Mljekarska mikrobiologija

I Opći dio

nastavni tekst

(radna verzija teksta)

Prof.dr. sc. Dubravka Samaržija

Sveučilište u Zagrebu Agronomski fakultet

2012.

2

Uvod

U ne tako davnoj prošlosti mljekarsku industriju činile su male mljekare

koje su otkupljivale mlijeko uglavnom od proizvoñača mlijeka koji su

držali mali broj životinja na farmama. Zato je ta proizvodnja, vrstama i

količinama mliječnih proizvoda bila ograničena, a proizvodi su se

uglavnom plasirali na lokalna tržišta. Današnju mljekarsku industriju, koja

se počela razvijati otprilike pedesetih godina 20. stoljeća, čine mljekare

velikog kapaciteta prerade. Proizvodnja mlijeka organizirana je najvećim

djelom na velikim farmama, od kojih neke imaju i više od tisuću muznih

grla. Zbog jake konkurencije koja danas vlada na globalnom tržištu,

mljekarska industrija gotovo svakodnevno plasira nove vrste mliječnih

proizvoda koji moraju udovoljavati najvišim standardima kvalitete. Te

značajne promjene koje su se dogodile u proizvodnji i preradi mlijeka,

uvjetovale su primjenu mljekarske mikrobiologije u svakom segmentu te

proizvodnje.

U tom smislu i nastavni tekst ove knjige dizajniran je na način koji

omogućuje studentima usvajanje specijalističkog znanja iz mljekarske

mikrobiologije potrebnog za uspješnu proizvodnju i kontrolu u

mljekarskoj industriji. Sadržajem ovaj tekst predstavlja i osnovu

mikrobioloških postulata koji vrijede za cijelu prehrambenu industriju.

Takoñer, on je i osnova za studente koji se žele dalje usavršavati na

području mikrobiologije općenito, ili imaju želju za znanstvenim

usavršavanjem na tom polju.

3

1. Osnove mikrobiologije i opća svojstva mikroorganizama

Mikrobiologija pripada grani biologije koja se zbog svoje

specifičnosti unutar te grane, razvila u samostalnu znanstvenu disciplinu.

Prema definiciji, mikrobiologija je nauka koja se bavi proučavanjem

mikroorganizama i njihovim aktivnostima.

Nove znanstvene spoznaje o mikroorganizmima, razvitak novih metoda,

prvenstveno molekularnih, te različiti ciljevi njihovog proučavanja

uvjetovali su daljnju podjelu mikrobiologije na različita specijalistička

polja ili subdiscipline. Neovisno da li se radi o bakteriologiji (proučava

bakterije), mikologiji (proučava gljive), protozoologiji (proučava

protozoae), filologiji (proučava alge), ili virologiji (proučava viruse),

zajedničko svima njima je proučavanje mikroorganizama na dvije

meñusobno povezane različite znanstvene i/ili stručne razine. Prvu razinu

čine fundamentalna istraživanja, koja se temelje na proučavanju strukture

mikrobne stanice, biokemijskim i fiziološkim reakcijama, te genetskim

karakteristikama pojedinačnih mikrobnih porodica, rodova, vrsta i sojeva.

Dok se na drugoj razini proučavanja u primijenjenoj mikrobiologiji

istražuje njihova povezanost s okolinom (sredinom) i ljudskom

aktivnošću. Unutar te druge razine proučavanja mikroorganizama, razvila

se i mljekarska mikrobiologija koja je dio šireg specijalističkog polja -

mikrobiologije hrane. Meñutim, niti jedna od specijalističkih

mikrobiologija, pa tako niti mljekarska ne djeluju izolirano, već zajedno s

fundamentalnom i svima ostalim primijenjenim mikrobiologijama čine

nedjeljivu dijalektičku cjelinu.

4

Mikroorganizmi su živi organizmi koji najvjerojatnije žive na gotovo

svim mjestima na Zemlji. Za većinu danas poznatih mikrobnih vrsta,

uvjeti koji pogoduju njihovom rastu i preživljavanju vrlo su slični

uvjetima u kojima čovjek prirodno živi. Zbog toga, u svakom smo

trenutku okruženi nebrojenim mikrobnim vrstama. Većina tih vrsta

potpuno je bezopasna za ljude, životinje i biljke s kojima one na odreñen

način žive u simbiotskom odnosu. Takoñer, bez odreñenih mikrobnih vrsta

koje nas okružuju, ne bi postojali niti brojni fermentirani prehrambeni

proizvodi (npr. jogurt, sir, kobasice). Ipak, neki od njih, kao što su npr.

Listeria ili Salmonella spp. mogu pod odreñenim okolnostima uzrokovati

bolest pa i smrtnost kod ljudi. Na sreću, razina mikrobiološkog znanja

kojom raspolažemo danas, omogućuje nam izbor najučinkovitijih metoda

kojima možemo te neželjene pojave spriječiti ili barem ublažiti.

Mikroorganizmi pripadaju skupinama bakterija, gljivica (kvasaca),

plijesni, protozoa, algi i virusa. Od tih skupina, direktno značenje za

proizvodnju, preradu i konzumaciju hrane jedino nemaju protozoe i alge.

1.1. Struktura i funkcija mikroorganizama

1.1.1. Bakterije

Bakterije su najmanji poznati samostalni jednostanični prokariotski

organizmi u prirodi. Prema svom osnovnom morfološkom obliku

5

pripadaju kokima (kuglasti oblik; grč. coccus-zrno), bacilima (oblik

štapića; lat. bacillus-štapić) ili spirilima (spirili ili vibrioni). (slika X)

Bojanje po Gram (metoda danskog biologa Christiana Grama) dijeli

ih na Gram- pozitivne i Gram- negativne bakterije. U identifikaciji

nepoznatih bakterija metoda bojanja po Gramu koristi se kao njezin prvi

korak. Za sam postupak bojanja koristi se slijedeće reagencije:i

kristalviolet, lugol, alkohol i safranin. Dodavanjem kristalvioleta (na

stakalce koje sadrži uzorak biološkog materijala) sve bakterije se boje

ljubičasto. Lugol koji se dodaje nakon kristalviolet bojila, fiksira boju

unutar stanične stjenke. Sve bakterije nakon dodavanja lugola i dalje

ostaju obojene ljubičaste. Nakon lugola, primarno bojilo se ispire

alkoholom. Primarno bojilo se neće isprati iz stanične stjenke Gram-

pozitivnih bakterija zbog gustog sloja peptidoglikana (50-90% stanične

stjenke). Suprotno, Gram-negativne bakterije čiji je sloj peptidoglukana

tanak (10% stanične stjenke postati će ponovno neobojene (slika X). Na

kraju postupka bojanja po Gramu, dodaje se safranin (kontrastno bojilo)

koji Gram-negativne bakterije boji u ružičastu ili crvenu boju.

6

Slika X: Bojanje bakterija po Gramu

Meñutim postoje i bakterije koje se ne mogu obojiti postupkom bojanja po

Gramu, poput na primjer spiroheta te se one svrstavaju u Gram-neosjetljive

bakterije. Takoñer, postoje i Gram-varijabilne vrste bakterija koje a koje u

različitim uvjetima rasta mogu pokazati osobine i gram-pozitivnih i gram-

negativnih bakterija.

Veličina bakterijske stanice izražava se u mikrometrima (µm; 1µm

= 0,001 milimetar). Koki su veličine izmeñu 0,4 i 1,5 µm, a bacili od 0,25-

1,0 µm širine i 0,5-6,0 µm dužine. Za koke i bacile karakteristična je

morfološka pojavnost u obliku pojedinačnih stanica, kratkih ili dugih

lanaca. Neke vrste koka pojavljuju se u obliku grozdastih nakupina

7

(Staphylococcus spp.), a neke tvore tetrakoke (Micrococcus spp.). Bacili

osim načina grupiranja, meñusobno se razlikuju i veličinom te oblikom

pojedinačne stanice (ravni, kratki, zakrivljeni štapić). Zavojite bakterije ili

spirili su u osnovi štapićaste bakterije jedanput ili više puta zavijene oko

svoje zamišljene osi. Mogu biti vibrioni (u obliku zareza) ili spirohete

(više zavoja). Oblik i način grupiranja bakterijskih stanica rod su

specifični.

L-oblik bakterije

U odreñenim okolnostima, kada su izložene konstantnim promijenjenim

uvjetima, bakterije se mogu transformirati u svoj L-oblik koji nema

staničnu stjenku.. Smatra se da je L-oblik, odgovor bakterije na stres zbog

kojeg im je onemogućena sinteza stanične stjenke, te im novi oblik stanice

omogućuje preživljavanje pod nepovoljnim uvjetima. Zbog toga, L-oblik

bakterije za razliku od svoje izvorne stanice iskazuje rezistentnost na

čimbenike koji su izazvali promjenu njenog prvotnog izgleda. Na primjer,

zna se da na L- oblik bakterije ne djeluje niti jedan poznati antibiotik.

Promjene u usporedbi s roditeljskom stanicom izražene su kroz značajnu

razliku u ekspresiji gena za morfološke i fiziološke funkcije stanice .

Takoñer, vjeruje se da je koegzistencija bakterija sa staničnom stjenkom i

L-oblika unutar heterogene bakterijske populacije prirodni fenomen koji

im omogućava razvitak vlastite strategije za izdržljivost i preživljavanje.

Meñutim, iako se zna se zna da je broj vrsta bakterija koje se u svom

8

prirodnom životnom ciklusu mogu transformirati u L- oblik velik, do

danas je opisano oko 50 vrsta.

L-oblik bakterije pokazuje znatan stupanj polimorfizma tako da se

pojavljuje u različitim veličinama i oblicima. Meñutim, većim dijelom

svog životnog ciklusa ona je izrazito sićušna stanica u promjeru veličine

0,01 mikrona (manja od virusa). Morfološki je kokoidnog oblika, ponekad

se stanice grupiraju te poprimaju izgled niske perli. Ponekada L- oblik

bakterija u laboratorijskim uvjetima može stvoriti tanki filamentozni

biofilm koji može biti dugačak i 60-70 mikrona. Biofilm je grañen od L-

oblika bakterije i zaštićen slojem proteina. Takoñer, iz nepoznatih razloga

L-oblik bakterije može prerasti u i veliku „stanicu“ (tijelo). Bakterije L-

oblika razmnožavaju se na različite načine koje uključuje pupanje,

filamentozni rast i binarnu fisiju. Neke vrste L-oblika poput Proteus spp.

mogu formirati veliko tijelo koje se replicira dijeljenjem. U drugim

okolnostima granula pupoljka s tijela bakterije se odvoji i izraste u malu

L-formu kolonije. Veličina i L- oblik omogućava im ulazak u bilo koju

eukariotsku stanicu i preživljavanje kroz vrlo dugi period bez da budu

prepoznate od stanica imunog sustava domaćina. Nakon što L- oblik

bakterije uspješno uñe u stanicu domaćina počinje koristiti stanične

nutrijente za svoje potrebe. Takoñer, ona je sposobna preuzeti i kontrolu

genetskog materijala stanice domaćina, te započinje tvorbu proteina

kojima zaštićuje svoju stanicu i tako dodatno povećava svoju sposobnost

preživljavanja. Izmeñu ostalog, zadnje studije L-oblika bakterija su na

primjeru E.coli potvrdile da odreñene bakterije mogu preživjeti i

sterilizaciju u autoklavu (>121° C) prelaskom u svoju L-formu. Općenito,

9

smatra se i da su neke kronične humane bolesti povezane s L-formom

bakterija.

Slika X: L –oblik Listeria monocytogenes

Bakterijska stanica-populacija

Zbog izuzetno male veličine pojedinačnih bakterijskih stanica, za njihovo

se proučavanje u praksi uvijek koristi čista kultura koja sadrži tisuće,

milijune pa čak i milijarde bakterijskih stanica iste vrste. Drugim riječima

proučava se populacija, a ne pojedinačna bakterijska stanica. Jednako

tako, kada se u odreñenom prehrambenom proizvodu, ili proizvodnoj

sredini želi ustanoviti prisutan broj bakterija takoñer se radi isključivo o

mikrobnoj populaciji . Naime, broj bakterija prosuñuje se na temelju

broja formiranih kolonija poraslih na čvrstom hranilištu. Dogovorno jedna

10

kolonija predstavlja jednu bakteriju neovisno koliko ih pojedinačna

kolonija zapravo stvarno sadrži. Te kolonije, ovisno o vrsti proizvoda,

predstavljaju broj prisutnih bakterija u jednom mililitru ili gra mu. U

internacionalnoj literaturi i praksi, što je prihvatila i Hrvatska, za

izražavanje broja bakterija u nekom mediju koristi se broj formiranih

kolonija na čvrstom hranilištu, a označava se oznakom CFU/g ili mL

(eng.Colony Forming Units).

Slika: bakterijske kolonije na različitim razrijeñenjima

1.1.1.1. Primarna struktura

Stanica svih bakterijskih vrsta sastoji se od stanične stjenke,

stanične ili plazmatske membrane, citoplazme, jednog kromosoma i

11

ribosoma. Bakterijski geni koji kontroliraju stanični razvitak i metaboličke

aktivnosti organizirani su na dva načina. Smješteni su na dugoj molekuli

DNK, bakterijskom kromosomu i/ili na maloj neesencijalnoj jedinici

DNK koja autonomno replicira plazmide. Prosječno kromosom sadrži oko

1000 gena. Plazmidi su mali cirkularni prsteni DNK koji unutar

bakterijske stanice egzistiraju neovisno o kromosomalnoj DNK. Oni su

nosioci 5-10 gena koji nisu esencijalni za preživljavanje bakterijske

stanice. Kada se bakterijska stanica dijeli, svaka stanica kćer dobije kopiju

kromosomalne DNK s kopijom ili kopijama svih plazmida koji su prisutni

u roditeljskoj stanici. Budući se plazmid(i) replicira neovisno o

kromosomu, bilo koja mutacija, ili jednostavno spontana reakcija

uzrokovana promjenom uvjeta medija može uzrokovati da stanice kćeri ne

dobiju plazmid(e). Tako one izgube funkciju koja je kodirana njihovim

genima. Gubitak plazmida kod bakterija mliječne kiseline (BMK) koji

kodiraju na primjer tvorbu mliječne kiseline to znači izostanak

fermentacije u proizvodnji fermentiranih mliječnih proizvoda. Indirektno,

gubitak proizvodno značajne bakterijske funkcije, za mljekarsku industriju

predstavlja i značajni financijski gubitak.

U nekim slučajevima bakterijski se plazmidi mogu prenositi i na

druge vrste bakterija. Opasnost od te bakterijske sposobnosti posebice je

značajna kada je ona vezana za patogene bakterije. Zbog toga, što se

njihova virulentnost tako može prenositi i na prirodno za čovjeka

neškodljive bakterije.

Kromosom i plazmid(i) zajedno čine bakterijski genom ili genetski

materijal bakterije koji se nasljeñuje. (SLIKA X) Ribosomi su mala

zaobljena tjelešca izgrañena od proteina i RNK. Oni su odgovorni za

12

sintezu proteina u bakterijskoj stanici, a poznati su i kao 70s ribosomi

(Svedbergova jedinica; mjera relativnog omjera sedimentacije čestica koja

nastaje centrifugiranjem pri velikoj brzini). Mitohondriji i kloroplasti

eukariotslih organizama sadrže ssrRNK koja je blisko srodna bakteiskoj

ribosomalnoj RNK , što ukazuje da su se te organele eukariti naslijedili od

prokariota. U praksi, ribosomiupravo su tjelešca koja su odgovorna za

intenzivnu reakciju bojanja bakterijske stanice osnovnim bojama kao što je

na primjer metilensko plavilo.

Slika X : Bakterijski genom

1.1.1.2. Stanična stjenka

Većina bakterija ima čvrstu staničnu stjenku koja štiti stanični

protoplast od mehaničkog oštećenja, osmotskog puknuća ili lize stanice.

Struktura stanične stjenke koja ima istovremenu čvrstoću i sposobnost

velike rastezljivosti izgrañena je od mureina, spoja koji postoji jedino u

bakterijskoj staničnoj stjenci i nigdje drugdje u prirodi. Murein je

13

jedinstvena vrsta peptidoglikana, polimera koji je sastavljen od dva šećera

N-acetil glukozamina (NAG) i N-acetil mureina (NAM) meñusobno

povezanih kratkim lancima aminokiselina. Peptidoglikan u staničnoj

stjenci imaju Gram- pozitivne i Gram-negativne bakterije.

