Monoterpeny – stare zwi¹zki, nowe zastosowania i ... · przeciwbólowe. Wykazano m.in., ¿e myrcen jest aktywnym sk³adnikiem stosowane-go w brazylijskiej medycynie ludowej naparu

Monoterpeny – stare zwi¹zki, nowezastosowania i biotechnologicznemetody ich otrzymywania

Mariusz Trytek1, Roman Paduch2, Jan Fiedurek1,Martyna Kandefer-Szerszeñ2

1Zak³ad Mikrobiologii Przemys³owej,2Zak³ad Wirusologii i Immunologii, Uniwersytet Marii Curie-Sk³odowskiej,Lublin

Monoterpenes – old compounds, new applications, and biotechno-

logical methods of their production

S u m m a r y

Monoterpenes are the largest class of plant secondary metabolites. The re-view discusses some of their key roles in chemical ecology. Several applicationsof monoterpenes in flavour and fragrance industry, bioremediation, in preven-tion and therapy of several inflammatory infection, potential disease-preventivephytochemicals, especially for cancer development, are presented. This reviewalso aims at a potential offered by biocatalysis for the synthesis of valuable nat-ural monoterpenes, highlighting relevant biotransformation of suitable precur-sors (like pinene, limonene, myrcene) using microorganism and porphyrins. Theindustrial processes based on biotechnological methods are also discussed interms of their advantages over classical chemical synthesis and extraction fromnatural sources.

Key words:

monoterpenes, fragrances, food ingredients, anticarcinogenic properties,biotransformation, cytochrome P-450.

1. Wprowadzenie

Terpeny stanowi¹ najwiêksz¹ klasê wtórnych metabolitówroœlin. Obejmuje ona oko³o 30 000 zdefiniowanych zwi¹zków(1), wœród których znanych jest ponad 400 monoterpenów (2).Monoterpeny i ich utlenione analogi zwane terpenoidami, cha-

P R A C E P R Z E G L ¥ D O W E

Adres do korespondencji

Mariusz Trytek,Zak³ad MikrobiologiiPrzemys³owej,UniwersytetMarii Curie-Sk³odowskiej,ul. Akademicka 19,20-033 Lublin.

1 (76) 135–155 2007

rakteryzuj¹ siê w³aœciwoœciami smakowo-zapachowymi oraz zró¿nicowan¹ aktyw-noœci¹ biologiczn¹. Powstaj¹ one na drodze metabolizmu kwasu mewalonowegow cytozolu komórek roœlinnych, aczkolwiek w najnowszych badaniach nad ich bio-syntez¹ wskazuje siê na udzia³ w tym procesie szlaku niezale¿nego od kwasu mewa-lonowego (3), którego wiêkszoœæ enzymów zlokalizowanych jest w plastydach (4).Zasadniczy etap biosyntezy terpenów polega na kondensacji difosforanu izopente-nylu (IPP) z difosforanem dimetyloallilu (DMAPP), zachodz¹cej zgodnie z regu³¹ izo-prenow¹. W wyniku tej reakcji powstaj¹ dwie izomeryczne formy (cis i trans) o otwar-tym ³añcuchu wêglowodorowym. S¹ to dziesiêciowêglowe jednostki, bêd¹ce pre-kursorami dla wszystkich mono-, seskwi- oraz wy¿szych terpenów (rys. 1). Z formytrans-geranylodifosforanu powstaje geraniol, wystêpuj¹cy w bodziszku (Geranium),ró¿y (Rosa) i pelargonii (Pelargonium). Forma cis-nerylodifosforan przekszta³cana jestw nerol, jeden z g³ównych sk³adników olejków cytrusowych (5).

Najbardziej rozpowszechnionymi w przyrodzie monoterpenami s¹ R-(+)-limo-nen i �-pinen. Na skalê przemys³ow¹, R(+)-limonen w iloœci oko³o 73 000 ton rocz-nie produkowany jest metod¹ ekstrakcji ze skórek owoców cytrusowych. Z kolei�-pinen otrzymywany jest g³ównie z terpentyny, bêd¹cej produktem ubocznym poprzerobie pulpy celulozowej drzew iglastych. Niski koszt surowców do produkcjitych monoterpenów powoduje, ¿e s¹ one substratami tanimi i powszechnie dostêp-nymi. Szereg zwi¹zków o w³aœciwoœciach zapachowych lub znaczeniu medycznym,ma zbli¿ony do nich szkielet wêglowy, co sprzyja otrzymywaniu wartoœciowych ter-penoidów w prostych jedno-, dwuetapowych reakcjach utleniania omawianych pre-

Mariusz Trytek, Roman Paduch, Jan Fiedurek, Martyna Kandefer-Szerszeñ

136 PRACE PRZEGL¥DOWE

Rys. 1. Biosynteza monoterpenów.

kursorów. Metody biotechnologiczne, zw³aszcza biotransformacja, s¹ szczególnieu¿yteczne w tego typu reakcjach chemicznych.

2. Biologiczna rola terpenów

Zwi¹zki organiczne, wchodz¹ce w sk³ad olejków eterycznych, s¹ wtórnymi meta-bolitami roœlin. Ka¿dego roku w lasach wytwarzanych jest 1,4 × 109 ton terpenów(6), z czego du¿a czêœæ uwalniana jest do atmosfery.

Od stuleci mikroorganizmy i owady nieprzerwanie poddawane s¹ dzia³aniu wtór-nych metabolitów roœlin, wskutek czego, miêdzy nimi a œwiatem roœlin ukszta³towa³siê zró¿nicowany zespó³ interakcji – od symbiozy po patogennoœæ. „Proces koewo-lucji pomiêdzy roœlinami oraz ich naturalnymi wrogami – do których nale¿¹ wirusy,bakterie, nicienie, insekty i ssaki – zmierza, wed³ug wielu biologów, do wygenero-wania jak najwiêkszej ró¿norodnoœci na ziemi” (7). Proces ten wi¹¿e siê z produkcj¹coraz to nowych substancji lotnych przez roœliny oraz indukcj¹ nowych enzymóww mikroorganizmach, w celu ich detoksyfikacji. Intensywna woñ i w³aœciwoœci tok-syczne olejków eterycznych chroni¹ roœliny przed kolonizacj¹ mikroorganizmówi wiêkszych paso¿ytów. Z czasem drobnoustroje uodparniaj¹ siê na te substancje,które pierwotnie by³y dla nich zwi¹zkami toksycznymi. Dla organizmu roœlinnegoobok toksycznych w³aœciwoœci olejków eterycznych wa¿ne s¹ ich wonne w³aœciwo-œci, gdy¿ intensywny zapach wabi owady zapylaj¹ce roœliny (8).

Oddzia³ywanie miêdzy drobnoustrojami, insektami a roœlinami prowadzi czêstodo zmian profilu zapachowego olejków emitowanych do atmosfery. Dla roœlino¿er-ców s¹ one sygna³em, który pomaga w odró¿nieniu roœliny opanowanej przez mi-kroorganizmy od nie zainfekowanej (9). Niekiedy, kolonie owadów wybieraj¹ roœlinyzainfekowane, gdy¿ mikroorganizmy oprócz dostarczania owadom podstawowychaminokwasów, mog¹ pomagaæ w redukcji toksycznego dzia³ania wtórnych metabo-litów roœlin. W odpowiedzi roœliny produkuj¹ specyficzne lotne zwi¹zki przyci¹ga-j¹ce paso¿yty roœlino¿erców (10,11). Podobnie reaguj¹ one na paso¿yty ¿eruj¹ce naliœciach, produkuj¹c terpeny wabi¹ce drapie¿ne owady, które tworz¹ w ten sposóbspecyficzn¹ armiê „ochroniarzy”. „Zjawisko to jest szeroko rozpowszechnionew królestwie roœlin, oznacza to, ¿e mechanizm odpowiedzialny za produkcjê tegotypu zwi¹zków posiada wiêkszoœæ z nich. Wystarczy, zatem wprowadziæ tylko jedengen, aby uruchomiæ szlak produkcji tego typu sygna³ów” – twierdzi H. Bouwme-ester – biochemik z Uniwersytetu Wageningen, który z produkcj¹ odpowiednichterpenów przez roœliny wi¹¿e nadzieje na zwalczanie szkodników roœlin uprawnychoraz zredukowanie iloœci stosowanych w tym celu pestycydów (12).

Monoterpeny uczestnicz¹ tak¿e w biosyntezie wy¿szych terpenów, ¿ywic i in-nych zwi¹zków o ró¿nych funkcjach biologicznych, takich jak: plastochinony, ubi-chinony, karotenoidy, sterole, fitoaleksyny, saponiny, a tak¿e regulatorów wzrostui hormonów roœlinnych (gibereliny, kwas abscysynowy) (13).

Monoterpeny – stare zwi¹zki, nowe zastosowania i biotechnologiczne metody ich otrzymywania

BIOTECHNOLOGIA 1 (76) 135-155 2007 137

3. Zastosowania monoterpenów

Roczne zu¿ycie monoterpenów przez cz³owieka wynosi 2,8 × 105 kg. Wynikaono z du¿ego zapotrzebowania i szerokiego ich zastosowania w przemyœle perfu-meryjno-kosmetycznym, spo¿ywczym, farmaceutycznym i medycznym. Ka¿dego ro-ku, w samym przemyœle perfumeryjno-kosmetycznym i spo¿ywczym do produkcjiró¿nych artyku³ów wykorzystuje siê 30 000 ton �- i �-pinenu (14). Monoterpeny do-stêpne s¹ w szerokiej gamie produktów pocz¹wszy od odczynników chemicznych,poprzez olejki eteryczne, a¿ po preparaty farmakologiczne.

