estén en los anteriores y existan en Phoenix.





Id_Resistencia_Fenotipica int(11) AI PK

Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico



Id_antibiotico int(11) Entre 1 y 2147483649 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico, siempre al nivel del nombre genérico

Id_interpretacion int(11) Entre 1 y 2147483650 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo interpretación

Id_equipo int(11) Entre 1 y 2147483651 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo equipo

Id_relacion_orden int(11) Entre 1 y 2147483652 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo relacion_orden

valor varchar(10)

Ascii hasta 10 No

El valor que le corresponde a la muestra dada para este antibiótico particular, según el equipo usado.

3.2.2 Datos moleculares sumistrados por el INS

Las tablas y los datos de las siguientes tablas se utilizaron para almacenar los datos de

pruebas moleculares reportadas por el Instituto Nacional de Salud.

Figura 3-2: Diagrama E-R para genes identificados por PCR


Tabla 3-11: Descripción del catálogo estado_edta_pcr

Nombre de la tabla: estado_edta_pcr

Descripción de la tabla: Catalogo que define los estados de existencia de un Gen según pruebas microbiológicas



id_estado_EDTA_PCR int(11) PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

Estado varchar(45) Ascii hasta 45 No

Negativo: NO se encontró el gen, Positivo: Si se encontró el Gen, No Realizado: No se hizo esa prueba Microbiológica

Tabla 3-12: Descripción del catálogo estado_edta_pcr

Nombre de la tabla: pcr_edta

Descripción de la tabla: Es el catálogo de todas las pruebas moleculares microbiológica que fueron realizadas, con el propósito de detectar genes conocidos resistentes a antibióticos a través de PCR



Id_pcr_edta int(11) PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

nombre varchar(45)

Ascii hasta 45 No

Nombre la prueba microbiológica, actualmente tenemos 12: EDTA/SMA, PCR blaNDM, PCR blaKPC, PCR blaVIM, PCR blaGES, PCR blaIMP, PCR blaOXA-48, PCR blaOXA-23, PCR blaOXA-24, PCR blaOXA-51, PCR blaOXA-58, PCR blaOXA-143

Tabla 3-13: Descripción de la tabla gen_fenotipico

Nombre de la tabla: gen_fenotipico

Descripción de la tabla: Esta tabla permite relacionar las tablas catálogos de este sub modulo, para guardar los resultados de las pruebas de detección de genes de resistencia a antibióticos conocidos.



Id_gen_fenotipico int(11) AI PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

Id_estado_edta_pcr int(11) Entre 1 y 2147483648 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo estado_edta_pcr



Id_pcr_edta int(11) Entre 1 y 2147483649 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo pcr_edta



3.2.3 Reglas pasivas de resistencia y Perfil de resistencia genómica.

Es importante tener en cuenta que todos los datos sobre genes de resistencia que se van

a anotar, deben estar incluidos en el catálogo de “gen_resistencia” Tabla 3-16, sin

excepciones.

Los genes de resistencia fueron ordenados de acuerdo con los mecanismos definidos para

este trabajo, que son los siguientes: Degradación o Modificación del Antibiótico, Alteración

de Porina, Bombas de Eflujo (entre estas se tiene las siguiente: MATE, ABC, MFC, RND,

SMR), Cambio de Sitio Blanco, Proteína de Protección, Modulación de genes, Elementos

Móviles, los cuales fueron presentados los apartes 1.3 y 1.4 del presente documento.

A continuación, se presentan las tablas implementadas para almacenar e integrar los datos

de los genes y reglas pasivas relacionadas con los elementos genómicos asociados a los

perfiles de resistencia genómica.


Figura 3-3: Diagrama E-R para el perfil genómico de resistencia

Tabla 3-14: Descripción del catálogo mecanismo_resistencia

Nombre de la tabla: mecanismo_resistencia

Descripción de la tabla: Catalogo que guarda estructuralmente los mecanismos y sub mecanismos de resistencia a antibióticos señalados en la literatura.



id_mecanismo_resistencia int(11) PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

nombre varchar(45) Ascii hasta 45 No

Nombre que identifica al mecanismo, o el nombre que agrupa más mecanismos

id_padre int(11)

Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea a la llave primaria de esta misma tabla, Sirve para crear las agrupaciones y dependencias en los respectivos niveles de los mecanismos de resistencia

Tabla 3-15: Descripción de la tabla gen_mecanismo_resistencia

Nombre de la tabla: gen_mecanismo_resistencia


Permite relacionar las tablas de los mecanismos de resistencia con la tabla catálogo de los genes de resistencia, y además califica a los genes agrupado por sus mecanismos (inicialmente)



Id_gen_resistencia int(11) PK Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea a la llave primaria de la tabla gen_resistencia

Id_mecanismo_resistencia int(11) PK Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea a la llave primaria de la tabla mecanismo_resistencia

porcentaje_identidad double

de 0 a 100, con decimales No

Configura el porcentaje de identidad mínimo que deben tener los genes de resistencia para ser evaluados dentro del perfil genómico de resistencia, agrupado por mecanismos inicialmente. Para los HMM se define en 0


qcover float

Entre 0 y 1 No

Configura el porcentaje de cobertura mínimo que deben tener los genes de resistencia para ser evaluados dentro del perfil genómico de resistencia, agrupados por mecanismos inicialmente. Para los HMM se define en 0

Tabla 3-16: Descripción del catálogo gen_resistencia

Nombre de la tabla: gen_resistencia

Descripción de la tabla: Catalogo que guarda todos los elementos genómicos de resistencia a antibióticos identificados para este proyecto, señalados en la literatura.



id_gen_resistencia int(11) AI PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico


Nombre del elemento genómico de resistencia.


Llave foránea al identificador de la tabla catalogo organismo

secuencia mediumtext

texto hasta 16777215 No

Secuencia o cadena de caracteres, sin diferenciar mayúsculas de minúsculas, que corresponden al elemento genómico de resistencia (ej. cadena de aminoácidos)

detalle varchar(200) Ascii hasta 200 Si

Una breve descripción sobre el elemento genómico en cuestión

proteinaOnucleotido enum('proteina

','nucleotido') Incluido en el tipo No

Solo permite escoger para esta enumeración si se trata de una secuencia de nucleótidos o de una secuencia de proteínas

iden1 varchar(45) Ascii hasta 45 No

Primer identificador del encabezado del archivo de origen de estos genes de resistencia.

iden2 varchar(100) Ascii hasta 100 No

Segundo identificador del encabezado del archivo de origen de estos genes de resistencia.

desc1 varchar(500) Ascii hasta 500 Si

Alguna descripción extra, o especial sobre el gen o este elemento de resistencia.



id_fuente int(11)

Entre 1 y

2147483647 No

Identificador al catálogo de la tabla

"fuente", donde describe el origen de

este gen de resistencia, en este

momento se tiene 3: CardDB, Resfam, y

Propio

perfilXregla bit(1) verdadero o falso No

Es un filtro para indicar si este gen está contemplado dentro de una de las reglas de resistencia (verdadero), o se evalúa directamente desde esta tabla (falso).

blactamEnGrupo bit(1)

verdadero o falso No

Indica si el gen en cuestión se debe evaluar como una beta-lactamasa que tiene asociación de resistencia a antibióticos con otras tablas especiales para este.

Tabla 3-17: Descripción de la tabla resistencia_genomica1

Nombre de la tabla: resistencia_genomica1

Descripción de la tabla: Es la tabla base que guarda la anotación, pero únicamente las características de resistencia por cada muestra teniendo en cuenta que sus características anotadas son las del catálogo "gen_resistencia"



id_resistencia_genomica int(11) AI PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

id_muestra int(11) Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo muestra

contig int(11) Ascii hasta 45 No

El numero perteneciente a la ubicación dentro del archivo ensamblado que corresponde al contig

locus_Tag int(11) Entre 1 y 2147483647 No

Es la parte entera del identificador locus tag que se usa en la anotación de características genómicas

pos_inicio int(11) Entre 1 y 2147483647 No

la posición inicial (en bases) de la característica dentro del contig

pos_fin int(11) Entre 1 y 2147483647 No

la posición final (en bases) de la característica dentro del contig


hebra tinyint(4)

1 o -1 No Dirección con la cual está orientada esta característica

porcentaje_identidad double

de 0 a 100, con decimales No

Es el porcentaje de identidad en el hit dado por uso de blast para la identificación de la característica, Si fue un HMM el resultado es 0

e_value varchar(20)

Ascii números > 0 No

Es el valor esperado del hit dado por uso de blast para la identificación de la característica, Si fue un HMM el resultado es 0

qcover float

Entre 0 y 1 No

Es el porcentaje de cobertura en el hit por uso de blast para la identificación de la característica, Si fue un HMM el resultado es 0

id_gen_resistencia int(11) Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo gen_mecanismo_antibiotico

id_caracteristica int(11) Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo gen_mecanismo_antibiotico

id_fuente int(11)

Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo fuente. Que indica el origen de este gen de resistencia, en este momento se tiene 3: CardDB, Resfam y Propio

Tabla 3-18: Descripción de la tabla gen_antibiotico_resistencia

Nombre de la tabla: gen_antibiotico_resistencia


Es la tabla que cruza la información entre la tabla de antibióticos y la tabla del catálogo de genes de resistencia "gen_resistencia", además permite calificar este cruce de datos con el nivel de resistencia y agruparlo por la correspondencia según el perfil de resistencia fenotípica.





id_gen_resistencia int(11) Entre 1 y 2147483648 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo gen_resistencia


Llave foránea al identificador de la tabla catalogo antibiótico

Id_interpretacion int(11)

Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo interpretación, que permite calificar cada gen según el antibiótico dado asignándole el nivel de resistencia correspondiente. Responde a la segunda regla.

id_correspondencia_antibiotico int(11)

Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo correspondecia_antibiotico que permite agrupar los genes que se van a evaluar según la resistencia antibióticos dada por el perfil de resistencia fenotípico.

Tabla 3-19: Descripción del catálogo correspondencia_antibiotico

Nombre de la tabla: correspondencia_antibiotico

Descripción de la tabla: Es el catalogo que permite hacer una agrupación o filtro del cruce entre las tablas: antibiótico y gen_resistencia. Para cumplir con la regla uno 3.4.1.



id_correspondencia_antibiotico int(11) PK Entre 1 y 2147483648 No

Identificador auto numérico

descripcion varchar(45)

Entre 1 y 2147483650 No

La descripción de la agrupación. Actualmente se tiene: Sin correspondencia, 8 antibióticos principales, sub clases y clases de los 8 base, Sin precisión.


Tabla 3-20: Decripción de la tabla gen_operon_resistencia

Nombre de la tabla: gen_operon_resistencia


La tabla que permite la relación de muchos a muchos entre el catálogo de genes de resistencia y la tabla de operónes de resistencia que hace referencia a las Bombas tipo RND. (Tercera Regla 3.4.3)



id_gen_resistencia int(11) PK Entre 1 y 2147483648 No


id_operon_resistencia int(11) PK Entre 1 y 2147483650 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo operon_resistencia

Tabla 3-21: Descripción del catálogo operon_resistencia

Nombre de la tabla: operon_resistencia

Descripción de la tabla: Es el catalogo que posee la arquitectura de la conformación los operónes de resistencia y los reguladores de estos operónes, que hacen parte de las bombas eflujo tipo RND. (Tercera Regla 3.4.3)



id_operon_resistencia int(11) PK Entre 1 y 2147483648 No Identificador auto numérico

nombre varchar(45)

Ascii hasta 45 No

Nombre de identificación del operón, del regulador o del gen

tipo

enum('operon',

'promotor', 'regulador')

Incluido en el tipo No

Para identificar qué clase de objeto genético se esta referencia en registro, realmente se están usando solo 2 o es un operón o es un regulador, para el operón ya definido

direccion int(11) Entre 1 y 2147483648 No

indica la dirección en la cual se debe dirigir la hebra de este gen



id_hermanoAtras int(11)

Entre 1 y 2147483648 Si

Llave foránea a la llave primaria de esta misma tabla, sirve para crear la posición del gen dentro del operón o del gen dentro regulador o del regulador con respecto al operador. Indicando cual es el gen que debe ir atrás.

id_hermanoAdelante int(11)

Entre 1 y 2147483648 Si

Llave foránea a la llave primaria de esta misma tabla, sirve para crear la posición del gen dentro del operón o del gen dentro regulador o del regulador con respecto al operador. Indicando cual es el gen que debe ir adelante.

nombreGen varchar(200)

Ascii hasta 200 No

El mismo nombre del gen que corresponde a la tabla gen_resistencia, para mejorar la visualización de los datos

Tabla 3-22: Descripción de la tabla bombas_rnd_antibiotico

Nombre de la tabla: bombas_rnd_antibiotico


La tabla que permite relacionar únicamente los operónes por nombre contra la tabla de antibióticos, porque esto es una excepción que precisamente se identifica en el filtro ""perfilXRegla" de la tabla "gen_antibiotico. (Tercera Regla)




Nombre del operón de resistencia



Tabla 3-23: Descripción de la tabla bombas_rnd

Nombre de la tabla: bombas_rnd



Es la tabla donde se aloja la operación final de identificación de los operónes y reguladores de resistencia por muestra, luego de ser previamente identificado todo según el catálogo de resistencia y el script en python para bombas eflujo tipo RND. (Tercera Regla 3.4.3)



id_bombas_rnd int(11) AI PK Entre 1 y 2147483650 No Identificador auto numérico

nombreOperon varchar(45) Ascii hasta 45 No

Nombre con el que se identifica el operón según la tabla operon_resistencia



nombreRegulador varchar(45) Ascii hasta 45 Si

Nombre con el que se identifica el regulador según la tabla operon_resistencia

tieneRegulador bit(1) Verdadero o falso No

Indica si este operón posee un regulador o no encontrado según las operaciones

contig_operon int(11) Entre 1 y 2147483650 No

El número del contig donde fue encontrado el operón

pos_inicio_operon int(11) Entre 1 y 2147483650 No

La posición inicial donde comienza el primer gen del operón de resistencia

pos_fin_operon int(11) Entre 1 y 2147483650 No

La posición final donde comienza el primer gen del operón de resistencia

pos_inicio_regulador int(11) Entre 1 y 2147483650 Si

La posición inicial donde comienza el primer gen del regulador de resistencia

pos_fin_regulador int(11) Entre 1 y 2147483650 Si

La posición final donde comienza el primer gen del regulador de resistencia

Tabla 3-24: Descripción de la tabla mutación_gen_resistencia

Nombre de la tabla: mutacion_gen_resistencia




La tabla que permite la relación de muchos a muchos entre el catálogo de genes de resistencia y la tabla de que hace referencia a genes que con mutaciones puntuales son resistentes a antibióticos. (Quinta Regla 3.4.5)





id_mutacion_resistencia int(11) PK Entre 1 y 2147483650 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo mutacion_resistencia

Tabla 3-25: Descripción de la tabla mutación_resistencia

Nombre de la tabla: mutacion_resistencia


La tabla que permite la relación de muchos a muchos entre el catálogo de genes de resistencia y la tabla de que hace referencia a genes que con mutaciones puntuales son resistentes a antibióticos. (Quinta Regla 3.4.5)



id_mutacion_resistencia int(11) PK Entre 1 y 2147483648 No Identificador auto numérico

nombre varchar(45)

Ascii hasta 45 No

Nombre que se le va a dar a esta mutación. Actualmente hay 2 únicamente: gyrA (S83L), parC S80L or W,E84K and G78C)

mutacionRegex varchar(45)

Ascii hasta 45 No

Es la expresión regular que permite encontrar la mutación de resistencia dentro de la secuencia de aminoácidos del gen correspondiente

Tabla 3-26: Descripción del catalogo blactam_clase

Nombre de la tabla: blactam_clase



Catálogo que contiene la clasificación más amplia que tienen las β-lactamasas, es decir por clase molecular y/o subclase, actualmente posee 6 clases. Finalmente, solo sirve como referencia a este tipo de agrupación obtenido de la literatura para el modelo de base de datos actual.



id_blactam_clase int(11) PK Entre 1 y 2147483648 No Identificador auto numérico

nombre varchar(45)

Ascii hasta 45 No

Es el nombre de la clase molecular y subclase. Con las siguientes 6 posibilidades: A, B1, B2, B3, C, D

Tabla 3-27: Descripción del catálogo blactam_grupo

Nombre de la tabla: blactam_grupo


Catálogo que contiene la clasificación del grupo funcional para las β -lactamasas, según la clasificación Bush-Jacoby. Esta tabla permite señalar los grupos de resistencia a antibióticos, así que incluso existen más registros que grupos funcionales según la clasificación Bush-Jacoby por que se debe subdividir según la resistencia a antibióticos.



id_blactam_grupo int(11) PK Entre 1 y 2147483648 No Identificador auto numérico


Es el nombre del grupo funcional actualmente posee 20 registros

id_blactam_clase int(11) PK Entre 1 y 2147483650 No

Llave foráea al identificador de la tabla catalogo blactam_clase

Tabla 3-28: Descripción de la tabla blactam_grupo_gen

Nombre de la tabla: blactam_grupo_gen


Esta tabla permite la relación de muchos a muchos entre la tabla gen_resistencia y blactam_group, por lo cual crea la asociación de cuales genes pertenecen a que grupo funcional de β-lactamasa.





id_blactam_grupo int(11) PK Entre 1 y 2147483648 No Identificador auto numérico



Tabla 3-29: Descripción de la tabla blactam_grupo_antibiotico

Nombre de la tabla: blactam_grupo_antibiotico


Es la tabla que cruza la información entre la tabla de antibióticos y la tabla del catálogo de grupos de beta-lactamasas "blactam_group", además permite calificar este cruce de datos con el nivel de resistencia y agruparlo por la correspondencia según el perfil de resistencia fenotípica. Funciona de forma similar que la tabla "gen_antibiotico_resistencia".



id_blactam_grupo int(11) Entre 1 y 2147483648 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo blactam_grupo




Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo interpretación, que permite calificar el grupo funcional para el antibiótico dado, asignándole el nivel de resistencia correspondiente. Respondiendo así a la segunda regla.



Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo correspondecia_antibiotico que permite agrupar los grupos funcionales de beta-lactamasas que se van a evaluar según la resistencia antibióticos dada por el perfil de resistencia fenotípico.

Tabla 3-30: Descripción del catálogo fuente

Nombre de la tabla: fuente

Descripción de la tabla: Pequeño catálogo que contiene el origen o fuente de los genes de resistencia con los cuales se trabajan en este proyecto.



id_fuente int(11) PK Entre 1 y 2147483648 No Identificador auto numérico

detalle varchar(45)

Ascii hasta 45 No

Indica el nombre o detalle de los datos. En este momento se tiene 3: CardDB, Resfam y Propio

Tabla 3-31: Descripción de la tabla perfil_resistencia_genomica1

Nombre de la tabla: perfil_resistencia_genomica1


Es la tabla permite agrupar por elementos de resistencia según todas las reglas de resistencia a antibióticos descritas, para poder evaluar un perfil genómico de resistencia, es un paso intermedio y necesario según el modelo para definir el perfil genómico.



id_perfil_resistencia_genomica1 int(11)

AI PK Entre 1 y 2147483647 No






id_resistencia_genomica1 int(11) Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo resistencia_genomica1




Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo interpretación, que permite calificar el grupo funcional o gen para el antibiótico dado, asignándole el nivel de resistencia correspondiente. Respondiendo así a la segunda regla.


Entre 1 y 2147483647 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo correspondecia_antibiotico que permite agrupar los grupos funcionales de beta-lactamasas o genes que se van a evaluar según la resistencia antibióticos dada por el perfil de resistencia fenotípico.

Tabla 3-32: Descripción de la tabla perfil_genomico

Nombre de la tabla: perfil_genomico

Descripción de la tabla: Consolida un consenso para definir un perfil genómico de resistencia orientado a la resistencia por antibiótico y calificándolo con un valor para una muestra dada.



id_perfil_genomico int(11) AI PK Entre 1 y 2147483647 No





id_antibiotico int(11)

Entre 1 y 2147483650 No


valor int(11)

Entre 1 y 2147483647 No

Es un valor entero que califica la resistencia a determinado antibiótico, donde los valores <= 0 corresponde a susceptible, 1 es intermedio y >= 2 es resistente.

3.2.4 Metadatos de la base de datos CARD y Resfams

Son datos adicionales a los genes de resistencia, que permiten cruzar (se crearon una

serie de scripts MySQL para cada caso y versión, scripts que se encuentran dentro del

repositorio de archivos del trabajo en la carpeta “COMPLEMENTARIOS”) los datos de los

catálogos de “mecanismos de resistencia” Tabla 3-14, y “antibióticos” Tabla 3-1, con los

genes de resistencia que estas bases proveen. Estos metadatos tuvieron que ser

adaptados a los mecanismos definidos para este proceso, y fue posible adaptarlos debido

a que los mecanismos usados logran englobar todo lo que los metadatos proveen.

A continuación, se presentan las tablas implementadas:

Figura 3-4: Diagrama E-R para Metadatos de la base de datos CARD y ResFams.



Tabla 3-33: Descripción tabla metadata CARD, aro_categories

Nombre de la tabla: aro_categories


Es la tabla principal de la metadata de la base de datos de CARD, tomada de un archivo con extensión csv. Aquí se encuentra la relación de las secuencias que se encuentran en un multifasta contra los mecanismos de resistencia y los antibióticos. Los datos originales tuvieron que ser curadas y ajustadas al modelo E-R.



Protein_Accession varchar(20)

Ascii hasta 20 No

Corresponde al identificador de la proteína en las bases de datos del NCBI, que además hace parte de la columna iden1 de la tabla "gen_resistencia".

DNA_Accession varchar(20) Ascii hasta 20 No

Identificador para este registro

ARO_Category_Name varchar(200)

Ascii hasta 200 No

Corresponde a un texto que contiene o el mecanismo de resistencia al cual pertenece este registro o el antibiótico al cual es resistente.

ARO_Accession varchar(20)

Ascii hasta 20 No

Corresponde a un identificador en la base de datos de CARD, que además hace parte de la columna iden2 de la tabla "gen_resistencia".

Tabla 3-34: Descripción tabla resfams_metadata

Nombre de la tabla: resfams_metadata


Es la tabla principal de la metadata de la base de datos de Resfams en HMM, tomada de un archivo con extensión csv. Aquí se encuentra la relación entre los 170 HMM que corresponden a resistencia a antibióticos. contra los mecanismos de resistencia y los antibióticos. Los datos originales tuvieron que ser curadas y ajustadas al modelo E-R de este proyecto.




Resfam_ID varchar(20)

Ascii hasta 20 No

Corresponde al identificador propio de ResFams, que además hace parte de la columna iden1 de la tabla "gen_resistencia".

Resfam_Family_Name varchar(100) Ascii hasta 100 No

El nombre que identifica a este HMM

Description varchar(200) Ascii hasta 200 No

Una descripción brevemente detallada del HMM en cuestión

ARO_Identifiers varchar(100)

Ascii hasta 100 No

Corresponde a un identificador en la base de datos de ResFams que además hace parte de la columna iden2 de la tabla "gen_resistencia".

HMM_Source varchar(20)

Ascii hasta 20 No

Es la fuente de donde Resfam, ha tomado la información siendo estas las siguientes posibles: Resfam, Pfam, TIGRFam.

Antibiotic_Classification varchar(50) Ascii hasta 50 Si

Corresponde al antibiótico o grupo de antibióticos para el cual este HMM es resistente.

Mechanism_Classification varchar(50) Ascii hasta 50 Si

Corresponde al Mecanismo de resistencia.

B_Lactamase_Ambler_Class varchar(50) Ascii hasta 50 Si

Califica a las betalactamasas por sus clases: A, B, C o sin clasificar.

Tetracycline_Resistance varchar(50)

Ascii hasta 50 Si

Tres tipos de clasificacion solo para los HMM resistentes a Tetraciclinas: Bomba Eflujo MFS, Protección ribosomal, inactivación.



3.2.5 Persistencia datos bibliográficos

Las siguientes tablas fueron implementadas para guardar sistemáticamente los datos

bibliográficos de muchos registros en diferentes tablas sobre el modelo completo de a

presente tesis, y además tener un modelo simplificado y unificado, es decir la misma

bibliografía puede aplicar a diferentes registros en diferentes tablas.

Las tablas a las cuales se les está referenciando la bibliografía son:

Figura 3-5: Diagrama E-R para la bibliografía

Tabla 3-35: Descripción del catálogo bibliografia

Nombre de la tabla: bibliografia

Descripción de la tabla: Catálogo que guarda todas las referencias bibliográficas que se desean persistir y que tiene relación con registros de otras tablas particulares en esta base de datos.



id_bibliografia int(11) AI PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

PMID varchar(45)

Ascii hasta 45 Si

Identificador PubMed del artículo que se relaciona con este gen de resistencia.

PMCID varchar(45)

Ascii hasta 45 Si

Identificador PMC del artículo que se relaciona con este gen de resistencia.


DOI varchar(50)

Ascii hasta 50 Si

Identificador digital de objeto del artículo que se relaciona con este gen de resistencia.


Nombre de la referencia bibliográfica

autores varchar(250) verdadero o falso No

Autores de la referencia bibliográfica en cuestión

anno int(11) entre 1900 y año actual No

EL año de publicación de la referencia bibliográfica en cuestión

Tabla 3-36: Descripción de la tabla bibliografia_tablas

Nombre de la tabla: bibliografia_tablas


Esta tabla permite la interacción entre el catalogo "Bibliografía", y cualquier tabla a la cual sus registros tiene alguna referencia bibliográfica que se quiera persistir en este modelo.



id_bibliografia_tablas int(11) AI PK Entre 1 y 2147483647 No Identificador auto numérico

id_bibliografia int(11) Ascii hasta 45 No

Llave foránea al identificador de la tabla catalogo bibliografía

nombre_tabla varchar(64) Ascii hasta 45 No

El nombre de la tabla a la cual va a hacer una referencia bibliográfica

id_tabla int(11) Ascii hasta 50 No

Es el ID o PK del registro de la tabla señalada en la columna anterior.

3.2.6 Lectura de los genomas ensamblados

Figura 3-6, las tablas incluidas en la base de datos implementadas para almacenar los

datos de anotación de los genomas ensamblados producidos por el programa Prokka en

forma de un archivo en formato gff. Este esquema es una adaptación de las tablas que

hacen parte de un modelo aún más avanzado y completo desarrollado por (Ballen Mejía,

2016), como parte de su tesis de maestría desarrollada dentro del grupo de Bioinformática

del Instituto de Biotecnología.



Para hacer la carga automática de las anotaciones de cada genoma ensamblado Ballen

en la base de datos (Ballen Mejía, 2016), desarrolló el programa “LecturaEnsamblados”

V.2.0.1 en Python que lee cada archivo gff capaz de leer los archivos gff y alimentar con

los datos de anotación las diferentes tablas implementadas en la base de datos (Figura

3-6). Para el presente trabajo, el programa “LecturaEnsamblados” V.2.0.1 tuvo que ser

modificado para que pudiera cargar los archivos gff producidos e incluir el tag “Product” de

los archivos de anotación, que contiene los valores correspondientes a e-value, porcentaje

de identidad y cobertura, producidos por el programa Blast durante la ejecución de Prokka

cuando encuentra el hit que corresponda con el CDS anotado dentro del genoma.

Finalmente, también se modificó para que además de funcionar por lotes también funcione

cargando una por una las muestras. Esta aplicación está hecha con la misma versión de

Python y las mismas librerías del presente trabajo, igualmente la misma versión del motor

de base de datos.

La utilidad de esta aplicación se encuentra en que ella carga toda la información de la

anotación a un modelo de base de datos, el cual permite su fácil extracción y análisis para

el presente trabajo.


Figura 3-6: Diagrama E-R para aplicación “LecturaEnsamblados” V.2.0.1

3.3 Clasificación de β-lactamasas orientada a la resistencia

Este grupo de enzimas por su cantidad y por la posibilidad de clasificación en la resistencia

a los antibióticos son tomadas y valoradas de una forma que se va a explicar en este sub

capitulo.

Es necesario encontrar y aplicar una clasificación consenso bajo la indicación de varios

artículos científicos que son relevantes para tal tarea (la bibliografía que referencia estos

artículos esta especificada en las la Tabla 3-37 y la Tabla 3-38). Hay que tener en cuenta



que el propósito principal en esta clasificación es encontrar una forma adecuada de crear

un perfil genómico de resistencia para este grupo de enzimas, orientado a la resistencia.

Como muchas de estas proteínas fueron tomadas de la base de datos de CardB (McArthur

et al., 2013) al igual que los metadatos que ellos tienen para descargar, la asignación a la

resistencia de los antibióticos simplemente apuntaba a la clase principal de antibióticos, es

decir β-Lactams, pero para poder hacer la comparación necesaria con el perfil fenotípico

de resistencia es necesario una discriminación más detallada, que nos lleve hasta el punto

de discriminar por sub-clase de antibióticos.

Primero la base de datos creada para manejar este sistema de información para la

resistencia a antibióticos en nuestras cepas de Acinetobacter baumannii, tiene definido un

modelo para asociar los genes con la resistencia a los antibióticos, como se aprecia en la

Figura 3-7.

Figura 3-7: Tablas que asocian los genes con la resistencia a los antibióticos

El modelo de la Figura 3-7, muestra una relación de muchos a muchos entre los

antibióticos y los genes de resistencia (por genes de resistencia se quiere indicar las


siguientes posibilidades: genes, proteínas y HMM asociadas a la resistencia a los

antibióticos). La tabla que permite esta interacción de muchos a muchos, califica a esta

relación con una interpretación basada en los mismos 3 niveles de susceptibilidad con los

cuales se califica la resistencia fenotípica cuando se realiza el antibiograma: Susceptible,

intermedio y resistente. Adicional también se permite agrupar a esta relación según la tabla

clsi-antibiotico actualmente corresponde únicamente para Acinetobacter spp. En su

concentración mínima inhibitoria dada según el año que le pertenece, según el año de la

muestra (Patel et al., 2015) páginas 56 y 57.

Por otro lado, la información sobre β-Lactamasas obtenida de la literatura consultada fue

almacenada en las tablas de la base de datos que se muestran en el modelo presentado

en la Figura 3-8.

Figura 3-8: Tablas que asocian los genes que codifican β-lactamasas con la resistencia a antibióticos.



La tabla blactam_clase (Tabla 3-26), guarda los registros de las clases moleculares de β-

lactamasas, agrupadas según la similitud de sus secuencias. Hay 4 clases reportadas: A,

B, C y D. (Bush and Jacoby, 2010) dentro de las cuales la clase B a su vez está dividida

en B1, B2, y B3.

La tabla blacta_grupo (Tabla 3-27) contiene los grupos funcionales definidos inicialmente

por Karen Bush y George A. Jacoby como subcategorías de las clases moleculares (Bush

and Jacoby, 2010). Esta tabla también contiene las sub clases de antibióticos de los que

hay reportes de haber sido hidrolizados por determinado grupo funcional y el nivel de

resistencia que se genera, esta última información tomada de (Bush, 2013), donde por

cada grupo funcional se detalla la resistencia para las enzimas más representativas y para

algunos de las sub clases de antibióticos.

Adicionalmente, dadas las diferencias reportadas entre las enzimas KPC, SME y GER

pertenecientes al grupo funcional de carbapenemasas 2f (Queenan and Bush, 2007),

dentro de los registros de la tabla la tabla blacta_grupo (Tabla 3-27) se establecieron 3

grupos para las carbapenemasas 2f: 2f, 2f_GES y 2f_SME, para facilitar la inclusión de las

diferencias en el perfil de resistencia que presentan los diferentes miembros del grupo

Finalmente, el consolidado de todas las agrupaciones es el que se describe en la Tabla

3-37.

