348

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA Streptococcus agalactiae - TÁC NHÂN GÂY

BỆNH Streptococcosis TRÊN CÁ RÔ PHI Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM SOME CHARACTERISTICS OF Streptococcus agalactiae – CAUSATIVE AGENT

OF Streptococcosis DISEASE OF TILAPIA IN NORTHERN VIETNAM

Đồng Thanh Hà*, Nguyễn Viết Khuê, Nguyễn Thị Hạnh *Trung tâm nghiên cứu quan trắc cảnh báo Môi trường

và Phòng ngừa dịch bệnh Thủy sản miền Bắc –

Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1

Email: dongha@ria1.org

TÓM TẮT

Năm 2009-2010, hiện tượng cá Rô Phi thương phẩm bị chết hàng loạt ở các tỉnh miền Bắc đã được xác

định là do vi khuẩn Streptoccocus sp. Dựa vào đặc điểm chính về hình thái (hiển vi và siêu hiển vi), các

đặc điểm sinh hóa và sinh thái, Streptoccocus sp được phân loại là Streptococcus agalactiae. Nghiên cứu

về sinh thái học cho thấy S. agalactiae là vi khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ cao, nhiệt độ thích hợp là 30-

370C. Vi khuẩn có khả năng phát triển ở độ mặn 0-35‰, có thể tồn lưu tự do trong nước ao và bùn đáy từ

3-7 ngày, pH =12 của nước vôi có thể ức chế và tiêu diệt vi khuẩn này. Bài báo cũng thảo luận về khả

năng phát triển của vi khuẩn ở 370C và độ mặn 35‰ được xem là yếu tố nguy cơ lây nhiễm bệnh cho cá

nước lợ và nước mặn hoặc gây bệnh cho động vật có vú và con người.

Từ khóa: Streptococcus sp., Streptococcus agalactiae, Rô Phi.

ABSTRACT

During 2009-2010, Streptococcus sp was identified as a causative agent of mass mortality Tilapia in

Northern Vietnam. Based on morphological, biochemical and physiological characteristics, Streptococcus

sp was re-identified as Streptococcus agalactiae. Research on physiology indicated that S. agalactiae can

survive well in high temperature condition, optimum temperature is 30-370C. This bacteria can also

survive well at salinity from 0-35‰, in pond water and mud from 3-7 days, pH=12 of lime can inhibit or

inactivate bacteria. This article also discuss about survival ability of bacteria at 370C and 35‰ are

potetial risks for diseased transmission to brackish water, marine water fish, manmal and human.

Keywords: Streptococcus sp, Streptococcus agalactiae, Tilapia.

I. GIỚI THIỆU

Cá rô phi là loài cá có giá trị kinh tế cao, đã và đang được nuôi rất phổ biến ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam

với quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, trong hai năm gần đây dịch bệnh bùng phát đã làm suy giảm sản

lượng cá nuôi và gây ảnh hưởng không nhỏ đến kinh tế của ngư dân. Xảy ra lần đầu tiên xảy ra vào mùa

hè năm 2009 ở cá tỉnh miền Bắc như Hà Nội, Hải Phòng, Hải Dương, Quảng Ninh, Bắc Ninh, Hà Giang.

Dịch bệnh đã gây chết hàng loạt cá rô phi thương phẩm và cá giống. Tỷ lệ cá chết của các ao nuôi có thể

lên tới 90-100%. Cá bệnh thường có biểu hiện mắt lồi, xuất huyết, bơi xoắn trước khi chết nên người nuôi

thường gọi là bệnh “cá điên” hay bệnh “động kinh”. Kết quả nghiên cứu bước đầu đã khẳng định

349

Streptoccoccus sp là tác nhân chính gây bệnh (Khuê và ctv, 2009). Mùa hè năm 2010, dịch bệnh lại tiếp

tục gây chết hàng loạt cá nuôi tại Quảng Ninh, Hải Dương. Từ các mẫu bệnh phẩm của cá bệnh chúng tôi

đều phân lập được vi khuẩn Streptococcus sp.