Stanična stjenka Gram-pozitivnih bakterija (koje se boje plavo bojanjem

po Gramu) sastoji se od nekoliko slojeva peptidoglikana koji su povezani

teikoičnom kiselinom (polimer glicerola i ribitola povezanan fosfatnim

skupinama). Teikoična je kiselina s mureinskom kiselinom povezana

kovalentnom vezom i nalazi se u staničnoj stjenci jedino Gram-pozitivnih

bakterija. Njena uloga je održavanje čvrstoće i negativnog naboja stanične

stjenke.

Stanična stjenka Gram-negativnih bakterija (koje se boje crveno

bojanjem po Gramu) sadrži samo jedan sloj peptidoglikana. Meñutim, za

razliku od Gram-pozitivnih bakterija, peptidoglikan Gram-negativnih

bakterija okružen je membranskom strukturom koja se naziva vanjska

membrana ili vanjska opna. Ona se sastoji od lipida, proteina i ne

promjenjivog lipopolisaharida (LPS) ili endotoksina. LPS je toksičan za

ljude i životinje. Takoñer, zbog LPS vanjska membrana za Gram-

negativne bakterije prva je njena permeabilna barijera.

Molekula LPS sastoji se od hidrofobne regije - lipida A koja je čvrsto

povezana sa hidrofilnom linearnom polisaharidnom regijom sastavljenom

od ne varijabilnog (temeljnog) polisaharida i O-specifičnog polisaharida.

Lipid A predstavlja konzerviranu regiju, a funkcija mu je zaštita stanice od

lijekova, kemikalija i drugih štetnih agensa. O-polisaharid ili antigen je za

bakterijsku stanicu species specifičan čak i na razini soja unutar iste vrste.

14

Meñutim, bakterijska stanica pod odreñenim okolnostima može izmijeniti

strukturu O-polisaharid. Na primjer, sposobnost preureñenja strukture O-

antigena, patogene bakterije koriste za zaštitu svoje stanice od djelovanja

imunološkog sustava domaćina.

Peptidoglikan molekule se mogu razgraditi enzimom lizozimom koji

je prisutan u serumu, tkivu, te sekretornim i fagocitoznim eukariotskim

stanicama . Funkcija lizozoma je liza bakterijske stanice kao konstitutivne

obrane organizma od patogenih bakterija. Neke Gram-pozitivne bakterije

izuzetno su osjetljive prema lizozimu. Na djelovanje lizozima znatno su

manje osjetljive Gram- negativne bakterije budući je njihov sloj

peptidoglikana zaštićen periplazmatskim prostorom i vanjskom

membranom. Lizozim izaziva lizu stanice cijepanjem 1,4 veze izmeñu N-

acetil glukozamina i N-acetil mureina. Na sličan način na patogene bakterije

djeluju i antibiotici. Mnogi antibiotici, uključujući i penicilin, djeluju

baktericidno upravo tako što priječe sintezu proteoglikanskog sloja stanične

stijenke (inhibiraju završnu reakciju poprečnog povezivanja

peptidoglikanskih niti). Istovremeno, zbog odsustva mureina u stjenci

eukariotskim stanica ne štete ljudskim i životinjskim stanicama.

U periplazmatskom prostoru koji se u bakterijskoj stanici nalazi

izmeñu peptidoglikanskog sloja, vanjske membrane i citoplazmatske

membrane smješteni su bakterijski digestivni enzimi i proteinski toksini.

Gram-pozitivne bakterije za razliku od Gram-negativnih bakterija imaju

zanemarivo mali periplazmatski prostor, te se enzimi i toksini iz stanice

izlučuju u okoliš. Suprotno, ti se spojevi kod Gram-negativnih bakterija iz

stanice oslobañaju tek njezinom razgradnjom. Funkcije stanične stjenke

bakterija su slijedeće:

15

- daje oblik stanici

- štiti stanicu od vanjskih uvjeta

- osigurava životne aktivnosti stanice

- najznačajnije je mjesto za djelovanje antibiotika

- sadrži receptore za prihvaćanje stanice za površinu

- sadrži receptori za lijekove, kemikalije, bakteriofage

- mjesto je virulentnosti stanice

- sadrži spojeve za utvrñivanje imunološke različitost izmeñu vrsta i

sojeva unutar iste vrste

- svojom strukturalnom grañom dijeli bakterije u dvije osnovne

skupine: Gram-pozitivne i Gram- negativne bakterije

Slika X . Graña stanične stjenke: A- Gram- negativne, B- Gram-pozitivne

16

1.1.1.3. Stanična membrana

Stanična ili citoplazmatska membrana je najdinamičnija struktura

prokariotske stanice koja je izgrañena od približno 40% fosfolipida i 60%

proteina. Njena je glavna funkcija selektivna regulacija prolaska supstanci

u stanicu i iz stanice. Stanična membrana u stanicu propušta prolaz vode i

za stanicu neškodljive molekule do veličine 100 Da (dalton; atomska

jedinica mase = 1/12 mase atoma ugljika 12C). U stanicu, stanična

membrana bakterija ne propušta veće molekule niti bilo koju škodljivu

supstancu. Neškodljive veće molekule ili druge supstance u stanicu

bakterije unose specijalnim transportnim procesima i/ili transportnim

sustavima smještenim na staničnoj membrani.

Prokariotska bakterijska stanica nema intracelularne organele zbog toga,

njihovu je funkciju preuzela stanična membrana. Posljedično tome,

membrana ima različite funkcije u procesima stvaranju energije i

biosintezi neophodnih za život bakterijske stanice.. Takoñer, stanična

membrana je mjesto oksidativne fosforilacije i fotofosforilacije koje su

analogne funkciji mitohondrija i kloroplasta u eukariotskim stanicama.

Citoplazmatska membrana sadrži i enzime koji su uključeni u mnoge

metaboličke procese poput sinteze stanične stjenke, sinteze membrane,

DNK replikacije, formiranja septuma tijekom dijeljenja stanice, CO2

fiksacije i oksidacije amonijaka.

Izmeñu brojnih i različitih funkcija koje ima citoplazmatska membrana

bakterijske stanice, njene dominantne funkcije su slijedeće:

17

- osmotske ili permeabilne barijere

- mjesto je transportnog sustava za specifične otopine nutrienata i

iona

- ima funkciju stvaranja energije uključivo respiratorne i fotosintetske

transportne sustave, uspostave proton pokretačke sile i ATP sinteze

ATPase.

- sinteze membranskih lipida uključivo i lipopolisaharida u staničnoj

stjenci G-negativnih bakterija

- sinteze mureina (peptidoglikan - stanična stjenka)

- tvorbe i sekrecija ekstra-citoplazmatskih proteina

- kordinacije DNK replikacije i procesa formiranja septuma tijekom

dijeljenja stanice

- mjesto je za specifični enzimatski sustav

- mjesto je za stvaranje flagela i pila

1.1.1.4. Citoplazma

Bakterijska citoplazma je gelu slična vodena otopina u koju su uklopljene

tri grupe makromolekula: proteini (enzimi), mRNK,i tRNK; male

molekule koje služe za: energetski izvor, prekursore makromolekula,

metaboliti, vitamini i slično; različiti anorganski ioni i kofaktori. Dok su

primarni strukturni elementi bakterijske citoplazme nukleotid (DNA) i

ribosomi, te moguće neke vrste inkluzija. Bakterijski kromosom odreñuje

18

sva svojstva i funkcije bakterije. Tijekom staničnog rasta i razmnožavanja,

prokariotski kromosom se replicira na način da daje istu kopiju molekule

za stvaranje stanica kćeri. Replikacija i odvajanje DNK koordinirana je

citoplazmatskom membranom i različitim proteinima smještenim u

citoplazmi.

1.1.1.5. Endospore

Bakterijsku strukturu ponekad čini vidljiva tvorba latentne stanice koja se

naziva endospora. Sposobnost stvaranja spora unutar vlastite stanice od

svih poznatih bakterija imaju jedino bakterijske vrste rodova Bacillus i

Clostridium. Zbog načina kako te bakterijske vrste stvaraju spore nazivaju

se endospore, premda one samostalno egzistiraju u okolišu. Nakon što je

spora unutar stanice majke formirana dogaña se liza stanice, a spora izlazi

u okoliš. U latentnom stanju spora ostaje u okolišu do nastanka povoljnih

uvjeta za rast vegetativne stanice. Meñutim, da bi se iz spore ponovno

razvila vegetativna stanica dodatno je potreban odreñeni kemijski ili

fizikalni stimulans od kojih je, vjerojatno, najvažniji temperaturni šok. To

saznanje posebno je značajno u mljekarskoj industriji koja u proizvodnji

svojih proizvoda gotovo uvijek koristi temperature izmeñu 60 i 140°C

(pasterizacija, sterilizacija).

Strukturalno spora je od unutrašnjosti prema vanjskom dijelu grañena od

slijedeći slojeva:

19

- unutrašnjosti koju čini citoplazma s bakterijskim genomom

- debele kore (korteks) koja se sastoji od peptidoglikana i visoke

koncentracije Ca-dipikolinata (inertne kiseline koja se u prirodi nalazi

jedino u bakterijskim endosporama)

- unutrašnje stjenke izgrañene od proteina keratinske vrste

- vanjske stjenke izgrañene od proteina, ugljikohidrata i lipida

Slika X: strukturna graña bakterijske endospore

Zbog svoje specifične grañe, fizioloških i biokemijskih karakteristika, te

visoke koncentracije Ca-dipikolinata, endospore su znatno rezistentnije na:

temperaturu, kemikalije uključujući i dezinficijense, zamrzavanje,

ekstremne pH vrijednosti sredine, dehidraciju, niski aktivitet vode,

isušivanje i druge nepovoljne uvjete sredine u usporedbi s vegetativnom

stanicom. Te znanstveno utvrñene činjenice, mljekarska industrija koristi

za postavljanje tehnološko-sanitarnih protokola i standarda u proizvodnji i

kontroli kvalitete svojih proizvoda. Za prehrambenu industriju općenito,

značenje u smislu kvarenja i/ili uzročnika zdravstvene neispravnosti

proizvoda podjednako su značajne Clostridium i Bacillus spp.

20

1.1.1. 6. Ekstacelularne strukture

1. 1.1.6.1. Kapsula i glikokolaks

Za razliku od sposobnost tvorbe endospora, velika većina

bakterijskih vrsta ima sposobnost stvaranja materijala koji se izlučuje

izvan bakterijske stanice. Zbog te sposobnosti bakterijske stanica mogu

formirati još jedanu estracelularni sloj (opnu) oko svoje stanične stjenke

koji nije strukturni element stanične stjenke. On može biti čvrsto

priljubljen uz staničnu stjenku te se tada naziva – kapsula. U slučajevima

kada ta ektracelularna struktura samo difuzno okružuje bakterijsku stanicu

poznata je pod imenom sluzavi omotač ili glikokoliks . Prema svojoj

kemijskoj strukturi ekstacelularna struktura bakterijske stanice je

polisaharidnog ili lipopeptidnog sastava zavisno o raspoloživom izvoru

ugljika u mediju (ugljikohidrati, aminokiseline). Uloga te strukture

prvenstveno je zaštita bakterijske stanice od isušivanja, infekcije

bakteriofaga (bakterijski virus), djelovanja antibiotika, dezinficijensa i

drugih sličnih štetnih agensa koji stanicu mogu oštetiti ili uništiti. Druga

uloga ekstracelularne strukture je funkcionalna u smislu sposobnosti

prihvaćanja bakterije za odreñenu površinu. Nakon adhezije na čvrstu

površinu bakterije mogu formirati biofilm.

Ekstracelularnu strukturu bakterijske stanice čine strukturalno različite

grupe metabolita koji im omogućavaju adheziju na čvrstu površinu na kojoj

formiraju biofilm.

21

Biofilm može formirati samo jedna bakterijska vrsta, ali češće ga

istovremeno formira više bakterijskih vrsta. Zbog toga, biofilm se općenito

definira kao kompleksna strukturno heterogena, genetski divergentna

zajednica mikroorganizama koja egzistira na čvrstoj površini u formi

ekstracelularnog matriksa sastavljenog od polimeričnih spojeva. Priroda

ekstracelularnog trodimenzionalnog matriksa, omjera razmnožavanja i

interakcije izmeñu stanica unutar biofilma odreñena je raspoloživim

uvjetima rasta, medijem i supstratom.

Fiziološki blisko povezane stanice unutar biofilma, pokazuju značajno

različita svojstva i promjene u bakterijskoj fiziologiji u usporedbi sa

slobodnom bakterijskom stanicom. Zbog nastalih promjena, zajednica

bakterija unutar biofilma pokazuje znatniju otpornost na okolišni stres, poput

djelovanja antibakterijskih sredstava ili rezistentnosti na većinu antibiotika. .

Značajna je i činjenica da su bakterijske vrste poput na primjer, B.cereus

(fakultativno anaerobne bakterije) i P.fluorescens (aerobna bakterija)

takoñer sposobne zajedno formirati biofilm. U formiranom binarnom

biofilmu te dvije bakterijske vrste preživljavanje bakterije P.fluorescens

nakon izlaganja na primjer klor dioksidu (ClO2) značajno je veće u

prisutnosti vrste B.cereus.. Osim toga, biofilm ima funkciju izvora slobodnih

bakterijskih stanica različitih karakteristika u odnosu na slobodne bakterijske

stanice i stanice iste vrste povezane u biofilm. Naime, bakterijske stanice

unutar biofilma razvijaju veću biomasu stanica i imaju mogućnost

povremenog izdvajanja iz stvorenog biofilma. Iz tih razloga, biofilm koji se

može formirati na svim površinama mljekarske opreme, predstavlja

tvrdokoran i dugotrajan izvor permanentne kontaminacije mliječnih

proizvoda. U mljekarskoj industriji, ta skupina bakterija je i uzročnikom

kvarenja proizvoda koja se manifestira pojavom sluzavosti na njegovoj

22

površini. Dobar primjer, česta je pojava sluzavosti površine svježeg sira

zbog rasta odreñenih vrsta Gram-negativnih bakterija koje imaju sposobnost

stvaranja sluzavog omotača izvan svoje stanične stjenke. Suprotno, bakterije

mliječne kiseline koje imaju istu sposobnost koriste se za poboljšanje

teksture fermentiranih mlijeka.

Slika X kapsula ili glikokolaks

Slika X: biofilm B.cereus

1. 1.1.6.2. Flagele i pili

23

Bakterijske flagele su izgrañene od nekoliko vrsta proteina od kojih

je najznačajniji flagelin (jedinstveni protein) i kompleksne su filamentozne

(nitaste) strukture. Za pokretanje približno ih koristi polovica bacila, te

sve bakterije spiralnog i zakrivljenog oblika. Suprotno, flagele za

pokretanje koristi svega nekoliko koka što ukazuje da su se koki adaptirali

na suho okruženje i tako izgubili potrebu za hidrodinamičku strukturu

stanice.

Flagele na bakterijskoj stanici mogu biti različito rasporeñene, ali načelno

razlikujemo dva osnovna oblika flagela: polarne (jedna ili više flagela koje

izbijaju iz jednog ili oba pola stanice) i peritrihalne ( flagele koje lateralno

okružuju cijelu stanicu). Raspored flagela genetski je odreñen, stoga se to

svojstvo ponekad koristi za karakterizaciju ili razlikovanje bakterijskih

vrsta. Na primjer izmeñu Gram-negativnih bakterija rod Pseudomonas ima

polarne flagele, te se može razlikovati od crijevnih bakterija koje imaju

peritrihalni oblik flagela. Osim funkcije kretanja flagele bakterijama služe

kao senzori, odnosno imaju sposobnost odgovora na odreñeni stimulans iz

okoliša. Tako se na primjer bakterije počinju kretati prema za njih

korisnom nutrientu, odnosno udaljavaju se od štetnih supstanci u okolišu.