Tabla 3-37: Agrupación Consolidada para β-lactamasas Clase

Molecular Grupo

Funcional Subclase

Antibiótico Interpretación Bibliografía

A

2a Penicillins Resistente (Bush and Jacoby, 2010)

2b Cephalosporin Ic Resistente

(Bush and Jacoby, 2010) Penicillins Resistente

2be

Cephalosporin Ic Resistente

(Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) Cephalosporin IIc Resistente

Cephalosporin IIIc Resistente

Cephalosporin IVc Resistente


Monobactams Resistente

Penicillins Resistente

2ber


(Bush, 2013), (Poole, 2004)

Cephalosporin IIc Intermedio

Cephalosporin IIIc Intermedio

Cephalosporin IVc Intermedio


2br

b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations

Intermedio (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013), (Poole, 2004)


2c Penicillins Resistente (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013)

2ce Penicillins Resistente (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013)

2e


(Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013)

Cephalosporin IIc Resistente




2f

Carbapenem Resistente

(Queenan and Bush, 2007), (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013)







2f_GES

Carbapenem Intermedio








2f_SME




Cephalosporin IIc Intermedio

Cephalosporin IIIc Intermedio

Cephalosporin IVc Intermedio



B1 3a


Intermedio (Queenan and Bush, 2007), (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013)









B2 3b


Intermedio (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013)


B3 3a


Intermedio

(Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013)







C

1


Intermedio (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013)


1e


Intermedio

(Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013) Cephalosporin Ic Resistente




D

2d Penicillins Resistente (Evans and Amyes, 2014), (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013)

2de

Cephalosporin Ic Resistente (Evans and Amyes, 2014), (Bush and Jacoby, 2010), (Bush, 2013)



2def


(Gomez et al., 2013), (Evans and Amyes, 2014)






2df


(Bush, 2013), (Evans and Amyes, 2014), (Bush and Jacoby, 2010)






El grado de resistencia conferida por una β-lactamasa, como ya se ha indicado, fue

obtenido de lo descrito en la literatura, teniendo cuidado de solo utilizar aquellos datos que

estuvieran soportados en pruebas experimentales.

Los datos que actualmente tiene la base de datos sobre las enzimas y familias de enzimas

de los grupos funcionales, fueron completados en algunos casos particulares con otras

fuentes especializadas (Tabla 3-38).

Tabla 3-38: Asignación de genes a los grupos de β-lactamasas por excepción. Clase

Molecular Grupo

Funcional Nombre

Gen Bibliografía Cometarios

A

2a PC1 (Bush and Jacoby, 2010) El nombre de este gen no se encuentra en

Lahey, por lo cual fue necesario el apoyo del artículo que lo menciona

2b

SHV-32 http://www.lahey.org/Studies/ Se logra asignar a un grupo por Lahey

SHV-1 (Bush and Jacoby, 2010) El nombre de este gen no se encuentra en


TEM-1 (Bush and Jacoby, 2010) El nombre de este gen no se encuentra en


TEM-2 (Bush and Jacoby, 2010) El nombre de este gen no se encuentra en


2be

GES-1 (Poole, 2004) El nombre de este gen no se encuentra en


PER-7 (Bonnin et al., 2011, p. 7) El nombre de este gen no se encuentra en


VEB-1a (Poirel et al., 2001) El nombre de este gen no se encuentra en


VEB-1b (Poirel et al., 2001) El nombre de este gen no se encuentra en


CTX-M-115 http://www.lahey.org/Studies/ Se logra asignar a un grupo por Lahey BEL 1 al 3



2ce CARB-16 (Petrova et al., 2014)

Según el artículo, posiblemente esta proteína tiene un tipo de resistencia muy limitado. Las enzimas CARB pueden estar tanto en el grupo 2c y 2ce. Por la descripción de resistencia limitada se decide dejar este gen en el grupo 2c. Identificada inicialmente para Psychrobacter maritimus, obtiene un 100% de identidad en la muestra RB 1321, id 74.

C 1

ADC-2 NCBI protein: WP_004746565.1

No se encuentra por este nombre en Lahey, fue necesario revisar la fuente principal que indica en un tag de la anotación sobre la pertenencia a la clase C

PDC-3 NCBI protein: ACQ82808.1

No se encuentra por este nombre en Lahey, fue necesario revisar la fuente principal que indica en un tag de la anotación sobre la pertenencia a la clase C

2df

OXA-24 (Guo-Bao Tian et al., 2011) Este gen corresponde al mismo OXA-40, que es mencionado en el artículo referenciado para A.

baumannii

OXA-120

http://www.lahey.org/Studies/ Se logra asignar a un grupo por Lahey OXA-215

OXA-255

OXA-100

La información de la clase molecular D es limitada en la literatura disponible, por lo que se

utilizó la página de la clínica Lahey (http://www.lahey.org/Studies/) para completar estos

datos. De esta misma forma también se completó el grupo AmpC, que hace parte de la

clase molecular C grupo funcional 1, y el grupo NDM que se encuentra en la clase

molecular B1 en el grupo funcional 3.

Todos los genes agrupados por sus clases y grupos de β-lactamasas se encuentra en el

Anexo D, tabla 1-13.

3.4 Reglas de negocio para la obtención teórica de la resistencia genómica

La primera parte de la implementación de las reglas consiste en la definición estática de

estas, en los diferentes catálogos. Más adelante se define la forma dinámica de las reglas,

para que con estas se obtenga la información de los catálogos asociados a cada una de

las muestras y así generar el perfil teórico de resistencia genómico.


3.4.1 Primera Regla

La primera regla tiene como finalidad el poder filtrar en los reportes del perfil genómico

según el alcance de los antibióticos que se encuentran en el perfil fenotípico.

Estos ajustes se implementan en la tabla llamada “gen_antibiotico_resistencia”(Tabla

3-18) , esta tabla es la que permite la relación muchos a muchos entre la tabla “antibiótico”

y la tabla “gen_resistencia”, encargada de almacenar el catálogo de todos los genes

relacionados con la resistencia a antibióticos, tomados de las bases de datos de proteínas

de CardDB (Jia et al., 2017), de los HMM de Resfam (Gibson et al., 2015) y otras proteínas,

obtenidas a partir de la literatura sobre resistencia de A. baumannii, que no estaban

incluidas en las bases de datos anteriormente nombradas.

Se creó la tabla catalogo llamada “correspondencia_antibiotico”(Tabla 3-19) para

relacionar con la tabla “gen_antibiotico_resistencia”(Tabla 3-18), para marcar cuales son

los antibióticos que van a ser relacionados en el perfil de resistencia genómica.

Este catálogo permite saber cuál es el perfil de resistencia genómico basado únicamente

en los 8 antibióticos base del perfil de resistencia fenotípica según el CLSI, y su versión

ampliada con las sub clases o clases de antibióticos a los cuales pertenecen esos 8

antibióticos base. Esto permite hacer la comparación entre los perfiles de resistencia

genómico y fenotípico.

EL Instituto Nacional de Salud (INS) basado en el estándar del CLSI, estableció los

siguientes 8 antibióticos, como la base de su perfil de resistencia fenotípica para A.

baumannii: Ampicillin-sulbactam, Ceftazidime, Amikacin, Cefepime, Cephalexin,

Imipenem, Meropenem, Piperacillin-tazobactam

Teniendo en cuenta lo sugerido en la literatura para los genes de resistencia a antibióticos

que se encuentran en la base de datos, se realizó una consulta que cruzó las tablas

mencionadas anteriormente, para obtener los registros que presentan elementos



genómicos asociados con resistencia únicamente a: Imipenem, Meropenem, Ceftazidime,

obteniendo los siguientes resultados:

➢ Imipenem (porinas: “CarO, omp33 y omp36”)

➢ Meropenem (porinas: “CarO”)

➢ Ceftazidime (Bomba eflujo "adeDE")

El resultado de la consulta muestra 4 genes, de los cuales los genes CarO, omp33 y omp66

se relacionan con resistencia al grupo global de antibióticos β-lactámicos, y no a alguna de

las sub clases de antibióticos, mientras que la bomba eflujo adeDE, está relacionada con

la resistencia a diferentes sub clases de antibióticos. Es evidente que la información de un

posible perfil genómico de resistencia que se podría obtener utilizando estos datos estaría

incompleto.

Para entender un poco como se relaciona los antibióticos base, con las sub clases y clases

de este, tenemos la siguiente tabla:

Tabla 3-39: Jerarquía de los antibióticos base para A.baumannii dada por el INS

Antibióticos Sub-Clase Clase

Ampicillin-sulbactam β-Lactam/β-lactamase inhibitor combinations

Piperacillin-tazobactam β-Lactam/β-lactamase inhibitor combinations

Ceftazidime Cephalosporin IIIc Cephems (parenteral)

Amikacin Aminoglycosides

Cefepime Cephalosporin IVc Cephems (parenteral)

Cephalexin Cephalosporin Ic Cephems (oral)

Imipenem Carbapenem Penems

Meropenem Carbapenem Penems

Por supuesto la regla debe incluir las sub clases: Cephalosporin IIIc, Cephalosporin IVc,

Cephalosporin, Carbapenem. Además, las clases: β-Lactam/ β -lactamase inhibitor

combinations, Aminoglycosides, Cephems (parenteral), Cephems (oral), Penems.


Por lo tanto, al hacer nuevamente la consulta en la base de datos con las anteriores clases

y subclases de los antibióticos, para los aminoglycosides se obtienen 197 genes, entre los

que se encuentran AAC, APH, ANT entre muchos otros; para Carbapenem se obtienen por

un lado 4 genes: OprD, AdeD, AdeE, SCO-1 y por el lado de los genes que codifican para

β-lactamasas se tienen 167 genes. Para Cephalosporin Ic, Cephalosporin IIIc,

Cephalosporin IVc, se tiene por un lado un gen llamado SCO-1 que confiere bajo nivel de

resistencia a estas sub clases de antibiótico y por el lado de los genes asociados a

resistencia a β-lactamasas que se muestran en la Tabla 3-40.

Tabla 3-40: β-lactamasas que pertenecen a la agrupación en segundo nivel.

Nombre grupo Interpretación Cantidad

Genes

b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations 1 Intermedio 96

Cephalosporin Ic 1 Resistente 96

b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations 1e Intermedio 1

Cephalosporin Ic 1e Resistente 1

Cephalosporin IIc 1e Resistente 1

Cephalosporin IIIc 1e Resistente 1

Cephalosporin IVc 1e Resistente 1

Cephalosporin Ic 2b Resistente 7

Cephalosporin Ic 2be Resistente 102

Cephalosporin IIc 2be Resistente 102

Cephalosporin IIIc 2be Resistente 102

Cephalosporin IVc 2be Resistente 102

Cephalosporin Ic 2ber Resistente 5

Cephalosporin IIc 2ber Intermedio 5

Cephalosporin IIIc 2ber Intermedio 5

Cephalosporin IVc 2ber Intermedio 5

b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations 2br Intermedio 8

Cephalosporin Ic 2de Resistente 21

Cephalosporin IIIc 2de Resistente 21

Carbapenem 2def Resistente 2

Cephalosporin IIc 2def Resistente 2

Cephalosporin IIIc 2def Resistente 2

Cephalosporin IVc 2def Resistente 2

Carbapenem 2df Resistente 45

Cephalosporin IIc 2df Resistente 45

Cephalosporin IIIc 2df Resistente 45



Cephalosporin IVc 2df Resistente 45

Cephalosporin Ic 2e Resistente 2

Cephalosporin IIc 2e Resistente 2

Cephalosporin IIIc 2e Resistente 2

Cephalosporin IVc 2e Resistente 2

Carbapenem 2f Resistente 14

Cephalosporin Ic 2f Resistente 14

Cephalosporin IIc 2f Resistente 14

Cephalosporin IIIc 2f Resistente 14

Cephalosporin IVc 2f Resistente 14

Carbapenem 2f_GES Intermedio 14

Cephalosporin Ic 2f_GES Resistente 14

Cephalosporin IIc 2f_GES Resistente 14

Cephalosporin IIIc 2f_GES Resistente 14

Cephalosporin IVc 2f_GES Resistente 14

Carbapenem 2f_SME Resistente 3

Cephalosporin Ic 2f_SME Resistente 3

Cephalosporin IIc 2f_SME Intermedio 3

Cephalosporin IIIc 2f_SME Intermedio 3

Cephalosporin IVc 2f_SME Intermedio 3

b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations 3a Intermedio 83

Carbapenem 3a Resistente 83

Cephalosporin Ic 3a Resistente 83

Cephalosporin IIc 3a Resistente 83

Cephalosporin IIIc 3a Resistente 83

Cephalosporin IVc 3a Resistente 83

b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations 3b Intermedio 8

Carbapenem 3b Resistente 8

Ciertamente si se toman únicamente como base de comparación, los ocho antibióticos

base incluidas las sub clases de antibióticos correspondientes, aun así, se pierde

información que puede ser valiosa en el perfil genómico teórico de resistencia.

3.4.2 Segunda Regla

Esta regla establece el nivel de resistencia, en “Resistente, intermedio o susceptible” a

los elementos genómicos de resistencia.


Para entender esta regla se presenta el siguiente ejemplo: el gen SCO-1 confiere alta

resistencia a penicilinas y baja resistencia a cefalosporinas y carbapenemasas (Poirel et

al., 2007), es decir que frente a la primera clase de antibióticos la bacteria se hace

“resistente” y frente al resto su nivel es “intermedio”.

Además, la resistencia en otros casos se debe a la poca expresión y/o la desaparición de

algunos genes como los que permiten la expresión de las porinas: carO, omp33, opm66,

oprD, opmW. Entonces para este caso, si los genes simplemente se encuentran en la

anotación, la regla señala que son “susceptibles” a carbapenemasas entre otros (García,

2013).

Así mismo los genes gyrA y parC, confieren resistencia intermedia a quinolonas (si

presentan la mutación que les confiere tal resistencia) (Ardebili et al., 2015). Si ambos se

encuentran mutados entonces esta combinación causaría que la resistencia sea alta. La

solución para este caso esta descrito en la quinta regla, por lo que el comportamiento de

estos genes estaría cubierto con la presente y la quinta regla.

En la implementación de esta regla interviene la tabla “gen_antibiotico_resistencia” Tabla

3-18 a través de su relación con la tabla “interpretación” Tabla 3-5, de tal forma que para

cada dupla gen-antibiótico se pueda acceder al nivel de resistencia asociado, bien sea:

“Resistente, intermedio, susceptible”, ya que la tabla “gen_antibiotico_resistencia” posee

una columna que se relaciona con la tabla “interpretación” que se usa para calificar el nivel

de resistencia en la relación gen-antibiótico durante la elaboración del perfil genómico de

resistencia.

La decisión de usar los 3 niveles de resistencia para calificar el nivel de resistencia en la

relación gen-antibiotico (que finalmente califica el perfil genómico de resistencia), es

porque esto permite hacerlos comparables con lo reportado por la literatura.

3.4.3 Tercera regla

Esta regla evalúa los Operones de resistencia y sus reguladores de expresión.



Esta regla aplica para las bombas eflujo del tipo RND (resistance-nodulation-cell division)

y otros genes que permiten o regulan su sobre expresión.

Para la implementación de esta regla se creó una tabla que permite guardar la

configuración de estos operones llamada: “operon_resistencia” (Tabla 3-21), donde se

incluye la dirección de la transcripción y los genes con su ubicación en el operón.

Igualmente, se almacena en esta tabla la ubicación de los reguladores de expresión, de tal

forma que en con junto de los datos almacenados en esta tabla corresponde a la

representación topológica de los operones y sus elementos de regulación, como se

esquematiza en la Figura 3-9, para los operones de algunas bombas de eflujo tipo RND

encontradas en el genoma de diferentes cepas de A. baumannii.

Figura 3-9: Algunas bombas eflujo tipo RND para A. baumannii

Imagen tomada de: (Coyne et al., 2011)

Cabe destacar que la implementación de esta regla permite ubicar el gen regulador,

aunque no esté cerca del gen que regula, como es el caso del gen adeN asociado con la

regulación de la bomba adeIJK (Rumbo et al., 2013) que no necesita estar cerca de la

bomba adeIJK para regular la expresión de la misma (Rosenfeld et al., 2012), y es diferente

a los otros genes reguladores como por ejemplo el gen adeL o la dupla de genes adeRS.