3.1. Prozdrowotne dzia³anie monoterpenów

Ju¿ w staro¿ytnoœci korzystano z leczniczych i zapachowych w³aœciwoœci mono-terpenów. Œwiadcz¹ o tym chocia¿by najstarsze wzmianki o stosowaniu zió³ i za-wartych w nich olejków eterycznych. Rzymski uczony Pliniusz zaleca³ spo¿ywanienasion kminku przy atakach histerii, stanach przygnêbienia i przy anemicznym wy-gl¹dzie (15). W podobnych celach leczniczych stosowano je np. w krajach arabskich.Wed³ug legendy, korzenie kminku mieszano z mlekiem i wyrabiano „Chara” –chleb spo¿ywany przez Juliusza Cezara, jak i ¿o³nierzy Valeriusa. Z kolei, w staro¿yt-nym Egipcie na szerok¹ skalê stosowano nasiona kopru (16). Popularn¹ bylin¹ ros-n¹c¹ w rejonach Morza Œródziemnego by³a tak¿e miêta. Jej nazwa (ang. Mentha) po-chodzi od imienia greckiej nimfy Menthe, ukochanej Hadesa, któr¹ jego zazdrosna¿ona Persefona zamieni³a w roœlinê. Wraz z up³ywem czasu zapach Menthe stawa³siê s³odszy i przyjemniejszy. Zdaniem Pliniusza (I w. n.e.), miêta poprawia pamiêæi pobudza aktywnoœæ mózgu, zaœ oplatanie g³owy tymi roœlinami powinno przynosiæ„ukojenie duszy” (15). Z porad tych korzystali uczniowie rzymskich filozofów no-sz¹c na g³owie wianki ze œwie¿ych liœci miêty. Arystoteles natomiast, zakazywa³wrêcz ¿o³nierzom u¿ywania miêty przed bitw¹, poniewa¿ jej w³aœciwoœci mog³ybyspowodowaæ zmniejszenie ich zapa³u do walki. Jednak¿e rzymscy gladiatorzy u¿y-wali przed walk¹ olejki z roœlin kminku, kopru i miêty do nacierania koñczyn. O po-pularnoœci tych zió³ w czasach staro¿ytnych œwiadczy zapis o sk³adaniu z nich rocz-nej dziesiêciny, o czym jest mowa np. w Ewangelii wg Œw. Mateusza.

Obecnie wiadomo, ¿e monoterpeny w organizmie cz³owieka maj¹ wszechstron-ne dzia³anie. Wykazano m.in., ¿e przenikaj¹ do krwi, dzia³aj¹c jako lecznicze sub-stancje chemiczne oraz swoiœcie steruj¹ prac¹ mózgu. Sk³adniki olejków eterycz-nych wykorzystywane s¹ tak¿e w leczeniu schorzeñ górnych dróg oddechowych(dzia³aj¹ wykrztuœnie, przeciwbakteryjnie i przeciwwirusowo) i schorzeñ gastrycz-nych (jako œrodki ¿ó³ciopêdnie i spazmolityczne). Wiele z nich dzia³a dezynfekuj¹coi aseptycznie na skórê oraz pobudza jej ukrwienie, skutecznie poprawiaj¹ samopo-czucie, ³agodz¹ bóle miêœni oraz dzia³aj¹ uspokajaj¹co lub pobudzaj¹co. Monoter-peny pochodz¹ce z olejków niektórych roœlin odpowiedzialne s¹ za w³aœciwoœci



przeciwbólowe. Wykazano m.in., ¿e myrcen jest aktywnym sk³adnikiem stosowane-go w brazylijskiej medycynie ludowej naparu z roœliny Cymbopogon citratus (ang. le-

mongrass) (17). Na w³aœciwoœciach leczniczych monoterpenów w olbrzymim stopniuoparta jest aromatoterapia. Na polskim rynku leków, dostêpny jest preparat do in-halacji pod nazw¹ Bronchicum Inhalat, który jest emulsj¹ sk³adaj¹c¹ siê z eukalipto-lu, terpineolu, olejku sosnowego, tymiankowego i rozmarynowego. Olejek miêtowyskutecznie poprawia funkcje uk³adu pokarmowego u pacjentów cierpi¹cych na ró¿-nego rodzaju zaburzenia w procesie trawienia. Ponadto, zastosowanie olejku miê-towego mo¿e ³agodziæ objawy w zespole wra¿liwego jelita, odp³ywie ¿o³¹dkowo-je-litowym (tzw. refluks) oraz zaka¿eniach Candida albicans i Helicobacer pylori (18).

Dziêki hydrofobowym w³aœciwoœciom, monoterpeny s³u¿¹ do rozpuszczania ka-mieni cholesterolowych i ¿ó³ciowych u ludzi (18). Du¿e zainteresowanie budzi ichaktywnoœæ przeciwnowotworowa, oraz w³aœciwoœci przeciwbakteryjne, przeciw-grzybiczne, przeciwwirusowe, immunomodulacyjne i przeciwzapalne.

3.1.1. Aktywnoœæ chemoprewencyjna i przeciwnowotworowa

Wiedza dotycz¹ca procesu transformacji nowotworowej, zarówno na poziomiekomórkowym jak i molekularnym, pozwoli³a na wyodrêbnienie nowej strategiiw dziedzinie ochrony przed kancerogenez¹, okreœlanej jako chemoprewencja (19).Kancerogeneza jest procesem stopniowej akumulacji b³êdów w genomie oraz zmianbiochemicznych w komórce, prowadz¹cych albo do jej œmierci na drodze apoptozylub do transformacji nowotworowej, daj¹cej pocz¹tek rozwoju guza, gdy komórki„uciekn¹” spod nadzoru immunologicznego organizmu (20). Celem chemoprewencjijest zatem zatrzymanie lub odwrócenie zmian w komórkach w stadium inicjacji roz-woju nowotworu, przez zastosowanie nietoksycznych substancji naturalnych lubczynników farmakologicznych (19).

Wœród wielu zwi¹zków pochodzenia naturalnego, monoterpeny, a szczególnie li-monen oraz alkohol perylowy spe³niaj¹ funkcje zarówno czynników chroni¹cych przedrozwojem raka jak i substancji znajduj¹cych zastosowanie w terapii przeciwnowotwo-rowej. Wykazano, ¿e limonen i alkohol perylowy hamuj¹ rozwój wielu typów nowo-tworów, w tym raka sutka, skóry, w¹troby, p³uc, okrê¿nicy, trzustki i prostaty (21-24).Aktywnoœæ tych monoterpenów oraz ich utlenionych metabolitów zwi¹zana jest z se-lektywnym, posttranslacyjnym hamowaniem izoprenylacji onkoproteiny P21ras, regu-luj¹cej wewn¹trzkomórkowe przekazywanie sygna³ów oraz podzia³y komórkowe. Post-translacyjna modyfikacja tego bia³ka jest niezbêdna do transformacji komórki, a tym sa-mym do nabycia w³aœciwoœci onkogennych (25-29). Kolejnym mechanizmem chemote-rapeutycznych w³aœciwoœci limonenu i alkoholu perylowego jest hamowanie syntezykoenzymu Q (CoQ). Spadek iloœci CoQ w b³onach komórkowych opóŸnia przekazywa-nie sygna³ów indukuj¹cych ich proliferacjê oraz czyni komórki nowotworowe podat-nymi na stres oksydacyjny (25). Ponadto, jednym z wa¿niejszych mechanizmów prze-


BIOTECHNOLOGIA 1 (76) 135-155 2007 139

ciwnowotworowej aktywnoœci monoterpenów jest aktywacja ekspresji transformu-j¹cego czynnika wzrostu-� (TGF-�). Czynnik ten wytwarzany jest w latentnej, nieak-tywnej formie. Wykazano, ¿e alkohol perylowy poœredniczy w aktywacji TGF-� orazzwiêksza ekspresjê mRNA dla jego receptorów. Aktywowany TGF-� wi¹¿e siê z recep-torem, indukuj¹c sygna³ prowadz¹cy do zahamowania cyklu komórkowego w fazie G1i apoptozy komórki (22,25). Ponadto, aktywacja TGF-� indukuje wzrost ekspresji czyn-ników proapoptotycznych, np. bia³ek Bax, Bak lub Bad. Na podstawie analizy regulacjicyklu komórkowego wykazano, ¿e monoterpeny indukuj¹ wzrost ekspresji bia³kaP21Waf1/Cip1, bêd¹cego inhibitorem cyklinozale¿nych kinaz (cdk) oraz wywo³uj¹ spa-dek ekspresji cyklin E i D1. Redukcja iloœci mRNA oraz ekspresji bia³ka dla cykliny D1ogranicza tworzenie aktywnego kompleksu z cdk4 i zahamowanie cyklu komórkowe-go w fazie G0. Ponadto, alkohol perylowy wzmacnia wi¹zanie bia³ka P21Waf1/Cip1 dokompleksu E-cdk2, hamuj¹c tym samym cykl komórkowy w fazie G1 (21,25,30). Prze-ciwnowotworowa aktywnoœæ limonenu i alkoholu perylowego jest obecnie przedmio-tem I fazy badañ klinicznych (29,31). Ponadto, wykonuje siê wstêpne, pilota¿owe ba-dania kliniczne II fazy maj¹ce na celu okreœlenie stopnia akumulacji limonenu i jegometabolitów w nowotworach piersi. Podczas prowadzonych badañ wskazuje siê, ¿edoustnie podany limonen jest w pe³ni absorbowany i ulega intensywnej biotransfor-macji do aktywnych metabolitów: kwasu peryllikowego, kwasu dihydroperyllikowegoi 1,2-dihydroksy-limonenu. Metabolity te wykazuj¹ wysok¹ aktywnoœæ farmakologicz-n¹, która nierzadko przewy¿sza aktywnoœæ substancji wyjœciowych. Dodatkowo, limo-nen w dawkach maj¹cych aktywnoœæ kliniczn¹ jest dobrze tolerowany przez pacjen-tów z zaawansowanymi nowotworami. Skutki uboczne, jak np. md³oœci, wymioty czybiegunka zale¿ne s¹ od dawki monoterpenu i szybko ustêpuj¹ nie prowadz¹c do po-wa¿nych dysfunkcji organów (29). Alkohol perylowy jest równie¿ badany jako inhibitorkancerogenezy indukowanej promieniami ultrafioletowymi. Wykazano, ¿e zastosowa-ny na skórê w formie kremu zmniejsza ryzyko rozwoju czerniaka. Postuluje siê zatem,aby uznaæ go za efektywny czynnik ochronny zabezpieczaj¹cy przed rozwojem rakaskóry (23). Aktywnoœæ przeciwnowotworow¹ wykazuj¹ równie¿ inne monoterpeny,np. karwon, karweol, uroterpenol oraz sobrerol. Ich aktywnoœæ wykazano w badaniachnad rakiem piersi (32). Ponadto, geraniol i farnezol charakteryzuj¹ siê aktywnoœci¹skierowan¹ przeciwko nowotworom trzustki (33,34).