Bài báo tập trung chính vào mô tả một số đặc điểm về hình thái, sinh thái và sinh hóa của vi khuẩn

Streptococus sp - tác nhân gây bệnh Streptococcosis trên cá rô phi. Các đặc điểm trên cũng là căn cứ để

phân loại vi khuẩn đến loài.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Vi khuẩn thí nghiệm

Ba chủng vi khuẩn phục vụ cho nghiên cứu có ký hiệu là CEDMA 09098 phân lập từ cá rô phi bị bệnh tại

Bắc Ninh năm 2009; CEDMA 10011 và CEDMA 10013 phân lập từ cá rô phi bị bệnh thu tại Quảng Ninh

và Hải Dương năm 2010 Cả ba chủng vi khuẩn đều đã được định danh là Streptococcus sp, hiện đang

được lưu giữ tại Trung tâm Nghiên cứu Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy

sản khu vực miền Bắc – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1.

2. Phương pháp nghiên cứu hình thái học của vi khuẩn

Để quan sát hình dạng hiển vi của vi khuẩn chúng tôi đã áp dụng phương pháp nhuộm Gram của của

Christian Gram (1884) để nhuộm cho tiêu bản phết từ các tổ chức mô gan, thận, lách, não và máu của cá

bệnh hoặc từ vi khuẩn sau khi nuôi cấy.

Để nghiên cứu cấu trúc siêu hiển vi của vi khuẩn, 2 mẫu gan và não của cá bệnh được cố định trong dung

dịch Glutaraldehyde 10%, cát lát mỏng sau đó kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử truyền qua. Vi khuẩn sau

khi nuôi cấy trên môi trường tổng hợp được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét. Tiến hành theo

phương pháp của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.

3. Phương pháp nghiên cứu sinh hóa của vi khuẩn

Sử dụng kết hợp kit API 20 STREP và phương pháp sinh hóa truyền thống để kiểm tra các đặc điểm sinh

hóa của vi khuẩn. Môi trường Blood Agar (BA) có bổ sung 5% máu cừu được sử dụng để kiểm tra khả

năng dung huyết của vi khuẩn. Phân loại vi khuẩn dựa vào hệ thống phân loại của Buller N. B (2004).

4. Phương pháp nghiên cứu sinh thái học của vi khuẩn

Nghiên cứu khả năng chịu đựng độ mặn: Sử dụng môi trường Nutrient broth (môi trường canh thang) có

bổ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau 0%, 1%, 2%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 6%, 8%, 10%. Cấy vi khuẩn

vào trong các ống nghiệm và theo dõi khả năng phát triển của vi khuẩn trong 5 ngày.

Nghiên cứu khả năng phát triển của vi khuẩn ở các mức nhiệt độ khác nhau: Vi khuẩn được cấy trên môi

trường thạch TSA, sau đó ủ ở các mức nhiệt độ khác nhau 200C, 250C, 300C, 330C, 370C, 450C. Theo dõi

khả năng mọc của vi khuẩn trong 3 ngày.

Nghiên cứu khả năng tồn lưu của vi khuẩn trong môi trường nước ao nuôi và bùn đáy: Nước ao nuôi được

lọc qua màng lọc 0.45 µm và bùn đáy ao được hấp khử ở 1210C/15 phút. Sau đó, nước ao và bùn đáy được

phân bố vào các hộp nồng vô trùng. Vi khuẩn được cấy vào các hộp lồng, theo dõi khả năng sống sót bằng

cách định kỳ 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày cấy phân lập lại vi khuẩn từ bùn đáy hoặc nước ao nuôi.

350

Nghiên cứu khả năng chịu đựng độ pH: Vôi bột (CaO) được hòa thành nước, để lắng và thu dung dịch

nước vôi trong có pH=12, dung dịch được điều chỉnh đến các nồng độ pH=10,5 và pH=9.5 bằng cách

thêm dung dịch HCl. Thêm vi khuẩn cùng một lượng vi khuẩn vào các ống nghiệm có giá trị pH khác

nhau, sau 15 phút và 30 phút 20µl của mỗi nồng độ được chang lại trên môi trường tổng hợp, đánh giá khả

năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn dựa vào khả năng mọc trên môi trường tổng hợp.