Ostali „taktički“ odgovori bakterijskih flagela na okolišne uvjete su

odgovor na svjetlost, kisik i zračenje. Funkcija odgovora na nepovoljne

uvjete okoliša kojima raspolažu flagele još je jedan dokaz koji objašnjava

sposobnost preživljavanja bakterija u različitim ekološkim uvjetima.

Složenost grañe i funkcije bakterijskih flagela potvrñuje i činjenica da je

otprilike 50 gena potrebno za njihovu sintezu i definiranje funkcionalnih

svojstva.

24

Pili ili fimbrije su kratke, kosi slične strukture koje se nalaze na površini

bakterijske stanice. Uobičajene su za Gram-negativne bakterije, ali ih

mogu imati i neke od Gram-pozitivnih bakterija. Pili omogućuju

bakterijama prihvaćanje za površine, supstrate i druge stanice ili tkiva u

prirodi. Posebno značenje za humani organizam imaju pili patogenih

bakterija koje tim bakterijama omogućavaju dobru kolonizaciju tkiva i/ili

rezistentnost na djelovanje fagocita bijelih krvnih stanica. Specijalizirani

pili (F ili seksualni pili) služe bakterijama za stabiliziranje procesa

konjugacije bakterijskih stanica. Poput flagela i pili su grañeni od proteina.

1.1.2. Gljivice

Gljivice se svrstavaju u odreñene skupine na osnovu njihovog

životnog ciklusa, strukture i načina razmnožavanja. Mikroskopske gljivice

su kvasci i plijesni. Od bakterija, one se razlikuju veličinom, strukturom,

staničnom organizacijom i načinom razmnožavanja. Kvasci se najčešće

pojavljuju kao pojedinačne stanice, a plijesni dolaze u obliku velikih

nakupina razgrananih stanica –hifa. U pravilu, kvasci tvore kolonije glatke

površine, koje su karakteristične i za veliki broj bakterijskih vrsta. Dok

plijesni, tvore pahuljaste ili paučinaste makroskopski vidljive kolonije.

Prosječna veličina stanice kvasaca varira od 5-8 µm do više od 100 µm, a

stanice plijesni je

25

10 x 40µm. Za prehrambenu industriju, praktično značenje imaju slijedeće

skupine gljivica: Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes i

Deuromycetes.

Za mikroskopske gljivice karakteristično je istovremeno kvarenje

odreñenih vrsta hrane, dok se neke vrste unutar te iste skupine koriste u

proizvodnji različitih prehrambenih proizvoda. Tako je proizvodnja kefira

nezamisliva bez korištenja mnogih vrsta kvasaca kao što su npr.

Kluyveromyces marxianus var. lactis, Saccharomyces cerevisiae, Candida

maris. Njihova prisutnost u svakom drugom fermentiranom mlijeku

smatra se ozbiljnom pogreškom.

1.1.2.1. Plijesni

Termin plijesni koristi se za bilo koje filamentozne, višestanične

gljivice koje su industrijski značajne za fermentaciju hrane, industrijsku

fermentaciju, procese biorazgradnje supstrata, ili su uzročnici kvarenja

prehrambenih proizvoda. Zbog toga, one i nemaju signifikantnu

taksonomsku identifikaciju. Neke od tih plijesni pripadaju skupini

Zygomycetes, neke skupini onih Deuromycetes plijesni koja se ne

razmnožavaju spolnim načinom, a neke su vrste pripadnici Ascomycetes

skupine. Karakterizira ih rast u obliku isprepletene nakupine koja se brzo

širi, te može za 2-3 dana prekriti površinu od nekoliko centimetara.

Izmeñu tih plijesni, neke su posebno interesantne mikrobiolozima zbog

jedinstvenih bioloških svojstava ili njihove ekonomske važnosti.

26

1.1.3. Virusi

Za prehrambenu industriju, virusi su interesantni, jer se prenose i

hranom, služe za identifikaciju patogenih bakterija, te mogu uzrokovati

pogreške mliječne fermentacije. Identifikacija virusa uključuje kulturu

tkiva ili staničnu kulturu, te elektronsku mikroskopiju. U svijetu, većina

laboratorija prehrambene industrije koristiti taj način identifikacije virusa

kao rutinsku metodu u kontroli hrane.

2. Rast mikroorganizama i mikrobne populacije

Većina studija rasta mikroorganizama temelji se na rastu

populacije, iz razloga izuzetno male veličine pojedinačne mikrobne

stanice. Meñutim, mikrobna populacija ovisna je o rastu pojedinačne

stanice, te je korisno razlikovati rast jedne stanice od rasta njene

populacije. Rast jedne stanice definiran je povećanjem staničnih sastojaka

i strukture stanice. Posljedica je povećanje veličine i težine stanice, nakon

čega obično slijedi njeno razmnožavanje. Omjer povećanja stanice u

vremenu je gotovo linearan. Dok rast populacije, s druge strane znači

povećanje broja stanica, što je posljedice rasta i razmnožavanja svake

pojedinačne mikrobne stanice. Za razliku od staničnog rasta koji je

linearan, rast mikrobne populacije je eksponencijalan ili logaritamski.

Omjer eksponencijalnog rasta u vremenu izražava se kao generacijsko

27

vrijeme koje označava vrijeme potrebno da se populacija udvostruči.

Zbog činjenice da su u prirodnoj populaciji pojedinačne stanice u

različitim fazama svoga životnog ciklusa, te da se sve stanice istovremeno

ne dijele, često se umjesto termina generacijsko vrijeme koristi i termin

prosječno generacijsko vrijeme. Generacijsko vrijeme izmeñu različitih

mikrobnih vrsta varira izmeñu svega nekoliko minuta do više sati.

Najkraće poznato generacijsko vrijeme od približno 10 minuta, utvrñeno je

za bakteriju Clostridium perfingens. Za većinu ostalih bakterijskih vrsta,

generacijsko vrijeme je izmeñu 30. i 60. minuta. Ono je za svaku

mikrobnu vrstu u optimalnim uvjetima rasta (nutrijenti, pH, redoks

potencijal, aktivitet vode) manje ili više konstantno. Meñutim, kada se bilo

koji od čimbenika mikrobnog rasta promijeni u odnosu na optimalno

potrebnu vrijednost, generacijsko vrijeme se povećava. Za Escerichia coli

čije je generacijsko vrijeme 20 minuta, promjenom jedino temperature

sredine s 37°C (optimum)na 20°C, znači povećanje generacijskog vremena

na više od 40 minuta.

Zbog eksponencijalnog ili logaritamskog rasta jednostaničnih

mikroorganizama koji se razmnožavaju binarno, njihov broj u populaciji,

vrlo često, je toliki da ga je teško izraziti. Najjednostavniji, a ujedno i

najčešći način interpretacije mikrobnog broja u populaciji je logaratamski

po bazi 10 (log10). Tako je ekvivalent broja mikroorganizama od 106 - 1

000000, 108 - 100 000000, a od 6,5 x 103- 6500. Takoñer, za izražavanje

mikrobnog broja u populaciji koristi se logaritam po bazi 2 (log 2) za opis

karakteristika udvostručenja broja stanica koje se binarno dijele, te

prirodni logaritam (log e) za dijeljenje stanica populacije u različitom

vremenu. Meñutim, krivulja rast mikrobne populacija u tekućem mediju

28

(SLIKA) odreñena je vremenom, a ne ukupnim brojem koji uključuje žive

i mrtve mikrobne stanice. Krivulja rasta mikrobne populacije u stvari

pokazuje četiri faza njezina rasta u tekućem mediju: lag faza, log ili

eksponencijalna faza, stacionarna faza i faza odumiranja ili smrti.

Lag faza

Lag faza označava vrijeme koje je potrebno za početak rasta

mikrobne populacije u novom tekućem mediju. U samom početku, kada se

mikrobna populacija inokulira u svježi medij, rast obično ne započinje

odmah već nakon odreñenog vremena. Vremensko trajanja lag faze

odreñuju uvjeti pod kojima je organizam bio kultiviran prije inokulacije,

broju organizama, te stupnjem optimalnih uvjeta u novom mediju za

mikrobni rast. Lag faza trajati će duže vrijeme kada je mikrobna

populacija u novi medij inokulirana iz stacionarne faze rasta. Ona će biti

duža i slučajevima kada su stanice u populaciji iz bilo kojeg razloga

oštećene (temperatura, radijacija, kemikalije), ili ako je ona iz bogatog

premještena u nutrijentima siromašan medij. Suprotno, lag faza može i

potpuno izostati, kada se u novi medij identičan starom, inokulira

mikrobna populacija koja je potjecala iz svoje eksponencijalne faze rasta.

Log ili eksponencijalna faza

Log ili eksponencijalna faza rasta je ona u kojoj se mikrobna

populacija udvostručuje. U bogatom mediju koji sadrži sve potrebne

sastojke za rast odreñene mikrobne populacije stvara se enormno veliki

broj stanica, a dužina log faza je vrlo kratka. Suprotno, ako u mediju

nedostaje samo jedan od esencijalnih sastojaka koji mikroorganizam sam

29

ne može sintetizirati, omjer rasta mikrobne populacije je značajno

usporen.

Stacionarna faza

Stacionarna faza rasta slijedi nakon eksponencijalne, a gustoća

mikrobne populacije dostiže svoj maksimum. Maksimalna gustoća, nakon

koje populacija prestaje rasti, odreñena je jednim ili kombinacijom

različitih čimbenika. Vrsta mikroorganizma i njegova sposobnost

konvertiranja sastojaka medija u svoju staničnu masu uz nutritivni sastav

medija, pH i temperaturu, smatraju se najodgovornijima za omjer gustoće

mikrobne populacije. U vrijeme stacionarne faze bakterije Bacillus i

Clostridium spp. stvaraju spore. Vegetativne stanice svih bakterijskih

vrsta u ovoj fazi stvaraju vidljive kolonije na čvrstom hranilištu.

Faza odumiranja

U fazi odumiranja nastupa postupna smrt stanica, a mikrobna se

populacija eksponencijalno smanjuje. Smrt mikrobne stanice unutar

populacije dogaña se zbog nedostatka raspoloživih nutrijenata u mediju,

te je stanica prinuñena trošiti vlastite energetske rezerve do svog

iscrpljenja. Takoñer, kao posljedice mikrobnog metabolizma mijenja se

pH i akumuliraju toksični produkti koji dodatno uzrokuju bržu smrt

stanice.

30

Slika X Rast bakterijske populacije

1. 2. 1. Rast micelijskih gljivica

Rast micelijskih gljivica, koje su predmetom interesa za prehrambenu

industriju, značajno se razlikuje od rata bakterija. U tom smislu, za

proučavanju njihovog rasta ne koristi se krivulja koja vrijedi za populaciju

jednostaničnih mikrobnih organizama. Rast te skupine mikroorganizama

karakteriziran je povećanjem: dužine i volumena hife i brojem hifa koje se

granaju. Rast u mediju započinje iz spore ili fragmenta hife, zatim se

povećava dužina i promjer hife, te raste broj novostvorenih razgrananih

hifa i rast (kolonija) postaje vidljiv. Neke vrste plijesni kao što su npr.

Rhizopus spp. rastu tako dugo dok ima prostora na za njih pogodnom

supstratu. Što znači da je veličina njihovih kolonija jedino ograničena

veličinom raspoloživog supstrata. Meñutim, neke druge vrste plijesni, pod

31

istim uvjetima tvoriti će kolonije samo do odreñene veličine, neovisno o

veličini raspoloživog supstrata. Ovoj drugoj vrsti plijesni, pripada i

Penicillium spp. čija je veličina kolonije odreñena razinom stvorenih

toksičkih supstanci u supstratu koje zaustavljaju daljnji rast hifa.

2. Rast mikroorganizama u hrani

Hrana se prema sastavu i svojstvima u većini slučajeva značajno razlikuje

od idealnog laboratorijski pripremljenog mikrobnog hranilišta. Usprkos

tome, bakterije i jednostanični kvasci u hrani zadržavaju sličnu krivulju

rasta kao što je imaju u tekućem laboratorijski pripremljenom mediju.

Odnosno, jasno se razlikuju lag, log, stacionarnu i faza odumiranja

tijekom njihovog rasta u hrani. Ista krivulja rasta, tipična je i za mikrobnu

kulturu koja se koristi za proizvodnju fermentirane hrane. Od vanjskih

čimbenika, temperatura za rast mikroorganizama u hrani ima posebno

značajan utjecaj. Što se temperatura približava minimalno potrebnoj

temperaturi rasta pojedinog mikroorganizam, ne samo da se smanjuje

omjer rasta, već se i produžuje lag faza. Značenje te prirodne zakonitosti,

prehrambena industrija koristi u kontroli rasta različitih mikrobnih skupina

u hrani. Naime, pohranom hrane na niskim temperaturama (-1 do 5°C)

smanjuje se omjer rasta mikroorganizmima uzročnicima kvarenja, a

vrijeme kada se populacija u hrani ne povećava se produžuje.

2.1. Čimbenici rasta

32

2.1.1. Temperatura

Mikroorganizmi kao skupina, sposobni su aktivno rasti na

temperaturama od -150°C do + 250°C. Unutar skupine, svaka

pojedinačna vrsta ima meñutim ograničeni temperaturni raspon

rasta. Temperaturni raspon odreñen je negativnim utjecajem kojeg

temperatura ima na membranu i stanične enzime pojedinačne mikrobne

vrste. Omjer rasta i utjecaja temperature grafički se zorno može prikazati

na primjeru E.coli (SLIKA 6.1. str.55). Od točke A do točke B, u prvom

djelu grafa, bakterijski rast povećava se u omjeru koji je sličan omjeru

enzimatski kataliziranih reakcija. Tako se omjer mikrobnog rasta gotovo

udvostručuje za svakih 10°C povećanja temperature okoliša. Kada je

dosegnuta točka B, omjer rasta je najveći, nakon toga rast se relativno brzo

smanjuje, a u točki C on potpuno prestaje. Temperaturni raspon rasta za

E.coli je: minimum 8 °C; optimum 37°C; maksimum 47°C.

33

U odnosu na temperaturni raspon mikrobnih vrsta, krivulja rasta,

neovisno o minimalnim, optimalnim i maksimalnim temperaturama je

ista. Slovo "A" na krivulji uvijek označava onu temperaturu ispod koje

više nema mikrobnog rasta. Na temperaturi ispod minimalne, mijenjaju se

34

svojstva mikrobne membrane i zbog toga stanica više ne može

transportirati hranu iz medija. Slovo "B" označava optimalnu temperaturu,

odnosno temperaturu na kojoj organizam najbrže raste. Najvišu

temperaturu iznad koje organizam više ne može rasti označava slovo "C".

Iznad te temperature mikrobni se enzimi denaturiraju, što zaustavlja

katalizu esencijalnih staničnih reakcija. Te temperature, takoñer, oštećuju

proteine i lipide stanične stjenke te izostaje njezina normalna funkcija.

Posljedično, dolazi do kolapsa stanične stjenke i naposljetku do lize

stanice.

Meñutim, svi mikroorganizmi nemaju točno odreñenu optimalnu

temperaturu rasta. Prilično često, optimalna temperatura pokriva širi

temperaturni raspon, npr. Clostridium perfingens ima optimalnu

temperaturu rasta od 37do 45°C. Minimalne i maksimalne temperature,

navedene za odreñeni organizam, ovise o čimbenicima koji odreñuju

njihovu optimalnu temperaturu rasta, npr. pH i aktivitet vode. Ukoliko se

ti vanjski čimbenici promijene u odnosu na optimalne uvjete sredine,

minimalna temperatura rasta odreñenog organizma će se povećati, a

maksimalna smanjiti. Dobar primjer za objašnjenje je bakterija

Staphylococcus aureus (patogeni mikroorganizam), čija je minimalna

temperatura rasta 6,7°C, a maksimalna 48°C jedino u sredini s pH 7,0 i

aktivitetom vode od 0,99. Promjenom pH na 5,0 i redukcijom aktiviteta

vode (npr. dodatak od 3,0% natrijevog klorida u medij), S. aureus više ne

može raste na 48°C, a minimalna temperatura rasta mijenja se na 30°C.