Monoterpeny s¹ nietoksycznymi zwi¹zkami zawartymi w codziennej diecie, któ-re wykorzystuj¹c wiele mechanizmów komórkowych wykazuj¹ dzia³anie przeciwno-wotworowe. Stanowi¹ zatem now¹, obiecuj¹c¹ klasê czynników, mog¹cych znaleŸæzastosowanie we wspó³czesnej onkologii.

3.1.2. Aktywnoœæ przeciwbakteryjna i przeciwgrzybiczna

Zastosowanie lecznicze monoterpenów wi¹¿e siê równie¿ z ich aktywnoœci¹przeciwdrobnoustrojow¹. Badania prowadzone s¹ na szczepach bakterii beztleno-



wych oraz tlenowych, w tym bakterii gramdodatnich i gramujemnych. Drobnoustro-je wykazuj¹ zró¿nicowan¹ wra¿liwoœæ na zwi¹zki pochodzenia roœlinnego. Bakteriegramdodatnie s¹ z regu³y bardziej podatne na ich dzia³anie ani¿eli gramujemne(35).

Mieszanina monoterpenów: terpinen-4-olu, �-terpineolu, 1,8-cyneolu i linalolu,pochodz¹cych z olejku drzewa herbacianego wykazuje przeciwdrobnoustrojowe dzia-³anie na szereg szczepów gramdodatnich i gramujemnych, izolowanych ze skóry, jamyustnej i górnych dróg oddechowych cz³owieka. Ponadto, uzyskano obiecuj¹ce wynikiw badaniach wykonanych na szczepach gronkowca z³ocistego (Staphylococcus aureus)opornych na metacyklinê. Wskazuj¹ one, ¿e mieszanina wymienionych monoterpe-nów w granicach stê¿eñ 2,5-5 mg/ml hamowa³a wzrost szczepów tych bakterii, zaœwy¿sze dawki mia³y efekt bakteriobójczy (35).

Gelomyrtol, mieszanina trzech monoterpenów (�-pinenu, limonenu i 1,8-cyne-olu) wykazuje z kolei w³aœciwoœci lecznicze w ostrym zapaleniu oskrzeli. Wykazano,¿e gelomyrtol jest dobrze tolerowany przez chorych i pod wzglêdem skutecznoœcileczenia ostrego zapalenia oskrzeli w niczym nie ustêpuje antybiotykom orazzwi¹zkom mukolitycznym. Dodatkowo, zastosowanie monoterpenów wi¹¿e siêz mniejsz¹ toksycznoœci¹ i brakiem powstawania opornoœci bakterii w porównaniuz klasycznym podejœciem terapeutycznym (36). W chorobach oskrzeli silne dzia³anieprzeciwbakteryjne wykazuje tak¿e mentol. Mechanizm dzia³ania mentolu jak rów-nie¿ tymolu i linalolu oparty jest na zaburzeniu struktury lipidowej b³ony komórko-wej mikroorganizmów. W konsekwencji, wzrasta jej przepuszczalnoœæ dla monoter-penów, które wnikaj¹c do komórek bakteryjnych hamuj¹ podstawowe mechanizmymetaboliczne drobnoustrojów, prowadz¹c do ich zabicia (37).

Monoterpeny wykazuj¹ równie¿ aktywnoœæ przeciwgrzybicz¹. Badania prowadzisiê na dwóch grupach grzybów: dro¿d¿akach i grzybach nitkowatych uznawanych zapotencjalnie chorobotwórcze dla cz³owieka. Rozwój grzybów z rodzaju Candida

(C. albicans, C. krusei, C. tropicalis) hamowany jest przez mieszaniny monoterpenów.Wysok¹ aktywnoœæ przeciwgrzybicz¹ wykazuj¹ terpinen-4-ol, �-pinen, �-pinen,1,8-cyneol, linalol i �-terpineol (35,38). Poza tym, wymienione monoterpeny hamuj¹rozwój dermatofitów w tym Trichophyton mentagrophytes, T. rubrum czy Microsporum

gypseum. Podobnie, wzrost Aspergillus niger i A. flavus hamowany jest przez wymie-nione monoterpeny. Nale¿y jednak zwróciæ szczególn¹ uwagê na ró¿nice we wra¿li-woœci poszczególnych grup grzybów na aktywnoœæ monoterpenów. Wykazano, ¿edermatofity oraz grzyby mikroskopowe s¹ znacznie oporniejsze na œrodki pocho-dzenia roœlinnego w porównaniu z dro¿d¿akami (35). Nierzadko zatem wprowadze-nie monoterpenów do terapii mo¿e okazaæ siê niemo¿liwe ze wzglêdu na trudne dozaakceptowania skutki uboczne, wynikaj¹ce z koniecznoœci zastosowania wysokichstê¿eñ tych zwi¹zków.


BIOTECHNOLOGIA 1 (76) 135-155 2007 141

3.1.3. Aktywnoœæ przeciwwirusowa

Przeciwwirusowa aktywnoœæ monoterpenów jest obecnie s³abo poznana. Arma-ka i wsp. wykazali, ¿e isoborneol jest silnym czynnikiem inaktywuj¹cym wirusyHerpes simplex typu I (HSV-1), który jest ludzkim patogenem wywo³uj¹cym infekcjeskóry, nab³onka œluzowego jamy ustnej, gard³a, prze³yku i oczu. Po zaka¿eniu wirusprzechodzi w fazê latencji, lecz okresowo mo¿e ulec reaktywacji. Ponadto, w pew-nych warunkach wirus infekuje centralny uk³ad nerwowy, wywo³uj¹c zapalenie móz-gu i opon mózgowych. Aktywnoœæ przeciwwirusowa isoborneolu polega na interak-cji grup hydroksylowych monoterpenu z lipidami wirusowego kapsydu oraz zaha-mowaniu glikozylacji bia³ek wirusowych. W wyniku tych procesów wirus traci swoj¹infekcyjnoœæ (39). Z kolei, mieszanina monoterpenów pochodz¹ca z olejku drzewaherbacianego (terpinen-4-ol, �-terpineol, 1,8-cyneol, linalol) skutecznie hamuje roz-wój wirusów grypy (Myxovirus influenzae). Dodatkowo wykazano korzystne efektylecznicze w przypadku opryszczki wywo³anej wirusem Herpesvirus hominis, po miej-scowym zastosowaniu mieszaniny wymienionych monoterpenów (35).

3.1.4. Aktywnoœæ przeciwzapalna i immunomodulacyjna

Jednym z monoterpenów wykazuj¹cych aktywnoœæ przeciwzapaln¹ jest (-)-lina-lol. Wykazuje on równie¿ w³aœciwoœci przeciwbólowe oraz zmniejszaj¹ce obrzêk(40). Przeciwzapaln¹ aktywnoœæ posiada równie¿ nasycony monoterpen 1,8-cyneol(eukaliptol). Zakres jego aktywnoœci jest doœæ szeroki. Hamuje on szlak metaboli-zmu kwasu arachidonowego, produkcjê cytokin przez aktywowane ludzkie monocy-ty, wykazuje aktywnoœæ mukolityczn¹ przez wp³yw na produkcjê mediatorów zapal-nych, jak równie¿ znajduje zastosowanie w leczeniu ostrego i przewlek³ego zapale-nia oskrzeli oraz zatok. Aktywnoœæ przeciwzapaln¹ 1,8-cyneolu wykorzystuje siêtak¿e do leczenia astmy (41). Niezbêdne s¹ jednak dalsze badania maj¹ce na celuokreœlenie wartoœci terapeutycznej 1,8-cyneolu w schorzeniach leczonych obecniesterydami oraz w procesach zapalnych.