Se tiene en cuenta la bomba adeXYZ que posee 97% de identidad con la bomba adeIJK.

Por último, se tiene la bomba adeDE. (Coyne et al., 2011).

Finalmente, esta información fue recopilada y organizada a través de scripts en MySQL

por medio de un procedimiento almacenado llamado “getBombasRNDXMuestra”, que a su

vez es utilizado por el script en Python llamado “bombasXMuestra.py”, encargado de

almacenar en la tabla “bombas_rnd”, todos los hallazgos de bombas y reguladores

encontrados en las anotaciones registradas en la base de datos para los genomas de las

diferentes muestras. (Tabla 3-23).

3.4.4 Cuarta Regla

Define un porcentaje de identidad y un porcentaje de cobertura mínimo por grupos de

genes según los mecanismos de resistencia.

La gran mayoría de genes de resistencia a antibióticos se encuentran bajo el mecanismo

definido como “Degradación o Modificación del Antibiótico” y dentro de este, la mayoría

pertenece al grupo de β-lactamasas. Esto último se debe a que la penicilina fue el primer

antibiótico descubierto y utilizado para el tratamiento de infecciones (Tan and Tatsumura,

2015), y por tanto, es frente al cual las bacterias han desarrollado más estrategias

moleculares para hacerse resistentes, estrategias que involucran mutación de su

secuencia genómica, de tal forma se generan variantes con secuencias muy parecidas,

que les permiten eludir la acción de la penicilina y sus derivados o de las otras clases de

antibióticos disponibles en este momento para el tratamiento de infecciones.

Dada las pequeñas variaciones de secuencia que se presentan en los elementos

genómicos asociados a resistencia en bacterias, fue necesario definir inicialmente el

porcentaje de identidad y el de cobertura, necesarias para identificar en la anotación de

los genomas estos elementos genómicos de resistencia. Por ejemplo, para el caso de las

de β-lactamasas, la identidad y la cobertura deben estar mucho más cercanas al 100%,



dado que la diferencia entre secuencias en muchos de sus grupos es apenas de unos

pocos aminoácidos, haciendo que porcentajes por debajo de 90% puedan generar errores

de identificación. Al resto de mecanismos se le dio un poco más de holgura, estableciendo

los porcentajes sobre 60% para la identidad y 75% para la cobertura.

Por otra parte, cuando los resultados de anotación de un elemento genómico no incluyen

un hit obtenido por el uso del programa de BlastP y por ende no incluyen los porcentajes

de identidad y cobertura, pero si resultados de la utilización de los HMM de ResFam, por

ejemplo, para facilitar el manejo interno de la aplicación a estos se les deja por defecto el

0% tanto para la identidad y como para la cobertura. Es posible que bajo la lupa de análisis

futuros se puedan dar mejor precisión a estos porcentajes inicialmente planteados

(separados y/o discriminados por grupos más pequeños e incluso por gen o elemento

genómico).

Para lograr la implementación de la parte estática de esta regla en la tabla llamada

“gen_mecanimos_resistencia” (Tabla 3-15), se almacena tanto el porcentaje de identidad

como la cobertura.

3.4.5 Quinta Regla

Evalúa las mutaciones puntuales de proteínas que causan resistencia a antibióticos

Se crea un catálogo para esta regla, que define la forma pasiva para los genes gyrA y

parC. Ambos según indica la literatura, al poseer mutaciones puntuales crea resistencia a

los siguientes antibióticos: Fluoroquinolonas, Quinolonas y Ciprofloxacin (Ardebili et al.,

2015).

Para estos genes, siempre se describe la posición puntual de la mutación, pero también

es importante establecer el vecindario del o los aminoácidos mutados para poder asegurar

con una búsqueda de sub-cadena que se encuentre sin equivocación dicha mutación

puntual.


Para el caso de gyrA se tiene la mutación: Serina 83 a Leucina (S83L), además obtenemos

el motivo “HPHGDLAVYETI” que incluye los aminoácidos vecinos a la mutación, en donde

la Leucina está en el centro indicando la mutación que hace a la bacteria resistente a los

antibióticos mencionados anteriormente (Martínez and Máttar, 2010). Esta cadena o

motivo siempre va a ser único dentro de la búsqueda para el gen gyrA mutado.

Para el caso de parC se debe encontrar la mutación: Ser80Leu, para definir entonces la

sub-cadena que permite la resistencia en este gen, la siguiente sub-cadena está asociada

a una alta resistencia: “HPHGDLACYEA”, nuevamente la Leucina está en el centro. (Vakili

et al., 2014). También se encuentran en la literatura otras posibilidades que añaden un

poco más de complejidad, y que las siguientes mutaciones en parC también causan

resistencia: (S80L or W, E84K and G78C). (Park et al., 2011) En la posición 80 ahora se

tienen 2 posibilidades L ó W y para las posiciones 84 y 78 se debe permitir que la búsqueda

se haga por ambos aminoácidos descritos allí, aunque la base sigue siendo la mutación

en la posición 80.

Para el caso de parC se debe encontrar la mutación: S80L, para lo cual el motivo asociada

a una alta resistencia es “HPHGDLACYEA”, encontrándose nuevamente la leucina en el

centro. (Vakili et al., 2014). También se encuentran en la literatura otras posibilidades que

añaden un poco más de complejidad, como las siguientes mutaciones en parC que también

causan resistencia: (S80L o W, E84K y G78C). (Park et al., 2011). En la posición 80 ahora

se tienen 2 posibilidades L ó W y para las posiciones 84 y 78 se debe permitir que la

búsqueda se haga por ambos aminoácidos descritos allí, aunque la base sigue siendo la

mutación en la posición 80. Entonces para este caso se usa una expresión regular y se

evalúa sobre las secuencias traducidas del gen parC, la expresión regular

HPH(G|C)D(L|W)ACY(E|K)A basada en el motivo antes descrito.

Esta regla es implementada con la tabla llamada “mutacion_resistencia” (Tabla 3-25),

donde se guardan los motivos o las expresiones regulares, y con la tabla llamada

“mutacion_gen_resistencia” (Tabla 3-24), en la cual se hace el cruce entre la tabla

“mutacion_resistencia” y la tabla “gen_resistencia” donde se encuentra el catálogo de los

genes de resistencia: (Tabla 3-16).



3.5 Determinación a los perfiles de resistencia Fenotípicos

El INS facilitó inicialmente los perfiles fenotípicos de resistencia (antibiograma) de las 89

muestras seleccionadas, obtenidos utilizando el método de disco plata Kirby Bauer (gold

estándar) (Cantón et al., 2000), el método automatizado Vitek 2 (d’Azevedo et al., 2009) ,

y el método automatizado Phoenix 100 (O’Hara, 2006).

Los datos fueron almacenados en la base de datos en la tabla “resistencia_fenotipica”

(Tabla 3-8), y con ellos se procedió a hacer una comparación muestra por muestra, del

antibiograma reportado por cada una de las tecnologías, encontrando diferentes

incongruencias en la resistencia del microorganismo frente a algunos antibióticos y las sub

clases a las que pertenecen. Por lo cual, para hacer más robustos los resultados de los

antibiogramas se repitieron las pruebas en las muestras que presentaron incongruencias.

De acuerdo con el protocolo del INS, el antibiograma obtenido por la metodología Kirby

Bouer utiliza 8 antibióticos, como se mencionó en la regla 1 del capítulo 3.4.1, todos

pertenecientes al grupo de los antibióticos las β-lactámicos. Dado que la prueba

considerada Gold estándar está limitada a un solo grupo de antibióticos, y que los sistemas

automatizados como Vitek y Phoenix incluyen muchos más en sus pruebas, se tomó la

decisión junto con el equipo del grupo de Epidemiologia Molecular del Instituto de

Biotecnología de la Universidad Nacional sede Bogotá, de definir las jerarquías y crear un

antibiograma consolidado utilizando los resultados de las tres pruebas. La totalidad de

estos datos se encuentra en el Anexo B.

Dentro de la búsqueda por un algún método que permitiera la comparación de los dos tipos

de perfiles de resistencia, fenotípico Versus genómico, se definió para el perfil fenotípico

de resistencia 4 categorías de multiresistencia: MDR resistente a múltiples antimicrobianos

cuando por lo menos es resistente a por lo menos 1 miembro de 3 categorías diferentes

de antimicrobianos; XDR Extremadamente resistente a los antimicrobianos cuando por lo

menos es resistente a por lo menos 1 miembro de 8 categorías diferentes de las 10 de

antimicrobianos; PDR pandrug resistente cuando es completamente resistente a todos los

antimicrobianos (Magiorakos et al., 2012); y sin asignar.


3.6 Desarrollo de la aplicación

La construcción de la aplicación se hizo por capas, según se avanzaba en las necesidades

del proyecto. Este desarrollo se realizó utilizando el lenguaje Python. Específicamente se

trabajó con la versión 3.4, usando para facilidad del desarrollador el IDE1 (entorno de

desarrollo integrado) de Microsoft Visual Studio 2015. Las librerías que se requieren para

el correcto funcionamiento de todos los scripts de la aplicación son los siguientes: bcbio-

gff (0.64), para leer y escribir los archivos GFF (Generic Feature Format) de la anotación

de los genomas; biopyhton (1.67), que posee muchas funcionalidades bioinformáticas

como por ejemplo la fácil manipulación de archivos en formato FASTA, entre muchas otras;

mysql-conector-python (2.13), driver para Python que facilita la interacción con la base de

datos en MySQL; y Numpy (1.11.2) paquete para la computación científica con Python,

que permite manipular objetos de matriz N-dimensional.

La aplicación en Python llamada “LecturaResistencia” es compatible tanto en Windows

como en Linux, siempre y cuando tenga los prerrequisitos instalados incluida la base de

datos en MySQL. La Figura 3-10, muestra un diagrama de flujo de los pasos que debe

seguir “LecturaResistencia” para cumplir con el objetivo de obtener un perfil genómico de

resistencia partiendo de la anotación de los genomas de A. baumannii descrita en el sub

capitulo (3.1.5). La línea de comando utilizada para su ejecución sobre la carpeta con la

muestra previamente anotada con Prokka para una de las muestras es el siguiente:

python3.4

/vault2/Hermes/codigoFuente/lecturaResistencia_V_1.0/perfilResistencia.p

y -r /vault2/SeqIlluminabaumannii/anotacionG3/GMRRA249.107

Es posible que la anterior línea de comando pueda estar en un archivo de Shell junto con

más líneas de comando para las diferentes muestras, y así hacer un procesamiento en lote

de ser necesario.

1 IDE: Entorno de Desarrollo Integrado, es un entorno de programación que ha sido empaquetado como un programa de aplicación, es decir, consiste en un editor de código, un compilador, un depurador y un constructor de interfaz gráfica (GUI)



Figura 3-10: Diagrama de flujo global del pipeline de la aplicación

Como se puede ver en la Figura 3-10, el ingreso de los datos solicita la ruta de la anotación

con el formato adecuado, como se puede ver en el ejemplo de línea de comando antes

presentada, el nombre de la carpeta utilizada es “GMRRA249.107”, cuyo nombre tiene el

formato adecuado que requiere, de la siguiente forma: nombre de la carpeta que contenga

el nombre de la muestra, seguido por un punto, y luego por el ID de la muestra en la base

de datos.

Este script llamado “perfilResistencia.py”, es el que internamente hace el llamado a

cada uno de los procesos de este pipeline, como se ve en el diagrama de flujo.


El segundo proceso llamado “Cargar Genes””, hace uso de una versión especial del

programa “LecturaEnsamblados” que permite subir a la base de datos, todo lo que la

anotación funcional llama “genes”, en las tablas que se muestran en el diagrama E-R, en

la Figura 3-6. Esta versión del programa fue modificada para guardar un tag de la

anotación llamado “Inference”, el cual permite identificar si la anotación del gen fue hecha

con base en el multifasta generado a partir de la base de datos CARD o en otras bases de

datos de HMM como ResFams. Además, permite hacer el cruce de todos estos datos de

la anotación con el ID de la muestra que ya existe en la base de datos.

El proceso llamado “Extraer Características”, se ejecuta a través de un procedimiento

almacenado llamado “extraerCaracteristicasxMuestra”, que únicamente solicita como

parámetro de entrada el “id_muestra”. Este extrae de manera adecuada todos los datos

previamente identificados para la resistencia genómica del proceso anterior; y los guarda

en la tabla “resistencia_genomica1” (Tabla 3-17), es decir los genes que identifica según

el archivo multifasta generado a partir de la base de datos CARD incluidos los genes

adicionales para A. baumannii, y los HMM de ResFams.

El siguiente proceso llamado “Extraer Bombas RND”, requirió de un script llamado

“bombasXMuestra.py” y un procedimiento almacenado llamado

“getBombasRNDXMuestra”, ya que por el tipo de configuración que estas tienen es

necesario hacer una evaluación más completa que requiere de esta interacción. La Figura

3-11 muestra el diagrama de flujo que explica en forma global el funcionamiento de este

script. Este proceso presenta una particularidad, mientras se almacenen en el catálogo de

las bombas eflujo tipo RND “operon_resistencia” Tabla 3-21, nuevos operones y

reguladores, no importando la configuración que estos tengan, el script lograra identificar

sí este está correctamente formado o no, para su evaluación dentro de la resistencia.

genómica.

Por último, el proceso llamado “Crear un perfil genómico”, utiliza un procedimiento

almacenado llamado “CrearPerfilGenomicoXMuestra”, que recibe únicamente como

parámetro el id_muestra, para generar el perfil.



Este procedimiento finalmente aplica todas las reglas definidas en el sub capítulo 3.4, y

genera los valores necesarios para el perfil de resistencia genómica que se presenta en el

capítulo Error! Reference source not found.. A continuación, se presenta una explicación a

manera de pseudo código de los pasos que realiza este procedimiento almacenado.

1. Borrar perfil consolidado genómico por muestra (si existe)

2. Borrar perfil de resistencia genómica temporal por muestra (si existe)

3. Insertar en el perfil de resistencia genómica temporal todos los genes que no

pertenecen a alguna regla ni las beta-lactamasas.

4. Insertar en el perfil de resistencia genómica temporal únicamente las beta-

lactamasas (estas poseen un camino de resistencia a antibióticos diferente).

5. Insertar en el perfil de resistencia genómica temporal las mutaciones puntuales

6. Insertar en la tabla temporal de bombas RND la información de resistencia a

antibióticos del grupo padre si es una agente.

7. Insertar en la tabla temporal de bombas RND la información de resistencia a

antibióticos cuando su información ya esta en un grupo y no un agente.

8. Insertar en la tabla de perfil temporal una agrupación únicamente de las bombas

RND, calificándolas con un valor.

9. Insertar en la tabla temporal PRG la información de resistencia a antibióticos

agrupada por los padres de los agentes, quitando elementos móviles y sin incluir

genes referenciados al grupo "Sin asignar".

10. Insertar en la tabla temporal PRG la información de resistencia a antibióticos

cuando su información ya hace parte de un grupo y no un agente, dejando afuera

los elementos móviles y aquí se incluye los agentes del grupo "Sin Asignar".

11. Inserta en la tabla de perfil temporal PRG una agrupación con los datos de los 2

pasos anteriores, calificándolas con un valor.

12. Inserta en la tabla del perfil consolidado la agrupación de la tabla perfil temporal

PRG.

13. Presenta el perfil genómico de resistencia de la muestra.


Figura 3-11: Diagrama de flujo macro Bombas Eflujo tipo RND

3.6.1 Scripts adicionales

Para poder subir los datos de los genes que provee CARD, fue necesario crear 2 pequeños

scripts para tener la información en el formato adecuado. El primer Script llamado



“ajusteFasta.py”, hace un ajuste al encabezado de cada Fasta, para que el proceso de

anotación pueda hacer correctamente el trabajo y guarde la información en el archivo GFF

de forma correcta. El segundo Script llamado “cargarCardDB.py”, sirve para subir de forma

adecuada la información que se encuentra en el archivo multifasta, a la tabla “gen

resistencia” Tabla 3-16.