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

1. Hình thái hiển vi của Streptococcus sp.

Streptococcus sp. là vi khuẩn có dạng hình cầu hoặc oval, gram dương, không hình thành bào tử. Vi khuẩn

thường cảm nhiễm hệ thống, trong tổ chức mô của ký chủ có thể tìm thấy sự có mặt của vi khuẩn ở nhiều

tổ chức khác nhau như gan, thận, não và máu. Vi khuẩn trong máu thường có kích thước lớn hơn trong

các tổ chức mô khác và nối thành chuỗi hoặc tập trung thành từng đám. Trong mô gan, thận phết, nhuộm

gram, ngoài vi khuẩn ký sinh ngoại bào còn có có thể phát hiện rất nhiều vi khuẩn ký sinh trong nguyên

sinh chất của các tế bào gan, thận (hình 1c, d, e ,f).

Trên môi trường tổng NA hoặc TSA, sau 24h nuôi cấy ở 300C khuẩn lạc vi khuẩn thường có kích thước

nhỏ (pinpoint), không sinh sắc tố, vi khuẩn thường kết cặp hoặc tạo chuỗi ngắn. Tuy nhiên, trong môi

trường canh thang (Nutrient broth), vi khuẩn thường nối thành chuỗi dài dạng liên cầu khuẩn, mỗi chuỗi

có thể lên tới 15-20 tế bào (hình 2b)

351

Hình 1 : Vi khuẩn Streptococcus sp. dạng hình cầu, gram dương trong thận (A )

và máu (B ) của cá bệnh. Vi khuẩn có thể kết cặp hoặc tạo thành chuỗi, trong máu thường kích

thước thường lớn hơn và nối thành chuỗi dài hơn. Có thể phát hiện vi khuẩn ký sinh dày đặc

trong nguyên sinh chất của các tế bào gan, thận, lách (C, D, E, F ).

Hình 2: Vi khuẩn Streptococcus sp. trên môi trường NA sau 24h nuôi cấy ở 300C, tạo nên những

khuẩn lạc nhỏ (pinpoint) màu trắng đục (A ). Vi khuẩn thường nối thành chuỗi dài

trong môi trường canh thang (B).

A B

C D E F

A B

352

2. Cấu trúc siêu hiển vi của Streptococus sp.

Từ lát cắt gan và não của cá bệnh cho thấy vi khuẩn Streptococcus sp có dạng hình hình cầu hoặc oval,

đường kính 0,45-0,7 mm. Vi khuẩn có thể ký sinh bên ngoài tế bào hoặc trong nguyên sinh chất của tế bào

gan, tế bào não. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả phết mô nhuộm gram cho thấy Streptococcus sp. ở

cá rô phi là loài vi khuẩn có khả năng ký sinh nội bào. Tại vị trí ký sinh vi khuẩn thường gây ra hiện tượng

hốc hóa nguyên sinh chất, tạo nên khoảng trống ở xung quanh các tế bào vi khuẩn (hình 3C), mật độ vi

khuẩn cao có thể gây thoái hóa hoàn toàn nguyên sinh chất (hình 3B). Đặc biệt là vi khuẩn có khả năng

sinh sản ngay trong nguyên sinh chất của tế bào ký chủ (3C, D). Ở độ phóng đại lớn có thể quan sát thấy

cấu trúc của vi khuẩn Streptococus sp. bao gồm: lớp ngoài cùng là lớp màng nhày (capsule), tiếp đến là

lớp vách tế bào, màng nguyên sinh chất, tiếp đến là nguyên sinh chất, chất nhiễm sắc thường tập trung ở

giữ tế bào (hình 3E). Vi khuẩn sinh sản theo hình thức phân đôi, giữa hai tế bào con thường hình thành

nên một vách ngăn (hình 3D).