3.2. Bioaktywne i smakowo-zapachowe w³aœciwoœci monoterpenów

Monoterpeny s³u¿¹ te¿ jako dodatki aromatyczne do produktów spo¿ywczych,œrodków czystoœci i perfum. Limonen oraz �-pinen, zwi¹zki niedrogie i ³atwo do-stêpne, znalaz³y zastosowanie jako rozpuszczalniki, m.in. w badaniach histologicz-nych i w przemyœle farbiarskim. Limonen u¿ywany jest w procesie oczyszczania cy-klodekstryn z ¿elowanej skrobi, z któr¹ tworzy daj¹ce siê ³atwo odfiltrowaæ sta³ecz¹steczki (42). Mo¿e te¿ wchodziæ w reakcje polimeryzacji. Opatentowano ju¿ ma-teria³y otrzymane w wyniku kopolimeryzacji limonenu z etylenem, propylenem czy



norbornadienem (42). W perfumerii istotne znaczenie maj¹ monoterpeny uzyskanebezpoœrednio z olejków eterycznych: �-terpineol, borneol, ich estry z kwasem octo-wym, myrtenol, eukaliptol, fenchol, linalol, karwon, terpinen-4-ol (43) oraz cytral,geraniol, anetol i mentol (8). Jako sk³adnik perfum czêsto stosowana jest mieszaninaoœmiu izomerów izopulegolu, choæ w ostatnich badaniach wskazuje siê, ¿e jej g³ów-ny komponent (-)-izopulegol jest bezwonny (44). Szereg innych monoterpenów wy-korzystywano w celu ulepszania b¹dŸ tworzenia nowych „niepowtarzalnych” kom-pozycji zapachowych. Podejmowane s¹ próby produkcji nowych analogów zwi¹z-ków o w³aœciwoœciach aromatycznych, np. z (R)-(-)-karwonu otrzymano analog santa-lolu – (Z)-normetylo-karwo-�-santalol o „delikatnie leœnym zapachu z nut¹ cedrolu”(18). Warto wspomnieæ tu o ment-1-ene-8-tiolu, zwi¹zku otrzymanym po raz pierw-szy w roku 1979 w reakcji siarczku wodoru z limonenem. Posiada on charaktery-styczny zapach grejpfrutów i ma jeden z najni¿szych progów wyczuwalnoœci zapa-chu spoœród substancji naturalnych (45). Bardzo wa¿n¹ rolê, w perfumowaniu myde³i innych œrodków czystoœci, odgrywaj¹ olejki posiadaj¹ce zdolnoœæ utrwalania zapa-chu innych zwi¹zków. Zalicza siê do nich: olejek cedrowy, sanda³owy, kopaiwowy(8).

W trakcie procesu technologicznego, przetwarzane produkty spo¿ywcze, trac¹swój naturalny smak i aromat. Zasadnicze znaczenie w przywracaniu ich pierwot-nych w³aœciwoœci maj¹ dodatki aromatyczne – aromaty naturalne, b¹dŸ identycznez naturalnymi. Obecnie najwiêksze zapotrzebowanie spoœród terpenoidowych zwi¹z-ków smakowo-zapachowych w przemyœle spo¿ywczym maj¹ R(-)-karwon oraz (-)-men-tol, gdy¿ charakteryzuj¹ siê orzeŸwiaj¹cym aromatem miêtowym. Wœród oœmiu mo¿-liwych izomerów mentolu tylko jeden, (-)-(1R,3R,4S) enancjomer, posiada po¿¹danew³aœciwoœci organoleptyczne i stosowany jest w celu poprawy walorów smako-wo-zapachowych wielu produktów. Wiêkszoœæ (-)-mentolu w dalszym ci¹gu pozyski-wana jest w wyniku krystalizacji z uprzednio zamro¿onego olejku z Mentha arvensis.Pomimo wielu prób otrzymania tego terpenoidu z ³atwo dostêpnych materia³ów,tylko dwa procesy, Haarmanna i Reimera [H&R] oraz Takasago znalaz³y przemy-s³owe zastosowanie. Jedynie w pierwszym z tych procesów wykorzystywane s¹ poczêœci metody biotechnologiczne, tj. lipaza (np. z Candida rugosa) do enancjoselek-tywnej hydrolizy, wczeœniej zsyntetyzowanego chemicznie, racemicznego benzo-esanu mentolu (44). Spoœród monoterpenów S(+)-karwon jest najbardziej efektyw-nym inhibitorem kie³kowania ziemniaków (18). Alkohol perylowy i kwas peryllikowywykorzystywane s¹ jako przeciwbakteryjne dodatki do produktów spo¿ywczychi farmaceutycznych.

Czêsto wskazuje siê na korzystny udzia³ naturalnych monoterpenów roœlinnychw bioremediacji ksenobiotyków (46). Hernandez, wzbogacaj¹c glebê skórkami po-marañczy, liœæmi bluszcza, ig³ami sosny lub liœæmi eukaliptusa zwiêkszy³ 100 000razy utylizacjê toksycznego bifenylu (47). Gilbert i Crowley badaj¹c wp³yw czystychterpenoidów na biodegradacjê polichlorowanych difenyli (PCB) przez Arthrobacter,

wykazali, ¿e zwi¹zkiem indukuj¹cym ten proces jest karwon. Karwon i limonen sty-


BIOTECHNOLOGIA 1 (76) 135-155 2007 143

mulowa³y biodegradacje mieszaniny komercyjnych PCB przez Pseudomonas stutzeri.W innym doœwiadczeniu stwierdzono, ¿e R-(-)-karwon w stê¿eniu 50 ppm indukowa³ekspresjê genu 2,3-dihydroksybifenylo 1,2-dioksygenazy u Ralstonia entropha (46).Monoterpeny mog¹ tak¿e stymulowaæ degradacjê innych ksenobiotyków, tj. tolu-enu, fenolu oraz trichloroetanu. Indukuj¹ te¿ mikrosomalne enzymy w¹troboweu szczura, zaanga¿owane w biotransformacjê ksenobiotyków, co udokumentowanow przypadku kamfory, mentolu, pinenu, limonenu, borneolu i 1,8-cineolu (48). No-we mo¿liwoœci walki z kornikami i innymi szkodnikami drzew iglastych stwarza wy-korzystanie werbenolu, werbenonu i pinokarwonu jako sk³adników ich feromonówagregacyjnych (49).

W przemyœle farmaceutycznym z terpenoidowych prekursorów produkowane s¹leki steroidowe i inne zwi¹zki o znaczeniu farmakologicznym, np. terpenoidowenienasycone 1,4-dialdehydy, utlenione diterpenoidy, nowe chiralne fenole czy sila-trany (18).

4. Biotransformacje monoterpenów

Celowoœæ badañ nad biotechnologiczn¹ metod¹ wytwarzania produktów terpe-noidowych z niedrogich monoterpenów wi¹¿e siê z ich wysok¹ wartoœci¹ rynkow¹i wynika z braku odpowiednio wydajnej metody ich produkcji.

Niektóre z monoterpenów o unikatowych w³aœciwoœciach zapachowych pow-staj¹ w naturalnych warunkach na drodze transformacji odpowiednich prekursorów.Jako przyk³ad wymieniæ nale¿y R(+)-limonen, który w roœlinach z rodzaju Mentha

jest utleniany, np. do R(-)-karwonu (M. spicata) i (-)-mentolu (M. piperita), zaœS(+)-karwon powstaje w drodze oksydacji S(-)-limonenu w owocach kminku (Carum

carvi). Zwi¹zki tego typu – bêd¹ce sk³adnikami olejków eterycznych – wystêpuj¹jednak w przyrodzie w ma³ych iloœciach, a ograniczony dostêp do materia³ów roœlin-nych, z których s¹ otrzymywane dodatkowo zwiêksza koszty i decyduje o ich du¿ejwartoœci rynkowej. Ponadto, wydajnoœæ procesu destylacji olejków eterycznych jeststosunkowo niewielka: np. z 100 kg kwiatu lawendy otrzymuje siê 2 kg olejku la-wendowego (50). Najni¿sza cena czystego enancjomerycznie R(+)-limonenu wahasiê w granicach 1-2 USD/kg (51). Dla porównania hurtowa cena mentolu oraz enan-cjomerów karwonu wynosi 30-60 USD/kg, a ceny (-) i (+) alkoholu perylowego s¹ conajmniej dziesiêciokrotnie wy¿sze (52). Podobnie, du¿e ró¿nice w cenach wystêpuj¹miêdzy �-pinenem (0,75 USD/kg) a werbenonem (ok. 3000 USD/kg) (53).

Inn¹ mo¿liwoœæ pozyskiwania naturalnych zwi¹zków zapachowych z roœlin mog¹stanowiæ metody chemiczne albo biotechnologiczne. Istnieje znaczna ró¿nicaw wartoœci rynkowej miêdzy zwi¹zkami otrzymywanymi ze Ÿróde³ naturalnych, a ichanalogami otrzymywanymi tymi metodami. Opracowanie biotechnologicznej meto-dy produkcji �-dekalaktonu (sk³adnika odpowiadaj¹cego za walory smakowo-zapa-chowe brzoskwiñ) z kwasów rycenolowych przyczyni³o siê do spadku jego ceny



z 12 000 USD/kg w 1986 r. do 500 USD/kg w roku 1998 (54). Z kolei cena syntetycz-nej waniliny wynosi 12 USD/kg, a ekstrahowanej ze str¹czków Vanilla sp. uzyskujecenê nawet 4000 USD/kg (55). Istnieje jednak tendencja do pozyskiwania wartoœcio-wych komponentów ¿ywnoœci metodami biotechnologicznymi, do których nale¿ym.in. biotransformacja. Polega ona na inkubacji tanich i ³atwo dostêpnych substra-tów w obecnoœci biokatalizatorów (wolne enzymy lub zawieraj¹ce je komórki, czytkanki). Metody te charakteryzuj¹ siê wysok¹ stereospecyficznoœci¹, enancjo- i re-gioselektywnoœci¹ oraz specyficznoœci¹ w zakresie typu reakcji. Sprzyja to powsta-waniu czystych enancjomerów o po¿¹danych w³aœciwoœciach organoleptycznych,bez potrzeby stosowania drogich i skomplikowanych metod rozdzielania mieszaninracemicznych. Procesy biotechnologiczne umo¿liwiaj¹ tak¿e znaczn¹ redukcjê licz-by etapów syntezy chemicznej prowadz¹cej do czystego koñcowego produktu.Poza tym, odpowiadaj¹ one rozwijaj¹cemu siê trendowi zdrowego i naturalnegostylu ¿ycia, poniewa¿ zwi¹zki otrzymane przy u¿yciu drobnoustrojów i enzymówmog¹ byæ klasyfikowane przez legislaturê USA i krajów europejskich jako produktynaturalne (GRAS, ang. Generally Regarded As Save). Warto tak¿e wspomnieæ o czêstopomijanym aspekcie czystoœci sk³adników ¿ywnoœciowych otrzymywanych z roœlin.Izolowane produkty nierzadko s¹ zanieczyszczone naturalnie wystêpuj¹cymi w roœ-linach toksynami i alergenami, które wp³ywaj¹ na pogorszenie walorów jakoœcio-wych produktów spo¿ywczych (56).