Na temelju optimalnih temperatura rasta, mikroorganizme radi

lakšeg snalaženja najčešće dijelimo u četiri osnovne skupine:

35

• psihrofilni organizmi

• psihrotrofni organizmi

• mezofilni organizmi

• termofilni organizmi

Temperaturni raspon rasta osnovnih skupina mikroorganizama prikazan je

u tablici X, a za neke pojedinačne vrste i rodove u tablici X.

Tablica: Skupine mikroorganizama u odnosu na temperature rasta

Grupa Minimum °C Optimum °C Maksimum °C

Psihrofilni

organizmi

-10 10 - 15 20

Psihrotrofni

organizmi

-10 20-30 42

Mezofilni organizmi 5 28-43 52

Termofilni

organizmi

Ekstremno

termofilni

30

65

50-65

80-90

70

100

(modificirano prema Garbutt, 1997.)

Tablica: Minimalne, optimalne i maksimalne temperature

36

rasta nekih mikrobnih vrsta

Organizam Min. °C Optimum °C Maksimum °C Grupa

Flavobacterium spp. -10,0 10 20 psihrofilni

Pseudomonas fragii -6,5 24 38 psihrotrofni

Escherichia. coli 8 37 45 mezofilni

Bacillus

stearothermophilus

28 55 72 termofilni

Bacillus subtilis 10 28 51 mezofilni

Bacillus coagulans 30 45 56 ttermofilni

Pseudomonas

fluorescens

-4 26 40 psihrotrofni

Aeromonas spp. 0 28 42 psihrotrofni

(modificirano prema Garbutt, 1997.)

2.1.1.1. Psihrofilni mikroorganizmi

Skupina psihrofilnih mikroorganizama živi u zemlji i vodi

hladnijih krajeva zemlje, odnosno područja koja imaju tijekom cijele

godine temperaturu tla ispod 0°C, a vode od 0-5°C. Organizmi te skupine

imaju minimalnu temperaturu rasta -10°C, a optimalna i maksimalna

takoñer im je niska.

2.1.1.2. Mezofilni mikroorganizmi

37

Mezofilni mikroorganizmi adaptirali su se na život na čovjeku i

toplokrvnim životinjama, te u zemlji i vodi u tropskim i subtropskim

područjima. Važna karakteristika mezofilnih mikroorganizama je njihova

nesposobnost rasta na niskim temperaturama (-1 do 5°C). Mnogi, ali ne svi

imaju optimalnu temperaturu rasta na 37°C (temperatura ljudskog tijela).

Mezofilnoj skupini mikroorganizama pripadaju mnogi rodovi bakterija,

kvasaca i plijesni. Mnogi uzročnici kvarenja hrane kao i patogeni

mikroorganizmi koji se prenose hranom takoñer pripadaju mezofilnoj

skupini organizama. Meñutim, treba istaknuti da se optimalna temperatura

za rast nekih patogenih organizama uvijek ne poklapa s optimalnom

temperaturom potrebnom za tvorbu njihovih toksina. Temperature rasta

za S. aureus i za tvorbu toksina prikazane su u tablici

Tablica Temperature rasta i tvorbe toksina bakterije Staphylococcus

aureus

Temperature rasta

°C

Temperature za tvorbu toksina

°C

Minimum 6,7 10

Optimum 37,0 40-45

maksimum 45,6 45,6

(modificirano prema Garbutt, 1997.)

2.1.1.3. Termofilni mikroorganizmi

Termofilna skupina mikroorganizama ima svoja staništa u toploj

zemlji, kompostu, silaži, i sl., gdje temperature mogu biti i 70°C.

Eksremno termofilni mikroorganizmi mogu se naći u sredinama koje

imaju temperature više i od 100°C. Smatra se da je ta skupina

38

mikroorganizama odgovorna za samo-zapaljivanje slame i sijena. Kada je

sijeno mokro, rastu mezofilni mikroorganizmi, njihovi metabolički procesi

generiraju toplinu i zbog izolirane sredine u stogu sijena temperatura se

povećava do termofilne zone. Tada nastupaju uvjeti za rast termofilnih

mikroorganizama zbog čijih se metaboličkih procesa temperatura u stogu

sijenu dalje povećava ( više od 70°C). Novonastale kemijske oksidacije

potom su uzrokom spontanog zapaljenja sijena. Izmeñu termofilnih

mikrobnih skupina, svega je nekoliko vrsta koji imaju značajan negativan

utjecaj na kvalitetu hrane. Bacillus steraothermophilus, Clostridium

termosaccharolyticum i Clostridium nigrificans su vrste koje uzrokuju

kvarenje konzervirane hrane koja se pohranjuju na povišenim

temperaturama. U mljekarskoj mikrobiologiji, skupina mikroorganizama

koja preživljava temperature pasterizacije, ne raste na tim temperaturama,

ali može rasti na niskim temperaturama naziva se termorezistentna

skupina mikroorganizama. Rodovi Bacillus, Clostridium, Arthrobacter,

Miccrobacterium, Microccocus, Streptococcus, Lactobacillus i

Corynebacterium pripadnici su te skupine. U termorezistentne

mikroorganizme spadaju i termofilni mikroorganizmi koji preživljavaju

najnižu temperaturu pasterizacije (63°C/30 min.).

2.1.1.4. Psihrotrofni mikroorganizmi

Psihrotrofni mikroorganizmi su posebna skupina bakterija,

kvasaca i plijesni koju karakterizira sposobnost rasta na niskim

temperaturama, neovisno o svojoj optimalnoj temperaturi rasta. Općenito,

psihrotrofni mikroorganizmi su najvažnija skupina organizama uzročnika

39

kvarenja hrane (TABLICA) koja se pohranjuje u hladnim uvjetima (-1 do

7°C). Patogene bakterije Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica i

Clostridium botulinum tip E, bez obzira što imaju optimalnu i maksimalnu

temperaturu rasta više karakterističnu za mezofilne organizme, takoñer se

svrstavaju u psihrotrofnu mikrobnu populaciju. Razlog tome je njihova

minimalna temperatura rasta koja je niža od 5°C. Za psihrotrofne

mikroorganizma povezane s mlijekom i mliječnim proizvodima

Meñunarodna mljekarska federacija (International Dairy Federation IDF)

1976. godine prihvatila je definiciju psihrotrofnih mikroorganizama

povezanih s mlijekom i mliječnim proizvodima koja glasi: "Psihrotrofni

mikroorganizmi mogu rasti na temperaturi 7°C i nižoj, bez obzira na

optimalnu temperaturu rasta (rast se u ovom kontekstu odnosi na sve

metaboličke procese koji su nužni za rat i razmnožavanje)".Ti

mikroorganizmi ne sačinjavaju specifičnu taksonomsku skupinu, već su

svrstani u 15 različitih rodova. Većina psihrotrofne populacije u sirovom

mlijeku pripada Gram- negativnim rodovima, iako se, ali u znatno manjem

broju, mogu naći i pripadnici Gram- pozitivnih rodova.

2. 1. 2. Aktivitet vode (aw )

Raspoloživa količina vode potrebna za rast mikroorganizama u

hrani ili aktivitet vode (aw) definira se kao omjer tlaka vodene pare iznad

površine proizvoda (p) i vodene pare prisutne u vodi (po) na istoj

temperaturi (aw= p/ po). Vrijednost aw je od 0, 0 do 1,0. Radi usporedbe aw

za mlijeko je 0,995, a za sir ovisan je o vrsti sira, periodu i dužini zrenja.

40

Većina Gram- negativnih bakterija za svoj rast zahtijeva aw od minimalno

0,95, a većina Gram-pozitivnih bakterija od minimalno 0,90. Bakterije

mliječne kiseline, u odnosu na ostale Gram- pozitivne bakterije,

zahtijevaju viši aw (npr. Lactobacillus spp. ≥0,96). Kvasci i plijesni, za

razliku od bakterija, mogu rasti u uvjetima vrlo niskih vrijednosti

aktiviteta vode. Tako je za rast kvascima dovoljan aw od 0,85, a osmofilni

kvasci mogu rasti i u uvjetima aw nižim od 0,60. Većini vrsta plijesni za

rast je dovoljan aw 0,75.

Promjena vrijednosti aw odreñuje mikrobne skupine u proizvodu.

Poznavanjem zahtjeva za količinom potrebne raspoložive vode (aw)

pojedinih mikrobnih skupina, koje mogu biti povezane sa proizvodom

može se utjecati na ukupnu kvalitetu proizvoda. Odnosno, smanjenjem

vrijednosti aw mijenja se krivulju rasta odreñenih mikrobnih vrsta,

smanjuje se njihov omjer rasta, produžuje se lag faza, smanjuje se broj

stanica u stacionarnoj fazi, a veći broj stanica odumire u fazi odumiranja

(slika 3.)

41

Slika 3.: Utjecaj aktiviteta vode (aw) na krivulju rasta mikroorganizama

(Garbutt, 1997.)

Općenito, prisutna voda u proizvodu (mediju) nije garancija da je ta voda

raspoloživa za mikrobni rast i zato ona ne predstavlja aktivitet vode (aw).

Voda u hrani nije dostupna mikroorganizmima kada sadrži otopljene tvari

kao što su šećeri ili soli i/ili je ona u kristaliziranom ili hidratacijskom

obliku ("vodeni plašt" npr. oko bjelančevina). Dobar primjer za

objašnjenje dostupnosti raspoložive vode je maslac (emulzija vode u

ulju) s niskim udjelom soli (2-3%) što sugerira da je aw u proizvodu

0,993-0,989. Meñutim zbog polarnog svojstva soli, ona je otopljena u

vodenoj fazi maslaca što podiže njenu koncentraciju na približno 18%, te

je stvarni aw 0,86. Takoñer, svaki specifični mikroorganizam ima svoj

vlastiti aw raspon, ali je za sve vrste zajedničko da je apsolutni aw limit

42

0,61. Izmeñu skupina mikroorganizama, bakterije su najosjetljivije na

smanjenje aw, a kvasci i plijesni su najrezistentniji ( graf X str.67 fig. 6.6.)

Na osnovu tih činjenica i potencijalne mogućnost kvarenja, hrana se može

podijeliti u hranu s visokim, srednjim i niskim udjelom vode.

• Hrana s visokim udjelom vode (aw 0,95-0,90); svi svježi proizvodi

(bez ili s vrlo malo promjena u smislu njihovog konzerviranja), mlijeko,

svježi sir, nesoljeni maslac i mliječni namazi. Kvarenje tih proizvoda

uzrokuju Gram-negativne bakterije, brzo rastuće plijesni i ne-osmolitski

kvasci. Meñutim kada se hrana konzervira isušivanjem, dodatkom šećera

ili soli (npr. soljeni maslac, sirevi koji zriju) uzročnici kvarenja postaju

gram-pozitivne bakterije, kvasci i plijesni.

• Hrana s srednje visokim udjelom vode (aw 0,90-0,61), odnosno

hrana pripremljena intenzivnim sušenjem i/ili dodatkom znatnih količina

šećera ili soli, kvariti će se zbog rasta kvasaca, plijesni, kserofilnih

plijesni i halofilnih bakterija. Od mliječnih proizvoda u ovu skupinu hrane

spadaju zreli sirevi.

• Hrana s niski udjelom vode (aw niži od 0,61), odnosno hrana

pripremljena potpunim isušivanjem (čokolada, brašno, šećer, mlijeko u

prahu i sl.) smatra se potpuno sigurnom u smislu kvarenja. No kvarenje se

dogaña u slučajevima kada se ti proizvodi drže u uvjetima s mogućnosti

ponovnog upijanja vlage.

Snižavanje aw u hrani iznimno je važno i u kontroli rasta patogenih

mikroorganizama. Uz izuzetak S.aureus, B.cereus i plijesni koje tvore

mikotoksine, patogeni mikroorganizmi neće rasti u hrani čiji je aw niži od

0,93 (48% saharoze, 10% NaCl). Meñutim, ne smije se zaboraviti

43

činjenica da patogeni mikroorganizmi premda neće rasti, mogu u

osušenom proizvodu čiji je aw niži od minimalnog, preživjeti kroz duži

period. Salmonella spp. može tako preživjeti u mliječnom prahu i do

sedam mjeseci.

2.1.3. pH

Vrijednost pH hrane ili mikrobnog hranilišta je jedan od najvažnijih

čimbenika koji utječu na rast i preživljavanje mikroorganizama.

Pojednostavljeno, termin pH je mjera koja pokazuje da li je medij kiseli,

bazični ili neutralan:

• otopina koji sadrži 10-7 mol H+/L ima pH vrijednost 7 i ona je

neutralna

• otopina koji sadrži 10-5 mol H+/L ima pH vrijednost 5 i ona je

kisela

• otopina koji sadrži 10-8 mol H+/L ima pH vrijednost 8 i ona je

bazična

Ne smije se zaboraviti da je pH skala logaritamska, te se kiselost ili

bazičnost sredine promjenom za jednu jedinicu povećava za faktor 10. Na

primjer, ako medij ima pH vrijednost 4 on je 1000x kiseliji u usporedbi s

medijem čija je pH vrijednost 7.

Svi mikroorganizmi imaju svoju specifičnu toleranciju prema pH

vrijednostima sredine i svoj optimalni pH, kada rastu najbolje. Slika (X)

44

prikazuje utjecaj pH na omjer rasta najvećeg broja bakterija, kvasaca i

plijesni.

Slika X: pH

Za rast bakterija minimalno potrebna vrijednost pH sredine je 4,0-

4,5, optimalna izmeñu 6,8-7,0, a maksimalna od 8,0-9,0. Neke bakterijske

vrste čine izuzetak od tog općeg pravila, na primjer Lactobacillus spp.

rastu unutar 3,8-7,2 a optimalna im je vrijednost oko pH 5. Acinetobacter

spp. raste izmeñu 2,8 i 4,3, s optimalnim pH oko 3.

Kvasci i plijesni su općenito manje senzibilni na pH sredine u usporedbi s

bakterijama, te rastu u puno širem rasponu pH vrijednosti. Plijesni

45

Fusarium spp. tako može rasti u mediju čija je pH vrijednost izmeñu 1,8 i

11,1. Optimalna vrijednost pH za kvasce je izmeñu 4,0 i 4,5, a za plijesni

izmeñu 3,0 i 3,5. Takoñer, pH nema samo utjecaj na rast mikroorganizma,

već i na njegovu krivulju rasta. Utjecaj pH medija na krivulju rasta

mikroorganizama ilustriran je na slici X.

Slika X.: promjena optimalnog pH

46

Odstupanjem od optimalne pH vrijednosti za odreñeni mikroorganizam

znači:

• smanjenje omjera rasta

• smanjenje broja novo stvorenih stanica

• produženje trajanje lag faze

• skraćenje trajanje stacionarne faze

• povećanje omjera odumiranja stanica

Za rast odreñenog mikroorganizma, minimalno potrebna pH vrijednost

sredine odreñena je temperaturom, izvorom raspoloživih hranjivih tvari,

aktivitetom vode i razinom inhibitornih tvari. Interni pH mikrobne stanice

je približno 7 (premda može biti i niži za neke organizme, npr. kvasce čiji

je pH u stanici 5,8) i kod te pH vrijednosti metabolizam stanice najbolje

funkcionira.

Hrana je općenito prilično varijabilna u smislu pH vrijednosti, ali

vrlo rijetko ima bazičnu reakciju (jaja su jedna od rijetke hrane koja imaju

bazičnu reakciju). Meñutim, osnovna pH vrijednost hrane mijenja se

njenom mikrobnom kontaminacijom. Mlijeko postaje kiselo zbog

djelovanja streptokoka i laktobacila koji imaju sposobnost tvorbe mliječne

kiseline.

Kvarenjem hrane Gram-negativnim bakterijama Pseudomonas spp.

(koriste amino kiseline za izvor ugljika), nastaje amonijak koji stvara

bazične uvjete sredine.

47

Hrana koja ima visoki puferni kapacitet (visoki udjel proteina u

namirnici), pokazuje veću rezistentnost na promjene pH od hrane s nižim

pufernim kapacitetom. U tom smislu, za kontrolu rasta patogenih i

mikroorganizama uzročnika kvarenja u hrani, vrlo često se korekcija pH

vrijednosti vrši organskim kiselinama (mliječna, limunska, octena). One

u prehrambenom proizvodu imaju ulogu konzervansa.

