• NUKLEINSKE KISELINE

• GENI I HROMOSOMI

• GENI I ENZIMI

• MOLEKULA DNK NOSITELJ GENETIČKE INFORMACIJE

• GENETIČKI KOD

1872. godine Fridrih Mišer je prvi put izolovaonukleinske kiseline. Ime su dobile po jedru ( lat. nucleus ).

Hipoteza : 1 gen – 1 enzim. Danas znamo dase mnogi enzimi sastoje od više polipeptida, pa je TRENUTNO PRIHVAĆEN OBLIK OVE HIPOTEZE ( svaki gen određuje strukturu jednog polipeptidnog lanca ).

Prvi eksperimentalni dokaz da je DNK nosilac nasljednih informacija, objavljen 1944. godine od strane američkog mikrobiologa Osvalda Ejverija ( desetogodišnja istraživanja na bakterijama Streptococcus pneumoniae ).

Prijenos genetičke informacije pomoću DNK

Direktan dokaz da se i virusni geni sastoje od DNK dobili su 1952. godine Herši i Čejz iz eksperimenta sa bakteriofagima T2, koji inficiraju bakteriju Esherichia coli.

Eksperiment kojim je dokazano da je DNK virusa nosilac nasljednih informacija

Braše i Karperson su pokazali da je količina DNK u nukleusu svih stanica jedne biološke vrste STALNA ( ne mijenja se čak ni u uslovima drastičnog gladovanja ). Mirski i Riz su to potvrdili citohemijskim analizama hromosoma.

1953. godine Votson i Krik su objavili modelsekundarne strukture DNK.

FIZIČKO HEMIJSKA STRUKTURA I GRAĐA NUKLEINSKIH KISELINA ( NK )

NK ( DNK i RNK ) su polimeri čija je osnovna jedinica građe nukleotid – sastoji se od 1 molekule azotne baze, 1 molekule pentoze i 1 molekule fosfatne kiseline. NK sadrže dva tipa azotnih baza: purinske i pirimidinske. Purinske baze ( purini ): adenin i guanin, a pirimidinske ( pirimidini ): timin, citozin i uracil.

U sastavu DNK mogu se naći A, G, T i C, a u sastavu RNK A, G, U i C. Pentoza koja ulazi u sastav DNK je dezoksiriboza, dok se u RNK nalazi riboza.

Purinske i pirimidinske baze koje se nalaze u sastavu NK

Kovalentna veza nastaje između između ugljikova atoma u položaju 1’ kod šećera i azotnog atoma u položaju 1’ pirimidina, tj. 9’ kod purina

Nukleozid – jedinjenje koje nastaje od azotne baze i pentoze. Azotne baze i šećeri u nukleozidu su vezani N – glikozidnom vezom između N9 purina ( odnosno N1 pirimidina ) i C1 šećera. Nukleozidi u NK su: adenozin ( adenin + riboza ); dezoksiadenozin( adenin + dezoksiriboza ); guanozin ( guanin + riboza ); dezoksiguanozin ( guanin + dezoksiriboza ), citidin (citozin + riboza ), dezoksicitidin ( citozin + dezoksiriboza ), uridin ( uracil + riboza ), dezoksitimidin ( timidin + dezoksiriboza ).

Nukleotidi su estri nukleozida i fosforne kiseline. Okosnicu molekula NK čine pentoze i fosfatne grupe. Na jednom kraju molekula ostaje slobodna C3 hidroksilna grupa i taj kraj se naziva 3´ kraj, a na drugom C5 fosfatna grupa i taj kraj se naziva 5' kraj molekule.

Nukleotidi u sastavu DNK (u zagradama su date uobičajene skraćenice kojima se obilježavaju pojedini nukleotidi.

Uracil

Nukleotidi u sastavu RNK (u zagradama su date uobičajene skraćenice kojima se obilježavaju pojedini nukleotidi

A

B

Hemijski sastav DNK. Slika prikazuje dio polinukleotidnog lanca (A) i produkte njegove hidrolize (B).

Lanac DNK

Na jednom kraju molekule ostaje slobodna C5’ fosfatna grupa

C3’ hidroksilna grupa

Fosfatna grupa je esterskom vezom vezana za C5’ pentozu

U zavisnosti od azotne baze koja učestvuje u izgradnji DNK molekule, razlikuju se 4 nukleotida ( adeninski, guaninski, citozinski i timinski ).