Hình ảnh kính hiển vi điện tử quét bề mặt cho thấy Streptococcus sp. là vi khuẩn có tiêm mao (pili), không

có tiên mao (flagella), bề mặt tế bào không trơn nhẵn, ở giữa tế bào thường hình thành hai vàng đai bao

xung quanh và chạy song song nhau (hình 3F, G).

353

Hình 3: Vi khuẩn Streptococcus sp. trong mao mạch của gan (A), trong nguyên sinh chất của tế bào

não (B), gan (C), gây thoái hóa nguyên sinh chất của tế. Vi khuẩn đang phân chia trong nguyên sinh

chất của tế bào gan và não (C, D). Cấu trúc điển hình của vi khuẩn Streptococcus sp. (E).

Hình ảnh quét bề mặt của vi khuẩn Streptococcus sp. (F,G).

A

D

B C

G

E

F

354

Chủng VK Đặc điểm

CEDMA 09098

CEDMA 10011

CEDMA 10013

Gram + + + Hình dạng Cầu,

oval Cầu, oval

Cầu, oval

Hemolytic - - - Oxidase - - - Catalase - - - O/F +/+ +/+ +/+ Di động - - - VP + + + HIP + + + Esculine - - - Arginine + + + Lysine - - - Ornithine - - - Nitrate - - - Citrate - - - Gelatin - - - Ribose + + + Arabinose - - - Glucose + + + Manitol - - - Sorbitol - - - Lactose - - - Trehalose + + + Inuline - - - Raffinose Maltose + + + Saccharose + + + Sinh hơi - - - Sinh H2S - - - RAF - - - AMD - - - GLYG - - - NaCl 0-3.5% + + + NaCl 4-10% - - - 450C - - -

3. Đặc điểm sinh hóa và sinh thái của vi khuẩn

Các đặc điểm sinh hóa của Streptococcus sp.

Cả 3 chủng vi khuẩn Streptococcus sp. có ký hiệu

là: CEDMA 09098, CEDMA 10011, CEDMA

10013 đều có các đặc điểm sinh hóa giống nhau

như: Gram dương, không hình thành bào tử,

catalase âm tính, không dung huyết, không có khả

năng di động, Hip (+), VP (+), Esculine (-),

Manitol (-), có khả năng sử dụng Arginine và một

số đường như Ribose, glucose, trehalose, maltose,

saccharose. Có khả năng phát triển ở độ muối từ 0-

3,5%, không phát triển ở 450C.

Khả năng chịu đựng độ mặn

Cả 3 chủng vi khuẩn đều phát triển tốt gây đục môi

trường canh thang ở các độ mặn 0-3%, phát triển

yếu ở độ mặn 3,5%, không phát triển ở các thang

độ mặn từ 4-10%.

Khả năng phát triển ở các mức nhiệt độ khác

nhau

Cả ba chủng vi khuẩn đều có khả năng phát triển ở

nhiệt độ từ 20-370C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ 20-250C

vi khuẩn thường phát triển chậm, kích thước khuẩn

lạc thường <0,5 mm sau 24h nuôi cấy. Ở mức 280C

kích thước khuẩn lạc thường từ 1-1,5mm sau 24h

nuôi cấy. Ở 300C, 330C và 370C kích thước khuẩn

lạc có thể đạt từ 1,5-3mm. Cả ba chủng vi khuẩn

đều không có khả năng phát triển ở 450C.

Từ các đặc điểm về hình thái và sinh hóa và sinh

thái trên, Streptococcus sp. được định danh là

Streptococcus agalactiae.

Khả năng tồn lưu của vi khuẩn S. agalactiae

trong môi trường nước ao, bùn đáy

Vi khuẩn S. agalactiae có khả năng sống sót sót tốt

trong nước ao và bùn đáy từ 3-5 ngày ở hai mức

nhiệt độ 250C và 300C.