4. Resultados y Discusión

La primera parte de esta capitulo introduce algunos resultados iniciales que se observan

al avanzar a través de las reglas en la metodología. Luego se presentan los datos sobre

los mecanismos, genes y la relación con los antibióticos. Para posteriormente presentar

los resultados finales del presente trabajo.

4.1 Resultados

4.1.1 Datos en la tercera regla

Algunas estadísticas generales al respecto de estas bombas para las 89 muestras:

▪ De las 89 muestras 88 poseen alguna bomba e-flujo tipo RND bien formada, solo la

muestra “RA 768” no posee ninguna.

▪ 44 muestras poseen la bomba adeABC.

▪ De las 44 muestras que poseen la bomba adeABC solo la muestra “RB 1458” no posee

el regulador adeRS.

▪ De las 89 muestras de cepas de A. baumannii ninguna posee la bomba adeDE.

▪ 88 muestras poseen la bomba adeIJK y el regulador adeN, muestras que la muestra

con “RA 768” no posee ninguno de los genes.

▪ 87 muestras poseen la bomba adeFGH, la muestra “RB 1287” poseen 2 bombas de

este tipo.

▪ De las 87 muestras que poseen la bomba adeFGH, 23 muestras poseen el regulador

adeL.

▪ Ninguna muestra posee la bomba adeXYZ.



De las 44 muestras que poseen el operón adeABC, 28 de estas comienzan en la misma

posición, (aunque en diferentes contigs para cada muestra), en la posición 17766, es decir

allí comienza el gen adeA, y de igual manera termina siempre en la misma posición 14583,

además indica que la dirección de estos operones siempre es negativa, y todos tienen el

regulador adeRS igualmente en la misma posición.

Con respecto a lo descrito en la bibliografía, se evidenciaron en algunas muestras

variaciones en la ubicación de los genes que forman el operón de las bombas RND y de

sus reguladores, lo que lleva a preguntarse si es posible que las Bombas RND puedan

funcionar con esas configuraciones que son un poco diferentes a las reportadas. Esto es

observable en 19 muestras (ID’s: 1,2, 3, 4, 16, 18, 19, 20, 21, 24,26, 27, 28, 29, 33, 34, 35,

36 y 37), donde el gen regulador adeL que a su vez regula la expresión del operón adeFGH,

no se encuentra exactamente detrás del gen adeF, como se supone debería estar, sino

que está repetido y a 2 genes de distancia en la dirección correcta, es decir que hay otro

gen adeL a 3 genes de distancia del gen adeF como se ilustra a continuación:

adeL <- adeL <- [proteína] -> adeF -> adeG -> adeH

Donde para todos los casos [proteína] es una proteína hipotética (verificadas contra la base

nr del NCBI), en donde 17 de los casos la proteína es la siguiente:

MVRMGETGFMEWTEHKSLSITNKYIKFDNTIRIFITIDVFALENALIGVGVWIYFMP

Y para los 2 casos restantes la siguiente:

MEWTEHKSLSITNKYIKFDNTIRIFITIDVFALENALIGVGVWIYFMP

Es posible que el regulador si sobre exprese al operón por la configuración 3D de la

molécula de ADN, ya que espacialmente el regulador adeL estaría precediendo al operón

(Reguero Reza, 2016).

Adicionalmente estas muestras siempre poseen un gen extra adeC al final del operón

adeABC, (solo para mostrar los hallazgos).

Capítulo 4: Resultados y Discusión 101

Por otro lado, en la muestra con ID 6 el regulador adeRS está en la posición y dirección

correcta con respecto al operón adeABC, pero esta repetido 2 veces de la siguiente

forma: adeR->adeR->adeS->adeS. Aunque esta configuración no es válida según lo

consultado en la literatura, de nuevo podría ser interesante conocer su comportamiento

in vivo.

Adicionalmente, en 16 muestras (ID’s: 8,9,10,11,12,13,15, 17, 22,23,25, 30, 31, 32, 38,

40), la bomba adeABC se encuentra incompleta, siempre falta el gen adeC, pero

poseen completo el regulador adeRS. Por supuesto es una bomba RND que

posiblemente no sea funcional, lo cual sería recomendable probar en el laboratorio.

4.1.2 Datos en la quinta regla

▪ Todas las 89 muestras poseen el gen gyrA, de las que la muestra RB 183,2 posee dos.

▪ De las 89 muestras 82 poseen el gen gyrA con la mutación que confiere resistencia.

▪ Ninguna de las muestras posee el gen parC.

4.1.3 Perfiles fenotípicos de resistencia

Tabla 4-1: Categorías y agentes antimicrobianos usados para definir MDR, XDR y PDR en Acinetobacter spp. En las 89 muestras del proyecto

Categoría Antimicrobiana

Agente Antimicrobiano

# R # I # S Total

Muestras

Aminoglycosides

Gentamicin 66 2 10 78

Tobramycin 73 1 14 88

Amikacin 0 0 0 0

Netilmicin 0 0 0 0

Antipseudomonal carbapenems

Imipenem 86 0 3 89

Meropenem 78 1 0 79

Doripenem 31 0 1 32

Antipseudomonal fluoroquinolones Ciprofloxacin 83 0 6 89

Levofloxacin 15 0 0 15

Antipseudomonal penicillins+ inhibitors Piperacillin-tazobactam 84 1 3 88

Ticarcillin-clavulanic acid 0 0 0 0

Extended-spectrum cephalosporins Cefotaxime 23 0 0 23



Ceftriaxone 66 5 1 72

Ceftazidime 65 17 7 89

Cefepime 80 5 3 88

Folate pathway inhibitors Trimethoprim-sulfamethoxazole 26 0 0 26

Monobactams Aztreonam 15 1 0 16

Penicillins+ inhibitors Ampicillin-sulbactam 63 17 8 88

Polymyxins Colistin 1 0 66 67

Polymyxin B 0 0 0 0

Tetracyclines

Tetracycline 0 0 0 0

Doxycycline 0 0 0 0

Minocycline 0 0 0 0

Criterio para Definir MDR, XDR y PDR en Acinetobacter spp. MDR: no-susceptible a ≥1 agente en ≥3 categorías antimicrobianas XDR: no-susceptible a ≥1 agente en ≥8 de 10 categorías antimicrobianas PDR: no-susceptible a todos los agentes antimicrobianos listados #R= Cantidad de muestras Resistentes; #I= Cantidad de muestras Intermedias; #S= Cantidad de muestras susceptibles.

Como se puede apreciar en la tabla 4-1, solo 3 miembros de 3 categorías diferentes de

antibióticos (las casillas que están resaltadas con color), fueron evaluados en las 89

muestras, siendo esto especialmente crítico para la categoría de las Tetraciclinas porque

ninguna muestra fue probada frente a este tipo de antibióticos. En el Anexo B, Tabla 1-4,

se encuentra para cada una de las muestras su clasificación de resistencia, además de

mostrar cuales son las categorías de antibióticos frente a los cuales cada muestra fue

resistente. En general la resistencia de las 89 muestras fue clasificada como sigue: 14

XDR, 73 MDR y solo 2 muestra sin clasificación (1 con todas las categorías sensibles y la

otra con 1 categoría sensible). Nuevamente con el agravante de que en el antibiograma

de algunas muestras no están representados todos los grupos de antibióticos, y, por lo

tanto, algunas de las muestras clasificadas como XDR podría ser PDR.

Por otro lado, es pertinente mostrar el antibiograma en general para las 89 muestras, de

tal forma que se pueda saber a cuantas muestras se les probo su resistencia frente a un

antibiótico en particular, visualizando además a que sub clase o clase pertenece ese

antibiótico (Tabla 4-2).


Tabla 4-2: Agrupación de la cantidad de muestras según antibiograma consolidado

ID Clase o

Subclase ID Antibiótico

# Muestras

89 Aminoglycosides 120 Amikacin 78

121 Gentamicin 88

24 Aminopenicillin 29 Ampicillin 32

4 b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations

41 Amoxicillin-clavulanate 14

42 Ampicillin-sulbactam 88

47 Piperacillin-tazobactam 88

21 Carbapenem

83 Doripenem 32

186 Ertapenem 15

84 Imipenem 89

85 Meropenem 83

12 Cephalosporin Ic 50 Cephalothin 23

14 Cephalosporin IIIc

57 Cefotaxime 23

58 Ceftazidime 89

60 Ceftriaxone 72

77 Cefuroxime (Oral) 22

15 Cephalosporin IVc 61 Cefepime 88

17 Cephamycin 66 Cefoxitin 54

114 Fluoroquinolone

158 Ciprofloxacin 89

166 Levofloxacin 15

169 Norfloxacin 8

107 Folate pathway inhibitors 131 Trimethoprim-sulfamethoxazole 26

117 Glycylcyclines 182 Tigecycline 54

7 Monobactams 81 Aztreonam 16

97 Nitrofurans 149 Nitrofurantoin 23

110 Polymyxins 188 Colistin 67

Como se puede apreciar en la tabla anterior, de 25 antibióticos utilizados en común por los

3 métodos para obtener el antibiograma (Kirby Bauer, Vitek2 y Phoenix 100), solo 3

antibiótico (Imipenen, Ceftazidime y Ciprofloxacina), fueron probados en las 89 muestras,

por lo que no fue posible una estandarización completa del perfil fenotípico.

4.1.4 Perfiles genotípicos de resistencia



Tabla 4-3: Cantidad total de genes encontrados en las 89 muestras según el mecanismo de resistencia

En general en los genomas de 89 muestras de A. Baumannii estudiadas se encontraron

elementos genómicos asociados a todos los mecanismos de resistencias antes descritos

(Tabla 4-3). También se identificaron 87 diferentes elementos genómicos cuyo mecanismo

de resistencia está catalogado como “Elementos Móviles”, que, aunque están descritos en

el Anexo E, tabla 1-15, no se tomaron en encuentra dentro de los perfiles genómicos de

resistencia abordados en el presente trabajo, ya que estos requieren de un análisis y

desarrollo que se consideró desde un comienzo por fuera del alcance de este proyecto y

que será abordado por el grupo de investigación en el futuro.

Los genes que corresponden al mecanismo de resistencia: Degradación o modificación del

Antibiótico como era de esperarse fueron los que se identificaron en mayor número (1685,

Tabla 4-3). Con cada uno de ello, como se explicó en el subcapítulo 3.3, se procedió a

establecer de acuerdo con la información disponible, el grupo, sub grupo, antibiótico y el

nivel de resistencia que podrían conferir cuando están presentes en el genoma de una

bacteria como A. Baumannii. Por supuesto esto fue únicamente posible para aquellos de

los que se encontró evidencia comprobada según la literatura (esto fue constantemente

actualizado), para el momento cuando se realizó la revisión de este apartado.

Las Bombas e-flujo tipo RND fueron identificadas en todos los genomas de A. Baumannii

estudiados, encontrando variaciones en términos de su ubicación y la de sus reguladores

de expresión de llegar a poseerlos, características que como se explicó antes, influyen en

la resistencia conferida a la bacteria por este tipo de elementos genómicos (Anexo E, tabla

1-14). La influencia de estas bombas de eflujo sobre la resistencia, se basó en reportes

Mecanismo

resistencia

Cantidad

Genes

Alteración de Porina 17

Modulación de genes 86

Elementos Móviles 87

Proteina de Protección 155

Cambio de Sitio Blanco 204

Bombas de Eflujo 288

Degradación o Modificación del Antibiótico 1685


de la literatura que señalan cuales son los antibióticos frente a los que confieren

resistencia, y estos a que clase o sub clase pertenecen (Tabla 4-4)

Tabla 4-4: Antibióticos y clases por tipos de Bomba eflujo RND

BombaRND Antibiótico subclase o Clase

adeABC

Gentamicin Aminoglycosides

Kanamycin

Cefotaxime Cephalosporin IIIc

Tigecycline Glycylcyclines

Erythromycin Macrolides

Chloramphenicol Phenicols

Tetracycline Tetracyclines

adeDE

Aminoglycosides

Rifampin Ansamycins

Carbapenem

Ceftazidime Cephalosporin IIIc

Fluoroquinolone

Erythromycin Macrolides



adeFGH Fluoroquinolone


adeIJK

Rifampin Ansamycins

b-Lactams

Fluoroquinolone

Trimethoprim Folate pathway inhibitors

Lincosamides

Macrolides


aminocoumarin Quinolones


adeXYZ

Rifampin Ansamycins

b-Lactams

Ciprofloxacin Fluoroquinolone





Así como ya se presentó el perfil fenotípico de resistencia discriminado por los antibióticos

y sus clases o subclases de todas las muestras (Tabla 4-2), se elaboró el perfil genotípico

de resistencia que relaciona el número de genes encontrados en las muestras con el grupo

o subgrupo del antibiótico frente al cual confieren resistencia (Tabla 4-5). Por supuesto,

esta relación se basa en lo encontrado en la literatura y permite la predicción teórica del

perfil de resistencia luego de la aplicación de las reglas, objetivo de la presente tesis, de

tal forma que lo hace comparable con el perfil fenotípico.

Tabla 4-5: Cantidad de genes por antibiótico y clases

subclase o Clase

Antibiótico Cantidad

Genes

Aminoglycosides 195

Ansamycins Rifampin 36

b-Lactams 1018

Carbapenem

2

Imipenem 3

Meropenem 1

Cephalosporin Ic 1

Cephalosporin IIIc 2

Cephalosporin IVc 1

Fluoroquinolone 209

Ciprofloxacin 2

Folate pathway inhibitors

Sulfonamides 7

Trimethoprim 48

Fosfomycins Fosfomycin 18

Fusidanes Fusidic acid 3

Glycopeptide 94

Lincosamides 53

Lipopeptides 10

Macrolides 110

Erythromycin 9

Nitrofurans Nitrofurantoin 1

Oxazolidinones linezolid 4

Penicillins 2

Phenicols 7

Phenicols Chloramphenicol 97

Polymyxins

22

Colistin 3

Polymyxin B 2

Pseudomonic acid Mupirocin 1


Quinolones 3

aminocoumarin 25

Sin Asignar

elfamycin 8

ethambutol 8

isoniazid 4

peptide antibiotic 14

pleuromutilin 10

pyrazinamide 1

triclosan 7

tunicamycin 1

Streptogramins 57

Tetracyclines Minocycline 1

Tetracycline 112

4.1.5 Comparación de los perfiles genómicos y fenotípicos

Finalmente, para entender por qué se necesitaba mostrar las tablas anteriores, siempre

incluyendo las clases y subclases de los antibióticos, es importante darse cuenta que

cualquier tipo de comparación tiene que darse entre iguales elementos o categorías, para

que la comparación tenga sentido.

Comparar los agentes microbianos entre ambos perfiles no es exactamente una opción

viable, por que como se puede observar en la Tabla 4-5, se tienen muchos elementos

genómicos que no se les reporta la resistencia que confieren hacia un agente específico si

no hacia una clase o subclase. En muchos otros casos incluso solo se enuncia la gran

posibilidad de conferir resistencia hacia un grupo, ya que por solo por nombrar un ejemplo:

el gen “ramA”, confiere resistencia al grupo de antibióticos β-lactámicos (Jia et al., 2017).

Por este motivo es necesario hacer la comparación a un nivel donde se pueda comparar,

y este nivel es precisamente un nivel superior, es decir en las clases y sub clases de los

antibióticos. Considerando lo anterior, por el lado del perfil fenotípico de resistencia, de las

muestras se obtuvo información de resistencia frente a 14 clases o sub clases de

antibióticos (Aminoglycosides, Aminopenicillin, b-Lactam/b-lactamase inhibitor

combinations, Carbapenem, Cephalosporin Ic, Cephalosporin IIIc, Cephalosporin IVc,

Cephamycin, Fluoroquinolone, Folate pathway inhibitors, Glycylcyclines, Monobactams,

Nitrofurans, Polymyxins), aunque debido a que el perfil se obtuvo basándose en las

indicaciones hechas por la CLSI, los conjuntos de antibióticos probados variaron de



pendiendo del año y de las necesidades del INS, por lo que no todas las 14 clases o sub

clases de antibióticos fueron probadas en todas las 89 muestras. Se encontró que

solamente 4 categorías de antibióticos (Fluoroquinolone, Carbapenem, b-Lactam/b-

lactamase inhibitor combinations, Cephalosporin IIIc), fueron utilizadas en todas las

muestras, y con ellas se realizó un estudio completo.