1950. godine Čargafovim pravilima prokrčen je put saznanju da se genetička specifičnost jedne vrste zasniva na redoslijedu nukleotida, tj. na primarnoj strukturi DNK ( varijabilnost primarne strukture DNK je ogromna ).

Genetička specifičnost svake biološke vrste počiva na broju i redoslijedu nukleotida u primarnoj strukturi DNK.

U DNK lancu su 2 komplementarna polinukleotidna lanca. Parovi baza ( azotnih ) su povezni sa vodoničnim vezama. Između A i T postoje 2 vodonične veze ( A = T ), a između guanina i citozina 3( G ≡ C ).

Vrlo brzo nakon upoznavanja primarne i sekundarne strukture DNK, postalo je jasno da je genetička informacija u DNK smještena u šifrovanom obliku.

Osnovu sekundarne strukture DNK ( po Votsonu i Kriku ) čini desnogrina dvolančana zavojnica, koja je antiparalelna, što znači da se naspram 5' kraja jednog lanca nalazi 3' drugog i obratno.

Struktura proteina određena je strukturom DNK.

ULOGA DNK – GENETIČKI KOD

Jedan od osnovnih početnih zadataka molekularne biologije je bio da objasni na koji način se struktura DNK prevodi u strukturu proteina.

Proteini se sastoje od 20 aminokiselina, a NK od samo 4 nukleotida. Jasno je da različite grupe od nekoliko nukleotida predstavljaju šifre ( kodove, kodone ) za različite aminokiseline.

Danas znamo da su sve informacije potrebne za samostalnu reprodukciju ćelije sadržane u njenim GENIMA, odnosno u DNK.

Uprošćen shematski prikaz procesa sinteze proteina

Tako, broj različitih grupa od po 3 nukleotida ( tripleta ) koja mogu da sačine 4 nukleotida iznosi 43 = 64 ( to je više nego što je potrebno za šifrovanje 20 aminokiselina.

Najveći doprinos teoriji šifrovanja genetičkih informacija dala su istraživanja Frensisa Krika na mutantima bakteriofaga T4.

Genetički dokaz tripletnog koda

baze-slovo,triplet-riječ,proteinska molekula-

rečenica

Rekonstruisan je proces sinteze proteina u epruveti i razvijeni su bezstanični, in vitro, sistemi za sintezu proteina. Takav eksperimentalni pristup je omogućio da se dešifruje genetički kod, tj. za svaku od 20 aminokiselina nađe odgovarajući triplet nukleotida.Naprimjer, u in vitro sistemu kao matrica korišten je poly–U ( polimer sastavljen od uridin monofosfata kao monomerne jedinice ).

Triplet UUU kodira fenilalanin

In vitro prevođenje sintetičke RNK koja se sastoji od ponavljajućih uracila (U kalup) rezultira sintezom polipeptida koji se sastoji samo od fenilalanina.

Dobijen je polipeptid sastavljen od samo 1 aminokiseline – fenilalanina. – znači triplet UUU predstavlja šifru za fenilalanin. Slično i AAA – predstavlja kodon za lizin, a CCC za prolin.

Nađeno je ukupno 64 kodona, 61 služi za šifrovanje ( kodiranje ) pojedinačnih aminokiselina. Preostala 3 kodona, UAA,UAG i UGA su nazvani besmislenim kodonima ( nonsense codons ), jer je ustanovljeno da ne odgovaraju ni jednoj aminokiselini, to su « STOP signali », tj. mjesta na kojima prestaje ugrađivanje aminokiselina u polipeptidni lanac.

« START signal « ujedno je kodon za metionin AUG, tj. mjesto od kojeg započinje čitanje iRNK, GUG kodon za valin kod bakterija često ima ulogu «start signala».

4 kodona za aminokiselinu alanin ( Ala )2 kodona za histidin ( His )6 kodona za serin ( Ser )1 kodon za metionin ( Met ) i triptofan ( Trp ).

Kodoni koji kodiraju istu aminokiselinu često su vrlo slični i najčešće se razlikuju samo u trećem nukleotidu.

Svi se organizmi služe istim genetičkim kodom ( što je čvrst dokaz da su se sve današnje stanice razvile od istog pretka ).

Iznimka je genetički kod mitohondrija.

Maršal Nirenberg ( M. W. Nirenberg ), Čarls Janofski ( C. Janofsky ) i Vitman ( H.G. Wittman ) sa saradnicima, razjasnili su tokom sedme decenije XX stoljeća PRIRODU GENETIČKOG KODA I KODONA.