355

Ở nhiệt độ 300C cả 3 chủng vi khuẩn đều không sống sót được trong bùn đáy đến ngày thứ 7, tuy nhiên 2

chủng CEDMA 09098, CEDMA 10011 vẫn có thể sống sót trong nước ao nuôi. Ở 250C, 2 chủng vi khuẩn

CEDMA 09098, CEDMA 10011 đều không sống sót được trong nước ao và bùn đáy đến ngày thứ 7. Tuy

nhiên, chủng CEDMA10013 mặc dù không còn sống sót trong nước ao nhưng vẫn còn sống sót trong bùn

đáy.

Khả năng sống sót ở các độ pH khác nhau của nước vôi

Kết quả thí nghiệm ở 3 mức pH của nước vôi cho thấy giá trị pH=9,5 và pH=10,5 không có khả năng tiêu

diệt vi khuẩn sau 15 và 30 phút. Ở mức pH=12 sau 30 phút có thể ức chế và tiêu diệt vi khuẩn tốt. Vi

khuẩn không còn khả năng phát triển hoặc phát triển yếu trên môi trường tổng hợp.

Vi khuẩn Streptococcus gây bệnh cho cá rô phi nuôi thường được thông báo gồm có hai loài chính là

Streptococcus iniae và và Streptococcus agalactiae. Hai loài vi khuẩn này còn được biết đến với 2 tên gọi

khác là S.shiloi và S. difficile – tác nhân gây bệnh viêm não ở cá Rô phi và cá Hồi vân (Eldar. A et al,

1994). Tuy nhiên, nghiên cứu về sinh học phân tử đã khẳng định lại S.shiloi chính là S. iniae, S. difficile

chính là S. agalactiae (Eldar. A et al, 1995; Kawamura. Y et al, 2005). Một số đặc điểm khác biệt giữa hai

loài vi khuẩn này là vi khuẩn S. iniae là vi khuẩn có khả năng dung huyết, có khả năng sử dụng đường

Manitol, phản ứng Esculine dương tính, có khả năng thủy phân tinh bột trong khi S.agalactiae thì ngược

lại, không dung huyết, không sử dụng đường Manitol, phản ứng Esculine âm tính, không có khả năng thủy

phân tinh bột. Các đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô phi bị bệnh tại miền Bắc

Việt Nam có tính tương đồng cao với loài S. agalactiae.

Nghiên cứu về sinh thái học của vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập từ cá rô phi bị bệnh tại miền

Bắc Việt Nam cho thấy vi khuẩn này có thể phát triển tốt ở nhiệt độ cao, nhiệt độ tối ưu là 30-370C, phát

triển chậm ở nhiệt độ thấp 20-250C. Đây là bằng chứng để khẳng định Streptococcosis là bệnh của cá rô

phi vào mùa có nhiệt độ cao. Mặt khác, khả năng phát triển tốt của S. agalactiae ở nhiệt độ 370C được

xem là yếu tố nguy cơ về vệ sinh an toàn thực phẩm. Streptococcus agalactiae đã được biết đến là tác

nhân gây bệnh viêm não ở cá, chứng viêm vú ở bò và bệnh viêm màng não ở trẻ sơ sinh. Ngoài ra, S.

agalactiae còn có khả năng gây bệnh trên nhiều loài vật chủ khác như như chó, mèo, gà, ngựa, khỉ, lạc đà,

ếch, chuột (Evans J. J et al, 2009; Pereira. U. P et al, 2010).

Để đánh giá khả năng gây bệnh của vi khuẩn S. agalactiae có nguồn gốc ký chủ khác nhau lên cá rô phi,

23 chủng vi khuẩn (8 chủng có nguồn gốc từ cá rô phi bị bệnh viêm não, 9 chủng có nguồn gốc từ bò có

biểu hiện lâm sàng hoặc tiền lâm sàng của bệnh viêm vú, 6 chủng có nguồn gốc từ người) đã được gây

nhiễm cho cá rô phi. Kết quả cho thấy 8/8 chủng có nguồn gốc từ người đã gây bệnh và gây chết 100% cá

thí nghiệm, 3/9 chủng có nguồn gốc từ bò có thể phát triển trên cơ thể cá tuy nhiên chỉ có 2 chủng gây ra

biểu hiện lâm sàng của bệnh viêm não. Đặc biệt là 6/6 chủng có nguồn gốc từ người có thể cảm nhiễm cho

cá, trong đó 1 chủng đã gây ra biểu hiện lâm sàng của bệnh viêm não và gây chết 16.7% cá thí nghiệm