Hrana s vrijednošću pH nižom od 4,2, smatra se u smislu rasta patogenih

bakterija sigurnom. Naravno odreñene patogene bakterije mogu rasti i u

uvjetima tako niskih pH vrijednosti, ali uz pretpostavku da svi ostali

čimbenici rasta imaju optimalnu vrijednost. Takvi uvjeti su karakteristični

za kulturološku hranjivu podlogu, ali na sreću, u hrani su izuzetno rijetki.

2. 1. 4. Kisik

Mikroorganizmi se meñusobno razlikuju i prema svojim potrebama

za kisikom. Tako neki mikroorganizmi zahtijevaju kisik da bi stvarali

staničnu energiju u formi adenozin trifosfata -ATP (aerobno disanje).

Proces uključuje glikolizu, Krebsov ciklus i sustav transporta elektrona

gdje kisik služi kao terminalni akceptor elektrona. Potrebna energija se

stvara potpunom oksidacijom organskog supstrata, a konačni produkt su

CO2 i voda. Kada je glukoza organski supstrat, stvara se 38 ATP iz ADP

(adenozin difosfat) po svakoj molekuli oksidirane glukoze.

Mikroorganizmi koji mogu rasti jedino u prisutnosti kisika zovu se

aerobni mikroorganizmi. U hrani obligatni aerobni mikroorganizmi su

bakterija Pseudomonas fluorescens, plijesni Penicillium spp. i neki kvasci.

48

Mikroorganizmi koji ne rastu u prisutnosti kisika nazivaju se anaerobni

mikroorganizmi. Za svoj rast potrebnu energiju stvaraju isključivo

fermentativnim putem, gdje, koriste organski akceptor elektrona. U

usporedbi s aerobnim mikroorganizmima stvara se znatno manje energije,

a organski meñu-produkti se oslobañaju iz stanice. Jedini obligatni

anaerobni mikroorganizam povezan sa hranom je Clostridium spp.

Meñutim, neke vrste tog roda, toleriraju odreñenu koncentraciju kisika u

sredini u kojoj rastu, te se opisuju kao aerotolerantni. Clostridium

perfingens, patogeni mikroorganizam povezan s hranom, pripada toj

mikrobnoj skupini.

Osim podjele na aerobne i anaerobne, mikroorganizmi mogu prema

svojim zahtjevima prema kisiku biti: mikroaerofilni, fakultativno

anaerobni, kisik-neovisni i fermentativni mikroorganizmi (SLIKA X)

49

Slika X odnos bakterija prema kisiku

Mikroaerofilni mikroorganizmi trebaju kisik za stvaranje potrebne

energije za rast, ali njegova razina u mediju mora biti manja od 20%.

Campylobacter spp. može tako rasti u hrani koja ima koncentraciju kisika

izmeñu 1 i 10% (optimum 6%). Koncentracija kisika veća od 10%

toksična je za te bakterije. Fakultativni anaerobni mikroorganizmi

mogu rasti u prisutnosti ili odsutnosti kisika. Kada je kisik u dovoljnoj

50

koncentraciji u mediju oni stvaraju energiju kao aerobni mikroorganizmi i

tada najbolje rastu. U odsutnosti kisika ta skupina mikroorganizama stvara

znatno manje raspoložive energije (2 ATP/molekuli glukoze). Mnoge

bakterije i kvasci povezani s hranom su fakultativno anaerobni

mikroorganizmi. Sve vrste koje pripadaju familiji Enterobacteriaceae, koja

uključuje i Escherichia coli te Salmonella spp. bakterije pripadaju toj

skupini. Takoñer, skupini fakultativno anaerobnih mikroorganizama

pripada i toksična bakterija Staphylococcus aureus. Većina bakterija

mliječne kiseline pripada skupini kisik-neovisnim mikroorganizmima

budući mogu rasti u mediju neovisno o prisutnom kisiku. Ti

mikroorganizmi u oba slučaja uvijek stvaraju organske meñu-produkte i

odreñenu količinu energije. Vrlo često, bakterije mliječne kiseline opisuju

se kao mikroaerofilne ili fakultativno anaerobne bakterije, meñutim

kako ne posjeduju citokrome niti jedan od tih termina nije prikladan za

njihov opis. Termin fermentativni mikroorganizmi koristi se za opis

mikroorganizama koji kao alternativni način kisiku, za stvaranje energije,

koriste organski akceptor elektrona. Fermentativni mikroorganizmi samo

djelomično oksidiraju ugljikohidrate i drugi organske spojeve, na način da

organske molekule ostaju kao rezidualni metabolički produkti.

Vrste metaboličkih produkata koji nastaju tom vrstom oksidacije znatno se

razlikuju izmeñu skupina mikroorganizama ( SLIKA str.80 fig.6.14.).

Fermentativni mikroorganizmi prema svom zahtjevu prema kisiku mogu

biti ili fakultativni anaerobni ili kisik-neovisni ili obligatni anaerobni

organizmi.

Kisik sam po sebi, neovisno da li ga organizam koristi ili ne koristi za

stanično disanje, kada je apsorbiran u stanicu, toksičan je za sve

51

mikroorganizme. Naime, prijenosom elektrona na kisik u stanici nastaju

toksični spojevi superoksid (O- 2) i vodikov peroksid (H2O2). Oni kao jaki

oksidansi, mogu oksidirati molekule vitalnih staničnih komponenti kao

što su fosfolipidi u staničnoj stjenci, te tako uzrokovati znatna oštećenja i

smrt stanice. Obligatno aerobni, fakultativno anaerobni i mikroaerofilni

organizmi, te bakterije mliječne kiseline tvore enzim superoksid dismutazu

koja im omogućava katalizu superoksida u vodikov peroksid. Stvoreni

vodikov peroksid djelovanjem drugog enzima - katalaze brzo se

razgrañuje do vode i kisika. Enzim katalazu posjeduju obligatni aerobni,

fakultativno anaerobni, mikroaerofilni i aerotolerantni anaerobni

mikroorganizmi. Bakterije mliječne kiseline za razgradnju vodikovog

peroksida koriste enzim peroksidazu. Obligatni anaerobni mikroorganizmi

ne mogu tvoriti enzime superoksid dismutazu i katalazu što objašnjava

smrt njihove stanice u prisutnosti kisika u mediju. Takoñer, zbog

vjerojatno istog razloga mikroaerofilni mikroorganizma ne mogu tolerirati

koncentraciju kisika u mediju koja je viša od one u atmosferi, te su u

usporedbi s drugim aerobnim mikroorganizmima senzitivniji na toksičnost

kisika.

2.1. 5. Oksido-redoks potencijal (Eh)

Svaka mikrobna vrsta ima svoj oksido-redoks raspon u kojem raste.

On je primarno odreñen reakcijom odreñene mikrobne vrste koju ona ima

prema kisiku u okolišu (Tablica 6.1. str. 81.). Oksido-redoks potencijal

(Eh) je mjera koja pokazuje da li materijal ima tendenciju davanja

elektrona (postaje reduciran) ili gubitka elektrona (postaje oksidiran).

52

Reducirani supstrat u odnosu na referentnu elektrodu (vodikova/platinasta

elektroda) koja ima vrijednost 0 pokazuje negativnu a oksidirani supstrat

pozitivnu vrijednost. Vrijednost oksido-redoks potencijala izražava se u

milivoltima (mV). Meñutim, oksido-redoks potencijal i mikrobni rast

izuzetno je kompleksan u prirodnom mediju i hrani koji sadrže mješovitu

mikrobnu populaciju. Osim toga na rast mikrobne populacije istovremeni

utjecaj imaju pH. aw, izvor hranjiva, te relativni broj odreñene vrste. No,

općenito rast mikrobne populacije u hrani u odnosu na oksido-redoks

potencijal ovisiti će o raspoloživom kisiku:

• površina proizvoda izložena zraku podržavati će rast obligatnih

aerobnih, fakultativnih anaerobnih ili kisik-neovisnih organizama

• hrana koja ne sadrži kisik i/ili je kisik iz proizvoda odstranjen

mehaničkim načinom kao što je zagrijavanje, ili hrana koja sadrži jake

reduktivne tvari podržavati će rast obligatnih anaerobnih, fakultativnih

anaerobnih ili kisik-neovisnih organizama

• hrana iz koje je djelomično odstranjen kisik podržavati će rast

mikroaerofilnih mikroorganizama

Poznavanje sposobnosti rasta različitih mikrobnih vrsta u odnosu na

njihov oksido-redoks potencijal i njihov odgovor na prisutni kisik u

mediju, prvenstveno su značajni za stvaranje uvjeta rasta u laboratorijskom

mediju. Mikroorganizmi koji rastu u laboratoriju prirodno se kultiviraju u

formi čistih kultura. Karakteristike rasta tako uzgajanih mikrobnih vrsta

odreñene su sastavom kulturološkog medija, pH, oksido-redoks

potencijalom i temperaturom inkubacije. U praksi, uvjeti slični

53

kultivacijskim, koriste se za mnoge industrijske fermentacijske procese.

Ta metoda, uspješno se može koristiti za suzbijanje mikrobnog rasta u

onim slučajevima kada je toplinski obrañen proizvod (npr. UHT mlijeko)

kontaminiran samo jednom mikrobnom vrstom (Clostridium spp. i /ili

Micrococcus spp.). Svježa hrana prirodno je kontaminirana mješovitom

mikrobnom populacijom koja potječe od životinja, biljaka i okoliša.

Takoñer, mješovita populacija može biti prisutna u tehnološki obrañenoj

hrani u kojoj značajna razina mikrobne populacije preživljava proces

prerade, ili ukoliko doñe do njene re-infekcije. Pasterizirano mlijeko je

dobar primjer za obje navedene moguće situacije rasta mješovite mikrobne

populacije. U hrani gdje su pH, temperatura i aw takvi da dozvoljavaju rast

više od jedne mikrobne vrste, organizmi će se meñusobno natjecati za

raspoloživi supstrat. Organizam(i) koji brže raste u zadanim uvjetima

sredine postati će dominantnom mikrobnom populacijom. Meñutim, ako je

početna razina kontaminiranosti neke vrste visoka, ona može ostati

dominantnom vrstom u hrani, neovisno što bi u normalnim okolnostima

njezin rast bio ograničen rastom kompetitivnih mikrobnih vrsta. Odreñene

mikrobne vrste iskazuju antagonizam prema drugim vrstama, na način da

brzo mijenjaju uvjete u mediju u kojem rastu. Bakterije mliječne kiseline

u mlijeku pohranjenom na sobnu temperaturu tvore mliječnu kiselinu koja

inhibira rast Gram-negativnih bakterija. Drugi antimikrobni spojevi

(vodikov peroksid ili nizin) koje one mogu stvarati u sredini rasta takoñer

inhibitorno djeluju na ostale Gram- negativne mikrobne vrste.

54

3. Taksonomija mikroorganizama

Taksonomija je znanstvena disciplina biologije koja se bavi

svrstavanjem organizama u grupe koje se nazivaju takse, a čine je tri

povezane cjeline:

• imenovanje organizama -nomenklatura

• grupiranje organizama-klasifikacija

• razlikovanje izmeñu pojedinačnih organizama- identifikacija

Sustav imenovanja koji se koristi za sve žive organizme pa tako i

mikroorganizme temelji se na binominalnom sustavu koji je u 18 stoljeću

razvio znanstvenik Carla von Linné. Nomenklatura mikroorganizama

djeluje na slijedeći način:

• svaki različiti mikroorganizam prepoznaje se kao vrsta (species;

množina, species)

• svakoj vrsti (species) daju se dva imena

• prva riječ je generičko ime (uvijek se piše velikim slovom)

• druga riječ je specifično ime (uvijek se piše malim slovom)

• specifično ime je obično riječ koja objašnjava generičko ime i često

nam govori o organizmu

Specifično ime na primjeru bakterije Escerichia coli znači da je prvo ime

Escerichia ta bakterija dobila u čast njemačko-austrijskog profesora

pedijatrije Theodora Escherich (1857.-1911.) koji ju je 1919. godine otkrio

i opisao. Drugo ime coli znači da je ona povezana s crijevima.

55

3.1. Nomenklatura

Nomenklatura znači imenovanje mikroorganizama. Imena

mikroorganizama pišu se u tiskanom tekstu uvijek u kurzivu a kada je tekst

napisan rukom njihova imena uvijek moraju biti podvučena ravnom crtom.

Dogovorene skraćenice generičkih imena mikroorganizama npr. E. coli

koriste se u svim knjigama, stručnim i znanstvenim radovima, ali samo

nakon što je početno u tekstu navedeno njihovo puno ime. Imena

mikroorganizama se nakon ozbiljnih kritičkih studija ponekad mijenjaju,

ali na sreću to nije tako često. Promjena imena već imenovanih

mikroorganizama dogaña se ako se prijašnja klasifikacija temeljila na

ograničenom broju njihovih karakteristika, i/ili ako je novim metodama

utvrñen drugačiji odnos izmeñu pojedinih organizama (npr. analizama

ribosomalne RNA mikroorganizama). Meñutim, promjena imena može

dovesti do zabune. Tako je originalno ime za Lactococcus lactis subsp.

lactis bilo Streptococcus lactis koje još uvijek koriste neki tehnolozi pa

čak i neki znanstvenici što dovodi do ozbiljnijih nesporazuma u

komunikaciji meñu stručnjacima. Korištenje točnih nazivlja

mikroorganizama osigurava: transparentnu verbalnu i znanstvenu

informaciju u literaturi, osigurava točnost i pouzdanost mikrobnih zbirki

kultura, ima veliko značenje u usporedbi poznate s nepoznatom

mikrobnom vrstom, te osigurava točnu i pouzdanu klasifikaciju

organizama.

Premda imenovanje mikroorganizama omogućuje razlikovanje

pojedinih vrsta prema brojnim karakteristikama, u praksi to nije uvijek

tako jednostavno. Općenito, problem imenovanja pojedinih mikrobnih

vrsta je u činjenici da se neke vrste spolno razmnožavaju u klasičnom

56

smislu, a neke svoj genetski materijal, prenose i plazmidima i/ili

dijelovima DNK konjugacijom ili transformacijom. Na taj način, te

mikrobne vrste dijele zajednički genski fond što otežava njihovo

imenovanje. Suprotno, za one mikrobne vrste koje nemaju te sposobnosti

kao što je na primjer E.coli definicija vrste na osnovu strukturnih,

biokemijske i molekularnih analiza relativno je jednostavna.

3.2. Klasifikacija

Klasifikacija ili grupiranje pojedinačnih vrsta (species)

mikroorganizama u veće, a potom u još veće skupine temelji se na

njihovoj prirodnoj genetičkoj povezanosti. Jednako kao i kod ostalih živih

organizama što se spuštamo od vrha piramide sličnost organizama se

povećava. Pojedina vrsta najmanje je slična svojoj domeni, ali su zato

sojevi unutar jedne mikrobne vrste vrlo slični. Najjednostavnija je

klasifikacija svrstavanja u rodove i vrste na osnovu karakteristika koje se

mogu ispitati u rutinskom laboratoriju. Tako su bojanje po Gramu, kratki i

dugi biokemijski nizovi, te morfološke karakteristike klasični postupci

prema kojima se najjednostavnije klasificiraju bakterije.

57

Slika: Klasifikacija vrsta

3.3. Identifikacija

Razlikovanje izmeñu pojedinačnih mikroorganizama naziva se

identifikacija . Ona se provodi složenijim morfološkim, fiziološkim i

biokemijskim testovima, te metodama temeljenim na principima

molekularne biologije. Kada se radi o bakterijama, rutinska identifikacija

u laboratoriju obavlja se na dva osnovna principa. Prvi uključuje izolaciju

na diferencijalnim ili selektivnim hranilištima nakon čega slijede potvrdni

testovi npr. bojanje, biokemijski testovi, serološki testovi, fag tipiziranje

itd. Drugi pristup je izolacija na općem hranilištu nakon čega slijede

standardne mikrobiološke procedure: bojanje po Gramu, bojanje spora,

test pokretljivosti, oksidativno-fermentativni testovi, glukoza

fermentativni test, katalaza test, oksidaza test i test fluorescencije. Ti

testovi daju preliminarne rezultate identifikacije na razini roda ili porodice.