Genetički kod obuhvata cijeli program po kojem se genetička informacija zapisana u DNK ( kod nekih virusa RNK ) prepisuje u iRNK i služi kao matrica za sintezu polipeptidnog lanca.

Osnovnu jedinicu genetičkog koda čini jedna od 4 azotne baze koje ulaze u sastav nukleotida.

Značenje prepisane genetičke informacije (šifre, koda) u molekuli iRNK

Većina aminokiselina ( njih 18 ) može da se obrazuje pod kontrolom većeg broja ( 2 do 6 ) različitih kodova, odnosno kodona. Ova pojava se naziva IZROĐENOST ( degenerativnost, sinonimnost ) genetičkog koda, odnosno kodona.

Izrođenost omogućava veću stabilnost genetičkog sistema ( jer svaka genetička promjena azotne baze, odnosno nukleotida DNK – genska mutacija, ne mora da dobije svoj fenotipski izraz ).

SEKUNDARNA STRUKTURA DNK

Struktura DNK može biti primarna, sekundarna i tercijarna. Primarna određuje broj i redoslijed nukleotida u jednom lancu. Sekundarna struktura DNK se sastoji od dva vrlo duga, originalna lanca nukleotida ( polinukleotida ) DNK, koji su komplementarni među sobom i povezani vodoničnim ( H ) vezama. Tercijarna struktura DNK je superspiralizovana ( mnogo puta ispresavijana tako da može da se smjesti u veoma mali prostor jedra u stanici, a da pri tome ostane funkcionalno sposobna ).

Struktura molekule DNK

Osnovu sekundarne strukture DNK poVotsonu i Kriku čini DESNOGIRA DVOLANČANA ZAVOJNICA. Dva polinukleotidna lanca koja čine ovu zavojnicu su ANTIPARALELNA ( što znači da se naspram 5' kraja jednog lanca nalazi 3' kraj drugog i obratno ). Prečnik dvostruke spirale je isti cijelom dužinom i iznosi 2 nm ( 20 A ). SVAKI ZAVOJ SPIRALE sadrži 10 parova nukleotida. Lanci su uvijeni jedan oko drugog, tako da se duž dvolančane spirale prostiru DVA SPIRALNO UVIJENA ŽLIJEBA, od kojih jedan ima veću dubinu i širinu ( VELIKI ŽLIJEB ) od drugog ( MALI ŽLIJEB ). Okosnicu spirale čine fosfatne grupe zajedno sa PENTOZAMA okrenute prema SPOLJAŠNJOJ STRANI ( 3',5' – fosfodiesterske veze ). 2 lanca povezana H vezama koje se formiraju između naspramnih baza. Hod zavojnice ima dužinu 3,4 nm.

Dvolančana zavojnica DNK

Sekundarna struktura je polimorfna. Najpoznatija, najstabilnija i najzastupljenija sekundarna struktura DNK je Votson-Krikova dvolančana spirala ( B spirala – zavojnica ). Postoje tri familije zavojnica A, B i Z.

POLIMORFNOST SEKUNDARNE STRUKTURE DNK

STRUKTURA I FUNKCIJA RNK

S obzirom na veličinu ( broj nukleotida ), građu, funkciju i mjesto gdje se nalaze, razlikuje se više tipova RNK. To su:

Informaciona RNK ili «messenger» RNA (iRNK ili mRNK).

Ribozomalna RNK ili ribozomna RNK ( r RNK=rRNK ).

Transportna RNK ili rastvorljiva RNK ili «transfer RNA» ili «solubile» RNA ( t RNK).

Virusna RNK ili viralna RNK ( vRNK=vRNK ).

iRNK, rRNK i tRNK proizvodi su DNK ( gena ) u stanici. Sintetiziraju se u jedru, na određenim dijelovima DNK u toku interfaze staničnog ciklusa, a zatim ulaze u citoplazmu.

Informaciona RNK

Nukleotidi iRNK su komplementarni po sastavu sa odgovarajućim nukleotidima DNK. Molekula iRNK u stanici je jednolančani polimer, sagrađen od velikog broja nukleotida ( porastom broja nukleotida raste po pravilu broj zapisanih informacija, a time i mogućnost sinteze dužih polipeptidnih lanaca ).Struktura prokariotske i eukariotske iRNK je složena i razlikuje se u nekim bitnim detaljima.

Struktura prokariotskih iRNKiRNK u prokariotskim stanicama koje nose informaciju za sintezu više od jednog lanca nazivaju se policistronskom RNK ( ima i onih koje su monocistronske ). Sve prokariotske iRNK imaju neke zajedničke strukturne karakteristike.