(Pereira. U. P et al, 2010). Như vậy, bằng chứng về vi khuẩn S. agalactiae có nguồn gốc từ người và động

vật có vú có khả năng gây bệnh cho cá đã phần nào được chứng minh. Tuy nhiên đến nay chưa có các

nghiên cứu về khẳ năng truyền lây của S. agalactiae có nguồn gốc từ cá sang người và động vật trên cạn.

356

Trong điều kiện thí nghiệm, vi khuẩn S. agalactiae có khả năng phát triển tốt ở độ mặn 0-35‰. Đây cũng

được xem là yếu tố nguy cơ của việc truyền lây bệnh giữa cá nước ngọt và nước mặn. Đã có nhiều nghiên

cứu khẳng định vi khuẩn S. iniae gây bệnh trên cá cá nước ngọt và nước mặn (Eldar. A et al, 1994;

Bromage. E. S et al, 1999). Tuy nhiên, đến nay chưa có thông báo về bệnh trên cá biển do vi khuẩn S.

agalactiae. Mặt khác các đặc điểm sinh thái học như khả năng tồn lưu tự do trong nước ao, bùn đáy trong

thời gian 3-7 ngày, bị ức chế và tiêu diệt bởi pH =12 của nước vôi là những căn cứ cho việc khuyến cáo

xử lý ao nuôi trong quá trình cải tạo. Việc phơi đáy ao 7-10 ngày, bón vôi bột để khử trùng trước khi nuôi

là những biện pháp hiệu quả để tiêu diệt mầm bệnh trong ao nuôi.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Viết Khuê, Nguyễn Thị Hà, Trương Thị Mỹ Hạnh, Đồng Thanh Hà và ctv. (2009). Xác

định nguyên nhân gây chết cá rô phi thương phẩm ở cá tỉnh miền Bắc. Báo cáo tổng kết Khoa học

kỹ thuật Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1.

2. Buller. N. B. (2004). Bacteria from fish and other aquatic animal – A practical dentification

manual. CABI publishing.

3. Bromage. E. S, Thomas. A, Owens. L. (1999) Streptococcus iniae, a bacterial infection in

barramundi Lates calcarifer. Disease of Aquatic Organism, 36, 177-181.

4. Eldar. A, Bejerano. Y, Bercovier. H. (1994). Streptococcus shiloi and Streptococcus difficile:

Two New Streptococcal Species Causing a Meningoencephalitis in Fish. Current Microbiology,

28, 139-143.

5. Eldar. A, Frelier. P. F, Assenta. L, Varner. P. W, Lawhon. S, Bercovier. H. (1995).

Streptococcus shiloi, the Name for an Agent Causing Septicemic Infection in Fish, Is a Junior

Synonym of Streptococcus iniae. International Journal of Systematic Bacteriology, 45, 840-842

6. Evans J. J, Klesius P. H, Pasnik D. J, Bohnsack J. F. (2009) Human Streptococcus agalactiae

Isolate in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Emerging Infectious Diseas, 15, 774-776.

7. Kawamura. Y, Itoh. Y, Mishima. N, Ohkusu. K, Kasai. H, Ezaki. T. (2005). High genetic

similarity of Streptococcus agalactiae and Streptococcus difficilis: S.difficilis Eldar et al.1995 is a

later synonym of S. agalactiae Lehmann and Neumann 1896 (Approved Lists 1980). International

Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 55, 961–965.

8. Pereira. U. P, Mian. G. F, Oliveira. I. C. M, Benchetrit. L. C, Costa. G. M, Figueiredo. H. C. P.

(2010). Genotyping of Streptococcus agalactiae strains isolated from fish, human and cattle and

their virulence potential in Nile tilapia. Veterinary Microbiology, 140, 186-192