Potencjalnie u¿yteczne zwi¹zki, które mo¿na otrzymaæ w procesie utleniania�-pinenu to, m.in. tlenek pinenu, werbenol (3500 USD/kg), werbenon, myrtenol,


BIOTECHNOLOGIA 1 (76) 135-155 2007 145

Rys. 2. Struktury monoterpenów stosowanych jako prekursory w otrzymywaniu wartoœciowych ter-penoidów.

myrtenal, sobrerol, nowalal, 2-metylo-5-izopropyloheksa-2,5-dienal (izonowalal) czykwas 2-metylo-5-izopropyloheksa-2,5-dienowy (tab. 1). Werbenon jest wa¿nymkomponentem zapachowym truskawek, malin, kopru, rozmarynu oraz zapachu miê-ty zielonej. Wspólnie z werbenolem posiadaj¹ nutê przypominaj¹c¹ zapach kamforyi miêty. Zwi¹zki te otrzymywane s¹ obecnie z sosny i eukaliptusa (53). Izonowalalodznacza siê leœno-cytrynowo-korzennym zapachem natomiast nowalal – leœno-al-dehydowym (57). Z �-pinenu mo¿na otrzymaæ pinokarweol i pinokarwon. Jednymiz wa¿niejszych zwi¹zków powstaj¹cych w wyniku oksydatywnej modyfikacji limone-nu s¹: alkohol perylowy (komponent zapachowy lawendy), aldehyd perylowy, kwasperyllikowy, karweol, karwon, dihydrokarwon, �-terpineol, izopiperitenol, izopipe-ritenon i tlenek 8,9-limonenu (tab. 2). S-(+)-karwon o zapachu koperkowym jestg³ównym sk³adnikiem olejku z kminku zwyczajnego. Zawiera go równie¿ koper i je-



Rys. 3. Przyk³ady cennych monoterpenów otrzymywanych w procesie biotransformacji odpowied-nich prekursorów.

go nasiona. R-(-)-karwon charakteryzuje siê miêtowo-pieprzowym zapachem, któryobok mentolu wchodzi w sk³ad olejku miêtowego. R-(+)-�-terpineol posiada za-pach podobny do bzu, zaœ S-(-)-�-terpineol przypomina zapach drzew iglastych i es-tragonu. �-Terpineol tworzy kompozycje zapachowe ró¿nych produktów spo¿yw-czych, np. jagód, cytryn, lim, ga³ek muszkata³owych, pomarañczy, imbiru, any¿uoraz brzoskwiñ. Tlenek 8,9-limonenu spotykany jest we frakcjach lotnych imbirui mandarynek (58). Z kolei izopiperitenol i piperitol s¹ wartoœciowymi substratamiw produkcji mentolu. Dalsza hydroksylacja tych substratów mo¿e prowadziæ douzyskania dioli 23 i 24, które s¹ u¿ytecznymi prekursorami p-menta-laktonów 25,

26, 27 (rys. 4) – zwi¹zków o bardzo intensywnych, a zarazem zale¿nych od ich for-my enancjomerycznej zró¿nicowanych zapachach miêty, kumaryny i kopru (44). Po-dobnie jak limonen oraz �-pinen stosunkowo tanimi prekursorami s¹ równie¿: myr-cen, �- i �- terpinen oraz cytronellen. Potencjalnymi produktami utleniania cytronel-lenu s¹ cytronellal oraz cytronellol. W wyniku biotransformacji �- i �- terpinenuotrzymaæ mo¿na terpinen-4-ol (sk³adnik olejku cyprysowego i ja³owcowego) i terpi-nen-1-ol oraz odpowiednie 1,2-diole (59,60). Produkty biotransformacji myrcenu to,m.in. kwas myrcenowy (61,62), linalol (63) i 2-metylo-6-metyleno-2,7-oktadien-1-ol(myrcen-8-ol) (64). Linalol w 78% wchodzi w sk³ad olejku bia³ej frezji, a wraz z octa-nem linalylu odpowiada za charakterystyczny aromat lawendy i kolendry.

Badania nad biotransformacj¹ monoterpenów prowadzone s¹ na œwiecie od po-cz¹tku lat szeœædziesi¹tych ubieg³ego wieku. Mikrobiologiczna transformacja mono-terpenów, przebiega w warunkach tlenowych przy udziale licznych drobnoustro-jów. Niektóre gatunki bakterii, grzybów oraz dro¿d¿y zdolnych do katalizy oksyda-tywnej transformacji monoterpenów w kierunku wspomnianych terpenoidówprzedstawiono w tabeli 1 i 2. W wielu przypadkach uruchamiane s¹ alternatywneszlaki transformacji monoterpenu prowadz¹ce do powstawania mieszaniny jegoutlenionych analogów. Przyjmuje siê, ¿e enzymy bior¹ce udzia³ w transformacji mo-


BIOTECHNOLOGIA 1 (76) 135-155 2007 147

Rys. 4. Inne monoterpeny o unikatowych w³aœciwoœciach smakowo-zapachowych i terapeutycznych.

noterpenów nale¿¹ do grupy izoenzymów zaliczanych do monooksygenaz, a okreœ-lanych wspóln¹ nazw¹ – cytochrom P-450. G³ówn¹ rolê odgrywa w nim ¿elazopro-toporfiryna IX. Zasadê dzia³ania enzymów tej grupy opisano na przyk³adzie cyto-chromu P-450 wyizolowanego z Pseudomonas putida hydroksyluj¹cego kamforê do5-exo-hydroksykamfory. Jest to kompleks wspó³dzia³aj¹cych enzymów, w sk³ad któ-rego wchodz¹: dehydrogenaza flawoproteinowa, która katalizuje reakcjê utlenianiaNADPH, putidaredoksyna – enzym zawieraj¹cy nie zwi¹zane w uk³adzie hemowym¿elazo i katalizuj¹cy odtworzenie utlenionego flawoenzymu oraz hemoproteina –cytochrom P-450, która wi¹¿e i uaktywnia cz¹steczkê tlenu.

Monooksygenazy s¹ enzymami niestabilnymi. Trudno jest je wyizolowaæ i oczyœ-ciæ, a w konsekwencji zidentyfikowaæ koduj¹ce je geny. Wymieniæ mo¿na jedynienieliczne, czêœciowo oczyszczone enzymy bior¹ce udzia³ w transformacji terpenów,np. dehydrogenaza alkoholu perylowego, dehydrogenaza aldehydu perylowego(88,89) oraz pochodz¹ce z Rhodococcus erythropolis DCL14 NAD(H)-zale¿n¹ dehydro-genaza karweolu (nikotynoprotina) (90), i hydrolaza epoksydowa katalizuj¹ca hydro-lizê tlenku 1,2-limonenu do 1,2 dihydroksy-limonenu (91). Wœród wymienionych en-zymów trzy pierwsze odznaczaj¹ siê szersz¹ specyficznoœci¹ substratow¹, katali-zuj¹c oksydacyjn¹ transformacjê innych terpenów.

Monoterpeny s¹ w zasadzie utleniane przez drobnoustroje na drodze konwersjikometabolicznej. Mog¹ byæ metabolizowane w szlaku cymenowym, kamforowym,jak równie¿ przez drobnoustroje rosn¹ce na cykloheksanie jako jedynym Ÿródle wê-gla, oraz posiadaj¹ce szlaki kataboliczne alkanów, toluenu, naftalenu, krezolu i kwa-su cytrynowego. Na podstawie tych obserwacji mo¿na przypuszczaæ, ¿e w pocz¹tko-wej fazie utleniania terpenów dochodzi raczej do nieca³kowitej regiospecyficznoœcipojedynczego enzymu ni¿ do jednoczesnej ekspresji kilku enzymów katalizuj¹cychreakcjê utleniania monoterpenów (52).

Nie uda³o siê, jak dot¹d, opracowaæ efektywnej metody biotechnologicznej, po-zwalaj¹cej wykorzystaæ tego typu substraty do przemys³owego otrzymywania zwi¹z-ków smakowo-zapachowych. ¯aden z dotychczas badanych katalizatorów nie spe³nia³wymagañ aplikacyjnych. Uzyskiwano niewielkie wydajnoœci i niskie stê¿enia produk-tów wynikaj¹ce zarówno z toksycznoœci substratu i produktów, ich du¿ej lotnoœcii niskiej rozpuszczalnoœci w wodzie, jak równie¿ z niestabilnoœci stosowanych bio-katalizatorów. Czêsto drobnoustroje nie akumuluj¹ ¿¹danego produktu, lecz meta-bolizuj¹ go w dalszych etapach prowadz¹c ostatecznie do jego degradacji. Ponadto,pewne ograniczenia zwi¹zane s¹ z barier¹ dyfuzyjn¹ dla substratu, która jest przy-czyn¹ jego ograniczonego dostêpu do centrum aktywnego enzymu, co z kolei prze-k³ada siê na d³ugi czas biokonwersji. Czas biotransformacji limonenu przy u¿yciuPleurotus sapidus wynosi³ a¿ 10-12 dni (83), biokonwersja �-pinenu przez Aspergillus

niger trwa³a znacznie krócej, bo wyj¹tkowo tylko 6 godzin, lecz przebiega³a z ma³¹wydajnoœci¹ (53). Immobilizacja biokatalizatorów równie¿ nie dawa³a oczekiwanejpoprawy wydajnoœci. Ciekawym usprawnieniem czêœciowo rozwi¹zuj¹cym problemnadmiernej lotnoœci terpenów jest zastosowanie do ich biotransformacji psychro-



troficznych kultur grzybów nitkowatych. Pozwala to obni¿yæ temperaturê procesudo 15°C (79). Najlepsze wyniki uzyskiwano przy zastosowaniu emulgatorów zwiêk-szaj¹cych biodostêpnoœæ terpenów. Tym sposobem otrzymano a¿ 3 g/l kwasu perylli-kowego (61), natomiast w 96-godzinnej hodowli bioreaktorowej grzybni Corynespora

otrzymano 900 g (1S,2S)-trans-diolu z limonenu (81). Obiecuj¹ce s¹ tak¿e wyniki ba-dañ nad bakteriami z rodzaju Mycobacterium i Rhodococus, które posiadaj¹ katabo-liczne szlaki alkanów i wêglowodorów aromatycznych. Przy ich udziale uzyskanozadowalaj¹c¹ wydajnoœæ alkoholu perylowego oraz karweolu w wyniku dzia³aniadioksygenazy naftalenowej i toluenowej (76,84). Na uwagê zas³uguj¹ biotransforma-cje: stereoselektywnej redukcji geraniolu do cytronellolu przez dro¿d¿e piekarnianeSaccharomyces cerevisiae (92), (L)-cytronellalu do (L)-cytronellolu (3,5 g/l) z udzia³emimmobilizowanych dro¿d¿y Rhodotorula minuta (93), oraz wysoko wydajna transfor-macja tlenku �-pinenu do izonowalalu przez liazê permeabilizowanych komórekPseudomonas rhodesiae (400 g/l w ci¹gu 2,5 h z 25 g biomasy/l) (94).