Čeoni niz – varira po dužini od nekoliko desetina do nekoliko stotina nukleotida. Sadrže jedan karakterističan TETRANUKLEOTID, tzv. ŠAJN-DALGARNOV NIZ( GGAG ili AGGA ), koji je komplementaran sa 3' krajem i ima ulogu da veže iRNK za MALU SUBJEDINICU ribosoma. Dalje od START kodona ( AUG ili GUG ) nalazi se KODIRAJUĆI NIZ ( u kome se nalaze TRIPLETI NUKLEOTIDA koji predstavljaju šifru za određenu amino kiselinu ). Kodirajući niz se završava STOP KODONOM ( UAA, UAG ili UGA ), a iza STOP kodona se nalazi niz nukleotida koji se ne prevode ( dužina niza varira )čeoni niz.

Opća struktura prokariotskih (A) i eukariotskih (B) iRNK

STRUKTURA EUKARIOTSKE iRNK

Eukariotske iRNK, za razliku od bakterijskih , UVIJEK SU MONOCISTRONSKE ( nose informaciju za sintezu samo jednog polipeptidnog lanca ). Na njihovom 5' kraju se nalazi karakteristična struktura 5' KAPA, a na 3' kraju se nalazi POLI ( A ) rep ( niz od 100 – 200 ADENINSKIH nukleotida ). Između 5' kape i START kodona ( AUG ) koji predstavlja SIGNAL za POČETAK prepisivanja – transkripcije, nalazi se ČEONI NIZ koji se ne prevodi. Kodirajući niz počinje sa prvim START kodonom nizvodno od 5' kape, a završava sa jedan ili više STOP kodona ( UAA, UAG ili UGA ) iza kojih se ponovo nalazi nekodirajući niz, a zatim poli ( A ) rep.

Virusna RNK ( vRNK )

vRNK je jednolančana i kod mnogih biljnih virusa i nekih bakteriofaga, te kod nekih životinjskih virusa nosi genetičku informaciju umjesto DNK. Zatvorena je proteinskim omotačem.

Duga je od 102 do 104 nukleotida. VRNK virusa mozaika duhana ( TMV ) sastoji se od 6 – 7 x 103 nukleotida, a njena masa iznosi 2,2 x 106 Daltona.

Transportne RNK

Uključene su u niz INTERAKCIJA U PROCESU TRANSLACIJE ( interreaguju sa određenim mjestima na ribosomu, sa aminokiselinama, enzimima aminoacil-tRNK sintetaza, iRNK, faktorima inicijacije i elongacije translacije ).

Odlikuju se trodimenzionalnom strukturom, koja je takva da im omogućava da ostvare sve ove funkcije.

Manje je složena od iRNK. Sadrži 74 do 95 nukleotida, ima relativno malu molekulsku masu ( 20 000 do 30 000 Da ). U stanici je tRNK zastupljena sa 10 – 15 % od ukupne količine RNK. P e t r o v i ć ( 1992 ) navodi da se u bakterije E. coli nalazi najmanje 40 različitih tRNK, a u stanicama eukariota 60 različitih tRNK .

tRNK ima ADAPTERSKU ULOGU između iRNK i odgovarajuće aminokiseline. Sve tRNK koje pokazuju specifičnost prema jednoj aminokiselini nazivaju se IZOAKCEPTORSKIM tRNK.

VEZIVANJE aminokiselina za odgovarajuće tRNK KATALIZIRAJU enzimi aminoacil tRNK sintetaza.

Struktura tRNK može biti : primarna, sekundarna i tercijarna.

Primarna struktura tRNK

U primarnoj strukturi tRNK nalaze se tipične ( osnovne ) azotne nukleotidne baze ( adenin, guanin, uracil i citozin ) i MODIFIKOVANE BAZE. tRNK su jedinstvene među ostalim RNK i po tome što sadrže tzv. NEOBIČNE, tj. MODIFIKOVANE BAZE, koje nastaju modifikovanjem uobičajenih baza i to poslije ugrađivanja u polinukleotidni lanac.Prema G. Matiću ( 1997 ) u tRNK mogu da se nađu slijedeće modifikovane baze: RIBOTIMIDIN,DIHIDROURIDIN, PSEUDOURIDIN, TIOURIDIN, 3-METILCITIDIN, INOZIN, KJUOZIN, VIOZIN, 7 – METILGUANOZIN itd.