Por otro lado, los perfiles genómicos de resistencia de las 89 muestras muestran 23 clases,

subclases o grupos de antibióticos (Aminoglycosides, Ansamycins, b-Lactam/b-lactamase

inhibitor combinations, b-Lactams, Carbapenem, Cephalosporin Ic, Cephalosporin IIc,

Cephalosporin IIIc, Cephalosporin IVc, elfamycin, Fluoroquinolone, Folate pathway

inhibitors, Glycylcyclines, Lincosamides, Macrolides, Monobactams, Penicillins, Phenicols,

Polymyxins, Quinolones, Streptogramins, Tetracyclines, triclosan).

El comportamiento en el perfil genómico por supuesto es diferente al del perfil fenotípico,

si en alguna muestra no se presenta el dato sobre una sub clase, clase o grupo de

antibiótico, es porque simplemente no se encontraron elementos genómicos que puedan

influir en la resistencia a tal categoría, como sucede por ejemplo para el caso de los

elementos que confieren resistencia a "Monobactams", que solo fueron hallados en 5

muestras.

Tabla 4-6: Relación entre clases y sub clases de los perfiles Fenotípicos y Genómicos

Genómico Fenotípico

Aminoglycosides

Aminoglycosides

Ansamycins Aminopenicillin



b-Lactams Carbapenem

Carbapenem

Cephalosporin Ic

Cephalosporin Ic

Cephalosporin IIIc

Cephalosporin IIc

Cephalosporin IVc

Cephalosporin IIIc

Cephamycin

Cephalosporin IVc

Fluoroquinolone

elfamycin Folate pathway inhibitors

Fluoroquinolone

Glycylcyclines

Folate pathway inhibitors

Monobactams

Glycylcyclines Nitrofurans

Lincosamides

Polymyxins

Macrolides

Monobactams

Penicillins

Phenicols

Polymyxins

Quinolones

Streptogramins

Tetracyclines

triclosan

Al comparar todas las clases o subclase, tanto del perfil fenotípico como del genómico

compilados para las 89 muestras de este estudio (Tabla 4-6), se encontró que dadas las

limitaciones de las pruebas fenotípicas utilizadas, solamente hay 11 categorías en común

entre los dos perfiles (señaladas en amarillo, Tabla 4-6)), 2 que se corresponden por que

la sub clase “Aminopenicillin” está incluida en la clase “Penicillins” (en naranja, Tabla 4-6)).

Las restantes categorías del perfil genómico no fueron correlacionadas en los ensayos con

el perfil fenotípico (en blanco, Tabla 4-6)). Por ultimo las celdas de la Tabla 4-6 que están

con fondo gris, corresponde a agentes antimicrobianos que hacen parte del grupo de

sustancias que no tienen una asignación a ninguna categoría de antibióticos.



Para efecto del análisis y la comparación entre perfiles es necesario ajustar lo que se

podría llamar como pseudo incongruencias, lo que sucede en muy pocas muestras y en

las muestras, en pocas sub clases y clases (Tabla 4-7). Este tipo de incongruencias o

pseudo incongruencias aparece cuando en una muestra, dentro de la misma sub-clase o

clase, un antibiótico es resistente y otro es susceptible

Tabla 4-7: Muestras con Incongruencias por clase en el perfil fenotípico

Id Muestra Sub-Clase / Clase

4 RB 13 b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations

8 RB 67 Cephalosporin IIIc

11 RB 138 Aminoglycosides


15 RB 184 Carbapenem





41 RA 121 Cephalosporin IIIc

42 RB 231-2 b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations

48 GMR-RA 1051 Aminoglycosides

80 GMR - RA 267 Aminoglycosides

118 RB330 b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations

Para solventar esta situación se procedió de la siguiente manera: primero la prelación se

da por el tipo de tecnología, siendo la prioridad el resultado por Kirby Bauer; segundo si la

tecnología es la misma entonces el perfil de resistencia estará orientado a la sospecha por

la resistencia, es decir, tendría prelación siempre el perfil resistente sobre los demás.

En la Tabla 4-8 se muestra el detalle de las incongruencias que fueron encontradas y la

solución que se le dio a cada muestra en la clase o sub clase que posee dicha

incongruencia.

Tabla 4-8: Detalle de incongruencias y ajustes.

ID Muestra Clase/Subclase Antibiótico Interpretación Equipo


4 RB 13 β-Lactam/β-lactamase inhibitor combinations

Ampicillin-sulbactam Sensible Kirby Bauer

4 RB 13 Piperacillin-tazobactam Resistente Kirby Bauer


Ceftazidime Sensible Kirby Bauer

8 RB 67 Ceftriaxone Intermedio Vitek 2

11 RB 138 Aminoglycosides

Amikacin Resistente Kirby Bauer

11 RB 138 Gentamicin Sensible Kirby Bauer

12 RB 147 β-Lactam/β-lactamase Ampicillin-sulbactam Sensible Kirby Bauer

12 RB 147 inhibitor combinations Piperacillin-tazobactam Resistente Kirby Bauer

15 RB 184 Carbapenem

Meropenem Sensible Kirby Bauer

15 RB 184 Imipenem Resistente Kirby Bauer


Ceftriaxone Resistente Vitek 2

18 RB 198 Ceftazidime Sensible Kirby Bauer


Ceftriaxone Resistente Vitek 2

23 RB 589 Ceftazidime Sensible Kirby Bauer



40 RB 1399 Ceftriaxone Intermedio Vitek 2

40 RB 1399 β-Lactam/β-lactamase Ampicillin-sulbactam Sensible Kirby Bauer

40 RB 1399 inhibitor combinations Piperacillin-tazobactam Intermedio Kirby Bauer

41 RA 121

Cephalosporin IIIc


41 RA 121 Ceftriaxone Intermedio Phoenix 100

41 RA 121 Cefuroxime (Oral) Resistente Phoenix 100

42 RB 231-2 β-Lactam/β-lactamase Piperacillin-tazobactam Resistente Kirby Bauer

42 RB 231-2 inhibitor combinations Ampicillin-sulbactam Sensible Kirby Bauer

48 GMR-RA 1051 Aminoglycosides

Gentamicin Sensible Kirby Bauer

48 GMR-RA 1051 Amikacin Resistente Kirby Bauer

80 GMR RA 267 Aminoglycosides

Gentamicin Resistente Kirby Bauer

80 GMR RA 267 Amikacin Sensible Kirby Bauer

118 RB330 β-Lactam/β-lactamase Ampicillin-sulbactam Sensible Vitek 2

118 RB330 inhibitor combinations Piperacillin-tazobactam Resistente Vitek 2

La casilla roja muestra entonces el perfil que no se va a tener cuenta dentro de esa clase

o sub clase para la muestra en particular. Esto aplica finalmente para las comparaciones

de perfiles, pero los datos en la base de datos del proyecto siguen estando completos, es

decir, con las incongruencias arriba nombradas.

Toda la información de las 89 muestras sobre de los perfiles de resistencia genómica se

encuentran en el Anexo E, Tabla 1-15, donde se puede apreciar por cada una los genes

de resistencia relacionados con los antibióticos y los mecanismos de resistencia, teniendo

en cuenta la posición de estos elementos dentro del genoma, previa aplicación de las

reglas de negocio propuestas.



4.1.6 Visualización de la comparación de los perfiles genotípicos y fenotípicos

A continuación, se presenta la comparación de perfiles de resistencia a antibióticos basado

en un experimento visual del profesor John Alexis Guerra Gómez (http://johnguerra.co/),

donde presenta una herramienta que compara importaciones y exportaciones de productos

en los países de América, llamada “TradeFlow”.

Esta herramienta a su vez está basada en la tecnología D3.js (https://d3js.org/), librería de

JavaScript que permite manipular documentos basados en datos. Usa HTML, SVG, y CSS,

Y Combinando componentes de visualización y un enfoque basado en datos para la

manipulación DOM.

Por supuesto algunas partes del código y la presentación fueron modificadas, aun así, la

Versión actual es Beta, pero permite una visualización sobre la comparación de perfiles de

resistencia a antibióticos. Esta se encuentra actualmente en la siguiente URL:

http://168.176.54.15/chartResistencia/flow/flow.html.

Todos los datos que componen la información necesaria para crear la visualización se

encuentran en el archivo llamado “todasLasMuestras.csv”, para el cual la información

necesaria para cada muestra es consultada en la base de datos y formateada por el

procedimiento almacenado implementado para este fin llamado “chartResistencia”.

La aplicación implementada para la comparación de los perfiles de resistencia fenotípicos

y genotípicos (http://168.176.54.15/chartResistencia/flow/flow.html) (Figura 4-1 y Figura

4-2), tiene en la parte superior izquierda una lista desplegable “muestra” donde se debe

seleccionar la muestra que se desea visualizar, y segundo se debe escoger el año de la

muestra para poder ver el grafico con la comparación.

Primero en la lista desplegable “muestra” se debe seleccionar la muestra que se desea

visualizar, y segundo se debe escoger el año de la muestra para poder ver el grafico con

la comparación.

http://johnguerra.co/

https://d3js.org/

http://168.176.54.15/chartResistencia/flow/flow.html


Ambos perfiles graficados una vez se ha seleccionado la muestra y el año, tienen las clases

o subclases de antibióticos con ciertos valores, pero en cada uno el significado es diferente.

En el perfil Fenotípico se tiene únicamente los valores 1 y 3: 1 significa que es susceptible

a esa clase o subclase de antibiótico 3 que es resistente (a todos los agentes que estaban

marcados como intermedios les fue asignado el valor 3, es decir resistente, para agrupar

y simplificar el gráfico).

El perfil genómico tiene valores desde el 1 hasta N, dependiendo de la aplicación de la

segunda regla de negocio (sección 3.4.2). Estos puntajes fueron asignados de la siguiente

forma: si el elemento genómico era resistente (+2), intermedio (+1) o susceptible (-1),

dependiendo claro de las demás reglas. Entonces se podría afirmar que si el valor es mayor

e igual a 2 en la Clase o subclase de antibiótico que lo posee este es posiblemente

resistente, entre más alto sea el valor significa que tiene más elementos genómicos que

suman a esa resistencia. Este grafico organiza de mayor a menor, y cambia el grosor de

la barra si el valor es mayor. Si el valor es de uno indica que el nivel de resistencia es

intermedio. Por otro lado, también existen valores de cero o negativos (los negativos

suceden por la suma de elementos susceptibles que están calificados con -1), como

sucede con algunas muestras en las Carbapenemasas, pero la gráfica solo muestra

valores mayores a cero.

Los colores en las barras a cada lado de la gráfica ayudan relacionar los que corresponden

a la misma Clase o Subclase entre ambos perfiles, pero están ordenados según la

interpretación: del lado izquierdo es una suma (perfil genómico) y del lado derecho solo si

son o no resistentes.

A continuación, se presenta 2 de las 89 figuras con la comparación grafica de los perfiles.

Las 89 figuras se encuentran en el Anexo F.



Figura 4-1: Comparación perfiles de resistencia para RA121

Figura 4-2: Comparación perfiles de resistencia para RB67


4.1.6.1 Calculo de precisión y análisis del perfil genómico de resistencia

Los criterios para la creación del script que permite la obtención de los porcentajes de

correspondencia entre los perfiles fenotípicos y genómicos fueron los siguientes:

▪ 1. Creación de una tabla que contiene las subclases de antibióticos que

corresponden a la totalidad comparable en los perfiles fenotípicos de resistencia,

basada en la Tabla 4-6.

▪ 2. Extraer para la muestra en cuestión cuantos de estas subclases de antibióticos

esta posee, ajustando la interpretación orientada a la sospecha de resistencia, es

decir que si la interpretación de la resistencia a la clase se clasifica como intermedia

esta corresponde a resistente.

▪ 3. Contar el número de subclases fenotípicas comparables que la muestra posee.

▪ 4. Extraer los valores y las subclases comparables en el perfil de resistencia

genómico.

▪ 5. Asignarle según valor genómico a la muestra, una interpretación de resistencia,

entre Susceptible o Resistente, valores mayores e iguales a 1 si son resistentes,

de lo contrario son susceptibles.

▪ 6. Contar el número de subclases genómicas comparables que posee la muestra.

▪ 7. Finalmente obtener el porcentaje de comparación de perfiles entre las muestras.

En la base de datos se implementó un procedimiento almacenado llamado

“porcentajeComparaticoXidMuestra”, para calcular este porcentaje entre perfiles por cada

una de las muestras. Adicional también se creó el procedimiento almacenado llamado

“porcentajeComparatico”, que despliega una tabla con la información de los porcentajes

para todas las muestras válidas.

Las muestras GMR-RA 959 (37.5%), RB 67 (40%) y RB 73 (40%), fueron las que

presentaron más incongruencias entre los perfiles y, por tanto, obtuvieron los porcentajes

más bajos. Como se muestra en el Anexo B tabla 1-4, estas muestras y principalmente la



RB 67, presentan un porcentaje muy bajo de comparación, al tener en cuenta los

elementos genómicos identificados que conforman su perfil de resistencia (Anexo E), en

comparación con muestras que poseen igual o similar contenido genómico con

probabilidad de conferir resistencia a una clase o sub clase de antibiótico, se llegó a la

conclusión que a estas 3 muestras valdría la pena realizarles más experimentos y

descartar las incongruencias que se puedan haber presentado en el perfil de resistencia

fenotípico.

El porcentaje promedio de similitud entre los perfiles fenotípico y genómico fue del 76.66,

sin incluir las 3 muestras acabadas de mencionar.

4.2 Discusión de resultados

Aunque una buena parte de las clases y las subclases tiene su respectiva correspondencia

entre ambos perfiles, según las comparaciones de los perfiles, se presentaron

principalmente 2 incongruencias mayores y 2 menores, que son corregibles con la

parametrización de la aplicación; igualmente a continuación se analizan todas las clases y

sub clases de antibióticos que son comparables entre ambos perfiles:

4.2.1 Monobactams

Por el lado del perfil de resistencia fenotípico 16 muestras presentaron resistencia a los

Monobactams: RB978, RB979, RB992, RA121, RB231-2, RB73, GMR-RA20, GMR-RA81,

GMR-RA291, GMR-RA292, RB1655, GMR-RA265, GMR-RA267, RB1690, RB1296, GMR-

RA687. (Como ya se mostró en la Tabla 4-2, solo 16 muestras de las 89 fueron evaluadas

frente a este antibiótico, y todas fueron resistentes a esta clase de antibióticos).

Adicionalmente 15 de estas muestras son resultados obtenidos a través del sistema

automatizado Phoenix 100, y el resultado de la muestra RB 231-2 fue obtenido a través

del sistema automatizado Vitek2.

Y por el lado de la resistencia genómica se tienen las siguientes muestras donde se

identificaron elementos genómicos que confieren resistencia a Monobactams: RB147,


RB184, RB197, RB1321, GMR-RA267. Es decir, solo coincide en la comparación la

muestra GMR-RA267.

Cabe mencionar que el sistema actualmente posee en su base de datos 135 genes que

codifican para β-lactamasas que pueden conferir resistencia a los Monobactams,

distribuidas dentro de los grupos: 2be, 2f, 2f_GES, 2f_SME, 2def, de los cuales identificó

con un 100% de identidad y cobertura y un e-value de cero los siguientes genes: KPC-2

(identificado originalmente en P. aeruginosa) en las muestras RB147 y RB 184; CTX-M-

115 (identificado por primera vez en A. baumannii) en las muestras RB197 y RB1321; y

finalmente el gen VEB-9 (identificado por primera vez en P. aeruginosa) en la muestra

GMR-RA267, es el único gen que se puede tener en consideración actualmente según la

comparación de perfiles como posible responsable de conferir resistencia a los

Monobactams ( porque es la única muestra con la cual se puede comparar). (información

detallada en el Anexo E, tabla 1-15).