Klasična fenotipska i biokemijska karakterizacija koristi se potom za

preliminarnu determinaciju vrste. Meñutim, točna identifikacija na razini

vrste ili još niže na razini soja moguća je jedino molekularno biološkim-

58

tehnikama koje proučavaju nukleinske kiseline što omogućava

diferencijaciju na razini genoma, neovisno o fazi i uvjetima rasta

mikroorganizama. Identifikacija bakterija molekularnim metodama na

razini vrste i/ili soja provodi se najvećim dijelom u istraživačko-

znanstvenim laboratorijima.

4. Mljekarska mikrobiologija

4.1. Značaj i podjela

Mlijeko i mliječni proizvodi obvezni su sastavni dio hrane u gotovo

cijelom njenom proizvodnom lancu. Oni se konzumiraju kao zasebni

proizvodi, bitan su sastojak mnogih drugih prehrambenih proizvoda, te

služe za pripremu različitih vrsta jela. Zbog svog sastava i svojstava

mlijeko i većina mliječnih proizvoda gotovo su savršen medij za rast i

razmnožavanje različitih vrsta mikroorganizama. Zbog toga, mljekarska

mikrobiologija ima prioritetno značenje ne samo za mljekarsku industriju

već i za svaku drugu koja se na nju naslanja.

Prema predmetu izučavanja mljekarska mikrobiologija obuhvaća:

• patogene mikroorganizme koji se mogu prenositi mlijekom i

mliječnim proizvodima i biti uzročnikom različitih bolesti ljudi i životinja

• mikroorganizme uzročnicima kvarenja mlijeka i mliječnih

proizvoda koji umanjuju njihovu kvalitetu i stvaraju gubitke u proizvodnji

59

• mikroorganizme koji se u sastavu mikrobnih kultura koriste u

proizvodnji fermentiranih mlijeka, vrhnja, maslaca i sira

Veliki broj bolesti kako ljudi tako i životinja mogu biti uzrokovani

patogenim mikroorganizmima koji se prenose mlijekom i mliječnim

proizvodima. Poznavanje izvora, načina njihovog rasta u mlijeku i

mliječnim proizvodima te postupaka njihovog uništenja čine osnovu

prema kojoj se odreñuju svi tehnološki procesi prerade mlijeka i

mliječnih proizvoda. Takoñer, poznavanje patogenih mikroorganizama

povezanih s mlijekom i mliječnim proizvodima služi i za sve sanitarno

higijenske i ostale tehničke mjere radi sprečavanja njihovog širenja.

Mikroorganizmi uzro čnici kvarenja izazivaju neželjene promjene u

mlijeku i mliječnim proizvodima. Te promjene, u većem ili manjem obimu

vidljive su pogreške proizvoda. Meñutim, da li će se pogreška

manifestirati u promjeni okusa, mirisa, teksture ili svih tih svojstava

proizvoda zajedno prvenstveno ovisi mikrobnoj vrsti i njenom broju .

No, i najmanja pogreška izazvana djelovanjem mikroorganizama

uzročnika kvarenja umanjuje hranjivu vrijednost tog proizvoda. U nekim

slučajevima kvarenje je takvog obima da proizvod postaje potpuno

neupotrebljiv za ljudsku i životinjsku hranu, premda ta skupina

mikroorganizama nema patogena svojstva.

Proizvodnja svih fermentiranih mliječnih proizvoda (fermentirana mlijeka,

vrhnje, maslac, sir) nezamisliva je bez upotrebe odreñenih vrsta

mikroorganizama. Oni takoñer, kao i druge dvije gore navedene skupine

60

mikroorganizama pripadaju bakterijama, kvascima i plijesnima. U

mljekarskoj industriji oni se koriste u sastavu mikrobnih kultura čijim

svojstvima i osobinama zahvaljujemo veliku brojnost i različitost

mliječnih proizvoda. Osim toga korištenjem specifičnih sojeva u sastavu

mikrobne kulture različitost u okusu, aromi i konzistenciji izmeñu

mliječnih proizvoda dodatno je povećana.

4.1.1.. Rast mikroorganizama u mlijeku

Mlijeko je kompleksna biološka tekućina koja sadrži više od 100 000

različitih molekula i kemijskih sojeva, te ima jedinstvene fizikalno-

kemijske karakteristike. Veći dio mlijeka čini vodena otopina laktoze,

organskih i anorganskih soli, vitamina, kiselina i enzima, te drugih malih

molekula. Dispergirani sirutkini proteini na molekulskoj razini, kazeini

kao velike nakupine (50-600nm), drugi globularni proteini i Ca-fosfat

čine koloidnu otopinu mlijeka. Lipidi, kao globule mliječne masti

(promjera 0,1-22 µm), u mlijeku prisutni su u formi emulzije (ulje u

vodi). Svi ti sastojci u savršenoj su prirodnoj fizikalnoj ravnoteži

uspostavljenoj izmeñu emulzije, koloidne i vodene otopine mlijeka.

Upravo zbog sastava i osobina, mlijeko nije samo kompletna hrana u

ishrani mladunčadi, gotovo kompletna u ishrani ljudi, već predstavlja i

odlučan izvor hranjiva za rast i razmnožavanje različitim vrstama

mikroorganizama prisutnim posvuda u prirodi. Iz mlijeka, kao najlakše

dostupan izvor energije mikroorganizmi najčešće koriste laktozu (mliječni

šećer). Bjelančevine i mliječna mast dodatni su izvor energije onim

mikrobnim vrstama koje tvore proteolitičke i lipolitičke enzime potrebne

61

za njihovu razgradnju. Veliki broj lako dostupnih vitamina i minerala,

gotovo neutralna pH vrijednost mlijeka (~6,6) i njegov visoki puferni

kapacitet daljnje su osobine mlijeka koje pogoduju mikrobnom rastu. Zato

se ne bez razloga, mlijeko smatra gotovo savršenim hranilištem za rast i

razmnožavanje brojnim mikrobnim vrstama.

Pogodnost mlijeka za rast i razmnožavanje mikroorganizama dodatno se

povećava ako oni rastu u mješovitim populacijama. Tada se u mlijeku

uspostavljaju brojni simbiotski i metabolički odnosi koji ubrzavaju njihov

rast. Meñutim brzina razmnožavanja pojedinih mikrobnih vrsta ne ovisi o

sastojcima mlijeka već je ovisna o inhibitornim svojstvima mlijeka i

vanjskim uvjetima od kojih je najvažnija temperatura.

4.1.1.1. Inhibitorna svojstva mlijeka i temperatura

Inhibitorne svojstva mlijeka objašnjavaju se postojanjem

bakteriocidnih i bakteriostatskih tvari ili kemijskih spojeva koji se krvlju u

procesu njegove sekrecije prirodno izlučuju u mlijeko. Bakteriocidno i/ili

bakteriostatsko djelovanje pripisuje se imunoglobulinima, laktoferinu

(glukoprotein s vezanim Fe), vitaminima vezani na protein, vitaminu B12,

folnoj kiselini, lizozimu- enzim stanične stjenke i enzimu

laktoperoksidazi. Te tvari, nakon mužnje odreñeno vrijeme inhibiraju rast

i razmnožavanje mikroorganizama, te na taj način pozitivno utječu na

održivost sirovog mlijeka. Trajanje inhibitorne faze ovisno je o vrsti i

indvidualnim osobinama životinje, početnom broju mikroorganizama i

62

temperaturi čuvanja mlijeka. Trajanje infibitorne faze znatno se produžava

snižavanjem temperature pohrane mlijeka. U odnosu na inhibitorna

svojstva i temperaturu razlikujemo četiri karakteristične faze

razmnožavanja mikroorganizama u mlijeku:

• inhibitorna ili mikrobicidna faza

• faza mješovite mikrobne populacije

• faza rasta bakterija mliječne kiseline

• faza rasta kvasaca i plijesni

Na završetku infibitorne ili mikrobicidne faze , koja prosječno za kravlje

mlijeko traje 2, a za ovčje i kozje 4 sata, započinje faza mješovite

mikrobne populacije. Ovu fazu karakterizira veći ili manji intenzitet rasta

svih mikroorganizama kojima mlijeko kao hranjiva sredina odgovara.

Meñutim, koja će od mikrobnih vrsta potom postati dominantnom,

odreñeno je temperaturom mlijeka. U mlijeku ohlañenom na temperaturu

nižu od 10° C dominantnu mikrobnu populaciju činiti će psihrotrofni

mikroorganizmi . Kada je temperatura mlijeka viša od 18°C dominantna

mikrobna populacija biti će mezofilna, te tada započinje faza rasta

bakterija mlije čne kiseline od kojih prevladavaju laktokoki.

Razgradnjom laktoze te bakterije stvaraju mliječnu kiselinu, koja se u

početku veže sa alkalnim spojevima te nastaju laktati, a kasnije se izdvaja

mliječna kiselina u slobodnom stanju. Pojavom mliječne i ostalih

organskih kiselina snižava se pH mlijeka, te se zaustavlja rast ostalih, a

prvenstveno proteoliti čkih bakterija . Uz bakterije mliječne kiseline na

početku te fazi u sirovom mlijeku razvijaju se i koliformne bakterije .

Povećanjem kiselosti zaustavlja se rast koliformnih bakterija, te nakon 6-

63

10 sati pohrane u sirovom mlijeku potpuno prevladavaju bakterije

mliječne kiseline. Na taj način faza mješovite populacije prelazi u fazu

bakterija mliječne kiseline. Proces stvaranja mliječne kiseline nastavlja se

do njezine koncentracije u mlijeku od 1,5%. Ta koncentracija mliječna

kiselina dovoljna je za početak inhibitornog djelovanja na rast bakterija

mliječne kiseline koji potpuno prestaje kada ona dosegne razinu od 2-3%.

Sirovo mlijeko tada ima pH vrijednost nižu od 4, odnosno kiselost koja je

dovoljna za inhibiciju rast većine bakterijskih vrsta. Uz prisustvo zraka,

kisela sredina mlijeka tada pogoduje rastu kvasaca i plijesni te započinje

nova faza mikrobnog rasta - faza rasta kvasaca i plijesni. Ti

mikroorganizmi za svoj rast koriste mliječnu kiselina za izvor ugljika i

pritom smanjuju kiselost mlijeka do vrijednosti pH 6-7. Zbog sada gotovo

ponovno neutralne vrijednosti mlijeka, uz kvasce i plijesni, započinju rasti

proteolitičke i lipolitičke bakterije. Oni zajedno intenzivno razgrañuju

bjelančevine i mliječnu mast mlijeka, a ono prelazi u gustu prljavo-žutu

tekućinu neugodna mirisa na trulež. Proces mikrobne razgradnje

kemijskih sastojaka mlijeka nastavlja se do njegove potpune

mineralizacije. Na kraju, dolazi do autolize samih mikroorganizama.

4.1.1.2. Početna mikrobna populacija

Mlijeko se u svijetu proizvodi u područjima u kojima temperatura

može biti niža od 0°C i te viša od 30°C. U prvima, mlijeko je potrebno

zaštititi od smrzavanja, a u drugima, nemoguće ga je zaštititi od mikrobne

64

kontaminacije bez hlañenja. Neovisno gdje se proizvodi, temperature i

vrijeme čuvanja mlijeka nakon mužnje značajno se razlikuju. Zbog toga,

broj i vrsta prisutnih mikroorganizama u mlijeku kada ono napušta farmu

su različiti. Često puta iz istih razloga bakteriološka kvaliteta je čak i pod

istim uvjetima proizvodnje nepredvidiva. Zakonskim odredbama odreñeno

obvezno hlañenja sirovog mlijeka i pridržavanja striktnih higijenskih

mjerna u načinu proizvodnje i pohrane do prerade, općenito bakteriološka

kvaliteta u znatnoj je mjeri poboljšana. Problemi s kojima se danas

mljekarska industrija susreće su povratni bakteriološki efekt zbog

prolongirane pohrane i subklinički - mastitično mlijeko. Maskiranje

bakteriološke kvalitete hlañenjem mlijeka premda postoji u modernoj

proizvodnji, smatra se manjim problemom.

Mlijeko u vimenu zdravih muznih životinja gotovo je sterilno.

Meñutim napuštanjem vimena u bilo kojim uvjetima proizvodnje, mlijeko

će se neizbježno bakteriološki kontaminirati iz dva izvora:

eksterijernog dijela vimena i sisa

preko pribora za mužnju i čuvanje mlijeka

Taj broj mikroorganizama čini početnu mikrobnu populaciju koja ima

direktan utjecaj na kasniju preradu mlijeka . Kontaminacija sirovog

mlijeka od 102-103/ml smatra se prirodnom kontaminacijom koja

potječe iz unutrašnjosti vimena i sisnog kanala. U uvjetima higijenski čiste

mužnje, kontaminacija od 104/ml smatra se prihvatljivom početnom

populacijom. koja potječe s površine sisa i mljekarskog pribora. Meñutim

65

broj i vrsta mikroorganizama koja će se razviti u mlijeku determinirani

su temperaturom pohrane mlijeka. Tako ovisno o broju, vrsti i

temperaturi, mlijeko postaje supstratom za patogene i mikroorganizme

uzročnike kvarenja. Neki sojevi bakterija mliječne kiseline sposobne su

preživjeti na temperaturi od 60°C/20 min., ali mali ih postotak preživljava

temperature niske pasterizacije (60-65°C/30 min). Dakle, bakterije

mliječne kiseline koje kontaminiraju sirovo mlijeku, nisu korisne

bakterije i uvijek se smatraju uzročnicima kvarenja.

Kada se mlijeko odmah nakon mužnje ohladi na ≤4°C i na toj temperaturi

čuva do transporta, niska temperatura onemogućiti će razmnožavanje

bakterija najmanje 24 sata. Broj mikroorganizama biti će gotovo identičan

početnom broju onih mikrobnih vrsta koje su neminovno dospjele tijekom

mužnjom u mlijeko. Ukoliko je početna mikrobna populacija u netom

pomuženom mlijeku bila 50 000 bakterija/mL, a mlijeko ostavljeno na

temperaturi od 30°C, za otprilike 1-2 sata broj bakterija će biti 108/ml.

U mlijeku bez obzira na način čuvanja, prisutni mikroorganizmi pripadaju

bakterijama, a rjeñe kvascima i plijesnima.

4.1.1.3. Glavne mikrobne vrste

Sirovo mlijeko, neposredno nakon higijenski provedene mužnje, uvijek

sadrži manje od 5000 organizama/ml. Dominantnu populaciju takovog

mlijeka uglavnom čine Micrococcus, Streptococcus, Lactococcus i

Corynebacterium, te zanemariv broj ostalih Gram-pozitivnih i Gram-

negativnih bakterija koji nemaju praktično značenje (tablica 1.) .

66

Tablica 1.: Prisutnost glavnih mikrobnih skupina u sirovom mlijeku

neposredno nakon mužnje, koje sadrži < 5000 bakterija/mL

Mikrobne skupine Učešće %

Mikrokoki 30-99

Streptokoki 0-50

Ostali Gram- rodovi < 10

Ostali Gram+rodovi (uključivo koliformni) < 10

____________________________________________________________

_

Modificirano prema Causin i Bremley,

1985.

Meñutim, hlañenje mlijeka odmah nakon mužnje mijenja prirodno

prisutnu mikrobnu populaciju, dok se istovremeno u neohlañenom mlijeku

mijenja jedino njihova razina kontaminacije. Neohlañeno mlijeko i/ili

ohlañeno na sobnu temperaturu ( ≥13) sadrži uglavnom Gram-pozitivne

bakterije mlije čne kiseline, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus i

Streptococcus spp. Suprotno, u ohlañenom mlijeku (≤4°C) dominantne

Gram-pozitivne bakterije, zamjenjuju se Gram-negativnim i Gram-

pozitivnim psihrotrofnim bakterijama koje mogu negativno utjecati na

67

ukupnu kvalitetu mlijeka produženim čuvanjem u hladnim uvjetima.