Modificirane baze u tRNK

Do sada je nađeno 50 različito modifikovanih NUKLEOZIDA u raznim tRNK ( reakciju modifikovane baze kataliziraju specifični enzimi ).

NEPROMJENJIVA karakteristika primarne strukture tRNK je prisustvo nekih modifikovanih baza na određenim pozicijama u lancu tRNK.

Sekundarna struktura tRNK

Obrazuje se uspostavljanjem vodoničnih ( H ) veza između komplementarnih azotnih baza u istom ( jednom ) polinukleotidnom lancu RNK.

Ova struktura dobiva oblik trolisne djeteline. Molekul sadrži 4 KRAKA, od toga 3 kraka imaju po jedan dvolančani segment ( drška ) i jednolančanu petlju.

AKCEPTORSKI KRAK ne sadrži PETLJU .

I Akceptorski krak ne sadrži petlju se sastoji od 7 komplementarnih parova baza i jednolančanog niza od 4 nukleotida ( na 3' kraju lanca ). Na ovom kraju svake tRNK nalazi se triplet ( 5' - CCA – 3' ) za koji se vezuje aminokiselina.

II T krak ( ili TΨC krak ) se sastoji od 5 bp i petlje od 7 nukleotida (tu se nalazi i triplet TΨC po kome je ovaj krak dobio ime).

III ANTIKODONSKI KRAK sadrži 5 parova nukleotida u «Drški» i 7 nukleotida u petlji( u njegovoj sredini se nalazi ANTIKODON, tj. triplet nukleotida komplementaran kodonu u iRNK ).

IV D KRAK ( ili DIHIDROURIDINSKI KRAK ) sadrži dvolančani segment od 3-4 bp i PETLJU od 8-12 nukleotida ( među njima se nalazi modifikovana baza dihidrouridin ).

Sekundarna struktura tRNK

Tercijarna struktura tRNK

Prva ispitana tRNK bila je tRNK za fenilalanin iz kvasca. Tercijarna struktura tRNK obrazuje dvije spirale ( zavojnice ) koje stoje pod PRAVIM UGLOM i stvaraju PROSTORNI oblik sličan slovu L.

Tercijarna struktura tRNK

Tercijarne H-veze najviše se formiraju u predjelu T i D petlje. Pretpostavlja se da je tercijarna struktura u rastvoru u prisustvu proteina podložna promjenama. I ovdje H-veze igraju ključnu ulogu. One održavaju tercijarnu strukturu između baza koje nisu sparene u sekundarnoj strukturi.

Akceptorski i T krak formiraju jednu spiralu, a antikodonski i D krak drugu spiralu.

Struktura fenilalanil-tRNK

Otvorena forma lista djeteline

Smotana forma

molekule

Prostorni model

Ribozomalna RNK ( rRNK ), ribozomna, ribozomska RNK

Sastavni dio ribozoma ( strukturna komponenta ribozoma ).

Uglavnom se nalazi u citoplazmi. rRNK čini 80 do 85 % ukupne RNK u stanici. Svaka biološka vrsta se odlikuje specifičnim rRNK.

rRNK je različite dužine ( zavisi od porijekla i veličine subjedinica ribozoma – dvije subjedinice . mala i velika – svaka sadrži odgovarajuće rRNK ).

U ribozomima se odvija povezivanje AMINOKISELINA PEPTIDNIM vezama u polipeptidne lance.

Denaturacija DNK

Pod denaturacijom se podrazumijevaNARUŠAVANJE sekundarne strukture DNK ( dolazi do RAZDVAJANJA dvolančane molekule DNK dva polinukleotidna lanca – oba prelaze u klupčasti, slučajnoispresjecan oblik bez uređene sekundarne strukture ).

Denaturacija u in vitro uslovima se može postići PRIMJENOM povišene temperature, promjenom pH rastvora itd.

Tačka topljenja dvolančane DNK zavisi od:

•Baznog sastava•Rasporeda nukleotida u lancu•Postotka ispravno sparenih baza

Renaturacija DNK ( oporavak ) je ponovno spajanje komplementarnih lanaca DNK ( pod odgovarajućim uslovima ).

Replikacija DNK

Replikacija genomske DNK je ključna za život svih stanica i organizama. ZAŠTO? Osnovni biološki proces razmnožavanja zahtijeva vjerni prijenos genetičke informacije sa roditelja na potomstvo.

Svaki put kada se stanica dijeli, njezin cjelokupni genom mora biti udvostručen, pri čemu je za kopiranje velikih molekula iz DNK ( koje grade prokariotske i eukariotske hromosome ) potrebna prisutnost cijelog niza ENZIMA.