Considerando la información almacenada en el sistema y la poca concordancia entre los

perfiles de resistencia de las muestras resistentes (falsos negativos) a las que no se les

pudo predecir su resistencia a Monobactams utilizando la información genómica, la

explicación podría ser: 1. El sistema no posee todos los elementos genómicos de

resistencia para esta clase de antibióticos en su base datos; 2. Pueden existir los

elementos genómicos de resistencia, pero no se les ha correlacionado con la resistencia a

Monobactams; 3. Cabe la posibilidad que los datos provenientes del perfil fenotípico de

resistencia estén sesgados, ya que es posible haya falsas resistencias o falsas

susceptibilidades en A. baumannii. (García C., 2002).

4.2.2 Aminoglycosides

Ventajosamente 88 de las 89 muestras poseen esta clase (agrupación) de antibióticos en

el perfil fenotípico de resistencia, de las cuales las siguientes 12 son susceptibles: RB67,

RB147, RB184, RB414, RB1399, GMR-RA959, RB73, RB1551, GMRRA211, GMRRA425,

RB157, RB330. Las demás son resistentes, pero aquí el análisis está enfocado para las

susceptibles, debido a que, en el perfil genómico de resistencia a las 89 muestras, se les

predijo la probabilidad de ser resistentes a esta clase de antibióticos.



Por un lado, las bombas eflujo tipo RND: adeABC y adeDE, confieren resistencia a esta

clase de antibióticos (Coyne et al., 2011). Además, en la base de datos posee otros 195

genes que también confieren resistencia contra los Aminoglycosides.

Revisando las 12 muestras que son susceptibles a los Aminoglycosides en el perfil

fenotípico contra el perfil genómico, el sistema permite encontrar en 11 de ellas el gen

llamado “rpsL”, con 71.5% identidad y 99% de cobertura, único gen encontrado en estas

muestras con la posibilidad de conferir resistencia a esta clase de antibióticos. Inicialmente

se podría inferir que este gen no confiere resistencia a esta clase de antibióticos en las

muestras de A. Baumannii debido a su divergencia con relación al identificado en

Mycobacterium tuberculosis CDC1551 resistencia a Streptomycin, o no se expresa. (ver

información detallada está en el Anexo E, tabla 1-15).

A diferencia de las otras muestras sensibles a Aminoglycosides, en la muestra RB157 se

identificaron 2 genes, “rpsL” con las mismas características encontradas en las otras 11

muestras y el “APH(3')-VIa” con 100% de identidad y cobertura, conservado e identificado

por primera vez para A. baumannii. Este comportamiento de puede deber a que el

resultado fenotípico no es correcto, ya que en este caso fue obtenido utilizando Vitek2, el

cual puede proporcionar falsos resistencias o falsas susceptibilidades en A. baumannii.

(García C., 2002). También esto se puede explicar teniendo en cuenta que estos genes

podrían no estar expresándose, aunque ciertamente es más improbable, porque la en la

muestra RB 138 presentan la misma configuración y su perfil de resistencia fenotípica

reporta resistencia a los Aminoglycosides.

Aunque las otras 77 muestras poseen el gen “rpsL” con el mismo porcentaje de identidad

y cobertura, también se identificaron en sus genomas 24 diferentes genes con diferentes

porcentajes de identidad y cobertura, que confieren resistencia a los Aminoglycosides,

encontrando entre 1 y 9 genes diferentes por cada muestra. Lo anterior podría indicar que

el gen “rpsL” no está confiriendo ninguna resistencia, pero para poder asegurar lo anterior

sería necesario un ensayo de en laboratorio para comprobarlo.

Considerando lo anterior, se actualizó la base de datos aumentando el parámetro de

porcentaje de identidad y cobertura para el gen “rpsL” a mayor de 90%. Luego de este


ajuste la comparación entre perfiles mejora excepto para la muestra RB157, lo que se

puede deber a una falsa susceptibilidad determinada por la prueba automatizada.

4.2.3 Carbapenem

La base de datos en cuanto a elementos genómicos que confieren resistencia a

Carbapenem, contiene datos sobre las bombas eflujo RND: adeDE, asociadas con

resistencia a esta subclase de antibióticos (Coyne et al., 2011), junto con datos de 169

genes que codifican para β-lactamasas clasificadas dentro de los grupos: 2f, 3a, 3b, 2df,

2f_GES, 2f_SME, 2def, y el gen “SCO-1”. Como contraparte se tienen 4 genes que

generan susceptibilidad a esta subclase de antibióticos (carO, omp33, Omp36, OprD).

La comparación inicial entre perfiles mostró que 86 muestras presentan resistencia a esta

subclase de antibióticos en el perfil fenotípico, mientras que solo 5 muestras fueron

clasificadas como resistentes con base en la presencia de genes que confieren resistencia

en el perfil genómico de resistencia.

Todas las muestras poseen el gen “OprD”, incluso hay 3 muestras a las cuales este gen

se les identifico 2 copias: RB1191, RB 1388, RB 1399, lo que implica que por tratarse de

un gen que genera susceptibilidad en la evaluación del perfil genómico va a comenzar

restando (-2) a la puntuación de cada muestra para esta subclase de antibióticos. De igual

forma todas las 89 muestras poseen al menos un gen que confiere resistencia a esta

subclase de antibióticos, todos ellos β-lactamasas dentro de las que se encontraron las

siguientes: OXA-23, OXA-65, VIM-4, OXA-120, OXA-90, OXA-146, OXA-64, OXA-51,

KPC-2, NDM-1, OXA-106, OXA-72, OXA-255, OXA-68 (ver información detallada está en

el Anexo E, tabla 1-15).

El problema del sistema para identificar la resistencia en esta sub clase de antibióticos es

de configuración de los parámetros de la aplicación con respecto a la valoración de los

puntajes aplicados en el perfil genómico (+resistencia, -susceptibilidad) (3.4.2 Segunda

Regla). Las 5 muestras a las que se les predijo resistencia a Carbapenemasas, fueron

clasificadas de esta forma en el perfil genómico porque tenían más genes que confieren

resistencia a esta subclase que permitieron aumentar suficientemente el puntaje utilizado



para la predicción de resistencia. Con base en lo anterior el sistema fue configurado de tal

forma que el valor asignado a los genes que confieren susceptibilidad de modificó

pasándolo de -2 a -1.

4.2.4 Polymyxins

El conjunto de datos recopilados en la base de datos relacionados con resistencia a

Polimyxins, está conformado por 5 genes conservados en A. baumannii o el complejo

baumannii - calcoaceticus: LpxC, LpxA, PmrB, OmpW, PmrA; 19 genes identificados

también en otras especies: MCR-1, arnA, PmrF, PmrE, mgrB, PmrC, Klebsiella mutant

PhoP conferring antibiotic resistance to colistin, PmrB, mexB, mexA, mexR, nalD, PmrA,

nalC, oprM, phoP, phoQ, rosA, rosB, rosB; y por un HMM llamado phoQ.

Solo la muestra RB 183_2, presenta resistencia contra esta subclase de antibióticos en el

perfil fenotípico. mientras las restantes 66 muestras que incluían este ensayo de

resistencia mostraron ser susceptibles. Por otro lado, en el perfil genómico las 89 muestras

presentan resistencia a las polimixinas, todas ellas poseen al menos 2 genes entre los

siguientes 3: LpxC, LpxA, PmrE. 21 muestras poseen los 3 genes juntos.

Las muestras: GMR-RA687, GMR-RA1051, RB1169, RB725, RB903 que poseen el gen

“PmrE” su porcentaje de identidad es del 62.3% con cobertura del 100% con respecto al

identificado por primera vez en Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 asociado con

resistencia a colistina. Es evidente que la diferencia en secuencia de este gen en las

muestras de A. baumannii estudiadas podría indicar que ha perdido su capacidad de

conferir resistencia parcial o totalmente, como ya ha sido reportado para mutaciones los

genes pmrA y pmrB de esta familia, encargados de regular la expresión del gen pmrC en

A. baumannii, gen que a su vez promueve la expulsión de la colistina (Adams et al., 2009).

De otra parte, las muestras RB1399, RB60, RB69, RB828 y RB67, poseen el gen LpxA

con un porcentaje de identidad mayor al 99% y cobertura del 100%, mientras todas las

demás poseen los genes LpxC o LpxA con 100% de identidad y cobertura, dando indicios

de una posible resistencia a las Polimyxins, ya que las mutaciones de los genes LpxA/B y

C o la falta de estos, están involucradas en la pérdida de lipopolisacáridos que causa


resistencia a las Polimixinas (Moffatt et al., 2010), y actualmente los genes que se

encuentran en la base de datos son los genes con la mutaciones.

Evidentemente, la identificación de los genes “PmrE”, LpxA/B y C no es condición

suficiente para predecir resistencia a las polimixinas, por lo que se realizó una actualización

de la parametrización de los datos, que consistió en elevar los porcentajes de identidad y

cobertura del gen PrmE; y adicionar los genes sin mutación para LpxA/B y C, valorándolos

como susceptibles cuando sean encontrados.

Es probable que la muestra RB 183_2 tenga algún otro elemento genómico de resistencia

que no se está identificando, para que esta posea resistencia, o por el contrario puede ser

un falso positivo.

4.2.5 Cephalosporin Ic

Para esta sub clase de antibióticos no se presentan problemas en la comparación de

perfiles con los datos actuales, donde solo 23 muestras poseen datos fenotípicos y todos

fueron clasificados como resistentes al agente “Cephalothin”. Por otra parte, las 89

muestras fueron clasificadas como probablemente resistentes frente a este antibiótico en

el perfil genómico de resistencia.

En la base de datos hay almacenados 349 genes identificados como elementos genómicos

que confieren resistencia a esta sub clase de antibiótico, los cuales en los genomas de las

23 muestras resistentes (perfil fenotípico), se identifican con 100% de cobertura y un e-

value de cero, los siguientes genes: ADC-2 (identidad mayor a 98%), TEM-1, NDM-1, VEB-

9 y VIM-4 (los últimos todos con identidad de 100%). 18 de las muestras poseen dos de

los genes antes descritos, 3 muestras poseen 1, 1 posee 3, y 1 posee 4. Entre las 66

muestras a las que no les fue realizando el antibiograma frente a “Cephalothin”, además

de los genes anteriormente nombrados, se les identificaron también los genes: KPC-2 y

CTX-M-115 con 100% de identidad. En general, se encontró que 21 muestras poseen solo

1 gen, 41 muestras poseen 2 genes, y 4 muestras posee 3 genes. Estos datos indican la

probabilidad de que todas las muestras sean resistentes a esta sub clase de antibiótico,

algo que en un trabajo posterior podría ser corroborado fácilmente en el laboratorio.



4.2.6 Cephalosporin IIIc

De las 89 muestras 7 muestras (RB 67, RB 198, RB 589, RB 1399, RA 121, GMR-RA 959

y RB 1388), presentan susceptibilidad a esta subclase de antibiótico, todas ellas sensibles

frente a la Ceftazidime de acuerdo con las pruebas realizadas con Kirby Bauer, excepto la

muestra GMR-RA 959 que adicionalmente presenta susceptibilidad a la Ceftriaxona de

acuerdo a la prueba realizada con el Vitek2.

El perfil genómico de resistencia clasificó las 89 muestras como resistentes a esta sub

clase de antibiótico y permitió establecer que, en las 7 muestras susceptibles de acuerdo

con el perfil fenotípico, todos los genes identificados tienen una cobertura del 100% y un

e-value de cero. Entre las 7 muestras susceptibles se encontró que la muestra GMR-A 959

contiene el gen OXA-120; la muestra RA 121 los genes OXA-23 y OXA-64; la muestra RB

1388 el gen OXA-68; la muestra RB 198 los genes OXA-23, OXA-65 y la bomba e-flujo tipo

RND adeABC con su regulador adeRS que potencian la resistencia frente a este antibiótico

(Coyne et al., 2011); la muestra RB 589 los genes OXA-23 y OXA-64 (todas con una

identidad del 100%); la muestra RB 67 un gen OXA-90-like (identidad del 99,64%); y la

muestra RB 1399 los genes OXA-106-like (identidad del 99,64%), OXA-255-like (identidad

del 99,37%) y OXA-72 (identidad del 100%).

En las 82 muestras restantes, una presentó un solo gen (muestra RB 73 con el gen OXA-

65 con 100% de identidad y cobertura, con e-value de cero), 75 presentaron 2 genes, y 6

presentaron 3 genes. Entre estas 82 muestras ninguna presentó los genes: OXA-68, OXA-

106, OXA-255, OXA-72, que se identificaron en los genomas de las 7 susceptibles del perfil

fenotípico. Adicionalmente, estas 82 muestras poseen genes tales como VEB-9, OXA-51,

KPC-2, VIM-4, NDM-1, CTX-M-115 y OXA-146, incluyen la bomba de eflujo tipo RND

adeABC y 42 de ellas presentan el regulador adeRS.

Cabe resaltar que ninguna otra muestra posee alguno los 3 genes identificados en las

muestras RB 1399 o RB 1388. Por otro lado, en 22 muestras se identificaron los mismos

genes que las muestras RA 121 y RB 589 (resistentes perfil de resistencia fenotípico), y

de igual forma en 48 muestras se identificaron los mismos genes que la muestra RB 198.


Es importante recordar que las muestras: RB 67, RB 198, RB 589, RB 1399; según el perfil

resistencia fenotípica obtenido para estas utilizando el método automatizado Vitek 2,

mostraron resistencia a otro agente de este sub grupo, pero que según el protocolo de

ajuste de incongruencias para cada clase o sub clase se dejaron los resultados obtenidos

por el método Kirby Bauer, como sucedió también con la muestra RA 121, que bajo el

método automatizado Phoenix 100, también presentó resistencia a esta sub clase. Es para

tener en cuenta este hecho como parte de un posible ajuste del protocolo de determinación

del perfil fenotípico, siendo necesarias más pruebas para confirmar o descartar la

resistencia frente a este tipo de antibióticos.

No hay suficiente evidencia para inferir con los datos genómicos actuales porque las 7

muestras que presentan susceptibilidad en el perfil fenotípico de resistencia no presentan

susceptibilidad en el perfil genómico, ya que estas 7 muestras tienen suficientes elementos

genómicos para conferir resistencia a esta sub clase de antibióticos. Esta discordancia en

el sistema actualmente no se puede remediar fácilmente, a menos que estas 7 muestras

hayan presentado una falsa susceptibilidad en el perfil fenotípico de resistencia. Son

necesarios más ensayos de laboratorio sobre esta sub clase para encontrar una solución

a esta discordancia.

4.2.7 Cephalosporin IVc

Con relación a esta clase de antibióticos 88 muestras cuentan con información dentro de

su perfil fenotípico de resistencia, mientras que este dato no fue reportado para la muestra

RB 198. Las muestras RB 67, RB 1399 y GMR-RA 959, mostraron en su perfil fenotípico

susceptibilidad a Cefepima, parte de la sub clase Cephalosporin IVc. Las pruebas fueron

realizadas utilizando Kirby Bauer (78 muestras) y Vitek2 (10 muestras).

El perfil genómico de resistencia mostró que las 89 muestras podrían presentar resistencia

a esta sub clase de antibióticos. Anotando con relación a los genes que confieren

resistencia al sub grupo Cephalosporin IVc identificados en los genomas de las muestras

que presentan susceptibilidad en el perfil fenotípico de resistencia, que la muestra GMR-

RA 959 contiene el gen OXA-120 (identidad del 100%), la muestra RA 67 el gen OXA-90-

like (identidad 99.64%), y la muestra RB 1399 los genes OXA-106-like (identidad 99,64%),

OXA-255-like (identidad 99,37%) y OXA-72 (identidad 100%). Cabe resaltar que ninguna



otra muestra posee alguno los genes identificados en los genomas de las muestras RB

1399, RB 67 y GMR-RA 959, aunque hay evidencia en la literatura disponible que los

relaciona con los mecanismos de resistencia a esta subclase de antibióticos (Jia et al.,

2017)( http://www.lahey.org/Studies/).