Naime, hlañenjem mlijeka značajno se usporava rast i razmnožavanje

većini organizama u mikrobnoj populaciji koja se spontano razvija u

mlijeku. Meñutim, hlañenje mlijeka značajno pogoduje rastu psihrotrofnih

mikroorganizmima. Brzina kojom će razina kontaminiranosti mlijeka tim

organizmima dostići vrijednost >106/mL, ovisi o njihovu početnom

(inicijalnom) broju neposredno nakon mužnje. Meñutim, čak i njihova

niska početna razina kontaminiranosti, nakon čuvanja mlijeka 3 do 4 dana

na temperaturi izmeñu 4 do 5°C, prije pasterizacije biti će >107/ml. Takvo

mlijeko i nakon pasterizacije potpuno je neprihvatljivo u proizvodnji

mliječnih proizvoda. Naime, većina psihrotrofnih mikroorganizama

stvara termostabilne hidroliti čke enzime (stabilni i nakon zagrijavanja

na 100°C/ 30 minuta) koji negativno utječu na ukupnu kvalitetu. Niskom

razinom kontaminiranosti psihrotrofnim mikroorganizmima smatra se

ohlañeno mlijeko u kojemu je ukupan broj bakterija <50 000/ml.

Koliformne bakterije , premda su neke od vrsta psihrotrofni

mikroorganizmi, druga su skupina Gram-pozitivnih bakterija koja vrlo

često kontaminira sirovo mlijeko . Kako ta skupina mikroorganizama

obično ne preživljava temperature pasterizacije, njihovo prisustvo i/ili

odsustvo često se koristi kao indikator uspješnosti proizvodnje.

Koliformne bakterije u mlijeku, ne moraju uvijek biti dokaz fekalne

kontaminacije. One vrlo brzo rastu i u vlažnim uvjetima, te na ostacima

mlijeka mljekarske opreme. Vrlo često, upravo je nečista mljekarska

oprema glavni izvor prisutnosti koliformnih mikroorganizmima u

mlijeku. Broj koliformnih mikroorganizama u mlijeku veći od 100/mL,

prema mnogim mljekarskim mikrobiolozima, je dokaz njegove

68

nehigijenske proizvodnje. Odreñeni sojevi te skupine bakterija pripadaju

i enteropatogenim organizmima, te njihovo prisustvo u mlijeku

predstavlja potencijalnu opasnost za zdravlje čovjeka.

Konačno, mikrobna populacija sirovog mlijeka može sadržavati i različite

patogene vrste, te sojeve bakterijskih vrsta koje imaju sposobnost

stvaranja toksičnih tvari. Osim toga, Listeria monocytogenes, Yersinia

enterocolitica i Bacillus cereus koje su za čovjeka izrazito patogeni

mikroorganizmi, pripadaju skupini psihrotrofnih organizmima. Iz sirovog

mlijeka najčešće izolirane mikrobne vrste prikazane su u tablici 2.

69

Tablica 2 Mikroorganizmi prisutni u sirovom mlijeku

(Scott, 1998.)

70

4.1.1.3.1. Skupina psihrotrofnih mikroorganizmama

Za skupinu psihrotrofnih mikroorganizama povezanih s mlijekom

i mliječnim proizvodima Meñunarodna mljekarska organizacija

(International Dairy Federation) 1976.godine, usvojila je slijedeću

definiciju koja glasi: "Psihrotrofni mikroorganizmi mogu rasti na

temperaturama nižim od 7° C, bez obzira na optimalnu temperaturu rasta

(rast se u ovom kontekstu odnosi i na sve metaboličke procese koji su

nužni za rast i razmnožavanje)."

Psihrotrofni mikroorganizmi nisu specifična taksonomska skupina

mikroorganizama, već su svrstani u 15 različitih rodova. Većina

psihrotrofne populacije u sirovom mlijeku pripada Gram-negativnim

rodovima. Premda, ali u znatno manjem broju u mlijeku se mogu naći i

pripadnici Gram-pozitivnih rodova. Široko rasprostranjeni u prirodi,

ponajprije u vodi i nedovoljno očišćenoj mljekarskoj opremi za mužnju i

čuvanje mlijeka, psihrotrofni mikroorganizmi vrlo lako dospijevaju u

mlijeko. Karakterizira ih brzi rast u ohlañenom mlijeku i sposobnost

stvaranja ekstracelularnih hidroliti čkih termostabilnih enzima. U

današnjim uvjetima proizvodnje mlijeka psihrotrofni mikroorganizmi ,

smatra se, glavni su uzročnici njegovog kvarenja. Nastalim promjenama

u načinu rada, period držanja mlijeka na niskim temperaturama nakon

mužnje i prije proizvodnje produžio se u prosjeku za 2-4 dana. Zbog toga,

prosječni broj aerobnih psihrotrofnih bakterija u mlijeku najčešće je veći

od 105/mL. Pohranom mlijeka prije početka prerade slijedećih 48 sati na

temperaturi od ≤ 6°C, broj psihrotrofnih bakterija povećava se na 107/mL.

71

Porast psihrotrofnih bakterija je isti i u slučajevima dnevnog sakupljanja

mlijeka (jutarnja i večernja mužnja) koje se prije prerade, sljedećih 18 sati

pohranjuje na temperaturi izmeñu 4 i 10°C. Upravo miješanje toplog i

hladnog mlijeka dviju mužnji smatra se uzrokom tako brzom povećanju

njihovog broja.. Kada broj psihrotrofnih bakterija u sirovom mlijeku

dostigne ≥107/ml koncentracija njihovih termostabilnih enzima postaje

značajna za neželjene lipolitičke i proteolitičke promjene.

Od bakterijskih vrsta, takvo mlijeko uglavnom sadržava Pseudomonas

spp. (~70%), Enterobacteriaceae (~ 8%), Gram-pozitivne bakterije (~7%),

te manji broj ostalih Gram-negativnih bakterijskih vrsta, Flavobacterium,

Seratia, Aerobacter i Proteus. Učinak hladnog čuvanja mlijeka na

temperaturi 4-10°C nekoliko dana, na porast psihrofnih bakterija prikazan

je na slici 1.

72

Slika 1.: Učinak hlañenja i čuvanja mlijeka, nekoliko dana na temperaturi izmeñu 4-

10°C, na broj različitih bakterijskih vrsta prisutnih u sirovom mlijeku. Ukupan broj

bakterija u pasteriziranom mlijeku prikazan je radi usporedbe.

(Scott,

1998.)

4.1.1.3.1.1. Ekstracelularni enzimi

Većina psihrotrofnih bakterija prisutnih u sirovom mlijeku ne

preživljava temperature pasterizacije > 60 °C. Meñutim, ta skupina

mikroorganizama ima sposobnost stvaranja nekoliko vrsta enzima,

proteinaze, lipaze, fosfolipaze, egzopeptidaze i glikozidaze, koje

73

temperature pasterizacije i sterilizacije (120-140°C) ne inaktiviraju u

potpunosti. Tako većina proteinaza i lipaza psihrotrofnih bakterija, nakon

toplinske obrade mlijeka, zadržava svoju aktivnosti izmeñu 60 i 70 %

4.1.1.3.1.1.1. Proteinaze

Proteinaze psihrotrofnih bakterija izoliranih iz mlijeka pripadaju

skupini metalo-enzima koji u svojoj molekuli sadrže jedan atom Zn i do

16 atoma Ca. Molekularna težina većine proteinaza je izmeñu 40-50kDa, a

mogu biti neutralne (~7 pH) i alkalne (8-9 pH). Optimalno djelovanje

proteinaza je na temperaturi izmeñu 30-50°C, na višim temperaturama ono

se značajno smanjuje, ali se aktivnost zadržava na temperaturi od 4°C.

Pojedini sojevi psihrotrofnih bakterijskih vrsta stvaraju više od jedne vrste

proteinaza. Varijabilnost u sposobnosti tvorbe proteinaza izmeñu vrsta i

sojeva unutar iste vrste, je uobičajen. Gotovo sve proteinaze pokazuju

sposobnost zgrušavanja mlijeka i razgradnje κ-, αs1- i β kazeina.

4.1.1.3.1.1.2. Lipaze

Lipaze psihrotrofnih bakterija (lecitinaze i fosfolipaze), zbog

sposobnosti hidrolize zaštitne membrane masne globule djeluju na

mliječnu mast mlijeka. Jednako kao i proteinaze, lipaze su termostabilni

enzimi. Izmeñu bakterijskih vrsta Aeromonas, Acinetobacter,

Flavobacterium, lipaze Pseudomonas spp., a posebice Ps. fluorescens

pokazuju najveću termostabilnost. Nakon pasterizacije mlijeka, lipaze Ps.

74

fluorescens zadržavaju aktivnost gotovo 100%. Molekularna težina im je

od 32 do 633kDa, a mogu djelovati u uvjetima pH vrijednosti od 5-11.

Optimalna temperatura djelovanja većine lipaza psihrotrofnih bakterija je

izmeñu 30°C i 50°C. Slično kao i proteinaze, lipaze svoju aktivnost

zadržavaju i na temperaturama od 1-8°C .

4.1.1.3.2.Gram-negativne psihrotrofne bakterija

Rodovi Pseudomonas, Flavobacterium Achromobacter, Alcaligenes,

Acinetobacter, Aeromonas, Chromobacterium, i Enterobacter najčešći su

predstavnici Gram-negativne psihrotrofne populacije bakterija

izoliranih iz sirovog mlijeka. Meñutim, u ohlañenom i na temperaturi od

4-5°C čuvanom mlijeku četiri dana, od ukupne Gram-negativne populacije

izdvaja se Pseudomonas spp. s izrazitom dominacijom vrste

Pseudomonas fluorescens . U odnosu na sve Gram-pozitivne i ostale

Gram-negativne psihrotrofne bakterije, Pseudomonas spp. na

temperaturama nižim od 6°C karakterizira brži rast, duže vrijeme

preživljavanja i kratko generacijsko vrijeme.

4.1.1.3.2.1. Pseudomonas

Rod Pseudomonas najčešće je izolirani psihrotrofni mikroorganizam

iz sirovog mlijeka. Unutar roda razlikujemo P. fluorescens, P.aeruginosa,

P. putida, P.maltophilia, P.cepacia, P.fragi, P.putrefaciens. Vrsta P.

fluorescens ima pet biovara, a vrsta Pseudomonas putida dva.

75

Zajedničke osobine svih vrsta: Gram-negativni ravni ili zakrivljeni štapići

(0,5-1µm x 1,5-4µm); pokretni s polarnim flagelama; katalaza pozitivne;

vrlo često oksidaza pozitivne; kemoorganotropne; striktni aerobni, (osim

vrsta koje mogu koristiti i nitrate iz medija).

4.1.1.3.2.2. Flavobacterium, Aeromonas , Chromobacterium

Meñusobno, rodovi Flavobacterium, Aeromonas i Chromobacterium

razlikuju se u pigmentaciji kolonija na čvrstom hranilištu. Aeromonas,

osim vrste A. salmonicida, ne stvara pigmentirane kolonije. Žuto-

narančaste, crvene ili smeñe kolonije stvara Flavobacterium, a ljubičaste

kolonije karakteristika su Chromobacterium bakterijskih vrsta.

Zajedničke osobine: Gram-negativni ravni ili zakrivljeni štapići (0,2-

2,0µm x 0,6-6,0µm); obično pokretni polarnim flagelama; aerobni i

fakultativno anaerobni; kemoorganotropni; oksidaza pozitivni.

4.1.1.3.2.3. Acinetobacter, Alcaligenes, Achromobacter

Rodovi Alcaligenes i Achromobacter pripadaju prirodnoj mikrobnoj

populaciji koja se spontano razvija u sirovom mlijeku. Zajednička im je

osobina sposobnost stvaranja lipoliti čkih enzima koji uzrokuju značajnu

razgradnju masti u mlijeku. Svojim morfološkim i fiziološkim

karakteristikama oba roda vrlo su slična. Jedan od pretpostavljenih načina

razlikovanja roda Achromobacter od roda Alcaligenes je njegova

sposobnost oksidacije glukoze i peritrihne flagele. Meñutim, opisani su i

76

nepokretni organizmi koji oksidiraju glukozu i neke druge šećere, te

pokretni organizmi koji ne oksidiraju laktozu. Rod Acinetobacter je Gram-

negativni organizam za kojeg je karakteristično grozdasto nakupljanje

stanica. Oksidaza je negativan, nepokretan, aeroban organizam.

4.1.1.3.2.4. Enterobacter

Rod Enterobacter pripada porodici Enterobacbacteriaceae. Zbog

ubikvitarnosti, Enterobacter je vrlo često prisutan u sirovom mlijeku.

Vrsta Enterobacter aerogenes može biti i fekalnog podrijetla. Neki sojevi

Enterobacter spp. imaju sposobnost stvaranja kapsule. Meñutim, premda

pripadaju psihrotrofnim mikroorganizmima, Enterobacter spp. bakterije

nisu dominante u populaciji koja se spontano razvija u mlijeku na

temperaturama nižim od 8°C.

4.1.1.3.3. Gram-pozitivne psihrotrofne bakterije

Gotovo svi Gram–pozitivni psihrotrofni mikroorganizmi povezani

s mlijekom su termorezistentni organizmi. Odnosno, termorezistentni

psihrotrofni mikroorganizmi su skupina bakterija koja preživljava

temperature pasterizacije, ne raste na tim temperaturama, a može rasti na

temperaturama od 4 do 7°C. Termorezistentne psihrotrofne bakterije

pripadaju sljedećim rodovima: Bacillus, Clostridium, Arthrobacter,

Microbacterium, Streptococcus, Micrococcus, i Corynebacterium. U

77

usporedbi s Gram-negativnim psihrotrofnim bakterijama, te bakterijske

rodove karakterizira prilično dugo generacijsko vrijeme i/ili dugačka log

faza. Osim rodova Bacillus i Clostridium, u mješovitoj populaciju sirovog

te kratko čuvanog ohlañenog mlijeka, kvantitativno termorezistentne

prsihrotrofne Gram-pozitivne bakterije imaju minorno značenje.

4.1.1.3.3.1. Bacillus i Clostridium.

Rodu Bacillus primarno stanište je tlo, premda može biti i široko

rasprostranjen u prirodi. U mlijeko i mliječne proizvode dospijeva zrakom,

vodom, životinjskom hranom i steljom. Od ukupno 60 različitih vrsta koje

pripadaju rodu Bacillus značenje za mljekarstvo u svojstvu uzročnika

kvarenja i/ili zdravstvenog rizika imaju vrste, B. cereus, B. subtilis, B.

stearothermophilus i B.coagulans.

Rod Clostridium je striktni anaerobni organizam kojega nalazimo u

različitim sedimentima, kao i u intestinalnom traktu ljudi i životinja. U

mlijeko dospijeva najčešće preko silaže ili fecesa. U svojstvu uzročnika

kvarenja sira najznačajnije su vrste: C. thermosaccharolyticum, C.

butyricum, C. tyrobutyricum i C. sporogenes. Premda rijetko, nažalost, sir

preko mlijeka može biti i izvorom izrazito za čovjeka patogene vrste C.

botulinum. Ovisno o proteolitičkom djelovanju i vrsti toksina, vrstu C.

botulinum čine četiri različite skupine sojeva: (a) proteolitički, A, B i F,

78

(b) neproteolitički, B, E i F, (c) proteolitički i neproteolitički, C i D, (d)

proteolitički, G. Svi toksini C. botulinum bakterija spadaju u skupinu

neurotoksina i imaju na čovjeka 100 000 puta jače djelovanje u odnosu na

najjači zmijski otrov. Meñutim, uzročnicima bolesti/trovanja ljudi

smatraju se sojevi C. botulinum A i B bakterija.

Zajedničke osobine rodova Bacillus i Clostridium: gram pozitivne

bakterije, pojedinačne stanice u obliku ravnih štapića koji mogu biti i

prilično veliki (0,3 -2,2 x1,2-7,0µm); dolaze pojedinačno, u parovima, ili u

lancima; stvaraju endospore otporne na toplinu i druge destruktivne

agense. Rod Bacillus stvara spore u aerobnim, a Clostridium u anaerobnim

uvjetima. Većina vrsta koje pripadaju rodu Bacillus su katalaza pozitivne,

a one koje pripadaju rodu Clostridium katalaza su negativne. Većina vrsta

rodova Bacillus i Clostridium ima sposobnost rasta na temperaturama

nižim od 4°C ali i na temperaturi od 50°C. Karakterizira ih i sposobnost

rasta u rasponu pH vrijednosti u mediju od 4,0-9,3, koncentraciji soli do

7% i aktivitetu vode od 0,92.