Replikacija je SEMIKONZERVATIVAN proces, u kojem svaki roditeljski lanac služi kao kalup za sintezu novih, komplementarnih lanaca kćeri.

Dva se lanca roditeljske DNK razdvajaju i svaki od njih služi kao kalup za sintezu po jednoga novoga lanca. Na taj način nastaju dvije nove, potpuno identične molekule DNK. Slijed nukleotida u novonastalim lancima DNK određen je komplementarnim sparivanjem baza.

Semikonzervativna replikacija DNK

Glavni enzim uključen u ovaj proces je DNK-POLIMERAZA, koja katalizira spajanje deoksiribonukleozid – 5' trifosfata ( dNTP ) rastućeg lanca DNK. Ipak, replikacija DNK je znatno kompleksnija i zahtijeva više od jedne enzimatske reakcije.

Udvajanje ( duplikacija, replikacija, matična sinteza ) molekuke DNK je proces nastajanja ( u prisustvu odgovarajućih enzima ) dva molekula DNK koji su identični izvornom molekulu DNK.

Dokaz da se replikacija odvija na semikonzervativan način potvrdili su 1958 godine Mezelson i Stal ( M. Messelson i F. W. Stahl ).

Koristili su metodu centrifugiranja DNK u gradijentu gustine cezijumhlorida ( CsCl ).

Eksperimentalni dokaz semikonzervativne replikacije DNK

Gajili su bakteriju E. coli u podlozi kojoj su dodali radioaktivni obilježeni azot ( dušik ), teški izotop azota 15N – NH4Cl, koji se ugrađivao u lance DNK u toku replikacije, tako da je ova DNK imala veću gustinu od normalne. Zatim su prenijeli bakterije u «laku» podlogu koja je kao izvor azota sadržavala 14N - NH4Cl i gajili ih u toku nekoliko generacija. Rezultat ovog eksperimenta je:

DVOLANČANA DNK KĆERKI ĆELIJA JE HIBRIDNA, SADRŽI JEDAN RODITELJSKI ( «TEŠKI» ) I JEDAN NOVI ( «LAKI» ) LANAC.

Opći pregled replikacije

Molekuli DNK su, čak i kod vrlo jednostavnih organizama veoma dugački, naprimjer genom virusa SV 40 se sastoji od jedne molekule DNK koja sadrži 5,1 kb ( 1 kb = 1 kilobaza = 1 000 nukleotida ) i ima dužinu od 1,7 µm, genom faga T2 sadrži 166 kb i ima dužinu 56 µm.

Bakterijski genom ( E. coli ) sadrži ( također se sastoji od jednog molekula DNK ) 4 000 kb i ima dužinu 1360 µm.

Humani genom ( HAPLOIDNI ), a zna se da svaki hromosom sadrži po jedan molekul DNK, se sastoji od oko 3 milijarde bp ( baznih parova ) i ima dužinu od oko 1 m. DNK mnogih ćelija ( npr. E. coli ) su kružnog oblika ( termin kružni koristi se da bi se istaklo da je molekul ZATVOREN, a ne da bi se opisao stvarni oblik molekule ).

DNK bakterije E. coli u toku replikacije izgleda kao zatvorena kružna linija s unutrašnjom petljom i podsjeća na grčko slovo θ ( teta ), tako da roditeljski lanci nisu u potpunosti razdvojeni.

Mjesta na hromosomu na kojima se replikacija odvija imaju oblik slova « Y « i nazvana su replikaciona viljuška.

Danas se zna da je replikativna viljuška asimetrična. Oba lanca se sintetišu u smjeru 5' 3' i istovremeno, s tim da se jedan sintetiše kontinuirano ( vodeći lanac ), a drugi diskontinuirano, u vidu fragmenata koji se naknadno povezuju usljed čega se završava sa zakašnjenjem ( lanac koji zaostaje ).

Dakle, REPLIKACIJA je i semikonzervativni proces

Replikativna viljuška

Replikacija vodećeg ( direktnog ) lanca DNK ( engl. leading strand ) teče NEPREKIDNO ( kontinuirano ), dok se replikacija zaostajućeg lanca DNK ( eng: lagging strand ) odvija sa prekidima ( diskontinuirano ) i sporije.

Replikacija zaostajućeg lanca odvija se POSREDNO ( indirektno ) – nastaje povezivanjem OKAZAKIJEVIH fragmenata ( R.T. Okkazaki i saradnici, 1968 ).