T a b e l a 1

Niektóre przyk³ady biotransformacji �-pinenu i �-pinenu

Mikroorganizm G³ówne produkty Literatura

Substrat: �-pinen

Armillariella mellea trans-werbenol, werbenon, myrtenol, sobrerol, �-terpineol,karweol, karwakrol

(67)

Aspergillus niger werbenol, werbenon (53)

Aspergillus sp., Penicillium sp. trans-werbenol, werbenon, trans-pinokarweol, sobrerol (65)

Bacidiomycetes sp. trans-werbenol, myrtenol, werbenon, myrtenal, trans-pinokar-weol, sobrerol, �-terpineol, karweol, karwon

(66)

Candida tropicalis �-terpineol, p-ment-2-en-1,2-diol (70)

Pseudomnas fluorescens myrtenol, tlenek �-pinenu, tlenek limonenu, limonen, alkoholperylowy

(68)

Pseudomonas fluorescens NCIMB 11671 myrtenol, myrtenal, tlenek �-pinenu, nowalal, 2-metylo-5-izo-propyloheksa-2,5-dienal (izonowalal), kwas2-metylo-5-izopro-pyloheksa-2,5-dienowy.

(71)

Pseudomonas maltophilia limonene, borneol, kamfora, kwas peryllikowy, kwas 2-(4-mety-lo-3-cykloheksenylodieno)-propionowy

(69)

Substrat: �-pinen

Armillariella mellea pinokarwon, 5-hydroksypinokarweol, alkohol perylowy, hydro-ksy-�-terpineol, trans-pinokarweol, myrtenol

(67)

Aspergillus niger NC1M 612 trans-pinokarweol (72)

Pleurotus flabellatus trans-pinokarweol, pinokamfon, eukaliptol, myrtenol, myrta-nol, myrtanal, alkohol perylowy, 1,4-cyneol, karweol, fenchon

(66)

Pseudomonas sp. myrtenol, borneol (73)


BIOTECHNOLOGIA 1 (76) 135-155 2007 149

T a b e l a 2

Produkty transformacji limonenu przez wybrane mikroorganizmy

Produkty transformacji limonenu

alkohol perylowy,aldehyd perylowy,kwas peryllikowy

tlenek-1,2-limonenu,1,2-dihydroksy-limonen

karweol, karwon,dihydro-karwon

�-terpineolizopiperitenol,izopiperitenon

tlenek 8,9-limnenu

Aspergillus

cellulosae M-77(74)

Bacillus

stearotermophilus

BR388(75)

Mycobacterium

sp.

HXN-1500(76)

Pseudomonas

gladioli

(77)

Pseudomonas

incognita

(78)

Mortierella

minutissima 01(79)

Armillariella

mellea

(80)

Aspergillus cellulosae

M-77 (74)

Corynespora

cassiicola

DSM62474/5(81)

Rhodococcus

erythropolis DCL14(82)

Aspergillus

cellulosae

M-77

(74)

Pleurotus sapidus

(83)

Rhodococcus

opacus

PWD4(84)

Bacillus

stearoter-

mophilus

BR388 (85)

Cladosporium

sp.

T12(86)

Penicillium

digitatum

NRRL 1202(87)

Pseudomonas

gladioli

(77)

Armillariella

mellea

(80)

Aspergillus

cellulosae

M-77(74)

Aspergillus

cellulosae

M-77

(74)

Hormonema sp.UOFS Y-0067(88)

Xanthobacter sp.C20

(58)

Podejmowane s¹ tak¿e próby zwiêkszenia regioselektywnoœci i wydajnoœci reak-cji enzymatycznych metodami in¿ynierii genetycznej i bia³kowej. Jedn¹ ze strategiiin¿ynierii bia³kowej jest in¿ynieria metaboliczna, która zajmuje siê modyfikowa-niem, doskonaleniem enzymów oraz optymalizacj¹ ich wydajnoœci w wyniku ukie-runkowanych zmian odpowiednich szlaków metabolicznych lub szlaków biosynte-zy. Obejmuj¹ one ekspresjê fragmentów genomu roœlinnego i bakteryjnego odpo-wiedzialnego za proces biotransformacji. Zespó³ szwajcarskich i holenderskich na-ukowców, z bakterii Mycobacterium sp. degraduj¹cych alkany, wyizolowa³ i oczyœci³oksygenazê specyficznie katalizuj¹c¹ reakcjê hydroksylacji w pozycji C-7 cz¹steczkilimonenu do czystego enancjomerycznie (-)-alkoholu perylowego, terpenoidu o w³aœ-



ciwoœciach przeciwnowotworowych. Nastêpnie, sklonowano fragment 6,2-kb ApTkoduj¹cy cytochrom P-450, ferredoksynê i reduktazê ferredoksyny i przy u¿yciuwektora pCom8 przeprowadzono udan¹ koekspresjê w Pseudomonas putida. Otrzy-many rekombinant transformowa³ limonen do (-)-alkoholu perylowego w 2-litrowymbioreaktorze z wydajnoœci¹ kilku gramów na litr pod³o¿a hodowlanego (95). Innympodejœciem do tego zagadnienia s¹ próby ekspresji funkcjonalnych enzymów roœlin-nych (cytochromu P-450) w mikroorganizmach. Zabieg ten pozwala ³¹czyæ wysok¹regio- i stereospecyficznoœæ tych enzymów z zaletami i wysok¹ efektywnoœci¹ drob-noustrojów w procesach przemys³owych, tj. fermentacji. W tym celu przeprowadzo-no izolacjê cDNA koduj¹cego C6-hydroksylazê i C3-hydroksylazê limonenu odpo-wiednio z roœlin Mentha spicata i M. piperita. Fragment genomu poddano nadekspre-sji w Escherichia coli i Saccharomyces cerevisiae w celu otrzymania kilku N-terminalniezmodyfikowanych hydroksylaz (96). In¿ynieria metaboliczna cytochromu P-450 obej-muj¹ca wprowadzenie genu koduj¹cego specyficzny enzym biosyntezy monoterpe-nu do genomu bakteryjnego lub grzybowego wci¹¿ pozostaje metod¹ zawodn¹.

Alternatyw¹ dla klasycznej metody, w której wykorzystywane s¹ ¿ywe komórkido biotransformacji monoterpenów, mo¿e byæ u¿ycie w tym celu uk³adów porfiry-nowych, jako biokatalizatorów. Jednym z takich uk³adów, ze zwi¹zanym atomem¿elaza, jest hem – podstawowy element hemoglobiny. Hem jest równie¿ niebia³kow¹grup¹ prostetyczn¹ niezbêdn¹ do prawid³owego funkcjonowania cytochromów, pe-roksydaz i katalaz. Zastosowanie porfiryn w biotechnologii, w tym katalizatorówimituj¹cych dzia³anie cytochromu P-450, (okreœlane mianem „katalizy biomimetycz-nej”) by³o przedmiotem osobnych opracowañ (97,98). Z naszych wczeœniejszych ba-dañ wynika, ¿e peroksydaza, której aktywn¹ grupê stanowi uk³ad porfirynowy, kata-lizuje utlenianie limonenu przy udziale H2O2 (99). Porfiryny mog¹ zatem s³u¿yæ jakobiokatalizatory w utlenianiu monoterpenów. S¹ stabilne wobec tego typu zwi¹z-ków, a modyfikacja ich rdzenia pozwala otrzymaæ katalizatory o zwiêkszonej roz-puszczalnoœci w œrodowisku organicznym. W œwiatowej literaturze jest tylko kilkaprac z zakresu transformacji monoterpenów przy u¿yciu porfiryn. Stosuj¹c te-tra(4-N-benzylopirydylo)porfirynê manganu(III) podjêto próbê utlenienia �-pinenu,(R)-(+)limonenu, karwakrolu i tymolu. Po 24-godzinnej konwersji limonenu otrzy-mano tlenek 1,2- limonenu i 8,9-epoxy-p-ment-1-ene (tlenek 8,9-limonenu). W przy-padku biokonwersji �-pinenu g³ównymi produktami by³y tlenek-�-pinenu i aldehydkamfolenowy. Konwersja karwakrolu i tymolu (komponentu olejku tymiankowego)przebiega³a w kierunku powstawania tymochinonu jako koñcowego produktu. Pounieruchomieniu porfiryny stwierdzono znaczn¹ poprawê regioselektywnoœci w utle-nieniu limonenu do jego tlenku (100). Z kolei, immobilizowana meso-tetrapirydylo-porfiryna magnezu by³a efektywnym i selektywnym katalizatorem w reakcji epoksy-dacji R-(+)-limonenu za pomoc¹ nadjodanu sodu. Reakcja trwa³a od 2 do 6 godzin.Odnotowano wiêksz¹ wydajnoœæ epoksydacji oraz wzrost regioselektywnoœci im-mobilizowanej porfiryny w utlenianiu R-(+)-limonenu do jego dwóch mo¿liwychepoksydów w porównaniu z porfiryn¹ u¿ywan¹ w uk³adzie homogenicznym (101).