4.1.1.3.4. Skupina koliformnih mikroorganizama

Koliformni mikroorganizmi mogu se opisati kao Gram-negativni,

oksidaza negativni, ne-sporotvorni štapići koji mogu rasti aerobno na

čvrstom hranilištu koje sadrži žučne soli i fermentirati laktozu unutar 48

79

sati na temperaturi od 37°C uz stvaranje kiselina i plina. Premda nekoliko

rodova pripada koliformnim mikroorganizmima, u sirovom mlijeku

najčešće su prisutne bakterije vrsta: Enterobacter, Aerobacter,

Escherichia, Citrobacter i povremeno Klebsiella. U odnosu na

psihrotrofne bakterije, ove bakterijske vrste rastu sporije, ali znatno bolje

od mnogih drugih bakterija prisutnih u sirovom ohlañenom mlijeku.

4.1.1.3.4.1. Aerobacter

Bakterije roda Aerobacter su aerobni do fakultativno anaerobni

kratki Gram-negativni, pokretni ili nepokretni štapići. Pokretne vrste imaju

peritrihne flagele. Fermentiraju glukozu i laktozu uz stvaranje kiseline i

plina. Koncentracija na taj način stvorenog CO2 dva puta je viša od

koncentracije stvorenog H2.

4.1.1.3.4.2. Escherichia

Rod Escherichia sadrži samo jednu vrstu, E. coli. Bakterije su

oblikom kratki Gram-negativni pokretni ili nepokretni štapići. E. coli

fermentira glukozu i laktozu i neke druge šećere uz stvaranje mliječne,

octene i mravlje kiseline. Hidrolizom mravlje kiseline nastaju jednake

koncentracije plinova CO2 i H2. Sposobnost stvaranja različitih spojeva

80

fermentacijom šećera koristi se za razlikovanje E.coli od ostalih

koliformnih organizama ( IMViC reakcija -Metil Red, Voges-Proskauer i

Citrat)

4.1.1.3.4.3. Citrobacter

Vrste koje pripadaju rodu Citrobacter su Gram-negativni, aerobni, ili

fakultativno anaerobni organizmi koji ne tvore spore. Bakterije obično

koriste citrat za izvor ugljika, fermentiraju glukozu, laktozu i druge šećere

uz stvaranje kiselina i plina. Oksidaza su negativni, katalaza pozitivni,

metil red pozitivni, a Voges-Proskauer negativni organizmi. Taksonomski,

rod Citrobacter usko je povezan s rodovima Salmonella i Escherichia.

4.1.1.3.4.4. Klebsiella

Rod Klebsiella, kao i Citrobacter, Enterobacter te Escherichia

pripada porodici Enterobacteriaciae. Klebsiella spp. bakterije su Gram-

negativni nepokretni kratki štapići okruglih krajeva koji uglavnom dolaze

pojedinačno, stvaraju kapsulu. Aerobani su do fakultativno anaerobani

organizmi koji fermentiraju glukozu uz stvaranje kiseline.

81

4.1.1.3.5. Skupina termorezistentnih mikroorganizama

Pasterizacija mlijeka (72°C/4-15 sekundi) obično je dovoljna za

uništenje svih patogenih bakterija koje ne stvaraju spore. Meñutim, na

tim temperaturno/vremenskim uvjetima pasterizacije, termorezistentna

mikrobna populacija, ovisno o vrsti, preživljava izmeñu 10 do 100%.

Rodovi bakterija Micrococcus, Microbacterium, Streptococcus,

Lactobacillus, Enterococcus, i Corynebacteriun čine tu mikrobnu skupinu.

Termorezistentna skupina mikroorganizama općenito slabo raste u

ohlañenom mlijeku (<5°C) i jedino u velikom broju može uzrokovati

kvarenje mlijeka i mliječnih proizvoda. Meñutim, ti mikroorganizmi

povećavaju ukupan broj bakterija koji se koristi za standardizaciju

mikrobiološke kvalitete mlijeka za daljnju preradu. Povećanje ukupnog

broja bakterija uzrokovano je njihovom mezofilnom prirodom (rast u

temperaturnom rasponu od 20 do 45°C).

4.3. Higijenska kvaliteta sirovog mlijeka

Ukupnu kvalitetu sirovog mlijeka odreñuju kemijski sastav, fizikalna

svojstva i higijenska kvaliteta. Kemijska kvaliteta odreñena je

genetikom, pasminom, vrstom, hranidbom i menagmentom. Direktno ili

indirektno u pozitivnom ili negativnom smislu higijenska kvaliteta mlijeka

značajno utječe na njegovu kemijsku kvalitetu. Zbog toga nemoguće ih je

odvojeno promatrati.

82

Mlijeko u zdravom vimenu životinje sadrži zanemariv broj bakterija, što

se smatra prirodnom bakterijskom populacijom. Pravilnom i higijenski

ispravnom mužnjom u proizvodnim uvjetima, mlijeko sadrži u 1 mL

izmeñu 100 i 5000 bakterija i manje od 250000 somatskih stanica.

Suprotno, nehigijenskom mužnjom i nehigijenskim postupcima s

mlijekom nakon mužnje i u slučajevima bakterijske upale vimena ukupan

broj bakterija u mlijeku može biti i veći od 107 /ml. Bakterijska upala

vimena, istovremeno, uzrokuje značajno povećanje broja somatskih

stanica iznad fiziološke granice, a nastaje zbog imunološkog odgovora

organizma na upalni proces.

Postoje brojni kriteriji za procjenu higijenske ispravnosti mlijeka odnosno

neškodljivosti mlijeka i mliječnih proizvoda kao namirnice. Ukupan broj

bakterija i broj somatskih stanica u mlijeku, dogovorno su usvojeni kao

najefikasniji higijenski kriteriji na nacionalnoj i internacionalnoj razini.

Premda se primarno svi higijenski kriteriji temelje na principima

očuvanja zdravlja ljudske populacije. U tom smislu, sirovo mlijeko kao

osnovna sirovina za izradu mliječnih proizvoda, smatra se higijenski

ispravno kada ne sadrži:

• patogene mikroorganizme ili viruse

• mikroorganizme iz skupine zoonoza

• bakterijske toksine

• ekološke zagañivače

• ostatke lijekova

• mikroorganizme uzročnike kvarenja u količini koja može

promijeniti njegove fizikalno-kemijska osobine

83

• broj somatskih stanica iznad fiziološke granice

Kada kontaminacija mlijeka nije posljedica upale vimena, ili bolesti

životinje, ono se patogenim mikroorganizmima može kontaminirati

tijekom mužnje, hlañenja i transporta. Uzročnik je uvijek nedovoljna

higijena, neznanje ili nesavjesnost radnika. Meñutim, kontaminacija tim

mikroorganizmima može se dogoditi i usprkos svim higijensko -

sanitarnim mjerama tijekom i nakon mužnje. Tako su zbog konzumacije

mliječnih proizvoda posljednjih godina zabilježena i trovanja ljudi

ekstremno patogenim bakterijama L. monocytogenes i E.. coli O 157: H7

nažalost sa smrtnim posljedicama. Zbog toga, kao obvezna mjera u

sprečavanju njihovog širenja, preporuča se povremena nasumična kontrola

prisutnosti patogenih mikroorganizama u sirovom mlijeku.

4.3.1. Zoonoze

Zoonoze su bolesti koje se prenose s životinje na čovjeka i s čovjeka

na životinje. U proizvodnji mlijeka, zahvaljujući zakonskoj legislativi one

su izuzetno rijetke. Prema tim propisima, mlijeko se može stavljati u

promet samo onda kada su ispunjeni slijedeći uvjeti:

• muzne životinje moraju biti pod stalnim veterinarskim nadzorom

• muzne životinje moraju biti slobodne od tuberkuloze i bruceloze

(službena potvrda)

• muzne životinje ne smiju pokazivati simptome bilo koje

infekcije koja se mlijekom može prenositi na čovjeka

84

• muzne životinje ne smiju imati infekcije genitalnog trakta sa

sekrecijom ili imati probavne infekcije s proljevima, temperaturu ili

klinički mastitis

• muzne životinje ne smiju imati oštećeno vime koje može postati

izvorom kontaminacije mlijeka

U slučaju kada je kod jedne ili kod svega nekoliko životinja utvrñena

tuberkuloza (zoonoza) u inače zdravom stadu, zakon dozvoljava njegovu

upotrebu tek nakon provedene visoke pasterizacije (≥80°C) sirovog

mlijeka.

4.3.2. Ekološki kontaminenti i ostaci lijekova

Ekološki kontaminenti u mlijeku su: pesticidi, teški metali,

nemetali, te ostaci sanitacijskih sredstava. Pod pojmom ostaci lijekova

smatraju se ostaci koji zaostaju u mlijeku nakon liječenja životinja.

Razina dozvoljenih ekoloških kontaminenata i ostataka lijekova u mlijeku

u svakoj zemlji regulirana je zakonskim propisima.

4.3.3. Somatske stanice

Somatske stanice prirodni su sastojak mlijeka čija je razina u

mlijeku prvenstveno odreñena pasminom, te periodom i brojem laktacija.

Tako se prosječnim fiziološkim brojem somatskih stanica u kravljem

mlijeku smatra njihova razina od 50 000-250 000 /mL, u kozjem od 1 000

000 do 1 500 000 /mL, a u ovčjem do 1 000 000/mL. U zdravoj mliječnoj

85

žlijezdi somatske stanice čine leukociti i epitelne stanice. Od leukocita ,

najvećim dijelom zastupljeni su makofazi (35-79%) slijede linfociti (16-

28%) i polimorfonuklearni neutrofili (3-26%). Od ukupnog broja vrsta

stanica, epitelne stanice koje nastaju od alveola, mliječnih kanalića i

cisterne vimena u procesu sinteze mlijeka čine 2-15%. U slučajevima kada

se na bilo koji način dogodi infekcija mliječne žlijezde broj somatskih

stanica u mlijeku značajno se povećava iznad fiziološke razine. Povećanje

broja somatskih stanica posljedica je prelaska leukocita iz krvi u mliječnu

žlijezdu kao imuni odgovor na upalni stimulans. Osim toga, povećanje

broja somatskih stanica mijenja i omjer vrsta stanica, te razina

polimorfonuklearnih neutrofila može biti i do 90%. Indirektno, povećanje

broja somatskih stanica iznad fiziološke granice povezano je s

promjenama u sekreciji i kemijskom sastavu mlijeka, fizikalnim,

bakteriološkim i tehnološkim osobinama mlijeka. Do značajnijih promjena

kvalitete sirovog mlijeka dolazi kada je broj somatskih stanica veći od 250

000/mL, a do izražajnijih kada je veći od 750 000/mL. U mlijeku s

povećanim brojem somatskih stanica Zato je broj somatskih stanica u

mlijeku meñunarodno priznati pokazatelj zdravstvenog stanja vimena.

Skupno sirovo kravlje mlijeko prema tim kriterijima ne smije sadržavati

više od 400 000 somatskih stanica/mL.

Najčešći uzročnici upale vimena su patogeni mikroorganizmi,

prvenstveno Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae,

Streptococcus spp. (uberis, pyogenes, dysgalactiae). Rjeñi su uzročnici:

Corynebacterium bovis, koagulaza-negativni stafilokoki, Mycobacterium

bovis. Predispozicije za nastanak upale su genetske (nepravilna graña),

fiziološke (hranidba, hormonalni poremećaj), bolesti (ozljeda kože, loše

86

zdravstveno stanje muzare), vanjski utjecaji (nepravilnosti tijekom

mužnje). Infekcija vimena patogenim mikroorganizmima dogaña se

njihovim ulaskom kroz sisni kanal (galaktogeno), preko ozlijeñene kože

(limfogeno) i krvlju (hematogeno). Upale se javljaju u kliničkom (3-5%) i

subkliničkom obliku (95-97%) kada simptomi bolesti nisu vidljivi. Prema

trajanju one mogu biti akutne (do 7. dana) subakutne (do 14.dana) i

kronične (više od 14. dana). S tehnološkog gledišta, za preradu mlijeka,

značenje ima jedino subklinički oblik mastitisa kod kojeg nema vidljivih

promjena u mlijeku. Osim toga, velik broj sojeva stafilokoka ima

sposobnost stvaranja ekstracelularnih termostabilnih enterotoksina, koji

svoju biološku aktivnost zadržavaju i nakon toplinske obrade mlijeka.

Broj rezistentnih sojeva na primjenu antibiotika u liječenju mastitisa

takoñer se povećao na približno 70%. Zato, mlijeko infektivnog vimena,

ovisno o uzročniku, može sadržavati i do 108 bakterija /mL.

Ujedno, upala vimena još uvijek je najskuplja bolest mljekarske

industrije. Najveći dio troškova (~70%) odnosi se na smanjenu

proizvodnju mlijeka, a ostatak na nekvalitetno mlijeko (~11%), izdatke za

obnovu stada (~8%), umanjenu tržnu vrijednost grla (~4,9%), izdatke za

lijekove (~3,2%), povećane troškove rada (~1,9%) i usluga (~1,7%).

4.3.4. Ukupan broj bakterija

Ukupan broj bakterija (UBB) predstavlja direktnu kontaminaciju

mlijeka bakterijama tijekom proizvodnje. Meñutim UBB nije indikacija

izvora i vrste mikrobne kontaminacije, niti ukazuje na pogreške u

87

proizvodnji koje su uvjetovale visoku razinu kontaminacije. Prema

meñunarodno prihvaćenom standardu UBB pokazatelj je higijenskih

uvjeta u proizvodnji mlijeka. Broj bakterija u mlijeku veći od 100

000/mL pokazatelj je ozbiljnih pogreška tijekom i nakon mužnje.

Bakterije u sirovom mlijeku, za potrebe vlastitog metabolizma razgrañuju

pojedine i/ili istovremeno više sastojaka mlijeka. Na taj način umanjena je

nutritivna i tehnološka vrijednost mlijeka, ili je u ekstremnim slučajevima

sirovo mlijeko u potpunosti neiskoristivo za daljnju preradu. U većini

zemalja odreñivanje ukupnog broja bakterija u sirovom mlijeku, provodi

se u prvom redu radi svrstavanja mlijeka u odreñeni bakteriološki razred,

na osnovi kojeg se korigiraju cijene mlijeka. Stoga je utvrñivanje ukupnog

broja bakterija u mlijeku klasičnom metodom na Petrijevim zdjelicama

osnovna metoda prosuñivanja njegove bakteriološke kvalitete. Metoda se

temelji na činjenici da jedino žive bakterijske stanice mogu rasti na

pogodnom mediju i tvoriti vidljive kolonije koje se mogu brojiti. Kolonije

nastaju umnažanjem jedne ili nakupine stanica, a sastoji i od nekoliko

milijuna organizama. Bilo koji stanični ekstracelularni materijala, ako ga

stanica tvori takoñer je sastavni dio kolonije. Kada stanica dosegne

stacionarnu fazu rasta, ona prestaje rasti i kolonija postaje vidljiva. Oblik,

veličina i boja kolonije species su karakteristični. Klasična metoda

utvrñivanja ukupnog broja bakterija u mlijeku odabrana je za

referentnu, te je metoda standardizirana na meñunarodnoj i nacionalnoj

razini (FIL-IDF 100B:1991.; HRN ISO 6610: 2001.). Ostale bakterijske

skupine koje su sadržane u ukupnom broju bakterija u mlijeku, mogu se

izbrojiti njihovim selektivnim izdvajanjem. Na primjer, psihrotrofne

bakterije - inkubacijom istog hranilišta na temperaturi od 5-7°C /10 dana,

88

a termorezistente bakterije - laboratorijskom pasterizacijom istog uzorka

mlijeka.

Utvrñivanje broja psihrotrofnih, termorezistentnih, sporotvornih,

koliformnih ili nekih drugih, kao dopunu u otkrivanju izvora bakteriološke

kontaminacije mlijeka, s većom ili manjom točnošću može biti korisno.

Meñutim, ti dodatni testovi nepraktični su u svakodnevnoj praksi, te ih

mljekarska industrija koristi za savjetovanje, istraživanja i nadzor

proizvodnje mlijeka.