OKAZAKIJEV fragment je dio DNK, tj. kratki lanci novosintetizirane DNK ( dužine 1 000 – 2 000 nukleotida kod bakterija, odnosno 100 – 200 nukleotida kod eukariota ).Kao početna matrica za sintezu Okazakijevih fragmenata služi molekula RNK sa prajmerom.

ENZIMI REPLIKACIJE

Učestvuje oko 20-ak enzima i drugih proteina.

Enzim koji katalizira fosfodiestersko povezivanje nukleotida u smjeru 5' – 3' je DNK polimeraza I ili Konbergov enzim. Ovaj enzim zahtijeva postojanje začetnika ili PRAJMERA ( eng. primer ) u vidu kratkih polinukleotidnih lanaca komplementarno sparenih sa lancem – matricom.

Enzim dobija instrukcije za sintezu novog lanca DNK od matrice. Pored polimerazne, posjeduje i egzonukleaznu aktivnost u oba smjera, 3' – 5' i 5' – 3'.

Kod bakterija DNK polimeraza I - kao egzonukleaza uklanja prajmere ( kada više nisu potrebni ), a kao polimeraza popunjava praznine nastale njihovim uklanjanjem.

Enzimi DNK polimeraza II i III su slični DNK polimerazi I – katalizuju sintezu DNK u smjeru 5' – 3' i to samo u prisustvu lanca matrice i prajmera. Egzonukleazna aktivnost im je samo u smjeru 3' – 5'. DNK polimeraza III može da ugradi više hiljada nukleotida u novi lanac ( prije nego se odvoji od matrice – ugrađuje 1 000 nukleotida / sec. ), a DNK polimeraza I ugrađuje 10 nukleotida / sec. DNK polimeraza III obavlja sintezu najvećeg dijela DNK molekule, pa se naziva DNK replikaza.

Ulogu prajmera u toku replikacije DNK imaju kratki lanci RNK dužine od 10 do 60 nukleotida ( komplementarno spareni sa dijelovima DNK lanca – matrice ). Kako nastaju prajmeri? Enzim primaza katalizuje nastajanje prajmera. Primaza međusobno povezuje ribonukleozidfosfate i može da započne sintezu polinukleotidnog lanca.

Mehanizmi neophodni za razdvajanje lanaca DNK i formiranje replikativne viljuške su 3 tipa proteina:

DNK HELIKAZA – omogućava raskidanje H – veza i otvaranje dvolančane zavojnice.

PROTEINI koji destabiliziraju dvolančanuzavojnicu ( SSB proteini, eng. single strand DNA – binding, ili

HDP – proteini, eng. Helix destabilizing proteins ).

DNK TOPOIZOMERAZE ( više tipova ovih enzima )DNK topoizomeraza I ( umanjuje tenziju uvrtanja u molekuli DNK )DNK topoizomeraza II , bakterijska se naziva DNK-žiraza ( stalno se umeću negativni supernavoji – djelovanjem ovog enzima). Specifični enzimi koji «odmotavaju» dvostruku uzvojnicu na mjestu SINTEZE.

Neki enzimi replikacije

MEHANIZMI REPLIKACIJE DNK KOD PROKARIOTA

Uslovno cio proces replikacije se može podijeliti u tri faze:

• INICIJACIJA replikacije.• ELONGACIJA novonastalih lanaca DNK.• TERMINACIJA replikacije.

Inicijacija: replikacija kod bakterijske DNK počinje na mjestima koja obuhvataju 245 bp i odlikuje se specifičnim redoslijedom nukleotida – označenog kao LOKUS oriC, gdje se nalaze 4x ponovljeni segmenti od po 9 bp, kao i 3 ponovka nukleotidnog niza dužine 13 bp.

Ishodište replikacije E. coli

DNK se u prisustvu proteina – HU ( sličnog eukariotskim histonima ) savija obuhvatajući proteinski kompleks DnaA ( oko 30 subjedinica ) i nastaje DnaA – DNA – POČETNI ili INICIJALNI KOMPLEKS.Za otvoreni kompleks uz pomoć proteina DnaC vezuju se HELIKSAZE gradeći PREINICIJALNI kompleks.