BIOTECHNOLOGIA 1 (76) 135-155 2007 151

U¿ywaj¹c porfiryny ¿elaza przeprowadzono utlenienie �-pinenu do werbenolu oraz2,3-epoksydu. Zwi¹zki te powsta³y w zbli¿onych iloœciach (102). W naszym laborato-rium po raz pierwszy zastosowano biomimetyczny katalizator w formie wolnej te-trafenyloporfiryny w procesie fotoutleniania limonenu, w wyniku czego uzyskanonie zidentyfikowany dot¹d monoterpen (6,0 g/l) oraz karwon z wydajnoœci¹ 3,5 g/l(103). Jest to wydajnoœæ odpowiednio 80- i 700-krotnie wy¿sza w porównaniu z pro-cesem prowadzonym w tym celu z zastosowaniem grzybni Pleurotus sapidus (83) lubuk³adu enzymatycznego oksydaza glukozowa-peroksydaza (99).

Kataliza za pomoc¹ uk³adów porfirynowych mo¿e przebiegaæ w œrodowisku bez-wodnym, co zasadniczo odró¿nia j¹ od stosowanych dot¹d metod. Reakcjê utlenia-nia monoterpenów prowadziæ mo¿na w ni¿szych temperaturach ni¿ 30-50°C, zbli-¿onych do stosowanych z u¿yciem psychrotroficznych drobnoustrojów. Pozwala tona ograniczenie strat substratu i produktu, zwiêkszon¹ rozpuszczalnoœæ tlenu,zmniejszenie kosztów zwi¹zanych z nak³adem energii w procesie biotransformacji(natlenianie, mieszanie) i kosztów przygotowania pod³o¿y do hodowli mikroorgani-zmów. Pomimo wielu zalet, biokatalizatory tego typu nie s¹ jeszcze praktycznie wy-korzystywane w procesach przemys³owych. Przyczyn¹ jest ich ma³a stabilnoœæ w o-becnoœci tlenu i innych czynników utleniaj¹cych oraz trudnoœæ z reizolacj¹ i powtór-nym ich wykorzystaniem. Immobilizacja porfiryn mo¿e czêœciowo rozwi¹zaæ te pro-blemy, a dodatkowo poprawiæ ich selektywnoœæ i aktywnoœæ, ze wzglêdu na œrodo-wisko noœnika (101). Korzystnym rozwi¹zaniem technologicznym by³oby zatem,prowadzenie procesu katalizy biomimetycznej z wykorzystaniem enzymów b¹dŸporfiryn imituj¹cych enzymy na kolumnie z unieruchomionym biokatalizatorem.W tych warunkach istnieje mo¿liwoœæ wielokrotnego wykorzystania biokatalizatoraoraz jego regeneracji.

Z uwagi na fakt, ¿e wiele utlenionych pochodnych limonenu, pinenu, terpinenu,czy myrcenu nie wystêpuje w przyrodzie mo¿na s¹dziæ, ¿e ich biotransformacja zapomoc¹ ¿ywych komórek, enzymów czy porfiryn mo¿e przyczyniæ siê do poszerze-nia grupy terpenoidów o nowe biologicznie aktywne zwi¹zki o nie spotykanychdot¹d w³aœciwoœciach smakowo-zapachowych i terapeutycznych.

5. Podsumowanie

Trwaj¹cy od milionów lat proces koewolucji pomiêdzy roœlinami-drobnoustroja-mi-owadami, ukszta³towa³ szeroki zakres katabolicznych mo¿liwoœci mikroorgani-zmów oraz du¿¹ ró¿norodnoœæ zwi¹zków lotnych. Du¿e zró¿nicowanie w³aœciwoœcimonoterpenów pozwala na praktyczne wykorzystanie ich w wielu dziedzinach prze-mys³u. Olbrzymi potencja³ monoterpenów tkwi w ich w³aœciwoœciach smakowo-za-pachowych, i terapeutycznych. Monoterpeny maj¹ obecnie zastosowanie w przemy-œle perfumeryjnym, spo¿ywczym i farmaceutycznym. Ze wzglêdu na dzia³anie prze-ciwnowotworowe, chemoprewencyjne, antydrobnoustrojowe, przeciwzapalne czy



immunomodulacyjne mog¹ znaleŸæ zastosowanie we wspó³czesnej onkologii i in-nych ga³êziach medycyny. Poszukuje siê tak¿e nowych zastosowañ dla znanych i no-wo zidentyfikowanych monoterpenów. Równolegle prowadzone s¹ badania nad wy-dajnymi sposobami ich produkcji. Metody biotechnologiczne stwarzaj¹ du¿e mo¿li-woœci w otrzymywaniu cennych monoterpenów na drodze modyfikacji tanich pre-kursorów, tj. pinenu, limonenu czy myrcenu. Nadzieje na wdro¿enie do przemys³ui rozpowszechnienie tego sposobu produkcji terpenów pok³ada siê w mikroorgani-zmach, enzymach i ostatnio w ich mimetykach jakimi mog¹ byæ porfiryny. Stanowito bardzo interesuj¹cy obiekt badañ, wi¹¿¹cy siê z wieloma zagadnieniami naturychemicznej, biologicznej i fizykochemicznej. To, czy prawid³owo rozpoznamy po-tencja³ dany nam przez naturê, zrozumiemy, a potem wykorzystamy w aplikacjachbiotechnologicznych, teraz ju¿ zale¿y od nas.

Literatura

1. Ed. Buckingham J., (1998), Dictionary of natural products, on CD-ROM, vol 6.1. Chapman & Hall, London.2. Devon T. K., Scott A. I., (1972), The monoterpenes, 3-54, in: Handbook of naturally occurring compounds,

vol. II. Terpenes, Academic Press, New York, N.Y.3. Eisenrich W., Rohdich F., Bacher A., (2001), Trends in Plant Science, 6, 78-84.4. Ohara K., Uijhara T., Endo T., Sato F., Yazaki K., (2003), J. Exp. Bot., 54, 2635-2642.5. McMurry J., (2005), Chemia organiczna, PWN, 5, 1035-1045.6. Pleszczyñska M., (2001), ¯ywnoœæ, Nauka, Technologia, Jakoœæ, 1, 14-25.7. Rausher M. D., (2001), Nature, 411, 857-864.8. Klimek R., (1957), Olejki eteryczne, Wydawnictwo Przemys³u Lekkiego i Spo¿ywczego, Warszawa.9. Kessler A., Baldwin I. T., (2002), Annu. Rev. Plant Biol., 53, 299-328.

10. DeMoraes C. M., (1998), Nature, 393, 570-573.11. Dicke M., (1994), J. Plant Physiol., 143, 465-472.12. Kappers I. F., Aharoni A., van Herpen T. W. J. M., Luckerhoff L. L. P., Dicke M., Bouwmeester H. J.,

(2005), Science, 309, 2070-2072.13. Kopcewicz X., Lewak Y., (1997), Podstawy fizjologii roœlin, PWN, Warszawa, 316-327.14. Karl A. D. Swift (2004), Topics in Catalysis, 27, 143-155.15. Plinius Secundus G., (77 AD) Naturalis Historiae (Natural History (1952) Pliny the Elder, Trans.). Cambri-

ge, USA: Harvard University Press, The Loeb Classical Library.16. Wilson H., (1988), Egyptian food and drink, Aylesbury, UK: Shire Publishers.17. Lorenzetti B. B., Souza G. E. P., Sarti S. J., Santos-Filho D., Ferreira S. H., (1991), J. Ethnopharmacol.,

34, 43-48.18. de Carvalho C. C. C. R., da Fonseca M. M. R., (2006), Food Chemistry, 95, 413-422.19. Gerhäuser C., Klimo K., Heiss E., Neumann I., Gamal-Eldeen A., Knauft J., Liu G-Y., Sitthimonchai S.,

Frank N., (2003), Mutat. Res., 523-524, 163-167.20. Paduch R., Niedziela P., (2004), Onkol. Pol., 7, 19-23.21. Bardon S., Foussard V., Fournel S., Loubat A., (2002), Cancer Lett., 181, 187-194.22. Crowell P. L., Ayoubi A. S., Burke Y. D., (1996), Adv. Exp. Med. Biol., 401, 131-136.23. Gupta A., Myrdal P. B., (2004), Int. J. Pharm., 269, 373-383.24. Stark M. J., Burke Y. D., McKinzie J. H., Ayoubi A. S., Crowell P. L., (1995), Cancer Lett., 96, 15-21.25. Ahn K-J., Lee Ch. K., Choi E. K., Griffin R., Song Ch. W., Park H. J., (2003), Int. J. Radiat. Oncol. Biol.

Phys., 57, 813-819.26. Gelb M. H., Tamanoi F., Yokoyama K., Ghomashchi F., Esson K., Gould M. N., (1995), Cancer Lett.,

91, 169-175.


BIOTECHNOLOGIA 1 (76) 135-155 2007 153

27. Hadcastle I. R., Rowlands M. G., Barber A. M., Grimshaw R. M., Mohan M. K., Nutley B. P., JarmanM., (1999), Biochem. Pharmacol., 57, 801-809.

28. Karlson J., Borg-Karlson A. K., Unelius R., Shoshan M. C., Wilking N., Ringborg U., Linder S., (1996),Anticancer Drugs, 7, 422-429.