Es evidente entonces que los perfiles genómicos de resistencias predichos tienen una alta

precisión en la medida que solo del 3.4% de los estos no tuvieron correspondencia con

perfil fenotípico para el caso del sub grupo Cephalosporin IVc. Con la información

disponible el sistema implementado no podría parametrizarse para obtener una mejor

concordancia en los perfiles, y lo recomendable es que las 3 muestras que presentan

discrepancias sean sometidas a ensayos de laboratorio adicionales.

4.2.8 Fluoroquinolone

Las 89 muestras poseen información sobre el perfil fenotípico de resistencia para esta sub

clase de antibióticos, de las cuales las muestras RB 15, RB 67, RB 69, RB 183-2, RB 1399

y GMR-RA 959, presentan susceptibilidad frente a la Ciprofloxacina, pruebas realizadas

con la metodología Kirby Bauer.

Las 89 muestras podrían presentar resistencia a esta subclase de antibióticos según el

perfil genómico de resistencia. En las 6 que presentaron susceptibilidad en el perfil

fenotípico de resistencia fueron identificados los genes mexT (identidad y cobertura 100%,

e-value 0); abeM (identidad > 99%; cobertura 100%, e-value 0); y parE (identidad >

68.89%; conbertura 100%, e-value 0), genes asociados a la resistencia frente a esta sub

clase de antibióticos (Jía et al., 2017). Adicionalmente, en las muestras RB 1399, RB 183-

2, RB 67 y RB 69, fue identificado el gen soxR (identidad 64.43%; conbertura 93%, e-value

1e-65); y en la muestra RB 15 el gen qacH (identidad 71.87%; conbertura 83%, e-value

2e-48).

De acuerdo con su perfil fenotípico de resistencia las 83 muestras restantes presentaron

resistencia frente a esta subclase de antibióticos, muchas de las cuales presentaron

perfiles genómicos de resistencia iguales y similares a las muestras descritas antes como

susceptibles.


De nuevo, es difícil saber con los datos genómicos actuales porque se presenta esta

incongruencia entre el perfil genómico y el perfil de las 6 muestras susceptibles, por lo que

puede ser conducente hacer más pruebas microbiológicas para corroborar de nuevo el

perfil fenotípico de resistencia.

4.2.9 Folate pathway inhibitors

Para esta clase de antibióticos no se presentaron problemas en la comparación de perfiles

con los datos actuales. Solo 26 muestras poseen datos fenotípicos, todas resistentes al

Trimethoprim-sulfamethoxazole (este se compone de una parte de trimetoprima por cinco

partes de sulfametoxazol (Hamilton, 2014)).

Las 89 muestras presentarían resistencia de acuerdo con el perfil genómico de resistencia,

donde en todas fue identificado el gen mexT con un 100% de cobertura, 88 de ellas con

identidad del 100% y 1 con identidad del 99.70%. 77 muestras poseen adicionalmente el

gen sul2 (identidad 100%, e-value 0), aunque 69 de ellas con una cobertura del 94%, 11

con cobertura del 100% y una con 96% de cobertura; 3 muestras poseen el gen sul1

(identidad y cobertura 100%); y finalmente, una muestra posee el gen dfrE (identidad

62.75% de, cobertura 92% e e-value de 6E-38). 82 muestras tienen más de 1 gen que

induce resistencia frente a esta clase de antibióticos, y 7 (GMR-RA 959, GMRRA211,

GMRRA425, RB 147, RB 184, RB 67 y RB 69), que tienen solamente el gen mexT

(identidad y cobertura 100%). Por un lado, el gen mexT se ha reportado que confiere

resistencia a la trimetoprim (además a las Fluoroquinolonas y al Chloramphenicol),

mientras que los genes sul1 y sul2, confieren resistencia a las Sulfonamidas (como el

sulfametoxazol) y el gen dfrE confiere resistencia a la trimetoprim (Jia et al., 2017). Las 26

muestras que son resistentes según el perfil fenotípico de resistencia todas poseen 2

genes el mext y el sul2, excepto la muestra RB 828, que posee adicionalmente el gen sul1.

Lo anterior podría indicar que el resto de las 51 muestras que poseen esta misma

configuración genómica podrían ser resistentes a la sub clase pholate pathway inhibitors.

Por su lado las muestras RB 15 y RB 60, poseen los genes mexT y sul1 también tienen

probabilidad de ser resistentes a esta sub clase de antibióticos, mientras que a las 10

muestras faltantes (GMR-RA 959, GMRRA211, GMRRA425, RB 1399, RB 1399, RB 147,

RB 184, RB 197, RB 197, RB 67, RB 69) sería necesario realizarles las pruebas de



laboratorio para comprobar el perfil fenotípico y obtener alguna conclusión sobre esta sub

clase.

4.2.10 Glycylcyclines

54 muestras poseen información sobre el perfil fenotípico de resistencia para esta sub

clase de antibiótico, 47 de estas presentan susceptibilidad la Tigeciclina (único agente para

esta sub clase), 45 de estas realizadas con Vitek2 y las otras 2 con Phoenix100. (para las

que son resistentes 4 con Vitek2 y 3 con Phoenix100).

Por el lado del perfil genómico 44 muestras podrían presentar resistencia a Glycyclines

conferida posiblemente por la presencia en su genoma de la bomba e-flujo tipo RND

llamada adeABC y 43 de ellas con su regulador adeRS (estos son los únicos elementos

genómicos identificados para este caso). Entre las 47 muestras a las que se les reportó

susceptibilidad en el perfil fenotípico, hay 20 que presentan la bomba e-flujo tipo RND

adeABC con su regulador adeRS.

Ahora tomando las 7 muestras que son resistentes según el perfil fenotípico, dentro del

perfil genómico 5 de estas poseen la misma bomba e-flujo y regulador. Se encontraron

adicionalmente 19 muestras que presentaron esta bomba e-flujo y no están dentro de las

muestras que poseen alguna información en el perfil fenotípico de resistencia.

Se tiene realmente muy poca información para obtener alguna conclusión satisfactoria

sobre esta discrepancia entre los perfiles, siendo posible que la bomba e-flujo adeABC no

tenga realmente ningún efecto sobre esta sub clase de antibiótico y exista algunos otros

elementos genómicos no identificados que confieran este tipo de resistencia.

4.2.11 b-Lactam/b-lactamase inhibitor combinations

Las 89 muestras poseen información en el perfil fenotípico de resistencia para esta clase

de antibióticos. 3 muestras: RB 67, GMR-RA 959 y RB 73, presentan susceptibilidad a

Ampicillin-sulbactam y Piperacillin-tazobactam, de acuerdo con los resultados obtenidos

utilizando la metodología Kirby Bauer.


Según el perfil genómico de resistencia las 89 muestras podrían presentar resistencia a

esta subclase de antibióticos. Por su parte, en las muestras GMR-RA 959, RB 67 y RB 73

reportadas como susceptibles de acuerdo con el perfil fenotípico de resistencia, fue

identificado el gen ADC-2 (Identidad 98.96%, 98.96% y 98.69% respectivamente). Las 86

muestras restantes poseen también el gen ADC-2 y en 79 de estas es el único elemento

genómico identificado asociado con la resistencia a esta clase de antibióticos, con

porcentajes de cobertura del 100%, e-values de cero y porcentajes de identidad siempre

entre al 98% y el 99%, es decir con unas características muy similares a las de las 3

muestras que presentan susceptibilidad. En 7 muestras se identificaron además los genes

NDM-1 y VIM-4, que también confieren resistencia a esta clase de antibióticos.

De nuevo es difícil saber con los datos genómicos actuales porque se presenta esta

incongruencia entre el perfil genómico y fenotípico para estas 3 muestras sensibles. Se

podría pensar que las pocas diferencias encontradas en la secuencias del gen ADC-2

podrían inactivar este gen, pero dado que las secuencias de este gen en las muestras

GMR-RA 959 (sensible) y RB 15 (resistente) son iguales y esto sucede igualmente con

las muestras RB 67 (Sensible) y las muestras: GMR-RA20, GMRRA211, RA 121, RB 137,

RB 589, RB 60, RB 640, RB 67, RB 69 (resistentes), o la muestra RB 73 (sensible) y otras

65 muestras son resistentes. la explicación de esta incongruencia podría estar relacionada

con la presencia de otros elementos genómicos no identificados.

4.2.12 Precisión del perfil genotípico

Luego de los ajustes que se realizaron a los resultados del perfil genómico de resistencia,

se establecieron los porcentajes de correspondencia o equivalencia entre los perfiles

fenotípicos y genómicos para cada una de las muestras, basándose el protocolo de

criterios descritos en el subcapítulo 4.1.6.1., y finalmente se calculó el porcentaje promedio

total de precisión de la aplicación para obtener perfiles de resistencia genómica (Tabla

4-9).



Tabla 4-9: Porcentaje de correspondencia entre perfiles por cada muestra

Id muestra

Cod Muestra

Cantidad Fenotípica

Correspondencia Genómica

Porcentaje

1 RB 06 8 6 75,00

2 RB 10 9 6 66,67

3 RB 11 9 6 66,67

4 RB 13 10 6 60,00

6 RB 15 8 5 62,50

8 RB 67 10 4 40,00

9 RB 69 9 5 55,56

10 RB 137 9 5 55,56

11 RB 138 10 6 60,00

12 RB 147 9 7 77,78

13 RB 182 9 6 66,67

14 RB 183,2 9 7 77,78

15 RB 184 10 7 70,00

16 RB 196 10 7 70,00

17 RB 197 9 7 77,78

18 RB 198 7 4 57,14

19 RB 356 9 6 66,67

20 RB 381 9 6 66,67

21 RB 397 9 6 66,67

22 RB 414 9 7 77,78

23 RB 589 9 6 66,67

24 RB 602 8 6 75,00

25 RB 640 8 7 87,50

26 RB 883 8 6 75,00

27 RB 903 9 8 88,89

28 RB 978 12 9 75,00

29 RB 979 12 9 75,00

30 RB 991 8 6 75,00

31 RB 992 12 8 66,67

32 RB 993 8 6 75,00

33 RB 1168 8 7 87,50

34 RB 1169 8 7 87,50

35 RB 1230 9 8 88,89

36 RB 1232 9 8 88,89

37 RB 1287 9 8 88,89

38 RB 1289 9 7 77,78

40 RB 1399 10 5 50,00

41 RA 121 11 7 63,64

42 RB 231-2 11 6 54,55


46 GMR-RA 958 6 6 100,00

47 GMR-RA 959 8 3 37,50

48 GMR-RA 1051 9 6 66,67

49 GMR - RA 871 8 6 75,00

50 GMR-RA 1010 8 6 75,00

53 GMR - RA 768 8 6 75,00

54 GMR - RA 857 8 6 75,00

57 RB 73 10 4 40,00

61 RB 1725 6 6 100,00

62 GMR - RA 20 10 7 70,00

63 GMR - RA 81 10 8 80,00

64 GMR - RA 291 10 8 80,00

65 GMR - RA 292 10 8 80,00

66 RB 1456 6 5 83,33

68 RB 1655 10 8 80,00

69 RB 725 8 7 87,50

71 RB 807 9 8 88,89

73 RB 60 9 6 66,67

74 RB 1321 8 7 87,50

79 GMR - RA 265 10 8 80,00

80 GMR - RA 267 11 8 72,73

82 RB 828 9 8 88,89

83 RB 1690 10 8 80,00

84 RB 1296 12 8 66,67

85 RB 1291 9 8 88,89

88 GMR - RA 687 10 8 80,00

90 RB 1388 6 4 66,67

91 RB 1551 6 6 100,00

92 RB 1552 6 5 83,33

93 RB 1571 6 5 83,33

96 RB 1263 6 5 83,33

97 RB 672 6 5 83,33

98 RB 794 6 5 83,33

99 RB 796 8 6 75,00

103 RB 727 6 5 83,33

104 RB 188 10 8 80,00

105 RB 1458 6 6 100,00

106 GMRRA211 8 7 87,50

107 GMRRA249 8 6 75,00

108 GMRRA293 6 5 83,33

109 GMRRA389 8 6 75,00

110 GMRRA413 8 6 75,00

111 GMRRA416 8 6 75,00

112 GMRRA425 8 7 87,50

113 RB1106 6 5 83,33



114 RB1191 8 6 75,00

115 RB157 8 6 75,00

116 RB1709 8 6 75,00

118 RB330 9 7 77,78

120 RB755 8 6 75,00

Porcentaje Promedio Total 75,40

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

▪ Con la estrategia diseñada se identificaron para las 89 muestras de A. baumannii

diferentes genes de resistencia relacionados con sus mecanismos de resistencia y

la resistencia a antibióticos, correlacionados con la información fenotípica.

▪ Este modelo con su acercamiento teórico de resistencia a los antibióticos, luego de

los ajustes correspondientes según comparaciones, logra correlacionar los perfiles

de resistencia al menos para las clases y subclases de antibióticos comunes entre

los dos perfiles.

▪ El modelo permite extraer información genómica y fenotípica con facilidad para las

89 muestras de Acinetobacter baumannii aisladas en Colombia.

▪ El sistema permite la escalabilidad, adaptabilidad y la extrapolación si se desea

incluir más muestras o más organismos bajo los mismos lineamientos.

▪ Este modelo contribuye al conocimiento de los elementos involucrados en la

resistencia de diferentes cepas multirresistentes en Acinetobacter baumannii, lo

cual permitiría a través de los perfiles de resistencia genómicos realizar un sistema

de seguimiento y evaluación de la propagación de este microorganismo, y así

permitir desarrollar medidas para su control.

▪ Este modelo tiene el potencial para predecir con una buena confiabilidad la

resistencia a los antibióticos basado en el genoma completo para A. baumannii.

5.2 Recomendaciones

▪ El presente modelo teórico requiere una gran inversión en recursos, como el monetario

(para obtener los perfiles fenotípicos), en recurso humano y en tiempo. Aun así, valdría

la pena invertir más en estos recursos para ampliar la cantidad de muestras clases de

13

2

Título de la tesis o trabajo de investigación

antibiótico a comparar, la cantidad de muestras y la cantidad de especies (inicialmente

como el grupo ESKAPE)

▪ Integrar la identificación y tipificación de microrganismos como las del grupo ESKAPE,

como parte del pipeline del proyecto.

▪ Desarrollar y automatizar los pasos primordiales en bioinformática antes de aplicar el

modelo de predicción de resistencia, es decir, el análisis de calidad, ensamblaje y

anotación. Especialmente en el ensamblaje del genoma para que el sistema identifique

automáticamente los mejores ensamblajes teniendo en cuenta los diferentes

algoritmos y diferentes K-mers. Adicional al curso normal de eventos que se tienen

actualmente.

▪ Adicionar al modelo la identificación de los diferentes plásmidos e islas genómicas de

resistencia (ojalá del nivel que actualmente posee el servicio web “IS Finder”), para

mejorar aún más la predicción de la resistencia a antibióticos, además de permitir una

mejor vigilancia epidemiológica en las infecciones asociadas a la atención en salud.

▪ Basándose en la información que se tiene actualmente, más la adicción de un nuevo

desarrollo software puede ser posible generar también un perfil de virulencia.

▪ Un proyecto de software siempre debe estar en mejoramiento continuo, si este tiene la

suficiente atención y recursos, solo por dar un ejemplo sobre la visualización de la

comparación final, se puede mostrar con detalle cuales son los elementos genómicos

que influyen en el perfil, basado en que parámetros y que reglas.

▪ Finalmente, luego de una gran base teórica depurada, se puede crear un proyecto

nuevo para predecir la resistencia a los antibióticos apoyado en el aprendizaje de

máquina para que la base teórica y el perfil fenotípico sirvan de comparación y de

fuente de alimentación.

.

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Modelo bioinformático para predecir la resistencia a