Inicijacija elongacije

Elongacija: Napredovanje REPLIKACIJE u oba pravca se odvija uz djelovanje DNK heliksaze i proteina SSB ( destabilizira dvolančanu zavojnicu ). Zatim sinteza prajmera – RNK polimeraze i primaze. DNK polimeraza III se vezuje za replikativnu viljušku i počinje kontinuiranu sintezu vodećih lanaca DNK. Sinteza lanca koji zaostaje je mnogo kompleksnija. Obezbjeđuje je « putujući» kompleks, PRIMOZOM, koji pored PRIMAZE I HELIKAZE sadrži 5 različitih proteina.Terminacija: replikacija se završava u regionu od 350 bp nazvanih REPLIKATIVNI TERMINUS – nasuprot REPLIKATIVNOM početku oriC. Replikativni terminus ili TERMINACIONI region obuhvata 6 identičnih segmenata dužine 23 bp ( TerE, TerD, TerA, TerF, TerB i TerC) po 3 sa svake strane. Replikativna viljuška koja dolazi u ovaj region preko segmenata biva zaustavljena u terminacionom regionu.

Terminacija replikacije DNK kod bakterija

MEHANIZMI REPLIKACIJE DNK KOD EUKARIOTA

Molekuli DNK u eukariotskim ćelijama su znatno veći nego u prokariotskim ćelijama i čvrsto su vezani za PROTEINE i REPLIKUJU se u okviru hromatinske strukture.Mehanizmi procesa replikacije su zajednički – odvijaju se semikonzervativnim i semidiskontinuiranim mehanizmom i istovremeno u oba smjera – bidirekciono.Molekula DNK se replikuje 10 – 20 puta sporije nego u prokariotskim. Mjesta početka replikacije nazvana su ARS elementima ( eng. autonomously replicating sequences, autonomni replicirajući slijedovi ) – obuhvataju regione od 300 bp.Replikon je region hromosoma čija replikacija započinje u određenom ARS elementu i predstavlja jednu replikativnu jedinicu.ENZIMI – najmanje 5 vrsta DNK polimeraza – α, β, γ, δ i ε itd.

DNK polimeraza α se sastoji od više subjedinica ( 4 u ćelijama Drosophile, 5 u ćelijama jetre pacova ) katalizuje sintezu lanca DNK u smjeru 5' – 3', počevši od prajmera – može da ugradi samo 100 – 200 nukleotida. Ne posjeduje EGZONUKLEAZE. AKTIVNOST – ne može da provjerava sopstveni učinak i ispravlja nastale greške.Polimeraze β i δ učestvuju u reparaciji oštećenja molekule DNK.Polimerazi γ se pripisuje replikacija mitohondrijalne DNK.

DNK polimeraza δ se sastoji od 2 subjedinice – može da ugradi neograničen broj nukleotida u rastući lanac DNK, posjeduje egzonukleaznu aktivnost smjera 3' – 5' ( koriguje greške u toku replikacije ). Njena katalitička aktivnost zavisi od interakcije sa proteinom PCNA ( eng. proliferating cell nuclear antigen ) – prisutan u nukleusu stanica koje imaju sposobnost da se dijele. Kompleks polimeraze δ i proteina PCNA ima ulogu REPLIKAZE vodećeg lanca DNK.

Kompleks RFA se vezuje za jednolančane regione molekula DNK ( uloga slična ulozi bakterijskog proteina SSB ), dok RFC učestvuje u formiranju aktivnih replikativnih kompleksa.Enzim telomeraza ( ribonukleoproteinski kompleks, čija komponenta RNK sadrži segment komplementaran nizu koji se ponavlja u okviru telomere ). Uloga mu je u replikaciji krajeva linearnih molekula DNK u telomerama. Telomerni dijelovi DNK sadrže ponovljene jednostrane slijedove DNK sa nakupinama G ostataka u jednom lancu. Djelovanjem telomeraze nastaju jednolančani 3' krajevi u kojima se često pojavljuje GVANIN ( G ), tzv. G - KVARTET G ≡ G.

• REPARACIJA NESPARENIH NUKLEOTIDA

• REPARACIJA ISJECANJEM BAZA ( EKSCIZIONA REPARACIJA )

• REPARACIJA ISJECANJEM NUKLEOTIDA

• DIREKTNA REPARACIJA

• POSTREPLIKATIVNA( REKOMBINACIJSKA ) REPARACIJA

• SOS ODGOVOR

POPRAVAK OŠTEĆENIH MOLEKULA DNK

( REPARACIJA )

VRSTE REKOMBINACIJA

HOMOLOGNA GENETIČKA REKOMBINACIJA )

SPECIJALNA REKOMBINACIJA ( ključna uloga enzima REKOMBINAZE )

TRANSPOZICIONA REKOMBINACIJA