29. Vigushin D. M., Poon G. K., Boddy A., English J., Halbert G. W., Pagonis Ch., Jarman M., Coombes R.Ch., (1998), Cancer Chemother. Pharmacol., 42, 111-117.

30. Shi W., Gould M. N., (2002), Carcinogenesis, 23, 131-142.31. Elegbede J. A., Flores R., Wang R. C., (2003), Life Sci., 73, 2831-2840.32. Crowell P. L., (1997), Breast Cancer Res. Treat., 46, 191-197.33. Burke Y. D., Stark M. J., Roach S. L., Sen S. E., Crowell P. L., (1997), Lipids, 32,151-156.34. Burke Y. D., Ayoubi A. S., Werner S. R., McFarland B. C., Heilman D. K., Ruggeri B. A., Crowell P. L.,

(2002), Anticancer Res., 22, 3127-3134.35. Kêdzia B., Alkiewicz J., Han S., (2000), Post. Fitoterapii, 2, czytelnia Borgis on-line.36. Lee S. S., Kai M., Lee M. K., (2001), Phytother. Res., 15, 167-169.37. Trombetta D., Castelli F., Sarpietro M. G., Venuti V., Cristani M., Daniele C., Saija A., Mazzanti G.,

Bisignano G., (2005), Antimicrob. Agents Chemother., 49, 2474-2478.38. Hammer K. A., Carson C. F., Riley T. V., (2003), J. Applied Microbiol., 95, 853-860.39. Armaka M., Papanikolaou E., Sivropoulou A., Arsenakis M., (1999), Antiviral Res., 43, 79-92.40. Peana A. T., D’Aquila P. S., Chessa M. L., Moretti M. D. L., Serra G., Pippia P., (2003), Eur. J. Pharma-

col., 460, 37-41.41. Juergens U. R., Dethlefsen U., Steinkamp G., Gillissen A., Repges R., Vetter H., (2003), Respir. Med.,

97, 250-256.42. Thomas A. F., (1989), Nat. Prod. Rep., 3, 291-309.43. Ohloff G., (1994), Scent and Fragrance, Springer-Verlag, Berlin.44. Serra S., Fuganti C., Brenna E., (2005), Trends in Biotechnology, 23, 193-198.45. Demole E., Enggist P., Ohloff G., (1982), Helv. Chim. Acta, 65, 1785-1794.46. Singer A. C., Crowley D. E., Thompson I. P., (2003), Trends in Biotechnology, 21, 123-130.47. Hernandez B. S., (1997), Biodegradation, 8, 153-158.48. de-Oliveira A. C. A. X., Ribeiro-Pinto L. F., Otto S. S., Goncalves A., Paumgartten F. J. R., (1997), Toxi-

cology, 124, 135-140.49. Schlyter F., Birgersson G., Byers J. A., Löfqvist J., Bergström G., (1987), J. Chem. Ecol., 13, 701-716.50. Ko³odziejczyk A., (2004), Naturalne zwi¹zki organiczne, PWN, Warszawa.51. Mazzaro D., (2000), Chem. Marketing Rep., 258, 18.52. Duetz W. A., Bouwmeester H., van Beilen J. B., Witholt B., (2003), Appl. Microbiol. Biotechnol., 61,

269-277.53. Agrawal R., Joseph R., (2000), Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 335-337.54. Waché Y., et al., (2003), Appl. Microbiol. Biotechnol., 61, 393-404.55. Feron G., Bonnarame P., Durand A., (1996), Trends Food Sci. Technol., 7, 285-293.56. Wright J., (1995), Food Flavorings, 2nd ed., Ed. Ashurst P.R., Blackie Academic and Professional, Gla-

sagow, U.K.57. Hagedorn S., Kaphammer B., (1994), Annu. Rev. Microbiol., 48, 773-800.58. van der Werf M. J., Keijzer P. M., van der Schaft P. H., (2000), J. Biotechnol., 84, 133–143.59. Abraham W. R., Hoffmann H. M., Kieslich K., Reng G., Stumpf B., (1985), Ciba Found Symp., 111,

146-60.60. Furstoss R., Archelas A., (1995), Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, Comprehensive Handbook, Eds.

Drauz K., Waldmann H., B.6.1.5.4., Wiley-VCH, Weinheim.61. Speelmans G., Bijlsma A., Eggink G., (1998), Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 538-544.62. Busmann D., Berger R. G., (1994), J. Biotechnol. 37, 9-43.63. King A., Dickinson R., (2000), John Wiley & Sons, Ltd, 16, 499-506.64. Iurescia S., Marconi A. M., Tofani D., Gambacorta A., Paterno A., Devirgiliis C., van der Werf M. J.,

Zennaro E., (1999), Appl. Environ. Microbiol., 65, 2871-2876.65. Agrawal R., Deepika N. U. A., Joseph R., (1999), Biotechnol. Bioeng., 63, 249-252.



66. Busmann D., Berger R. G., (1994), Z. Naturforsch., 49, 545-552.67. Draczyñska B., Cagara C., Siewiñski A., Rymkiewicz A., Zab¿a A., Leufvèn A., (1985), J. Basic

Microbiol., 25, 487-492.68. Best D. J., Floyd N. C., Magalhaes A., Burfield A., Rhodes P. M., (1987), Biocatal., 1, 147-159.69. Narushima H., Omori T., Minoda Y., (1982), Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 16, 174-178.70. Chatterjee T., De B. K., Bhattacharyya D. K., (1999), Ind. J. Chem., 38, 515-517.71. Colocousi A., Saqib K. M., Leak D. J., (1996), Appl. Microbiol. Biotechnol., 45, 822-830.72. Devi J. R., Bhattacharyya P. K., (1978), J. Indian Chem. Soc., 55, 1131-1137.73. Shukla O. P., Moholay M. N., Bhattacharyya P. K., (1968), Indian. J. Biochem. Soc., 5, 79-91.74. Noma Y., Yamasaki S., Asakawa Y., (1992), Phytochem., 31, 2725-2727.75. Chang H. C., Oriel P., (1994), J. Food Sci., 59, 660-662.76. Duetz W. A., Jourdat C., Witholt B., (2001), Process for the preparation of perillyl alcohol,

EP1236802.77. Cadwallader K. R., Braddock R. J., Parish M. E., Higgins D. P., (1989), J. Food Sci., 54, 1241-1245.78. Rama D. J., Bhattacharyya P. K., (1977), Indian J. Biochem. Biophys., 14, 288-291.79. Trytek M., Fiedurek J., (2005), Biotechnol. Lett., 27, 149-153.80. Draczyñska-£usiak B., Siewiñski A., (1989), J. Basic. Microbiol., 29, 269-275.81. Abraham W. R., Stumpf B., Kieslich K., (1986), Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, 24-30.82. van der Werf M. J., Swarts H. J., de Bont J. A. M., (1999), Appl. Microbiol. Biotechnol., 65,

2092-2102.83. Onken J., Berger R. G., (1999), J. Biotechnol., 69, 163-168.84. Duetz W. A., Fja A. H. M., Ren S. Y., Jourdat C., Witholt B., (2001), Appl. Env. Biol., 67, 2829–2832.85. Kraidman K., Mukherjee B. B., Hill I. D., (1969), Bacteriol. Proc., 69, 63-68.86. Tan Q., Day D. F., Cadwallader K. R., (1998), Proc. Biochem., 33, 29-37.87. van Dyk M. S., van Rensburg E., Moleleki N., (1998), Biotechnol. Lett., 20, 431-436.88. Ballal N. R., Bhattacharyya P. K., Rangachari P. N., (1967), Biochem. Biophys. Res. Comun., 29,

275-280.89. Ballal N. R., Bhattacharyya P. K., Rangachari P. N., (1968), Indian J. Biochem., 5, 1-6.90. van der Werf M. J., van der Ven C., Barbirato F., Eppink M. H. M., de Bont J. A. M., van Berkel W. J.

H., (1999), J Biol. Chem., 274, 6296-26304.91. van der Werf M. J., Overkamp K. M., de Bont J. A. M., (1998), J. Bacteriol., 180, 5052-5057.92. Doig S. D., Boam A. T., Leak D. J., Livingston A. G., Stuckey D. C., (1998), Biocatal. Biotransform.,

16, 27-44.93. Velankar H. R., Heble M. R., (2003), Electronic J. Biotechnol., 6, 90-103.94. Fontanille P., Larroche C., (2003), Appl. Microbiol. Biotechnol., 60, 534-540.95. Beilen J. B., Holtackers R., Lüscher D., Bauer U., Witholt B., Duetz W. A., (2005), Appl. Env. Micro-

biol., 71, 1737-1744.96. Haudenschild C., (2000), Arch. Biochem. Biophys., 379, 127-136.97. Trytek M., Makarska M., Polska K., Radzki S., Fiedurek J., (2005), Biotechnologia, 4, 109-127.98. Trytek M., Fiedurek J., Polska K., Makarska M., Radzki S., (2005), Biotechnologia, 4, 128-141.99. Trytek M., Fiedurek J., (2002), Acta Microbiol. Polon., 51, 57-62.

100. Skrobot F. C., Valente A. A., Neves G., Rosa I., Rocha J., Cavaleiro J. A. S., (2003), J. Mol. Catal. A:Chem., 201, 211-222.

101. Moghadam M., Tangestaninejad S., Habibi M. H., Mirkhani V., (2004), J. Mol. Catal. A: Chem., 217,9-12.

102. Henning H., Luppa D., (1999), J. Prakt. Chem., 341, 757-758.103. Trytek M., Fiedurek J., Polska K., Radzki S., (2005), Catal. Lett., 105, 119-126.


BIOTECHNOLOGIA 1 (76) 135-155 2007 155

Documents

Monoterpeny – stare zwi¹zki, nowe zastosowania i ... · przeciwbólowe. Wykazano m.in., ¿e myrcen jest aktywnym sk³adnikiem stosowane-go w brazylijskiej medycynie ludowej naparu